JP3623230B2 - Chimeric receptor polypeptide, human H13 protein, and uses thereof - Google Patents

Description

本発明によるキメラ受容体ポリペプチドの非限定的な例には、Tyr242、Phe242及び／又はTrp242、及びVal1240、Met240、Leu240、Ile240、Glu244、Gln244、Asp244、又はAsn244のうちの少なくとも１つ；及びAsn239、Asp239、Glu239又はGln239（配列番号:3）が含まれ得るが、H13（配列番号:8）の少なくともPro242をTyrで置換し、そしてGly240とVal244（配列番号:8）の少なくとも１つをそれぞれValとGluで置換する。
H13のウィルス結合特異性を改変するためのもう１つの手段は、ERRの残基に対応しないH13内の１又は２以上の“余分な”アミノ酸残基を欠失させるこによるものである。好ましい欠失（細胞外ドメイン４内での）は、H13位置326〜331（配列番号:1）からの１〜６残基の欠失、最も好ましくは、これら６残基全ての欠失である。
本発明のキメラ受容体ポリペプチドのもう１つの非限定的な例では、非ヒトウィルスのenv結合ドメインに結合するヒト細胞の結合能力を付与するH13キメラ受容体ポリペプチドを提供することができる。その場合、かかる結合能力を付与するために、H13の１〜30アミノ酸をERRからの対応するアミノ酸によって置換、欠失又は修飾する。好ましくは、そのようなキメラ受容体ポリペプチドは、H13ポリペプチド（配列番号:8）の少なくともPro242がTyrで置換され、そしてGly240とVal244（配列番号:8）の少なくとも１つがそれぞれValとGluで置換されたペプチド、又はH13のアミノ酸配列に実質的に一致するアミノ酸配列を有するフラグメントを含み、その結果、得られるキメラ受容体は、他のヒト又は非マウス細胞型若しくは組織型を感染することができないマウスエコトロピックレトロウィルスにより選択的に結合される。
また、H13に対応するアンフォトロピック第一種ウィルス受容体の同種キメラ受容体ポリペプチドを同じように改変して、非第一種特異性アンフォトロピックウィルスの、例えばキメラ受容体細胞又は組織への結合をできるようにしてもよい。好ましくは、その第一種はヒト又はげっ歯類である。
ここに記載した全ての用途のための類似の生物活性を有する、H13又はキメラ受容体ポリペプチドの可溶型、並びにそれらの機能性誘導体も含まれる。キメラ受容体又はそのキメラ受容体から誘導したH13ポリペプチド又はH13転写産物それぞれの全ての活性型、及びH13様活性を有する全ての突然変異体も意図されている。
正常では膜貫通タンパク質である受容体の可溶型を作る方法は当該技術分野で知られている（例えば、スミス（Smith,D.H.）ら,Science,238:1704−1707（1987）；フィッシャー（Fisher,R.A.）ら,Nature,331:76−78（1988）；ハッセイ（Hussey,R.E.）ら,Nature,331:78−81（1988）；ディーン（Deen,K.C.）ら,Nature,331:82−84（1988）；トラウネッカー（Traunecker,A）ら,Nature,331:84−86（1988）；ゲルショニ（Gershoni,J.M.）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:4087−4089（1988）を参照のこと，これら文献は参照によってここに組み入れられるものとする）。かかる方法は、一般に、受容体タンパク質をコードする核酸のトランケーションに基づくものであって、膜貫通部分を排除して無傷のレトロウィルス又はレトロウィルスタンパク質若しくは糖タンパク質の如き特異性リガンドと相互作用できる１つ（又は複数）の細胞外ドメインを無傷で残すものである。本発明のためには、可溶性キメラ受容体ポリペプチド又はH13ポリペプチドが、ウィルスへの結合を可能にするキメラ受容体又はH13の結合部位の要素を含むことが重要である。キメラ受容体ポリペプチド又はH13ポリペプチドは多くのアミノ酸残基を有するが、２〜15、又は３〜５、６〜９若しくは10〜15の如きそのうちのいずれかの値若しくは範囲の如き１又は２又はそれ以上だけがウィルス認識及び結合に決定的に関与している。
ここで説明するように、本発明のH13タンパク質又はキメラ受容体ポリペプチドを、ドラッグデザインのために、例えば、免疫原性を低減するために、溶解性促進又は運搬増進のために、又はクリアランス若しくは分解を阻止するために、既知の方法に従って更に改変してもよい。更なる態様においては、本発明は、本発明のキメラ受容体ポリペプチドの突然変異タンパク質を提供する。“突然変異タンパク質”により、H13タンパク質又はキメラ受容体ポリペプチドの“フラグメント”、“変異体”又は“化学誘導体”が意味される。突然変異タンパク質は、本発明によりその利用が可能となるH13タンパク質の機能の少なくとも一部を保持している。
H13タンパク質又はキメラ受容体ポリペプチドの“フラグメント”は、この分子のあらゆるサブセット、即ち、より短いペプチドである。
H13キメラ受容体ポリペプチドの“突然変異タンパク質”とは、この全縁ペプチド又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子のことをいう。突然変異タンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて、直接化学合成法又は突然変異誘発法を含む突然変異タンパク質の組換え産生法によって都合良く調製することができる。例えば、サムブルーク（Sambrook）の前記文献、アウスベル（Ausubel）の前記文献、コリガン（Coligan）の前記文献を参照のこと。
また、H13又はキメラ受容体ポリペプチドの突然変異タンパク質は、この合成されたペプチドをコードする核酸内の突然変異によって調製することができる。かかる突然変異体には、例えば、ここに示したアミノ酸配列内の残基の欠失体、又は挿入体又は置換体が含まれる。最終構築体が所望の活性を有することを条件として、欠失、挿入及び置換のあらゆる組み合わせを用いて最終構築体に到達することもできる。明らかに、突然変異タンパク質ペプチドをコードする核酸内で行われる突然変異は、そのリーディングフレームを変化させてはならず、そして好ましくは第二mRNA構造をもたらし得る相補的領域を作り出さないであろう（例えば、ヨーロッパ特許公報EP75,444を参照のこと）。
遺伝子レベルでは、これら突然変異タンパク質は、通常、このペプチド分子をコードする核酸内のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発（アデルマン（Adelman）ら,DNA 2:183（1983）又はアウスベルの前記文献、サムブルークの前記文献又はコリガンら編,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Association and Wiley Intersciences N.Y.,（1992,1993）により例示されている）を行い、それによってこの突然変異体をコードする核酸を作成した後、組換え細胞培養でこの核酸を発現することによって調製される。突然変異タンパク質は、典型的には、キメラペプチドと同質の生物活性を示す。
特に、ERRの如き他の非ヒト又は非動物特異性ウィルスから誘導した決定的なアミノ酸残基を有するキメラ受容体ポリペプチド又はH13ポリペプチドを、部位特異的突然変異誘発法を用いて作ってもよい。
突然変異タンパク質のもう１つのグループは、このタンパク質分子内の少なくとも１つ、好ましくは唯１つだけのアミノ酸残基が除去されて異なる残基がその場所に挿入されたものである。タンパク質化学及び構造の詳細な説明については、シュルツ（Schulz,G.E.）ら,Principles of Protein Structure,Springer−Verlag,New York,1978、及びクレイトン（Creighton,T.E.）,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,1983を参照のこと。なお、これらは参照により全体がここに組み入れられるものとする。本発明のタンパク質又はペプチド分子内に行うことができる置換のタイプは、シュルツらの前記文献の表１〜２及びクレイトンらの前記文献の図３〜９に示されたものの如き、異なる種の同種タンパク質間のアミノ酸置換の頻度の分析に基づくことができる。そのような分析に基づけば、保存的置換は、ここでは次の５グループのうちの１グループ内での交換として定義される。
1.小さい脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基:ala,ser,thr（pro,gly）；
2.極性で負に荷電した残基及びそれらのアミド:asp,asn,glu,gln;
3.極性で正に荷電した残基:his,arg,lys;
4.大きい脂肪族の非極性残基:met,leu,ile,val（cys）；及び
5.大きい芳香族残基:phe,tyr,trp。
機能的又は免疫学的特性の実質的な変化は、上記の５グループ内というよりもむしろ５グループ間の置換の如きあまり保存的ではない置換を選択することによってなされる。それら置換により、（ａ）その置換域内のペプチド主鎖の構造、例えば、シート又はヘリックスコンフォメーションのような構造の維持、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性の維持、又は（ｃ）側鎖の嵩高さの維持へのそれらの効果がより有意に異なるであろう。かかる置換の例は、（ａ）gly及び／又はproの他のアミノ酸による置換又はgly若しくはproの欠失又は挿入；（ｂ）親水性残基、例えば、ser又はthrの、疎水性残基、例えば、leu、ile、phe、val又はalaに代わる（又はそれによる）置換；（ｃ）cys残基の、他のいずれかの残基に代わる（又はそれによる）置換；（ｄ）電気的に正の側鎖を有する残基、例えば、lys、arg又はhisの、電気的に負の電荷を有する残基、例えば、glu又はaspに代わる（又はそれによる）置換；（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、pheの、そのような側鎖を有さない残基、例えば、glyに代わる（又はそれによる）置換である。
本発明による殆どの欠失及び挿入、及び置換は、そのタンパク質又はペプチド分子の特性に根本的な変化をもたらさないものである。しかしながら、置換、欠失又は挿入をするより先にそうすることの正確な効果を予見することが困難な場合には、当業者は、その効果が日常的なスクリーニング検定法、つまり免疫学的検定法又は生物学的検定法により評価されることが理解できるであろう。例えば、突然変異タンパク質は、典型的には、そのペプチド分子をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発、その突然変異型核酸の組換え細胞培養での発現、及び随意であるが例えばカラムで（少なくとも１つのエピトープに結合することによってこの突然変異タンパク質を吸着するための）特異性抗体を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィーによるこの細胞培養物からの精製により作られる。
H13若しくはキメラ受容体ポリペプチドを含有する細胞溶解産物の活性、又はH13若しくはキメラ受容体の精製試料の活性は、所望の特性に適するスクリーニング検定法でスクリーニングすることができる。例えば、このタンパク質分子の所与の抗体への結合性の如き免疫学的特性の変化は、（ここに記載するような）競合型免疫学的検定法によって測定することができる。生物活性は、ここに記載したように、ウィルス感染性の如き適切な生物学的検定法でスクリーニングされる。
酸化還元又は熱安定性、疎水性、タンパク質分解への感受性又はキャリヤーと若しくは多量体に凝集する傾向の如きペプチド特性の変更は、当業者に周知の方法によって検定される。
更に、本発明によるキメラ受容体ポリペプチドのアミノ酸の修飾アミノ酸又は化学的誘導体が提供され得るので、このポリペプチドは、正常ではこのタンパク質の一部ではない追加の化学部分又は修飾アミノ酸を含有する。かくして、本発明の範囲内には、このペプチドの共有結合修飾体が含まれる。かかる修飾は、キメラ受容体ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択した側鎖又は末端残基と反応することのできる有機誘導化剤と反応させることによってこのポリペプチド内に導入することができる。
二官能性物質での誘導化は、このペプチドを既知の方法に従って非水溶性支持マトリックス又は他の高分子キャリヤーに架橋するのに有用である。普通に用いられる架橋剤には、例えば、1,1−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、3,3'−ジチオビス（コハク酸イミジルプロピオネート）の如きジコハク酸イミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−1,8−オクタンの如き二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−〔（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイミデートの如き誘導化剤は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化能中間体を生成する。また、臭化シアン活性化炭水化物の如き反応性非水溶性マトリックス及び米国特許第3,969,287;3,691,016;4,195,128;4,247,642;4,229,537;及び4,330,440号（これらは参照により全体がここに組み入れられるものとする）に記載された反応性基質をタンパク質固定化に用いてもよい。
本発明のキメラ受容体ポリペプチドの他の修飾には、既知の方法による、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（クレイトン,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,pp.79−86（1983））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びある場合にはＣ−末端カルボキシル基のアミド化が含まれ得る。
かかる誘導化された部分は、溶解性、吸収性、生物学的半減期及びそれに類したものを向上させ得る。キメラ受容体ポリペプチドのかかる部分又は修飾は、一方では、そのタンパク質及びそれに類したものの望ましくない副作用を排除又は弱め得る。かかる作用を媒介することができる部分が、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th ed,Mack Publishing Co.,Easton,PA（1980）に開示されている。
キメラ受容体ポリペプチドのかかる化学誘導体も、精製、抗体の生成又はクローニングのために；又はキメラ受容体ポリペプチド、それに対する抗体又はそのフラグメントを含む治療性組成物にとって望ましい、酵素的分解に対する抵抗性又は結合親和性の増加又はキメラ受容体ポリペプチドの変調の如き物性の変更のために、固体支持体に付着させることができる。かかるペプチド誘導体、並びにかかる誘導体を作る方法は、当該技術分野で知られている。
“単離された又は組換えH13ポリペプチド”とは、配列番号:8のアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸部分と実質的に一致するか、又は本質的にその部分からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、HIVenv結合ドメインの如きレトロウィルスに結合するポリペプチドのことをいう。キメラ受容体ポリペプチド又はH13タンパク質のアミノ酸配列に“実質的に一致する”とは、そのタンパク質分子の可溶性部分内の少なくとも１アミノ酸残基が除去されてその場所に異なる残基が挿入されたアミノ酸配列のことをいう。その置換の数は比較的小さいので、ここに記載するように十分に特徴付けられ又は保存的である。
キメラ受容体ポリペプチド又はH13ポリペプチドを作る 方法
この発明の好ましい用途は、化学合成又は組換え核酸法によって単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチド又はそれらのフラグメントを作ることである。この場合、これらのフラグメントは、できるだけ小さいものであるが、非ヒト特異性レトロウィルス又はHIVへの結合に依然として十分に高い親和性を保持しているものである。H13の好ましいフラグメントには、ここに示したように細胞外ドメイン３が含まれる。
ウィルス受容体としてのその機能のために、本発明のH13の細胞外フラグメント又はキメラ受容体ポリペプチドは、それぞれヒト又は非ヒト特異性ウィルスに結合することができる。このペプチドのより小さなフラグメントを作ることにより、当業者は、既知の結合及び阻害検定法を用いて、ここに示した教示及び指針に基づき、過度の実験をすることなしに、十分に高い親和性でウィルス又はレトロウィルスの結合ドメインに結合して感染力を抑制することのできる最小のペプチドを容易に同定することができるであろう。短いペプチドは大きなタンパク質よりも２つの利点、即ち、（１）より大きい安定性と拡散性、及び（２）より少ない免疫原性、を有していると考えられる。
非限定的な例として、マウスERR配列からのアミノ酸残基の存在のために、本発明の突然変異型キメラ受容体ポリペプチドは、この受容体を発現するヒト細胞又は他の非マウス細胞に、マウスＥ−MuLV又はHuLVの如き非ヒト特異性ウィルスにより感染される能力を与える。なお、この非ヒト特異性ウィルスは、複製コンピテント型への逆突然変異の可能性を低減するために修飾されていてもよい。
ウィルス受容体の１又は２以上のアミノ酸残基の適切な置換によって、ここに示した教示及び指針に基づき、過度の実験をすることなしに、本発明のキメラ受容体ポリペプチドを得ることができる。
本発明は、MuLV又はHuLVの如きレトロウィルス及びアデノウィルスを含む、類似の受容体特異性を有するあらゆる非ヒトエコトロピック又はアンフォトロピックウィルスへのキメラ受容体ポリペプチドの結合を包含することも意図している。
当業者は、ここに示した教示及び指針に基づき、過度の実験をすることなしに、あらゆる種又は細胞型から本発明のキメラ受容体ポリペプチドの獲得に用いるのに適するウィルス受容体をコードする核酸をどのように得るかを決定することができるであろう。かかる操作の非限定的な例として、最初に、興味の対象である種又は細胞型のcDNAライブラリー、例えば、ヒトＴ細胞cDNAライブラリーを（当該技術分野で日常的に行われる方法を用いて）H13の如きヒトウィルス受容体の配列に基づくプローブを用いてスクリーニングすることになろう。次に、ハイブリダイズする核酸をクローン化及び配列決定して“新規な”レトロウィルス受容体の配列を得ることになろう。目視検査により又は（ここに記載したような）コンピュータープログラムで、その新規なレトロウィルス受容体タンパク質の配列がERR又はH13と異なっている領域を同定することが可能である。特に、H13の細胞外ドメイン領域３又は類似するドメインに対応するドメインに注目することになろう。
認められた配列相違点に基づき、ここに示した教示を用いて、その新規な受容体と既知受容体の間のキメラ受容体が作り出されるような１又は２以上のアミノ酸置換を有する配列を作成することが可能である。次いで、このキメラ受容体を選り抜きの細胞内で発現して、慣用的なウィルス結合検定法又はウィルス感染力検定法を用いてその機能を容易に試験することができる。
更には、本発明によれば、マウス白血病ウィルスの如きウィルスの外膜糖タンパク質内の受容体選択決定基の知見に基づきウィルスの受容体付着部位を修飾して、それがその本来の受容体に結合しないように、又は異なる受容体に結合するようにすることが可能である。例えば、バッチニ（Battini）ら,J.Virology,66（３）:1468−1475（1992）を参照のこと。
例えば、HIV−１の結合を阻止するためにHIV−１ CD4−結合ドメインの配列を変化させると、このウィルスはCD4保有細胞に対し非感染性になるであろう。対応する変化をH13に導入でき、そうすれば、この突然変異型HIVはそれに結合するであろう。このようにして、適切な変異型受容体を保有する細胞を選択するためにだけ結合するがHIV−１の正常な標的には結合しない安全なHIV試料を生じさせることができる。
同じ細胞の表面上に２以上の無傷又は突然変異型ウィルス受容体ポリペプチドを発現させることも本発明の範囲に属する。かくして、第１発現キメラ受容体ポリペプチド、例えば、ERRによって、ヒト細胞を１つのウィルス株でin vitroで一過的に感染させることができ、そしてサイトカイン成長又は分化因子の適切な使用によって操作することができる。かかる細胞をレシピエントに導入してもよい。望ましい時期に、第２発現キメラ受容体ポリペプチドに結合する第２ウィルスをその個体に導入して、第２レトロウィルス受容体を保有するそれら導入細胞だけを安定に感染させそして変化させることができる。
H13配列の一部分に相当するオリゴヌクレオチド（配列番号:2）は、同種遺伝子の存在のスクリーニング及びかかる遺伝子のクローニングに有用である。かかるオリゴヌクレオチドを合成する技術は、例えば、ウー（Wu,R）ら,Prog.Nucl.Acid.Res.Molec.Biol.,21:101−141（1978）；アウスベルらの下記文献；サムブルークの下記文献；ベラガジェ（Belagaje,R）ら,J.Biol.Chem.,254:5765−5780（1979）;Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression,ニエルリッヒ（Nierlich,D.P.）ら編,Acad Press,NY（1976）中のマニアチス（Maniatis,T）らの報文；ウーら,Prog.Nucl.Acid.Res.Molec.Biol.,21:101−141（1978）；コーラマ（Khorana,R.G.）,Science,203:614−625（1979）により開示されている。更に、DNA合成は、自動合成装置を用いて行うことができる。DNAハイブリダイゼーションの技術は、サムブルークらの前記文献及びハイメス（Haymes,B.D.）ら（DNA Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,DC（1985）中の報文）により開示されている。なお、これら文献は参照によってここに組み入れられるものとする。上記の如き技術又はそれに類似の技術は、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（スー（Hsu,L.C.）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3771−3775（1985））、フィブロネクチン（スズキら,Eur.Mol.Biol.Organ.J.,4:2519−2524（1985））の遺伝子、ヒトエストロゲン受容体遺伝子（ウォルター（Walter,P.）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:7889−7893（1985））、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ペニカ（Pennica,D.）ら,Nature,301:214−221（1983））及びヒト出産予定時期胎盤アルカリ性ホスファターゼ（相補的DNA（カム（Kam,W.）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:8715−8719（1985）のクローニングをうまくできるようにした。
H13遺伝子、受容体突然変異体又はその相当物をクローニングする別の方法では、（H13、受容体突然変異体又はその相当物を発現することができる細胞からの）DNA又は、より好ましくは、cDNAを発現ベクター内にクローニングすることにより発現ベクターのライブラリーを調製する。次いで、そのライブラリーを、抗H13、抗突然変異体又は抗相当物抗体に結合し、かつH13、受容体突然変異体又はその相当タンパク質若しくはペプチド、又はそのフラグメントと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列を有するタンパク質を発現することができるメンバーについてスクリーニングする。
本発明のH13、受容体突然変異体又はその相当物、つまりポリペプチド若しくはタンパク質をコードする核酸配列、又はその機能性誘導体を、連結のための平滑末端又は粘着末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な場合の粘着末端のfilling in、望ましくない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及び適切なリガーゼでの連結を含む慣用的技術に従って、ベクターDNAで組み換え、そして適切な宿主細胞内で発現させることができる。かかる操作法は、サムブルークらの前記文献により開示されており、また当該技術分野において周知である。
原核細胞内での適切な発現には、遺伝子コーディング配列の上流でのリボソーム結合部位の存在も必要である。かかるリボソーム結合部位は、例えば、ゴールド（Gold,L）ら,Ann Rev.Microbiol.,35:365−404（1981）により開示されている。
真核性宿主には、in vivo又は組織培養でのいずれかの酵母、昆虫、真菌、及び哺乳動物細胞が含まれる。哺乳動物細胞では、タンパク質分子は、正確なフォールディング又は正確な部位でのグリコシル化を含む翻訳後修飾に付される。宿主として有用であり得る哺乳動物細胞には、VERO又はCHOの如き線維芽細胞起源の細胞又はハイブリドーマSP2/O−Ag14若しくはマウスメラノーマP3−X63Ag8の如きリンパ球起源の細胞、及びそれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物細胞は、遺伝的に欠損のある細胞の機能をin vivoで置き換えるよう意図された細胞である。骨髄幹細胞は、造血又は免疫系の障害の遺伝子治療に好ましい。
哺乳動物細胞宿主については、多くの可能なベクター系が単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの発現に利用可能である。宿主の性質に依り、幅広い種々の転写及び翻訳調節配列を用いることができる。これら転写及び翻訳調節シグナルは、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス、シミアンウィルス又はそれに類したものの如きウィルス性供給源から誘導することができる。この場合、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関係する。また、アクチン、コラーゲン、ミオシンの如き哺乳動物発現産物からのプロモーターが、タンパク質産生を促進する。生きている昆虫を用いる場合、現時点では蚕の幼虫及びバキュロウィルスベクターが本発明による大規模単独キメラ受容体ポリペプチド又は複数キメラ受容体ポリペプチド産生に好ましい宿主である。例えば、アウスベルの下記文献、サムブルークの前記文献を参照のこと。
望ましい場合は、発現した単独キメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドを、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、又はそれらに類したものの如き慣用的条件に従って単離及び精製してもよい。例えば、細胞を遠心分離によって又は適当な緩衝剤で採集し、溶解し、そして、例えば、DEAE−セルロース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸−アガロース、ヒドロキシアパタイトでのカラムクロマトグラフィーによって又は電気泳動若しくはイムノプレシピテーションによってタンパク質を単離することができる。また、ERR由来アミノ酸置換を含有するタンパク質と依然として反応する抗受容体ポリペプチド抗体の如き特異性抗体を用いることによって、キメラ受容体タンパク質を単離することができる。かかる抗体は、周知の方法により得ることができる。
更には、本発明の遺伝子構築体を操作すると、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの膜貫通及び細胞質内部分上に特定のウィルス結合ドメインを移植できるか、又は別の分子の膜貫通及び細胞質内部分上に単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドのレトロウィルス受容体結合ドメインを移植でき、更に別のタイプのキメラ分子にすることができる。
キメラ受容体細胞又は組織の調製
本発明は、レトロウィルス感染の如き与えられた非ヒトウィルスのenv結合ドメインによる結合を受け易いヒト又はその他の真核細胞又は組織を与える方法にも関する。
この方法は、随意に、まず、真核細胞又は組織を、キメラ受容体ポリペプチドをコードする発現可能な核酸で、in vitro、in vivo又はin situで形質転換して、非特異性ウィルスの細胞外ウィルスenv結合ドメインに結合することができるキメラ受容体ポリペプチドを発現できる組換えキメラ受容体細胞又は組織を作ることを含む。
組換えDNA法の一般的原理を述べた標準的な文献には、ワトソン（Watson,J.D.）ら,Molecular Biology of the Gene,Volumes I and II,The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.,publisher,Menlo Park,CA（1987）；ダーネル（Darnell,J.E.）ら,Molecular Cell Biology,Scientific American Books,Inc.,publisher,New York,N.Y.（1986）；レビン（Lewin,B.M.）,Genes II,John Wiley ＆ Sons,publisher,New York,N.Y.（1985）；オールド（Old,R.W.）ら,Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering,2d eddition,University of California Press,publisher,Berkeley,CA（1981）；サムブルークら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY（1989）；及びアウスベルら,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,N.Y.,（1987,1993）が含まれる。これら文献は参照によってその全体がここに組み入れられるものとする。
そのような方法においては、次のものから選択される１種によりin vivo形質転換を行うのが好ましい、即ち、既知の方法による、組織又は細胞内への突然変異型核酸の注入；組織又は細胞に特異的な少なくとも１つの組織特異的調節配列の制御下で突然変異型核酸を含む組換えレトロウィルスを用いるレトロウィルス感染；組織又は細胞への突然変異型核酸のリポソーム運搬；組織又は細胞への突然変異型核酸の抗体運搬；又は突然変異型核酸に接合した細胞又は組織特異性抗体の組織又は細胞との接触。
そのような方法においては、次のものから選択される１種によりin situ又はin vitro形質転換を行うのが好ましい、即ち、既知の方法による、組織又は細胞内への突然変異型核酸の注入；発現可能な形で突然変異型核酸を含む組換えレトロウィルスを用いるレトロウィルス感染；突然変異型核酸のリポソーム運搬；突然変異型核酸の抗体運搬；突然変異型核酸での組織又は細胞の形質移入；又は突然変異型核酸に接合した細胞又は組織特異性抗体の組織又は細胞との接触。ウィルスが組換えマウスエコトロピック又はハムスターアンフォトロピックレトロウィルスであり、キメラ受容体ポリペプチドがここに示したキメラ受容体ポリペプチドであるのが更に好ましい。
本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、幾つかの細胞型、特にＴリンパ球及び単球／マクロファージ系列の細胞内で膜内在性タンパク質（integral membrane protein）として細胞表面上で発現され得る。これは、HIV−１及びHTLV−１の如き既知のヒトレトロウィルスのin vitro向性（tropism）と合致する。かくして、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、正常では非ヒト特異性ウィルス感染に抵抗性であるヒトにおけるこれら系列の細胞をかかるウィルスで感染されるようにするであろう。
ERRタンパク質で行うよりも本発明のキメラ受容体ポリペプチド置換受容体で非マウス細胞を形質転換することの主要な利点は、免疫原性の大きな低下である。
他の態様においては、本発明は、ここに記載した方法により作られた修飾キメラ受容体細胞又は組織を包含する。この場合、真核細胞又は組織は、哺乳動物、昆虫、鳥類又は酵母起源から選択されるがこれらに限定されない。哺乳動物細胞又は組織がヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ又はネコ起源のものであるのが好ましいが、他のあらゆる哺乳動物細胞を用いることができる。
トランスジェニック及びキメラ非ヒト哺乳動物
本発明は、ヒトレトロウィルス受容体として役立つことができる単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドをコードする本発明によるゲノミックDNAをその生殖細胞及び体細胞が含有するトランスジェニック非ヒト真核動物（好ましくはマウスの如きげっ歯類）にも向けられている。単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチド核酸は、トランスジェニックにされるべき動物又はその動物の祖先に、胚形成期に、好ましくは一細胞期、又は受精した卵母細胞期に、一般には約８細胞期より遅くはない時期に導入される。ここで用いる“トランスジェン”という用語は、動物のゲノム内に組み込まれそしてその動物内で発現され、そのトランスジェニック動物内にタンパク質を存在させる遺伝子を意味する。
そのような遺伝子を既知の方法に従って染色体に組み込んで発現させるために、動物胎児のゲノム内に導入することができる幾つかの手段がある。
全部よりも少ない桑実胚の細胞がトランスジェニック哺乳動物の作成プロセス中に形質移入されるときに作られる動物の如き、全部よりも少ない体細胞及び生殖細胞が本発明のキメラ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチド核酸を含有するキメラ非ヒト哺乳動物も、本発明の範囲内になるよう意図されている。
移植したヒト細胞又は組織をその体内に有するキメラ非ヒト哺乳動物も本発明に包含される。この哺乳動物は、ヒト組織内でのキメラ受容体ポリペプチドの発現を試験するのに及び／又は本発明のキメラ受容体ポリペプチドに優先的に結合する運搬ベクターを伴った治療薬及び／又は診断薬の有効性を試験するのに用いることができる。キメラ非ヒト哺乳動物を得る方法は、例えば、米国特許出願第07/508,225、07/518,748、07/529,217、07/562,746、07/596,518、07/574,748、07/575,962、07/207,273、07/241,590及び07/137,173に示されている。なお、どのようにしてヒト細胞又は組織を非ヒト哺乳動物の体内に移植するかのそれらの記載については、参照により全体がここに組み入れられるものとする。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成についてレーダー（Leder）の米国特許第4,736,866号（参照によりその全体がここに組み入れられるものとする）に記載された技術を、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成に用いてもよい。パルミター（Palmiter,R.）ら,Ann Rev.Genet.,20:465−99（1986）に記載された種々の技術も用いることができる。なお、この全内容は、参照によりここに組み入れられるものとする。
ヒトレトロウィルス感染又はかかる感染の結果として起こる疾患を予防、抑制又は治癒することのできる化合物又は他の治療法を、細胞を感染するそれらレトロウィルスについて試験するために、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドを受容体として用いて、キメラ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチド遺伝子を保持する動物を用いることができる。これら試験は、この発明のトランスジェニック動物に与えられるウィルスの用量を調節することができるので、非常に感度が高くなり得る。かかる動物は、同じヒトレトロウィルス疾患の診断法を試験するためのモデルとしても役立つであろう。かかる疾患には、エイズ、HTLV誘発白血病、及びそれに類したものが含まれるが、これらに限定されない。本発明によるトランスジェニック動物は、細胞培養用の細胞の供給源としても用いることができる。
本発明のトランスジェニック動物モデルは、ヒト免疫系の適当な細胞を有するそれぞれ別々のマウスを再集団化することが必要なためにかなり多くの時間と実験を要する“SCIDマウス”モデル（マクキュン（McCune,J.M.）ら,Science,241:1632−1639（1988））よりも大きな経済的利点を有している。
キメラ受容体又はH13特異性抗体及び方法
この発明は、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドのエピトープに特異的な抗体にも向けられている。更なる態様においては、本発明の抗体は、レトロウィルス感染を予防又は治療するのに、細胞内の又は細胞若しくは組織抽出物内の又は体液内の単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの存在を検出するのに、又はその量若しくは濃度を測定するのに用いられる。一般的には、コリガン（Coligan）の前記文献及びハーロー（Harlow）の下記文献を参照のこと。
“抗体”という用語は、ハイブリドーマ、組換え法又は化学合成の如きあらゆる既知の方法によって与えられる、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、及びそれらのフラグメントを含む。
抗体は、ある分子と特異的に反応し、それによってその分子をその抗体に結合させるのであれば、その分子と“結合することができる”と言われる。“エピトープ”という用語は、ある抗体により結合されることができそしてその抗体により認識されることもできるあらゆる分子の部分のことをいう。エピトープ又は“抗原決定基”は、通常、アミノ酸又は糖側鎖の如き分子の化学的に活性な表面群体からなり、特異的３次元構造特性並びに特異的荷電特性を有している。
“抗原”は、抗体により結合されることができ、更に動物がその抗原のエピトープに結合できる抗体を産生するのを誘発することができる分子又は分子の一部分である。抗原は１つまたは２つ以上のエピトープを有しうる。上で言及した特異的反応は、抗原が高い選択性でその対応する抗体と反応するが、他の抗原により喚起され得る他の多数の抗体とは反応しないことを示そうとするのもである。
ポリクローナル抗体は、ある抗原で免疫感作された動物の血清から誘導される抗体分子の異種個体群である。
モノクローナル抗体は、特異性抗原に対する抗体の実質的に同種の個体群である。MAbは、当業者に知られている方法により得ることができる。例えば、コーラー（Kohler）とミルスタイン（Milstein）,Nature,256:495−497（1975）及び米国特許第4,376,110号を参照のこと。また、例えば、アウスベルら編,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.,（1987,1992）；及びハーローとレーン（Lane）,Antibodies:A Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory（1988）；コリガンら編,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.,（1992,1993）を参照のこと。かかる抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、及びそれらのあらゆるサブクラスを含むあらゆるイムノグロブリンクラスのものであってもよい。この発明のmAbを産生するハイブリドーマは、in vitroでもin vivoでも培養することができる。in vivo産生での高力価mAbの産生は、これを現時点で好ましい産生方法にする。簡単に説明すると、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスタン感作したBalb/cマウスに腹腔内注射して、高濃度の所望のmAbを含有する腹水を生成させる。当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、アイソタイプIgM又はIgGのmAbを、かかる腹水から、又は培養上澄み液から精製することができる。
キメラ抗体は、マウスmAb由来の可変部とヒトイムノグロブリン不変部とを有するものの如き、その異なる部分が異なる動物種から誘導された分子である。キメラ抗体及びそれらの産生方法は当該技術分野で既知である（例えば、モリソン（Morrison）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:6851−6855（1984）；ヌーバーガー（Neuberger）ら,Nature,314:268−270（1985）；サン（Sun）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:214−218（1987）；ベター（Better）ら,Science,240:1041−1043（1988）；ベター（Better,M.D.）国際特許公開WO9107494を参照のこと、なお、これら文献は参照により全体がここに組み入れられるものとする）。
