JP3629759B2

JP3629759B2 - Proteasome activator

Info

Publication number: JP3629759B2
Application number: JP15537895A
Authority: JP
Inventors: 啓二田中; 直樹新原
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1995-05-30
Filing date: 1995-05-30
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: JPH08322576A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、プロテアソームアクチベーターに関するものであり、さらに詳しくは該プロテアソームアクチベーターのポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアソームは、別名、多機能性プロテアーゼと呼ばれ、不活性型で細胞内に局在し、エネルギー依存性蛋白質分解系を構成する主要酵素である。本酵素は、酵母からヒトに至る真核生物に広く存在しており、またすべての組織に存在し、なかでも肝臓では、全可溶性蛋白質の１％も占める。
該酵素は同一分子内に複数の触媒活性部位を持ち、トリプシン型酵素の基質である塩基性アミノ酸、キモトリプシン型酵素の基質である中性アミノ酸、そしてプロテアーゼとしては稀な酸性アミノ酸を含む合成ペプチドのカルボキシ末端のペプチド結合を切断する活性がある。
しかしながら、種々の既知の阻害剤の中で特異的で有効に作用するものがないことから、該酵素は、既知のプロテアーゼとは異なる触媒活性部位を持つと推定されている。
また、沈降係数２０Ｓ、分子量は約７５万と推定され、プロテアーゼとしては例外的に大きい。
【０００３】
かかるプロテアソームは、非リソゾーム系蛋白質分解経路における主要酵素であり、蛋白質の修飾による機能制御や蛋白質の代謝回転の調節など多彩な生理作用を有していると推定される。
さらに、最近、プロテアソームが内在性抗原のプロセシング酵素であると考えられており、注目されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
プロテアソームは、このような２０Ｓ型複合体として見いだされた。
さらに、本発明者は最近、多数の制御因子群がこの２０Ｓプロテアソームに可逆的に結合し、分子量約２００万、沈降係数２６Ｓの巨大な複合体を形成していることを見いだし、２６Ｓプロテアソームと命名した（特開平５−２９２９６４、特開平６−０２２７５９）。また、これら、多数の制御因子群が結合することによって、２０Ｓプロテアソームの活性が促進されることがしられている。
しかしながら、プロテアソームを活性化する制御因子群は、これら２６Ｓプロテアソーム制御因子群しか明かにされておらず、その他の活性化因子、すなわちプロテアソームアクチベーターについての詳細は明かにされておらず、その詳細を明かにし、各種病態の診断、および治療法を確立することが強く要望されている。
【０００５】
そこで、本願発明者は、このような状況を踏まえ、前記プロテアソームアクチベーターについて、その構成成分である個々のサブユニットの構造、機能等について鋭意研究を重ねた結果、新規なプロテアソームアクチベーターについて解明し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はプロテアソームアクチベーターの構成成分の同定およびその機能を明らかにし、さらに該プロテアソームアクチベーターのポリペプチドのアミノ酸配列を提供することを目的とするものである。
また、本発明は前記プロテアソームアクチベーターの構成成分のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は、該プロテアソームアクチベーターの機能の解明および、免疫疾患をはじめ各種病態の診断治療の方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、前記目的を達成可能とするため、前記プロテアソームについて、その構成成分である個々のサブユニットの構造、機能等について詳細に研究を重ねた結果、プロテアソームの構成成分であるプロテアソームアクチベーターについて解明した。
さらに、前記の知見に基づき、各種病態の診断、および治療法を提供することが可能となった。
すなわち、本発明は、前記プロテアソームアクチベーターを同定しそのポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること、さらにそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定することからなる。
【０００７】
さらに本発明は、プロテアソームアクチベーターのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補的ポリヌクレオチドを作製可能とし、これを用いて各種ヒト臓器におけるプロテアソームアクチベーターのｍＲＮＡの発現量を定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方法に使用可能とするものである。
【０００８】
さらに本発明においては、各種プロテアソームアクチベーターに対する抗体を作成可能とし、これらの抗体を用いて、各種細胞中のプロテアソームアクチベーターを定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方法に使用可能とするものである。
【０００９】
より詳しくは、本発明は、分子中に少なくとも、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドに係るものであり、さらにそのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに係るものである。
【００１０】
さらに本発明は、分子中に少なくとも、配列番号２に記載の塩基配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリヌクレオチドに係るものである。
【００１６】
さらに本発明は、配列番号１に記載のポリペプチドを構成するアミノ酸配列であって、連続する少なくとも１５のアミノ酸からなるポリペプチドに係るものである。
【００２２】
また本発明は、分子中に少なくとも、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞、または大腸菌に係るものである。
【００２４】
以下本発明を詳細に説明する。
（ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチド）
以下で説明する方法により塩基配列が決定されたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから推定される、ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に記載の通りである。
また、本発明に係るヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合していないポリペプチド、および前記アミノ酸配列のＮ末端にヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのためのシグナルペプチドの部分もしくは全部が結合または、欠損した中間体も含包する。
【００２５】
また、自然の変異により、または人工の変異によりポリペプチドの主たる活性に変化を与えることなく、ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させることが可能である。
本発明のヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、前記アミノ酸配列を有する相同変異体に相当する構造を有するポリペプチドも含包する。
【００２６】
（ラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチド）
以下で説明する方法により塩基配列が決定されたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから推定される、ラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３に記載の通りである。
本発明に係るラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合していないポリペプチド、および前記アミノ酸配列のＮ末端にラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのためのシグナルペプチドの部分もしくは全部が結合または、欠損した中間体も含包する。
【００２７】
また、自然の変異により、または人工の変異によりポリペプチドの主たる活性に変化を与えることなく、ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させることが可能である。
本発明のラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、前記アミノ酸配列を有する相同変異体に相当する構造を有するポリペプチドも含包する。
【００２８】
（プロテアソームアクチベーターの精製）
本発明のプロテアソームアクチベーターは、各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより、精製が可能である。例えば牛赤血球細胞からは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０５１５−１０５２３，１９９２に記載の方法に準じて、硫酸アンモニウムによる沈殿の後、セファクリルＳー３００、ＤＥＡＥーＳｅｐｈａｃｅｌ，ハイドロキシアパタイトカラム、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬー４Ｂによる分離精製が可能である。
なお、精製を進めるためのアッセイ法としては、２０Ｓプロテアソームのプロテアーゼ活性をアクチベートする活性があるかどうかを調べることによって行うことができる。
【００２９】
精製したプロテアソームアクチベーターは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳーＰＡＧＥ，ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗＤａｖｉｄｌａｎｅ著、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６３６−６４０，１９８８）や、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ等による２次元電気泳動（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，４００７−４０２１，１９７５）により分離した後、ゲルをクマシー染色すると、分子量２８ｋＤａのバンドとして観察される。
【００３０】
（プロテアソームアクチベーターの単離）
上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥや２次元電気泳動によるバンドからプロテアソームアクチベーターを単離するには、分子量約２８ｋＤａのバンドを選ぶことにより可能である。さらに、電気泳動法より分離同定されたプロテアソームアクチベーターをポリビニリデンジフルオロダイド（ＰＶＤＦ）等にトランスファーすることが可能である。
【００３１】
（プローブの作成）
上記の処理後、リジルエンドペプチダーゼなどによる各種酵素処理によりポリペプチドフラグメントの混合物とし、得られたペプチドフラグメントの混合物を高速液体クロマトグラフィーで分離する。
上記で得られたポリペプチドフラグメントのいくつかのフラグメントのアミノ酸配列を自動アミノ酸シークエンサー等を用いて決定することが可能である。
上記の解析によって得られたアミノ酸配列の一部の情報をもとにポリヌクレオチドの検索に必要なプローブは、得られたポリペプチドフラグメントのうち縮重頻度の低いものを選択し、これに対応する相補的ポリヌクレオチドとして合成して作成することにより可能である。
【００３２】
また、複数のアミノ酸配列が得られた場合は、対応する相補的ポリヌクレオチドを組み合わせて、ヒトのｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法（例えば、ＭｉｃｈａｅｌＡ．Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ｅｄ．，斎藤隆監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）により、より長い断片のＤＮＡプローブを得ることが可能である。
以上のようにして、プロテアソームアクチベーターをスクリーニングするためのＤＮＡプローブが得られる。
【００３３】
（相補鎖ＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニング）
本発明においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをスクリーニングするためのｃＤＮＡライブラリーの作製は、一般的な方法が使用可能であり例えば次のステップにより可能である。
【００３４】
すなわち、（ｉ）プロテアソーム産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、
（ｉｉ）該ｍＲＮＡから、単鎖の相補鎖ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、次いで２重鎖ポリヌクレオチドを合成し、
（ｉｉｉ）２重鎖ポリヌクレオチドをプラスミドまたはファージに組み込み、
（ｉｖ）得られた組換えプラスミドまたはファージにより適当な宿主細胞を形質転換し、
（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から、適当な方法、例えばコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションにより、目的とするポリヌクレオチドを含有するプラスミドまたはファージを単離し、
（ｖｉ）そのプラスミドまたはファージから目的とするポリヌクレオチドを切り出し、
（ｖｉｉ）該クローン化ポリヌクレオチドを適当なプラスミドにサブクローニングする、というステップである。
【００３５】
各ステップについてさらに詳しく説明する。
ステップ（ｉ）：プロテアソームアクチベーターのポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、種々の動物の組織、器官、産生細胞から、より具体的には、肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、胸腺、肝臓癌細胞株、腎臓癌細胞株などから得ることができる。
また該酵素産生細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、グアニジウム／セシウムクロライド法（Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ／ＣｅｓｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄｅｍｅｔｈｏｄ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．，ａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９４−１９６，１９８２）やグアニジウムチオシアネート法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔａｌ．，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６−１５９，１９８７）等が一般に用いられる。
