JP3629634B2

JP3629634B2 - Primer for periodontal pathogen detection

Info

Publication number: JP3629634B2
Application number: JP26041698A
Authority: JP
Inventors: 光央坂本; 義己辨野; 崇中瀬
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2018-09-14
Also published as: JP2000083699A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯周病原菌トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出できるＰＣＲ用プライマーセット、及び該ＰＣＲ用プライマーセットを利用したトレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト口腔スピロヘータは、ヒト口腔内に生息するらせん状のグラム陰性嫌気性細菌で、スピロヘータ目、スピロヘータ科、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）に属する細菌の総称である。ヒトにおいては歯の支持組織である歯肉、歯根膜、歯槽骨及びセメント質が傷害又は破壊される歯周疾患の原因菌の一つと考えられている。口腔スピロヘータは、極めて厳密な栄養要求性をもつため、その培養には高度の嫌気度が必要であり、人工培養に成功した菌種は数少ない。
【０００３】
これまでに人工培養に成功した報告例としては、トレポネーマ・アミロボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａａｍｙｌｏｖｏｒｕｍ）、トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・マルトフィラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｍａｌｔｏｐｈｉｌｕｍ）、トレポネーマ・メディウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｍｅｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）、トレポネーマ・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）及びトレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）が挙げられる。
これらの人工培養可能菌のうち、トレポネーマ・ソクランスキーは、歯周病患者から高頻度に分離される菌種であり、本菌を迅速かつ精度よく検出・同定することは、歯周病の発生機序の解明や歯周病の治療法・予防法を開発する上で非常に重要であると考えられる。
【０００４】
現在のところ、トレポネーマ・ソクランスキーを迅速かつ精度よく検出・同定できる方法は開発されておらず、トレポネーマ・ソクランスキーの培養後、その生理的・生化学的性状に基づいてトレポネーマ・ソクランスキーを検出・同定するほかなかった。しかし、この方法では、トレポネーマ・ソクランスキーの培養に特別な栄養素を添加した特製培地や特別な培養装置が必要であり、さらに、培養後にトレポネーマ・ソクランスキーを検出・同定するために多くの生理的・生化学的性状を調べる必要があるため、多大な労力と時間を要し、精度の点からも問題があった。
そこで、トレポネーマ・ソクランスキーを迅速かつ精度よく検出・同定できる方法の開発が切望されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、トレポネーマ・ソクランスキーを迅速かつ精度よく検出・同定できる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、トレポネーマ・ソクランスキーに属する数種の菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定することに成功した。そして、これらの菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析の結果に基づいて、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株は共通に有するが、トレポネーマ・ソクランスキーに属しない菌株は有しない塩基配列からなる部分、すなわち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分を明らかにした。
【０００７】
そして、この塩基配列に基づいて、トレポネーマ・ソクランスキーの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るプライマーセット作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るＰＣＲ用プライマーセット。
（２）前記プライマーセットの一方のプライマーが、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなる、前記（１）記載のプライマーセット。
【０００９】
（３）前記プライマーセットの一方のプライマーが、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなる、前記（１）記載のプライマーセット。
（４）前記プライマーセットの一方のプライマーが、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列のうちの少なくとも１５塩基部分を含んでなる、前記（１）記載のプライマーセット。
【００１０】
（５）前記プライマーセットの一方のプライマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）により表される前記（１）記載のプライマーセット。
（ａ）配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した塩基配列であって、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列
【００１１】
（６）以下の工程：
（ａ）対象動物からＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無により、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かを判別する工程、
を含んでなることを特徴とする、トレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るＰＣＲ用プライマーセットである。
本発明のＰＣＲ用プライマーセットの各プライマーの塩基配列は、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得る限り、特に限定されない。
【００１３】
ここで、「トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片」とは、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合に増幅されるＤＮＡ断片をいい、「トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得る」とは、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合のみ、増幅断片が得られ、それ以外のものを鋳型とした場合には、増幅断片が得られないことをいう。
【００１４】
本発明のＰＣＲ用プライマーセットとしては、一方のプライマーが、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなり、他方のプライマーがトレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列からなるＰＣＲ用プライマーセットを例示できる。
【００１５】
ここで、「トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分」とは、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株は共通に有するが、トレポネーマ・ソクランスキーに属しない菌株は有しない塩基配列部分をいい、例えば、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分を例示できる。
従って、本発明のＰＣＲ用プライマーの一方のプライマーとしては、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなるものを例示できる。
【００１６】
このようなプライマーの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列に基づいて決定することができる。この際、プライマーの塩基配列に、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列の全部又は一部が含まれるようにする。配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列の一部は、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列のどの部分であってもよく、当該一部の塩基数は特に限定されないが、１５〜３３塩基が好ましく、１８〜２２塩基がさらに好ましい。また、当該一部は、プライマーの塩基配列のどの部分に含まれてもよく、プライマーの塩基配列のうち、当該一部以外の塩基配列は特に限定されない。また、プライマーの塩基数は、１５〜３５塩基とするのが好ましく、１８〜２２塩基とするのがさらに好ましい。また、プライマーのＧＣ含量は、５０〜６０％とするのが好ましく、プライマーのＴｍ値は、５０〜６０℃とするのが好ましい。
【００１７】
配列番号１記載の塩基配列に基づいて決定したプライマーしては、配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるプライマーを好ましいものとして例示できる。
配列番号２記載の塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち、１番目の塩基から２０番目の塩基までの部分と同一の塩基配列である。従って、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーは、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る。また、配列番号２記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるプライマーは、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る。
【００１８】
また、プライマーの塩基配列は、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列である限り、配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列であってもよい。ここで、「１又は複数個の塩基」とは、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る限り、その個数は限定されない。
【００１９】
本発明のＰＣＲ用プライマーセットの一方のプライマーの塩基配列を上記のように決定する場合、他方のプライマーの塩基配列は、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列であればよく、具体的には公知のトレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて決定できる。より具体的には、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する各菌株で保存性の高い部分の塩基配列に基づいて決定できる。このようなプライマーとしては、例えば、配列番号３記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるプライマーを例示できる。
【００２０】