抗イディオタイプ（抗Id）抗体とは、ある抗体の抗原結合部位に広く関連する独特な決定基を認識する抗体である。Id抗体は、mAbの供給源と同じ種及び遺伝型（例えば、マウス株）の動物を、それに対する抗Idを調製しようとするmAbで免疫感作することによって調製することができる。免疫感作された動物は、その免疫感作抗体のイディオタイプ決定基を認識し、そしてこれらイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Id抗体）を産生することによって応答するであろう。
抗Id抗体を“免疫原”として用いて、更に他の動物に免疫応答を誘発させ、いわゆる抗抗Id抗体を産生させることもできる。この抗抗Id抗体は、抗Idを誘発したもとのmAbに対して構造的類似性を有し得る。かくして、mAbのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、特異性が同一の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
従って、本発明の単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドに対して生成したmAbを用いて、Balb/cマウスの如き適当な動物内で抗Id抗体を誘発させることができる。かかる免疫感作マウスからの脾臓細胞は、抗Id mAbを分泌する抗Idハイブリドーマを産生させるために用いられる。更に、この抗Id mAbをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）の如きキャリヤーにカップリングさせて、更なるBalb/cマウスを免疫感作するのに用いることができる。これらマウスからの血清は、キメラ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチドエピトープに特異的なもとのmAbの結合特性を有する抗抗Id抗体を含有するであろう。
かくして、抗Id mAbは、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドのエピトープの如き評価されるエピトープと構造的に類似するそれら自身のイディオタイプエピトープ又は“イディオタイプ”を有する。
上で示した“抗体”という用語は、無傷分子並びに例えばFab及びＦ（ab'）_２の如き抗原と結合できるそのフラグメントの両方を含めようとするものである。Fab及びＦ（ab'）_２フラグメントは、無傷抗体のFcフラグメントを欠いており、無傷抗体よりも急速に循環系から消え、そして無傷抗体よりも少ない非特異的組織結合性を有することができる（ウォール（Wahl）ら,J.Nucl.Med.,24:316−325（1983））。
抗体診断検定法
本発明に有用な抗体のFab及びＦ（ab'）_２及びその他のフラグメントを、無傷抗体分子についてここに開示した方法に従って、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの検出及び定量に用いることができるということが分かるであろう。かかるフラグメントは、典型的には、パパイン（Fabフラグメントを生成させる）又はペプシン（Ｆ（ab'）_２フラグメントを生成させる）の如き酵素を用いるタンパク質分解によって作られる。
本発明の抗体、又は抗体のフラグメントは、それらの表面上又は細胞内で単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞の存在を定量的に又は定性的に検出するのに用いることができる。これは、光学顕微鏡、フロー・サイトメトリ、又は蛍光光度検出法を結び付けた、蛍光標識抗体を用いる免疫蛍光法（以下を参照のこと）によって行うことができる。
単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドのin situ検出のために、本発明の抗体を免疫蛍光法又は免疫電気顕微鏡法におけるように組織学に用いてもよい。そのような操作を用いることで、単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの存在のみならず、検査組織上でのその分布も測定することが可能になる。
更に、治療で用いた単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの存在及び量を追跡する手段の如き、本発明の抗体を用いて、生体サンプル中の可溶性単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドの存在を検出することができる。
単独のキメラ受容体ポリペプチド又は複数のキメラ受容体ポリペプチドについてのかかる免疫検定法は、典型的には、体液、組織抽出物、採取したばかりのリンパ球又は白血球の如き細胞、又は組織培養液中でインキュベートした細胞の如き生体サンプルを、H13タンパク質を同定できる検出できるよう標識した抗体の存在下でインキュベートし、そして当該技術分野において周知の幾つかの技術のうちのいずれかによってその抗体を検出することを含む。
生体サンプルをニトロセルロースの如き固相支持体又はキャリヤー（この用語はここでは相互に交換可能に用いられる）、又は細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を免疫感作できる他の固体支持体で処理することができる。次いで、この支持体を適当な緩衝液で洗浄した後、検出できるよう標識した単独のキメラ受容体ポリペプチドに特異的な抗体又は複数のキメラ受容体ポリペプチドに特異的な抗体で処理することができる。次いで、この固相支持体を緩衝液で２回洗浄して未結合抗体を除去することができる。次いで、前記固体支持体上に結合した標識の量を、慣用的手段によって検出することができる。
“固相支持体”又は“キャリヤー”により、抗原又は抗体に結合できるあらゆる支持体が意図される。周知の支持体、又はキャリヤーには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱が含まれる。
所与のロットの抗キメラ受容体ポリペプチド又は抗キメラ受容体ポリペプチド抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定することができる。当業者は、日常的な実験を用いることによって、それぞれの測定について効力がありかつ最適な検定条件下で測定できるであろう。
単独のキメラ受容体ポリペプチドに特異的な抗体又は複数のキメラ受容体ポリペプチドに特異的な抗体を検出できるよう標識できる１つの方法は、それを酵素に連結して、既知の方法による酵素免疫検定法（EIA）に用いることによる方法である。
検出は、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,ワーク（Work）ら,North Holland Publishing Company,New York（1978）、特にチャード（T.Chard）により“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques"と題された章に関する如き、他の種々の免疫検定法のいずれかを用いて行うことができる。なお、上記文献は参照により全体がここに組み入れられるものとする。
この抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。
この抗体を¹⁵²Eu又はランタン系列のその他のものの如き蛍光放出性金属を用いて検出できるよう標識することもできる。これら金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）のような金属キレート化群を用いて抗体に結合させることができる。
この抗体を化学発光性化合物にカップリングさせることによって検出できるよう標識することもできる。次いで、この化学発光標識抗体の存在を、化学反応の間に発生するルミネセンスの存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光性標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
同じく、生物発光性化合物を用いて本発明の抗体を標識してもよい。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系内に見出される化学発光の１タイプである。生物発光性タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって測定される。標識に重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
本発明の抗体分子を“二部位（two site）”又は“サンドイッチ”検定法としても知られている免疫測定法での利用に適合させることができる。
典型的で好ましい免疫測定法には、固相に結合させた抗体を試験されるサンプルとまず接触させ、二成分の固相抗体−抗原複合体の形成によってそのサンプルから抗原を“抽出”する“フォワード”検定法が含まれる。適当な時間インキュベーションした後、固体支持体を洗浄して、未反応抗原がもしあればそれを含む液体サンプルの残渣を除去してから、未知量の標識抗体（これは“受容体分子”として機能する）を含有する溶液と接触させる。未標識抗体を介して固体支持体に結合した抗原とこの標識抗体が複合化できる時間だけ２回目のインキュベーションをした後、固体支持体を２回洗浄して未反応の標識抗体を除去する。
本発明の抗原でやはり有用である他のタイプの“サンドイッチ”検定法では、いわゆる“同時”及び“リバース”検定法が用いられる。同時検定法は、固体支持体に結合した抗体及び標識抗体が両方とも、試験されるサンプルに同時に添加される単一のインキュベーション工程を包含する。インキュベーションが終わった後、固体支持体を洗浄して液体サンプルの残渣と未複合化標識抗体とを除去する。次いで、固体支持体と結合した標識抗体の存在を慣用的な“フォワード”サンドイッチ検定法の通りに測定する。
“リバース”検定法では、まず標識抗体の溶液を液体サンプルに段階的に添加してから、適当な時間インキュベーションした後に、固体支持体に結合した未標識抗体を添加する。２回目のインキュベーション後に、慣用的なやり方で固相を洗浄して試験されるサンプルの残渣と未反応標識抗体の溶液とを除去する。次いで、固体支持体に結合した標識抗体の測定を“同時”及び“フォワード”検定法における通りに行う。
キメラ受容体及び／又はH13ポリペプチド及び／又はキ メラ細胞又は組織を包含する治療及び診断方法
本発明により治療方法も提供される。その方法は、キメラ受容体ポリペプチドをコードする少なくとも１種の発現可能な核酸を有する組織又は細胞を、キメラ受容体ポリペプチドを発現するか又はそれが表面上に結合した細胞だけを認識する組換え非ヒト特異性レトロウィルスベクターによる感染に付するものであり、そのレトロウィルスベクターは、そのベクターの非ヒト特異性のために及び複製コンピテンスを提供するための復帰突然変異、突然変異又は組換え能力が比較的欠如しているために、他のヒト細胞を感染できない。本発明によれば、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を有する組換えレトロウィルスにより感染させることによって、キメラ受容体ポリペプチドが標的細胞に選択的に会合できるか又は標的細胞上で発現される。この一時的及び／又は永久の会合が、特定の受容体を有する病的な細胞の如き標的細胞、並びに構成的にキメラ受容体ポリペプチドが発現される場合におけるかかる病的な細胞の子孫に、キメラ受容体ポリペプチドを選択的に曝させるか又はそれを選択的に発現させる結果、本発明に従い、かかる標的細胞及び／又はそれらの子孫への治療薬の特異的運搬が可能となるのである。
かくして、本発明により、キメラ受容体ポリペプチドを細胞表面受容体の如き標的細胞特異性細胞表面分子と一時的又は永久に会合させ、次いでこのキメラ受容体ポリペプチドと結合して標的細胞を感染する組換えレトロウィルスを投与することによる、特異型の標的細胞を（随意に組換え体、キメラ受容体ポリペプチドの染色体発現、それらの子孫で）マーキングする方法が提供される。感染性ウィルスベクターは、１又は２以上の機能を付与するあらゆる多様な治療用核酸又は治療性遺伝子を保持していてもよい。
１つの非限定的な例においては、キメラ受容体ポリペプチドを、抗体、リポソーム又は標的細胞特異性受容体リガンドの如き標的細胞特異性ベクターとの会合によって第一の種の標的細胞に特異的に運搬する。そうすると、このキメラ受容体ポリペプチドが標的細胞と十分な時間会合して、このキメラ受容体ポリペプチドと結合することができる第一の種以外の種に特異的なウィルスの受容体結合又はenvドメインと会合した治療薬又は診断薬を用いる治療又は診断が可能になる。こうして、治療性又は診断性核酸の如き治療薬又は診断薬が、標的細胞に優先的に運搬され、例えば、この核酸が標的細胞の染色体中に組み込まれる場合は、非標的細胞が排除される。
他の非限定的な例として、ウィルスベクターが細胞の中に修飾レトロウィルス受容体遺伝子を運べるかも知れない。標的細胞が感染されると、その標的細胞はキメラ受容体ポリペプチドをコードするDNAと一体となる。そうして、続いて標的及び細胞及び全ての子孫が標的細胞表面上でキメラ受容体ポリペプチドを発現するであろう。本発明に従ってキメラ受容体ポリペプチドでかかる標的細胞及びそれらの子孫をマーキングすることにより、遺伝子治療を用いて病気を患っている動物被験体を治療することができる。この場合、遺伝子治療ベクターは、キメラ受容体ポリペプチドに特異的に結合して標的細胞に治療薬又は診断薬を運搬する。本発明のかかる方法を用いると、非特異性レトロウィルスベクター感染及び染色体内への遺伝子挿入の危険を実質的に低下させて又は低下させないで、特定の病気を治療することができる。
本発明によれば、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を、特定のタイプの標的細胞に特異的な受容体に特異的に結合するポリペプチドをコードする配列と結合させる。組換え宿主内でそのような核酸を発現させると、治療的投与に適する融合タンパク質を回収可能な量で得られる。次いで、この薬学的に許容できる融合タンパク質を病気の被験体に投与することができる。そうすると、この融合タンパク質は標的細胞に特異的に結合して、本発明による非ヒト特異性ウィルスのenv結合ドメインとして作用するであろう。続いて、多様な遺伝子のいずれかをコードする核酸を有する非ヒト特異性ウィルスを投与すると、感染細胞に１又は２以上の機能を与えることができ、その細胞に正又は負の治療効果をもたらすであろう。
更なる非限定的な例として、ヒト腫瘍細胞表面受容体に特異的な抗体の抗体フラグメントへの融合タンパク質としてキメラ受容体ポリペプチドを用いて、ヒト腫瘍を治療することができる。薬学的に許容できる形でのそのような融合タンパク質を動物モデル又はヒト被験者に投与して、キメラ受容体ポリペプチドをコードするDNAを有する非ヒト特異性レトロウィルスによる感染用に腫瘍細胞をマーキングする。この融合タンパク質が標的細胞としての腫瘍細胞に結合したら、第２段階はこのレトロウィルスの投与からなるものであって、腫瘍細胞に感染すると、その感染した腫瘍細胞のサブサール（subsall）並びにそれらの子孫によるキメラ受容体ポリペプチドの発現がもたらされる。腫瘍細胞がキメラ受容体ポリペプチドを構成的に発現すると、実質的に非標的細胞に感染することなしに遺伝子治療を安全に用いて、標的細胞としての腫瘍細胞に治療薬を運搬することができる。しかしながら、この細胞が第２段階を介してこの受容体を発現する必要はない。事実、第２段階は、当業者によって決定されるときは、全体として省略してもよい。
非限定的な副次的例として、ヒト腫瘍細胞に特異的なB3抗体フラグメントを用いて融合タンパク質と遺伝子治療を提供することができる。この場合、特異性病的細胞特異性抗体又は結合タンパク質は、まず融合タンパク質として発現され、（ａ）病的細胞に結合して、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を有する非ヒト特異性ウィルスによるin vitro及びin vivoでの感染を可能にする結果、そのウィルス感染病的細胞の表面上でキメラ受容体ポリペプチドが発現され、（ｂ）キメラ受容体ポリペプチドに結合する運搬ベクターとしてのenv結合ドメインと会合した少なくとも１種の治療薬により、ウィルス感染標的細胞がin vitro及びin vivoで死滅する。好ましくは、既知の方法に従い、ヒトの臨床治療の前に動物モデル系を用いてもよい。
エコトロピック又はアンフォトロピックウィルスの如き組換え非ヒト特異性ウィルスにより感染されることになる動物又はヒトの細胞若しくは組織へのキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸の選択的導入は、既知の方法に従って行うことができる。非限定的な例には、（幹細胞又は間質細胞のような）骨髄細胞、白血球、及び分化した又は分化していない顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球、赤血球、巨核球、中枢神経系の細胞、及び神経組織の如き組織細胞、肝細胞、腎細胞、筋肉細胞、心臓細胞又は心筋細胞、動脈又は静脈細胞又は組織、眼細胞、結合組織又は細胞、肺組織又は細胞、脾臓細胞又は組織、内分泌組織又は細胞、CSF、又は中枢神経系の細胞の如きヒト細胞又は組織の、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸でのin vitro形質転換、その後のヒト被験者内への再導入；又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸の、筋肉、心臓、肝臓、腎臓、脳、神経、脾臓、膵臓、精巣、卵巣、脳下垂体、視床下部、胆嚢、眼、肺、又は骨髄の如き組織内へのin vivo又はin situでの直接注射が含まれる。
かくして、本発明の一側面においては、少なくとも１種の治療薬又は診断薬をキメラ受容体保有細胞又は組織に移す方法が提供される。この方法は、本発明によるキメラ受容体細胞又は組織を得ること及びそのキメラ受容体細胞又は組織を、非ヒトウィルスのenv結合ドメイン及び少なくとも１種の治療薬又は診断薬を含む運搬ベクターとin vitro、in vivo又はin situで接触させることを含む。その結果、この運搬ベクターがキメラ修飾細胞に結合して、その治療薬又は診断薬がそのキメラ受容体細胞に治療又は診断効果をもたらす。
治療薬又は診断薬は、本発明の方法に従い、キメラ受容体細胞又は組織としての標的細胞に、このキメラ受容体細胞上で細胞外発現されるキメラ受容体ポリペプチドのキメラ受容体に特異的であるウィルス外膜タンパク質のenv結合ドメインを含む運搬ベクターによって選択的に運搬される。
運搬ベクター
運搬ベクターは、ウィルスベクター、リポソーム、又は診断薬若しくは治療薬と会合したenv結合ドメインの複合体であってもよい。
運搬ベクターは、更に、その運搬ベクターの標的細胞としてのキメラ受容体細胞に治療又は診断効果をもたらす何らかの診断薬又は治療薬を含んでもよい。
診断薬又は治療薬
診断薬又は治療薬は、核酸、化合物、タンパク質、元素、脂質、抗体、サッカライド、アイソトープ、炭水化物、画像形成剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可能なプローブ、及び抗体又はそのフラグメント、又はそれらの組み合わせから選択される少なくとも一種であってもよいが、これらに限定されない。なお、抗体の標識については、ここに記載したようにして、検出できるように標識することができる。かかる標識には、酵素標識、ラジオアイソトープ又は放射性化合物又は元素、蛍光化合物又は金属、化学発光性化合物及び生物発光性化合物が含まれるが、これらに限定されない。また、本発明の方法では、他のあらゆる既知診断薬又は治療薬を用いることができる。
治療薬の標的細胞
本発明で用いる治療薬は、キメラ受容体細胞としての標的細胞への治療効果を有することができ、その効果は、欠損遺伝子又はタンパク質の矯正、薬物作用、毒性効果、成長刺激効果、成長抑制効果、代謝効果、異化作用、同化効果、抗ウィルス効果、抗菌効果、ホルモン効果、神経液性効果、細胞分化刺激効果、細胞分化抑制効果、神経修飾効果、抗新生物効果、抗腫瘍効果、インシュリン刺激又は抑制効果、骨髄刺激効果、多能性幹細胞刺激効果、免疫系刺激効果、及び本発明による運搬ベクターを介してキメラ受容体細胞に運搬される治療薬によって与えられ得る他のあらゆる既知の治療効果から選ばれるが、これらに限定されない。
治療用核酸
治療薬としての治療用核酸は、キメラ受容体細胞に次の治療効果のうちの少なくとも１種を有することができるが、これらに限定されない:DNA配列の転写を抑制すること;RNA配列の翻訳を抑制すること;RNA又はDNA配列の逆転写を抑制すること；タンパク質の翻訳後修飾を抑制すること;DNA配列の転写を誘発すること;RNA配列の翻訳を誘発すること;RNA又はDNA配列の逆転写を誘発すること；タンパク質の翻訳後修飾を誘発すること;RNAのような核酸の転写；タンパク質又は酵素のような核酸の翻訳；及び治療用核酸の構成的又は一過的発現のためのキメラ受容体細胞の染色体への核酸の組み込み。
治療効果
かかる治療効果は、アンチセンスANA又はDNAの如き欠損遺伝子の消去又はその発現のプロセシング；ウィルス複製又は合成の抑制；治療用タンパク質をコードする異種核酸の発現又は欠損タンパク質の矯正のような遺伝子治療;hnRNA、mRNA、tRNA、又はrRNAの如きRNAの欠損体又は不十分発現体の修飾；ドラッグ若しくはプロドラッグ、又はキメラ受容体を発現する病的又は正常細胞内でドラッグ又はプロドラッグとしての化合物を生成する酵素をコードすること；チミジンキナーゼ水痘−帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ（VZV TK）（例えば、フーバー（Huber）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:8039−8042（1992）を参照のこと、なお、この全内容はそこでの引用文献を含めて参照により組み入れられるものとする）を新生物細胞の如き病的細胞内でコードして、かかる病的細胞を直接又は間接に死滅させること；及び他のあらゆる既知の治療効果を含むことができるが、これらに限定されない。かくして、上記の如き変異型核酸を遺伝子治療に用いることができる。
病的細胞への運搬のために既知のあらゆる毒素、プロドラッグ又はドラッグ遺伝子をコードするか又は治療効果を提供する本発明の治療用核酸は、新生物細胞の如き病的細胞に特異的な組織特異的転写調節配列（TRS）（α−胎児性タンパク質TRS又は肝臓関連アルブミンTRSを含む）（例えば、ダイナン（Dynan）とチアン（Tjian）,Nature（London）316:774−778（1985）を参照のこと）の制御の下で遺伝子を含むこともできる。かかるTRSは、本発明のキメラ受容体ポリペプチドを発現する癌細胞のような標的細胞内の細胞死滅性毒素、ドラッグ又はプロドラッグの発現を更に制限するであろう。
キメラ受容体細胞内に運搬されて発現される本発明の治療用核酸の更なる例は、脳腫瘍細胞の如き真核性デバイディング（dividing）細胞を選択的に死滅させるチミジンキナーゼをコードする治療用核酸である。なお、この腫瘍細胞を囲む脳細胞はデバイディングではない。従って、キメラ受容体ポリペプチドをコードする本発明の核酸を脳細胞に注射し、又はその核酸で脳細胞を形質移入又はin vivoでウィルスベクター形質転換した後に、チミジンキナーゼをコードする組換えエコトロピックレトロウィルスでそのキメラ受容体脳腫瘍細胞を治療処理すると、その脳腫瘍細胞がチミジンキナーゼの発現によって選択的に死滅するであろう。例えば、アンダーソン（F.Anderson）ら,Science,June,1992を参照のこと。
また、疾患に対し高い罹患率をもたらす異常H13分子を、変異型H13タンパク質の如きキメラ受容体ポリペプチドで形質移入された所望の系列の細胞（例えば、造血幹細胞）の注入によって、その注入された細胞が内因性の細胞個体群と優先的に置き換わるような条件下で置き換えてもよい。
本発明の方法では、運搬ベクターが組換え非ヒト特異性ウィルスであるのが好ましい。そうすれば、その非ヒト特異性ウィルスのキメラ受容体細胞又は組織への結合が、その修飾受容体細胞の感染とキメラ受容体細胞内の治療用核酸の治療効果をもたらす。他の好ましい態様においては、運搬ベクターが、リンカーによって治療薬又は診断薬に結合していて、その結合又は接触が所望の治療的又は診断効果をもたらす、非ヒト特異性env結合ドメインを含む複合融合タンパク質又はそれをコードする核酸を含む。なお他の好ましい態様においては、運搬ベクターは、env結合ドメインと治療薬を含有するリポソームを更に含んでもよい。そうすれば、env結合ドメインがキメラ受容体細胞のキメラ受容体結合部位と結合できる。
他の好ましい態様においては、運搬ベクターのキメラ受容体細胞又は組織との接触が、治療用核酸の治療的有効量の発現産物を発現するキメラ受容体細胞又は組織をもたらすことができる。
他の好ましい態様においては、治療用核酸は、キメラ受容体含有細胞又は組織を選択的に死滅させるように作用する毒素をコードする。病的細胞は癌細胞であってもよい。他の態様においては、治療用核酸は、上皮増殖因子、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、組織増殖因子−α、インシュリン増殖因子−１、又は線維芽細胞増殖因子から選択される増殖因子を更にコードしてもよい。
毒素は、精製されても又は組換え型毒素であってもよく、又は、例えば、リシン、シュードモナス解毒素、ジフテリア毒素、内毒素、毒液毒素、及びそれらに類したものの少なくとも１種から選択された毒素の少なくとも１つの機能性細胞毒性ドメインを含む毒素フラグメントであってもよい。
治療用核酸は、キメラ受容体細胞又は組織内での異常タンパク質の発現を遮断するように作用する単鎖リボソーム阻害性タンパク質から選択された少なくとも１メンバー；サイトカイン；又は増殖因子をコードしてもよい。
本発明の他の側面によれば、細胞毒性又は化学療法性物質を、標的キメラ受容体細胞としての病的細胞に優先的に結合する、env結合ドメインを有する運搬ベクターに又は抗体若しくはそのフラグメント又は増殖因子に直接に結合させてもよい。このタイプの治療のための標的は、増殖因子受容体、分化抗原、又は他の病的細胞と特異的に会合した他のあまり特徴付けされていない細胞表面抗原であってもよい。今日では、多くの癌は、オンコ遺伝子として又はオートクリン（autocrine）な様式で癌細胞の増殖を促進するよう機能できる増殖因子受容体を過剰産生することが確認されている（パスタン（Pastane）とフィツゲラルド（Fitzgerald）,1991;ベル（Velu）ら,1987;カワノら;1988;ヘルストロム（Hellsttom）＆ヘルストロム,1989）。例えば、上皮増殖因子受容体は、多くの偏平上皮細胞及び類表皮癌、グリア芽細胞腫、及び幾つかの転移性卵巣及び膀胱癌に大量に存在する（細胞当たり３×10⁶受容体まで）（ヘンダー（Hender）ら,1984;ジョーンズ（Jones）ら,1990;ラウ（Lau）ら,1988）。対照的に、正常細胞は、細胞当たりより少ない量を含有できるに過ぎない（デュン（Dunn）ら,1986）。他の例では、インターロイキン−２（IL−２）受容体が、正常Ｔ細胞におけるよりも成人Ｔ細胞白血病の患者の細胞上に相当多くの数で存在する（ATL;細胞当たり３×10⁴受容体）。
Ｂリンパ球の如き正常細胞上に存在する他の分化抗原も、Ｂ細胞リンパ腫の如き腫瘍細胞上に存在することが多い。かかる抗原はＢ細胞を産生する幹細胞上に存在しないので、標的療法によって死滅させられるあらゆる成熟Ｂ細胞は、幹細胞個体群から置き換えられるであろうが、一方、癌細胞は置き換えられないであろう（ゲティー（Ghetie）ら,1988）。最後に、その機能が未だ分かっていない癌細胞上で優先的に発現される抗原がある。癌胎児性抗原（CEA）（ムラロ（Muraro）ら,1985）の如きこれらの幾つかのものは、胎児性抗原であって、正常成人組織上に存在しないか又は少量だけ存在するかのいずれかである。このグループは、モノクローナル抗体とのそれらの反応性によって規定されるに過ぎない未知の起源の抗原も含有する（フリーンケル（Fraenkel）ら,1985;バルキ（Varki）ら,1984;ウィリンガム（Willingham）ら,1987）。
本発明の治療用又は診断用運搬ベクターの成分として用いることができる単鎖抗原結合タンパク質は、それらの大きさが小さいために臨床応用において数多くの利点を有している。これらタンパク質は、モノクローナル抗体又はFabフラグメントよりも速く血清から除去される。それらは細胞受容体により認識される抗体のFc部分を欠いているので、それらは画像形成に応用した場合のバックグランドが低く、免疫原性も低い。それらは、モノクローナル抗体よりも良好に固体腫瘍を取り囲む微小循環に浸透するとも考えられる。
そのような治療用運搬ベクターでは、治療薬は毒素又は毒素フラグメント若しくはドメインであり、リシン、シュードモナス・エキソ毒素、ジフテリア毒素、チミジンキナーゼ、及びそれらに類したものの少なくとも１つから選択された毒素の少なくとも１種の機能性細胞毒性ドメインを含む精製された又は組換え型毒素又は毒素フラグメントの如きものである。例えば、癌治療に組換え型毒素を用いることは当該技術分野で知られている（例えば、パスタンとフィツゲラルドScinece,November 22,1991,pp.1173−1177,及びそこに引用された文献、これら文献は参照によりその全体がここに組み入れられるものとする）。
in vivo遺伝子治療にとってより安全なベクターの獲得
in vivo遺伝子治療処理の安全限界を高めるのに用いることができる３つの異なる手段を使用することが、本発明により提供される。これら手段は：（ａ）異なるパッケージング細胞株の使用；（ｂ）アンフォトロピックよりむしろエコトロピックを基礎とするベクターの使用；及び（ｃ）in vivoでレトロウィルスベクターの標的を所望の細胞個体群に設定する方法を提供することである。
（ａ） 異なるパッケージング細胞株の使用
背景：
アンフォトロピックウィルスを基礎とするベクターを退かせることの安全性に関する問題は、高力価エコトロピックレトロウィルスベクターの産生のための新規な系を発見する動機を提供してきた。この戦略は、ヒト細胞はハムスター白血病ウィルスにより感染され得ないという事実（ステンバック（Stenback）ら,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.122:1219−1223,1966）に依拠している。ハムスター白血病ウィルスは、マウス、ラット、ネコ、サル及びヒト細胞を感染しようと試みたが失敗に終わったので、ハムスター細胞しか感染しないと報告されている（リーバー（Lieber）ら,Science,182:56−58 91973）。ハムスター細胞でのマウスエコトロピックウィルスの複製も用いることができる。これは、マウス又は修飾ヒトエコトロピック受容体をこれら細胞内に形質移入してから感染させることによって行われた。この戦略は、アンフォトロピックウィルスを複製するこれら細胞の天然の抵抗性を更に利用するものであり、これら細胞内でのマウスエコトロピックウィルス配列の増幅を繰り返すことによって高力価のエコトロピック発現を達成するものである。
関連する特定の方法
ベストウィック（Bestwick）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5404−5408,1988）のいわゆる“ピンポン”戦略に実質的に手を加える。どとらもヒト細胞内で正常に複製することができない２種のレトロウィルスを用いる。Ψ−HaLVを発現し；マウスエコトロピックウィルス受容体を安定に発現するチャイニーズハムスター細胞（細胞株Ａ）を用いてヘルパーウィルスを得、そしてΨ−エコトロピックMuLVを発現するがマウスエコトロピックウィルス受容体を発現しない第２チャイニーズハムスター細胞（細胞株Ｂ）と共に同時培養する。このように細胞株Ａ内で増殖したウィルスは、HaLV受容体を介して細胞株Ｂに感染することができる。この細胞内で複製されたウィルスは、マウスエコトロピックgp70を有し、そして細胞株Ａに感染することができる。このプロセスは、理論最大数（約10⁹〜10¹⁰PFU）の粒子の産生が達成されるまで続くと考えられる（ボディン（Bodine）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:3738−3742,1990）。ここで説明するように、混合パッケージング系同時培養でのレトロウィルス配列の増幅は、組織培養時間で割った増加コピー数と関係することが分かった（ヘソルファー（Hesorffer）ら,Hematology/Oncology Clinic of North America 5:423−432,1991）。更に、レトロウィルスベクターDNAは、それが細胞中に形質移入されたときは、プロウィルス組み込み後に得られるレベルに比較して相対的に発現が乏しいようなので（ベストウィックら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5404−5408,1988;ヒュアング（Huang）とギルボア（Gilboa）,J.Virol.,50:417−424,1984）、このアプローチは好ましい。
このアプローチに従えば、ゲノム内に組み込まれた多コピーのエコトロピックウィルス配列を含有し、そして少なくとも約10⁷〜10¹⁰、好ましくは約10⁹〜10¹⁰を産生するチャイニーズハムスター細胞株が提供されるが、それらのウィルス受容体が本発明に従って修飾されなければ、組換えで又は他の方法でヒト細胞に感染できる粒子は産生されない。この結果が得られたことを確認するために、ウィルス感染性を検出するために普通に用いられる種々のヒト及びマウス細胞株で適切なウィルス感染性検定を行う。このアプローチは、これまで利用可能であったよりも遙に安全なパッケージング系を生み出すと考えられる。
HaLVをクローン化してそのパッケージングシグナル内に欠失を生じさせる。パッケージングシグナルの除去は、既知の方法に従って得ることができる。次に、CHOハムスター細胞内へのマウスエコトロピックウィルス受容体の形質移入及び安定発現を既知の方法、例えば、ヨシモトら（1993）に記載されたような方法に従って行う。随意に、クローン化したヘルパーウィルスを追加の安全性のためのスプリットゲノム（split genome）としてこれら細胞内に導入してもよい。マウスエコトロピックウィルスヘルパーの場合、Ψパッケージング配列の134塩基対が欠失したエコトロピックモロニーマウス白血病ウィルスに相当する3POプラスミドから誘導したプラスミドpgag−polgpt及びpenvは、商業的供給機関から又はここに示した公表された研究者から容易に得ることができる。かかるプラスミドをうまく用いて、アンスプリット（unsplit）ヘルパーウィルスゲノムを用いるものよりも幾分高い安全性を有するPCLを生成させた。
HaLVをクローン化するために、既知の操作、例えば、組換え型チャイニーズハムスター卵巣細胞株からの欠損レトロウィルス粒子のクローニングに類似するアンダーソンら（1992）の操作を用いる。例えば、かかるクローンは、アンダーソンによって同定されたpCHOC.ML10配列又は内因性のポリトロピックマウス白血病ウィルス（MuLV）分離株、MX27（ストイ（Stoye）及びコフィン（Coffin）,1987）を含む。後者のプローブは、完全9.3kbプロウィルスゲノムを包含する12.3kbマウスゲノミックフラグメントからなる。ハムスターＣ型関連配列をlgt10内の粒子RNAのランダムにプライムしたcDNAから単離する。後者のプローブを用いる場合、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを用いて興味の対象であるプラークを同定する。細胞外粒子は、培養液組換え型CHO細胞サブクローン、３−3000−44（ラスキイ（Lasky）ら,1986）から調製される。このサブクローンは、マウスdhfrの遺伝子と１型ヒト免疫不全ウィルス（HIV−１）の組換え型外膜糖タンパク質（gp120）を含有する発現ベクターで形質移入した後のジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）欠乏CHO−DuxB11細胞（シモンセン（Simonsen）とレビンソン（Levinson）,1983;ウルラブ（Urlab）とチャシン（Chasin）,1980）から誘導した。CHO−K1細胞株（CHO−DUXB11細胞株の祖先）は、もとは成熟チャイニーズハムスターの卵巣バイオプシー（プック（Puck）ら,1958）から誘導されたものであるが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）の如き商業的供給機関から容易に入手できる。また、ハムスター配列をマウスエコトロピックウィルスの同等部分で修復する。アンダーソンらによって観察されたようにして、ウィルス粒子が産生されると考えられる。pCHOC.ML10配列は、そのエンドヌクレアーゼ遺伝子の３つ全てのリーディングフレーム内に潜在的コーディング配列の複数の中断を含んでいるので、もしもそのクローンが無傷エンドヌクレアーゼをコードしないならば、そのエンドヌクレアーゼ領域は、エコトロピックMuLVの如き同種レトロウィルスゲノムのそれで置き換えられることができる。HaLV表面外膜タンパク質は、その粒子が他のハムスター細胞を感染できるように適度に発現されるが、他の全てのHaLV遺伝子は必須ではないので（LTRはおそらく排除される）、同種MuLV配列によって置換可能である。クローンHaLVのΨ領域を欠失させるには、マーン（Mann）らの方法を用いる（Cell 33:153−159,1983）。
（ｂ）キメラ受容体ポリペプチドの使用
非限定的な例として、遺伝子運搬のために修飾されたエコトロピックレトロウィルス受容体（MERR）は、遺伝子治療中の癌及び関連する疾患の潜在的な発生率を低下させる筈である。
本発明の方法には幾つかの利点がある。第１に、マウスエコトロピックウィルスはヒト細胞内で複製できないので、思い浮かべられるどの組換えウィルスもヒト細胞に感染することはできないであろう。更には、遺伝子治療をする者は、感染されるのが望ましい標的細胞に対してだけ精巧な特異性で感染を限定できるであろう。種々のタイプの器官内のヒトゲノム全てにわたるウィルスの可能なランダム挿入が起こることは、ヒト感染性アンフォトロピックレトロウィルスを基礎とするベクターが用いられる時はいつでも考えられるようには、考えられず又示されもしないであろう。更に、本発明の方法は、修飾を最小限に止めたヒトウィルス受容体タンパク質を用いるので、感染したヒト細胞の免疫系による拒絶反応の可能性は、相当に低下されているか又は排除される。
（ｃ）標的指向性ベクターの様式
背景：
特にin vivo法についての本発明の好ましい側面は、標的細胞に治療効果を提供する組換え型非ヒト特異性エコトロピックウィルスによって感染される細胞の特異的標的化を可能にする運搬ベクターを用いて動物を治療する方法である。そのような物質の非限定的な例には、適当なリンカーペプチド及びマウスエコトロピックウィルス受容体又は修飾ヒトエコトロピック受容体と結合した細胞表面分子（MHCクラス１抗原の如きもの）に特異的な抗体のV_H及びV_L領域を包含する融合タンパク質が含まれる。また、膜受容体（上皮増殖因子受容体の如きもの）のリガンドは、マウスエコトロピックウィルス受容体又は修飾ヒトウイルスエコトロピック受容体と融合した。デザインは、その特異性が比較的簡単に修飾できるよう十分に柔軟なものとなろう。
医薬組成物：
少なくとも１種のキメラ受容体ポリペプチド又は抗体の如き本発明のタンパク質、ペプチド又は抗体を含む医薬組成物は、少なくとも１種の治療薬がその意図する目的を達成するに有効な量で含まれる全ての組成物を包含する。更に、少なくとも１種の治療薬を含有する医薬組成物は、活性化合物を薬学的に用いることができる製剤に加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む適当な薬学的に許容できる担体を含有してもよい。
医薬組成物は、注射による投与又は経口投与に適する溶液を含み、約0.001〜99％、好ましくは約20〜75％の活性成分（即ち、治療薬）を賦形剤と共に含有する。経口投与のための医薬組成物は、錠剤及びカプセル剤を含む。直腸に投与することができる組成物は座薬を含む。
治療薬の担体
活性成分のための担体は、噴霧できるものであっても噴霧できないものであってもよい。噴霧できない形態は、局所投与に助けとなる担体を含みそして好ましくは水の粘度よりも大きな動的粘度を有する半固体又は固体であってもよい。適する製剤には、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、クリーム剤、軟膏剤（ointment）、散剤、塗布剤、軟膏剤（salve）及びそれらに類したものが含まれるがこれらに限定されない。所望により、これらを滅菌しても又は補助剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、又は浸透圧に影響を及ぼす塩及びそれらに類したものと混合してもよい。噴霧できない局所製剤に好ましいビヒクルには、軟膏ベース、例えば、ポリエチレングリコール−1000（PEG−1000）;HEBクリームの如き慣用的なクリーム；ゲル；並びに石油ゼリー及びそれらに類したものが含まれる。
全身適用にも局所適用にも適するが、特に粘膜及び肺への適用に適するのは、活性成分が好ましくは固体又は液体の不活性な担体物質と組み合わさった噴霧可能なエアゾール製剤である。このエアゾール製剤は、本発明のタンパク質又はペプチドに加えて溶媒、緩衝剤、界面活性剤、香料、及び／又は酸化防止剤を含有してもよい。エアゾール投与については、本発明による治療薬をスクィーズボトル内に、又はバルブとアクチュエーターの適当な系を有する与圧容器内に包装してもよい。当該技術分野では全く周知であるが、計量バルブを用い、そのバルブチャンバーは駆動又は投与の間に再装填されるのが好ましい。
治療薬の投与
本発明の治療薬は、その意図する目的、例えば、感染を有しているか又は受け易い被験体における居所感染の治療又は全身感染の治療、を達成するあらゆる手段によって投与することができる。例えば、免疫抑制された個体は、レトロウィルス感染及び疾患を特に受け易い。
例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、頭蓋内、経皮、又は舌下ルートの如き種々の非経口ルートによることができる。別に又は同時に、投与は経口ルートによってもよい。非経口投与は、一回の注射により又は時間をかけて徐々に灌流することによってもよい。
本発明の治療薬を用いる更なる様式は、局所投与によるものである。本発明の治療薬を、皮膚上への平滑効果並びに患部に直接活性成分を投与する手段の両方を有する軟膏剤（salve,ointment）の如き局所用に適用されるビヒクルに混和してもよい。