【００３６】
前記操作により得られる全ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離、精製は例えば、オリゴｄＴーセルロース（コラボレイティブリサーチ社（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ社））やオリゴテックスーｄＴ３０（タカラ社）等を用いて吸着カラム法またはバッチ法により実施できる。
ステップ（ｉｉ）：このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えばオカヤマーバーグ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３，２８０，１９８３）やグブラーとホフマンの方法（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｖ．ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６９，１９８３）等に従いｃＤＮＡを合成する。
【００３７】
ステップ（ｉｉｉ）：得られたｃＤＮＡをプラスミドやファージに組み込み、ｃＤＮＡのライブラリーを調製する。
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとしては、例えば、ＰＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５，１９７７）、ＰＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ，４，１２１，１９７８），ＰＵＣ１２（Ｇｅｎｅ，１９，２５９，１９８２），ＰＵＣ１３（Ｇｅｎｅ，１９，２５９，１９８２），ＰＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５），ＰＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５），ＰＵＣ１１８（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３，１９８７），ＰＵＣ１１９（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３，１９８７），ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，９４９４，１９８９）、などが挙げられるが、その他のものであっても、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも用いることができる。
【００３８】
また、ｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えば、λｇｔ１０（Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．Ｖ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１，４９，１９８５）、λｇｔ１１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，１１９４，１９８３）またはλＺＡＰＩＩ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，９４９４，１９８９）、などが使用可能であるが、その他のベクターであっても、適当な宿主内で増殖できるものであれば良い。
また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えば、Ｈｙｕｎｈ，Ｔ．Ｖ．等の方法（ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１，４９，１９８５）などが使用可能である。
【００３９】
ステップ（ｉｖ）：前記の方法により得られたプラスミドやファージベクターは、これを適当な宿主たとえば、エシェリヒアコリ（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等に導入して、これを形質転換できる。
プラスミドベクターで宿主を形質転換する方法としては、例えば、文献（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１．７４−１．８４，１９８９）記載のエレクトロポーレーション法あるいはカルシウムクロライド法などが挙げられる。また、ファージベクターにはたとえば、増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導入することができる。
【００４０】
ステップ（ｖ）：前記方法によるｃＤＮＡから目的のプロテアソームアクチベーターのｃＤＮＡを選択するには、例えばラベル化したプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション法または、プラークハイブリダイゼーション法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１．８５−１．１０４ｏｒ２．１１２−２．１２０，１９８９）などが使用可能である。
前記のハイブリダイゼーションにおけるプローブとして用いるポリヌクレオチドとしては、プロテアソームアクチベーターとハイブリダイズする少なくとも１２の塩基からなるポリヌクレオチドであれば、何でもよく、例えばプロテアソームアクチベーターのアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチド，あるいはプロテアソームの他のコンポーネントをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、およびこれらの部分ＤＮＡ等が使用可能である。
【００４１】
さらに、プロテアソームの他のコンポーネントをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、およびこれらの部分ＤＮＡも、サブユニットとハイブリダイズ可能であるかぎり使用可能である。
以上のようにして、プロテアソームアクチベーターをコードするポリヌクレオチドが調製可能となる。
【００４２】
（プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの塩基配列の決定）
前記に従い得られたｃＤＮＡの塩基配列の決定は、例えば、マキサムーギルバート（Ｍａｘｉａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９−５６０，１９８０）、ジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，９，３０９，１９８１）、蛍光色素を用いたＴａｑサイクルシークエンシング法等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，４９４−４９９，１９８９）により可能である。
決定されたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は例えば配列番号２に記載のごとく表される。またラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は例えば配列番号４に記載のごとく表される。
【００４３】
本発明に係る上記ポリヌクレオチドは、配列番号２または４に記載塩基配列であって、５’末端にＡＴＧが結合していない塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
本発明の上記ポリヌクレオチドはまた、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのシグナルペプチドの部分または全部をコードする５’フランキングポリヌクレオチドを含むＤＮＡも含む。
さらに、自然の変異により、または人工的変異により、主たる活性に変化を与えることなく、ポリヌクレオチドの構造およびそれから演繹されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめることが可能である。
従って、本発明に係るポリヌクレオチドは、前述のすべてのポリペプチドの相同異性体に相当する構造を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する。
【００４４】
さらに、遺伝暗号の縮重に従い、ポリヌクレオチドから生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくそのポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一つの塩基を他の種類の塩基に置換することができる。
従って、本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、変換された塩基配列を含有する。この場合、上記置換により得られた塩基配列より、演繹されるアミノ酸配列はヒトの場合は配列番号１に記載のアミノ酸配列と一致し、ラットの場合は配列番号３に記載のアミノ酸配列と一致する。
【００４５】
本発明のプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、前記の方法の他に、ヒト、ラット、マウスなどのゲノムＤＮＡのライブラリーからのクローニングによっても得ることができる。
これら、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βをコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、目的により、そのままあるいは制限酵素で切断して使用することが可能である。
【００４６】
本発明により得られたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのｃＤＮＡの構造は図１に示されるように、７６３残基からなり、オープンリーディングフレームは７１７残基であり、２３９アミノ酸をコードする。
計算上の分子量は、２７０７２であり、等電点は、５．３３である。
【００４７】
また本発明により得られたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのｃＤＮＡの構造は図２に示されるように、７５４残基からなり、オープンリーディングフレームは７１４残基であり、２３８アミノ酸をコードする。
計算上の分子量は、２６７９１であり、等電点は、５．２８である。
【００４８】
（免疫疾患等の診断用測定方法）
プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βは実施例２でも示すように免疫インターフェロンとよばれるインターフェロンーγにより強く誘導される。
また、本発明のヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βをホモロジー検索したところ、代表的な自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者において見出された自己抗体の抗原蛋白質Ｋｉ−Ａｎｔｉｇｅｎ（Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９，２０９−２１４，１９９０）に４０％のホモロジーをもつことがわかった。
【００４９】
従って、前記得られたポリヌクレオチドをプローブとして用いることは、免疫疾患をはじめとする各種疾患の診断等にも有効な手段を与える。すなわち、本発明で得られたプロテアソームアクチベーターの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、各種ヒト臓器のｍＲＮＡ発現量を例えばノザンブロット解析やＲＴ−ＰＣＲ解析（例えば、ＭｉｃｈａｅｌＡ．Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ｅｄ．，斎藤隆監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）を行うことにより定量的に測定可能となり、前記各種疾患の診断手段を与えるものである。
さらにプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの遺伝的多型性を調べることにより、各種疾患との関連も明らかにでき、ポリヌクレオチド診断に有効に使用可能となる。
【００５０】
また、本発明において得られたプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作成することが可能である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｅｄ．，Ｈａｒｌｏｗｅｔ．ａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載の方法に準じて可能である）。なお、モノクローナル抗体を作成する際の抗原とするポリペプチドは少なくとも４のアミノ酸から成ればよい。得られた抗体を用いた免疫的測定法により、各種細胞中の該プロテアソームアクチベーターの変化を定量的に測定する手段が与えられる。
【００５１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）プロテアソームアクチベーターの遺伝子配列の決定
プロテアソームアクチベーターの調製
（１）プローブの調製
（１ー１）出発物質の調製
牛血液あるいは心臓細胞より、プロテアソームアクチベ−ターは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０５１５−１０５２３，１９９２に記載の方法に準じて精製可能である。ただし、精製の過程で蛋白質の分解を防ぐために蛋白質分解阻害剤としてバッファ−類に１０ｍＭロイペプチン（ＳＩＧＭＡ社）、２．５ｍＭ４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社）を添加する必要がある。
【００５２】
精製の概略は、以下の通りである。牛血液をヘパリン存在下で収集し、２０００ｘｇで１時間遠心し赤血球細胞を集めた後、得られた沈殿を４倍体積のリン酸緩衝液に懸濁し、再沈殿することにより洗浄し、ＤＥ５２（ＤＥＡＥｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ｗｈａｔｍａｎ社）を添加し、結合画分を調製し、硫安沈殿後、セファクリルＳ−３００、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ、ハイドロキシアパタイト、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ（１０ｘ２５ｃｍ）のカラムクロマトグラフィ−による精製を行う。
（１ー２）活性画分の測定方法
プロテアソームアクチベーター活性は、２０Ｓプロテアソームと精製の各ステップの蛋白を混合して，２０Ｓプロテアソームのペプチダーゼ活性を促進するかどうかを測定することにより、測定可能である。反応は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（キモトリプシン様活性を測定するための合成基質）、５０ｍＭ，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），２０Ｓプロテアソームと精製各段階の蛋白を添加して最終容積１０００μｌで行った。この反応液を、３７℃で１０分間インキュベートして、蛍光を測定した。