本発明のＰＣＲ用プライマーセットの各プライマーの塩基配列が決定すれば、その塩基配列からなるプライマーは常法に従って合成することができる。
本発明のＰＣＲ用プライマーセットは、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の検出に使用できる。
また、本発明のＰＣＲ用プライマーセットは、以下の本発明のトレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法に使用できる。
【００２１】
本発明のトレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法は、以下の工程：
（ａ）対象動物からＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、上記プライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無により、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かを判別する工程、
を含んでなることを特徴とする。
以下、各工程ごとに説明する。
【００２２】
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、対象動物からＤＮＡを含有する試料を調製する工程である。
ここで、「対象動物」とは、トレポネーマ・ソクランスキー感染の有無を判別しようとする動物を意味する。
対象動物は、トレポネーマ・ソクランスキーに感染し得る動物である限り特に限定されず、いかなる動物であってもよい。このような対象動物としては、例えば、ヒト、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００２３】
ＤＮＡを含有する試料は、例えば、対象動物の唾液、歯垢等から常法に従って調製することができる。例えば、対象動物の唾液や歯垢に市販の界面活性剤を加え、９５℃で５分間加熱した後、冷却し、次いで遠心分離して上清を採取することによりＤＮＡを含有する試料を調製することができる。
調製されたＤＮＡを含有する試料には、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳＲＮＡ遺伝子の他、各種ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製してもよい。
【００２４】
（２）工程（ｂ）
工程（ｂ）は、上記試料に対して、上記プライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程である。
工程（ｂ）におけるＰＣＲは、常法に従って行うことができる。
工程（ｂ）により、試料中にトレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が含まれている場合には、使用したプライマーの塩基配列を両端に有するトレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子由来の増幅断片が得られる。
【００２５】
（３）工程（ｃ）
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無により、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かを判別する工程である。
増幅断片の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動により増幅断片の有無を確認することができる。
増幅断片の有無の確認の結果、増幅断片が存在する場合には、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染していると判別することができる。また、増幅断片の有無の確認の結果、増幅断片が存在しない場合には、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染していないと判別することができる。
【００２６】
対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かをさらに精度よく判別するために、増幅断片がトレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来することを確認することが好ましい。確認する方法としては、例えば、増幅断片を制限酵素で処理して得られる制限断片長多型解析を行う方法が挙げられる。この際使用する制限酵素としては、増幅断片を切断し制限断片長多型を示し得るものであれば特に限定されない。制限酵素は、単独で使用してもよいが、２種以上を組み合わせて使用することが望ましい。増幅断片を制限酵素で処理して得られる制限断片長多型は、例えば、サザンブロット法により検出することができる。
【００２７】
【実施例】
〔実施例１〕トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分の特定
１．トレポネーマ・ソクランスキーに属する数種の菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定
トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株として基準株３菌株と臨床分離株１４菌株を使用し、これらの１７菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。
使用した基準株３菌株を以下に示す。
【００２８】
▲１▼トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）ＪＣＭ８１５７^Ｔ
▲２▼トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｂｕｃｃａｌｅ）ＪＣＭ８１５５^Ｔ
▲３▼トレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．
ｐａｒｅｄｉｓ）ＪＣＭ８１５６^Ｔ
また、使用した臨床分離株１４菌株は、１０４３株、１１４２株、１１６４Ａ株、１１６６株、１２２Ｂ株、１２２Ｃ株、１２６７株、１２８Ｂ株、１２８Ｄ株、１２９２株、３５１株、６７３株、Ｂ４１８株、Ｔ１０株である。
【００２９】
まず、各菌株の培養液（約１．５〜３ｍｌ）を遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）して集菌した。遠心分離により得られるペレットを１００μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁した。次いで、この懸濁液に１００μｌの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、９５℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）を行った。
【００３０】
遠心分離により得られた上清を鋳型ＤＮＡ溶液としてＰＣＲを行い、上記各菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。
ＰＣＲはＴａＫａｒａＥｘＴａｑ（宝酒造）を用いて行った。
【００３１】
ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ溶液５．０μｌ、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ１０．０μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ８．０μｌ、プライマー２７Ｆ１．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、プライマー１４９２Ｒ１．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、Ｈ_２Ｏ７４．５μｌ、及びＥｘＴａｑ０．５μｌで、総容量は１００．０μｌである。なお、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅはＴａｋａｒａＥｘＴａｑのキットに添付されているものを使用した。
ユニバーサルプライマー２７Ｆの塩基配列は、５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号４）であり、ユニバーサルプライマー１４９２Ｒの塩基配列は、５’−ｇｇｔｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’（配列番号５）である。
【００３２】
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰを用いて次のように行った。すなわち、初期変性を９５℃で３分行った後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で１分３０秒を１サイクルとして、これを３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥＣｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．２％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。
【００３３】
増幅が確認されたサンプルをスピンカラムによって精製し、シークエンス反応に供した。シークエンス反応は、ＡＢＩのＢｉｇＤｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＪａｐａｎ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行い、塩基配列解析はＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。
以上のようにして配列決定した各菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を図１〜８に示す。図１〜８の各図において、中段に示す塩基配列は上段に示す塩基配列の続きであり、後段に示す塩基配列は中段に示す塩基配列の続きである。また、図２は図１の続きであり、同様に図３は図２の、図４は図３の、図５は図４の、図６は図５の、図７は図６の、図８は図７の続きである。また、図１〜８中、「ＴＳ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）ＪＣＭ８１５７^Ｔを表し、「ＴＢ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｂｕｃｃａｌｅ）ＪＣＭ８１５５^Ｔを表し、「ＴＰ」はトレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｐａｒｅｄｉｓ）ＪＣＭ８１５６^Ｔを表し、「＊」は各菌株で共通する塩基を表す。
【００３４】
２．１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析
以下の菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析を行った。
（１）トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）（ＡＦ０３３３０６）
（２）トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｂｕｃｃａｌｅ）（ＡＦ０３３３０５）
（３）トレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｐａｒｅｄｉｓ）（ＡＦ０３３３０７）
（４）トレポネーマ・ソクランスキー・０４（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．０４）
【００３５】
（５）トレポネーマ・アミロボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａａｍｙｌｏｖｏｒｕｍ）（Ｙ０９９５９）
（６）トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（Ｍ７１２３６）
（７）トレポネーマ・マルトフィラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｍａｌｔｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｘ８７１４０）