局所適用については、本発明による有効量の治療薬を感染、例えば、皮膚表面、粘膜等に投与するのが好ましい。この量は、一般に、治療すべき面積、その用途が予防のためであるか治療のためであるか、症状の重さ、及び用いる局所ビヒクルの性質に依存して、１回の適用で約0.0001mg〜約1gである。好ましい局所製剤は、軟膏剤ベースcc当たり約0.001〜約50mgの活性成分が用いられる軟膏剤である。軟膏剤ベースは好ましくはPEG−1000である。
治療又は予防のための局所療法は、１日又は数日間、１週間〜約６か月まで及び１週間〜約６か月を包含する期間にわたって有効量を投与することを含む。
in vivo又はin vitroで投与される本発明の治療薬の投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、及び体重、もしあるとすれば同時に行っている治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果の性質に依存するであろうと理解される。以下に示す有効投与量の範囲は、限定することを意図したものではなくて好ましい投与量の範囲を表わすものである。しかしながら、最も好ましい投与量は、個々の被験体に適するように決められるであろうが、当業者によって理解されかつ決定可能であろう。
それぞれの治療に要求される総投与量は、複数投与あるいは１回投与で投与されてもよい。治療薬は、単独で投与してもウィルス感染に向けられた又はウィルス性疾患の他の症状に向けられた他の治療薬と共に投与してもよい。
本発明の治療薬の有効量は、約0.001μｇ〜約100mg/kg体重であり、好ましくは約１μｇ〜約50mg/kg体重である。
非経口投与用の製剤には、滅菌水溶液又は非水溶液剤、懸濁剤、及び乳濁剤がふくまれ、当業者に知られている補助剤又は賦形剤を含有してもよい。錠剤及びカプセルの如き医薬組成物も慣用的方法に従って調製される。
診断的検定法
本発明は、被験体の正常な若しくはキメラな受容体又はH13タンパク質又はmRNAの存在及びレベルを評価する方法を提供する。個体中のH13遺伝子の不存在、又はより典型的には、H13遺伝子の低発現又は変異型H13の存在は、レトロウィルス感染に対する抵抗性及びかくしてエイズ又は一定のタイプの白血病又は他のレトロウィルス媒介疾患の発症の重要な予測材料として役立ち得る。また、H13の過剰発現は、レトロウィルス感染を受け易くなったことの重要な予測材料として役立つ。
更に、ウィルスに誘発された腫瘍細胞株では、ERR又はH13mRNA発現が増加するが、これはmRNA又は受容体タンパク質発現のレベルが、他の方法では検出できないウィルス感染の有用な指標として役立ち得ることを示している。従って、H13mRNA（以下を参照のこと）又はタンパク質（上記のような免疫検定法を用いる）の量を測定する手段を提供することによって、本発明は、被験体内のヒトレトロウィルス感染又はレトロウィルス形質転換細胞を検出する手段を提供する。
キメラ受容体ポリペプチドの種々の部分をコードするオリゴヌクレオチドプローブ又はキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を用いて、キメラ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチドDNA若しくはmRNAの存在について被験体からの細胞を試験する。好ましいプローブは、キメラ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチド配列の少なくとも12、好ましくは少なくとも15ヌクレオチドをコードする核酸配列に向けられたものであろう。定性的又は定量的検定法は、かかるプローブを用いて行うことができる。例えば、ノーザン分析（以下を参照のこと）を用いて、細胞又は組織試料中のキメラ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチドmRNAの発現を測定する。
かかる方法は、選択的増幅技術の使用が知られているので、個体から得られた非常に少量の核酸を使用して用いることができる。精製核酸フラグメントを増幅できる組換え核酸法が、長い間認められてきた。典型的には、かかる方法は、核酸フラグメントのDNA又はRNAベクター内への導入、そのベクターのクローン増幅、及び増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。かかる方法の例は、コーエンら（米国特許第4,237,224号）、サムブルークらの前記文献等によって示されている。
最近になって、かかる所望の核酸分子の濃度を増加できる。in vitro酵素的方法が記載された。この方法は、“ポリメラーゼ連鎖反応”又は“PCR"と言われている（ムリス（Mullis,K.）ら,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263−273（1986）；エルリッヒ（Erlich,H.）,EP50,424;EP84,796;EP258,017;EP237,362;ムリス,EP201,184;ムリスら，米国特許第4,683,202号；エルリッヒ，米国特許第4,582,788号；及びサイキ（Saiki,R）ら，米国特許第4,683,194号）。これら全ては、参照により全体がここに組み入れられるものとする。
このポリメラーゼ連鎖反応は、特定のDNA配列がそれまでに精製されておらずかつ特定のサンプル中に単一のコピーが存在するに過ぎない場合でも、そのDNA配列の濃度を選択的に増加する方法を提供する。この方法は、一本鎖又は二本鎖DNAのいずれを増幅するのにも用いることができる。この方法の真髄は、所望のDNA分子の鋳型依存性ポリメラーゼ媒介複製のためのプライマーとして役立つ２つのオリゴヌクレオチドの使用を包含することである。
PCRの委細は、ムリス（Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263−273（1986）；サイキら（Bio/Technology 3:1008−1012（1985））；及びムリスら（Meth.Enzymol.155:335−350（1987）により示されている。
ここまで本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することによって本発明をより容易に理解できるであろう。この実施例は、説明のために示したものであって本発明を限定しようとするものではない。
実施例Ｉ
一般的な材料及び方法
細胞株
次の細胞株を以下に記載した検討に用いた:CCL120（ATCC♯ CCL120），ヒトＢリンパ芽球様細胞株;CCL119（CEM,ATCC♯ CCL119），ヒトＴリンパ芽球様細胞株;SupT1,ヒト非ホジキンＴリンパ腫細胞株;H9,HUT78由来単一細胞クローン，ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞株;MOLT4（ATCC♯ CRL1582），ヒト急性リンパ芽球白血病細胞株;HOS（ATCC♯ CRL1543），ヒト骨肉腫細胞株;HeLa（ATCC♯ CCL2），ヒト類上皮癌細胞株;CHO−K1（ATCC♯ 61），チャイニーズハムスター卵巣細胞株;B10T6R,B10.T（6R）マウスの放射線誘発胸腺腫；及びRL12,C57BL/6Kaマウスの放射線誘発胸腺腫。
スクリーニング
ヒトCEM及びHUT78T細胞cDNAライブラリー（λgt11）をクローンテック・ラボラトリーズ社（パロアルト，カルフォルニア）から入手した。ヒトリンパ球コスミドライブラリー（pWE15）をストラタジェン（ラジョラ,CA）から入手した。これらライブラリーをマニアチスらの方法（マニアチスら,Cell,15:887−701（1978）によってスクリーニングした。ERR cDNA（pJET）の全縁オープンリーディングフレームを含有するBamH I−EcoR Iフラグメントを、アルブリットン（Albritton）及びクニンハム（Cunningham）の両博士（ハーバード医学校，ボストン,MA）から提供して貰った。このDNAをニックトランスレーションにより³²Pで約２×10⁶cpm/μｇの比活性に標識して、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。
サザーンブロット分析
ブリン（Blin,N.）ら（Nucleic Acids Res.,3:2303−2308（1976））により記載され、パンペノ（Pampeno,C.L.）とメロイロ（Meruelo）（パンペノら,J.Virol.,58:296−306（1986）により手を加えられた通りにして、高い相対質量のDNAを細胞から調製した。制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロースゲル電気泳動、ニトロセルロースへの写し取り（Schleicher ＆ Schuell社，キーン，ニューハンプシャー）、ハイブリダイゼーション及び洗浄は記載されているとおりであった（パンペノらの前記文献；ブラウン（Brown,G.D.）,Immunogenetics 27:239−251（1988））。
ノーザンブロット分析
全細胞RNAを酸性グアニジニウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム法（コムクジンスキイ（Chomczynski,P.）ら,Anal.Biochem.,162:156−159（1987））によって細胞から単離した。そのDNAを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動してナイトラン（Nytran）フィルター（Schleicher ＆ Schuell社，キーン，ニューハンプシャー）に写し取った。ハイブリダイゼーション及び洗浄は、アマリ（Amari,N.M.B.）ら（Mol.Cell.Biol.,7:4159−4168（1987））に従って行った。
DNA配列分析
陽性ファージからのcDNAクローンをプラスミドベクターpBluescript（ストラタジェン）のEcoR I部位に再クローン化した。このプラスミドの一方向欠失体をエキソヌクレアーゼIII及びS1ヌクレアーゼを用いることによって構築し、シーケナーゼ（Sequenase）試薬（U.S.バイオケミカル社，クリーブランド，オハイオ）でのジデオキシチェインターミネーター法（サンガー（Sanger,F.S.）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74:5463−5467（1977）によって配列決定した。他で記載された部分消化コスミドDNAを探り出すT3又はT7プロモーター特異性オリゴヌクレオチドを用いて（エバンス（Evans,G.A.）ら,Meth.Enzymol.152:604−610（1987）、陽性コスミド挿入体の制限酵素地図を決定した。このコスミドのEcoR I−EcoR I又はEcoR I−Hind IIIフラグメントをpBluescript又はpSport1（GIBCO BRL,ガイセルスブルグ,MD）内にサブクローン化した。そのエキソン同志及びエキソン−イントロン接合部を、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて配列決定した。配列は、ジェネティックス（Genetics）コンピューターグループ配列分析ソフトウェアーパッケージを用いて編集及び分析した（デベロークス（Devereux,J.）ら,Nucleic Acids Res.,12:387−395（1984））。
実施例II
H13のDNA及び推定タンパク質配列
コーディング配列の5'及び3'末端において非コーディング配列を含むH13の全ヌクレオチド配列（配列番号:7）を図１に示す。この配列は、クローン７−２（配列番号:1）からもともと得られる部分配列を含む。配列番号:1のヌクレオチド１〜６及び1099〜1102は、もともと誤って決定されたものであった。図１は、このヌクレオチド配列から推定される全アミノ酸配列（配列番号:8）も示している。この配列は、このヌクレオチド配列からもともと誤って推定されたＮ−末端Pro−Gly及びＣ−末端Proを除いては、もとから記載されていた部分アミノ酸配列（配列番号:2）を含む。
H13とERRのヌクレオチド配列の比較を図２に示し、H13、ERR及びTEAのアミノ酸配列の比較を図３に示す。
これら比較した配列間の相同性は非常に高く、例えば、H13とERRのDNA間の相同性は87.6％であり、H13とTEAのアミノ酸間の相同性は52.3％である。
実施例III
ヒト細胞内でのH13遺伝子の存在と発現
種々の種の細胞から採取したDNAのサザーン分析により、マウスERRcDNAプローブ（図４）及びH13cDNA（図５）とハイブリダイズできるDNAが、CCL120、CCL119、SupT1、Ｈ−９及びMOLT−４を含む５つのヒト細胞株内に、及びハムスター細胞（CHO−K1）とマウス細胞（正常Balb/cマウス胸腺細胞）内に存在することが分かった。H13遺伝子発現は、ノーザン分析を用いて、H13cDNAプローブを用いて検査した。このプローブは、HeLa、SupT1、HOS及びCCL119細胞からのRNA内中に約9kbの転写産物を検出した（図６）。このRNAは、マウスERRcDNAプローブを用いても検出できた（図７）。
実施例IV
ハムスター細胞内へのマウスレトロウィルス受容体cDNA の形質移入
マウスレトロウィルス受容体（ERR）cDNAを、選択可能マーカープラスミドDNAP、pSV₂Neoで、リン酸カルシウムを用いて、マウスエコトロピックレトロウィルスによっては感染され得ないハムスターCHO細胞内に同時形質移入した（ウィグナー（Wigler,M.）ら,Cell,14:725−731（1978））。次いで、この受容体遺伝子を発現する形質移入体をマウス放射線白血病ウィルス（RadLV）により感染した。感染後２週間してその上澄み液の逆転写酵素（RT）活性を測定し（ステフェンセン（Stephensen,J.R.）ら,Virology 48:749−756（1972））、ノーザンブロット分析をウィルスプローブを用いてそのRNAの調製後に行った。
図８に示すように、この受容体遺伝子を発現しない未形質移入CHO細胞内で検出されたRT活性は、組織培養培地の活性（バックグランド）と区別できなかった。これは、この細胞がMuLVによって感染されなかったことを示している。
このERRcDNAで形質移入した後は、その形質移入細胞上澄み液のRT活性はバックグランドよりも大いに高かった（図８）。
MuLVウィルスプローブは、この形質移入体から調製したRNA中に転写産物を検出したが、未形質移入CHO細胞から調製したRNA中では検出しなかった。これらの結果は、ERRcDNAで形質移入された細胞は、エコトロピックマウス白血病ウィルスに対する感受性を与えることができることを示している。
実施例Ｖ
Ｈ−13に対する抗体の作製および使用
予測される全タンパク質（配列番号２）を有するＨ−13含有融合タンパク質を作製することは非常に困難である。というのは、図９に示されるように、予測されるタンパク質は疎水性が高いからである。従って、このタンパク質中に存在する抗原エピトープを予測するために、PEPTIDESTRUCTUREのプログラム（Jameson et al.,CABIOS 4:181−186（1988））を用いてコンピューター分析を行った。図10は、Ｈ−13タンパク質配列の抗原性プロフィールを示す。
180bpのAcc I−EcoR I断片を生じる制限酵素Acc IとEcoR Iで切断することにより、抗原性の高い部分をコードするDNA配列（配列番号２、アミノ酸残基309−367）を作製した。オープンリーディングフレームの発現を可能にする配向（Smith,D.B.et al.,Gene 67:31−40（1988））で、Ｈ−13 cDNAのこの断片をpGEX−2Tプラスミドベクター（ファルマシアLKBバイオテクノロジー）のクローニング部位に連結した。なお、このプラスミドベクターはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として抗原を発現することができる。
イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）を培養物に添加して融合タンパク質を誘導し、グルタチオンセファロース4Bクロマトグラフィー（ファルマシアLKBバイオテクノロジー）を用いて精製した（図11参照）。精製した融合タンパク質をフロインド完全アジュバントとともにウサギに筋肉内および皮下注射して抗血清を得た。
この抗血清は、Ｈ−13タンパク質およびそのエピトープ断片への特異的な結合を示す。
ヒト細胞由来の膜タンパク質を標準的な手法に従って作製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ウェスタンブロット分析用ニトロセルロース上にブロットした。このＨ−13特異的抗体は、これらのブロット上のタンパク質への結合を示す。
実施例VI
Ｈ−13の遺伝地図作製
Ｈ−13遺伝子の染色体上の位置をヒト−ハムスター体細胞ハイブリッド（Kouri,R.E.et al.,Cytogenet.Cell Genet.51:1025（1989））のパネルからのDNAを含む染色体ブロット（Bios Corp.,New Haven,Connecticut）を用いて決定した。ヒト−ハムスターハイブリッド細胞中に残っているヒト染色体とH13 cDNAの発現を比較することにより、そのＨ−13遺伝子はヒト染色体13にマッピングされた（図12参照）。染色体13に結合しているヒト遺伝子（あるいはその中の変異により生じる疾患）には、以下のものが含まれる。網膜芽細胞腫、骨肉腫、ウィルソン病、レテラー−ジーヴェ病、デュービン−ジョンソン症候群、凝固因子ViiおよびＸ、コラーゲンIVα１およびα２鎖、Ｘ線感受性、リンパ球細胞質ゾルタンパク−１、頸動脈小体腫瘍−１、プロピオルCoAカルボキシラーゼ（αサブユニット）等。
実施例VII
キメラH13/ERR DNAによりコードされたキメラ受容体ポリペプチドおよびタンパク質分子
マウスERR配列およびヒトH13配列間の数個のキメラ分子を作製し、キメラＩ−キメラIVと命名した。詳細には、図13に示される共通の制限部位の使用に基づいて、H13 cDNAの４つの領域を置換した。
pSG5またはpCDM8発現ベクターを用いて、これらのDNA配列をチャイニーズハムスター卵巣（CHO）セルラインに一過的にトランスフェクトした。
２日後、これらのトランスフェクタントのＥ−MuLV感染を支持する能力を試験した。細胞を2BAGと命名された組換えモロニーＥ−MuLV（Price,J.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:156−160（1987）に感染させた。この組換えウィルスはまた、選択可能なマーカーおよび検出可能な産物を提供するβ−ガラクトシダーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo ^Ｒ）遺伝子を含んでいた。その後、前記細胞を0.6mg/mlの濃度の抗生物質G418の存在下、選択的な条件下で増殖させて、neo^R−発現トランスフェクタントを選択した。２週間後、G418−耐性コロニーの数を計測した。
これらの結果は、Ｅ−MuL V感染に必須のERR遺伝子の部分がNco I−Bst XI制限部以内に位置し、細胞外ドメイン３を含むものであることを示している。（図13の上段に示されるような）細胞外ドメイン３は、図14に示されるように、ヒトおよびマウス配列間で非常に異なる受容体タンパク質の領域である。Genetics computer group sequence analysis software package（Devereux,J.et al.,Nucl.Acids Res.12:387−395（1984））を用いて、（図１〜３に示される配列から誘導された）図14の配列を整列させた。
次に、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（oligonucleotide−directed mutagenesis）により、細胞外ドメイン３内の個々のアミノ酸置換を含むキメラ分子を作製した。これらを上記のようにしてトランスフェクトし、上記のようにしてトランスフェクタント細胞のＥ−MuLVによる感染に対する感受性の試験を行った。
上記の検討の結果は、本来のアミノ酸配列をマウスERRタンパク質の対応する位置由来の１〜４個のアミノ酸で置換することにより、ヒトH13分子がＥ−MuLVに結合する能力を獲得することを示す。
実施例VIII
エコトロピックのマウス白血病レトロウィルスの感染性を与えることができるH13誘導体としてのキメラ受容体ポリペプチド
図18に記載のように、ヒトH13アミノ酸残基をマウスERR残基で置換した。細胞外ドメイン３および／または４が重要なアミノ酸残基を含んでいることを明らかにしている共通の制限部位を利用した置換により、マウス−ヒトキメラ受容体分子を作製した。その後、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、上記の２つの細胞外ドメイン内に１個または２個のアミノ酸の置換または挿入を有する13個の個々の変異体ERR分子を創製した。ヒトH13の242および244アミノ酸残基のProおよびValの少なくとも２個のアミノ酸を対応するアミノ酸残基TyrおよびGluで置換したり、あるいはヒトH13のGly240およびPro242をValおよびTyr（ERRのVal233およびTyr235に対応する。）で置換すると、得られる変異体H13はマウスエコトロピックレトロウィルス受容体として機能する能力を持つようになる。この変異体H13は、遺伝子治療に利用できるであろう。
マウスERRおよびヒトH13がMuLV−Ｅの受容体として機能する相対的な能力を比較するために、チャイニーズハムスター卵巣（CHO−K1）セルラインをマウスERRまたはヒトH13のいずれかを発現するベクターで一過的にトランスフェクトした（図16の文字を参照）。２日後、これらのトランスフェクタントを大腸菌lacZβ−ガラクトシダーゼおよびTn5 neo耐性遺伝子を含む組換えMuLV−Ｅ、ΨCRE/BAGビリオンに感染させ（Price et l.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 84:156−160（1987）;Danos et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:6460−6464（1988））、G418で選択した。10〜14日後、G418耐性コロニーの数を計測した（図16）。H13トランスフェクタントでは陽性クローンは得られなかったが、ERRトランスフェクタントでは10³個以上のコロニーが得られた。このことは、アミノ酸の置換または欠失により改変されなかったH13分子がMuLV−Ｅの受容体として機能する能力を欠いていることを示している。
図18に表されているような、MuLV−Ｅ感染のためのアミノ酸残基の改変を同定するために、共通でかつ単一の制限部位であるKpn Iを利用した置換によりH13改変タンパク質を作製し、それらのMuLV−Ｅの受容体として機能する能力を測定した（図16）。前半部分がERRの対応する領域で置換されているキメラＩのトランスフェクタントについては約10³個のコロニーが得られたが、後半部分がERRの対応する領域で置換されているキメラIIのトランスフェクタントについてはコロニーは得られなかった。このことは、重要なアミノ酸残基が前半部分に位置していることを示している。必須の領域をより狭く特定するために、Nco I−Nco I断片がERRの対応する領域で置換されているキメラIIIを作製し、その受容体として機能する能力を測定した（図16）。約10³個のコロニーが得られたが、このことは、感染に重要な領域がNco I−Nco I制限部位内に位置していることを示している。
図17は、マウスERRおよびヒトH13における細胞外ドメインおよび４の配列の比較を示すものであるが、それらの配列はGenetics Computer group sequence analysis software package（Devereaux et al.Nucleic Acid Res.12:387−395（1984））を用いて整列させてある。細胞外ドメイン３は、上記の２つのドメイン内に１個または２個のアミノ酸置換または挿入を有するマウスERR分子（変異体１〜11）間で最も異なる領域である（図17および表２）。各置換については、ERRのアミノ酸残基をH13配列の同じ位置に見いだされるものと置換した。各挿入については、H13のアミノ酸残基を図17に示されるように整列させたERR配列の同じ位置に付加した。
変異型ERRタンパク質を発現するCHO−K1細胞のMuLV−Ｅの受容体として機能する能力を試験した。驚くべきことに、変異体７のみについてはコロニーが得られなかったが、他の変異体については約500個のコロニーが得られ、このことは、これらの11個の変異体のうち、変異体７だけが前記受容体として機能する能力を失っていることを示している（表２）。変異体７は２個のアミノ酸置換を有しており、Tyr（ERRの235アミノ酸残基）がPro（H13のアミノ酸残基242に相当する。）に、Glu（ERRのアミノ酸残基244に対応する。）がVal（H13の244アミノ酸残基）に置換している。従って、たった１個のアミノ酸置換を含む（変異体7A:TyrからPro、変異体7B:GluからVal）変異体7AおよびＢを作製し、前記受容体として機能するそれらの能力を試験した。変異体7Bは、もとのERRとほぼ同じ程度で、前記受容体として機能する能力を有しているが、変異体7Aはこの能力をほぼ完全に失っていることが見いだされた（表２）。これらの結果は、ERR配列の235アミノ酸残基に位置するTyrがMuLV−Ｅの受容体タンパク質として機能するためには極めて重要であり、このアミノ酸残基を置換するとERRが該受容体として機能する能力を失うことを示唆している。
H13のあるアミノ酸残基がERRの対応するアミノ酸残基で置換されると、H13分子が前記受容体として機能する能力を獲得するか否かを決定するために、H13の８個の変異体を図18に示されるように作製し、前記受容体として機能するそれらの能力を測定した。例えば、Lewis and Thompson,Nucleic Acid Res.18:3439−3443（1990）に提示されているように、ファージミドベクターpSELECT−１（Promega）を用いる変法部位特異的突然変異誘発（altered site−directed mutagenesis）の方法により、前記H13変異体を創製した。この突然変異誘発は、一本鎖DNAおよび２個のプライマーの使用に基づくものである。前記２個のプライマーは、ひとつが突然変異誘発性プライマーで、もう一つは第２の修正プライマー（ベクター中のアンピシリン耐性に対する欠損を修正する。）である。
pSG5H13の挿入物をBamH Iで完全に、EcoR Iで部分的に消化し、pSELECT−１のBamH I−EcoR I部位にサブクローニングして、pSELECT−１アンチセンスH13を得た。PSG5H13変異体５および８の挿入物をEcoR Iで切り出し、pSELECT−１のEcoR I部位にサブクローニングして、pSELECT−１アンチセンスH13変異体５および８を得た。鋳型としてのpSELECT−１アンチセンスH13およびオリゴヌクレオチド：
AAAGAAGGGAAGTACGGRGRRGGRGG（配列番号９）（H13変異体１）；
ACACAAAAGAAGTGAAGTACGGTGTTGGTGG（配列番号10）（H13変異体２）；
ATGACACAAAAAACGTGAAGTACGGTGTTGGTGG（配列番号11）（H13変異体３）；および
AAAGAAGGGAAGTACGGTGAGGGTGGATTCATG（配列番号12）（H13変異体５）
を用いて、H13変異体１〜３および５を作製した。pSELECT−１アンチセンスH13変異体８およびオリゴヌクレオチド：
TGAAGTACGGTGTTGGTGGATTCATG（配列番号13）
を用いて、H13変異体４を作製した。pSELECT−１アンチセンスH13変異体５およびオリゴヌクレオチド：
ACACAAAAGAAGTGAAGTACGGTGA（配列番号14）（H13変異体６）；
AATGACACAAAAAACGTGAAGTACGGTGA（配列番号15）（H13変異体７）；および
AACAATGACACAAACGTGAAGTACGGTGAGGGTGGATTCATG（配列番号16）（H13変異体８）
を用いて、H13変異体６〜８を作製した。
例えば、Lewis and Thompson,Nucleic Acids Res.18:3439−3443（1990）に提示されているように、ファージミドベクターpSELECT−１（Promega）を用いる変法部位特異的突然変異誘発の方法により、前記ERR変異体を創製した。この突然変異誘発は、一本鎖DNAおよび２個のプライマーの使用に基づくものである。前記２個のプライマーは、ひとつが突然変異誘発性プライマーで、もう一つは第２の修正プライマー（ベクター中のアンピシリン耐性に対する欠損を修正する。）である。
pSG5ERRの挿入物をBamH IおよびEcoR Iで部分的に消化し、pSELECT−１のBamH IおよびEcoR I部位にサブクローニングして、pSELECT−１センスおよびアンチセンスERRを得た。一本鎖DNAをpSELECT−１センス（変異体２および６の作製用）およびアンチセンス（他の変異体の作製用）ERRから調製し、製造元の指示（Promega）に従って突然変異誘発を行った。Sequenase（USB）およびプライマーとしての２つのERR特異的アンチセンスオリゴヌクレトチド（変異体１〜７用のGGTGGCGATGCAGTCAA
（配列番号17）および変異体８〜11用のTCAGCCATGGCATAGATA（配列番号18））
を用いる直接配列決定により、正しく突然変異させたクローンを選択した。ミニプレップにより作製したファージミドの突然変異した挿入物をEcoR Iで切り出し、pSG5のEcoR I部位にサブクローニングした。上記で使用したものと同じプライマーを用いて各プラスミドの配列決定を行うことにより、突然変異の存在を確認した。その後、リポフェクチン試薬を用いる方法により、各変異体をCHO−K1細胞に一過的にトランスフェクトし、MuLV−Ｅによる感染に対するそれらの感受性を上記のようにして測定し、図18に示されるような結果を得た。
その結果、Tyr242並びにVal 240およびGlu244の少なくとも１つを含む本発明の変異型H13ポリペプチドは、そのようなキメラ受容体ポリペプチドがヒト細胞の細胞外表面に発現されることによりマウスエコトロピックレトロウィルスによる結合および感染が可能となるように、MuLV−Ｅのようなマウスエコトロピックレトロウィルスにより機能的に認識される変異型H13受容体結合領域を与えることが示された。従って、このような方法を本発明に従って、in vitro、in vitroまたはin situの遺伝子治療の方法として用いることができる。あるいはまた、本発明のこのような方法を用いて、マウスエコトロピックレトロウィルスベクターを使用してヒト細胞または組織に異種または外来遺伝子を導入することができる。従って、本発明のH13変異体を使用することにより、アンフォトロピックレトロウィルスベクターを使用するより、はるかに安全な遺伝子治療の手段が提供され、これによりアンフォトロピックレトロウィルスによる非標的細胞の意図しない感染の問題の他、組換えエコトロピックウィルスを比較的低い投与量で使用するための免疫抗原性の減少の問題が解決された。
以上をまとめると、ヒトエコトロピックレトロウィルス受容体がクローニングされ、マウスエコトロピックウィルスは、分子改変の導入がなければ、通常ヒト細胞を感染できないことが認識されると、レトロウィルスを包含する遺伝子治療の安全性が劇的に改良される状態となる。第１工程において、エコトロピックレトロウィルス受容体の改変された遺伝子は標的細胞に運ばれ、一過的に発現されるであろう。その後、マウスエコトロピックウィルスベクターを使用して感染させ、安定に組み込んで、所望の治療用遺伝子を発現させることとなろう。感染の第１工程には、時間が全くかからないか、いくらかかかるかもしれない。
使用すべきエコトロピックウィルスベクターは、構造遺伝子の欠失を有しており、安全性を付加するための“安全な”パッケージングセルライン中で増殖するであろう。10⁸〜10¹⁰粒子/mlの範囲のウィルス力価を産する新規なパッケージングラインが構築されると予想されるが、この構築においては、ヒト細胞を感染できる組換えウィルスが欠けている。さらに、ウィルスの外膜糖タンパク質の改変により、in vivoのウィルス感染性を妨げるか、または、ウィルス力価を減少させるようなあらゆる決定基が排除されよう。また、ヒトエコトロピックウィルス受容体相同体を研究することにより、その正常な遺伝子機能を決定したり、遺伝子治療プロトコールがその正常な機能に有害な影響を及ぼす可能性を排除するためのそのタンパク質に関する十分な理解が得られる。
実施例IX
ヒトアンフォトロピックウィルス受容体のクローニング
遺伝子治療ベクターの開発のために、アンフォトロピック受容体をクローニングする。公知の工程（例えば、Brown et al,1990;Anderson et al,1991）に従い、テナガザル（Gibbon ape）白血病ウィルスおよびマウスエコトロピックウィルス（Ｅ−MLV）の受容体をクローニングするのに用いられるものと類似の戦略により、アンフォトロピックMLVの受容体をクローニングする。その戦略は、ヒト細胞がＡ−MLVに感染されうるがハムスター細胞は感染され得ないという事実に依るものである。ハムスター細胞を感染できないのは、それらが適当な受容体を欠いているからであり、そのヒト遺伝子をハムスター細胞にトランスフェクトすれば、Ａ−MLVに感染可能とすることができる。これらの細胞を抗生物質耐性の組換えウィルスに感染させることにより単離し、次いで、抗生物質含有培地の選択を行う。前記の受容体遺伝子はヒト反復DNAと会合するのでクローニングしやすい。アンフォトロピック受容体遺伝子をクローニングして、種々のアッセイおよび種々の手法で前記エコトロピックウィルス受容体との類似性および非類似性を検討する（例えば、Yoshimoto et al.,1993）。
方法 CHO細胞をトランスフェクションの朝にプレートした。切断したヒトゲノムDNA（50μｇ）およびpSV_2gptDNA（１μｇ）をWiglerら（1978）の方法によりリン酸カルシウムで共沈させ、CHO細胞に適用した。翌日、トランスフェクトした細胞をgpt選択培地（DMEM/10％ FCS、ヒポキサンチン15μｇ、キサンチンμg/ml、チミジン10μg/ml、グリシン10μg/ml、メトトレキセート0.1μＭ、およびミコフェノール酸25μg/ml）中でプレート当たり２×10⁵細胞で継代培養した。選択下21日後、コロニーをトリプシン/EDTAに簡単に晒して分散させ、ウィルスに晒す前に置換して、ヒトDNAを獲得した細胞を富化した。
PA317/LNL6アンフォトロピックレトロウィルス産生線維芽細胞をコンフルエンスになるまで増殖させ、新鮮な培地で再培養した。12〜20時間後、培養培地を濾過し（0.45μｍ、Nalge）、ポリブレン（polybrene）８μg/mlとし、トランスフェクトしたCHO細胞とともにインキュベートした。４〜12時間後、新鮮な培地を添加し、感染プロトコールをその翌日繰り返した。３日後、これらの細胞を1mg/mlのG418を含有するDMEM/10％ FCS中で82mmプレート当たり２×10⁵細胞で再プレートし、選択培地を３日毎に15日間置換した。20,000個のトランスフェクタントのうち、数個（10〜20個）だけがg418耐性コロニー中に発生することが予想された。クローンがこのアンフォトロピックウィルスに感染可能で、実際にこのアンフォトロピックウィルス受容体を発現することを証明するために、それらをまた第２のアンフォトロピックウィルス（Ψ−２−AM−ZIP−DHFR）に感染させた。細胞は前記ウィルス受容体を含まない効率の低い経路により前記ウィルスを獲得することが可能である。G418耐性コロニーを細胞クローニングシリンダーで単離し、ネオマイシンウィルスについて上記したように各々をΨ−２−AM−ZIP−DHFRウィルスに晒した。前記ウィルスへの暴露に続いて、細胞をメトトレキセート（150nM）を含有するDMEM/10％透析FCS中で選択した。14日後、プレートを１％クリスタルバイオレットで染色して、メトトレキセート耐性コロニーの存在を調べた。
その後、DNAをこの最初にトランスフェクトしたセルライン（１゜TF）から調製し、トランスフェクション／感染プロトコールの第２のサイクルにおいて使用した。第２のトランスフェクタントセルライン中の前記受容体遺伝子を同定するために、ヒト反復配列のパネルをプローブとして用いるサザンブロットを行った。DNAトランスフェクションの効率が低いために（0.1％ゲノム／サイクル）、数サイクルのトランスフェクション／選択はマウスゲノムの残りから前記受容体遺伝子を分離するに足るものであった（Murray et al.,1981）。所望の断片を単離するために、ランダファージライブラリーを二次トランスフェクタントDNAから作製し、サザンブロットスクリーニングから非常に適していると思われる放射性標識した反復プローブとハイブリダイズさせた。アンフォトロピック受容体遺伝子の部分をコードするタンパク質を含む分子クローンを同定するために、前記のアンフォトロピックウィルスを増殖させている２゜TFsに存在するRNA転写物を同定した。問題の遺伝子の特定の転移により、アンフォトロピックウィルス感染に対する感受性も同じように移動することが予想され、この分子を発現するこれらのウィルスに感染しうる大パネルの細胞が提供される。
実施例Ｘ
本発明の治療用運搬ベクターの発現
抗体B3（例えば、Brinkmann et al.,1991）からの相補的DNA（cDNA）を用いて、本発明のキメラ受容体ポリペプチドに融合しているFv断片を構築した。この一本鎖組換え受容体を用いれば、標的ヒト細胞のレトロウィルス感染が可能となる。多くの癌腫の表面に発現されている炭水化物抗原に結合する、B3に対する抗体を用いてマウスにおいてヒト腫瘍の完全な退縮を起こす単鎖組換え毒素が製造されてきた（Brinkmann et al.,1991）。単鎖Fvおよび２種の異なる（B3（Fv）イムノトキシン、B3（Fv）−PE40およびB3（Fv）PE38KDEL）ベクターを標準的な組換えDNA手法で使用して、核酸をコードするキメラ受容体ポリペプチドに挿入したり、その組換え毒素を前記ヒトエコトロピックウィルス受容体の改変領域をコードする遺伝子のウィルス結合ドメインで置換した。得られたプラスミド（B3（Fv）−mH13）およびイムノトキシンベクターB3（Fv）PE38KDELを大腸菌のような宿主で発現させ、一本鎖免疫受容体および一本鎖イムノトキシンを当業界で知られているように均質になるまで精製した。
B3（Fv）−mH13の抗腫瘍活性をまずin vitroで測定した。このB3抗体は結腸、胃、および卵巣の多くのムチン癌腫の表面と、また、胃腺、気管および膀胱の上皮、食道の分化した上皮、および小腸ムチンのような正常組織とよく反応する（Pastan et al.（Cancer Res.51:3781−3787,1991））。また、このB3抗体は、MCF7、MDA−MB−468、およびHTB20（胸）、A431（エピデルモイド）、TH29（結腸）、HTB33（頸部）、およびDU145（前立腺）を含む多くのヒト腫瘍セルラインとよく反応する。B3（Fv）−mH13から誘導された融合タンパク質を用いて改変した受容体ペプチドを細胞にまず運んだ後、A431のような、これらの細胞のいくつかまたは全てにおける、ネオマイシン耐性遺伝子を有するマウスエコトロピックレトロウィルスベクターのような、非ヒト特異的組換えレトロウィルスベクターの感染が予想される。チミジンキナーゼ遺伝子を有するマウスエコトロピックレトロウィルスベクターのような、前記キメラ受容体ポリペプチドおよび治療薬を結合するenv結合ドメインを有するウイルスベクターを予め使用して、細胞培養物にガンシクロビル（ganciclovir）を添加することにより、A431細胞のような培養腫瘍細胞の細胞死を生ぜしめる。
そのような細胞が培養中に作用することがわかったら、ウサギモデルまたはラットモデルのような動物モデル系で致死的な病的な細胞を使用する。その結果、キメラ受容体ポリペプチドまたはマウスエコトロピックウィルス受容体の対応する領域が選択した動物モデル細胞表面上に本明細書に提示した運搬ベクターによって発現されない限り、本発明のマウスエコトロピックウィルスをベースとするベクターはこれらの細胞を感染できないことが予想される。融合タンパク質注入後に種々の時間間隔で、チミジンキナーゼ遺伝子を有するウィルスベクターを用いて、選択した標的細胞上の前記キメラ受容体ポリペプチドを発現している動物モデルを感染させる。この発現の後、動物にガンシクロビルを投与する。このプロトコールにより、ガンシクロビルが腫瘍細胞内でその毒性のある形態にリン酸化され、関連する“バイスタンダー効果（bystander effect）”と共同して、腫瘍が減少することが予想される。
実施例XI
キメラ受容体ポリペプチドと、腫瘍または病的な細胞または組織を認識する一本鎖抗原結合タンパク質との融合タンパク質の発現用ベクターの構築
導入の適切な方法論の一例を図４に示す。発現プラスミドpUL1はイムノトキシンB3（Fv）−PE40の遺伝子を含んでいるが、該イムノトキシンは、癌腫細胞に特異的なB3に対する抗体に対する抗体断片を含み、毒素PE40に結合した融合タンパク質である。PE40毒素をコードする部分を本発明のキメラ受容体ポリペプチドまたはマウスエコトロピックウィルス受容体の対応する領域で置換して、キメラ受容体ポリペプチドを発現するようにin vivo、in situまたはin vitroで癌腫細胞をトランスフォームする運搬ベクターを提供するように、前記pUL1発現プラスミドを改変した。
B3（Fv）は、B3に対するモノクローナル抗体から誘導された一本鎖抗原結合タンパク質である。このB3抗体断片は、多くのムチン癌腫の表面に見いだされる炭水化物抗原を認識する。しかしながら、この抗体断片は、in vivoで癌腫細胞を優先的に結合するように、限られた数の正常組織のみと反応する。PE40は、シュードモナス外毒素の切り出された誘導体である。PE40コード領域は、5'末端にHind III制限部位、B3（Fv）をコードするDNAに接続する部位、および3'末端を少し越えたところにEcoR I部位を有する。PE40をコードするこのHind III−EcoR I断片をpUL1から除き、直線化したpUL1の両末端を部分的にdATPでfill−inし、粘着末端−AAとする。B3（Fv）コード領域の3'末端の−TTCGAおよび直線化したプラスミドの他の末端のAATTC−を以下のように同様に改変して、前記のキメラ受容体ポリペプチドをコードするDNAを補足した。