制御因子群にアクチベート活性があれば、２０Ｓプロテアソームによる合成基質の分解活性が上昇することから、活性画分を同定可能となる。
【００５３】
（２）プロテアソームアクチベーターのアミノ酸配列の決定
（２ー１）プロテアソームアクチベーターの単離
（１）の処理で得られた分子量約２８ｋＤａのプロテアソームアクチベーター画分を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−３００Ｃ８カラム２．１ｘ１００ｍｍ，ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ社、Ｍｏｄｅｌ１３０Ａ）を使用し、以下の条件で分離した。
分離条件：
流速５０μｌ／ｍｉｎ、
溶媒Ａ、０．０６％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；溶媒Ｂ，０．０５％ＴＦＡ／７０％アセトニトリル／３０％水。
【００５４】
Ａ（６４％）とＢ（０％）からなる混合溶媒によりカラムを平衡化し、Ｂ溶媒を０から７０％まで用いたグラジエントで溶出した。
【００５５】
２１４ｎｍの波長で検出し、ピーク画分をスピードバックコンセントレータ（ＳａｖａｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で乾燥した。その結果、２本のピ−クが観察されたので、後半に溶出された画分について、以下の操作を行った。
【００５６】
（２ー２）電気泳動による分離
前記得られた乾燥サンプルはＳＤＳサンプルバファーに溶解し、１０％ＳＤＳーＰＡＧＥ（ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗＤａｖｉｄｌａｎｅ著、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６３６−６４０，１９８８）により分離した。電気泳動が終わったゲルは、イモビロン−ＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社製）にセミドライエレクトロブロティング装置を用いてトランスファーした。
蛋白質をブロットした膜フィルターは、蒸留水で洗浄した後、クマシーブルー染色液（０．２％クマシーブリリアントブルーＲ２５０を含む４０％メタノール、１０％酢酸溶液）で染色後、脱色液（６０％メタノール溶液）に浸し、振とうしてバックグラウンドを脱色した。
【００５７】
このメンブラン上の約２８Ｄａの位置のスポットを切出し、ｉｎｓｉｔｕでＬ−１−ｔｏｓｙｌａｍｉｄｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ処理トリプシン（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＥｎｚｙｍｅｓ社）、またはＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（ベーリンガーマンハイム社）により酵素処理した。生成したペプチドはＨＰＬＣ（パーキンエルマー社製）によって分離精製した（流速５０μｌ／ｍｉｎ，０．１％ＴＦＡを溶媒とし０−７０％のアセトニトリルによるグラジエント、ＲＰ３００カラム（２．１ｘ１００ｍｍ））。
得られたポリペプチドフラグメントのいくつかをペプチドシークエンサー（パーキンエルマー社製プロテインシークエンサー４９７型分析装置）により解析を行った。
【００５８】
以上のアミノ酸解析により次の２種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。
フラグメント１；ＱＶＥＶＦＲ
フラグメント２；ＱＮＬＦＱＥＡＥＥＦＬＹＲ
フラグメント３；ＦＬＰＱＫ
フラグメント４；ＩＩＹＬＮＱＬＬＱＥＤＳＦＮＶＴＤＬＮＳＬＲ
フラグメント５；ＡＰＬＤＩＰＩＰＤＰＰＰＫＤＤＥＭＥＴＤ
フラグメント６；ＴＫＶＥＡＦＱＴＴＩＳＫ
フラグメント７；ＡＬＶＨＥＲＤＥＡＶＹＧＤＬＲ
フラグメント８；ＡＭＶＬＤＲ
フラグメント９；ＡＦＹＡＥＬＹＨＩＩＳＳＮＬＥＫ
（３）ｃＤＮＡプローブの作製
（３ー１）プライマーの合成
（プロテアソームアクチベーターＰＡ２８β）
得られた以上のペプチドフラグメントの配列から縮重度の低い配列として、フラグメント５からＰＰＫＤＤＥＭＥ、フラグメント６からＡＬＶＨＥＲＤＥＡＶの配列を選択した。
【００５９】
次に、これら選択したポリペプチドに対応する相補的オリゴヌクレオチドとして、フォワードプライマーとして５’−ＣＧＣＡＴＡＡＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＧＡ−−３’ を選び，リバースプライマーとして５’−ＡＣＴＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣ（Ｇ／Ｔ）ＣＴＣＡＴＧＴＧＡＧＩＡＧＩＧＣ−３’をＤＮＡ合成機３８０Ｂ（アプライドバイオシステムズ社製）で合成した。
得られたオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドカートリッジ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して精製した。
【００６０】
（３ー２）ＰＣＲ用ｍＲＮＡ調製
牛肝臓５ｇからの全ＲＮＡはグアニジンチオシアネイト法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）により以下のようにして分離精製した。
５ｇの試料をグアニジンチオシアネイト溶液（ｓｏｌ．Ｄ溶液；６Ｍのグアニジンチオシアネート、０．５％のザルコシル、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７），１００ｍＭの２ーメルカプトエタノール，０．１％のアンチフォームＡ）中で超音波処理し、変性させた後遠心して上澄を得た。
これに（１／１０）量の２Ｍ酢酸および等量のエタノール、（１／５）量のクロロフォルムーイソアミルアルコール（４９：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）を加え、氷上で１５分間静置して、１０，０００ｇで１５分間４℃にて遠心処理して沈殿を得た。
【００６１】
水相を別の試験管に移し、等量のイソプロパノールを添加し、ー２０℃で１時間静置し、１０，０００ｇで２０分間４℃において遠心した。
得られた沈殿をｓｏｌ．Ｄ溶液に溶解し等量のイソプロパノールを添加し、遠心して沈殿を７５％エタノールで洗浄した。
次にこの沈殿をｓｏｌ．Ｄ溶液に懸濁し、等量のイソプロパノールを再度添加し、−２０℃で１時間冷却した後、遠心処理を行った。
遠心分離により沈殿を集め、７５％エタノールで洗浄し、遠心処理後、上清を除去し、これをＤＥＰＣ処理（ジエチルピロカーボネート０．１％で５時間処理後、オートクレーブ処理）したミリＱに溶解し、５４ｍｇの全ｍＲＮＡを得た。
【００６２】
前記の処理により得られた全ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）−ラテックス（タカラ社；ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０）を用いてｍＲＮＡを得た。
すなわち全ＲＮＡ１ｍｇに対して反応緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），０．１％ＳＤＳ）を加えて全量で１ｍｌとした。
次に、これにＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０１ｍｌを加え、６５℃で５分間熱変性し、氷上で３分間急冷した。
５ＭＮａＣｌ０．２ｍｌを加え撹拌後、３７℃で１０分間インキュベートし、１５，０００ｒｐｍ１０分間遠心した後上清を除去した。
ペレットを洗浄液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳ，１００ｍＭＮａＣｌ）２．５ｍｌに懸濁し、３７℃で１０分間放置した。
これを１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心分離した。
【００６３】
得られたペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、ＥＤＴＡ１ｍＭ）１ｍｌに懸濁し、６５℃、５分間加熱し、ｍＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０から溶出した。
さらに１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を回収し、エタノール沈殿を行うため３ＭＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６）１００ μｌと冷エタノール２ｍｌを加え、ー８０℃で３０分間放置した。
１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液５０μｌに溶解した。
本実施例により、１０ｍｇの全ＲＮＡから４５μｇのｍＲＮＡを得ることができた。
【００６４】
（３ー３）ＰＣＲ用ｃＤＮＡ合成
得られたｍＲＮＡを鋳型としてＯｌｉｇｏ（ｄＴ） _１５をプライマーとして相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した（ファルマシア社製、ｃＤＮＡ合成キット）。
（３ー４）ＰＣＲによるｃＤＮＡプローブの調製
前記（３ー１）で得られたフォワードプライマーとともにリバースプライマーを用い前記（３ー３）で得られた牛肝臓のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行った（例えば、ＭｉｃｈａｅｌＡ．Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ｅｄ．，斎藤隆監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）。
各プライマー濃度は２０ｐｍ／ μｌ，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは０．０２５Ｕ／ μｌ、ｃＤＮＡ１ｎｇ／ μｌで３０サイクル、パーキンエルマー（シータス）社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて増幅し、約６００ｂｐのｃＤＮＡプローブを得た。
【００６５】
（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製
（４ー１）ｃＤＮＡの調製
ヒト肝細胞癌ＨＥＰＧ２（ＡＴＣＣから入手可能）から、（３ー２）記載のグアニジウムチオシアネイト法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）によって全ＲＮＡを分離した。全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）ラテックス（タカラ社；Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０）を用いて（３ー２）記載の方法と同様にＨＥＰＧ２細胞からｍＲＮＡ１０μｇを得た。
前記の方法によって得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、ファルマシア社製ＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを得た。
【００６６】
より詳しくは、オリゴｄＴプライマーを前記ｍＲＮＡのポリＡ部分にアニールさせ、逆転写酵素（ＭｕｒｉｎｅＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）により、１本鎖ＤＮＡを合成し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１により、２本鎖ｃＤＮＡとして合成した。
得られた前記ｃＤＮＡの両端にＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩアダプターを付加するため、Ｔ４ＤＮＡライゲース処理およびポリヌクレオチドキナーゼ処理を行ない、両端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡを得た。
【００６７】
（４ー２）インビトロパッケージング反応
得られた両端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡをクローニングベクターであるλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ処理λＺＡＰＩＩを含むλＺＡＰＩＩクローニングキット）のＥｃｏＲＩ間にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。
ライゲーション反応溶液１ｍｌをＧｉｇａｐａｃｋＩＩＧｏｌｄｐａｃｋａｇｉｎｇｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によりパッケージングを行った。
【００６８】
パッケージングした組換えバクテリオファージを含むパッケージング溶液と大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅを３７℃で１５分間培養した。
これを２〜３ｍｌのトップアガー（４８℃）に加えＮＺＹアガープレートへプレーティングして、３７℃で１夜培養した。
１５０ｍｍＮＺＹプレートには約５０，０００個のプラークを培養し、１０枚のプレートにまいて、約５ｘ１０ ^５／個のプラークをスクリーニング用に用いた。
【００６９】
（５）クローンの単離
（５ー１）スクリーン用フィルタの調製
ＮＺＹプレートを４℃で２時間冷却し、このプレート上にナイロンフィルタ（アマシャム社、ハイボンドＮ＋）をのせ、２分間放置した。
これをはがしてフィルターペーパ上で乾燥し、紫外線照射により固定してスクリーニング用フィルターを調製した。
これを用いて以下のハイブリダイゼーションを行った。
【００７０】
（５ー２）ハイブリダイゼーションのためのプローブは（１）で得られたＤＮＡプローブを、ランダムプライムラベリング法（タカラ社；ランダムプライマＤＮＡラベリングキットＶｅｒ．２）で^３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム社）標識したものを使用した。
プレハイブリダイゼーション溶液として、５ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ０．１５Ｍ，クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）０．０１５Ｍ），５０％フォルムアミド、１ｘｄｅｎｈａｒｄｔ（ウシ血清アルブミン（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．２％，ポリビニルピロリドン０．２％，Ｆｉｃｏｌｌ４０００．２％）溶液、０．１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用いた。
【００７１】
フィルターは４２℃、３時間、プレハイブリダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダイゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った。
以上の操作により９個のポジティブクローンが得られた。
【００７２】
（６）ｉｎｖｉｖｏｅｘｃｉｓｉｏｎ（きりだし）による大腸菌組換え体の作成
（５ー２）で得られたアガープレート中のポジティブＺＡＰファージクローン９個のプラークの中心をそれぞれ竹くしでつき、５００ μｌのＳＭ緩衝液と２０μｌのクロロフォルム混合液中に溶出し、ボルテックスをした後、一夜放置した。