（８）トレポネーマ・メディウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｍｅｄｉｕｍ）（Ｄ８５４３７）
（９）トレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）（Ｍ７１２３７）
（１０）トレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）（ＡＦ０３３３０９）
【００３６】
（１１）アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（Ｍ７５０３９）
（１２）バクテロイデス・フォーシンサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）（Ｘ７３９６２）
（１３）バクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｌ０４３２０）
（１４）カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ．ｒｅｃｔｕｓ）（Ｌ０４３２０）
（１５）カプノサイトファガ・ジンジバリス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｘ６７６０８）
【００３７】
（１６）エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（Ｍ２２５１２）
（１７）フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（Ｍ５８６８３）
（１８）ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｌ１６４９２）
（１９）プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｌ１６４６８）
（２０）プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｌ１６４７１）
【００３８】
アライメント解析の結果を図９〜１８に示す。図９〜１８の各図において、中段に示す塩基配列は上段に示す塩基配列の続きであり、後段に示す塩基配列は中段に示す塩基配列の続きである。また、図１０は図９の続きであり、同様に図１１は図１０の、図１２は図１１の、図１３は図１２の、図１４は図１３の、図１５は図１４の、図１６は図１５の、図１７は図１６の、図１８は図１７の続きである。また、図９〜１８において、「Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙ」はアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（Ｍ７５０３９）を表し、「Ｂ．ｆｏｒｓｙｔｈｕ」はバクテロイデス・フォーシンサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）（Ｘ７３９６２）を表し、「Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ」はバクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｌ０４３２０）を表し、「Ｃ．ｒｅｃｔｕｓ」はカンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ．ｒｅｃｔｕｓ）（Ｌ０４３２０）を表し、「Ｃａ．ｇｉｎｇｉｖａ」はカプノサイトファガ・ジンジバリス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｘ６７６０８）を表し、「Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎ」はエイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（Ｍ２２５１２）を表し、「Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕ」はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（Ｍ５８６８３）を表し、「Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａ」はポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｌ１６４９２）を表し、「Ｐｒ．ｉｎｔｅｒｍｅ」はプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｌ１６４６８）を表し、「Ｐｒ．ｎｉｇｒｅｓｃ」はプレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｌ１６４７１）を表し、「Ｔ．ａｍｙｌｏｖｏｒ」はトレポネーマ・アミロボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａａｍｙｌｏｖｏｒｕｍ）（Ｙ０９９５９）を表し、「Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌ」はトレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（Ｍ７１２３６）を表し、「Ｔ．ｍａｌｔｏｐｈｉ」はトレポネーマ・マルトフィラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｍａｌｔｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｘ８７１４０）を表し、「Ｔ．ｍｅｄｉｕｍ」はトレポネーマ・メディウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｍｅｄｉｕｍ）（Ｄ８５４３７）を表し、「Ｔ．ｖｉｎｃｅｎｔｉ」はトレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）（ＡＦ０３３３０９）を表し、「Ｔ．ｐｅｃｔｉｎｏｖ」はトレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）（Ｍ７１２３７）を表し、「Ｔ．ｓ．ｓｏｃｒａｎ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）（ＡＦ０３３３０６）を表し、「Ｔ．ｓ．ｂｕｃｃａｌ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｂｕｃｃａｌｅ）（ＡＦ０３３３０５）を表し、「Ｔ．ｓ．ｐａｒｅｄｉ」はトレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｐａｒｅｄｉｓ）（ＡＦ０３３３０７）を表し、「Ｔ．ｓ．０４」はトレポネーマ・ソクランスキー０４（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．０４）を表す。
また、図９〜１８中の「Ｎ」はＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのいずれかを表し、「＊」は各菌株で共通する塩基を表す。
【００３９】
３．トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分の特定
上記１及び２の結果より、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が共通に有し、かつトレポネーマ・ソクランスキーに属しない菌株は有しない塩基配列部分、すなわち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分を特定することに成功した。
すなわち、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２０７番目から２３９番目の塩基配列（配列番号１）は、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分であることが判明した。
【００４０】
〔実施例２〕プライマーの作製
実施例１で特定されたトレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分の塩基配列（配列番号１）に基づいて、この塩基配列部分にハイブリダイズし得るプライマーＴＲＳ２０７Ｆを作製した。
プライマーＴＲＳ２０７Ｆの塩基配列は、（５’−ａｇｇｔａｇａｃａｇｃｇｇｇａａａｇｇａ−３’）であり（配列番号２）、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２０７番目から２２６番目の塩基配列と同一の塩基配列である。
【００４１】
また、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する各菌株において保存性の高い領域に基づいて、プライマー１０８９Ｒを作製した。プライマー１０８９Ｒの塩基配列は、（５’−ｔａａｃｃｃａａｃａｃｃｔｃａｃｇｇｃａ−３’）であり（配列番号３）、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１１０８番目から１０８９番目の塩基配列と相補的な塩基配列である。
【００４２】
〔実施例３〕ＰＣＲによるトレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の検出
（１）トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）に属する６菌種及び代表的な歯周病関連菌９菌種について、実施例２で作製したプライマーの特異性を調べた。
使用したトレポネーマ属の６菌種及び代表的な歯周病関連菌９菌種を以下に示す。
【００４３】
（トレポネーマ属の６菌種）
▲１▼トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）（ＪＣＭ８１５７^Ｔ）
▲２▼トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．ｂｕｃｃａｌｅ）（ＪＣＭ８１５５^Ｔ）
▲３▼トレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．ｓｕｂｓｐ．
ｐａｒｅｄｉｓ）（ＪＣＭ８１５６^Ｔ）
▲４▼トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＪＣＭ８２２５）
▲５▼トレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）（ＪＣＭ８１５４^Ｔ）
▲６▼トレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）（ＪＣＭ８２２７）
【００４４】
（代表的な歯周病関連菌９菌種）
▲１▼アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ＪＣＭ２４３４、ＪＣＭ８５７８）
▲２▼バクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＪＣＭ８５３８^Ｔ、ＦＤＣ４０１、ＦＤＣ４０２、ＦＤＣ４０６）
▲３▼カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ．ｒｅｃｔｕｓ）（ＪＣＭ６３０１^Ｔ）
▲４▼カプノサイトファガ・ジンジバリス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（ＤＳＭ３２９０^Ｔ）
【００４５】
▲５▼エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（ＤＳＭ８３４０^Ｔ、ＦＤＣ３７３、ＦＤＣ４７０、ＦＤＣ１０８５）
▲６▼フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（ＪＣＭ８５３２^Ｔ）
▲７▼ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（ＪＣＭ８５２５）
▲８▼プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＪＣＭ７３６５^Ｔ）
▲９▼プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）（ＮＣＴＣ９３３６^Ｔ）
【００４６】