本発明のキメラ受容体ポリペプチドのNru 1−Pst 1断片は、改変H13 cDNAのように、改変H13の全コード領域を含んでいるが、これをTfi Iで消化し、改変H13の第３の細胞外ドメインをコードする領域を含む850bpの断片を1.5％アガロースゲル上で精製した。その後、この精製した850bpのTfi 1断片をBsr Iで消化し、改変H13の全第３細胞外ドメインをコードする85bpのBsr 1−Tfi I断片をEx3mH13と命名した。得られた制限断片EX3m13を2.0％アガローズゲル上で精製した。この精製した85bpのBsr 1−Tfi I断片は5'末端に粘着末端 AGC−を、
CGTCG−
3'末端に −GGを有する。
−CCTAA
この3'末端をdATPで部分的にfill−inし、3'末端を−GGA −CCTAAとする。
部分的にfilling−inした後、アダプター
CGCTTTCAACTGGC（配列番号19）
AAGTTGAC
およびTTCTAATTAG（配列番号20）
GATTAATCTT（配列番号21）
（これらは、いかなるフレームシフトも妨げるように特別にデザインされている。）を用いて、前記の85bpのBsr 1−Tfi断片を直線化したpUL1の部分的にfill−inしたHind III−EcoR I部位に連結した。得られたプラスミドをpBH30と命名する。
B3（Fv）をコードする上記の遺伝子は5'末端にNde1部位を有している。その後、得られたプラスミドpBH30をNde1で消化し、その末端をdATPおよびdTTPでfill−inし、平滑末端とした。次いで、前記の直線化してfill−inしたプラスミドをEcoR Iで消化し、B3（Fv）−Ex3mH13コード領域を含む断片をアガロースゲル上で精製した。
いかなるフレームシフトも妨げられるように、アダプター
GATCCCCGGG（配列番号22）
GGGCCC
を用いて、前記の精製した断片をBg III−EcoR I部位で発現ベクターpTrcHisBに組み込んだが、該部位は、一連のTrcプロモーター、ATG開始コドン、ポリヒスチジンコード領域およびエンテロキナーゼ切断部位コード領域の下流に位置する。
得られたプラスミドをpBH3と命名する。
B3（Fv）−Ex3mH13融合タンパク質の発現および精製
上記の発現プラスミドpBH3は、B3（Fv）−Ex3MH13をポリヒスチジン金属結合ドメイン、エンテロキナーゼ切断部位およびB3（Fv）−Ex3mH13から構成される融合タンパク質として発現させることができる。
その後、大腸菌HB101をpBH3でトランスフォームした。イソプロピルβ−ｄ−チオガラクトシドで発現を誘導し、細胞を回収して緩衝液に懸濁させた。懸濁液を音波処理して、上清をNi²⁺金属アフィニティー樹脂カラムにかけた。樹脂に結合したタンパク質をグリシンとの競合により溶離させた。
その後、溶離したタンパク質を除去すべきポリヒスチジン配列用のエンテロキナーゼで処理した。
得られた融合タンパク質は、上記の病的な細胞を特異的に結合することが予想され、本明細書中に記載したように治療の標的としてのキメラ細胞を提供するのに適している。
実施例XII
本発明のキメラ受容体ポリペプチドのような受容体に結合するウィルス外膜の重要な領域を決定することにより、in vivoのウィルス複製の効率を増加させる
背景
前記受容体に結合するウィルス外膜の重要な領域を理解することは、改良されたベクターを開発するというゴールにとって等しく重要である。本発明により、新規なベクターを工学的に作製することが劇的に改良され、それらのin vivo力価が効果的に増加する。その結果、本発明により、両受容体への結合に必要なウィルス外膜要素、および、当該受容体を結合する能力を失うことなくこれらのタンパク質を許容するであろうという改変の程度のキャラクタリゼーションの詳細な分析であって、ウィルスの結合を可能にするヒトおよびマウスエコトロピック受容体間の限られた相違を検討するための詳細な分析が提供された。第２の目的は、ヒトにおけるウィルスの溶解を導くかもしれないウィルス外膜上のあらゆる潜在的な補体結合領域を排除することである。これは、おそらくマウスレトロウィルスをベースとする治療用ベクターのin vivoの感染能力を制限すると何人かの研究者により議論されてきた問題である。
非特異的不活性化およびマウス、ネコ、サルＣ型ウィルスの溶解に関する知見は最初にWelshら（1975,1976）により公表された。この溶解は、gp70へのヒトC1q補体成分の抗体非依存性結合によるものであり、古典補体経路の活性化につながるものである（Cooper et al.,1976）。gp70分子は免疫グロブリンのFc断片上のC1q認識部位に類似したドメインを有するので、C1qはgp70を認識すると考えられている。ヒト補体によるレトロウィルスの非特異的溶解は、ウィルス血症から保護し、その表面上にgp70を発現する細胞の溶解を引き起こすかもしれない適応防禦系であることが示唆された（Welsh et al.,1975;Cooper et al.,1976）。しかし、補体欠乏患者は霊長類レトロウィルスに対する交差反応性抗体のレベルの上昇を示し、このことは、これらの患者においてはレトロウィルス感染に対する感受性がこれ以上上がることはないことを示しているということを予備的な知見は示唆している（Kurth et al.,1979b）。さらに、Gallagherら（1978）により、レトロウィルス外膜に対するテナガザル血清の類似の溶解活性が示されたが、同じテナガザルの何匹かはGALVに感染し抗GALV抗体を合成した。従って、レトロウィルスの補体依存性溶解の保護効果については議論の余地があるところである。
前記ウィルス受容体に結合するマウスエコトロピックウ ィルス外膜の配列
マウス白血病ウィルス（MuLV）表面糖タンパク質（gp70^SU）の結合パラメータを定義するひとつの方法は、gp70^SUのどの領域が細胞表面受容体との特異的相互作用に関与しているかを決定することである。種々の研究により、受容体特異性の決定基はgp70^SUのＮ末端の３分の２にあることが示唆されている（Ott and Rein J.Virol 66:4632−4638,1992−−引用文献13、16）。事実、最近HeardおよびDanos（1991）により、フレンドMULV gp70^SUのこの領域の大半を含むEnv断片がNIH 3T3細胞における前記のエコトロピック受容体に結合できることが示された。また、最近、OttおよびReinは、モロニーMCF（Mo−MCF）、10A1、およびアンフォトロピックgp70^SU配列を用いて、一連のキメラenv遺伝子を構築することにより、gp70^SUにおける受容体特性をマッピングすることを試みた。これらのキメラgp70^SUを含むMuLVsの分析により、単純な結果および複雑な結果の両方が得られた。ある場合には、受容体特異性はgp70^SUの一つの領域にマッピングできた。最後に、いくつかの組合せは、ひとつの受容体と完全に機能的に相互作用することができるが、ひとつまたは２つの受容体とは部分的に相互作用するかあるいは全く相互作用できないようであった。
HeardおよびDanos（J.Virol.65:4036−4032,1991）により、干渉アッセィ（interference assay）により、gp70アミノ末端ドメインは、この分子のカルボキシ末端部分に関係なく、前記のエコトロピック受容体を認識する構造に折り畳まれることが示された。彼らは、ウィルスエントリーアッセィを用いることにより、外膜糖タンパク質に導入された、構造改変の機能的結果を解釈することは難しいかもしれないと論じている。一方、外膜糖タンパク質を構成的に発現している細胞において、干渉現象は外膜−受容体相互作用のみによるものである。従って、同じ受容体を結合するウィルス粒子のさらなるエントリーに対する細胞耐性の描写は、機能性受容体結合アッセィを提供する。
実験
干渉アッセイを使用して、受容体への結合に重要であるマウスエコトロピックエンベロープ糖タンパク質（MuLVE−gp70）の領域を更に正確に特定する。エコトロピック受容体への結合に関する構造上の要件を更に正確に確立するために、アミノ末端ドメイン内のイン・フレーム（in−frame）欠失により、そしてオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりMuLVE−gp70を修飾する。エンベロープ配列を比較すると、MLVgp70はそれらのアミノ末端ドメインが二つの限定領域において異なることがわかる。これらはアミノ酸50〜116および170〜183である。また、それらはプロリンに富むセグメント、アミノ酸244〜283が異なっている。トリ肉腫および白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（この場合、受容体相互作用の決定因子が短い超可変配列に帰せられた（HeardおよびDanos J.Virol.65:4026−4032,1991））から類推すると、これらの三つの超可変領域の一つ以上が受容体結合細胞を含むものと予測される。修飾E.coli lacZ遺伝子を導入する欠陥レトロウイルスベクターを使用して、野生型または修飾MuLVE−gp70を発現する細胞を感染させる。感染に対する感受性を、Ｘ−Gal陽性フォーカスをカウントすることにより測定する。
エコトロピックエンベロープＮ末端ドメインベクターを、外在性マウスエコトロピックレトロウイルス受容体遺伝子（Albr−ittonら,1989）を発現するサルのCos−７細胞に一過性にトランスフェクトする。pSG5ベクターは初期SV40真核生物プロモーターを使用するので、Cos細胞（Ｔ抗原遺伝子を発現する）は高レベルのenv遺伝子発現を可能にする（Gluzman,1981）。トランスフェクト細胞をエコトロピック偽型ΨCRE/BAG（ATCC CRL 1850）ウイルス粒子（Priceら,1987）で感染し、そしてβ−ガラクトシダーゼ（gal）フォーカスの数を分析する。β−galフォーカスの数を減少する修飾envフラグメントを、ERRと相互作用するそれらの能力につき更に調べる。
1. Cos−７細胞へのERR遺伝子のトランスフェクション
ERR遺伝子をpcDNA/neo発現ベクター（インビトロゲン）にクローン化し、CaPO₄法（ストラタジーン）によりCos−７細胞にトランスフェクトした。Cos−７細胞は高力価のMuLVレトロウイルスを産生し得ることがわかっている（LandauおよびLittman,1992）。トランスフェクト細胞を500μg/mlのG418に対するネオマイシン耐性につき選択する。耐性クローンを、ΨCRE/BAGウイルス粒子（Priceら,1987）により感染されるそれらの能力につき試験する。細胞を生理緩衝塩類液中0.5％のグルタルアルデヒドで固定し、そして1mg/mlのＸ−gal（Sanesら,1986）を含む組織化学液で染色する。最大数のβ−galフォーカスを有する細胞を干渉アッセイに使用する。
2. 受容体結合配列を更に概説するための修飾env遺伝 子の構築
この実験は、エコトロピックウイルス感染を阻止する最小のＮ末端フラグメントを決定する。Akv内在性マウス白血病ウイルスからのgp70遺伝子をこれらの研究に使用する。Akvゲノムは活性ウイルス粒子を産生することができ、そしてenv配列が決定されている（Lenzら,1982）。
Acc I制限部位とXba I制限部位の間に含まれる完全gp70遺伝子をpsG5真核生物発現ベクター（ストラタジーン）にクローン化する。また、env遺伝子のフラグメントをクローン化して下記のＮ末端ペプチドを産生する。Acc1/Alul 247 aaフラグメントはHeardおよびDanos（1991）の結果を生じ、そして感染を機能的に阻止する。受容体結合特異性を決定すると考えられる領域を含む122aa Acc1/Sma 1フラグメントが特に興味がもてる（Battiniら,1992）。
3. 修飾env遺伝子構築物の干渉アッセイ
組換えenv遺伝子構築物を、マウスERRを含むCos−７細胞に一過性にトランスフェクトする。この系はマウス細胞中に存在し得る内在性env転写産物によりひき起こされる潜在的な問題を排除すると予測される。Cos細胞は、SV40プロモーターを含む発現プラスミド（Gl−uzman,1981）の高度の発現を可能にすると予測される。細胞をストラタジーンのプロトコルに従ってDEAEデキストラン法によりトランスフェクトする。env遺伝子トランスフェクションの約48時間後に、2x10⁵の細胞を６ウェル培養皿にまき、そしてHeardおよびDanos（1991）の方法に従って８μｇのポリブレン/mlの存在下で10²〜10³のΨCRE/BAGウイルス粒子を感染させる。細胞が集密まで増殖した後、それらをPBS中0.5％のグルタルアルデヒド中で固定し、そして1mg/mlのＸ−galを含む組織化学液（sanesら,1986）で染色する。β−galフォーカスの数を、pSG5ベクター単独でトランスフェクトした細胞に対して評価する。β−galフォーカスの減少した数がpSG5ベクター単独でトランスフェクトした細胞に対して評価されると予測される。β−galフォーカスの減少した数は、トランスフェクトされたenv構築物がおそらくERRを結合でき、かつウイルス粒子相互作用を阻止できることを表している。
4. トランスフェクト細胞中の修飾env生合成の分析
組換えenv遺伝子産物がトランスフェクト細胞により産生されるか否かを決定するために、タンパク質分析を行う。細胞を³⁵Sメチオニンと³⁵Sシステインの混合物（ICN）で代謝標識する。何となれば、envタンパク質は対象の領域が比較的システイン残基に富むからである。30〜60分間標識した後、細胞をペレットにし、ペレットと上澄みの両方をポリクローナルヤギ抗ローシャー（Rauscher）gp70抗体（NIHレポジトリィ）または非マウス血清、続いてS.aureausA細胞による免疫沈殿のために処理する。免疫沈殿物をSDS−ポリアクリルアミドゲルで分析する。免疫沈殿タンパク質の不在は、envタンパク質が分解されるか、または抗gp70抗体により認識され得ないことを意味すると予測される。この現象では、env RNA転写産物の存在がトランスフェクト細胞から全RNAを抽出し、続いてAKv env配列プローブを使用してノーザンブロット分析により測定される。免疫沈殿により検出でき、かつΨCRE/BAGウイルス粒子感染を阻止するフラグメントが本発明の更に別の実施例および方法に使用される。
5.1修飾envフラグメントの突然変異
数種のエコトロピックおよび非エコトロピックレトロウイルスgp70遺伝子のDNA配列を決定した。これらの配列の比較は、受容体相互作用に重要である領域を示唆するであろう。例えば、図19は、受容体特異性に関与すると考えられる、Ｎ末端領域内の、３つのエコトロピックおよび非エコトロピックgp70アミノ酸配列の比較を示す。３種のエコトロピックレトロウイルスが強い配列相同性を示す。エコトロピック配列と非エコトロピック配列にはかなりの相違があり、最も顕著な相違は位置68〜97に存在する約30のアミノ酸のギャップである（Battiniら,1992）。この領域はエコトロピック結合部位を含みうるが、レトロウイルスの異なるサブグループに異なるコンホメーションを与えることもあるらしい。
Ｎ末端envタンパク質の限定領域がウイルス−受容体相互作用を阻止することがわかったら、重要な残基を同定するためにアミノ酸を系統的に修飾することが可能である。次に突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用してin vitro突然変異誘発を行い、そしてERRの修飾につき先に記載されたプロメガのpSelected（pAlter）系（Yoshimotoら,1993）を使用する。
点突然変異を生じることが実施可能となるように受容体結合ドメインの位置を制限することができない場合、異なるウイルスサブグループの制限gp70領域の間の欠失分子またはキメラ分子が作製される。
ａ） 欠失変異体の作製の基準およびプロトコル
1. 組換えプラスミド中の対象の領域および比較的少ない他の領域内に部位を有する酵素による消化。
2. 読み取り枠が変更される場合、エキソヌクレアーゼIIIを使用してヌクレオチドを次第に除去する。
3. S1ヌクレアーゼを使用して平滑末端をつくる（13）。欠失分子を連結し、そして形質転換する。
4. 欠失クローンの配列を決定して正確な読み取り枠を維持するものを見出す。
例えば（図20）、163bpのSma １フラグメントがAkv env N末端配列（Lenzら,1992）の可変領域内に存在する（404bp,567bp）。このフラグメントは、アンフォトロピック配列から欠失される30のアミノ酸を含む（図19および20）。この配列の単純な除去は不正確な読み取り枠を生じるであろう。何となれば、一つのSma １部位（404bp）がアミノ酸トリプレットの一つのヌクレオチドを欠いているからである。
ｂ） 挿入の作製
標準プロトコル（Sambrook,前掲;Ausubel,前掲）に従って対象の配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用することにより特定の配列の挿入を行う。PCRプライマーを、envタンパク質の適切な読み取り枠を維持するように設計する。
例えば、アンフォトロピックウイルス配列へのエコトロピックウイルスの30アミノ酸領域の挿入を下記の工程により行う。
1. 位置325におけるRsalによるアンフォトロピックenv配列の消化は平滑末端部位を生じ、そしてチロシンに関するアミノ酸コドンの第二および第三のヌクレオチド（Ａ、Ｃ）から第一ヌクレオチド（Ｔ）を分離する。
2. エコトロピック配列を挿入するために、チロシン残基を保持するために5'末端に追加のACを含むプライマーを合成する。チロシン残基を追加し、そして読み取り枠を保持する追加のＴをその5'末端に有する3'プライマーを合成する。Akv配列に対する提案されたプライマーの位置を表IIIに示す。

PCR後に、生成物を２％のアガロースゲルで処理して、90bpフラグメントを切り出し、精製し、そしてRsal部位でアンフォトロピックenv配列につなぐ。組換えクローンの配列を決定してPCRフラグメントの正しい方向を有するものを決定する。
7. ウイルスエンベロープ配列結合C1qの同定
gp70分子は免疫グロブリンのFcフラグメントのC1q認識部位に類似しているドメインを有することが提起されていた。これが正しければ、そしてこの領域がウイルス結合および侵入にとってその分子の不必要な部分にあるならば、その除去および置換は遺伝子治療用のレトロウイルスベクターの直接的なin vivo使用に対する血清オンコルナウイルス溶解活性（SOLA）の潜在的影響を軽減すると予測される。C1q結合に重要なアミノ酸残基を同定するために、そのドメインが免疫グロブリンのFcフラグメントのC1q認識部位に類似している場合には、インフレーム欠失により、そしてオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発によりMuLVE−gp70を修飾する。C1q認識が一旦同定されると、本発明者らは、非C1q結合配列により置換されたこの領域を有する修飾MuLVE−gp70env遺伝子を構築しようと試みるであろう。
血清中のSOLA活性、およびウイルス感受性について分析するために、スクロースで分画化し、そして精製したクローン化放射線白血病ウイルスをPBSで基準化濃度に希釈し、少なくとも100,000cpmが本発明者らの標準逆転写酵素アッセイ（Brownら,1990）で検出できるようにする。種々の希釈率のヒト血清をウイルス調製物に添加し、そして通常の実験室照明条件下で30分間インキュベートする。対照試料を0.5％のトリトンＸ−100（シグマ）で処理する。次に全ての試料を以前に記載されたように（Merueloら,1988）RT活性について分析する。
雑誌または抄録、公開され、もしくは相当する米国もしくは外国の特許出願、発行された米国もしくは外国の特許、またはあらゆるその他の文献を含む本明細書で引用された全ての文献は、引用文献中に示された全てのデータ、表、図、および本文を含み、本明細書に参考としてそのまま組み入れるものとする。更に、本明細書で引用された文献中に引用されている文献の内容も参考としてそのままま組み入れられる。
公知方法の工程、慣用方法の工程、公知の方法または慣用の方法に関する言及は、本発明のあらゆる面、説明または実施態様が関連技術において開示され、教示され、または示唆されるということをいかなる場合も容認するものではない。
特定の実施態様の以上の説明は、当業者の知識（本明細書で引用された文献の内容を含む）を適用することにより、他の当業者が、無用な実験を行わないで、本発明の全概念から逸脱しないで、このような特定の実施態様を容易に改良し、かつ／または種々の用途に採用するのに充分なほど、本発明の一般的な特質を明らかにするであろう。それ故、このような適用および改良は、本明細書に示された教示および指針に基いて、開示された実施態様の均等物の意味および範囲内に包含されるものとする。本明細書中の表現または用語は説明のためであり、限定のためではないことを理解するべきであり、それ故、このような用語または表現は本明細書に示された教示および指針に鑑みて当業者により解釈されるべきである。
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Markowitz,D.ら“安全かつ有効なアンフォトロピックパッケージング細胞系"Virol.,167:400−406,1988a;
Meruelo,D.ら“有効投薬量で著しい抗レトロウイルス活性および低毒性を有する治療薬：芳香族多環式ジオンハイペリシンおよびシュードハイペリシン"Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5230−5234,1988;
Miller,A.D.ら“ヘルパーウイルス生産をもたらす組換えを避けるためのレトロウイルスパッケージング細胞系の再設計"Mol.Cell Biol.,6:2895−2902,1986;
Miller,A.D.ら“ヘルパー無レトロウイルスベクターの生産に関与する因子"Somat.Cell.Mol.Genet.,12:175−183,1986;
Muenchau,D.ら“複製コンピテントウイルスの発生のためのレトロウイルスパッケージング系の分析"Virology,176:262−265,1990;
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Ogata,M.らJ.Immunol.,141:4224,1988;
O'Hara,B.ら“テナガザル類人猿白血病ウイルスによる感染に対する感受性を与えるヒト遺伝子の特性決定"Cell Growth Diff.,1:119−127,1990;
Ott,D.ら“非エコトロピックマウス白血病ウイルス表面糖タンパク質gp70^SUの受容体特異性の基礎"J.Virol.,66:4632−4638,1992;
Pastan,I.ら“癌治療のための組換え毒素"Science,254:1173−177,1991;
Pastan,I.ら“粘液性癌腫と反応するモノクローナル抗体B1およびB3の特性決定"Cancer Res.,51:3781−3787,1991;
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Rasheed,S.ら“天然産野生マウス白血病ウイルスのアンフォトロピック宿主範囲"J.Virol.,19:13−18,1976;
Rein,A.ら“異なる組換えマウス白血病ウイルスは異なる細胞表面受容体を使用する"Virology,136:144−152,1984;
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Sanes,J.R.ら“マウス胚中の後移植細胞系列を研究するための組換えレトロウイルスの使用"EMBO J.,5:3133−3142,1986;
Sattentau,Q.J.ら“ヒトおよびサルの免疫不全ウイルスHIV−１、HIV−２およびSIVがそれらの細胞表面受容体、CD4分子の同様のエピトープと相互作用する"AIDS,2:101−105,1988;
Scadden,D.T.ら“レトロウイルスベクターで感染されたヒト細胞が内在性マウスプロウイルスを獲得する"J.Virol.,64:424−427,1990;
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Shih,C.C.ら“レトロウイルス組み込みに非常に好ましい標的"Cell,53:531−537,1988;
Shinnick,T.M.ら“モロニーマウス白血病ウイルスのヌクレオチド配列"Nature,293:543−548,1981;
Simonsen,C.C.ら“変性マウスジヒドロフォレートレダクターゼcDNAの単離および発現"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2495−2499,1983;
Skerra,A.ら“エスチリシア・コリ中の機能性免疫グロブリンFvフラグメントの構築"Science,240:1038−1041.1988;
Sommerfelt,M.A.ら“ヒト細胞に塗布する20のレトロウイルスの受容体干渉群"Virology,176:58−69,1990;
Sommerfelt,M.A.ら“ヒトＴ細胞白血病ウイルスは、ヒト染色体17により決定された受容体を使用する"Science,242:1557−1559,1988;
Sommerfelt,M.A.ら“ヒト染色体19におけるＤ型シミアンレトロウイルスの受容体遺伝子の局在化"J.Virol.,64:6214−6220,1990;
Stenback,W.A.ら“電子顕微鏡により明らかにされるようなハムスター腫瘍中のウイルス粒子"Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,122:1219−1223,1966;
Stoye,J.P.ら“内在性マウス白血病ウイルスの４種のクラス：構造上の関係および潜在的な組換え"J.Virol.,61:2859−2669,1987;
Thompson,L.Science,258:744−746,1992;
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Urlab,G.ら“ジヒドロフォレートレダクターゼ活性を欠乏しているチャイニーズハムスター細胞変異体の分離"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4216−4220,1980;
Varkl,N.らCancer Res.,44:681,1984;
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Verma,I.M.,1990.遺伝子治療Sci.Am.,262:68−84;
Vile,R.G.ら“パーミアーゼとしてのウイルス受容体"N−ature,352:666−667,1991;
Vitetta,E.S.らScience,238:1098−177,1987;
Wahl,R.L.らJ.Nucl.Med.,24:316,1983;
Waldemann.Cell.Immunol.,99:53−731,1986;
Walz,G.らProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:9485,1989;
Wang,H.ら“エコトロピックマウスレトロウイルスの細胞表面受容体は基本的なアミノ酸トランスポーターである"Nuture,352:729−731,1991;
Weiss,R.ら“RNA腫瘍ウイルス：腫瘍ウイルスの分子生物学"Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1984;
Welsh,R.M.ら“ヒト血清はRNA腫瘍ウイルスを溶解する"Nature,257:612−614,1975;
Welsh,R.M.ら“ヒト血清によるオンコルナウイルスの不活化および溶解"Virology,74:432−440,1976;
Wigler,M.ら“ドナーとして完全細胞DNAを使用する単一コピー真核生物遺伝子の生化学的移入"Cell,14:725−731,1978;
Williams,D.P.らProtein Eng.,1:49,1987;
Willingham,M.C.らProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:2474,1987;
Yee,J.K.らCold Spring Harbor Symp.Quant.,Biol.,51:1021,1986;
Yoshimoto,T.ら“マウスエコトロピックレトロウイルス受容体に相同の新規なヒト遺伝子の分子クローニングおよび特性決定"Virology,185:10−17,1991;
Yoshimoto,T.ら“エコトロピックマウス白血病レトロウイルスによる感染に重要なアミノ酸残基の同定"J.Virol.,印刷中、1993;
Yu,S.F.ら“哺乳類細胞への完全遺伝子の移入に設計された自己不活化レトロウイルスベクター"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83:3194−3198,1986;

配列表
配列番号:1
配列の長さ:1102
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..1102
配列

配列番号:2
配列の長さ:367
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:3
配列の長さ:2425
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:199..2064
配列

配列番号:4
配列の長さ:622
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:5
配列の長さ:2397
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:410..1768
配列

配列番号:6
配列の長さ:453
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:7
配列の長さ:2157
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:148..2034
配列

配列番号:8
配列の長さ:629
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:9
配列の長さ:26
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:10
配列の長さ:31
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:11
配列の長さ:35
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:12
配列の長さ:33
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:13
配列の長さ:26
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:14
配列の長さ:25
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:15
配列の長さ:29
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:16
配列の長さ:42
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:17
配列の長さ:17
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:18
配列の長さ:18
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:19
配列の長さ:17
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:20
配列の長さ:28
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:21
配列の長さ:30
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:22
配列の長さ:30
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:23
配列の長さ:26
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:24
配列の長さ:29
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:25
配列の長さ:32
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:26
配列の長さ:26
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:27
配列の長さ:17
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:28
配列の長さ:27
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:29
配列の長さ:26
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:30
配列の長さ:28
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

配列番号:31
配列の長さ:28
配列の型:DNA
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA
配列

Background of the Invention
Field of Invention
The present invention belongs to the fields of virology and molecular genetics, and comprises nucleic acids, methods, and proteins comprising mammalian mutant viral receptor polypeptides that bind to protein-binding domains of viruses and / or viral outer membranes. The present invention also relates to their production methods and their use in diagnostic and therapeutic applications including gene therapy.
Background art description
Infection of a cell with a virus begins with the virus attaching to the viral receptor of the cell. A number of virus-specific cellular receptors have been identified, and most of these receptor molecules have other known cellular functions.
The expression of these virus-binding proteins, or receptors, is a powerful factor that determines susceptibility to viral infection. When the viral outer membrane protein (env) is fused to the target cell, it is necessary for the virus to bind. This fusion can occur at the cell surface or in endosomes that have become acidic following receptor-dependent endocytosis (White et al., Quant. Rev. Biophys. 16: 151-195, 1983). ). After this fusion, the virion core enters the cytoplasm and the viral replication process begins. For example, in the case of HIV, recent studies have suggested that cell surface molecules other than CD4 also play an important role in the entry of viruses into human cells.
Ecotropic and amphotropic mouthlet Rovirus receptor and infection
Cell susceptibility to infection with Ekorotopic (species-specific) murine leukemia virus (E-MuLV) or amphotropic (species non-specific) murine leukemia virus (E-MuLV) is also related to membrane receptors on the viral outer membrane. It can be determined by the connectivity.
Based on viral interference assays, four specific MuLV receptors are envisioned. (A) a receptor for E-MuLV, (b) a receptor for wild-type amphotropic E-MuLV, (c) a recombinant virus derived from E-MuLV, such as “mink cell focus-inducible”, That is, it is a receptor for MCF virus, and (d) a receptor for recombinant virus derived from amphotropic MuLV (Rein, A. et al., Virology 136: 144-152, 1984).
Recently, a clone of cDNA (designated W1) (SEQ ID NO: 4) encoding mouse ecorotopic retroviral receptor (ERR) was identified (Albritton, LWet al., Cell 57: 659-666). 1989). This study demonstrated that susceptibility to E-MuLV infection was acquired by expression of a single mouse gene in human EJ cells.
Viral receptor-dependent tissue specificity
HIV is an example of a virus that exhibits receptor-dependent tissue restriction, which is clearly based on the fact that the virus uses the CD4 protein as the primary receptor. However, cell-specific receptors are unlikely to be the only determinants of tissue specificity. The tissue orientation of retroviruses depends on various factors such as tissue specificity of long terminal repeats, virusesenvIt is likely that the result is a complex intertwining of protein mutations, cellular factors, and expression of appropriate cell surface receptors (Kabat, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 148: 1-31, 1989).
tea(T cell early activation) gene (SEQ ID NO: 5), for example clone 20.5 (MacLeod et al., J. Biol. Chem. 1: 271-279, 1990), activates T cells. This is the first example of a cloned gene, i.e., cDNA, capable of encoding multiple transmembrane proteins that are induced in the meantime (Crabtree, Science 243: 355-361, 1989).teaThe function of the gene is not yet known.
The sequence of 20.5 cDNA (SEQ ID NO: 5) had surprising homology with the mouse ERR cDNA clone (SEQ ID NO: 3) described above (Rec-1gene). In research on retrovirus binding and infection,teaThere is a need to determine whether the protein encoded by is functioning as a viral receptor (Rein et al., Virology 136: 144-152, 1984).teaAlthough ERR and ERR have a high degree of homology, both genes have different chromosomal positions and different expression patterns in the tissue of the assumed protein product.