大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ２００ μｌとポジティブファージクローン２００ μｌ（＞１ｘ１０ ^５ファージパーティクル）、ヘルパーファージＲ４０８１ μｌ（＞１ｘ１０ ^６ｐｆｕ／ｍｌ）を５０ｍｌチューブにて混合し３７℃、１５分間で、ＺＡＰとヘルパーファージを感染させた。
【００７３】
５ｍｌの２ｘＹＴ培地（１０ｇＮａＣｌ，１０ｇＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ，１６ｇＢａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ／１ｌ）を加え、３７℃で３時間振とう培養し、大腸菌よりファージミドを分泌させた。
７０℃で２０分間熱処理した後、４０００ｇで５分間遠心し、菌体を死滅させた。
上清のファージミドを別の試験管に移した。
この上清にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）粒子が含まれており、この上清２００ μｌあるいは１００倍に希釈した溶液２０μｌとＸＬ−１Ｂｌｕｅ２００ μｌ（ＯＤ６００＝１．０）を混合し３７℃で１５分間混合し感染させた。
【００７４】
１〜１００ μｌの培養液をＬＢ／Ａｍｐプレートにプレーティングした後、３７℃で一晩培養した。
インサートＤＮＡを含む２本鎖のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）をもった大腸菌（ＸＬ−１Ｂｌｕｅ）形質転換体のコロニーが現われた。
これらポジティブクローンの大腸菌を培養後プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐＰｌａｓｍｉｄキット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて調製し、制限酵素ＮｏｔＩで切断して、そのうち最も長いインサートをもつクローンについて以下のＤＮＡ塩基配列の決定を行った。
【００７５】
（７）塩基配列の決定
前記で得られたクローンの塩基配列を、パーキンエルマー社製ＤＮＡシークエンサー３７３Ａを用い、Ｔａｑサイクルシークエンシング法により決定した。
得られたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの塩基配列の解析結果を図１に示す。
決定した塩基数は７６３残基で、オープンリーディングフレームは７１７残基であり、２３９個のアミノ酸がコードされている。
計算上の分子量は２７０７２であり、等電点は、５．３３である。
図１の下線部は、（２ー２）記載の牛より精製したプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βから決定されたペプチドシークエンスと相同性のある部分を示すものである。
【００７６】
（８）ラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの遺伝子配列の解析
ラット肝癌細胞株Ｈ４ＴＧ（ＡＴＣＣから入手可能）から、ｃＤＮＡライブラリーを（４）記載の方法と同様に調製し、約５ｘ１０ ^５／個のプラークをスクリーニング用に用いた。
（５）記載の方法と同様にして、５個のクローンを単離して、（６）記載のｉｎｖｉｖｏｅｘｃｉｓｉｏｎ（きりだし）による大腸菌組換え体の作成を行い、（７）記載の方法と同様にして塩基配列の決定を行った。
【００７７】
得られたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの塩基配列の解析結果を図２に示す。
決定した塩基数は７５４残基で、オープンリーディングフレームは７１４残基であり、２３８個のアミノ酸がコードされている。
計算上の分子量は２６７９１であり、等電点は、５．２８である。
【００７８】
図２の下線部は、（２ー２）記載の牛より精製したプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βから決定されたペプチドシークエンスと相同性のある部分を示すものである。
なおこのラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの０．７５ｋｂのインサートをもつ大腸菌ＢＬ−２１形質転換体についてはＰＲＯ／ＢＬ−ｒＰＡ２８と命名して、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年５月２５日に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭＰ−１４９３８）。
【００７９】
（９）ラットおよびヒト間でのプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのホモロジー
図３のホモロジーアライメントの結果に示されるように、ヒトおよびラット間では、ホモロジーが高く、８９％のホモロジーがあった。これらの結果から、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βは種間で高く保存されていることがわかった。
【００８０】
（実施例２）プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリヌクレオチドの発現解析
（１）プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いて、各種ヒト臓器でのｍＲＮＡ発現量のノザンブロット分析を行った。
プローブとしては、実施例１（４）で得られた組み換え体を使用し、プラスミドＤＮＡを大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅより、ＱＩＡｗｅｌｌＰｌａｓｍｉｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて調製した。このプラスミドを制限酵素Ｎｏｔ１（タカラ社）で処理後、２％アゲロースゲル電気泳動で分離して、１．４ｋｂｐのサブユニットＰ４５のプローブをＱＩＡｑｕｉｃｋＧＥＩＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で調製した。
【００８１】
これをマルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）で３２Ｐ標識してプローブとして用いた。
フィルターは、各種ヒト臓器（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）より抽出したｍＲＮＡ（２μｇ）がブロットされたポジチィブチャージドナイロンフィルター（ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ，クローンテック社）を用いた。
プレハイブリダイゼーション溶液として、５ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ０．１５Ｍ，クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）０．０１５Ｍ），５０％フォルムアミド、１ｘｄｅｎｈａｒｄｔ（ウシ血清アルブミン（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．２％，ポリビニルピロリドン０．２％，Ｆｉｃｏｌｌ４０００．２％）溶液、０．１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用いた。
【００８２】
フィルターは４２℃、３時間、プレハイブリダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダイゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った。
フィルターは２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４２℃、１５分間で４回洗浄し、さらに１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで３０分間１回洗浄した。
【００８３】
オートラジグラフィーは、ＫｏｄａｋＸＡＲ−５フィルムを用いて、−７０℃で行った。
オートラジオグラフィーの結果、図４に示すように、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βは、約０．９ｋｂのｍＲＮＡと反応し、その発現量は、心臓、骨格筋で高く、腎臓、肺では低い発現であることが明確に定量可能であり、本発明のプローブを用いることにより、ｍＲＮＡ発現量を測定することが可能である。
【００８４】
（２）（１）と同条件で、ヒト腎臓癌由来株化細胞、ＫＰＫー１細胞のインターフェロンーγ添加によるノザンブロット分析を行った。ＫＰＫー１細胞は１０ｃｍシャーレで培養した。培養液は、１０％仔牛胎児血清を含むＤＭＥ培養液を用い、これにヒトインターフェロンーγ（５００Ｕ／ｍｌ）を添加して、経時的（０、１２、２４、３６、４８時間後）に細胞を回収しトータルＲＮＡを得た。各トータルＲＮＡ１０ μｇを用いて、ナイロンメンブランフィルター（アマシャム社、ＨｙｂｏｎｄＮ＋）を作成し、（１）と同じプローブを用いて、ノザンブロット解析を行った。その結果、図５に示すように、ＰＡ２８βはインターフェロンーγ添加１２時間後から強く誘導されていることが判明した。従って、ヒトにおいて免疫系の異常による疾患等により、インターフェロンーγが誘導されたような状態の際に、ＰＡ２８βを測定することにより、診断が早期に可能となると考えられる。
【００８５】
（実施例３）プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βポリペプチドの発現解析
（１）プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βに反応するポリクローナル抗体の作製
ヒトおよびラットで共通し、他のサブユニットとホモロジーのない部分であるプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのＮ末端側付近、３番目から１７番目の１５アミノ酸（ＫＰＣＧＶＲＬＳＧＥＡＲＫＱＶＥ）を選択し、このペプチドをＦ−Ｍｏｃ法（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９，Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．著）により、パーキンエルマー社製ペプチド合成機４３３Ａを用いて合成した。
【００８６】
合成したポリペプチドの脱保護および精製は、抗ペプチド抗体実験プロトコール、大海忍他著、秀潤社、２５− ４６ページに記載の方法で行った。
なお脱保護後のペプチドの精製はＣ_１８ＯＤＳカラム（島津ＳｙｎＰｒｏＰｅｐカラム、４．６ｘ１５０ｍｍ，０．１％ＴＦＡ，０−８０％アセトニトリルグラジエント）を用いた。
（２）前記ペプチドにヘモシアニン（ＫＬＨ）をイムジェクトアクチベイテッドイムノグロビンコンジュゲイションキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて結合させ、ペプチドとＫＬＨとの複合体を前記のキット中のカラムにより調製した。
（３）初回約１５０μｇをフロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ、キャペル社）とともにエマルジョンにし、ラビット（ジャパニーズホワイト）の背中に免疫した。その後２週間おきに３回不完全アジュバント（ＦＩＡ）により同様に免疫した。
初回免疫後、７、８、９週目にＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定し、抗体価の上昇を確認後全採血を行なった。
（４）ウサギ血液は、室温で３時間静置後、セパラピッドチューブ（積水化学）にアプライし、３０００回転で３０分間の遠心によりプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βに対する血清を得た。
【００８７】
（５）ヒト腎臓癌由来株化細胞、ＫＰＫー１を実施例２（２）と同様にして、インターフェロンーγ添加によるイムノブロット分析を行った。ＫＰＫー１細胞にヒトインターフェロンーγ（５００Ｕ／ｍｌ）を添加して、経時的（０、４８時間後）に細胞を回収し、ソニケーションして、細胞蛋白を得た。各蛋白５０ μｇを用いて、電気泳動後、ＰＶＤＦメンブランにトランスファーし、（３）の抗体を２００倍希釈して、ＥＣＬ（アマシャム社）を用いて、イムノブロット解析を行った。その結果、図６に示すようにプロテアソームアクチベーター抗体が２８ｋＤａのバンドを認識して反応することが明かとなり、またＰＡ２８βはインターフェロンーγ添加により、強く誘導されていることが判明した。従って、ヒトにおいて免疫系の異常による疾患等により、インターフェロンーγが誘導されたような状態の際に、ＰＡ２８βの蛋白量を測定することにより、診断が早期に可能となると考えられる。
【００８８】
【発明の効果】
プロテアソームアクチベーターを構成する個々のサブユニットのポリペプチドのアミノ酸配列、およびそれぞれのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより、抗体による免疫反応による方法、さらに相補的ポリヌクレオチドを利用する方法で、各種疾患等の診断および治療が可能となる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの決定された塩基配列と塩基配列から推定したアミノ酸配列（ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの１次構造）を示す図（下線は、ペプチドシークエンスの結果得たアミノ酸配列と相同性のある部分を示す）である。
【図２】実施例１で得られたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの決定された塩基配列と塩基配列から推定したアミノ酸配列（ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの１次構造）を示す図（下線は、ペプチドシークエンスの結果得たアミノ酸配列と相同性のある部分を示す）である。
【図３】ラットおよびヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのホモロジーアライメントの比較結果を示す図である。
【図４】ヒトプロテアソームアクチベーターの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いた各種ヒト臓器でのｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果を示す図である。
【図５】ヒトプロテアソームアクチベーターの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いたＫＰＫ−１細胞でのインターフェロンーγ誘導によるｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果を示す図である。
【図６】ヒトプロテアソームアクチベーターの抗体を用いたイムノブロットの結果を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a proteasome activator, and more particularly to a polypeptide of the proteasome activator and a gene encoding the polypeptide.