まず、上記各菌種の培養液（約１．５〜３ｍｌ）を遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）して集菌し、得られたペレットを１００μｌのＰＢＳｂｕｆｆｅｒに懸濁した。懸濁液に１００μｌの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、９５℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、冷却後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）した。
遠心分離により得られた上清を鋳型ＤＮＡ溶液とし、プライマーとしてＴＲＳ２０７Ｆ及び１０８９Ｒを使用して、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲはＴａＫａｒａＥｘＴａｑ（宝酒造）を用いて行った。
【００４７】
ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ溶液５．０μｌ、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ１０μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ８．０μｌ、プライマーＴＲＳ２０７Ｆ１．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、プライマー１０８９Ｒ１．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、Ｈ_２Ｏ７４．５μｌ、及びＥｘＴａｑ０．５μｌで、総容量を１００．０μｌとした。なお、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅはＴａｋａｒａＥｘＴａｑのキットに添付されているものを使用した。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰを用いて次のように行った。すなわち、初期変性を９５℃で３分行った後、９５℃で３０秒、６７℃で３０秒、及び７２℃で１分を１サイクルとして、これを３０サイクル行い、最後に７２℃で２分の伸長反応を行った。
【００４８】
ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥＣｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．２％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。なお、上記歯周病関連菌９菌種のうち、同種の菌株については、そのうちの１菌株について電気泳動を行った。すなわち、▲１▼アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ＪＣＭ２４３４、ＪＣＭ８５７８）においてはＪＣＭ２４３２について、▲２▼バクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＪＣＭ８５３８^Ｔ、ＦＤＣ４０１、ＦＤＣ４０２、ＦＤＣ４０６）においてはＪＣＭ８５３８^Ｔについて、▲５▼エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（ＤＳＭ８３４０^Ｔ、ＦＤＣ３７３、ＦＤＣ４７０、ＦＤＣ１０８５）においてはＤＳＭ８３４０^Ｔについて、電気泳動を行った。
【００４９】
電気泳動の結果を図１９に示す。図１９中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン１〜６は、それぞれ上記トレポネーマ属６菌種▲１▼〜▲６▼についての結果を示し、レーン７〜１５は、それぞれ上記歯周病関連菌９菌種▲１▼〜▲９▼についての結果を示す。
図１９に示すように、レーン１〜３、すなわち、▲１▼トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー、▲２▼トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ及び▲３▼トレポネーマ・ソクランスキー・パレディスから得られた鋳型ＤＮＡ溶液を用いてＰＣＲを行った場合のみ、増幅断片が得られた。
【００５０】
（２）トレポネーマ・ソクランスキー臨床分離株２２菌株について、上記と同様にしてＰＣＲを行い、実施例２で作製したプライマーの特異性を調べた。
電気泳動の結果を図２０に示す。なお、図２０には、臨床分離株２２菌株のうちの１５菌株についての電気泳動結果を示してある。
図２０に示すように、トレポネーマ・ソクランスキー臨床分離株から得られた鋳型ＤＮＡ溶液を用いてＰＣＲを行った場合、いずれの臨床分離株においても増幅断片が得られた。
【００５１】
（３）以上の（１）及び（２）の結果を以下の表１に示す。
【００５２】
【表１】

【００５３】
表１に示す結果から、プライマーＴＲＳ２０７Ｆ及び１０８９Ｒを用いたＰＣＲにより、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅できることが判明した。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るＰＣＲ用プライマーセットが提供される。
本発明のＰＣＲ用プライマーセットにより、トレポネーマ・ソクランスキー１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出することができ、これにより対象動物のトレポネーマ・ソクランスキー感染を精度よく判別することができる。
【００５５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図２】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図１に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図３】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図２に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図４】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図３に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図５】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図４に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図６】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図５に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図７】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図６に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図８】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図７に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図９】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果を示す図である。
【図１０】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図９の続き）を示す図である。
【図１１】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１０の続き）を示す図である。
【図１２】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１１の続き）を示す図である。
【図１３】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１２の続き）を示す図である。
【図１４】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１３の続き）を示す図である。
【図１５】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１４の続き）を示す図である。
【図１６】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１５の続き）を示す図である。
【図１７】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１６の続き）を示す図である。
【図１８】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１７の続き）を示す図である。
【図１９】ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図２０】ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a PCR primer set that can specifically detect a periodontal pathogen Treponema sochransky 16S rRNA gene, and a method for distinguishing Treponema sochransky infection using the PCR primer set.
[0002]
[Prior art]
Human oral spirochete is a spiral gram-negative anaerobic bacterium that inhabits the human oral cavity and is a general term for bacteria belonging to the order Spirocheta, Spirocheidae, and Treponema. In humans, it is considered to be one of the causative bacteria of periodontal diseases in which the gums, periodontal ligament, alveolar bone and cementum, which are tooth supporting tissues, are damaged or destroyed. Since oral spirochetes have extremely strict auxotrophy, their culture requires a high degree of anaerobicity, and few bacterial species have succeeded in artificial culture.
[0003]
Examples of reports that have so far been successful in artificial culture include Treponema amylovorum, Treponema denticola, Treponema ditomuum, Treponema maltofilum, Treponema metotorumum. pectinovorum, Treponema socranski and Treponema vincentii.
Among these artificially cultivatable bacteria, Treponema socransky is a species that is frequently isolated from periodontal disease patients, and it is important to detect and identify this bacteria quickly and accurately. It is considered to be very important in elucidating the mechanism and developing treatment and prevention methods for periodontal diseases.