Gene therapy and gene delivery
Although relatively efficient in achieving gene delivery, one of the problematic methods is the delivery of amphotropic retrovirus-dependent genes (Gilboa, E., Bio-Essays 5: 252-258, 1987; Williams, DA et al., Nature 310: 476-480, 1984; Weiss, RA et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1985). Recombinant amphotropic retroviruses have been studied as having the potential to be used as vectors in delivering genes to human cells (Cone, RD et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6349-6353, 1984; Danos, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464, 1988). These studies are conducted because this type of amphotropic virus, such as mouse amphotropic E-MuLV, can infect human cells. Although one of the safety issues that could impede clinical development in this approach is the wild type due to recombination that causes replication, even for replication-defective amphotropic retroviruses. It is a fact that it may produce a variant of. Such changes can cause retrovirus infection to spread to cells and tissues that were not intended for genetic modification. This can result in systemic diseases, such as pathological conditions, including cancer, where the amphotropic virus nucleic acid, together with the long terminal repeat nucleic acid, becomes an important functional gene in the cell. This is due to the insertion and destruction of the functional gene resulting in a pathological condition (Mulligan, R., Science, 1993). The present invention aims to meet these needs and solve these problems.
Thus, there is a need to overcome one or more of the problems associated with introducing heterologous genes into eukaryotic cells using known amphotropic retroviruses. Binds to viruses and can be used for diagnostic and therapeutic applications without the problems of immunogenicity and binding to nonspecific cells seen when using mouse amphotropic recombinant viruses There is also a need to provide human viral receptor proteins.
Although various references are cited herein, this does not mean that the cited references are prior art or consideration material that has a particular relevance to any patentability in the claims of this application. The descriptions of the contents and dates of the cited documents are based on the information that the applicant had at the time of filing of the present application, and do not confirm that the descriptions are accurate.
Disclosure of the invention
The present invention is intended to overcome one or more of the deficiencies of the related background art.
The present invention improves the safety and / or selectivity by which a nucleic acid having a therapeutic and / or diagnostic effect can be delivered to a target cell, so that the nucleic acid is non-specifically incorporated into or associated with the cell. It is also intended to provide a novel and / or superior method of gene therapy that is less likely to occur.
The present invention provides such selective gene therapy by using a vector having a viral binding domain capable of binding to a chimeric receptor polypeptide of the present invention that may be associated with a selected target cell. To do. Target cells are selective for virus-binding domains of species other than the target cell species by being accompanied by a chimeric receptor polypeptide. This mutant receptor polypeptide has the same species of viral receptor binding site as the target cell of the first species, and this binding is not limited to viruses specific to species other than the first species. It has been modified to bind.
The present invention corresponds to a binding portion of a viral receptor specific for at least a first species, and is associated with and / or infected by a virus specific for a species other than the first species, or at least a first Viral outer membrane proteins specific to species other than species (envAnd a chimeric receptor polypeptide that has been modified to allow binding by the binding domain. The amino acid sequence of the chimeric receptor polypeptide that contains the altered portion of the viral receptor binding site of the chimeric receptor polypeptide shall be referred to as the chimeric receptor binding site. The use of this sequence shall be embodied in the concept of a chimeric receptor, regardless of its origin.
The chimeric receptor polypeptide also results in at least one amino acid substitution, deletion, or addition corresponding to at least one amino acid in a viral receptor binding site of a virus specific for a species other than the first species. The binding site sequence of the first-type virus receptor modified in this way can also be included. Such substitutions, deletions or additions result in a chimeric receptor polypeptide of a virus specific for a species other than the first species.envThe ability to bind to the binding domain is conferred. The first species is preferably selected from human, primate, or rodent species.
A chimeric receptor polypeptide is one that is provided as an isolated, purified, recombinant and / or organic synthetic polypeptide. Therefore, the obtained chimeric receptor polypeptide or the chimeric receptor cell on which the chimeric receptor polypeptide is expressed or attached is the virus specific for the species other than the first species or the binding thereof. It can be bound and / or infected in vivo, in situ, or in vitro by a sex domain.
Accordingly, the present invention is based on the teachings and guidelines presented herein and all compounds, compositions, and chimeric receptor polypeptides of this type that can be practiced without undue experimentation. Including methods of making and using the.
Furthermore, the chimeric receptor polypeptide of the present invention is used for diagnosis, research or treatment, for example, human gene therapy or cancer treatment or diagnosis, and the chimeric receptor binding site of the chimeric receptor polypeptide is expressed on the surface thereof. Alternatively, it is intended for use in selectively targeting accompanying cells. In addition, a use is not limited to these.
In one aspect of the invention, the chimeric receptor polypeptide is a virus specific to a species other than the first species, orenvA binding domain can be used in selectively binding to a target cell in which a chimeric receptor polypeptide is expressed or associated. A virus specific to a species other than the first species, orenvThe complex containing the binding domain can be used as a target cell-specific delivery vector when delivering at least one diagnostic or therapeutic agent to the target cell or tissue.
The present invention also contemplates providing nucleic acids encoding such chimeric receptor polypeptides and / or cells or tissues that express such chimeric receptor polypeptides.
Thus, the present invention is useful for delivery vectors, such as gene therapy, that include one or more therapeutic and / or diagnostic agents that are evaluated as having improved safety compared to various approaches in the related art. It is intended to provide a suitable vector. In particular, the present invention relates to a therapeutic agent and / or diagnostic agent substance that binds substantially only to a target cell that is a chimeric receptor cell or a tissue that expresses a cell surface chimeric receptor polypeptide. It allows the use of specific delivery vectors. This delivery vector has substantially reduced or substantially no binding and / or infectivity to non-target cells or tissues.
The present invention uses transient or constitutive expression of a chimeric receptor polypeptide associated with a chimeric receptor cell of the first species, ie, on the surface of the chimeric receptor cell of the first species. It is also intended to provide in vitro, in situ, or in vivo gene therapy for selected cells or tissues of eukaryotes such as mammals, birds, insects, or yeast. Such a chimeric receptor cell or tissue may be a viral vector specific for a species other than the first species, or itsenvIt is susceptible to exclusive infection or binding by the binding domain.
By infection with a non-human specific viral vector or binding site, a gene, eg, a therapeutic gene, is stably incorporated into the selected cell or tissue in vivo, in situ, or in vitro, and the selected cell or tissue. As a result, a gene product having a desired effect on the target cell or tissue is expressed.
The present invention provides gene therapy for a specific target cell or tissue that is substantially free or substantially free of non-target cells from infecting and / or binding to a viral vector. It is also intended.
The present invention further provides that the viral vector used for delivery of the therapeutic agent for gene therapy is substantially free from reverting or interchanging into a replicable state or a state that can be packaged in a virus. It is also intended to provide less gene therapy. The target cell can express or accompany the chimeric receptor polypeptide of the present invention.
The present invention is also intended to provide a chimeric receptor polypeptide or a retroviral polypeptide that can be used in vivo, in situ, or in vitro to suppress infection of human cells or tissues with retroviruses. To do.
The present invention also provides methods for preventing or treating viral infections, such as retroviral infections (eg, HIV), using the receptor polypeptides of the present invention. In addition, an applicable case is not limited to these.
The present invention comprises a recombinant form comprising a nucleotide sequence encoding a sequence substantially corresponding to an H13 molecule, or an H13 amino acid sequence or a mutant thereof, or a sequence consisting essentially of the H13 amino acid sequence or a mutant thereof. The nucleic acid (SEQ ID NO: 8) is also provided, wherein the nucleic acid is composed of DNA or RNA.
Those skilled in the art can appreciate other objects, features and advantages of the present invention from the following detailed description. The following detailed description and specific examples, while indicating preferred embodiments of the invention, are intended to be illustrative of the invention and are not to be construed as limiting the invention. I want you to understand. Many changes and modifications may be made within the scope of the present invention without departing from the spirit thereof, and the invention includes all such modifications.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the nucleic acid sequence of H13 (SEQ ID NO: 7) including coding and non-coding sequences, and the expected protein sequence of the H13 protein (SEQ ID NO: 8).
FIG. 2 shows a schematic diagram in which one strand of H13 and the cDNA sequence of ERR (SEQ ID NOs: 7 and 3, respectively) are juxtaposed. Sequence analysis is performed using the Genetics Computer Group sequence analysis software package (Devereux, J. et al., Nucl. Acids. Res. 12: 387-395, 1984). went.
FIG. 3 shows the assumed amino acid sequences of H13, ERR, and TEA in parallel. The vertical line indicates that the sequences are homologous. One point indicates that the sequence is not homologous, and two points indicate conservative amino acid substitutions. The sequence was analyzed as in FIG. Shown in parentheses is the sequence of H13 corresponding to extracellular domain 3 (residues 210-249), as well as extracellular domain 4 (residues 310-337).
FIG. 4 shows that nucleic acids derived from humans (CCL120, CCL119, SupT1, H9, MOLT4), hamster (CHO-K1), and mouse (Balb / c thymocytes or BIOT6R) digested with EcoR I An autoradiogram of the hybridization pattern of the probe probed with the Kpn I-Kpn I fragment (390 bp) is shown.
FIG. 5 shows autoradiograms obtained by Southern blot analysis of nucleic acids obtained from various species having H13 cDNA (SEQ ID NO: 1). Hybridized nucleic acids are nucleic acids derived from humans (CCL120, CCL119, SupT1, H9, MOLT4), hamster (CHO-K1), and mouse thymocytes (Balb / c or BIOT6R) digested with EcoRI.
FIG. 6 shows an autoradiogram of H13 gene expression. RNA derived from the human cell line shown in the figure was hybridized with H13 cDNA (SEQ ID NO: 1).
FIG. 7 shows RNA derived from human (CEM, H9, MOLT4, SupT1, CCL120, CCL119), hamster (CHOK1), and mouse (RL) probed with the Kpn I-Kpn I fragment (390 bp) of mouse ERR cDNA. , Shows an autoradiogram of a hybridization pattern.
FIG. 8 shows a Northern blot demonstrating that susceptibility to infection by mouse Echotopic retrovirus was acquired by transfecting resistant cells with ERR cDNA. After transfection of ERR cDNA into hamster CHOK1 cells, the transfection product expressing the mouse retrovirus receptor gene was infected with mouse radiation leukemia virus (RadLV). Two weeks later, analysis by Northern blot was performed using a viral probe, and the reverse transcriptase (RT) activity of the cell supernatant was measured.
FIG. 9 is a plot of the hydrophilicity of the assumed proteins of H13, ERR, and TEA. The vertical axis shows the hydrophilicity values obtained with the PEPTIDESTRUCTURE program (see, for example, Jameson et al., CABIOS 4: 181-186, 1988).
FIG. 10 is a graph showing the antigenicity of the assumed protein of H13. In analyzing the antigenicity of the assumed protein of H13, PEPTIDESTRUCTURE^TMUsing the program. One of the highly antigenic peptide portions (amino acid residues 309-367) was prepared by using the Acc I-EcoR I fragment shown in FIG.
FIG. 11 shows an SDS-PAGE autoradiogram showing that a fusion protein containing the H13 protein with glutathione-S-transferase (GST) has been synthesized. The fusion protein is derived by ligating the 180 bp Acc I-EcoR I fragment of the H13 cDNA to the plasmid pGEX-2T that expresses the antigen as a fusion protein and adding isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG). And purified by using glutathione-Sepharose chromatography.
Figures 12A and B show the genetic mapping of the H13 gene to human chromosome 13. The autoradiogram (FIG. 12A) shows the hybridization pattern of nucleic acid digested with EcoR I from human-hamster somatic cell hybrids probed with H13 cDNA (SEQ ID NO: 1). Lanes 1 and 11 contain human and hamster nucleic acids, respectively. Lanes 2-10 contain nucleic acids derived from the chromosomes listed in the table of FIG. 12B.
FIG. 13 is a schematic diagram of the genetic structure of the H13 gene, the ERR gene, and four chimeric constructs between the H13 gene and the ERR gene. It has also been suggested that E-MuLV is infectious to human cells transfected with various constructs.
FIG. 14 shows a comparison of the sequence (nucleotide sequence and amino acid sequence) of the region called extracellular domain 3 of H13 and ERR (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and also shown as part of FIG. 1). is there). This region of the receptor protein is the region where the human and mouse sequences are most different. Sequences are software packages for sequence analysis from the Genetics Computer Group (see, eg, Devereux, J. et al., Nucl. Acids. Res. 12: 387-395, 1984) Was used in parallel.
FIG. 15 shows a schematic diagram of several cDNA clones used in determining the sequence of H13. The general structural relationship between homologous mouse ERRs was also determined using these cDNA clones. Clone 7-2 (H13.7-2) shows part of the complete H13 nucleic acid sequence. This clone was the first H13 clone that was sequenced, and SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were obtained. Clone 1-1 (H13.1-1) and clone 3-2 (H13.3-2) each contain part of the sequence of H13. When these three clones were combined and sequenced, the entire nucleic acid sequence and amino acid sequence of H13 (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively) were obtained.
FIG. 16 shows a schematic diagram of extracellular domains 3 and 4. In the figure, * indicates a position containing an amino acid essential for infection with MuLV-E. The mouse-human chimeric receptor molecule (chimera I-III) was prepared by substitution using the common restriction site of mouse ERR as well as human H13, and its ability to function as a receptor for MuLV-E is expressed by recombinant MuLV. -E, measured by using ΨCRE / BAG virions (eg Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 156-160, 1987; Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15: 6460-6464, 1988). The black square at the top of the figure indicates the extracellular domain of ERR and H13 (see, eg, Alberton et al., Cell 57: 659-666, 1989; Yoshimoto et al., Virology 185: 10-17, 1991 ), Fine dots and shaded bars indicate the nucleotide sequences of ERR and H13, respectively. This figure is one of the representative results obtained in three different experiments.
FIG. 17 shows a comparison between the nucleotide sequence and amino acid sequence of extracellular domains 3 and 4 of mouse ERR and human H13. In paralleling both sequences, the Genetics Computer Group sequence analysis software package (eg Devereux, J. et al., Nucl. Acids. Res. 12: 387-395, 1984). ) Was used. To identify the essential amino acid residues, oligonucleotide-dependent mutagenesis was performed to generate 13 distinct mutant ERR molecules, including one or two amino acid substitutions or insertions enclosed in a box. Generated.
FIG. 18 shows the results illustrating that H13 acquired the ability to function as a receptor for MuLV-E by mutation.
FIG. 19 shows the amino acid sequence of gp70 having receptor specificity in parallel with the sequences of various leukemia viruses. Ecorotopic retrovirus sequences: Akv (8), Friend MLV (11), Moloney MLV (12). Non-ecological topic retrovirus sequences: xenotropic MLV NZB.1U6 (2), polytropic MCF247 (2), amphotropic MLV 4070A (2). (+): Amino acid identity. (-): Sequence gap. Capital letters: Conservative amino acid substitutions. Lower case: non-conservative amino acid substitution. The numbers indicate the amino acid positions in the gp70 sequence.
Figure 20 shows the N-terminal of AKv of ecotopic and MLV 4070A of amphotropic.envA comparison of amino acids and nucleic acids in the region is shown. There is a 30 amino acid gap in the amphotropic sequence. The nucleotide sequence is shown as well as the corresponding amino acid. AKv sequence (9): Genbank accession number V01164. Amphotropic MLB4070 (2): Genbank accession number mm469. The upper number indicates the position of the nucleotide in the reporting sequence. The lower number indicates the amino acid position (see FIG. 4). The location of the AKv Sma I restriction site as well as the Ampho.Rsa I restriction site are also indicated. Nucleotide sequences suitable for PCR primers are indicated by arrows.
Detailed Description of the Preferred Embodiment
The present invention relates to chimeric receptor polypeptides that have been found to provide target cell-specific binding sites for gene therapy and delivery vectors for specific viruses, viral vectors and therapeutic and / or diagnostic agents. Such chimeric receptor polypeptides of the present invention can be used for therapeutic applications including diagnosis, research and gene therapy, in which case target cells having such chimeric receptor polypeptides on their surface are non-human. It can be exclusively and / or substantially infected by a specific delivery vector. Thus, the present invention overcomes one or more of the problems associated with using known viral vectors that are susceptible to non-specific infection of non-target cells, as well as back mutations or mutations of such viral vectors to replication competence. To do.
According to the present invention, a human or other mammalian cell or tissue is used as a chimeric receptor cell or tissue so that it associates with, or transiently or constitutively expresses, the chimeric receptor polypeptide. It can be processed in vivo, in situ or in vitro. Thus, an animal or human subject having such a chimeric receptor cell or tissue is treated with a therapeutic and / or diagnostic agent further comprising an env binding domain polypeptide that binds to the cell surface chimeric receptor polypeptide of the invention. It can be treated or diagnosed according to the method.
In the context of the present invention, the term “chimeric receptor binding site” or “chimeric receptor” is a modified first type virus receptor binding site, the modification being a non-first type specific virus receptor. A receptor binding site composed of a chimeric receptor polypeptide in which at least two amino acids have been substituted, deleted or added from the binding site. This at least two amino acid deletions, substitutions or additions confer binding ability on the chimeric receptor for the env binding domain of the non-first-specific virus surface protein. Preferably, this substitution or addition corresponds to domain 3 of human H13 substituted with a non-human specific viral receptor such as ERR, MuLV or GALV. Preferably, the substituted, deleted or added amino acid residues are residues 200 to 280 or 220 to 260, 230 to 245 of H13 (SEQ ID NO: 8) or any range or value thereof. For example, it corresponds to a residue similar to the substitution shown in Table 1 below.
The term “chimeric receptor cell” or “chimeric receptor tissue” refers to a non-first-specific virus that has a chimeric receptor polypeptide on its cell surface or is associated with the chimeric receptor polypeptide. Alternatively, it refers to a first type of cell or tissue in which an env binding domain specific for the chimeric receptor polypeptide can bind to the chimeric cell or tissue in vivo, in situ or in vitro. Preferably, the chimeric receptor polypeptide may be associated with the chimeric receptor cell via a cell specific receptor associated with a chimeric receptor polypeptide, preferably the combination is first Binding to a species-specific cell type or tissue type provides a chimeric receptor cell of the invention. In other preferred embodiments, such association is provided by recombinant expression of this specific cell or tissue type of at least one chimeric receptor polypeptide.
In the context of the present invention, the term “association” refers to covalent bonds, hydrophobic / hydrophilic interactions, van der Waals forces, ion pairs, ligand-receptor interactions, epitope-antibody binding site interactions, enzyme-substrate interactions. , Refers to, but is not limited to, any type of covalent or non-covalent bond or association, such as liposome-hydrophobic interactions, nucleotide base pairing, membrane-hydrophobic interactions and the like.
The term “chimeric receptor polypeptide” refers to a polypeptide of at least 10 amino acids corresponding to a human viral receptor protein or a consensus sequence thereof, wherein the chimeric receptor polypeptide is 10-700, 10-100, Contains a chimeric receptor binding site capable of binding to the env binding domain of a non-human specific virus such as 10-50, 10-30, 20-30, 20-40, 40-60 or any range or value thereof .
Alternatively, or in addition, the chimeric receptor polypeptide of the present invention is at least 80% (e.g. 83-85, 87-90, 93-95, 97-98, or As an amino acid sequence of at least 10 residues having homology of 81-99% or any range or value thereof, such as 99% or any range or value thereof, from a non-first class virus receptor Can be defined as any ecotropic or amphotropic first-type virus receptor that is modified to contain the amino acids and has the biological activity of binding to the binding domain of a non-first-type virus env polypeptide. Preferably, the first species is human and the second species is rodent or vice versa. Non-limiting examples of such corresponding human viral receptor sequences are those corresponding to SEQ ID NO: 8, eg, 10-629 amino acids of SEQ ID NO: 8, or any value or range thereof.
On the other hand, the chimeric receptor polypeptide of the present invention corresponds to at least 1 to 20 transmembrane domains of the first type virus receptor protein, and has at least 80% (80 to 80%) of the corresponding first type virus receptor. It may further comprise a hydrophobic amino acid sequence that is homologous (such as 100% or any range or value thereof). Such transmembrane domains are those already described, for example the human H13 sequence (SEQ ID NO: 8) or mouse ERR (SEQ ID NO: 4) with 14 potential transmembrane domains (eg Eisenberg). Et al., J. Mol. Biol., 179: 125-142 (1984)), for example, a hydrophobic plotting method according to known methods cited therein or cited herein. Can be confirmed.
A non-limiting example of a first type virus receptor as a human virus receptor is the human H13 protein (SEQ ID NO: 8), and as an H13 polypeptide according to the present invention, for example, in each case as a reference here It can be obtained in a non-naturally occurring form such as purified or chemically synthesized according to known methods as cited or produced recombinantly.
Such non-limiting examples of chimeric receptor polypeptides of the invention include, for example, non-humans such as the non-limiting examples E-MuLV, gp-70 or ERR receptor protein (SEQ ID NO: 4). It may be a modified human H13 amino acid sequence of at least 10 amino acids modified to give the ability to bind to a specific virus (eg, as in SEQ ID NO: 8). Such modifications may preferably include substitution at the receptor binding site of the human viral receptor sequence with at least one non-human viral receptor amino acid, such as a mouse ERR amino acid in the corresponding site in H13. Allows the infection of human or non-mouse target cells with body polypeptides, preferably human cells, with viruses such as E-MuLV or retroviruses.
Thus, as a further non-limiting secondary example, to confer E-MuLV infection susceptibility to human or non-mouse cells, the corresponding E-MuLV receptor amino acid residues in domain 3 of H13 are replaced. Is preferred. Domain 3 contains several residues at positions 210-250 (SEQ ID NO: 7). Preferred substitutions are substitutions of amino acid residues 210-242 (SEQ ID NO: 4), preferably amino acids 238, in the range of 1-10 amino acid residues from the corresponding domain of ERR or some or any of them. 239 and 242 substitutions, more preferably at least 242 substitutions. Substitution of 1 to 4 residues is preferred. For example, the residues and positions that differ within the extracellular domain 3 and ERR of H13 are listed in Table 1 below. In a more preferred embodiment, as shown in FIG. 18, this replaces at least Pro242 of H13 (SEQ ID NO: 8) with Tyr and replaces at least one of Gly240 and Val244 (SEQ ID NO: 8) with Val and Glu, respectively. Replace. Furthermore, preferably at least one of the H13 amino acids 239 may be substituted with the corresponding ERR amino acid 233.

Non-limiting examples of chimeric receptor polypeptides according to the invention include Tyr242, Phe242 and / or Trp242 and at least one of Val1240, Met240, Leu240, Ile240, Glu244, Gln244, Asp244, or Asn244; and Asn239, Asp239, Glu239 or Gln239 (SEQ ID NO: 3) may be included, but at least Pro242 of H13 (SEQ ID NO: 8) is replaced with Tyr, and at least one of Gly240 and Val244 (SEQ ID NO: 8) Replace with Val and Glu, respectively.
Another means for altering the virus binding specificity of H13 is by deleting one or more “extra” amino acid residues in H13 that do not correspond to residues of ERR. Preferred deletions (within extracellular domain 4) are deletions of 1 to 6 residues from H13 positions 326 to 331 (SEQ ID NO: 1), most preferably all 6 residues. .
In another non-limiting example of a chimeric receptor polypeptide of the invention, an H13 chimeric receptor polypeptide can be provided that confers the ability of human cells to bind to the env binding domain of a non-human virus. In that case, in order to confer such binding ability, 1 to 30 amino acids of H13 are substituted, deleted or modified with the corresponding amino acids from ERR. Preferably, such a chimeric receptor polypeptide is one in which at least Pro242 of the H13 polypeptide (SEQ ID NO: 8) is replaced with Tyr, and at least one of Gly240 and Val244 (SEQ ID NO: 8) is Val and Glu, respectively. Comprising a substituted peptide, or a fragment having an amino acid sequence substantially matching the amino acid sequence of H13, so that the resulting chimeric receptor may infect other human or non-mouse cell types or tissue types. Not selectively bound by mouse ecotropic retrovirus.
In addition, the homotypic chimeric receptor polypeptide of the amphotropic first-type virus receptor corresponding to H13 is similarly modified to produce a non-first-type specific amphotropic virus, such as a chimeric receptor cell or tissue. You may enable it to combine. Preferably, the first type is a human or a rodent.
Also included are soluble forms of H13 or chimeric receptor polypeptides, as well as functional derivatives thereof, that have similar biological activities for all uses described herein. Also contemplated are all active forms of each of the chimeric receptors or H13 polypeptides or H13 transcripts derived from the chimeric receptors and all mutants having H13-like activity.
Methods for making soluble forms of receptors that are normally transmembrane proteins are known in the art (eg, Smith, DH et al., Science, 238: 1704-1707 (1987); Fisher , RA) et al., Nature, 331: 76-78 (1988); Hussey, RE et al., Nature, 331: 78-81 (1988); Deen, KC et al., Nature, 331: 82-84. (1988); Traunecker, A. et al., Nature, 331: 84-86 (1988); Gershoni, JM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4087-4089 (1988). And these documents are incorporated herein by reference). Such methods are generally based on truncation of the nucleic acid encoding the receptor protein, which can interact with specific ligands such as intact retroviruses or retroviral proteins or glycoproteins by eliminating the transmembrane moiety. One (or more) extracellular domains are left intact. For the purposes of the present invention, it is important that the soluble chimeric receptor polypeptide or H13 polypeptide comprises a chimeric receptor or H13 binding site element that allows binding to the virus. A chimeric receptor polypeptide or H13 polypeptide has many amino acid residues, but 1 or 2 as any value or range 2-15, or 3-5, 6-9 or 10-15. Only or more are critically involved in virus recognition and binding.
As described herein, the H13 protein or chimeric receptor polypeptide of the invention may be used for drug design, e.g., to reduce immunogenicity, to enhance solubility or to enhance transport, or to provide clearance or Further modifications may be made according to known methods to prevent degradation. In a further aspect, the present invention provides a mutein of the chimeric receptor polypeptide of the present invention. By “mutant protein” is meant a “fragment”, “variant” or “chemical derivative” of an H13 protein or chimeric receptor polypeptide. The mutein retains at least part of the function of the H13 protein that can be used according to the present invention.
A “fragment” of an H13 protein or chimeric receptor polypeptide is any subset of this molecule, ie, a shorter peptide.
A “mutant protein” of an H13 chimeric receptor polypeptide refers to a molecule that is substantially similar to either this entire peptide or a fragment thereof. Muteins can be conveniently prepared by methods of recombinant production of muteins, including direct chemical synthesis or mutagenesis, using methods well known in the art. See, for example, Sambrook's reference, Ausubel's reference, and Coligan's reference.
Alternatively, muteins of H13 or chimeric receptor polypeptides can be prepared by mutations in the nucleic acid encoding the synthesized peptide. Such mutants include, for example, deletions or insertions or substitutions of residues within the amino acid sequences set forth herein. Any combination of deletions, insertions, and substitutions can be used to arrive at the final construct, provided that the final construct has the desired activity. Obviously, mutations made in the nucleic acid encoding the mutein peptide should not change its reading frame and preferably will not create a complementary region that can result in a second mRNA structure ( For example, see European Patent Publication EP75,444).
At the genetic level, these muteins are usually found in site-directed mutagenesis of nucleotides within the nucleic acid encoding this peptide molecule (Adelman et al., DNA 2: 183 (1983) or Ausberg, supra, Sambrook. The above-mentioned document or edited by Corigan et al., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Association and Wiley Intersciences NY, (1992, 1993)), thereby creating a nucleic acid encoding this mutant, Prepared by expressing this nucleic acid in recombinant cell culture. The mutein typically exhibits the same biological activity as the chimeric peptide.
In particular, chimeric receptor polypeptides or H13 polypeptides with critical amino acid residues derived from other non-human or non-animal specific viruses such as ERR may be made using site-directed mutagenesis. Good.
Another group of muteins are those in which at least one, preferably only one, amino acid residue in this protein molecule has been removed and a different residue inserted in its place. For a detailed description of protein chemistry and structure, see Schulz, GE et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978, and Creighton, TE, Proteins: Structure and Molecular Properties, WHFreeman. & Co., San Francisco, 1983. These are incorporated herein by reference in their entirety. The types of substitutions that can be made in the protein or peptide molecule of the present invention are the same species of different species, such as those shown in Tables 1-2 of Schultz et al. It can be based on an analysis of the frequency of amino acid substitutions between proteins. Based on such analysis, conservative substitutions are defined herein as exchanges within one of the next five groups.
1. Small aliphatic nonpolar or slightly polar residues: ala, ser, thr (pro, gly);
2. Polar and negatively charged residues and their amides: asp, asn, glu, gln;
3. Polar and positively charged residues: his, arg, lys;
4. Large aliphatic nonpolar residues: met, leu, ile, val (cys); and
5. Large aromatic residues: phe, tyr, trp.
Substantial changes in functional or immunological properties are made by selecting substitutions that are less conservative, such as substitutions between the five groups, rather than within the five groups described above. These substitutions can either (a) maintain the structure of the peptide backbone within the substitution zone, eg, a structure such as a sheet or helix conformation, (b) maintain the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) Their effect on maintaining the bulkiness of the side chains will be more significantly different. Examples of such substitutions are: (a) substitution of gly and / or pro with other amino acids or deletion or insertion of gly or pro; (b) hydrophilic residues, eg, hydrophobic residues of ser or thr, For example, substitutions for (or by) leu, ile, phe, val or ala; (c) substitutions for (or by) any other residue of cys residues; (d) electrically Substitution of a residue having a positive side chain, eg lys, arg or his, instead of (or by) an electrically negative charge, eg glu or asp; (e) a bulky side chain A substitution for (or by) a residue having, for example, phe, that does not have such a side chain, such as gly.
Most deletions and insertions and substitutions according to the present invention are those that do not cause fundamental changes in the properties of the protein or peptide molecule. However, if it is difficult to foresee the exact effect of doing so prior to making a substitution, deletion or insertion, one skilled in the art will recognize that the effect is a routine screening assay, ie, an immunological assay. It will be understood that it is evaluated by a method or a biological assay. For example, a mutein is typically site-directed mutagenesis of a nucleic acid encoding the peptide molecule, expression of the mutant nucleic acid in recombinant cell culture, and optionally, eg, in a column ( Made by purification from this cell culture by immunoaffinity chromatography using a specific antibody (to adsorb this mutein by binding to at least one epitope).
The activity of a cell lysate containing H13 or chimeric receptor polypeptide, or the activity of a purified sample of H13 or chimeric receptor can be screened by a screening assay suitable for the desired property. For example, changes in immunological properties, such as the binding of this protein molecule to a given antibody, can be measured by competitive immunoassays (as described herein). Biological activity is screened with an appropriate biological assay, such as viral infectivity, as described herein.
Changes in peptide properties such as redox or thermal stability, hydrophobicity, sensitivity to proteolysis or tendency to aggregate with carriers or multimers are assayed by methods well known to those skilled in the art.
Furthermore, since a modified amino acid or chemical derivative of an amino acid of a chimeric receptor polypeptide according to the present invention can be provided, the polypeptide contains additional chemical moieties or modified amino acids that are not normally part of the protein. Thus, within the scope of the present invention, covalent modifications of this peptide are included. Such modifications can be introduced into the polypeptide by reacting the target amino acid residue of the chimeric receptor polypeptide with an organic derivatizing agent capable of reacting with a selected side chain or terminal residue.
Derivatization with a bifunctional material is useful for crosslinking the peptide to a water insoluble support matrix or other polymeric carrier according to known methods. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters such as esters with 4-azidosalicylic acid, 3,3 Included are homobifunctional imide esters including disuccinic acid imidyl ester such as' -dithiobis (succinic acid imidyl propionate), and bifunctional maleimides such as bis-N-maleimide-1,8-octane. Derivatives such as methyl-3-[(p-azidophenyl) dithio] propioimidate produce photoactivatable intermediates that can form crosslinks in the presence of light. Also described in reactive water-insoluble matrices such as cyanogen bromide activated carbohydrates and US Pat. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; and 4,330,440, which are hereby incorporated by reference in their entirety. The prepared reactive substrate may be used for protein immobilization.
Other modifications of the chimeric receptor polypeptides of the invention include proline and lysine hydroxylation, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and α- Methylation of amino groups (Clayton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetylation of N-terminal amines, and in some cases the C-terminus Carboxyl group amidation may be included.
Such derivatized moieties can improve solubility, absorbability, biological half-life and the like. Such portions or modifications of the chimeric receptor polypeptide can, on the one hand, eliminate or attenuate undesirable side effects of the protein and the like. Portions that can mediate such action are disclosed, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).
Such chemical derivatives of chimeric receptor polypeptides are also resistant to enzymatic degradation for purification, antibody production or cloning; or desirable for therapeutic compositions comprising chimeric receptor polypeptides, antibodies thereto or fragments thereof. Alternatively, it can be attached to a solid support for altered physical properties such as increased binding affinity or modulation of the chimeric receptor polypeptide. Such peptide derivatives and methods for making such derivatives are known in the art.
An “isolated or recombinant H13 polypeptide” is a polypeptide having an amino acid sequence that substantially matches or consists essentially of at least a 10 amino acid portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. It refers to a polypeptide that binds to a retrovirus, such as the HIVenv binding domain. “Substantially match” the amino acid sequence of a chimeric receptor polypeptide or H13 protein means an amino acid in which at least one amino acid residue in the soluble portion of the protein molecule has been removed and a different residue inserted in its place. Refers to an array. Since the number of substitutions is relatively small, it is well characterized or conservative as described herein.
Make chimeric receptor polypeptide or H13 polypeptide Method
A preferred use of this invention is to make a single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides or fragments thereof by chemical synthesis or recombinant nucleic acid methods. In this case, these fragments are as small as possible, but still retain sufficiently high affinity for binding to non-human specific retroviruses or HIV. Preferred fragments of H13 include extracellular domain 3 as shown here.
Because of its function as a viral receptor, the extracellular fragment of H13 or chimeric receptor polypeptide of the present invention can bind to human or non-human specific viruses, respectively. By making smaller fragments of this peptide, one of ordinary skill in the art can use a known binding and inhibition assay to generate a sufficiently high affinity without undue experimentation based on the teachings and guidance provided herein. Would readily identify the smallest peptide that can bind to the binding domain of a virus or retrovirus and suppress infectivity. Short peptides are believed to have two advantages over large proteins: (1) greater stability and diffusivity, and (2) less immunogenicity.
As a non-limiting example, due to the presence of amino acid residues from the mouse ERR sequence, the mutant chimeric receptor polypeptides of the present invention can be expressed in human cells or other non-mouse cells that express this receptor. Provides the ability to be infected by non-human specific viruses such as mouse E-MuLV or HuLV. This non-human specific virus may be modified in order to reduce the possibility of back mutation to replication competent type.
By appropriate substitution of one or more amino acid residues of the viral receptor, the chimeric receptor polypeptide of the present invention can be obtained without undue experimentation based on the teachings and guidelines presented herein. .
The present invention is also intended to encompass the binding of the chimeric receptor polypeptide to any non-human ecotropic or amphotropic virus with similar receptor specificity, including retroviruses and adenoviruses such as MuLV or HuLV. ing.