[0002]
[Prior art]
The proteasome is also called a multifunctional protease, and is the main enzyme that forms an energy-dependent proteolytic system that is localized in the cell in an inactive form. This enzyme is widely present in eukaryotes from yeast to humans and is present in all tissues, and in the liver, it accounts for 1% of the total soluble protein.
The enzyme has a plurality of catalytic active sites in the same molecule, and is a synthetic peptide containing a basic amino acid that is a substrate for trypsin-type enzyme, a neutral amino acid that is a substrate for chymotrypsin-type enzyme, and an acidic amino acid that is rare as a protease. There is activity to cleave the peptide bond at the carboxy terminus.
However, since none of the various known inhibitors act specifically and effectively, the enzyme is presumed to have a different catalytic active site than known proteases.
Moreover, the sedimentation coefficient is 20S and the molecular weight is estimated to be about 750,000, which is exceptionally large as a protease.
[0003]
Such proteasome is a main enzyme in the non-lysosomal proteolytic pathway, and is presumed to have various physiological actions such as functional control by protein modification and regulation of protein turnover.
Furthermore, recently, the proteasome is considered to be an endogenous antigen processing enzyme, and has attracted attention.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The proteasome was found as such a 20S type complex.
Furthermore, the present inventor recently found that a large number of regulatory factors are reversibly bound to the 20S proteasome to form a huge complex having a molecular weight of about 2 million and a sedimentation coefficient of 26S, and is named 26S proteasome. (JP-A-5-292964, JP-A-6-022759). Moreover, the activity of the 20S proteasome is promoted by the combination of these many regulatory factors.
However, the regulatory factor group that activates the proteasome is disclosed only in the 26S proteasome regulatory factor group, and details on other activators, ie, proteasome activators, are not disclosed. Clearly, there is a strong demand to establish diagnosis and treatment methods for various pathological conditions.
[0005]
In view of this situation, the present inventor has conducted extensive research on the structure and function of individual subunits that are constituents of the proteasome activator, and as a result, has clarified the novel proteasome activator. The present invention has been completed.
That is, an object of the present invention is to clarify the component of a proteasome activator and clarify its function, and to provide an amino acid sequence of the polypeptide of the proteasome activator.
Another object of the present invention is to provide a base sequence of a gene encoding a polypeptide that is a constituent component of the proteasome activator.
Furthermore, an object of the present invention is to elucidate the function of the proteasome activator and provide a method for diagnosing and treating various disease states including immune diseases.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have conducted detailed studies on the structure and function of individual subunits that are constituents of the proteasome, and as a result, proteasome activators that are constituents of the proteasome. Clarified about beta.
Furthermore, it has become possible to provide diagnosis and treatment methods for various pathological conditions based on the above findings.
That is, the present invention comprises identifying the proteasome activator and determining the amino acid sequence of the polypeptide, and further determining the base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide.
[0007]
Furthermore, the present invention makes it possible to produce a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a proteasome activator polypeptide, and to use this to quantify the expression level of proteasome activator mRNA in various human organs. It can be used for diagnostic methods such as immune diseases.
[0008]
Furthermore, in the present invention, antibodies against various proteasome activators can be prepared, and by using these antibodies, proteasome activators in various cells can be quantified and can be used for diagnostic methods such as immune diseases. Is.
[0009]
More specifically, the present invention relates to a polypeptide of human proteasome activator PA28β characterized in that it contains at least the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the molecule, and further a polypeptide encoding the amino acid sequence. It concerns nucleotides.
[0010]
Furthermore, the present invention relates to a polynucleotide of human proteasome activator PA28β characterized in that the molecule contains at least the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
[0016]
Furthermore, the present invention relates to a polypeptide comprising at least 15 consecutive amino acids, which is an amino acid sequence constituting the polypeptide described in SEQ ID NO: 1.
[0022]
The present invention also provides a recombinant plasmid transformed with a recombinant plasmid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide of human proteasome activator PA28β, wherein the molecule contains at least the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. It relates to microbial cells or E. coli.
[0024]
The present invention will be described in detail below.
(Polypeptide of human proteasome activator PA28β)
The amino acid sequence of the polypeptide of human proteasome activator PA28β deduced from the polynucleotide encoding the polypeptide of human proteasome activator PA28β whose base sequence was determined by the method described below is as shown in SEQ ID NO: 1. is there.
Further, the polypeptide of the human proteasome activator PA28β according to the present invention is a polypeptide in which methionine is not bound to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the human proteasome activator PA28β to the N-terminus of the amino acid sequence. It also includes intermediates in which part or all of the signal peptide for is bound or deleted.
[0025]
Moreover, it is possible to change a part of the structure of DNA encoding a polypeptide without changing the main activity of the polypeptide by natural mutation or by artificial mutation.
The polypeptide of the human proteasome activator PA28β of the present invention includes a polypeptide having a structure corresponding to a homologous variant having the amino acid sequence.
[0026]
(Polypeptide of rat proteasome activator PA28β)
The amino acid sequence of the polypeptide of rat proteasome activator PA28β deduced from the polynucleotide encoding the polypeptide of rat proteasome activator PA28β whose base sequence was determined by the method described below is as shown in SEQ ID NO: 3. is there.
The polypeptide of rat proteasome activator PA28β according to the present invention is a polypeptide in which methionine is not bound to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the rat proteasome activator PA28β to the N-terminus of the amino acid sequence. An intermediate in which part or all of the signal peptide is bound or deleted is also included.
[0027]
Moreover, it is possible to change a part of the structure of DNA encoding a polypeptide without changing the main activity of the polypeptide by natural mutation or by artificial mutation.
The polypeptide of the rat proteasome activator PA28β of the present invention also includes a polypeptide having a structure corresponding to the homologous mutant having the amino acid sequence.
[0028]
(Purification of proteasome activator)
The proteasome activator of the present invention can be purified by combining various chromatographies. For example, from bovine red blood cells, J. Biol. Chem. In accordance with the method described in 267, 10515-10523, 1992, separation and purification with Sephacryl S-300, DEAE-Sephacel, Hydroxyapatite column, and Phenyl-Sepharose CL-4B are possible after precipitation with ammonium sulfate.
In addition, as an assay method for proceeding with the purification, it can be carried out by examining whether there is an activity to activate the protease activity of the 20S proteasome.
[0029]
The purified proteasome activator is obtained by SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE, Antibodies A Laboratory Manual, by Harlow David lane, Cold Spring Harbor laboratory, 636-640, 1988, O Dimension, 1988, 1988, 1988, 1988) After separation by electrophoresis (J. Biol. Chem. 250, 4007-4021, 1975), when the gel is stained with Coomassie, a band with a molecular weight of 28 kDa is observed.
[0030]
(Isolation of proteasome activator)
In order to isolate a proteasome activator from the band obtained by SDS-PAGE or two-dimensional electrophoresis, it is possible to select a band having a molecular weight of about 28 kDa. Furthermore, it is possible to transfer the proteasome activator separated and identified by electrophoresis to polyvinylidene difluorodide (PVDF) or the like.
[0031]
(Create probe)
After the above treatment, a mixture of polypeptide fragments is obtained by various enzyme treatments such as lysyl endopeptidase, and the obtained mixture of peptide fragments is separated by high performance liquid chromatography.
The amino acid sequences of some of the polypeptide fragments obtained above can be determined using an automatic amino acid sequencer or the like.
Based on the partial information of the amino acid sequence obtained by the above analysis, the probe required for the polynucleotide search is selected from the obtained polypeptide fragments with a low degeneracy frequency and corresponds to this. It is possible by synthesizing and making as a complementary polynucleotide.
[0032]
In addition, when a plurality of amino acid sequences are obtained, the corresponding complementary polynucleotides are combined, and a PCR method (for example, Michael A. Innis et al., Ed., Translated by Takashi Saito, using human cDNA as a template, It is possible to obtain DNA fragments with longer fragments according to the PCR Experiment Manual, HBJ Publishing Bureau (1991).
As described above, a DNA probe for screening a proteasome activator is obtained.
[0033]
(Preparation and screening of complementary DNA library)
In the present invention, a cDNA library for screening a polynucleotide encoding a polypeptide can be prepared by a general method, for example, by the following steps.
[0034]
That is, (i) separating messenger RNA (mRNA) from proteasome producing cells,
(Ii) synthesizing a single-stranded complementary strand polynucleotide (cDNA) and then a double-stranded polynucleotide from the mRNA;
(Iii) incorporating the double-stranded polynucleotide into a plasmid or phage;
(Iv) transforming a suitable host cell with the resulting recombinant plasmid or phage;
(V) After culturing the obtained transformant, a plasmid or phage containing the target polynucleotide is isolated from the transformant by an appropriate method such as colony hybridization or plaque hybridization,
(Vi) excising the polynucleotide of interest from the plasmid or phage;
(Vii) subcloning the cloned polynucleotide into an appropriate plasmid.
[0035]
Each step will be described in more detail.
Step (i): mRNA encoding a proteasome activator polypeptide is derived from various animal tissues, organs, producing cells, more specifically liver, kidney, heart, brain, lung, thymus, liver cancer cells. Strains, kidney cancer cell lines and the like.
In addition, as a method for preparing total RNA from the enzyme-producing cells, the guanidinium / cesium chloride method (Guanidium / Cesium Chloride method, Maniatis, T., Frisch EF, and Sambrook, J., Molecular Cling Singing). Laboratory Press, 194-196, 1982) and the guanidinium thiocyanate method (Chomczynski, P. et al., Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987) are generally used.