[0004]
At present, no method has been developed that can detect and identify Treponema sochranski quickly and accurately. After culturing Treponema sochransky, it can be detected based on its physiological and biochemical properties.・ There was nothing else to identify. However, this method requires special media and special culture equipment with special nutrients added to the culture of Treponema sochransky, and many physiological methods are used to detect and identify Treponema sokransky after culturing.・ Because it is necessary to investigate biochemical properties, it took a lot of labor and time, and there was a problem in terms of accuracy.
Therefore, development of a method capable of detecting and identifying Treponema and Sokransky quickly and accurately is eagerly desired.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a method capable of detecting and identifying Treponema Sokransky quickly and accurately.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors have succeeded in determining the base sequences of 16S rRNA genes of several strains belonging to Treponema Sokransky. Based on the results of the 16S rRNA gene base sequence and the 16S rRNA gene alignment analysis of these strains, among the strains of Treponema sochransky 16S rRNA genes, strains belonging to Treponema sochransky have in common. A part consisting of a base sequence not possessed by a strain not belonging to Sokransky, that is, a base sequence part specific to Treponema Sokransky was clarified.
[0007]
Based on this nucleotide sequence, the present inventors have succeeded in producing a primer set capable of specifically amplifying a DNA fragment derived from the 16S rRNA gene of Treponema sochransky, and completed the present invention.
That is, the present invention includes the following inventions.
[0008]
(1) A PCR primer set capable of specifically amplifying a DNA fragment derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene.
(2) The primer according to (1) above, wherein one primer of the primer set is composed of a base sequence capable of hybridizing to a base sequence portion specific to Treponema sochransky in the Treponema sochransky 16S rRNA gene. set.
[0009]
(3) One primer of the primer set consists of a base sequence capable of hybridizing to a portion consisting of a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Treponema sochransky 16S rRNA gene. The primer set according to (1) above.
(4) The primer set according to (1) above, wherein one primer of the primer set comprises at least a 15-base portion of a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
[0010]
(5) The primer set according to (1), wherein one primer of the primer set is represented by the following (a) or (b).
(A) a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2
(B) a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2 and comprising the Treponema Socransky 16S rRNA gene , A base sequence capable of hybridizing to a portion consisting of a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1
[0011]
(6) The following steps:
(A) preparing a sample containing DNA from the subject animal;
(B) performing a PCR using the primer set according to any one of (1) to (5) on the sample; and
(C) determining whether the target animal is infected with Treponema sochransky by the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b),
A method for determining Treponema-Socransky infection, characterized by comprising:
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is a PCR primer set capable of specifically amplifying a DNA fragment derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene.
The base sequence of each primer in the PCR primer set of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically amplify a DNA fragment derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene.
[0013]
Here, the “DNA fragment derived from the Treponema Sokransky 16S rRNA gene” refers to a DNA fragment that is amplified when PCR is performed using the Treponema Sokransky 16S rRNA gene as a template. “A DNA fragment derived from an rRNA gene can be specifically amplified” means that an amplified fragment is obtained only when PCR is performed using the Treponema Sokransky 16S rRNA gene as a template, and other DNA is used as a template. Means that an amplified fragment cannot be obtained.
[0014]
In the PCR primer set of the present invention, one primer consists of a base sequence capable of hybridizing to a base sequence portion specific to Treponema sochransky 16 in the Treponema sochransky 16S rRNA gene, and the other primer is A primer set for PCR consisting of a base sequence that can hybridize to the Treponema sochransky 16S rRNA gene can be exemplified.
[0015]
Here, “the base sequence portion specific to Treponema Sokransky among the Treponema Sokransky 16S rRNA genes” means that the strains belonging to Treponema Sokransky among the Treponema Sokransky 16S rRNA genes have in common. However, it refers to a base sequence portion that does not have a strain that does not belong to Treponema sochransky, for example, a portion of the Treponema sochransky 16S rRNA gene that has the same or complementary base sequence as the base sequence described in SEQ ID NO: 1. It can be illustrated.
Therefore, as one primer of the PCR primer of the present invention, a base sequence capable of hybridizing to a portion consisting of a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Treponema sochransky 16S rRNA gene The thing which consists of can be illustrated.
[0016]
The base sequence of such a primer can be determined based on the base sequence described in SEQ ID NO: 1. At this time, the base sequence of the primer is made to include all or part of the base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1. The part of the base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 may be any part of the base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and the number of bases in the part Is not particularly limited, but preferably 15 to 33 bases, more preferably 18 to 22 bases. The part may be contained in any part of the base sequence of the primer, and the base sequence other than the part is not particularly limited in the base sequence of the primer. Further, the number of bases of the primer is preferably 15 to 35 bases, more preferably 18 to 22 bases. The GC content of the primer is preferably 50 to 60%, and the Tm value of the primer is preferably 50 to 60 ° C.
[0017]
As a primer determined based on the base sequence described in SEQ ID NO: 1, a primer having a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2 can be exemplified as a preferable example.
The base sequence described in SEQ ID NO: 2 is the same base sequence as the portion from the first base to the 20th base in the base sequence described in SEQ ID NO: 1. Therefore, the primer consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 can hybridize to the portion consisting of the base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Treponema Sokransky 16S rRNA gene. Further, a primer composed of a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2 can hybridize to a portion consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Treponema Sokransky 16S rRNA gene.
[0018]
As long as the base sequence of the primer is a base sequence that can hybridize to a portion consisting of a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Treponema Sokransky 16S rRNA gene, SEQ ID NO: 2 A base sequence in which one or a plurality of bases are deleted, substituted or added in the same or complementary base sequence as described. Here, the number of “one or more bases” is not limited as long as it can hybridize to a portion consisting of the base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
[0019]
When the base sequence of one primer of the PCR primer set of the present invention is determined as described above, the base sequence of the other primer may be any base sequence that can hybridize to the Treponema Sokransky 16S rRNA gene. Specifically, it can be determined based on the base sequence of the known Treponema Sokransky 16S rRNA gene. More specifically, it can be determined based on the base sequence of a highly conserved portion of each strain belonging to Treponema sochransky among the base sequence of Treponema sochransky 16S rRNA gene. As such a primer, for example, a primer having a base sequence identical or complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 can be exemplified.
[0020]
If the base sequence of each primer of the PCR primer set of the present invention is determined, a primer comprising the base sequence can be synthesized according to a conventional method.
The primer set for PCR of the present invention can be used for detection of Treponema sochransky 16S rRNA gene.