Those skilled in the art will encode a viral receptor suitable for use in obtaining the chimeric receptor polypeptide of the present invention from any species or cell type, without undue experimentation, based on the teachings and guidance provided herein. It would be possible to determine how to obtain the nucleic acid. As a non-limiting example of such manipulation, first a cDNA library of the species or cell type of interest, eg, a human T cell cDNA library (using methods routinely practiced in the art). ) It will be screened with probes based on human viral receptor sequences such as H13. The hybridizing nucleic acid will then be cloned and sequenced to obtain the "new" retroviral receptor sequence. It is possible to identify regions where the sequence of the novel retroviral receptor protein differs from ERR or H13 by visual inspection or with a computer program (as described herein). In particular, the domain corresponding to the extracellular domain region 3 of H13 or a similar domain will be noted.
Based on the recognized sequence differences, the teachings presented here are used to create sequences with one or more amino acid substitutions that create a chimeric receptor between the new and known receptors Is possible. This chimeric receptor can then be expressed in select cells and its function easily tested using conventional virus binding assays or virus infectivity assays.
Furthermore, according to the present invention, the receptor attachment site of the virus is modified based on the knowledge of the receptor selection determinant in the outer membrane glycoprotein of a virus such as murine leukemia virus, and it becomes the original receptor. It is possible not to bind or to bind to different receptors. See, for example, Battini et al., J. Virology, 66 (3): 1468-1475 (1992).
For example, changing the sequence of the HIV-1 CD4-binding domain to block HIV-1 binding will render the virus non-infectious to CD4 bearing cells. Corresponding changes can be introduced into H13, and this mutant HIV will bind to it. In this way, a safe HIV sample can be generated that binds only to select cells carrying the appropriate mutant receptor, but does not bind to the normal target of HIV-1.
It is also within the scope of the present invention to express two or more intact or mutant viral receptor polypeptides on the same cell surface. Thus, with a first expressed chimeric receptor polypeptide, eg, ERR, human cells can be transiently infected in vitro with one virus strain and manipulated by appropriate use of cytokine growth or differentiation factors be able to. Such cells may be introduced into the recipient. At a desired time, a second virus that binds to the second expressed chimeric receptor polypeptide can be introduced into the individual to stably infect and change only those transduced cells that carry the second retroviral receptor. .
An oligonucleotide corresponding to a portion of the H13 sequence (SEQ ID NO: 2) is useful for screening for the presence of homologous genes and cloning of such genes. Techniques for synthesizing such oligonucleotides include, for example, Wu, R. et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol., 21: 101-141 (1978); Literature: Belagaje, R. et al., J. Biol. Chem., 254: 5765-5780 (1979); Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, edited by Nierlich, DP et al., Acad Press, NY (1976) ) Maniatis, T. et al .; Woo et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol., 21: 101-141 (1978); Khorana, RG, Science, 203: 614-625 (1979). Furthermore, DNA synthesis can be performed using an automatic synthesizer. Techniques for DNA hybridization are disclosed by Sambrook et al., Supra and Haymes, B.D. et al. (Report in DNA Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)). These documents are incorporated herein by reference. Techniques such as those described above or techniques similar thereto include human aldehyde dehydrogenase (Hsu, LC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3771-3775 (1985)), fibronectin (Suzuki et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J., 4: 2519-2524 (1985)), human estrogen receptor gene (Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7889- 7893 (1985)), tissue-type plasminogen activator (Pennica, D., et al., Nature, 301: 214-221 (1983)) and human birth schedule placental alkaline phosphatase (complementary DNA (cam ( Kam, W.) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8715-8719 (1985).
In another method of cloning the H13 gene, receptor mutant or equivalent thereof, DNA (from a cell capable of expressing H13, receptor mutant or equivalent) or more preferably cDNA An expression vector library is prepared by cloning into a vector. The library is then bound to an anti-H13, anti-mutant or anti-equivalent antibody and a polypeptide having the same amino acid sequence as H13, a receptor mutant or its equivalent protein or peptide, or fragment thereof. Screen for members capable of expressing a protein having a nucleotide sequence that can be encoded.
In order to obtain a blunt or sticky end for ligation, a suitable end of a nucleic acid sequence encoding H13, a receptor mutant or equivalent thereof of the present invention, ie, a polypeptide or protein, or a functional derivative thereof. Recombining with vector DNA according to conventional techniques, including restriction enzyme digestion, filling in sticky ends where appropriate, alkaline phosphatase treatment to avoid unwanted conjugation, and ligation with appropriate ligase, and appropriate host cells Can be expressed within. Such operating procedures are disclosed by Sambrook et al., Supra, and are well known in the art.
Proper expression in prokaryotes also requires the presence of a ribosome binding site upstream of the gene coding sequence. Such ribosome binding sites are disclosed, for example, by Gold, L. et al., Ann Rev. Microbiol., 35: 365-404 (1981).
Eukaryotic hosts include yeast, insect, fungi, and mammalian cells, either in vivo or in tissue culture. In mammalian cells, protein molecules are subjected to post-translational modifications that include correct folding or glycosylation at the correct site. Mammalian cells that may be useful as hosts include cells of fibroblast origin such as VERO or CHO or cells of lymphocyte origin such as hybridoma SP2 / O-Ag14 or mouse melanoma P3-X63Ag8, and derivatives thereof. It is. Preferred mammalian cells are those intended to replace the function of genetically defective cells in vivo. Bone marrow stem cells are preferred for gene therapy of hematopoiesis or immune system disorders.
For mammalian cell hosts, many possible vector systems are available for expression of a single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides. A wide variety of transcriptional and translational regulatory sequences can be used, depending on the nature of the host. These transcriptional and translational control signals can be derived from viral sources such as adenovirus, bovine papilloma virus, simian virus or the like. In this case, the regulatory signal relates to a specific gene with a high level of expression. In addition, promoters from mammalian expression products such as actin, collagen, and myosin promote protein production. When using live insects, moth larvae and baculovirus vectors are currently preferred hosts for producing large-scale single chimeric receptor polypeptides or multiple chimeric receptor polypeptides according to the present invention. See, for example, the following document by Ausberg and the above document by Sambrook.
If desired, the expressed single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides can be isolated and isolated according to conventional conditions such as extraction, precipitation, chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, or the like. It may be purified. For example, the cells are harvested by centrifugation or with a suitable buffer, lysed and, for example, by column chromatography with DEAE-cellulose, phosphocellulose, polyribocytidylic acid-agarose, hydroxyapatite or by electrophoresis or immunoprecipitation Proteins can be isolated by phenation. Alternatively, chimeric receptor proteins can be isolated by using specific antibodies such as anti-receptor polypeptide antibodies that still react with proteins containing ERR-derived amino acid substitutions. Such antibodies can be obtained by well-known methods.
Further, the genetic constructs of the invention can be engineered to transplant specific viral binding domains onto the transmembrane and cytoplasmic portions of a single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides, or another A single chimeric receptor polypeptide or a retroviral receptor binding domain of multiple chimeric receptor polypeptides can be grafted onto the transmembrane and intracytoplasmic portions of the molecule, resulting in yet another type of chimeric molecule.
Preparation of chimeric receptor cells or tissues
The present invention also relates to a method of providing human or other eukaryotic cells or tissues that are susceptible to binding by a given non-human viral env binding domain, such as a retroviral infection.
The method optionally involves first transforming a eukaryotic cell or tissue with an expressible nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide, in vitro, in vivo or in situ, to produce a cell of a nonspecific virus. Generating a recombinant chimeric receptor cell or tissue capable of expressing a chimeric receptor polypeptide capable of binding to the outer viral env binding domain.
Standard literature describing the general principles of recombinant DNA methods include Watson, JD et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, The Benjamin / Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo. Park, CA (1987); Darnell, JE et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., publisher, New York, NY (1986); Lewin, BM, Genes II, John Wiley & Sons , publisher, New York, NY (1985); Old, RW, et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, NY, (1987, 1993). These documents are hereby incorporated by reference in their entirety.
In such methods, it is preferred to perform in vivo transformation with one selected from the following: injection of mutant nucleic acids into tissues or cells by known methods; tissues or cells Retroviral infection with a recombinant retrovirus comprising a mutated nucleic acid under the control of at least one tissue-specific regulatory sequence specific for; liposome delivery of the mutated nucleic acid to the tissue or cell; Antibody delivery of mutant nucleic acids; or contact of cells or tissue specific antibodies conjugated to mutant nucleic acids with tissues or cells.
In such methods, it is preferred to perform in situ or in vitro transformation with one selected from the following: injection of mutant nucleic acids into tissues or cells by known methods; Retroviral infection with recombinant retroviruses containing the mutant nucleic acid in an expressible form; liposome delivery of the mutant nucleic acid; antibody delivery of the mutant nucleic acid; tissue or cell transfection with the mutant nucleic acid; Or contact of a cell or tissue specific antibody conjugated to a mutant nucleic acid with a tissue or cell. More preferably, the virus is a recombinant mouse ecotropic or hamster amphotropic retrovirus and the chimeric receptor polypeptide is a chimeric receptor polypeptide as shown herein.
The chimeric receptor polypeptides of the invention can be expressed on the cell surface as an integral membrane protein in several cell types, particularly cells of the T lymphocyte and monocyte / macrophage lineage. This is consistent with the in vitro tropism of known human retroviruses such as HIV-1 and HTLV-1. Thus, the chimeric receptor polypeptides of the present invention will cause these lineage cells in humans that are normally resistant to non-human specific viral infections to be infected with such viruses.
A major advantage of transforming non-mouse cells with the chimeric receptor polypeptide substituted receptor of the present invention over that performed with the ERR protein is a significant reduction in immunogenicity.
In other aspects, the invention encompasses modified chimeric receptor cells or tissues made by the methods described herein. In this case, the eukaryotic cell or tissue is selected from, but not limited to, mammalian, insect, avian or yeast origin. Preferably the mammalian cell or tissue is of human, primate, hamster, rabbit, rodent, bovine, porcine, sheep, horse, goat, dog or cat origin, but any other mammalian cell is used. be able to.
Transgenic and chimeric non-human mammals
The present invention provides a transgenic non-transgenic cell in which germ cells and somatic cells contain genomic DNA according to the present invention that encodes a single chimeric receptor polypeptide or a plurality of chimeric receptor polypeptides that can serve as human retroviral receptors. It is also directed to human eukaryotes (preferably rodents such as mice). A single chimeric receptor polypeptide or a plurality of chimeric receptor polypeptide nucleic acids is introduced into the animal to be transgenic or its ancestors, in the embryogenesis phase, preferably in the single cell phase, or in the fertilized oocyte phase. In general, it is introduced at a time not later than about the 8-cell stage. As used herein, the term “transgene” refers to a gene that is integrated into and expressed in the genome of an animal and causes the protein to be present in the transgenic animal.
There are several means that can be introduced into the genome of an animal fetus in order to incorporate and express such genes in the chromosome according to known methods.
Less than all somatic and germ cells, such as animals produced when less than all morulae cells are transfected during the production process of the transgenic mammal, are chimeric receptor polypeptides or Chimeric non-human mammals containing chimeric receptor polypeptide nucleic acids are also intended to be within the scope of the present invention.
Chimeric non-human mammals having transplanted human cells or tissues in their bodies are also encompassed by the present invention. The mammal can be used to test the expression of a chimeric receptor polypeptide in human tissue and / or a therapeutic and / or diagnostic with a delivery vector that preferentially binds to the chimeric receptor polypeptide of the invention. It can be used to test the effectiveness of a drug. Methods for obtaining chimeric non-human mammals are described, for example, in U.S. patent applications 07 / 508,225, 07 / 518,748, 07 / 529,217, 07 / 562,746, 07 / 596,518, 07 / 574,748, 07 / 575,962, 07 / 207,273, 07 / 241,590 and 07 / 137,173. It should be noted that the description of how to transplant human cells or tissues into the body of a non-human mammal is hereby incorporated by reference in its entirety.
The technique described in US Pat. No. 4,736,866 to Leder for the production of transgenic non-human mammals, which is hereby incorporated by reference in its entirety, can be applied to the transgenic non-human mammals of the present invention. It may be used for creation. Various techniques described in Palmiter, R. et al., Ann Rev. Genet., 20: 465-99 (1986) can also be used. It should be noted that this entire content is incorporated herein by reference.
A single chimeric receptor polypeptide to test compounds or other therapies that can prevent, suppress or cure human retroviral infections or diseases resulting from such infections for those retroviruses that infect cells Alternatively, an animal carrying a chimeric receptor polypeptide or a chimeric receptor polypeptide gene can be used using a plurality of chimeric receptor polypeptides as receptors. These tests can be very sensitive because the dose of virus given to the transgenic animals of this invention can be adjusted. Such animals will also serve as models for testing diagnostic methods for the same human retroviral disease. Such diseases include, but are not limited to, AIDS, HTLV-induced leukemia, and the like. The transgenic animals according to the present invention can also be used as a source of cells for cell culture.
The transgenic animal model of the present invention is a “SCID mouse” model (McCune) that requires a significant amount of time and experimentation due to the need to repopulate each individual mouse with appropriate cells of the human immune system. JM) et al., Science, 241: 1632-1639 (1988)).
Chimeric receptor or H13 specific antibody and method
The invention is also directed to antibodies specific for a single chimeric receptor polypeptide or epitopes of multiple chimeric receptor polypeptides. In a further aspect, the antibody of the invention is a single chimeric receptor polypeptide or a plurality of chimeric receptors in a cell or in a cell or tissue extract or in a body fluid to prevent or treat retroviral infection. It is used to detect the presence of a body polypeptide or to measure its amount or concentration. See generally the above-mentioned references by Coligan and the following references by Harlow.
The term “antibody” refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies, anti-idiotype (anti-Id) antibodies, and fragments thereof given by any known method such as hybridomas, recombinant methods or chemical synthesis. including.
An antibody is said to be able to “bind” with a molecule if it specifically reacts with that molecule, thereby binding the molecule to the antibody. The term “epitope” refers to any portion of a molecule that can be bound by and recognized by an antibody. Epitopes or “antigenic determinants” usually consist of chemically active surface groupings of molecules such as amino acids or sugar side chains and have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics.
An “antigen” is a molecule or portion of a molecule that can be bound by an antibody and can further induce an animal to produce an antibody that can bind to an epitope of that antigen. An antigen can have one or more epitopes. The specific reactions mentioned above are also intended to show that an antigen reacts with its corresponding antibody with high selectivity, but does not react with many other antibodies that can be evoked by other antigens. .
Polyclonal antibodies are a heterogeneous population of antibody molecules derived from the sera of animals immunized with an antigen.
Monoclonal antibodies are a substantially homogeneous population of antibodies to a specific antigen. MAbs can be obtained by methods known to those skilled in the art. See, for example, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975) and US Pat. No. 4,376,110. Also, for example, edited by Ausberg et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, (1987, 1992); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). See Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, (1992, 1993). Such antibodies may be of any immunoglobulin class including IgG, IgM, IgE, IgA, and any subclass thereof. The hybridoma producing the mAb of this invention can be cultured both in vitro and in vivo. The production of high titer mAbs for in vivo production makes this the currently preferred production method. Briefly, cells from individual hybridomas are injected intraperitoneally into pristane sensitized Balb / c mice to produce ascites containing high concentrations of the desired mAb. Isotype IgM or IgG mAbs can be purified from such ascites fluid or from culture supernatants using column chromatography methods well known to those skilled in the art.
A chimeric antibody is a molecule in which different portions are derived from different animal species, such as those having a variable region derived from a murine mAb and a human immunoglobulin constant region. Chimeric antibodies and methods for their production are known in the art (eg, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 314: 268-270 (1985); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 214-218 (1987); Better et al., Science, 240: 1041-1043 ( 1988); see Better, MD International Patent Publication No. WO9107494, which is incorporated herein by reference in its entirety).
An anti-idiotype (anti-Id) antibody is an antibody that recognizes unique determinants that are widely associated with the antigen binding site of an antibody. Id antibodies can be prepared by immunizing an animal of the same species and genotype (eg, mouse strain) as the source of mAb with a mAb to which anti-Id is to be prepared. Immunized animals will respond by recognizing the idiotypic determinants of the immunizing antibody and producing antibodies against these idiotypic determinants (anti-Id antibodies).
Anti-Id antibodies can be used as “immunogens” to further induce immune responses in other animals to produce so-called anti-anti-Id antibodies. This anti-anti-Id antibody may have structural similarity to the original mAb that induced the anti-Id. Thus, by using antibodies against the idiotypic determinants of mAbs, it is possible to identify other clones that express antibodies with the same specificity.
Thus, mAbs generated against a single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides of the invention can be used to elicit anti-Id antibodies in an appropriate animal such as a Balb / c mouse. . Spleen cells from such immunized mice are used to produce anti-Id hybridomas that secrete anti-Id mAbs. In addition, this anti-Id mAb can be coupled to a carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) and used to immunize additional Balb / c mice. Sera from these mice will contain an anti-anti-Id antibody having the binding properties of the original mAb specific for the chimeric receptor polypeptide or chimeric receptor polypeptide epitope.
Thus, anti-Id mAbs have their own idiotype epitopes or “idiotypes” that are structurally similar to the epitope being assessed, such as a single chimeric receptor polypeptide or an epitope of multiple chimeric receptor polypeptides.
The term “antibody” as indicated above refers to intact molecules as well as Fab and F (ab ′)₂It is intended to include both fragments thereof capable of binding to an antigen such as Fab and F (ab ')₂The fragment lacks the Fc fragment of the intact antibody, can disappear from the circulatory system more rapidly than the intact antibody, and can have less non-specific tissue binding than the intact antibody (Wahl et al., J. Biol. Nucl. Med., 24: 316-325 (1983)).
Antibody diagnostic assays
Antibodies Fab and F (ab ′) useful for the present invention₂It will be appreciated that and other fragments can be used for the detection and quantification of a single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides according to the methods disclosed herein for intact antibody molecules. Such fragments are typically papain (which produces Fab fragments) or pepsin (F (ab ′)₂Produced by proteolysis using an enzyme such as
The antibodies, or antibody fragments, of the present invention quantitatively or qualitatively detect the presence of a single chimeric receptor polypeptide or cells expressing multiple chimeric receptor polypeptides on their surface or in cells. Can be used. This can be done by immunofluorescence using a fluorescently labeled antibody (see below) coupled with light microscopy, flow cytometry, or fluorometric detection.
For in situ detection of a single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides, the antibodies of the invention may be used in histology as in immunofluorescence or immunoelectron microscopy. By using such an operation, it is possible to measure not only the presence of a single chimeric receptor polypeptide or a plurality of chimeric receptor polypeptides, but also its distribution on the test tissue.
Further, soluble single chimeric receptors in biological samples can be obtained using the antibodies of the present invention, such as a means of tracking the presence and amount of a single chimeric receptor polypeptide or a plurality of chimeric receptor polypeptides used in therapy. The presence of the polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides can be detected.
Such immunoassays for a single chimeric receptor polypeptide or multiple chimeric receptor polypeptides typically involve body fluids, tissue extracts, cells such as freshly harvested lymphocytes or leukocytes, or tissue culture media. Incubate a biological sample, such as cells incubated in, in the presence of a detectably labeled antibody capable of identifying the H13 protein and detect the antibody by any of several techniques well known in the art Including doing.
Treating a biological sample with a solid support or carrier such as nitrocellulose (the terms are used interchangeably herein) or other solid support capable of immunizing cells, cell particles or soluble proteins. Can do. The support is then washed with a suitable buffer and then treated with an antibody specific for a single chimeric receptor polypeptide or an antibody specific for multiple chimeric receptor polypeptides labeled for detection. it can. The solid support can then be washed twice with buffer to remove unbound antibody. The amount of label bound on the solid support can then be detected by conventional means.
By “solid support” or “carrier” is intended any support capable of binding to an antigen or antibody. Well known supports or carriers include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amylase, natural and modified cellulose, polyacrylamide, gabbro, and magnetite.
The binding activity of a given lot of anti-chimeric receptor polypeptide or anti-chimeric receptor polypeptide antibody can be measured according to well-known methods. One skilled in the art will be able to measure under optimal and optimal assay conditions for each measurement by using routine experimentation.
One method by which an antibody specific for a single chimeric receptor polypeptide or an antibody specific for multiple chimeric receptor polypeptides can be labeled is detected by linking it to an enzyme and enzyme immunization by known methods. It is a method by using it for the test method (EIA).
Detection was entitled “An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques” by Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work et al., North Holland Publishing Company, New York (1978), especially T. Chard. It can be performed using any of a variety of other immunoassays, such as for chapters. The above document is incorporated herein by reference in its entirety.
It is also possible to label this antibody with a fluorescent compound.
This antibody¹⁵²It can also be labeled for detection using a fluorescent emitting metal such as Eu or others of the lanthanum series. These metals can be bound to the antibody using metal chelating groups such as diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
The antibody can also be labeled for detection by coupling to a chemiluminescent compound. The presence of this chemiluminescent labeled antibody is then measured by detecting the presence of luminescence that occurs during the chemical reaction. Examples of particularly useful chemiluminescent labeling compounds are luminol, isoluminol, theromatic acridinium ester, imidazole, acridinium salt and oxalate ester.
Similarly, the antibody of the present invention may be labeled using a bioluminescent compound. Bioluminescence is a type of chemiluminescence found in biological systems where catalytic proteins increase the efficiency of chemiluminescent reactions. The presence of the bioluminescent protein is measured by detecting the presence of luminescence. Important bioluminescent compounds for labeling are luciferin, luciferase and aequorin.
The antibody molecules of the present invention can be adapted for use in immunoassays, also known as “two site” or “sandwich” assays.
A typical and preferred immunoassay involves first contacting an antibody bound to a solid phase with a sample to be tested and “extracting” the antigen from the sample by forming a two-component solid phase antibody-antigen complex. A “forward” test is included. After an appropriate period of incubation, the solid support is washed to remove any residual liquid sample containing unreacted antigen, if any, and then an unknown amount of labeled antibody (which functions as a “receptor molecule”). In contact with a solution containing After the second incubation for the time that the labeled antibody can be complexed with the antigen bound to the solid support via the unlabeled antibody, the solid support is washed twice to remove the unreacted labeled antibody.
Another type of “sandwich” assay that is also useful with the antigens of the invention employs so-called “simultaneous” and “reverse” assays. A simultaneous assay involves a single incubation step in which both antibody bound to a solid support and labeled antibody are added simultaneously to the sample to be tested. After incubation is complete, the solid support is washed to remove liquid sample residues and uncomplexed labeled antibody. The presence of labeled antibody bound to the solid support is then measured as in a conventional “forward” sandwich assay.
In the “reverse” assay, a labeled antibody solution is first added stepwise to a liquid sample, followed by incubation for an appropriate time, followed by addition of unlabeled antibody bound to a solid support. After the second incubation, the solid phase is washed in a conventional manner to remove sample residues and unreacted labeled antibody solution to be tested. Measurement of labeled antibody bound to the solid support is then performed as in the “simultaneous” and “forward” assays.
Chimeric receptor and / or H13 polypeptide and / or key Methods of treatment and diagnosis involving melanocytes or tissues
A therapeutic method is also provided by the present invention. The method comprises a tissue or cell having at least one expressible nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide that recognizes only cells that express the chimeric receptor polypeptide or have it bound on its surface. Subject to infection by a replacement non-human specific retroviral vector, the retroviral vector being backmutated, mutated or recombinant for the non-human specificity of the vector and to provide replication competence Due to the relatively lack of capacity, other human cells cannot be infected. According to the present invention, the chimeric receptor polypeptide can be selectively associated with or expressed on the target cell by infection with a recombinant retrovirus having a nucleic acid encoding the chimeric receptor polypeptide. . This temporary and / or permanent association is a target cell, such as a pathological cell with a particular receptor, as well as the progeny of such pathological cell when the constitutive chimeric receptor polypeptide is expressed, As a result of selectively exposing or selectively expressing the chimeric receptor polypeptide, specific delivery of the therapeutic agent to such target cells and / or their progeny is possible in accordance with the present invention.
Thus, according to the present invention, a chimeric receptor polypeptide is temporarily or permanently associated with a target cell specific cell surface molecule, such as a cell surface receptor, and then binds to the chimeric receptor polypeptide to infect a target cell. Methods are provided for marking specific types of target cells (optionally with recombinants, chromosomal expression of chimeric receptor polypeptides, their progeny) by administering a recombinant retrovirus. Infectious viral vectors may carry any of a variety of therapeutic nucleic acids or therapeutic genes that confer one or more functions.
In one non-limiting example, the chimeric receptor polypeptide is specifically directed to a target cell of the first species by association with a target cell specific vector such as an antibody, liposome or target cell specific receptor ligand. Carry. A viral receptor binding or env domain specific for a species other than the first species that allows the chimeric receptor polypeptide to associate with the target cell for a sufficient amount of time to bind to the chimeric receptor polypeptide. Treatment or diagnosis using a therapeutic or diagnostic agent associated with the Thus, a therapeutic or diagnostic agent, such as a therapeutic or diagnostic nucleic acid, is preferentially delivered to the target cell, eg, if the nucleic acid is integrated into the chromosome of the target cell, non-target cells are eliminated.
As another non-limiting example, a viral vector may carry a modified retroviral receptor gene into a cell. When the target cell is infected, the target cell becomes integral with the DNA encoding the chimeric receptor polypeptide. Thus, subsequently, the target and the cell and all progeny will express the chimeric receptor polypeptide on the surface of the target cell. By marking such target cells and their progeny with chimeric receptor polypeptides according to the present invention, gene therapy can be used to treat animal subjects suffering from disease. In this case, the gene therapy vector specifically binds to the chimeric receptor polypeptide and carries the therapeutic or diagnostic agent to the target cell. With such a method of the invention, certain diseases can be treated with substantially no or reduced risk of non-specific retroviral vector infection and gene insertion into the chromosome.
In accordance with the present invention, a nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide is conjugated to a sequence encoding a polypeptide that specifically binds to a receptor specific for a particular type of target cell. Expression of such a nucleic acid in a recombinant host provides a recoverable amount of fusion protein suitable for therapeutic administration. This pharmaceutically acceptable fusion protein can then be administered to the sick subject. The fusion protein will then specifically bind to the target cell and will act as the env binding domain of the non-human specific virus according to the invention. Subsequent administration of a non-human specific virus having a nucleic acid encoding any of a variety of genes can confer one or more functions to the infected cell, resulting in a positive or negative therapeutic effect on the cell. Will.
As a further non-limiting example, a human tumor can be treated using the chimeric receptor polypeptide as a fusion protein to an antibody fragment of an antibody specific for a human tumor cell surface receptor. Such fusion proteins in a pharmaceutically acceptable form are administered to an animal model or human subject to mark tumor cells for infection by a non-human specific retrovirus having DNA encoding a chimeric receptor polypeptide. . When this fusion protein binds to the tumor cell as the target cell, the second step consists of administration of this retrovirus, and when infected with the tumor cell, the subsall of the infected tumor cell and their progeny Results in expression of the chimeric receptor polypeptide. When tumor cells constitutively express the chimeric receptor polypeptide, gene therapy can be safely used to deliver therapeutic agents to tumor cells as target cells without substantially infecting non-target cells . However, it is not necessary for the cell to express the receptor through the second stage. In fact, the second stage may be omitted entirely as determined by those skilled in the art.
As a non-limiting secondary example, B3 antibody fragments specific for human tumor cells can be used to provide fusion proteins and gene therapy. In this case, the specific pathological cell-specific antibody or binding protein is first expressed as a fusion protein and (a) by a non-human specific virus that binds to the pathological cell and has a nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide. As a result of enabling in vitro and in vivo infection, a chimeric receptor polypeptide is expressed on the surface of the virus-infected diseased cell, and (b) env binding as a delivery vector that binds to the chimeric receptor polypeptide At least one therapeutic agent associated with the domain kills the virus-infected target cell in vitro and in vivo. Preferably, animal model systems may be used prior to human clinical treatment according to known methods.
Selective introduction of a nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide into an animal or human cell or tissue to be infected by a recombinant non-human specific virus such as ecotropic or amphotropic virus is a known method. Can be done according to. Non-limiting examples include bone marrow cells (such as stem cells or stromal cells), white blood cells, and differentiated or undifferentiated granulocytes, monocytes, macrophages, lymphocytes, erythrocytes, megakaryocytes, central nervous system Cells, and tissue cells such as neural tissue, hepatocytes, kidney cells, muscle cells, heart cells or cardiomyocytes, arterial or venous cells or tissues, ocular cells, connective tissues or cells, lung tissues or cells, spleen cells or tissues In vitro transformation of a human cell or tissue, such as an endocrine tissue or cell, CSF, or a cell of the central nervous system, with a nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide, followed by reintroduction into a human subject; or chimera Nucleic acid encoding a receptor polypeptide into a tissue such as muscle, heart, liver, kidney, brain, nerve, spleen, pancreas, testis, ovary, pituitary gland, hypothalamus, gallbladder, eye, lung, or bone marrow In vivo or i Includes direct injection in situ.
Thus, in one aspect of the invention, a method is provided for transferring at least one therapeutic or diagnostic agent to a chimeric receptor-bearing cell or tissue. The method comprises obtaining a chimeric receptor cell or tissue according to the invention and in vitro the chimeric receptor cell or tissue with a delivery vector comprising an env binding domain of a non-human virus and at least one therapeutic or diagnostic agent. , Contacting in vivo or in situ. As a result, the delivery vector binds to the chimeric modified cell and the therapeutic or diagnostic agent provides a therapeutic or diagnostic effect on the chimeric receptor cell.
The therapeutic or diagnostic agent is specific for the chimeric receptor of the chimeric receptor polypeptide expressed extracellularly on the chimeric receptor cell or target cell as a tissue according to the method of the invention. It is selectively delivered by delivery vectors containing the env binding domain of certain viral outer membrane proteins.
Vector
The delivery vector may be a viral vector, a liposome, or a complex of env binding domains associated with a diagnostic or therapeutic agent.
The delivery vector may further comprise any diagnostic or therapeutic agent that provides a therapeutic or diagnostic effect on the chimeric receptor cells as target cells of the delivery vector.
Diagnostic or therapeutic agent
Diagnostic or therapeutic agents are nucleic acids, compounds, proteins, elements, lipids, antibodies, saccharides, isotopes, carbohydrates, imaging agents, lipoproteins, glycoproteins, enzymes, detectable probes, and antibodies or fragments thereof, or thereof Although it may be at least one selected from these combinations, it is not limited to these. The antibody can be labeled so that it can be detected as described herein. Such labels include, but are not limited to, enzyme labels, radioisotopes or radioactive compounds or elements, fluorescent compounds or metals, chemiluminescent compounds and bioluminescent compounds. Also, any other known diagnostic or therapeutic agent can be used in the method of the present invention.
Target cells for therapeutic drugs
The therapeutic agent used in the present invention can have a therapeutic effect on a target cell as a chimeric receptor cell, and the effect is correction of a defective gene or protein, drug action, toxic effect, growth stimulating effect, growth inhibitory effect. Metabolic effect, catabolic effect, anabolic effect, antiviral effect, antibacterial effect, hormone effect, neurohumoral effect, cell differentiation stimulating effect, cell differentiation inhibiting effect, neuromodulating effect, anti-neoplastic effect, antitumor effect, insulin stimulation Or suppressive effect, bone marrow stimulating effect, pluripotent stem cell stimulating effect, immune system stimulating effect, and any other known therapeutic effect that can be provided by the therapeutic agent delivered to the chimeric receptor cell via the delivery vector according to the present invention However, it is not limited to these.
Nucleic acids for treatment
A therapeutic nucleic acid as a therapeutic agent can have, but is not limited to, at least one of the following therapeutic effects on a chimeric receptor cell: inhibiting transcription of a DNA sequence; translating an RNA sequence Inhibiting; inhibiting reverse transcription of RNA or DNA sequences; inhibiting post-translational modification of proteins; inducing transcription of DNA sequences; inducing translation of RNA sequences; reversing RNA or DNA sequences Inducing post-translational modifications of proteins; transcription of nucleic acids such as RNA; translation of nucleic acids such as proteins or enzymes; and chimeras for constitutive or transient expression of therapeutic nucleic acids Nucleic acid integration into the chromosome of the receptor cell.
Therapeutic effect
Such therapeutic effects include deletion of defective genes such as antisense ANA or DNA or processing of their expression; suppression of viral replication or synthesis; gene therapy such as expression of heterologous nucleic acids encoding therapeutic proteins or correction of defective proteins; Modification of deficient or underexpressed RNA such as hnRNA, mRNA, tRNA, or rRNA; generation of drugs or prodrugs, or compounds as drugs or prodrugs in diseased or normal cells that express chimeric receptors A thymidine kinase varicella-zoster virus thymidine kinase (VZV TK) (see, eg, Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8039-8042 (1992)). The entire content of which is incorporated by reference, including references cited therein) in a pathological cell such as a neoplastic cell, Cal pathological cells directly or indirectly to kill; may include, and any other known therapeutic effect, but is not limited thereto. Thus, the mutant nucleic acid as described above can be used for gene therapy.
The therapeutic nucleic acids of the present invention that encode any known toxin, prodrug or drug gene for delivery to pathological cells or provide a therapeutic effect are specific for pathological cells such as neoplastic cells. Specific transcription regulatory sequences (TRS) (including alpha-fetal protein TRS or liver-associated albumin TRS) (see, eg, Dynan and Tjian, Nature (London) 316: 774-778 (1985)) The gene can also be included under the control of Such TRS will further limit the expression of cell killing toxins, drugs or prodrugs in target cells such as cancer cells expressing the chimeric receptor polypeptides of the invention.
A further example of a therapeutic nucleic acid of the invention that is delivered and expressed in a chimeric receptor cell is a therapeutic that encodes a thymidine kinase that selectively kills eukaryotic dividing cells such as brain tumor cells. It is a nucleic acid. The brain cells surrounding this tumor cell are not dividing. Thus, recombinant ecotropic encoding thymidine kinase after injecting into the brain cells a nucleic acid of the invention encoding a chimeric receptor polypeptide, or transfecting brain cells with the nucleic acid or in vivo viral vector transformation. Treatment of the chimeric receptor brain tumor cells with retrovirus will selectively kill the brain tumor cells by expression of thymidine kinase. See, for example, F. Anderson et al., Science, June, 1992.
Also, an abnormal H13 molecule that causes a high morbidity for the disease was injected by injecting a desired lineage of cells (eg, hematopoietic stem cells) transfected with a chimeric receptor polypeptide such as a mutant H13 protein. Replacement may be under conditions such that the cells preferentially replace the endogenous cell population.
In the method of the present invention, the delivery vector is preferably a recombinant non-human specific virus. Then, binding of the non-human specific virus to the chimeric receptor cell or tissue results in infection of the modified receptor cell and the therapeutic effect of the therapeutic nucleic acid in the chimeric receptor cell. In other preferred embodiments, the fusion vector comprises a non-human specific env binding domain comprising a non-human specific env binding domain wherein the delivery vector is linked to a therapeutic or diagnostic agent by a linker, the binding or contacting of which provides the desired therapeutic or diagnostic effect. It includes a protein or a nucleic acid that encodes it. In still other preferred embodiments, the delivery vector may further comprise a liposome containing an env binding domain and a therapeutic agent. The env binding domain can then bind to the chimeric receptor binding site of the chimeric receptor cell.
In other preferred embodiments, contacting the delivery vector with a chimeric receptor cell or tissue can result in a chimeric receptor cell or tissue that expresses a therapeutically effective amount of the expression product of the therapeutic nucleic acid.