[0036]
The separation and purification of mRNA from the total RNA obtained by the above operation is performed by, for example, an adsorption column method or batch method using oligo dT-cellulose (Collaborative Research) or Oligotex-dT30 (Takara). Can be implemented.
Step (ii): Using the thus obtained mRNA as a template, using reverse transcriptase, for example, Okayamarberg method (Okayama, H. and Berg, P., Molecular and Cellular Biology, 3, 280, 1983) Then, cDNA is synthesized according to the method of Gubler and Hoffman (Gubler, V. and Hoffman, BJ, Gene, 25, 263-269, 1983).
[0037]
Step (iii): The obtained cDNA is incorporated into a plasmid or phage to prepare a library of cDNA.
Examples of plasmid vectors into which cDNA is incorporated include PBR322 (Gene, 2, 95, 1977), PBR325 (Gene, 4, 121, 1978), PUC12 (Gene, 19, 259, 1982), PUC13 (Gene, 19, 259). , 1982), PUC18 (Gene, 33, 103, 1985), PUC19 (Gene, 33, 103, 1985), PUC118 (Methods in Enzymology, 153, 3, 1987), PUC119 (Methods in Enzymology 3, 1987) ), Bluescript II (Nucleic Acids. Res., 17, 9494, 1989) and the like. As long as they are manufactured held, all of which can be used.
[0038]
Examples of phage vectors that incorporate cDNA include, for example, λgt10 (Huynh, TV, Young, RA and Davis, RW, DNA cloning, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1, 49. , 1985), λgt11 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 1194, 1983) or λZAPII (Nucleic Acids. Res., 17, 9494, 1989), etc. can be used. However, other vectors may be used as long as they can be propagated in an appropriate host.
As a method for incorporating cDNA into a phage vector, see, for example, Hyunh, T .; V. (DNA cloning, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1, 49, 1985) and the like can be used.
[0039]
Step (iv): The plasmid or phage vector obtained by the above method is introduced into an appropriate host such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, etc. This can be transformed.
Examples of a method for transforming a host with a plasmid vector include an electroporation method or a calcium chloride method described in literature (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.74-1.84, 1989). The phage vector can be introduced into, for example, grown E. coli using an in vitro packaging method.
[0040]
Step (v): In order to select the cDNA of the desired proteasome activator from the cDNA obtained by the above method, for example, colony hybridization using a labeled probe or plaque hybridization (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press) , 1.85-1.104 or 2.112-2.120, 1989) can be used.
The polynucleotide used as a probe in the above hybridization may be any polynucleotide as long as it is a polynucleotide comprising at least 12 bases that hybridizes with a proteasome activator. For example, an oligonucleotide chemically synthesized based on the amino acid sequence of the proteasome activator Alternatively, cDNA encoding other components of the proteasome, genomic DNA, chemically synthesized DNA, partial DNA thereof, and the like can be used.
[0041]
Furthermore, cDNA, genomic DNA, chemically synthesized DNA, and partial DNAs encoding other components of the proteasome can be used as long as they can hybridize with the subunit.
As described above, a polynucleotide encoding a proteasome activator can be prepared.
[0042]
(Determination of the base sequence of proteasome activator PA28β)
The determination of the base sequence of the cDNA obtained according to the above can be performed by, for example, the Maxam-Gilbert method (Methods in Enzymology, 65, 499-560, 1980), the dideoxy method (Messing, J. et al., Nucleic). Acids Research, 9, 309, 1981), Taq cycle sequencing method using a fluorescent dye, etc. (Biotechniques, 7, 494-499, 1989).
The determined nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the polypeptide of the human proteasome activator PA28β is represented as shown in SEQ ID NO: 2, for example. The nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the polypeptide of rat proteasome activator PA28β is represented as shown in SEQ ID NO: 4, for example.
[0043]
The polynucleotide according to the present invention includes a polynucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 and having a base sequence in which ATG is not bound to the 5 ′ end.
The above polynucleotides of the present invention also include DNA comprising a 5 ′ flanking polynucleotide encoding part or all of the signal peptide of the proteasome activator PA28β.
Furthermore, it is possible to mutate part of the structure of the polynucleotide and the structure of the polypeptide deduced therefrom without altering the main activity by natural mutation or by artificial mutation.
Therefore, the polynucleotide according to the present invention contains a base sequence encoding a polypeptide having a structure corresponding to a homologous isomer of all the aforementioned polypeptides.
[0044]
Furthermore, according to the degeneracy of the genetic code, at least one base of the polynucleotide base sequence can be replaced with another type of base without changing the amino acid sequence of the polypeptide produced from the polynucleotide.
Accordingly, the polynucleotide of the present invention also contains a base sequence converted by substitution based on the degeneracy of the genetic code. In this case, the deduced amino acid sequence matches the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the case of humans and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the case of rats. .
[0045]
In addition to the above-described method, a polynucleotide comprising a cDNA encoding the polypeptide of the proteasome activator PA28β of the present invention can be obtained by cloning from a library of genomic DNA such as human, rat and mouse.
These cDNA and genomic DNA encoding the proteasome activator PA28β can be used as they are or after being cleaved with a restriction enzyme depending on the purpose.
[0046]
As shown in FIG. 1, the cDNA structure of human proteasome activator PA28β obtained according to the present invention is composed of 763 residues, the open reading frame is 717 residues, and encodes 239 amino acids.
The calculated molecular weight is 27072 and the isoelectric point is 5. 33.
[0047]
Further, as shown in FIG. 2, the cDNA structure of rat proteasome activator PA28β obtained by the present invention is composed of 754 residues, the open reading frame is 714 residues, and encodes 238 amino acids.
The calculated molecular weight is 26791 and the isoelectric point is 5. 28.
[0048]
(Measurement method for diagnosis of immune diseases)
The proteasome activator PA28β is strongly induced by interferon-γ called immune interferon as shown in Example 2.
Further, a homology search of the human proteasome activator PA28β of the present invention revealed that the autoantibody antigen protein Ki-Antigen (Clin. Exp.) Was found in a patient with systemic lupus erythematosus (SLE), which is a typical autoimmune disease. Immunol. 79, 209-214, 1990) was found to have 40% homology.
[0049]
Therefore, using the obtained polynucleotide as a probe provides an effective means for diagnosing various diseases including immune diseases. That is, by using the complementary strand polynucleotide of the proteasome activator obtained in the present invention as a probe, the mRNA expression level of various human organs can be analyzed, for example, by Northern blot analysis or RT-PCR analysis (for example, Michael A. Innis et al., ed., supervised by Takashi Saito, PCR experiment manual, HBJ Publishing Bureau, 1991) can be quantitatively measured, and provides diagnostic means for the various diseases.
Furthermore, by examining the genetic polymorphism of the proteasome activator PA28β, the association with various diseases can be clarified and it can be effectively used for polynucleotide diagnosis.
[0050]
In addition, a polyclonal or monoclonal antibody against the proteasome activator PA28β obtained in the present invention can be prepared (see, for example, Antibodies, A Laboratory Manual, Ed., Harlow et.al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). It is possible according to the method described). The polypeptide used as an antigen when preparing a monoclonal antibody may be composed of at least 4 amino acids. An immunoassay using the obtained antibody provides a means for quantitatively measuring changes in the proteasome activator in various cells.
[0051]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
(Example 1) Determination of gene sequence of proteasome activator
Preparation of proteasome activator
(1) Probe preparation
(1-1) Preparation of starting material
From the bovine blood or heart cells, the proteasome activator is Biol. Chem. 267, 10515-10523, 1992. However, 10 mM leupeptin (SIGMA) and 2.5 mM 4- (2-aminoethyl) benzene-sulfonyl fluoride (SIGMA) are added to buffers as a protein degradation inhibitor in order to prevent protein degradation during the purification process. There is a need.
[0052]
The outline of purification is as follows. Bovine blood was collected in the presence of heparin, centrifuged at 2000 × g for 1 hour to collect red blood cells, and the resulting precipitate was washed by suspending in 4 volumes of phosphate buffer, reprecipitation, and DE52 ( DEAE cellulose, Whatman) is added to prepare a bound fraction, and after ammonium sulfate precipitation, purification by column chromatography of Sephacryl S-300, DEAE Sephacel, Hydroxyapatite, Phenyl-Sepharose CL-4B (10 × 25 cm) is performed.
(1-2) Method for measuring active fraction
The proteasome activator activity can be measured by measuring whether the 20S proteasome and the protein of each step of purification are mixed to promote the peptidase activity of the 20S proteasome. The reaction consists of Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (synthetic substrate for measuring chymotrypsin-like activity), 50 mM, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM dithiothreitol (DTT), 20S proteasome. And purification was performed at a final volume of 1000 μl with the addition of protein at each stage. This reaction solution was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and fluorescence was measured.
If the control factor group has an activate activity, the activity of decomposing the synthetic substrate by the 20S proteasome increases, so that the active fraction can be identified.
[0053]
(2) Determination of amino acid sequence of proteasome activator
(2-1) Isolation of proteasome activator
The proteasome activator fraction having a molecular weight of about 28 kDa obtained by the treatment of (1) was separated using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-300 C8 column 2.1 × 100 mm, PERKIN ELMER, Model 130A) under the following conditions. did.
Separation conditions:
Flow rate 50 μl / min,
Solvent A, 0.06% trifluoroacetic acid (TFA); Solvent B, 0.05% TFA / 70% acetonitrile / 30% water.
[0054]
The column was equilibrated with a mixed solvent consisting of A (64%) and B (0%), and eluted with a gradient using B solvent from 0 to 70%.
[0055]
Detection was performed at a wavelength of 214 nm, and the peak fraction was dried with a speed-back concentrator (Savant Instruments). As a result, since two peaks were observed, the following operation was performed on the fraction eluted in the latter half.
[0056]
(2-2) Separation by electrophoresis
The obtained dried sample was dissolved in SDS sample buffer and separated by 10% SDS-PAGE (Cold Spring Harbor laboratory, 636-640, by Antibodies A Laboratory Manual, Harlow David lane). The gel after electrophoresis was transferred to Immobilon-PVDF membrane (Millipore) using a semi-dry electroblotting apparatus.