In addition, the PCR primer set of the present invention can be used in the following method for determining Treponema-Socransky infection of the present invention.
[0021]
The determination method of Treponema sochransky infection of the present invention includes the following steps:
(A) preparing a sample containing DNA from the subject animal;
(B) performing a PCR using the primer set on the sample; and
(C) determining whether the target animal is infected with Treponema sochransky by the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b),
It is characterized by comprising.
Hereinafter, each step will be described.
[0022]
(1) Step (a)
Step (a) is a step of preparing a sample containing DNA from the target animal.
Here, the “target animal” means an animal that attempts to determine the presence or absence of Treponema sochransky infection.
The target animal is not particularly limited as long as it is an animal that can be infected with Treponema sochransky, and may be any animal. Examples of such target animals include humans, dogs, cats and the like.
[0023]
A sample containing DNA can be prepared from saliva, dental plaque, etc. of a subject animal according to a conventional method. For example, a commercially available surfactant is added to the saliva or plaque of the target animal, heated at 95 ° C. for 5 minutes, cooled, then centrifuged, and the supernatant is collected to prepare a sample containing DNA. be able to.
Samples containing the prepared DNA include various RNAs, DNAs, proteins and the like in addition to the Treponema Sokransky 16S RNA gene. Therefore, the sample may be purified according to a conventional method.
[0024]
(2) Step (b)
Step (b) is a step of performing PCR using the primer set on the sample.
PCR in the step (b) can be performed according to a conventional method.
In step (b), when the sample contains the Treponema sochransky 16S rRNA gene, an amplified fragment derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene having the base sequence of the primer used at both ends is obtained.
[0025]
(3) Step (c)
Step (c) is a step of determining whether or not the target animal is infected with Treponema sochranski based on the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b).
The presence or absence of the amplified fragment can be confirmed according to a conventional method. For example, the presence or absence of the amplified fragment can be confirmed by electrophoresis.
As a result of confirming the presence or absence of the amplified fragment, when the amplified fragment is present, it can be determined that the target animal is infected with Treponema sochransky. As a result of confirming the presence or absence of the amplified fragment, if the amplified fragment is not present, it can be determined that the target animal is not infected with Treponema sochransky.
[0026]
In order to more accurately determine whether or not the target animal is infected with Treponema sochransky, it is preferable to confirm that the amplified fragment is derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene. Examples of the confirmation method include a method of performing restriction fragment length polymorphism analysis obtained by treating an amplified fragment with a restriction enzyme. The restriction enzyme used in this case is not particularly limited as long as it can cleave the amplified fragment and exhibit a restriction fragment length polymorphism. Restriction enzymes may be used alone, but it is desirable to use a combination of two or more. The restriction fragment length polymorphism obtained by treating the amplified fragment with a restriction enzyme can be detected by, for example, Southern blotting.
[0027]
【Example】
[Example 1] Identification of nucleotide sequence specific to Treponema sochransky among Treponema sochransky 16S rRNA genes
1. Determination of the base sequence of 16S rRNA gene possessed by several strains belonging to Treponema sochransky
Three strains of the reference strain and 14 clinical isolates were used as strains belonging to Treponema sochransky, and the base sequences of 16S rRNA genes possessed by these 17 strains were determined.
The three reference strains used are shown below.
[0028]
(1) Treponema socranski. Socransky JCM 8157^T
(2) Treponema socranski bukkale JCM 8155^T
(3) Treponema socransky paredis (Treponema socranskii. Subsp.
paredis) JCM 8156^T
The 14 clinical isolates used were 1043, 1142, 1164A, 1166, 122B, 122C, 1267, 128B, 128D, 1292, 351, 673, B418, T10 strain.
[0029]
First, the culture solution (about 1.5 to 3 ml) of each strain was collected by centrifugation (10,000 rpm for 1 minute). The pellet obtained by centrifugation was suspended in 100 μl of PBS buffer. Then, 100 μl of 10% Triton X-100 was added to this suspension and heated at 95 ° C. for 5 minutes. After heating, the mixture was cooled in ice and centrifuged (at 10,000 rpm for 1 minute).
[0030]
PCR was performed using the supernatant obtained by centrifugation as a template DNA solution to amplify the 16S rRNA gene possessed by each strain.
PCR was performed using TaKara Ex Taq (Takara Shuzo).
[0031]
The composition of the PCR reaction solution was as follows: template DNA solution 5.0 μl, 10 × reaction buffer 10.0 μl, dNTP mixture 8.0 μl, primer 27F 1.0 μl (10 pmol / μl), primer 1492R 1.0 μl (10 pmol / μl), H₂With 74.5 μl O and 0.5 μl ExTaq, the total volume is 100.0 μl. In addition, 10X reaction buffer and dNTP mixture used were those attached to the Takara ExTaq kit.
The base sequence of the universal primer 27F is 5'-agagtttgattcctggctcag-3 '(SEQ ID NO: 4), and the base sequence of the universal primer 1492R is 5'-ggttactttgtacgactt-3' (SEQ ID NO: 5).
[0032]
PCR was performed using TaKaRa PCR Thermal Cycler MP as follows. That is, after initial denaturation at 95 ° C. for 3 minutes, 95 cycles for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute and 30 seconds, this was performed for 30 cycles, and finally at 72 ° C. An extension reaction was performed for 10 minutes.
After PCR, electrophoresis with 1.2% agarose gel was performed using a Mupid minigel electrophoresis tank (ADVANCE Co., Ltd), and the gel was stained with ethidium bromide solution to confirm the presence or absence of amplification of the target band.
[0033]
The sample confirmed to be amplified was purified by a spin column and subjected to a sequencing reaction. The sequencing reaction was performed using ABI's Big Dye terminator cycle sequencing kit (Perkin-Elmer Japan, Applied Biosystems Division, Chiba, Japan), and the base sequence analysis was performed using Ai by BI.
The base sequence of the 16S rRNA gene of each strain determined as described above is shown in FIGS. 1 to 8, the base sequence shown in the middle row is a continuation of the base sequence shown in the upper row, and the base sequence shown in the rear row is a continuation of the base sequence shown in the middle row. 2 is a continuation of FIG. 1. Similarly, FIG. 3 is FIG. 2, FIG. 4 is FIG. 3, FIG. 5 is FIG. 8 is a continuation of FIG. In FIGS. 1 to 8, “TS” is Treponema socransky.subran.socranski JCM 8157^T“TB” represents Treponema socranski buccale JCM 8155^T“TP” represents Treponema socranski paredis JCM 8156^T"*" Represents a base common to each strain.