In other preferred embodiments, the therapeutic nucleic acid encodes a toxin that acts to selectively kill the chimeric receptor-containing cells or tissues. The pathological cell may be a cancer cell. In other embodiments, the therapeutic nucleic acid is selected from epidermal growth factor, interleukin-2, interleukin-4, interleukin-6, tissue growth factor-α, insulin growth factor-1, or fibroblast growth factor. The growth factor may be further encoded.
The toxin may be purified or a recombinant toxin or selected from at least one of, for example, ricin, Pseudomonas detoxin, diphtheria toxin, endotoxin, venom toxin, and the like. It may be a toxin fragment comprising at least one functional cytotoxic domain of the toxin.
The therapeutic nucleic acid may encode at least one member selected from single chain ribosome inhibitory proteins that act to block the expression of aberrant proteins in chimeric receptor cells or tissues; cytokines; or growth factors .
According to another aspect of the present invention, a delivery vector having an env binding domain or antibody or fragment thereof, which preferentially binds cytotoxic or chemotherapeutic substances to pathological cells as target chimeric receptor cells or It may be bound directly to a growth factor. Targets for this type of therapy may be growth factor receptors, differentiation antigens, or other less well-characterized cell surface antigens specifically associated with other pathological cells. Today, many cancers have been found to overproduce growth factor receptors that can function as oncogenes or promote cancer cell growth in an autocrine manner (Pastane and Fitzgerald, 1991; Bell, et al., 1987; Kawano et al., 1988; Hellsttom & Healthtrom, 1989). For example, epidermal growth factor receptor is abundant in many squamous cell and epidermoid carcinomas, glioblastomas, and some metastatic ovarian and bladder cancers (3 × 10 6 per cell)⁶(To the receptor) (Hender et al., 1984; Jones et al., 1990; Lau et al., 1988). In contrast, normal cells can only contain lower amounts per cell (Dunn et al., 1986). In another example, interleukin-2 (IL-2) receptors are present in a greater number on the cells of adult T-cell leukemia patients than on normal T cells (ATL; 3 × 10 6 per cell)^FourReceptor).
Other differentiation antigens present on normal cells such as B lymphocytes are often also present on tumor cells such as B cell lymphomas. Since such antigens are not present on stem cells that produce B cells, any mature B cells killed by targeted therapy will be replaced from the stem cell population, while cancer cells will not be replaced ( Getty (Ghetie et al., 1988). Finally, there are antigens that are preferentially expressed on cancer cells whose function is not yet known. Some of these, such as carcinoembryonic antigen (CEA) (Muraro et al., 1985) are fetal antigens, either absent or present in small amounts on normal adult tissue It is. This group also contains antigens of unknown origin that are only defined by their reactivity with monoclonal antibodies (Fraenkel et al., 1985; Varki et al., 1984; Willingham et al., 1987).
Single chain antigen binding proteins that can be used as components of the therapeutic or diagnostic delivery vectors of the present invention have numerous advantages in clinical applications due to their small size. These proteins are removed from serum faster than monoclonal antibodies or Fab fragments. Because they lack the Fc portion of antibodies recognized by cellular receptors, they have a low background when applied to imaging and are less immunogenic. They are thought to penetrate the microcirculation surrounding solid tumors better than monoclonal antibodies.
In such therapeutic delivery vectors, the therapeutic agent is a toxin or toxin fragment or domain and is at least a toxin selected from at least one of ricin, Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin, thymidine kinase, and the like. Such as a purified or recombinant toxin or toxin fragment containing one functional cytotoxic domain. For example, the use of recombinant toxins for cancer treatment is known in the art (eg, Pastan and Fitzgerald Scinece, November 22,1991, pp. 1173-1177, and references cited therein, these references Are hereby incorporated by reference in their entirety).
Obtaining safer vectors for in vivo gene therapy
It is provided by the present invention to use three different means that can be used to increase the safety limits of in vivo gene therapy treatment. These means are: (a) the use of different packaging cell lines; (b) the use of ecotropic-based vectors rather than amphotropic; and (c) the target of the desired retroviral vector in vivo. It is to provide a way to set a group.
(A)Use of different packaging cell lines
background:
The safety concerns of repelling vectors based on amphotropic viruses have provided a motivation to find new systems for the production of high-titer ecotropic retroviral vectors. This strategy relies on the fact that human cells cannot be infected by hamster leukemia virus (Stenback et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 122: 1219-1223, 1966). The hamster leukemia virus has been reported to infect only hamster cells since attempts to infect mouse, rat, cat, monkey and human cells were unsuccessful (Lieber et al., Science, 182: 56). -58 91973). Mouse ecotropic virus replication in hamster cells can also be used. This was done by transfecting these cells with mouse or modified human ecotropic receptors before infection. This strategy further takes advantage of the natural resistance of these cells to replicate the amphotropic virus, and by repeating the amplification of mouse ecotropic virus sequences in these cells, high titer ecotropic expression is achieved. To achieve.
Related specific methods
It substantially modifies the so-called “ping-pong” strategy of Bestwick et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5404-5408, 1988). They use two retroviruses that cannot replicate normally in human cells. Chinese hamster cells (cell line A) that express Ψ-HaLV and stably express mouse ecotropic virus receptor are used to obtain helper virus, and Ψ-ecotropic MuLV expresses mouse ecotropic virus receptor Co-cultured with a second Chinese hamster cell (cell line B) that does not express. The virus thus propagated in the cell line A can infect the cell line B via the HaLV receptor. This intracellularly replicated virus has mouse ecotropic gp70 and can infect cell line A. This process is the theoretical maximum number (approximately 10⁹~Ten^TenPFU) particles are thought to continue until production is achieved (Bodine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 3738-3742, 1990). As described here, amplification of retroviral sequences in mixed packaging co-cultures was found to be related to increased copy number divided by tissue culture time (Hesorffer et al., Hematology / Oncology Clinic of North America 5: 423-432, 1991). In addition, retroviral vector DNA appears to be relatively poorly expressed when transfected into cells compared to levels obtained after proviral integration (Bestwick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5404-5408, 1988; Huang and Gilboa, J. Virol., 50: 417-424, 1984), this approach is preferred.
According to this approach, it contains multiple copies of ecotropic virus sequences integrated into the genome and at least about 10⁷~Ten^Ten, Preferably about 10⁹~Ten^TenChinese hamster cell lines that produce are provided, but if their viral receptors are not modified according to the present invention, particles that are capable of infecting human cells recombinantly or otherwise will not be produced. To confirm that this result was obtained, appropriate viral infectivity assays are performed on various human and mouse cell lines commonly used to detect viral infectivity. This approach is thought to produce a much safer packaging system than was previously available.
HaLV is cloned to produce a deletion in its packaging signal. Removal of the packaging signal can be obtained according to known methods. Next, transfection and stable expression of mouse ecotropic virus receptor into CHO hamster cells is carried out according to known methods, for example, as described in Yoshimoto et al. (1993). Optionally, the cloned helper virus may be introduced into these cells as a split genome for additional safety. In the case of the mouse ecotropic virus helper, plasmids pgag-polgpt and penv derived from the 3PO plasmid corresponding to the ecotropic moloney murine leukemia virus lacking 134 base pairs of the Ψ packaging sequence can be obtained from commercial sources or here It can be easily obtained from the published researchers shown. Such plasmids have been successfully used to generate PCL with somewhat higher safety than that using an unsplit helper virus genome.
To clone HaLV, known procedures are used, such as those of Anderson et al. (1992), which are similar to the cloning of defective retroviral particles from recombinant Chinese hamster ovary cell lines. For example, such clones contain the pCHOC.ML10 sequence identified by Anderson or the endogenous polytropic murine leukemia virus (MuLV) isolate, MX27 (Stoye and Coffin, 1987). The latter probe consists of a 12.3 kb mouse genomic fragment encompassing the complete 9.3 kb proviral genome. Hamster type C related sequences are isolated from randomly primed cDNA of particle RNA in lgt10. When using the latter probe, low stringency hybridization is used to identify the plaque of interest. Extracellular particles are prepared from broth recombinant CHO cell subclone, 3-3000-44 (Lasky et al., 1986). This subclone is deficient in dihydrofolate reductase (dhfr) after transfection with an expression vector containing the mouse dhfr gene and recombinant outer membrane glycoprotein (gp120) of type 1 human immunodeficiency virus (HIV-1) It was derived from CHO-DuxB11 cells (Simonsen and Levinson, 1983; Urlab and Chasin, 1980). The CHO-K1 cell line (the ancestor of the CHO-DUXB11 cell line), originally derived from an ovarian biopsy of a mature Chinese hamster (Puck et al., 1958), is an American type culture collection. Readily available from commercial suppliers such as (ATCC). In addition, the hamster sequence is repaired with the equivalent part of mouse ecotropic virus. Viral particles are thought to be produced as observed by Anderson et al. The pCHOC.ML10 sequence contains multiple interruptions of the potential coding sequence within all three reading frames of the endonuclease gene, so if the clone does not encode an intact endonuclease, the endonuclease region Can be replaced with that of a homologous retroviral genome such as ecotropic MuLV. The HaLV outer membrane protein is moderately expressed so that the particle can infect other hamster cells, but not all other HaLV genes are essential (LTR is probably excluded), so by homologous MuLV sequences It can be replaced. To delete the ψ region of clone HaLV, the method of Mann et al. Is used (Cell 33: 153-159, 1983).
(B) Use of chimeric receptor polypeptides
As a non-limiting example, an ecotropic retrovirus receptor (MERR) modified for gene delivery should reduce the potential incidence of cancer and related diseases during gene therapy.
The method of the present invention has several advantages. First, since mouse ecotropic virus cannot replicate in human cells, any conceivable recombinant virus will not be able to infect human cells. Furthermore, those who perform gene therapy will be able to limit infection with elaborate specificity only to target cells that are desired to be infected. The possible random insertion of the virus across the entire human genome in various types of organs is unlikely and is unlikely to be considered whenever vectors based on human infectious amphotropic retroviruses are used. It will not be shown. Furthermore, since the method of the present invention uses human virus receptor proteins with minimal modification, the possibility of rejection by the immune system of infected human cells is significantly reduced or eliminated.
(C) Target-directed vector format
background:
A preferred aspect of the invention, particularly for in vivo methods, is the use of delivery vectors that allow specific targeting of cells infected by recombinant non-human specific ecotropic viruses that provide therapeutic effects to target cells. A method of treating an animal. Non-limiting examples of such substances are specific to a suitable linker peptide and a cell surface molecule (such as an MHC class 1 antigen) bound to a mouse ecotropic virus receptor or a modified human ecotropic receptor. Antibody V_HAnd V_LFusion proteins that encompass the region are included. Also, ligands for membrane receptors (such as epidermal growth factor receptor) were fused with mouse ecotropic virus receptors or modified human virus ecotropic receptors. The design will be flexible enough so that its specificity can be modified relatively easily.
Pharmaceutical composition:
A pharmaceutical composition comprising a protein, peptide or antibody of the invention, such as at least one chimeric receptor polypeptide or antibody, all contains at least one therapeutic agent in an amount effective to achieve its intended purpose. Of the composition. In addition, pharmaceutical compositions containing at least one therapeutic agent are suitable pharmaceutically acceptable containing excipients and adjuvants that facilitate processing of the active compound into a pharmaceutically acceptable formulation. A carrier may be contained.
Pharmaceutical compositions include solutions suitable for administration by injection or oral administration, and contain about 0.001 to 99%, preferably about 20 to 75%, of the active ingredient (ie, therapeutic agent) with excipients. Pharmaceutical compositions for oral administration include tablets and capsules. Compositions that can be administered rectally include suppositories.
Therapeutic carrier
The carrier for the active ingredient may be sprayable or non-sprayable. The non-sprayable form may be a semi-solid or solid that contains a carrier that aids in topical administration and preferably has a dynamic viscosity greater than that of water. Suitable formulations include, but are not limited to, solutions, suspensions, emulsions, creams, ointments, powders, coatings, salves and the like. If desired, they may be sterilized or mixed with adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting agents, buffers, or salts that affect osmotic pressure and the like. Preferred vehicles for topical formulations that cannot be sprayed include ointment bases such as polyethylene glycol-1000 (PEG-1000); conventional creams such as HEB cream; gels; and petroleum jelly and the like.
Although suitable for systemic and topical application, particularly suitable for mucosal and pulmonary applications are sprayable aerosol formulations in which the active ingredient is preferably combined with an inert carrier substance, either solid or liquid. The aerosol formulation may contain a solvent, buffer, surfactant, fragrance, and / or antioxidant in addition to the protein or peptide of the present invention. For aerosol administration, the therapeutic agent according to the invention may be packaged in a squeeze bottle or in a pressurized container with a suitable system of valves and actuators. As is well known in the art, it is preferred that a metering valve be used and that the valve chamber be reloaded during actuation or dosing.
Administration of therapeutic drugs
The therapeutic agents of the present invention can be administered by any means that achieve their intended purpose, for example, treatment of home infection or treatment of systemic infection in a subject having or susceptible to infection. For example, immunosuppressed individuals are particularly susceptible to retroviral infection and disease.
For example, administration can be by various parenteral routes such as subcutaneous, intravenous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intracranial, transdermal, or sublingual route. Alternatively or simultaneously, administration may be by the oral route. Parenteral administration may be by a single injection or by gradual perfusion over time.
A further mode of using the therapeutic agents of the present invention is by topical administration. The therapeutics of the invention may be incorporated into topical vehicles such as salves, ointments that have both a smoothing effect on the skin and a means of administering the active ingredient directly to the affected area.
For topical application, it is preferred to administer an effective amount of a therapeutic agent according to the present invention to an infection, such as the skin surface, mucous membrane, and the like. This amount is generally about 0.0001 per application, depending on the area to be treated, whether the use is prophylactic or therapeutic, the severity of the symptoms, and the nature of the topical vehicle used. mg to about 1 g. A preferred topical formulation is an ointment in which from about 0.001 to about 50 mg of active ingredient is used per cc of the ointment base. The ointment base is preferably PEG-1000.
Topical therapy for treatment or prevention includes administering an effective amount over a period of one day or days, including from 1 week to about 6 months and from 1 week to about 6 months.
The dosage of the therapeutic agent of the present invention administered in vivo or in vitro depends on the age, sex, health status, and weight of the recipient, the type of treatment, if any, the frequency of treatment, and It is understood that it will depend on the nature of the desired effect. The effective dose ranges shown below are not intended to be limiting but represent preferred dose ranges. However, the most preferred dosage will be determined as appropriate for the individual subject, but will be understood and determinable by one of ordinary skill in the art.
The total dose required for each treatment may be administered in multiple or single doses. The therapeutic agent may be administered alone or in conjunction with other therapeutic agents directed to viral infection or directed to other symptoms of viral disease.
An effective amount of the therapeutic agent of the present invention is about 0.001 μg to about 100 mg / kg body weight, preferably about 1 μg to about 50 mg / kg body weight.
Formulations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions, and may contain adjuvants or excipients known to those skilled in the art. Pharmaceutical compositions such as tablets and capsules are also prepared according to conventional methods.
Diagnostic tests
The present invention provides a method for assessing the presence and level of a subject's normal or chimeric receptor or H13 protein or mRNA. The absence of the H13 gene in the individual, or more typically, the low expression of the H13 gene or the presence of mutant H13 is indicative of resistance to retroviral infection and thus AIDS or certain types of leukemia or other retroviral mediation. It can serve as an important predictor of disease onset. In addition, overexpression of H13 serves as an important predictor of becoming susceptible to retroviral infection.
Furthermore, virus-induced tumor cell lines have increased ERR or H13 mRNA expression, indicating that the level of mRNA or receptor protein expression can serve as a useful indicator of viral infection that cannot be detected by other methods. Show. Thus, by providing a means for measuring the amount of H13 mRNA (see below) or protein (using an immunoassay as described above), the present invention provides for human retroviral infection or retroviral trait in a subject. A means for detecting transformed cells is provided.
From a subject for the presence of a chimeric receptor polypeptide or chimeric receptor polypeptide DNA or mRNA using oligonucleotide probes encoding various portions of the chimeric receptor polypeptide or nucleic acid sequences encoding the chimeric receptor polypeptide Test the cells. Preferred probes will be directed to a nucleic acid sequence encoding at least 12, preferably at least 15 nucleotides of the chimeric receptor polypeptide or chimeric receptor polypeptide sequence. Qualitative or quantitative assays can be performed using such probes. For example, Northern analysis (see below) is used to measure the expression of a chimeric receptor polypeptide or chimeric receptor polypeptide mRNA in a cell or tissue sample.
Such methods can be used using very small amounts of nucleic acid obtained from an individual, since the use of selective amplification techniques is known. Recombinant nucleic acid methods that can amplify purified nucleic acid fragments have long been recognized. Typically, such methods include the introduction of a nucleic acid fragment into a DNA or RNA vector, clonal amplification of the vector, and recovery of the amplified nucleic acid fragment. Examples of such methods are given by Cohen et al. (US Pat. No. 4,237,224), Sambrook et al.
More recently, the concentration of such desired nucleic acid molecules can be increased. An in vitro enzymatic method has been described. This method is referred to as “polymerase chain reaction” or “PCR” (Mullis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich, H.), EP50,424; EP84,796; EP258,017; EP237,362; Muris, EP201,184; Muris et al., US Pat. No. 4,683,202; Erlich, US Pat. No. 4,582,788; and Saiki, R Et al., US Pat. No. 4,683,194). All of which are hereby incorporated by reference in their entirety.
This polymerase chain reaction is a method that selectively increases the concentration of a DNA sequence, even if the DNA sequence has not been purified so far, and there is only a single copy in a particular sample. I will provide a. This method can be used to amplify either single-stranded or double-stranded DNA. The essence of this method is to include the use of two oligonucleotides that serve as primers for template-dependent polymerase-mediated replication of the desired DNA molecule.
PCR delegations are described in Muris (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Saiki et al. (Bio / Technology 3: 1008-1012 (1985)); and Muris et al. (Meth. Enzymol. 155). : 335-350 (1987).
Although the invention has been generally described so far, it will be more readily understood by reference to the following examples. This example is provided for purposes of illustration and is not intended to limit the invention.
Example I
General materials and methods
Cell line
The following cell lines were used for the studies described below: CCL120 (ATCC # CCL120), human B lymphoblastoid cell line; CCL119 (CEM, ATCC # CCL119), human T lymphoblastoid cell line; SupT1, Human non-Hodgkin T lymphoma cell line; H9, HUT78-derived single cell clone, human skin T cell lymphoma cell line; MOLT4 (ATCC # CRL1582), human acute lymphoblastic leukemia cell line; HOS (ATCC # CRL1543), human bone Sarcoma cell line; HeLa (ATCC # CCL2), human epidermoid carcinoma cell line; CHO-K1 (ATCC # 61), Chinese hamster ovary cell line; B10T6R, B10.T (6R) mouse radiation-induced thymoma; Radiation-induced thymoma in C57BL / 6Ka mice.
screening
Human CEM and HUT78T cell cDNA library (λgt11) were obtained from Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). A human lymphocyte cosmid library (pWE15) was obtained from Stratagene (La Jolla, CA). These libraries were screened by the method of Maniatis et al. (Maniatis et al., Cell, 15: 887-701 (1978). The BamH I-EcoR I fragment containing the entire open reading frame of ERR cDNA (pJET) was (Albritton) and Cunningham (Dr. Harvard Medical School, Boston, MA).³²About 2 × 10 for P⁶Labeled to a specific activity of cpm / μg and used as a hybridization probe.
Southern blot analysis
Blin, N. et al. (Nucleic Acids Res., 3: 2303-2308 (1976)), and Pampeno, CL and Meruelo (Pampeno et al., J. Virol., 58: 296). -306 (1986), high relative mass DNA was prepared from the cells, restricted endonuclease digestion, agarose gel electrophoresis, copying to nitrocellulose (Schleicher & Schuell, Keene, (New Hampshire), hybridization and washing were as described (Pampeno et al., Supra; Brown, GD, Immunogenetics 27: 239-251 (1988)).
Northern blot analysis
Total cellular RNA was isolated from cells by the acidic guanidinium thiocyanate phenol phenol chloroform method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162: 156-159 (1987)). The DNA was electrophoresed in a 1% formaldehyde agarose gel and transferred to a Nytran filter (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Hybridization and washing were performed according to Amari, N.M.B. et al. (Mol. Cell. Biol., 7: 4159-4168 (1987)).
DNA sequence analysis
The cDNA clone from the positive phage was recloned into the EcoR I site of the plasmid vector pBluescript (Stratagen). A unidirectional deletion of this plasmid was constructed using exonuclease III and S1 nuclease and dideoxy chain terminator method (Sanger, FS) with Sequenase reagent (US Biochemical, Cleveland, Ohio) Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977), using T3 or T7 promoter-specific oligonucleotides to probe partially digested cosmid DNA described elsewhere (Evans ( Evans, GA) et al., Meth. Enzymol. 152: 604-610 (1987), the restriction enzyme map of the positive cosmid insert was determined. (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) .The exons and exon-intron junctions were synthesized into synthetic oligonucleotides. The sequences were edited and analyzed using the Genetics computer group sequence analysis software package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Res., 12: 387- 395 (1984)).
Example II
H13 DNA and predicted protein sequence
The full nucleotide sequence of H13 (SEQ ID NO: 7) including the non-coding sequence at the 5 ′ and 3 ′ ends of the coding sequence is shown in FIG. This sequence contains a partial sequence originally obtained from clone 7-2 (SEQ ID NO: 1). Nucleotides 1 to 6 and 1099 to 1102 of SEQ ID NO: 1 were originally determined incorrectly. FIG. 1 also shows the entire amino acid sequence deduced from this nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8). This sequence includes the partial amino acid sequence originally described (SEQ ID NO: 2) except for the N-terminal Pro-Gly and the C-terminal Pro that were originally erroneously deduced from this nucleotide sequence.
A comparison of the nucleotide sequences of H13 and ERR is shown in FIG. 2, and a comparison of the amino acid sequences of H13, ERR and TEA is shown in FIG.
The homology between these compared sequences is very high, for example, the homology between H13 and ERR DNA is 87.6%, and the homology between H13 and TEA amino acids is 52.3%.
Example III
Presence and expression of H13 gene in human cells
According to Southern analysis of DNA collected from cells of various species, DNA that can hybridize with mouse ERR cDNA probe (FIG. 4) and H13 cDNA (FIG. 5) includes CCL120, CCL119, SupT1, H-9, and MOLT-4. It was found to be present in two human cell lines and in hamster cells (CHO-K1) and mouse cells (normal Balb / c mouse thymocytes). H13 gene expression was examined using an H13 cDNA probe using Northern analysis. This probe detected a transcript of about 9 kb in RNA from HeLa, SupT1, HOS and CCL119 cells (FIG. 6). This RNA could also be detected using a mouse ERR cDNA probe (FIG. 7).
Example IV
Murine retrovirus receptor cDNA into hamster cells. Transfection
Mouse retrovirus receptor (ERR) cDNA, selectable marker plasmid DNAP, pSV₂Neo was co-transfected with calcium phosphate into hamster CHO cells that could not be infected by mouse ecotropic retrovirus (Wigler, M. et al., Cell, 14: 725-731 (1978)). The transfectants expressing this receptor gene were then infected with mouse radiation leukemia virus (RadLV). Two weeks after infection, the reverse transcriptase (RT) activity of the supernatant was measured (Stephensen, JR et al., Virology 48: 749-756 (1972)), and Northern blot analysis was performed using a viral probe. Performed after preparation of the RNA.
As shown in FIG. 8, the RT activity detected in untransfected CHO cells not expressing this receptor gene was indistinguishable from the activity (background) of the tissue culture medium. This indicates that the cells were not infected by MuLV.
After transfection with this ERR cDNA, the RT activity of the transfected cell supernatant was much higher than the background (FIG. 8).
The MuLV virus probe detected transcripts in RNA prepared from this transfectant, but not in RNA prepared from untransfected CHO cells. These results indicate that cells transfected with ERR cDNA can confer susceptibility to ecotropic murine leukemia virus.
Example V
Production and use of antibodies against H-13
It is very difficult to make an H-13 containing fusion protein with the entire predicted protein (SEQ ID NO: 2). This is because the predicted protein is highly hydrophobic, as shown in FIG. Therefore, in order to predict the antigenic epitope present in this protein, computer analysis was performed using the program of PEPTIDESTRUCTURE (Jameson et al., CABIOS 4: 181-186 (1988)). FIG. 10 shows the antigenic profile of the H-13 protein sequence.
A DNA sequence (SEQ ID NO: 2, amino acid residues 309 to 367) encoding a highly antigenic portion was prepared by cleaving with restriction enzymes Acc I and EcoR I which generate a 180 bp Acc I-EcoR I fragment. In an orientation that allows for the expression of an open reading frame (Smith, DB et al., Gene 67: 31-40 (1988)), this fragment of H-13 cDNA was transformed into the pGEX-2T plasmid vector (Pharmacia LKB Biotechnology). Ligated to the cloning site. This plasmid vector can express an antigen as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST).
Isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture to induce the fusion protein and purified using glutathione sepharose 4B chromatography (Pharmacia LKB Biotechnology) (see FIG. 11). The purified fusion protein was injected intramuscularly and subcutaneously into rabbits with Freund's complete adjuvant to obtain antisera.
This antiserum exhibits specific binding to H-13 protein and its epitope fragments.
Membrane proteins from human cells were made according to standard procedures, separated by polyacrylamide gel electrophoresis and blotted onto nitrocellulose for Western blot analysis. This H-13 specific antibody shows binding to the proteins on these blots.
Example VI
Genetic mapping of H-13
Chromosomal blots containing DNA from a panel of human-hamster somatic cell hybrids (Kouri, RE et al., Cytogenet. Cell Genet. 51: 1025 (1989)). New Haven, Connecticut). By comparing the expression of H13 cDNA with the human chromosome remaining in the human-hamster hybrid cells, the H-13 gene was mapped to human chromosome 13 (see FIG. 12). The human genes linked to chromosome 13 (or diseases caused by mutations therein) include the following. Retinoblastoma, osteosarcoma, Wilson disease, letterer-Give disease, Dubin-Johnson syndrome, coagulation factors Vii and X, collagen IV α1 and α2 chain, X-ray sensitivity, lymphocyte cytosolic protein-1, carotid body tumor— 1, propiol CoA carboxylase (α subunit) and the like.
Example VII
Chimeric receptor polypeptides and protein molecules encoded by chimeric H13 / ERR DNA
Several chimeric molecules between the mouse ERR sequence and the human H13 sequence were generated and designated chimera I-chimera IV. Specifically, four regions of the H13 cDNA were replaced based on the use of common restriction sites shown in FIG.
These DNA sequences were transiently transfected into Chinese hamster ovary (CHO) cell lines using pSG5 or pCDM8 expression vectors.
Two days later, the ability of these transfectants to support E-MuLV infection was tested. The cells were infected with a recombinant Moloney E-MuLV designated 2BAG (Price, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 156-160 (1987). , Β-galactosidase and neomycin phosphotransferase providing selectable markers and detectable products(Neo ^R) Contained the gene. The cells are then grown under selective conditions in the presence of the antibiotic G418 at a concentration of 0.6 mg / ml and neo^R-Expression transfectants were selected. Two weeks later, the number of G418-resistant colonies was counted.
These results indicate that the portion of the ERR gene essential for E-MuLV infection is located within the Nco I-Bst XI restriction region and contains the extracellular domain 3. The extracellular domain 3 (as shown in the upper part of FIG. 13) is a region of the receptor protein that is very different between human and mouse sequences as shown in FIG. Using the Genetics computer group sequence analysis software package (Devereux, J. et al., Nucl. Acids Res. 12: 387-395 (1984)), FIG. 14 (derived from the sequences shown in FIGS. 1-3) The sequences were aligned.
Next, chimeric molecules containing individual amino acid substitutions in the extracellular domain 3 were generated by oligonucleotide-directed mutagenesis. These were transfected as described above, and the susceptibility of the transfectant cells to infection with E-MuLV was tested as described above.
The results of the above studies indicate that the human H13 molecule acquires the ability to bind to E-MuLV by replacing the original amino acid sequence with 1 to 4 amino acids from the corresponding position of the mouse ERR protein. .
Example VIII
Chimeric receptor polypeptides as H13 derivatives capable of conferring ecotropic murine leukemia retrovirus infectivity
As described in FIG. 18, human H13 amino acid residues were replaced with mouse ERR residues. Mouse-human chimeric receptor molecules were created by substitution utilizing common restriction sites that revealed that extracellular domains 3 and / or 4 contain important amino acid residues. Subsequently, thirteen individual mutant ERR molecules with one or two amino acid substitutions or insertions in the two extracellular domains described above were created by oligonucleotide-specific mutagenesis. Replace at least two amino acids of Pro and Val of 242 and 244 amino acid residues of human H13 with the corresponding amino acid residues Tyr and Glu, or replace Gly240 and Pro242 of human H13 with Val and Tyr (Val233 and Tyr235 of ERR) The resulting mutant H13 becomes capable of functioning as a mouse ecotropic retrovirus receptor. This mutant H13 could be used for gene therapy.
In order to compare the relative ability of mouse ERR and human H13 to function as MuLV-E receptors, a Chinese hamster ovary (CHO-K1) cell line was integrated with a vector expressing either mouse ERR or human H13. Overtransfected (see letters in FIG. 16). Two days later, these transfectants were infected with E. coli lacZβ-galactosidase and recombinant MuLV-E, ΨCRE / BAG virions containing the Tn5 neo resistance gene (Price et l. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84 : 156-160 (1987); Danos et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 6460-6464 (1988)), G418. After 10-14 days, the number of G418 resistant colonies was counted (FIG. 16). No positive clones were obtained with H13 transfectants, but 10 with ERR transfectants.^ThreeMore than one colony was obtained. This indicates that H13 molecules that were not modified by amino acid substitutions or deletions lack the ability to function as MuLV-E receptors.
To identify amino acid residue alterations for MuLV-E infection, as depicted in FIG. 18, a H13 variant protein was generated by substitution using a common and single restriction site, Kpn I Then, their ability to function as a receptor for MuLV-E was measured (FIG. 16). For chimeric I transfectants where the first half is replaced by the corresponding region of ERR, about 10^ThreeOne colony was obtained, but no colony was obtained for the chimeric II transfectant in which the latter half was replaced with the corresponding region of ERR. This indicates that important amino acid residues are located in the first half. In order to more narrowly identify the essential region, Chimera III in which the Nco I-Nco I fragment was replaced with the corresponding region of ERR was prepared and its ability to function as a receptor was measured (FIG. 16). About 10^ThreeOne colony was obtained, indicating that the region important for infection is located within the Nco I-Nco I restriction site.
FIG. 17 shows a comparison of the extracellular domain and 4 sequences in mouse ERR and human H13, which sequences are described in Genetics Computer group sequence analysis software package (Devereaux et al. Nucleic Acid Res. 12: 387- 395 (1984)). Extracellular domain 3 is the most different region between mouse ERR molecules (variants 1-11) having one or two amino acid substitutions or insertions in the two domains described above (Figure 17 and Table 2). For each substitution, the amino acid residue of ERR was replaced with that found at the same position in the H13 sequence. For each insertion, the amino acid residue of H13 was added at the same position of the ERR sequence aligned as shown in FIG.
The ability of CHO-K1 cells expressing mutant ERR protein to function as MuLV-E receptors was tested. Surprisingly, no colonies were obtained for mutant 7 alone, but about 500 colonies were obtained for the other mutants, indicating that among these 11 mutants, Only 7 has lost the ability to function as the receptor (Table 2). Mutant 7 has two amino acid substitutions, Tyr (235 amino acid residues of ERR) corresponds to Pro (corresponds to amino acid residue 242 of H13), Glu (corresponds to amino acid residue 244 of ERR) Is substituted with Val (244 amino acid residues of H13). Therefore, mutants 7A and B were generated that contained only one amino acid substitution (mutant 7A: Tyr to Pro, mutant 7B: Glu to Val) and tested for their ability to function as the receptor. Mutant 7B has the ability to function as the receptor to approximately the same extent as the original ERR, but mutant 7A has been found to have almost completely lost this ability (Table 2). ). These results indicate that Tyr located at 235 amino acid residues of the ERR sequence is extremely important for functioning as a MuLV-E receptor protein, and ERR functions as the receptor when this amino acid residue is substituted. It suggests losing ability.
To determine whether an H13 molecule gains the ability to function as the receptor when a certain amino acid residue in H13 is replaced with the corresponding amino acid residue in ERR, eight variants of H13 are They were made as shown in FIG. 18 and their ability to function as the receptor was measured. For example, as shown in Lewis and Thompson, Nucleic Acid Res. 18: 3439-3443 (1990), modified site-directed mutagenesis using the phagemid vector pSELECT-1 (Promega) ) To create the H13 mutant. This mutagenesis is based on the use of single stranded DNA and two primers. One of the two primers is a mutagenic primer, and the other is a second correction primer (which corrects a defect in ampicillin resistance in the vector).
The insert of pSG5H13 was digested completely with BamH I, partially with EcoR I, and subcloned into the BamH I-EcoR I site of pSELECT-1 to yield pSELECT-1 antisense H13. The inserts of PSG5H13 variants 5 and 8 were excised with EcoR I and subcloned into the EcoR I site of pSELECT-1 to give pSELECT-1 antisense H13 variants 5 and 8. PSELECT-1 antisense H13 and oligonucleotide as template:
AAAGAAGGGAAGTACGGRGRRGRGGG (SEQ ID NO: 9) (H13 variant 1);
ACACAAAAGAAGTGAAGTACGGTGTTGGTGG (SEQ ID NO: 10) (H13 variant 2);
ATGACACAAAAAACGTGAAGTACGGTGTTGGTGG (SEQ ID NO: 11) (H13 variant 3); and
AAAGAAGGGAAGTACGGTGAGGGTGGATTCATG (SEQ ID NO: 12) (H13 variant 5)
Were used to make H13 mutants 1-3 and 5. pSELECT-1 antisense H13 variant 8 and oligonucleotides:
TGAAGTACGGTGTTGGTGGATTCATG (SEQ ID NO: 13)
Was used to prepare H13 variant 4. pSELECT-1 antisense H13 variant 5 and oligonucleotides:
ACACAAAAGAAGTGAAGTACGGTGA (SEQ ID NO: 14) (H13 variant 6);
AATGACACAAAAAACGTGAAGTACGGTGA (SEQ ID NO: 15) (H13 variant 7); and
AACAATGACACAAACGTGAAGTACGGTGAGGGTGGATTCATG (SEQ ID NO: 16) (H13 variant 8)
Were used to prepare H13 mutants 6-8.
For example, as described in Lewis and Thompson, Nucleic Acids Res. 18: 3439-3443 (1990), the method of modified site-directed mutagenesis using the phagemid vector pSELECT-1 (Promega) allows the ERR A mutant was created. This mutagenesis is based on the use of single stranded DNA and two primers. One of the two primers is a mutagenic primer, and the other is a second correction primer (which corrects a defect in ampicillin resistance in the vector).
The insert of pSG5ERR was partially digested with BamH I and EcoR I and subcloned into the BamH I and EcoR I sites of pSELECT-1 to obtain pSELECT-1 sense and antisense ERR. Single-stranded DNA was prepared from pSELECT-1 sense (for making variants 2 and 6) and antisense (for making other variants) ERR and mutagenized according to the manufacturer's instructions (Promega). Sequenase (USB) and two ERR-specific antisense oligonucleotides as primers (GGTGGCGATGCAGTCAA for variants 1-7)
(SEQ ID NO: 17) and TCAGCCATGGCATAGATA (SEQ ID NO: 18) for variants 8-11
Correctly mutated clones were selected by direct sequencing using. The mutated insert of phagemid prepared by miniprep was excised with EcoR I and subcloned into the EcoR I site of pSG5. The presence of the mutation was confirmed by sequencing each plasmid using the same primers as used above. Subsequently, each mutant was transiently transfected into CHO-K1 cells by a method using Lipofectin reagent, and their susceptibility to infection by MuLV-E was measured as described above, as shown in FIG. Results were obtained.
As a result, the mutant H13 polypeptide of the present invention containing Tyr242 and at least one of Val 240 and Glu244 is expressed in mouse ecotropic retro by expressing such a chimeric receptor polypeptide on the extracellular surface of human cells. It has been shown to provide a mutant H13 receptor binding region that is functionally recognized by murine ecotropic retroviruses such as MuLV-E to allow binding and infection by viruses. Accordingly, such methods can be used as in vitro, in vitro or in situ gene therapy methods in accordance with the present invention. Alternatively, such methods of the invention can be used to introduce heterologous or foreign genes into human cells or tissues using mouse ecotropic retroviral vectors. Thus, the use of the H13 variants of the present invention provides a much safer means of gene therapy than using an amphotropic retroviral vector, whereby the intent of non-target cells by an amphotropic retrovirus In addition to infectious problems, the problem of reduced immunogenicity due to the use of recombinant ecotropic viruses at relatively low doses has been solved.
In summary, when human ecotropic retrovirus receptors have been cloned and it has been recognized that mouse ecotropic viruses cannot normally infect human cells without the introduction of molecular modifications, gene therapy involving retroviruses The safety will be dramatically improved. In the first step, the modified gene of the ecotropic retrovirus receptor will be delivered to the target cell and transiently expressed. It will then be infected using a mouse ecotropic virus vector and stably integrated to express the desired therapeutic gene. The first step of infection may take little or some time.
The ecotropic viral vector to be used has a deletion of the structural gene and will grow in a “safe” packaging cell line to add safety. Ten⁸~Ten^TenIt is anticipated that a new packaging line will be constructed that will produce virus titers in the particle / ml range, but this construction lacks recombinant viruses capable of infecting human cells. Furthermore, modification of the viral outer membrane glycoprotein will eliminate any determinants that prevent viral infectivity in vivo or reduce viral titer. In addition, by studying human ecotropic virus receptor homologues, it is possible to determine its normal gene function and to eliminate the possibility that a gene therapy protocol will adversely affect its normal function. Full understanding is gained.
Example IX
Cloning of human amphotropic virus receptor
The amphotropic receptor is cloned for the development of gene therapy vectors. Similar to that used to clone the receptor for Gibbon ape leukemia virus and mouse ecotropic virus (E-MLV) according to known steps (eg Brown et al, 1990; Anderson et al, 1991) The amphotropic MLV receptor is cloned by this strategy. The strategy relies on the fact that human cells can be infected with A-MLV but hamster cells cannot. The inability to infect hamster cells is because they lack the appropriate receptor, and if the human gene is transfected into hamster cells, it can be made infectable with A-MLV. These cells are isolated by infecting with antibiotic-resistant recombinant virus, followed by selection of antibiotic-containing media. The receptor gene is easily cloned because it associates with human repetitive DNA. The amphotropic receptor gene is cloned and examined for similarities and dissimilarities with the ecotropic virus receptor in a variety of assays and a variety of approaches (eg, Yoshimoto et al., 1993).
Method  CHO cells were plated on the morning of transfection. Cleaved human genomic DNA (50 μg) and pSV_2gptDNA (1 μg) was coprecipitated with calcium phosphate by the method of Wigler et al. (1978) and applied to CHO cells. The next day, the transfected cells were placed in gpt selection medium (DMEM / 10% FCS, hypoxanthine 15 μg, xanthine μg / ml, thymidine 10 μg / ml, glycine 10 μg / ml, methotrexate 0.1 μM, and mycophenolic acid 25 μg / ml). 2 x 10 per plate^FiveCells were subcultured. After 21 days of selection, colonies were briefly exposed to trypsin / EDTA to disperse and replaced prior to exposure to virus to enrich for cells that had acquired human DNA.
PA317 / LNL6 amphotropic retrovirus-producing fibroblasts were grown to confluence and re-cultured in fresh medium. After 12-20 hours, the culture medium was filtered (0.45 μm, Nalge) to 8 μg / ml polybrene and incubated with the transfected CHO cells. After 4-12 hours, fresh media was added and the infection protocol was repeated the next day. After 3 days, these cells were washed 2 × 10 2 per 82 mm plate in DMEM / 10% FCS containing 1 mg / ml G418.^FiveCells were re-plated and the selection medium was replaced every 3 days for 15 days. Of the 20,000 transfectants, only a few (10-20) were expected to occur in g418 resistant colonies. In order to prove that the clones can infect this amphotropic virus and in fact express this amphotropic virus receptor, they are also referred to as a second amphotropic virus (Ψ-2-AM-ZIP- DHFR). Cells can acquire the virus by a less efficient pathway that does not contain the viral receptor. G418 resistant colonies were isolated with a cell cloning cylinder and each was exposed to Ψ-2-AM-ZIP-DHFR virus as described above for neomycin virus. Following exposure to the virus, cells were selected in DMEM / 10% dialyzed FCS containing methotrexate (150 nM). After 14 days, the plates were stained with 1% crystal violet to check for the presence of methotrexate resistant colonies.
DNA was then prepared from this first transfected cell line (1 ° TF) and used in the second cycle of the transfection / infection protocol. To identify the receptor gene in the second transfectant cell line, a Southern blot using a panel of human repeats as a probe was performed. Due to the low efficiency of DNA transfection (0.1% genome / cycle), several cycles of transfection / selection were sufficient to separate the receptor gene from the rest of the mouse genome (Murray et al., 1981). ). To isolate the desired fragment, a random phage library was generated from secondary transfectant DNA and hybridized with radiolabeled repetitive probes that appeared to be very suitable from Southern blot screening. In order to identify molecular clones containing proteins encoding portions of the amphotropic receptor gene, RNA transcripts present in 2 ° TFs propagating the amphotropic virus were identified. The specific transfer of the gene in question is expected to shift susceptibility to amphotropic virus infection as well, providing a large panel of cells that can be infected with these viruses expressing this molecule.
Example X
Expression of the therapeutic delivery vector of the present invention
Complementary DNA (cDNA) from antibody B3 (eg, Brinkmann et al., 1991) was used to construct Fv fragments fused to the chimeric receptor polypeptides of the present invention. Use of this single-chain recombinant receptor enables retroviral infection of target human cells. Single-chain recombinant toxins have been produced that cause complete regression of human tumors in mice using antibodies to B3 that bind to carbohydrate antigens expressed on the surface of many carcinomas (Brinkmann et al., 1991). . Chimeric receptors encoding nucleic acids using single chain Fv and two different (B3 (Fv) immunotoxins, B3 (Fv) -PE40 and B3 (Fv) PE38KDEL) vectors in standard recombinant DNA techniques It was inserted into the polypeptide or its recombinant toxin was replaced with the virus binding domain of the gene encoding the modified region of the human ecotropic virus receptor. The resulting plasmid (B3 (Fv) -mH13) and immunotoxin vector B3 (Fv) PE38KDEL are expressed in a host such as E. coli and single chain immunoreceptors and single chain immunotoxins are known in the art. Purified until homogeneous.
The antitumor activity of B3 (Fv) -mH13 was first measured in vitro. This B3 antibody reacts well with the surface of many mucinous carcinomas of the colon, stomach, and ovary, and with normal tissues such as gastric glands, trachea and bladder epithelium, differentiated epithelium of the esophagus, and small intestine mucin (Pastan et al. (Cancer Res. 51: 3781-3787, 1991)). The B3 antibody is also used in many human tumor cells including MCF7, MDA-MB-468, and HTB20 (chest), A431 (epidermoid), TH29 (colon), HTB33 (cervical), and DU145 (prostate). It reacts well with the line. After first carrying the receptor peptide modified with a fusion protein derived from B3 (Fv) -mH13 into the cells, mouse ecology carrying the neomycin resistance gene in some or all of these cells, such as A431 Infection with non-human specific recombinant retroviral vectors, such as tropic retroviral vectors, is expected. Add ganciclovir to the cell culture using a viral vector with an env binding domain that binds the chimeric receptor polypeptide and therapeutic agent, such as a mouse ecotropic retroviral vector with a thymidine kinase gene. As a result, cell death of cultured tumor cells such as A431 cells occurs.
Once such cells are found to work during culture, lethal pathological cells are used in animal model systems such as rabbit or rat models. As a result, based on the murine ecotropic virus of the present invention unless the corresponding region of the chimeric receptor polypeptide or mouse ecotropic virus receptor is expressed on the selected animal model cell surface by the delivery vector presented herein. It is expected that the vector will not be able to infect these cells. At various time intervals after fusion protein injection, a viral vector carrying a thymidine kinase gene is used to infect an animal model expressing the chimeric receptor polypeptide on selected target cells. Following this expression, the animals are administered ganciclovir. This protocol is expected to cause ganciclovir to be phosphorylated in tumor cells to its toxic form, and in conjunction with the associated “bystander effect” to reduce the tumor.
Example XI
Construction of expression vector for fusion protein of chimeric receptor polypeptide and single chain antigen binding protein that recognizes tumor or pathological cell or tissue
An example of a suitable methodology for introduction is shown in FIG. The expression plasmid pUL1 contains the gene for immunotoxin B3 (Fv) -PE40, which immunotoxin is a fusion protein containing an antibody fragment against an antibody against B3 specific for carcinoma cells and bound to toxin PE40. The portion encoding PE40 toxin is replaced with the corresponding region of the chimeric receptor polypeptide or mouse ecotropic virus receptor of the present invention to express the chimeric receptor polypeptide in vivo, in situ or in vitro. The pUL1 expression plasmid was modified to provide a delivery vector for transforming carcinoma cells.
B3 (Fv) is a single chain antigen binding protein derived from a monoclonal antibody against B3. This B3 antibody fragment recognizes the carbohydrate antigen found on the surface of many mucin carcinomas. However, this antibody fragment reacts only with a limited number of normal tissues so as to preferentially bind carcinoma cells in vivo. PE40 is a cleaved derivative of Pseudomonas exotoxin. The PE40 coding region has a HindIII restriction site at the 5 ′ end, a site that connects to DNA encoding B3 (Fv), and an EcoR I site just beyond the 3 ′ end. This Hind III-EcoR I fragment encoding PE40 is removed from pUL1, and both ends of the linearized pUL1 are partially filled-in with dATP to form a sticky end-AA. -TTCGA at the 3 'end of the B3 (Fv) coding region and AATTC at the other end of the linearized plasmid were similarly modified as follows to complement the DNA encoding the chimeric receptor polypeptide. .
The Nru 1-Pst 1 fragment of the chimeric receptor polypeptide of the present invention, like the modified H13 cDNA, contains the entire coding region of modified H13, but this is digested with Tfi I and the third of modified H13. A 850 bp fragment containing the region encoding the extracellular domain was purified on a 1.5% agarose gel. Subsequently, this purified 850 bp Tfi 1 fragment was digested with Bsr I, and the 85 bp Bsr 1-Tfi I fragment encoding the entire third extracellular domain of modified H13 was named Ex3mH13. The resulting restriction fragment EX3m13 was purified on a 2.0% agarose gel. This purified 85 bp Bsr 1-Tfi I fragment has a sticky end AGC- at the 5 ′ end,
CGTCG-
It has -GG at the 3 'end.
−CCTAA
The 3 ′ end is partially filled-in with dATP, and the 3 ′ end is designated as -GGA-CCTAA.
After partially filling-in, the adapter
CGCTTTCAACTGGC (SEQ ID NO: 19)
AAGTTGAC
And TTCTAATTAG (SEQ ID NO: 20)
GATTAATCTT (SEQ ID NO: 21)
(These are specifically designed to prevent any frameshifting) using the partially filled-in Hind III-EcoR I of pUL1 linearized from the 85 bp Bsr 1-Tfi fragment. Ligated to site. The resulting plasmid is designated pBH30.
The above gene encoding B3 (Fv) has an Nde1 site at the 5 ′ end. Thereafter, the obtained plasmid pBH30 was digested with Nde1, and the ends were filled-in with dATP and dTTP to make blunt ends. The linearized fill-in plasmid was then digested with EcoR I and the fragment containing the B3 (Fv) -Ex3mH13 coding region was purified on an agarose gel.
Adapter to prevent any frame shifting
GATCCCCGGG (SEQ ID NO: 22)
GGGCCC
Was used to incorporate the purified fragment into the expression vector pTrcHisB at the Bg III-EcoR I site, which was downstream of a series of Trc promoter, ATG start codon, polyhistidine coding region and enterokinase cleavage site coding region. Located in.
The resulting plasmid is designated pBH3.
Expression and purification of B3 (Fv) -Ex3mH13 fusion protein
The expression plasmid pBH3 can express B3 (Fv) -Ex3MH13 as a fusion protein composed of a polyhistidine metal binding domain, an enterokinase cleavage site and B3 (Fv) -Ex3mH13.
Thereafter, E. coli HB101 was transformed with pBH3. Expression was induced with isopropyl β-d-thiogalactoside, and cells were collected and suspended in buffer. Sonicate the suspension and remove the supernatant from Ni²⁺It applied to the metal affinity resin column. The protein bound to the resin was eluted by competition with glycine.
The eluted protein was then treated with enterokinase for the polyhistidine sequence to be removed.
The resulting fusion protein is expected to specifically bind the above pathological cells and is suitable for providing chimeric cells as therapeutic targets as described herein.
Example XII
Increase the efficiency of viral replication in vivo by determining critical regions of the viral outer membrane that bind to receptors such as the chimeric receptor polypeptides of the invention
background
Understanding the key regions of the viral outer membrane that bind to the receptor is equally important to the goal of developing improved vectors. The present invention dramatically improves the engineering of new vectors and effectively increases their in vivo titer. As a result, the invention characterizes the viral outer membrane elements required for binding to both receptors and the degree of modification that would allow these proteins without losing the ability to bind the receptors. A detailed analysis was provided to examine the limited differences between human and mouse ecotropic receptors that allow virus binding. The second objective is to eliminate any potential complement binding regions on the viral outer membrane that may lead to lysis of the virus in humans. This is a problem that has been discussed by several investigators, possibly limiting the in vivo infectivity of therapeutic vectors based on murine retroviruses.
The findings regarding non-specific inactivation and lysis of mouse, cat and monkey C virus were first published by Welsh et al. (1975, 1976). This lysis is due to antibody-independent binding of the human C1q complement component to gp70, leading to activation of the classical complement pathway (Cooper et al., 1976). C1q is thought to recognize gp70 because the gp70 molecule has a domain similar to the C1q recognition site on the Fc fragment of an immunoglobulin. Nonspecific lysis of retroviruses by human complement has been suggested to be an adaptive defense system that protects against viremia and may cause lysis of cells expressing gp70 on its surface (Welsh et al ., 1975; Cooper et al., 1976). However, complement-deficient patients have increased levels of cross-reactive antibodies to primate retroviruses, indicating that these patients are no longer more susceptible to retroviral infection. Preliminary findings suggest (Kurth et al., 1979b). In addition, Gallagher et al. (1978) demonstrated similar lytic activity of gibbon serum against the retroviral outer membrane, but some of the same gibbon infected GALV and synthesized anti-GALV antibodies. Thus, the protective effect of retrovirus complement-dependent lysis is controversial.
Mouse ecotropic binding to the viral receptor The arrangement of the virus outer membrane
Murine leukemia virus (MuLV) surface glycoprotein (gp70^SUOne way to define binding parameters is gp70^SUIt is to determine which region of the throat is involved in specific interactions with cell surface receptors. Various studies have shown that the determinant of receptor specificity is gp70^SU(Ott and Rein J. Virol 66: 4632-4638, 1992--cited references 13, 16). In fact, recently Friend MULV gp70 by Hard and Danos (1991)^SUIt was shown that an Env fragment containing most of this region of can bind to the ecotropic receptor in NIH 3T3 cells. Recently, Ott and Rein have also introduced Moloney MCF (Mo-MCF), 10A1, and amphotropic gp70.^SUBy constructing a series of chimeric env genes using the sequence, gp70^SUWe attempted to map the receptor characteristics in These chimera gp70^SUAnalysis of MuLVs containing both simple and complex results. In some cases, the receptor specificity is gp70^SUIt was possible to map to one area. Finally, some combinations can interact fully functionally with one receptor, but seem to partially interact with one or two receptors or not at all. It was.
According to Heard and Danos (J. Virol. 65: 4036-4032, 1991), the gp70 amino-terminal domain recognizes the ecotropic receptor, regardless of the carboxy-terminal part of the molecule, by an interference assay. It has been shown to be folded into a structure. They argue that it may be difficult to interpret the functional consequences of structural alterations introduced into the outer membrane glycoprotein by using virus entry assays. On the other hand, in cells that constitutively express outer membrane glycoproteins, the interference phenomenon is only due to outer membrane-receptor interaction. Thus, the depiction of cellular resistance to further entry of viral particles that bind the same receptor provides a functional receptor binding assay.
Experiment
Interference assays are used to more accurately identify regions of the mouse ecotropic envelope glycoprotein (MuLVE-gp70) that are important for receptor binding. To more accurately establish structural requirements for binding to ecotropic receptors, MuLVE-gp70 by in-frame deletion within the amino-terminal domain and by oligonucleotide-specific mutagenesis. To qualify. Comparing the envelope sequences shows that MLVgp70 differs in their amino terminal domains in the two restricted regions. These are amino acids 50-116 and 170-183. They also differ in proline rich segments, amino acids 244-283. By analogy with avian sarcoma and leukemia virus envelope glycoproteins, where the determinants of receptor interaction were attributed to short hypervariable sequences (Heard and Danos J. Virol. 65: 4026-4032, 1991) One or more of the three hypervariable regions are predicted to contain receptor-bound cells. A defective retroviral vector that introduces a modified E. coli lacZ gene is used to infect cells expressing wild type or modified MuLVE-gp70. Susceptibility to infection is measured by counting X-Gal positive focus.
The ecotropic envelope N-terminal domain vector is transiently transfected into monkey Cos-7 cells expressing the exogenous mouse ecotropic retroviral receptor gene (Albr-itton et al., 1989). Since the pSG5 vector uses the early SV40 eukaryotic promoter, Cos cells (which express the T antigen gene) allow high levels of env gene expression (Gluzman, 1981). Transfected cells are infected with the ecotropic pseudotype ψCRE / BAG (ATCC CRL 1850) virus particles (Price et al., 1987) and the number of β-galactosidase (gal) foci is analyzed. Modified env fragments that reduce the number of β-gal foci are further examined for their ability to interact with ERR.
1.Transfection of ERR gene into Cos-7 cells
The ERR gene is cloned into pcDNA / neo expression vector (Invitrogen)_FourCos-7 cells were transfected by the method (Stratagene). It has been found that Cos-7 cells can produce high titer MuLV retroviruses (Landau and Littman, 1992). Transfected cells are selected for neomycin resistance to 500 μg / ml G418. Resistant clones are tested for their ability to be infected by ΨCRE / BAG virions (Price et al., 1987). Cells are fixed with 0.5% glutaraldehyde in physiological buffered saline and stained with a histochemical solution containing 1 mg / ml X-gal (Sanes et al., 1986). Cells with the largest number of β-gal foci are used for interference assays.
2.Modified env inheritance to further review receptor binding sequences Child building
This experiment determines the smallest N-terminal fragment that blocks ecotropic virus infection. The gp70 gene from Akv endogenous mouse leukemia virus is used for these studies. The Akv genome can produce active virus particles and the env sequence has been determined (Lenz et al., 1982).
The complete gp70 gene contained between the Acc I and Xba I restriction sites is cloned into a psG5 eukaryotic expression vector (Stratagene). In addition, a fragment of the env gene is cloned to produce the following N-terminal peptide. The Acc1 / Alul 247 aa fragment gives the result of Hard and Danos (1991) and functionally blocks infection. Of particular interest is the 122aa Acc1 / Sma 1 fragment containing a region thought to determine receptor binding specificity (Battini et al., 1992).
3.Interference assay of modified env gene constructs
The recombinant env gene construct is transiently transfected into Cos-7 cells containing mouse ERR. This system is expected to eliminate potential problems caused by endogenous env transcripts that may be present in mouse cells. Cos cells are expected to allow high expression of an expression plasmid containing the SV40 promoter (Gl-uzman, 1981). Cells are transfected by the DEAE dextran method according to the Stratagene protocol. Approximately 48 hours after env gene transfection, 2x10^FiveCells in 6-well culture dishes and 10 according to the method of Hard and Danos (1991) in the presence of 8 μg polybrene / ml.²~Ten^ThreeInfect ΨCRE / BAG virus particles. After the cells have grown to confluence, they are fixed in 0.5% glutaraldehyde in PBS and stained with a histochemical solution (sanes et al., 1986) containing 1 mg / ml X-gal. The number of β-gal foci is evaluated against cells transfected with pSG5 vector alone. It is expected that a reduced number of β-gal foci will be assessed against cells transfected with pSG5 vector alone. The reduced number of β-gal foci indicates that the transfected env construct can probably bind ERR and block virion interactions.
Four. Analysis of modified env biosynthesis in transfected cells
Protein analysis is performed to determine whether the recombinant env gene product is produced by the transfected cells. Cells³⁵With S-methionine³⁵Metabolic labeling with a mixture of S cysteines (ICN). This is because the env protein is relatively rich in cysteine residues in the target region. After labeling for 30-60 minutes, the cells are pelleted and both pellet and supernatant are for immunoprecipitation by polyclonal goat anti-Rauscher gp70 antibody (NIH repository) or non-mouse serum followed by S.aureausA cells To process. Immunoprecipitates are analyzed on SDS-polyacrylamide gels. The absence of immunoprecipitated protein is expected to mean that the env protein is degraded or cannot be recognized by anti-gp70 antibodies. In this phenomenon, the presence of env RNA transcripts is determined by extracting total RNA from the transfected cells followed by Northern blot analysis using the AKv env sequence probe. Fragments that can be detected by immunoprecipitation and block ψCRE / BAG virion infection are used in yet another embodiment and method of the invention.
5.1Mutation of modified env fragment
The DNA sequences of several ecotropic and non-ecotropic retroviral gp70 genes were determined. Comparison of these sequences will suggest regions that are important for receptor interaction. For example, FIG. 19 shows a comparison of three ecotropic and non-ecotropic gp70 amino acid sequences within the N-terminal region that are thought to be involved in receptor specificity. Three ecotropic retroviruses show strong sequence homology. There are considerable differences between ecotropic and non-ecotropic sequences, with the most notable difference being a gap of about 30 amino acids present at positions 68-97 (Battini et al., 1992). This region may contain ecotropic binding sites, but may confer different conformations to different subgroups of retroviruses.
Once a limited region of the N-terminal env protein is found to block virus-receptor interactions, amino acids can be systematically modified to identify important residues. The mutagenic oligonucleotides are then used for in vitro mutagenesis and the Promega pSelected (pAlter) system (Yoshimoto et al., 1993) previously described for modification of ERR.
If the position of the receptor binding domain cannot be restricted so that it is feasible to produce point mutations, deletion or chimeric molecules between restriction gp70 regions of different viral subgroups are created.
a) Criteria and protocol for generation of deletion mutants
1. Digestion with an enzyme having a site in the region of interest and relatively few other regions in the recombinant plasmid.
2. If the reading frame is changed, gradually remove nucleotides using exonuclease III.
3. Create blunt ends using S1 nuclease (13). The deleted molecule is ligated and transformed.
4. Sequencing deleted clones to find one that maintains an accurate reading frame.
For example (Figure 20), 163 bpSmaOne fragment is present in the variable region of the Akv env N-terminal sequence (Lenz et al., 1992) (404 bp, 567 bp). This fragment contains 30 amino acids deleted from the amphotropic sequence (FIGS. 19 and 20). Simple removal of this sequence will result in inaccurate reading frames. What if oneSmaThis is because one site (404 bp) lacks one nucleotide of the amino acid triplet.
b) Making the insert
Insertion of specific sequences is performed using the polymerase chain reaction (PCR) that amplifies the sequence of interest according to standard protocols (Sambrook, supra; Ausubel, supra). PCR primers are designed to maintain an appropriate reading frame for the env protein.
For example, insertion of the ecotropic virus 30 amino acid region into the amphotropic virus sequence is performed by the following steps.
1. Digestion of the amphotropic env sequence with Rsal at position 325 results in a blunt end site and separates the first nucleotide (T) from the second and third nucleotides (A, C) of the amino acid codon for tyrosine.
2. To insert an ecotropic sequence, synthesize a primer containing an additional AC at the 5 ′ end to retain the tyrosine residue. A tyrosine residue is added and a 3 ′ primer with an additional T at its 5 ′ end that retains the open reading frame is synthesized. The proposed primer positions relative to the Akv sequence are shown in Table III.

Following PCR, the product is treated on a 2% agarose gel to excise a 90 bp fragment, purify, and link to an amphotropic env sequence at the Rsal site. The sequence of the recombinant clone is determined to determine the correct orientation of the PCR fragment.
7.Identification of viral envelope sequence binding C1q
It has been proposed that the gp70 molecule has a domain similar to the C1q recognition site of immunoglobulin Fc fragments. If this is correct, and if this region is in an unnecessary part of the molecule for virus binding and entry, then removal and replacement will result in serum oncornavirus lysis for direct in vivo use of retroviral vectors for gene therapy. It is expected to reduce the potential impact of activity (SOLA). To identify amino acid residues important for C1q binding, MuLVE by in-frame deletion and by oligonucleotide-induced mutagenesis if the domain is similar to the C1q recognition site of an immunoglobulin Fc fragment. -Modify gp70. Once C1q recognition has been identified, we will attempt to construct a modified MuLVE-gp70env gene with this region replaced by a non-C1q binding sequence.
To analyze for serum SOLA activity and virus sensitivity, sucrose fractionated and purified cloned radiation leukemia virus was diluted to a standardized concentration in PBS and at least 100,000 cpm was our standard reversal Allow detection by the photoenzyme assay (Brown et al., 1990). Various dilutions of human serum are added to the virus preparation and incubated for 30 minutes under normal laboratory lighting conditions. Control samples are treated with 0.5% Triton X-100 (Sigma). All samples are then analyzed for RT activity as previously described (Meruelo et al., 1988).
All references cited in this specification, including journals or abstracts, published or equivalent US or foreign patent applications, issued US or foreign patents, or any other document, are indicated in the cited references. Including all data, tables, figures, and text, and are incorporated herein by reference in their entirety. Furthermore, the contents of the documents cited in the documents cited in this specification are also incorporated as references.
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The foregoing description of specific embodiments applies the knowledge of those skilled in the art (including the contents of the references cited herein) to allow the person skilled in the art to carry out the present invention without undue experimentation. Without departing from the overall concept of the invention, it will be apparent that the general features of the present invention are sufficient to readily improve such specific embodiments and / or be employed in various applications. . Therefore, such applications and improvements are intended to be included within the meaning and scope of the equivalents of the disclosed embodiments based on the teachings and guidance presented herein. It should be understood that the expressions or terms herein are for purposes of illustration and not limitation, and therefore such terms or expressions are in light of the teachings and guidance provided herein. Should be interpreted by those skilled in the art.
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Claims (25)

At least one binding wherein a human receptor polypeptide comprising a binding site of amino acid residues 210-250 of SEQ ID NO: 8 to a human specific virus binds to a viral env binding domain of a virus specific to a non-human species it a chimeric cell virus receptor polypeptide, characterized in that has been modified to include a site, the modified binding site, specific for a species other than the human to the chimeric cell virus receptor polypeptide confer binding activity to viral env binding domain of a virus, at least a first amino acid residue and a second amino acid residue is Dressings containing, the chimeric cell virus receptor polypeptide. Non-human species are mice or hamsters The chimeric receptor polypeptide of claim 1, wherein: Have at least 80% homology to the amino acid residues 210 to 250 of SEQ ID NO: 8, and comprising a binding site capable of binding a specific virus human, chimeric receptor of claim 1 or 2 Polypeptide. The homology is at least 95% Item 4. A chimeric receptor polypeptide according to Item 3. Virus virus specific to non-human species At least one binding site that binds to the env binding domain Any of claims 1 to 4, wherein the position is a binding site for an ERR receptor A chimeric receptor polypeptide according to any one of the preceding claims. The human receptor polypeptide is SEQ ID NO: 8 And having at least the first sequence of SEQ ID NO: 8 The amino acid residue and the second amino acid residue are modified Here, the first amino acid residue is Pro242 of SEQ ID NO: 8. And the second amino acid residue is Val244, Gl of SEQ ID NO: 8 Amy selected from the group consisting of u239, Gly240 and Gly225 The texture according to any one of claims 1 to 5, which is a noic acid. La receptor polypeptide. Modification of the first amino acid residue is SEQ ID NO: 8 The chimera of claim 6 comprising a modification of Pro242 to Tyr. Receptor polypeptide. Modification of the second amino acid residue is SEQ ID NO: 8 From modification of Gly240 to Val or modification of Val244 to Glu The chimeric receptor polypeptide according to claim 6, which is selected. De. Mouse receptor polypeptide comprising a binding site of the amino acid residues 210-242 of SEQ ID NO 4 for specific virus mouse, at least one of which binds to viral env binding domain of a specific virus species other than mice it a chimeric cell virus receptor polypeptide, characterized in that has been modified to contain a binding site, the modified binding site, specific for a species other than the mouse to the chimeric cell virus receptor polypeptide A chimeric cell virus receptor polypeptide as described above , comprising at least a first amino acid residue and a second amino acid residue conferring binding activity on the viral env binding domain of a typical virus . Species other than mice are human or hamster The chimeric receptor polypeptide of claim 9, wherein Paired with amino acid residues 210 to 242 of SEQ ID NO: 4 At least 80% homology and specific to mice 10. A binding site capable of binding to a typical virus. Or a chimeric receptor polypeptide according to 10; The homology is at least 95%. 12. A chimeric receptor polypeptide according to claim 11. Viruses specific to species other than mice At least one binding that binds to the ILs env binding domain The binding site is a binding site of H13 protein. 3. The chimeric receptor polypeptide according to any one of 2. A method of making a eukaryotic cell or tissue susceptible to binding by a viral env binding domain of a virus specific to a non-human species , comprising:
(A) the eukaryotic cell or tissue is in vitro or in vivo or in situ in a non-human organism with a nucleic acid encoding the chimeric receptor polypeptide of any one of claims 1-8. Transformed to create a chimeric receptor cell or tissue, and (b) at least one binding site of the chimeric receptor polypeptide is expressed by the chimeric cell virus receptor cell and is specific for a non-human species . Conditions that allow it to bind to the virus en v binding domain of any virus,
A method involving that. A method of making a eukaryotic cell or tissue susceptible to binding by a viral env binding domain of a virus specific for a species other than a mouse , comprising:
(A) the eukaryotic cell or tissue is in vitro or in vivo or in situ in a non-human organism with a nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide according to any one of claims 9-13. Transformed to produce a chimeric receptor cell or tissue, and (b) at least one binding site of the chimeric receptor polypeptide is expressed by the chimeric cell virus receptor cell and is specific for a species other than a mouse. Granting conditions that allow it to bind to the viral env binding domain of any virus,
A method involving that. The chimeric receptor cell or tissue produced by the method according to claim 14 or 15 , wherein the eukaryotic cell or tissue is derived from a non-human mammal, insect, bird or yeast. 17. The chimeric receptor cell of claim 16 , wherein the non-human mammalian cell or tissue is from a primate, hamster, rabbit, rodent, cow, pig, sheep, horse, goat, dog, or cat. Or organization . A method of delivering at least one therapeutic or diagnostic agent to a chimeric receptor cell or tissue, comprising:
(A) preparing a chimeric receptor cell or tissue according to claim 16 or 17 ,
(B) the chimeric receptor cell or tissue is in vitro, or in vivo or in situ in a non-human organism, the viral env binding domain and at least one species specific for a species other than a human or a species other than a mouse A delivery vector comprising a therapeutic agent or a diagnostic agent, wherein the delivery vector binds to the chimeric receptor cell or tissue and the therapeutic agent or diagnostic agent treats or treats the chimeric receptor cell or tissue. To have a diagnostic effect,
A method that consists of things. The therapeutic agent is a therapeutic nucleic acid, and the therapeutic effect on the chimeric receptor cell or tissue (i) prevents transcription of the DNA sequence;
(Ii) blocking the translation of RNA sequences;
(Iii) blocking reverse transcription of RNA or DNA sequences;
(Iv) blocking post-translational modification of proteins;
(V) inducing transcription of the DNA sequence;
(Vi) inducing translation of RNA sequences;
(Vii) inducing reverse transcription of RNA or DNA sequences;
(Viii) inducing post-translational modification of the protein;
(Ix) transcription of the nucleic acid as RNA;
(X) translating the nucleic acid as a protein, and (xi) integrating the nucleic acid into the chromosome of the chimeric receptor cell or tissue ;
19. The method of claim 18 , wherein the method is selected from the group consisting of: A transgenic non-human mammal comprising a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a chimeric receptor polypeptide according to any one of claims 1 to 13 , wherein substantially all germ cells and somatic cells. A nucleic acid encoding a chimeric receptor polypeptide according to any one of claims 1 to 13, wherein the chimeric receptor polypeptide, modifications Pro242 within Tyr at amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 are, have either one Gly240 is amino acid sequence Val244 or Val is modified Glu, those having the nucleic acid sequence the nucleic acid, nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 has been modified The nucleic acid . A chimeric receptor cell or tissue produced by transforming a eukaryotic cell or tissue in vitro with the nucleic acid of claim 21 , wherein the eukaryotic cell or tissue is a mammal, insect, bird or The chimeric receptor cell or tissue, which is derived from yeast. Mammalian cells or tissues, human, primate, hamster, rabbit, rodent, cow, pig, sheep, horse, goat, is derived from a dog or a cat, a chimeric receptor cells or tissue of claim 22, wherein . A delivery vector comprising a viral env binding domain specific for a non-human species for exerting a therapeutic or diagnostic effect on a chimeric receptor cell or tissue, and at least one therapeutic or diagnostic agent comprising: A delivery vector has the ability to bind to the chimeric receptor cell or tissue, the chimeric cell or tissue
(A) transformed in vitro, in vivo, or in situ using a nucleic acid encoding the chimeric receptor polypeptide according to any one of claims 1 to 8 ,
(B) expression of at least one binding site of the chimeric receptor polypeptide is possible,
(C) capable of binding to a viral env binding domain of a virus specific for a non-human species , and (d) derived from a mammal, insect, bird or yeast,
The transport vector. The therapeutic agent is a therapeutic nucleic acid, and the therapeutic effect on the chimeric receptor cell or tissue (i) prevents transcription of the DNA sequence;
(Ii) blocking the translation of RNA sequences;
(Iii) blocking reverse transcription of RNA or DNA sequences;
(Iv) blocking post-translational modification of proteins;
(V) inducing transcription of the DNA sequence;
(Vi) inducing translation of RNA sequences;
(Vii) inducing reverse transcription of RNA or DNA sequences;
(Viii) inducing post-translational modification of the protein;
(Ix) transcription of the nucleic acid as RNA;
(X) translating the nucleic acid as a protein, and (xi) integrating the nucleic acid into the chromosome of the chimeric receptor cell or tissue ;
25. A delivery vector according to claim 24 , selected from the group consisting of:

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