The membrane filter on which the protein was blotted was washed with distilled water, stained with Coomassie Blue staining solution (40% methanol containing 10% acetic acid solution containing 0.2% Coomassie Brilliant Blue R250), and then decolorized solution (60% methanol solution). ) And shaken to decolorize the background.
[0057]
A spot at a position of about 28 Da on the membrane was cut out and in situ treated with L-1-tosylamido-2-phenyl chloromethyl-treated trypsin (Worthington Enzymes) or Lys-C protease (Boehringer Mannheim). The produced peptides were separated and purified by HPLC (Perkin Elmer) (flow rate 50 μl / min, 0.1% TFA as a solvent, gradient with 0-70% acetonitrile, RP300 column (2.1 × 100 mm)).
Some of the obtained polypeptide fragments were analyzed with a peptide sequencer (Protein Sequencer Type 497 analyzer manufactured by PerkinElmer).
[0058]
The amino acid sequences of the following two types of peptide fragments were determined by the above amino acid analysis.
Fragment 1; QVEVFR
Fragment 2; QNLFQEAEEFLYR
Fragment 3; FLPQK
Fragment 4; IIYLNQLLQEDSFFNVTDLNSLR
Fragment 5; APLDIPIPDPPPKDDEMETD
Fragment 6; TKVEAFQTTISK
Fragment 7; ALVHERDEAVYGDLR
Fragment 8; AMVLDR
Fragment 9; AFYAELYHIISSNLEK
(3) Preparation of cDNA probe
(3-1) Primer synthesis
(Proteasome activator PA28β)
From the sequences of the peptide fragments obtained above, the sequences of fragment 5 to PPKDDEME and fragment 6 to ALVHERDEAV were selected as sequences with low degeneracy.
[0059]
Next, 5′-CGCATAGAG (T / C) GA (T / C) GA (A / G) ATGGA-3 ′ is selected as a forward primer as a complementary oligonucleotide corresponding to these selected polypeptides, and reverse As a primer, 5′-ACTGCCTCGTCTC (G / T) CTCATGTGAGIAGIGC-3 ′ was synthesized with a DNA synthesizer 380B (Applied Biosystems).
The obtained oligonucleotide was purified using an oligonucleotide cartridge (Applied Biosystems).
[0060]
(3-2) Preparation of mRNA for PCR
Total RNA from 5 g of beef liver was separated and purified by the guanidine thiocyanate method (Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987) as follows.
5 g of sample was added to guanidine thiocyanate solution (sol. D solution; 6 M guanidine thiocyanate, 0.5% sarkosyl, 10 mM sodium citrate (pH 7), 100 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% antifoam. The supernatant was obtained by sonication in A), denatured and then centrifuged.
To this was added (1/10) amount of 2M acetic acid and an equal amount of ethanol, and (1/5) amount of chloroformic isoamyl alcohol (49: 1 vol / vol), and left on ice for 15 minutes. Centrifugation at 000 g for 15 minutes at 4 ° C. gave a precipitate.
[0061]
The aqueous phase was transferred to another test tube, an equal volume of isopropanol was added, allowed to stand at −20 ° C. for 1 hour, and centrifuged at 10,000 g for 20 minutes at 4 ° C.
The resulting precipitate was sol. Dissolved in the D solution, added an equal volume of isopropanol, centrifuged, and washed the precipitate with 75% ethanol.
The precipitate is then sol. The suspension was suspended in the solution D, an equal amount of isopropanol was added again, and the mixture was cooled at -20 ° C for 1 hour, and then centrifuged.
The precipitate was collected by centrifugation, washed with 75% ethanol, centrifuged, the supernatant was removed, and this was dissolved in Milli Q treated with DEPC (treated with 0.1% diethylpyrocarbonate for 5 hours and then autoclaved). 54 mg of total mRNA was obtained.
[0062]
From the total RNA obtained by the above treatment, mRNA was obtained using oligo (dT) -latex (Takara Corporation; oligotex-dT30).
That is, a reaction buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.1% SDS) was added to 1 mg of total RNA to make a total volume of 1 ml.
Next, 1 ml of Oligotex-dT30 was added thereto, heat-denatured at 65 ° C. for 5 minutes, and rapidly cooled on ice for 3 minutes.
After adding 0.2 ml of 5M NaCl and stirring, the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was removed.
The pellet was suspended in 2.5 ml of a washing solution (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 100 mM NaCl) and left at 37 ° C. for 10 minutes.
This was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes.
[0063]
The obtained pellet was suspended in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), EDTA 1 mM), heated at 65 ° C. for 5 minutes, and mRNA was eluted from Oligotex-dT30.
The mixture was further centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. To perform ethanol precipitation, 100 μl of 3M NaOAc (sodium acetate, pH 5.6) and 2 ml of cold ethanol were added and left at −80 ° C. for 30 minutes.
Centrifugation was performed at 15,000 rpm for 10 minutes, and the resulting pellet was washed with 70% ethanol and dissolved in 50 μl of TE buffer.
According to this example, 45 μg of mRNA could be obtained from 10 mg of total RNA.
[0064]
(3-3) cDNA synthesis for PCR
Oligo (dT) using the obtained mRNA as a template ₁₅ As a primer, a complementary strand DNA (cDNA) was synthesized (manufactured by Pharmacia, cDNA synthesis kit).
(3-4) Preparation of cDNA probe by PCR
PCR was performed using the cDNA synthesized from the bovine liver mRNA obtained in (3-3) as a template using the reverse primer together with the forward primer obtained in (3-1) (for example, Michael A. Innis). et al., ed., directed by Takashi Saito, PCR Experiment Manual, HBJ Publishing Bureau, 1991).
Each primer concentration was 20 pm / μl, Taq DNA polymerase was 0.025 U / μl, and cDNA was 1 ng / μl for 30 cycles. Amplification was performed using a Perkin Elmer (Citas) DNA thermal cycler to obtain a cDNA probe of about 600 bp.
[0065]
(4) Preparation of cDNA library
(4-1) Preparation of cDNA
Total RNA was isolated from human hepatocellular carcinoma HEPG2 (available from ATCC) by the guanidinium thiocyanate method (Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987) described in (3-2). From the total RNA, 10 μg of mRNA was obtained from HEPG2 cells in the same manner as described in (3-2) using oligo (dT) latex (Takara Corporation; Oligotex-dT30).
CDNA was obtained from the poly (A) + RNA obtained by the above-described method using a TimeSaver cDNA synthesis kit manufactured by Pharmacia.
[0066]
More specifically, an oligo dT primer is annealed to the poly A portion of the mRNA, and single-stranded DNA is synthesized by reverse transcriptase. It was synthesized as a double-stranded cDNA by using E. coli DNA polymerase 1.
In order to add NotI / EcoRI adapters to both ends of the obtained cDNA, T4 DNA ligase treatment and polynucleotide kinase treatment were performed to obtain cDNA having EcoR I restriction enzyme cleavage sites at both ends.
[0067]
(4-2) In vitro packaging reaction
The cDNA having EcoR I restriction enzyme cleavage sites at both ends was inserted between EcoRI of λZAPII (Stratagene, λZAPII cloning kit containing EcoRI / CIAP-treated λZAPII), which is a cloning vector, using T4 DNA ligase.
1 ml of the ligation reaction solution was packaged by Gigapack II Gold packaging extract (Stratagene).
[0068]
A packaging solution containing the packaged recombinant bacteriophage and E. coli XL-1 Blue were incubated at 37 ° C. for 15 minutes.
This was added to 2-3 ml of top agar (48 ° C.), plated on an NZY agar plate, and cultured at 37 ° C. overnight.
About 50,000 plaques are cultured on a 150 mm NZY plate, spread on 10 plates, and about 5 × 10 5 ⁵ / Plaque was used for screening.
[0069]
(5) Isolation of clones
(5-1) Preparation of screen filter
The NZY plate was cooled at 4 ° C. for 2 hours, and a nylon filter (Amersham, High Bond N +) was placed on the plate and allowed to stand for 2 minutes.
This was peeled off, dried on filter paper, and fixed by ultraviolet irradiation to prepare a screening filter.
The following hybridization was performed using this.
[0070]
(5-2) The probe for hybridization is obtained by subjecting the DNA probe obtained in (1) to the random primer labeling method (Takara Corporation; random primer DNA labeling kit Ver. 2). ³² The one labeled with P-dCTP (Amersham) was used.
As a prehybridization solution, 5 × SSC (NaCl 0.15M, sodium citrate (pH 7.0) 0.015M), 50% formamide, 1 × denhardt (bovine serum albumin (Fraction V) 0.2%, polyvinylpyrrolidone 0. 2%, Ficoll 400 0.2%) solution, 0.1% SDS, 200 μg / ml salmon palm DNA.
[0071]
The filter was incubated in a prehybridization solution at 42 ° C. for 3 hours, and then incubated at 42 ° C. for 16 hours in a hybridization solution (a prehybridization solution containing 10% dextran sulfate) to which a labeled probe had been added. Hybridization was performed.
Nine positive clones were obtained by the above operation.
[0072]
(6) Preparation of E. coli recombinants by in vivo excision
The centers of 9 plaques of 9 positive ZAP phage clones in the agar plate obtained in (5-2) were attached with bamboo combs, eluted in 500 μl of SM buffer and 20 μl of chloroform mixture, and vortexed. Later, it was left overnight.
E. coli XL-1 Blue 200 μl and positive phage clone 200 μl (> 1 × 10 ⁵ Phage particles), helper phage R408 1 μl (> 1 × 10 ⁶ pfu / ml) were mixed in a 50 ml tube and infected with ZAP and helper phage at 37 ° C. for 15 minutes.
[0073]
5 ml of 2 × YT medium (10 g NaCl, 10 g Bacto Yeast Extract, 16 g Bactotryptone / 1 l) was added, and cultured with shaking at 37 ° C. for 3 hours to secrete phagemid from E. coli.
After heat treatment at 70 ° C. for 20 minutes, the cells were killed by centrifugation at 4000 g for 5 minutes.
The supernatant phagemid was transferred to another tube.
This supernatant contains pBluescript SK (−) particles. Mix 200 μl of this supernatant or 20 μl of 100-fold diluted solution with 200 μl of XL-1 Blue (OD600 = 1.0) at 37 ° C. Mix for 15 minutes to infect.
[0074]
After 1 to 100 μl of the culture solution was plated on an LB / Amp plate, it was cultured at 37 ° C. overnight.
A colony of an E. coli (XL-1 Blue) transformant having double-stranded pBluescriptSK (-) containing the insert DNA appeared.
After culturing these positive clones of E. coli, plasmid DNA was prepared using a QIAprep Plasmid kit (Qiagen), cleaved with the restriction enzyme NotI, and the clone having the longest insert was determined for the following DNA base sequence.
[0075]
(7) Determination of base sequence
The base sequence of the clone obtained above was determined by Taq cycle sequencing method using Perkin Elmer DNA Sequencer 373A.
The analysis result of the nucleotide sequence of the obtained human proteasome activator PA28β is shown in FIG.
The determined number of bases is 763 residues, the open reading frame is 717 residues, and 239 amino acids are encoded.
The calculated molecular weight is 27072 and the isoelectric point is 5.33.
The underlined portion in FIG. 1 shows a portion homologous to the peptide sequence determined from the proteasome activator PA28β purified from the cow described in (2-2).
[0076]
(8) Analysis of gene sequence of rat proteasome activator PA28β
A cDNA library was prepared from the rat hepatoma cell line H 4TG (available from ATCC) in the same manner as described in (4), and about 5 × 10 ⁵ / Plaque was used for screening.
(5) In the same manner as described in the method, 5 clones were isolated, and E. coli recombinants were prepared by in vivo excision described in (6). Thus, the base sequence was determined.
[0077]
The analysis result of the base sequence of the obtained rat proteasome activator PA28β is shown in FIG.
The determined number of bases is 754 residues, the open reading frame is 714 residues, and 238 amino acids are encoded.
The calculated molecular weight is 26791 and the isoelectric point is 5.28.
[0078]
The underlined portion in FIG. 2 shows a portion homologous to the peptide sequence determined from the proteasome activator PA28β purified from the cow described in (2-2).
The Escherichia coli BL-21 transformant having a 0.75 kb insert of this rat proteasome activator PA28β was named PRO / BL-rPA28 and was assigned to the National Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science, May 25, 1995. Deposited on the day (Accession Number: FERM P-14938).
[0079]
(9) Homology of proteasome activator PA28β between rat and human
As shown in the results of the homology alignment in FIG. 3, the homology was high between human and rat, and there was 89% homology. From these results, it was found that the proteasome activator PA28β is highly conserved among species.
[0080]
(Example 2) Expression analysis of polynucleotide of proteasome activator PA28β
(1) Northern blot analysis of mRNA expression levels in various human organs was performed using a complementary strand polynucleotide of proteasome activator PA28β as a probe.
As the probe, the recombinant obtained in Example 1 (4) was used, and plasmid DNA was prepared from Escherichia coli XL-1 Blue using a QIAwell Plasmid Purification System (QIAGEN). This plasmid was treated with restriction enzyme Not1 (Takara) and then separated by 2% agarose gel electrophoresis, and a 1.4 kbp subunit P45 probe was prepared with QIA quick GEI Extraction Kit (QIAGEN).
[0081]
This was 32P-labeled with a multi-prime DNA labeling system (Amersham) and used as a probe.
The filter is a positive charged nylon filter (Human Multi Tissue Northern Blot, Clontech) blotted with mRNA (2 μg) extracted from various human organs (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas). Was used.
As a prehybridization solution, 5 × SSC (NaCl 0.15M, sodium citrate (pH 7.0) 0.015M), 50% formamide, 1 × denhardt (bovine serum albumin (Fraction V) 0.2%, polyvinylpyrrolidone 0. 2%, Ficoll 400 0.2%) solution, 0.1% SDS, 200 μg / ml salmon palm DNA.
[0082]
The filter was incubated in a prehybridization solution at 42 ° C. for 3 hours, and then incubated at 42 ° C. for 16 hours in a hybridization solution (a prehybridization solution containing 10% dextran sulfate) to which a labeled probe had been added. Hybridization was performed.
The filter was washed 4 times with 2 × SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. for 15 minutes, and further washed once with 1 × SSC, 0.1% SDS for 30 minutes.
[0083]
Autoradiography was performed at −70 ° C. using Kodak XAR-5 film.
As a result of autoradiography, as shown in FIG. 4, proteasome activator PA28β reacts with mRNA of about 0.9 kb, and its expression level is high in heart and skeletal muscle, and low in kidney and lung. The amount of mRNA expression can be measured by using the probe of the present invention.
[0084]
(2) Under the same conditions as in (1), Northern blot analysis of human kidney cancer-derived cell line, KPK-1 cell by addition of interferon-γ was performed. KPK-1 cells were cultured in a 10 cm dish. As the culture solution, a DME culture solution containing 10% fetal calf serum was added, and human interferon-γ (500 U / ml) was added thereto, and the cells were collected over time (after 0, 12, 24, 36, 48 hours). Was recovered to obtain total RNA. Using 10 μg of each total RNA, a nylon membrane filter (Amersham, Hybond N +) was prepared, and Northern blot analysis was performed using the same probe as (1). As a result, as shown in FIG. 5, it was found that PA28β was strongly induced 12 hours after the addition of interferon-γ. Therefore, it is considered that early diagnosis is possible by measuring PA28β in a state in which interferon-γ is induced due to a disease caused by abnormality of the immune system in humans.
[0085]
Example 3 Expression Analysis of Proteasome Activator PA28β Polypeptide
(1) Preparation of polyclonal antibody that reacts with proteasome activator PA28β
Near the N-terminal side of the proteasome activator PA28β, which is common to humans and rats and has no homology with other subunits, the 15th amino acid from 3rd to 17th (KPCGVRLSGEARKQVE) is selected, and this peptide is subjected to F-Moc method (Solid Phase Peptide synthesis, A practical approach, IRL Press, Oxford, 1989, Atherton, E., Sheppard, RC) and synthesized using a peptide synthesizer 433A manufactured by Perkin Elmer.
[0086]
Deprotection and purification of the synthesized polypeptide were carried out by the method described in the anti-peptide antibody experimental protocol, Shinobu Oumi et al.
The peptide after deprotection is purified by C ₁₈ An ODS column (Shimadzu Syn ProPep column, 4.6 × 150 mm, 0.1% TFA, 0-80% acetonitrile gradient) was used.
(2) Hemocyanin (KLH) was bound to the peptide by using an immunoactivated immunoglobin conjugation kit (PIERCE), and a complex of the peptide and KLH was prepared using the column in the kit.
(3) Initially about 150 μg was emulsified with Freund's complete adjuvant (FCA, Capel) and immunized on the back of rabbit (Japanese white). Thereafter, immunization was similarly carried out with incomplete adjuvant (FIA) three times every two weeks.
After the first immunization, antibody titers were measured by the ELISA method at 7, 8, and 9 weeks, and whole blood was collected after confirming the increase in antibody titers.
(4) The rabbit blood was allowed to stand at room temperature for 3 hours, and then applied to a separapid tube (Sekisui Chemical Co., Ltd.), and serum for the proteasome activator PA28β was obtained by centrifugation at 3000 rpm for 30 minutes.
[0087]
(5) Human blot cancer-derived cell line, KPK-1, was subjected to immunoblot analysis by adding interferon-γ in the same manner as in Example 2 (2). Human interferon-γ (500 U / ml) was added to KPK-1 cells, and the cells were collected over time (after 0, 48 hours) and sonicated to obtain cellular proteins. After electrophoresis using 50 μg of each protein, it was transferred to a PVDF membrane, the antibody (3) was diluted 200 times, and immunoblot analysis was performed using ECL (Amersham). As a result, as shown in FIG. 6, it was revealed that the proteasome activator antibody recognizes and reacts with the 28 kDa band, and it was found that PA28β was strongly induced by the addition of interferon-γ. Therefore, in the state where interferon-γ is induced in humans due to a disease caused by an abnormality of the immune system, it is considered that diagnosis is possible at an early stage by measuring the amount of PA28β protein.
[0088]
【The invention's effect】
By determining the amino acid sequence of the polypeptide of each subunit constituting the proteasome activator and the base sequence of the polynucleotide encoding the amino acid sequence of each polypeptide, a method based on an immune reaction by an antibody, and a complementary Diagnosis and treatment of various diseases and the like are possible by a method using nucleotides.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the determined nucleotide sequence of human proteasome activator PA28β obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence (primary structure of human proteasome activator PA28β) (underlined is peptide sequence) Shows a portion having homology with the amino acid sequence obtained as a result of
FIG. 2 shows the determined nucleotide sequence of rat proteasome activator PA28β obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence (primary structure of human proteasome activator PA28β) (underlined is peptide sequence) Shows a portion having homology with the amino acid sequence obtained as a result of
FIG. 3 shows comparison results of homology alignment of rat and human proteasome activator PA28β.
FIG. 4 is a diagram showing the results of Northern blot analysis of mRNA expression levels in various human organs using a complementary strand polynucleotide of a human proteasome activator as a probe.
FIG. 5 shows the results of Northern blot analysis of mRNA expression levels induced by interferon-γ in KPK-1 cells using a complementary polynucleotide of a human proteasome activator as a probe.
FIG. 6 is a view showing the results of immunoblotting using an antibody of human proteasome activator.

Claims

A polypeptide of human proteasome activator PA28β, comprising at least the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the molecule.

A polynucleotide encoding the amino acid sequence according to claim 1.

A polynucleotide of human proteasome activator PA28β, characterized in that it contains at least the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the molecule.

A polypeptide comprising at least 15 consecutive amino acids, the amino acid sequence constituting the polypeptide according to claim 1.

A recombinant microbial cell transformed with a recombinant plasmid comprising the polynucleotide of claim 2.

The microbial cell according to claim 5, wherein the recombinant microbial cell is Escherichia coli.