[0034]
2.16S rRNA gene alignment analysis
The alignment analysis of 16S rRNA gene of the following strains was performed.
(1) Treponema socranski. Socransky (AF033306) (AF033306)
(2) Treponema socranski bukkale (AF033305)
(3) Treponema socranski paredis (AF033307)
(4) Treponema Sokransky 04 (Treponema socranski. 04)
[0035]
(5) Treponema amylovorum (Y09959)
(6) Treponema denticola (M71236)
(7) Treponema maltofilum (X87140)
(8) Treponema medium (D85437)
(9) Treponema pectinovorum (M71237)
(10) Treponema vincentii (AF033309)
[0036]
(11) Actinobacillus. Actinomycetemcomitans (M75039)
(12) Bacteroides forsythus (X73962)
(13) Bacteroides. Gracilis (L04320)
(14) Campylobacter rectus (L04320)
(15) Capnocytophaga gingivalis (X67608)
[0037]
(16) Eikenella. Corrodens (M22512)
(17) Fusobacterium nucleatum (M58683)
(18) Porphyromonas gingivalis (L16492)
(19) Prevoterra.intermedia (L16468)
(20) Prevotella nigrecens (L16471)
[0038]
The results of alignment analysis are shown in FIGS. 9 to 18, the base sequence shown in the middle row is a continuation of the base sequence shown in the upper row, and the base sequence shown in the rear row is a continuation of the base sequence shown in the middle row. 10 is a continuation of FIG. 9. Similarly, FIG. 11 is FIG. 10, FIG. 12 is FIG. 11, FIG. 13 is FIG. 12, FIG. 14 is FIG. 16 is a continuation of FIG. 15, FIG. 17 is a continuation of FIG. 9 to 18, “A. actinomy” represents Actinobacillus. Actinomycetemcomitans (M75039), and “B. forsythu” for B. "B. gracilis" represents Bacteroides gracilis (L04320), "C. rectus" represents Campylobacter rectus (L04320), and "Ca. gingiva" Nocytophaga gingivalis (Capnocytophaga. Gingiv) alis) (X67608), “E. corroden” represents Eikenella. corrodens (M22512), “F. nucleeatu” represents Fusobacterium nucleatum (58, P3 ". Gingiva" represents Porphyromonas gingivalis (L16492), "Pr.interme" represents Prevotella intermedia (L16468), and "Pr. (Prevotella. Nigrescens) (L16471), “T. “Amylov” represents Treponema amylovorum (Y09959), “T. denticol” represents Treponema denticola (M71236), and “T. "T. medium" represents Treponema medium (D85437), "T. vincenti" represents Treponema vincentii (AF033309), and "T. spectinov" represents Treponema. Pectinobolum (Treponema pectino orum) represents the (M71237), "T. s. socran "represents Treponema socranski. subsp. socranski (AF033306), and" T.s. buccal "represents Treponema socranski buc “T.s.paredi” represents Treponema socranski paredis (AF033307), “T.s.04” represents Treponema socransky 04 (Treponema socransky 04. Represent.
In addition, “N” in FIGS. 9 to 18 represents any of A, T, C, and G, and “*” represents a base common to each strain.
[0039]
3. Identification of the specific nucleotide sequence of Treponema sochransky 16S rRNA gene
From the results of 1 and 2 above, among the Treponema sochransky 16S rRNA genes, the base sequence portion that the strain belonging to Treponema sochranski has in common and the strain not belonging to Treponema sokransky does not have, that is, Treponema・ We succeeded in identifying the base sequence part specific to Sokransky.
That is, it was found that the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the 207th to 239th nucleotides of the Treponema sochransky 16S rRNA gene is a nucleotide sequence specific to Treponema sochransky.
[0040]
[Example 2] Preparation of primer
Based on the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the nucleotide sequence specific to Treponema Socransky identified in Example 1, primer TRS207F capable of hybridizing to this nucleotide sequence was prepared.
The base sequence of the primer TRS207F is (5'-agtagagacaggggaagaga-3 ') (SEQ ID NO: 2), which is the same base sequence as the 207th to 226th base sequences of the Treponema sochransky 16S rRNA gene.
[0041]
Moreover, primer 1089R was produced based on the region having high conservation in each strain belonging to Treponema sochransky among the Treponema sochransky 16S rRNA gene. The base sequence of the primer 1089R is (5'-taacccaacacctacacggca-3 ') (SEQ ID NO: 3), which is a base sequence complementary to the 1108th to 1089th base sequences of the Treponema Socransky 16S rRNA gene.
[0042]
[Example 3] Detection of Treponema sochransky 16S rRNA gene by PCR
(1) The specificity of the primers prepared in Example 2 was examined for 6 species belonging to the genus Treponema and 9 typical species associated with periodontal disease.
The 6 species of Treponema used and 9 species of typical periodontal disease-associated bacteria are shown below.
[0043]
(6 species of Treponema)
(1) Treponema socransky. Subsp. Socranski (JCM 8157)^T)
(2) Treponema socranski bukkale (JCM 8155)^T)
(3) Treponema socransky paredis (Treponema socranskii. Subsp.
paredis) (JCM 8156^T)
(4) Treponema denticola (JCM 8225)
(5) Treponema pectinovorum (JCM 8154)^T)
(6) Treponema vincentii (JCM 8227)
[0044]
(9 typical species of periodontal disease-related bacteria)
(1) Actinobacillus actinomycetemcomitans (JCM 2434, JCM8578)
(2) Bacteroides. Gracilis (JCM 8538)^TFDC401, FDC402, FDC406)
(3) Campylobacter rectus (JCM 6301)^T)
(4) Capnocytophaga gingivalis (DSM 3290)^T)
[0045]
(5) Eikenella. Corrodens (DSM 8340)^TFDC373, FDC470, FDC1085)
(6) Fusobacterium nucleatum (JCM 8532)^T)
(7) Porphyromonas gingivalis (JCM 8525)
(8) Prevotella.intermedia (JCM 7365)^T)
(9) Prevotella nigrecens (NCTC 9336)^T)
[0046]
First, the culture solution (about 1.5 to 3 ml) of each of the above-mentioned bacterial species was collected by centrifugation (10,000 rpm for 1 minute), and the resulting pellet was suspended in 100 μl of PBS buffer. 100 μl of 10% Triton X-100 was added to the suspension and heated at 95 ° C. for 5 minutes. After heating, it was cooled in ice, and after cooling, it was centrifuged (at 10,000 rpm for 1 minute).
The supernatant obtained by centrifugation was used as a template DNA solution, and PCR was performed using TRS207F and 1089R as primers.
PCR was performed using TaKara Ex Taq (Takara Shuzo).
[0047]
The composition of the PCR reaction solution was as follows: template DNA solution 5.0 μl, 10 × reaction buffer 10 μl, dNTP mixture 8.0 μl, primer TRS207F 1.0 μl (10 pmol / μl), primer 1089R 1.0 μl (10 pmol / μl), H₂The total volume was 100.0 μl with O 74.5 μl and ExTaq 0.5 μl. In addition, 10X reaction buffer and dNTP mixture used were those attached to the Takara ExTaq kit.
PCR was performed using TaKaRa PCR Thermal Cycler MP as follows. That is, after initial denaturation at 95 ° C. for 3 minutes, 95 cycles at 30 ° C., 30 seconds at 67 ° C., and 1 minute at 72 ° C. for 30 cycles, and finally at 72 ° C. for 2 minutes. The elongation reaction was performed.
[0048]
After PCR, electrophoresis with 1.2% agarose gel was performed using a Mupid minigel electrophoresis tank (ADVANCE Co., Ltd), and the gel was stained with ethidium bromide solution to confirm the presence or absence of amplification of the target band. Of the nine species of periodontal disease-related bacteria, the same kind of strains were subjected to electrophoresis for one of them. That is, (1) Actinobacillus actinomycetemcomitans (JCM 2434, JCM8578), JCM 2432, (2) Bacteroides gracilis (Bacteroides.^T, FDC401, FDC402, FDC406) in JCM 8538^T(5) Eikenella. Corrodens (DSM 8340)^T, FDC373, FDC470, FDC1085) in DSM 8340^TWas subjected to electrophoresis.
[0049]
The result of electrophoresis is shown in FIG. In FIG. 19, “M” represents a molecular weight marker, lanes 1 to 6 show the results for 6 species of the genus Treponema (1) to (6), and lanes 7 to 15 show the periodontal disease, respectively. The results for 9 related bacterial species (1) to (9) are shown.
As shown in FIG. 19, template DNAs obtained from lanes 1 to 3, that is, (1) Treponema Sokransky Sokransky, (2) Treponema Sokransky Bukkale, and (3) Treponema Sokransky Paredis. Only when PCR was performed using the solution, an amplified fragment was obtained.
[0050]
(2) PCR was carried out in the same manner as described above for 22 strains of Treponema sochransky clinical isolates, and the specificity of the primers prepared in Example 2 was examined.
The result of electrophoresis is shown in FIG. In addition, in FIG. 20, the electrophoresis result about 15 strains out of 22 clinical isolates is shown.
As shown in FIG. 20, when PCR was performed using a template DNA solution obtained from a Treponema Sokransky clinical isolate, an amplified fragment was obtained in any clinical isolate.
[0051]
(3) The results of (1) and (2) above are shown in Table 1 below.
[0052]
[Table 1]

[0053]
From the results shown in Table 1, it was found that a DNA fragment derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene can be specifically amplified by PCR using primers TRS207F and 1089R.
[0054]
【The invention's effect】
The present invention provides a primer set for PCR that can specifically amplify a DNA fragment derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene.
With the PCR primer set of the present invention, the Treponema sochransky 16S rRNA gene can be specifically detected, whereby the Treponema sochransky infection of the target animal can be accurately determined.
[0055]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a view showing the base sequence of 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky.
FIG. 2 is a view showing the base sequence of the 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky (continuation of the base sequence shown in FIG. 1).
FIG. 3 is a view showing the base sequence of a 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky (continuation of the base sequence shown in FIG. 2).
FIG. 4 is a view showing a base sequence of a 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky (continuation of the base sequence shown in FIG. 3).
FIG. 5 is a view showing the base sequence of a 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky (continuation of the base sequence shown in FIG. 4).
FIG. 6 is a diagram showing the base sequence of the 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky (continuation of the base sequence shown in FIG. 5).
FIG. 7 is a diagram showing the base sequence of the 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky (continuation of the base sequence shown in FIG. 6).
FIG. 8 is a diagram showing the base sequence of the 16S rRNA gene possessed by a strain belonging to Treponema sochransky (continuation of the base sequence shown in FIG. 7).
FIG. 9 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene.
FIG. 10 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 9).
FIG. 11 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 10).
FIG. 12 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 11).
FIG. 13 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 12).
FIG. 14 is a diagram showing alignment analysis results of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 13).
FIG. 15 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 14).
FIG. 16 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 15).
FIG. 17 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 16).
FIG. 18 shows the results of alignment analysis of 16S rRNA gene (continuation of FIG. 17).
FIG. 19 is a photograph showing the results of electrophoresis of PCR products.
FIG. 20 is a photograph showing the results of electrophoresis of PCR products.

Claims

A PCR primer set capable of specifically amplifying a DNA fragment derived from the Treponema sochransky 16S rRNA gene, wherein one primer of the primer set is described in SEQ ID NO: 1 among the Treponema sokransky 16S rRNA gene A primer set, which is a primer comprising at least a 15-base portion of a base sequence identical or complementary to the base sequence.

2. The primer set according to claim 1, wherein the one primer is a primer comprising an 18-22 base portion of a base sequence identical or complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.

The primer set according to claim 1, wherein the one primer is a primer having a base sequence identical or complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.

The primer set according to any one of claims 1 to 3, wherein the other primer of the primer set is represented by a base sequence identical or complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 3.

The following steps:
(A) preparing a sample containing DNA from the subject animal;
(B) performing the PCR using the primer set according to any one of claims 1 to 4 on the sample, and (c) the presence or absence of the amplified fragment obtained in the step (b). Determining whether the animal is infected with Treponema sochransky,
A method for determining Treponema-Socransky infection, characterized by comprising: