JP3614485B2

JP3614485B2 - Method for quantifying cholesterol in lipoprotein fractions

Info

Publication number: JP3614485B2
Application number: JP31883594A
Authority: JP
Inventors: 吉史渡津; 泰史白波瀬; 正光高橋; 浩司岸
Original assignee: 国際試薬株式会社
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 2005-01-26
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: JPH08131195A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、主として臨床検査の分野での使用を目的とし、血清中のリポ蛋白の特定分画中のコレステロールを定量すること、特に自動分析装置で直接定量することに関する。
【０００２】
【発明の背景】
臨床検査において動脈硬化性疾患と関連性の深い診断的指標として、従来からコレステロールが知られており、血清中のリポ蛋白分画のうちで高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）分画中のものが注目されている（渡辺富久子他，臨床病理，２８，５９〜６２，１９８０）。一方、一般の検査値が正常であっても冠動脈硬化症を発症した症例が多いことから、近年では低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）やレムナント様リポ蛋白（ＲＬＰ）分画が注目されるようになった（中嶋克行，動脈効果，２０，７９〜８８，１９９２）。
【０００３】
【従来の技術】
従来、リポ蛋白分画中のコレステロールを定量するにはリポ蛋白を超遠心、電気泳動、ゲル濾過、凝集などの方法で分画した後、測定すべき分画中のコレステロールを公知の方法で定量していた。
【０００４】
しかるに、このような方法は臨床検査の分野では種々の問題があった。即ち、超遠心法、電気泳動法、ゲル濾過法などは操作が煩雑で長時間かかり、熟練を要するなど臨床検査の日常業務には不適当とされている。また凝集法は、凝集を形成後、遠心分離操作で上清を分取するので、短時間に多数の検体を取り扱うことができず、自動分析装置を用いて測定することが困難である。更に、検体に直接手を触れる機会が多いためウイルス感染の危険性も無視できない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、このような従来の方法を改良し、血清中のリポ蛋白の特定分画中のコレステロールの測定が臨床検査の日常業務として自動分析装置で直接実施できる方法を提供し、もって臨床検査の分野に寄与することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが鋭意研究した結果、前述の凝集法が自動分析装置での測定に適応できないのは、凝集により生じた濁りが呈色反応に影響してブランク値を上昇させるためであることに着目した。
【０００７】
従来のコレステロールの定量法は、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼを用いて生じた過酸化水素を、色素形成による呈色として終点測定するものである（Ｃ．Ｃ．Ａｌｌａｉｎ，Ｌ．Ｓ．Ｐｏｏｎ，ｅｔａｌ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０，４７０，１９７４）。従って、濁りの影響を避けるために、遠心分離して凝集物を除去したり、場合によっては凝集を溶解することが必要であった。
【０００８】
そこで本発明者らは更に研究を重ねた結果、コレステロールの定量にコレステロールエステラーゼと共にコレステロール脱水素酵素を用いて、反応初速度を測定することにより、濁りの影響を受けることなくコレステロールを定量できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、血清中のリポ蛋白の特定リポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法であって、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を反応系におき、生成した還元型補酵素の吸収波長に基づく吸光度の増加速度を測定することを特徴とするリポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法である。
【００１０】
本発明で血清中のリポ蛋白の特定分画を抽出するために、特定分画以外のリポ蛋白の分画を凝集させる方法としては、本発明の目的を達成できる公知の方法は全て用いることができる。例えばＨＤＬ分画中のコレステロールを定量するために、ＨＤＬ分画以外のリポ蛋白の分画を凝集させるには、デキストラン硫酸、ヘパリン、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、リンタングステン酸、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ショ糖（シュークロース；Ｓｕｃｒｏｓｅ）及びこれらの塩などの化合物を単独または複数用いるか、更にこれら化合物にＭｇ^＋＋、Ｍｎ^＋＋、Ｃａ^＋＋、Ｌｉ^＋＋などの二価の金属を組み合わせたものを凝集剤として使用することができる。特に、ＨＤＬ分画以外のリポ蛋白の分画を凝集させる凝集剤としては、ＰＥＧ、リンタングステン酸及びＭｇ^＋＋を含み、さらにＢＳＡ及び／又はショ糖を含む組み合わせが好ましい。例えば、５〜２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ、０．４〜２％（ｗ／ｖ）のリンタングステン酸及び１〜１０ｍＭのＭｇ^＋＋を含み、さらに０．１〜５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ及び／又は１〜５％（ｗ／ｖ）のショ糖を含む凝集剤が例示される。
【００１１】
また、同じ目的でアポＢ、アポＣ、β−リポ蛋白などに対する抗体を用いることもできる。これら抗体は単独又は複数を使用することができ、更に上記の如き凝集剤に加えることもできる。
【００１２】
このようにして凝集剤、抗体を血清検体に加えることによって、測定すべき特定分画以外のリポ蛋白分画は凝集して濁りを生じる。ここにコレステロールエステラーゼと共にコレステロール脱水素酵素を直接反応させると、反応初速度として測定ができ、リポ蛋白の特定分画中のコレステロールが定量できる。
【００１３】
本発明でコレステロールエステラーゼの反応は下記で表される。
【００１４】
【化１】

【００１５】
コレステロールエステラーゼの濃度は、０．０１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０Ｕ／ｍｌであるが、その量は検体の種類などにより適宜決定することができる。コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）については、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）活性を含むものが好ましい。
【００１６】
更に、コレステロール脱水素酵素の反応は下記で表される。
【００１７】
【化２】

【００１８】
ここで補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（チオＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドフォスフェート、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドフォスフェート、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドフォスフェートなどがある。
【００１９】
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、コレステロールを基質にして可逆反応によりΔ４−コレステノンを生成する酵素であればいずれも好適に用いられ、例えば、ＮＡＤ依存性コレステロール脱水素酵素、ＮＡＤＰ依存性コレステロール脱水素酵素など公知のものが挙げられる。
【００２０】
酸化型補酵素の濃度は、０．０２〜１００ｍＭ、好ましくは０．０５〜３０ｍＭであり、コレステロール脱水素酵素の濃度は、０．０５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌであるが、検体の種類などに応じて適宜決定される。
【００２１】
本発明における反応初速度は、酸化型補酵素が還元型に変換されるときの紫外領域における吸光度の増加速度として測定することができる。即ち、反応開始一定時間経過後の２点間の数〜数十分間における、使用する補酵素の吸収波長に基づく吸光度の変化、例えば、ＮＡＤやＮＡＤＰでは波長３４０ｎｍの吸光度、チオＮＡＤやチオＮＡＤＰでは波長４１５ｎｍの吸光度の変化を測定する。
【００２２】
本発明方法では、コレステロール脱水素酵素の反応に補酵素のサイクリング反応を組み合わせることにより、更に測定感度を増大させることができる。
【００２３】
本発明におけるサイクリング反応は、自体公知の反応であり、公知の報告（特開平３−２２４４９８号公報など）が利用でき、サイクリング反応で組み合わせた補酵素の変化量を反応初速度として測定する。補酵素としては、上述のものが使用できるが、組み合わせる際には、それぞれ測定条件（吸収波長など）の異なるものを選ぶことにより検出が容易となる。例えば、ＮＡＤとチオＮＡＤとの組合せを選んだ場合、それぞれの還元型の極大吸収の波長が異なるので、上述のようにいずれかの波長で反応初速度を測ることにより、コレステロールの定量ができる。
【００２４】
サイクリング反応を組み合わせる場合のコレステロール脱水素酵素の反応は、下記に示される。
【００２５】
【化３】

【００２６】
酸化型補酵素（ａ）及び還元型補酵素（ｂ）の濃度は、それぞれ０．０２〜１００ｍＭ、好ましくは０．０５〜３０ｍＭであり、コレステロール脱水素酵素の濃度は、０．０５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌであるが、検体の種類などに応じて適宜決定される。
【００２７】
本発明では、下記に示すように他の脱水素酵素（Ａ）を組み合わせることができる。
【００２８】
【化４】

【００２９】
脱水素酵素（Ａ）は、酸化型補酵素（ｂ）及びコレステロールに作用せず、補酵素（ａ）を還元型に変換させる脱水素酵素であり、還元型補酵素（ａ）を再生するために添加される。脱水素酵素（Ａ）を用いることによって、還元型補酵素（ａ）の添加量を少なくすることが可能となり、還元型補酵素（ａ）を添加せずに、あるいは補酵素（ａ）の酸化型と還元型との混合物を添加することによって、反応が進行する。
【００３０】
脱水素酵素（Ａ）及びその基質としては、例えば酸化型補酵素（ａ）がＮＡＤ類の酸化型である場合、アルコールデヒドロゲナーゼとエタノール又はアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼとグリセロール又はジヒドロキシアセトン、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼとＬ−グリセロール−３−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとＬ−リンゴ酸又はオキザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼとＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸又は１，３−ジフォスフォ−Ｄ−グリセリン酸、酸化型補酵素（ａ）がチオＮＡＤＰ類又はＮＡＤＰ類の酸化型である場合、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸又はグルコノラクトン−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼとイソクエン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼとＣｏＡとグリオキシル酸、フォスフォグルコン酸デヒドロゲナーゼと６−フォスフォ−Ｄ−グリコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼとＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸又は１，３−ジフォスフォ−Ｄ−グリセリン酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼとベンズアルデヒドなどを用いることができる。
【００３１】
脱水素酵素（Ａ）の濃度は、酸化型補酵素（ａ）に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（Ｕ／ｍｌ単位）以上、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌである。また、脱水素酵素（Ａ）の基質の濃度は、０．０５〜２０ｍＭが好ましい。脱水素酵素（Ａ）を用いた場合、還元型補酵素（ｂ）の生成量を測定することによって、コレステロールの定量を行うことができる。
【００３２】
本発明方法では、コレステロール脱水素酵素の反応に、下記に示すような反応式のテトラゾリウム塩を還元する反応を組み合わせ、生成するフォルマザンの量を、その吸光度の増加を反応初速度として測定することによって、定量することができるので、更に測定感度を増大させることができる。
【００３３】
【化５】

【００３４】
テトラゾリウム塩としては、ＩＮＴ〔３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロライド〕、ＭＴＴ〔３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロマイド〕、Ｎｅｏ−ＴＢ〔３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムクロライド）〕、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ「３，３’−〔３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル〕−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロライド）」、ＴＮＴＢ「３，３’−〔３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル〕−ビス〔２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈテトラゾリウムクロライド〕」、ＴＢ「３，３’−〔３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル〕−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムクロライド）」、ＮＴＢ「３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロライド〕」などを例示することができる。これらのうち例えばＩＮＴを用いた場合、波長４９０ｎｍでの吸光度の増加を反応初速度として測定することができる。
【００３５】
ダイアフォラーゼの濃度は、０．０５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌであり、テトラゾリウム塩の濃度は、０．０２〜１００ｍＭ、好ましくは０．０５〜３０ｍＭであるが、検体の種類などに応じて適宜決定される。
【００３６】
なお、テトラゾリウム塩に代えて、水溶性テトラゾリウム化合物（特公平４−１３３５１号公報参照）、水溶性ジテトラゾリウム化合物（特公平４−１３３５２号公報参照）などを使用することができる。また、ダイアフォラーゼに代えて、メルドラブルー（９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライド）、ＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート）、１−メトキシＰＭＳ（１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート）などの電子キャリヤーを用いることもできる。
【００３７】
さらに、サイクリング反応とテトラゾリウム塩の還元反応とを組み合わせることも好ましい。例えば、下記の反応式に示されるように、コレステロール脱水素酵素に補酵素ＮＡＤを反応させた場合、生成したＮＡＤＨ（還元型ＮＡＤ）を公知のＮＡＤＨキナーゼを用いてリン酸化し、生成したＮＡＤＰＨ（還元型ＮＡＤＰ）をＧ−６−ＰＤＨ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）を用いたＮＡＤＰＨのサイクリング反応に付して、フォルマザンの生成速度を測定する方法（特開平４−２５２２００号公報参照）でコレステロールを定量することもできる。
【００３８】
【化６】

【００３９】
このように、本発明方法にサイクリング反応及び／又はテトラゾリウム塩の還元反応を組み合わせることにより、コレステロールの測定感度を増大させることが可能となり、その結果、微量の検体でもそのリポ蛋白中の特定分画中のコレステロールを定量することができる。
【００４０】
検体が微量であれば、反応初速度を測定する際の初期吸光度を低くすることができるので、実質的な測定範囲を拡大することができる。さらに、検体が微量でも良いということ自体が、小児や老人など採血量に制限がある場合にも有利である。
【００４１】
【発明の効果】
本発明方法によれば、血清中のリポ蛋白の特定分画を分離するために、特定分画以外のリポ蛋白分画を凝集させ、その際に生じた濁りをそのままの状態にして、直接その特定分画中のコレステロールを定量することができる。その結果、従来、凝集法において必要とされていた遠心分離の操作が不要となるので、多数の検体を短時間で処理できるようになり、臨床検査の日常業務において自動分析装置を用いた測定が可能となる。
【００４２】
また、検体を扱う上で、検体に直接手を触れる機会が著しく減少するので、ウイルス感染の危険性も減少できる。さらに、検体量を微量にすることができるので、小児や老人など採血量に制限がある場合でも測定が可能となる。従って、本発明方法は、臨床検査の分野において極めて有用であり、臨床検査の日常業務における作業効率の向上に貢献することができる。
【００４３】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例及び比較例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕
血清５μｌと、５０ｍＭのＢＥＳ〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸〕−ＢｉｓＴｒｉｓ〔ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン〕緩衝液（ｐＨ７．０）中に、５ｍＭのＭｇＣｌ_２，１２％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００），１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ，０．５％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸ナトリウム，１．０ｍＭのＮＡＤ及び０．１ｍＭのＮＴＢを含む第１試薬２５０μｌとを混和して５分間加温後、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中に１２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４０００，２．５Ｕ／ｍｌのＣＥ，１３．５Ｕ／ｍｌのＣｈＤＨ（コレステロールデヒドロゲナーゼ），１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ及び２．５Ｕ／ｍｌのダイアフォラーゼを含む第２試薬１００μｌを添加して、残存するＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄｌ）を５４０ｎｍにおける吸光度量を測定することによって求めた。
【００４５】
既知の血清を参考にして、ヒト血清１０例を測定した結果と、従来の方法〔ポリエチレングリコールによる沈殿法（製品名「ＨＤＬ−コレス（ＰＧ）」，国際試薬社製）〕とを比較し、その結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】

【００４７】
ｙ＝０．９５５ｘ＋１４．２６Ｒ＝０．９５６
ｘ：従来法による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
ｙ：実施例１による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
Ｒ：相関係数
【００４８】
〔実施例２〕
血清５μｌと、５０ｍＭのＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中に５ｍＭのＭｇＣｌ_２，１２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４０００，１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ，０．５％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸ナトリウム，１．０ｍＭのＮＡＤ及び０．１ｍＭのＮＴＢを含む第１試薬２５０μｌとを混和して５分間加温後、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中に１２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４０００，３．５Ｕ／ｍｌのＣＥ，１．０Ｕ／ｍｌのＣｈＤＨ，２．５Ｕ／ｍｌのダイアフォラーゼ，２．５Ｕ／ｍｌのＮＡＤＨキナーゼ及び２．５Ｕ／ｍｌのＧ−６−ＰＤＨを含む第２試薬１００μｌを添加して、残存するＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄｌ）を５４０ｎｍにおける吸光度量を測定することによって求めた。
【００４９】
既知の血清を参考にして、ヒト血清１０例を測定した結果と、実施例１における従来法とを比較し、その結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】

【００５１】
ｙ＝０．７７４ｘ＋１９．９４Ｒ＝０．９７８
ｘ：従来法による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
ｙ：実施例２による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
Ｒ：相関係数
【００５２】
〔実施例３〕
血清５μｌと、５０ｍＭのＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中に５ｍＭのＭｇＣｌ_２，１２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４０００，１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ，０．５％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸ナトリウム及び１．２５ｍＭのチオＮＡＤを含む第１試薬２５０μｌとを混和して５分間加温後、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中に１２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４０００，２．５Ｕ／ｍｌのＣＥ，１Ｕ／ｍｌのＣｈＤＨ，１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ及び３．５ｍＭのＮＡＤＨを含む第２試薬１００μｌを添加して、残存するＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄｌ）を４０５ｎｍにおける吸光度量を測定することによって求めた。
【００５３】
既知の血清を参考にして、ヒト血清１５例を測定した結果と、実施例１における従来法とを比較し、その結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】

【００５５】
ｙ＝０．８６５ｘ＋１５．８１Ｒ＝０．９４１
ｘ：従来法による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
ｙ：実施例３による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
Ｒ：相関係数
【００５６】
〔実施例４〕
血清３μｌと、５０ｍＭのＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中に５ｍＭのＭｇＣｌ_２，１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−４０００，１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ，０．５％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸ナトリウム，０．７％（ｗ／ｖ）のショ糖及び１．２５ｍＭのチオＮＡＤを含む第１試薬２５０μｌとを混和して５分間加温後、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中に、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ，０．７％（ｗ／ｖ）のショ糖，４０Ｕ／ｍｌのＣＥ（ＬＰＬ活性を含むもの），２０Ｕ／ｍｌのＣｈＤＨ及び３．５ｍＭのＮＡＤＨを含む第２試薬１００μｌを添加して、残存するＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄｌ）を４０５ｎｍにおける吸光度量を測定することによって求めた。
【００５７】
既知の血清を参考にして、ヒト血清１５例を測定した結果と、実施例１における従来法とを比較し、その結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】

【００５９】
ｙ＝０．９５６ｘ＋１．８６７Ｒ＝０．９９２
ｘ：従来法による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
ｙ：実施例４による値（単位：ｍｇ／ｄｌ）
Ｒ：相関係数
【００６０】
以上の実施例１〜４の結果から、本発明方法は従来の方法と相関関係が良好であり、リポ蛋白のＨＤＬ分画中のコレステロールを精度良く定量できることが分かる。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention is mainly intended for use in the field of clinical examinations, and relates to the quantification of cholesterol in a specific fraction of lipoproteins in serum, particularly the direct quantification with an automatic analyzer.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Cholesterol has been conventionally known as a diagnostic index closely related to arteriosclerotic diseases in clinical examinations, and attention is focused on high-density lipoprotein (HDL) fractions among serum lipoprotein fractions. (Tomiko Watanabe et al., Clinical Pathology, 28, 59-62, 1980). On the other hand, since there are many cases in which coronary sclerosis has developed even if the general test values are normal, in recent years, low-density lipoprotein (LDL) and remnant-like lipoprotein (RLP) fractions have been attracting attention. (Katsuyuki Nakajima, Arterial effect, 20, 79-88, 1992).
[0003]
[Prior art]
Conventionally, to quantify cholesterol in lipoprotein fractions, lipoproteins are fractionated by methods such as ultracentrifugation, electrophoresis, gel filtration, and aggregation, and then cholesterol in fractions to be measured is quantified by known methods. Was.
[0004]
However, such a method has various problems in the field of clinical examination. That is, ultracentrifugation, electrophoresis, gel filtration and the like are not suitable for daily clinical examination because they are complicated and require a long time and require skill. In the agglutination method, after the agglutination is formed, the supernatant is fractionated by centrifugation, so that a large number of specimens cannot be handled in a short time, and it is difficult to measure using an automatic analyzer. Furthermore, since there are many opportunities to touch the specimen directly, the risk of virus infection cannot be ignored.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to improve such a conventional method and provide a method in which the measurement of cholesterol in a specific fraction of lipoprotein in serum can be directly carried out by an automatic analyzer as a daily routine of clinical tests. To contribute to the field of clinical testing.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies by the present inventors, the reason why the above-described aggregation method cannot be applied to the measurement with an automatic analyzer is that the turbidity caused by the aggregation affects the color reaction and increases the blank value. Pay attention.
[0007]
A conventional method for quantifying cholesterol is to measure the end point of hydrogen peroxide produced using cholesterol esterase and cholesterol oxidase as coloration due to pigment formation (CC Allain, L.S. Poon, et al.). : Clin. Chem. 20, 470, 1974). Therefore, in order to avoid the influence of turbidity, it was necessary to remove the aggregates by centrifugation, or to dissolve the aggregates in some cases.
[0008]
Therefore, as a result of further research, the present inventors have found that cholesterol can be quantified without being affected by turbidity by measuring the initial reaction rate using cholesterol dehydrogenase together with cholesterol esterase for the quantification of cholesterol. The present invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention relates to a method for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein fraction of lipoprotein in serum, wherein cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme are placed in a reaction system, and the produced reduced coenzyme is absorbed. It is a method for quantifying cholesterol in a lipoprotein fraction, characterized by measuring the rate of increase in absorbance based on wavelength.
[0010]
In order to extract a specific fraction of lipoprotein in serum in the present invention, all known methods that can achieve the object of the present invention can be used as a method of aggregating a fraction of lipoprotein other than the specific fraction. it can. For example, in order to quantitate cholesterol in the HDL fraction, dextran sulfate, heparin, PEG (polyethylene glycol), phosphotungstic acid, BSA (bovine serum albumin) are used to aggregate the lipoprotein fraction other than the HDL fraction. , Sucrose (Sucrose) and a salt thereof, alone or in combination, or a combination of these compounds with a combination of divalent metals such as Mg ⁺⁺ , Mn ⁺⁺ , Ca ⁺⁺ , Li ⁺⁺ It can be used as an agent. In particular, as an aggregating agent for aggregating a lipoprotein fraction other than the HDL fraction, a combination containing PEG, phosphotungstic acid and Mg ⁺⁺ , and further containing BSA and / or sucrose is preferable. For example, containing 5-20% (w / v) PEG, 0.4-2% (w / v) phosphotungstic acid and 1-10 mM Mg ⁺⁺ , further 0.1-5% (w / v ) Of BSA and / or 1-5% (w / v) sucrose.
[0011]
For the same purpose, antibodies against Apo B, Apo C, β-lipoprotein, etc. can also be used. These antibodies can be used alone or in combination, and can also be added to the aggregating agent as described above.
[0012]
By adding the aggregating agent and antibody to the serum specimen in this way, the lipoprotein fraction other than the specific fraction to be measured aggregates and becomes turbid. When cholesterol dehydrogenase is reacted directly with cholesterol esterase, the initial reaction rate can be measured, and cholesterol in a specific fraction of lipoprotein can be quantified.
[0013]
In the present invention, the reaction of cholesterol esterase is expressed as follows.
[0014]
[Chemical 1]

[0015]
The concentration of cholesterol esterase is 0.01 to 100 U / ml, preferably 0.5 to 50 U / ml, but the amount can be appropriately determined depending on the type of specimen. As for cholesterol esterase (CE), those containing lipoprotein lipase (LPL) activity are preferred.
[0016]
Furthermore, the reaction of cholesterol dehydrogenase is expressed as follows.
[0017]
[Chemical 2]

[0018]
Here, as a coenzyme, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), thionicotinamide adenine dinucleotide (thio NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate (thio NADP) Acetylpyridine adenine dinucleotide, acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate, thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide, thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate, etc. is there.
[0019]
As the cholesterol dehydrogenase in the present invention, any enzyme that produces Δ4-cholestenone by reversible reaction using cholesterol as a substrate is preferably used. For example, NAD-dependent cholesterol dehydrogenase, NADP-dependent cholesterol Well-known things, such as a dehydrogenase, are mentioned.
[0020]
The concentration of oxidized coenzyme is 0.02 to 100 mM, preferably 0.05 to 30 mM, and the concentration of cholesterol dehydrogenase is 0.05 to 100 U / ml, preferably 1 to 50 U / ml. It is determined appropriately according to the type of specimen.
[0021]
The initial reaction rate in the present invention can be measured as the rate of increase in absorbance in the ultraviolet region when oxidized coenzyme is converted to reduced form. That is, the change in absorbance based on the absorption wavelength of the coenzyme used, for example, the absorbance at 340 nm for NAD and NADP, and the thio-NAD and thio-NADP between several points to several tens of minutes after a certain time from the start of the reaction. Then, a change in absorbance at a wavelength of 415 nm is measured.
[0022]
In the method of the present invention, measurement sensitivity can be further increased by combining a coenzyme cycling reaction with a cholesterol dehydrogenase reaction.
[0023]
The cycling reaction in the present invention is a reaction known per se, and a known report (JP-A-3-224498, etc.) can be used, and the amount of change in coenzyme combined in the cycling reaction is measured as the initial reaction rate. As the coenzyme, those described above can be used, but when they are combined, detection is facilitated by selecting those having different measurement conditions (such as absorption wavelength). For example, when a combination of NAD and thio-NAD is selected, the wavelength of the maximum absorption of each reduced type is different. Therefore, cholesterol can be quantified by measuring the initial reaction rate at any wavelength as described above.
[0024]
The reaction of cholesterol dehydrogenase when combining the cycling reaction is shown below.
[0025]
[Chemical 3]

[0026]
The concentration of oxidized coenzyme (a) and reduced coenzyme (b) is 0.02 to 100 mM, preferably 0.05 to 30 mM, respectively, and the concentration of cholesterol dehydrogenase is 0.05 to 100 U / ml, preferably 1 to 50 U / ml, but is appropriately determined according to the type of specimen.
[0027]
In the present invention, other dehydrogenases (A) can be combined as shown below.
[0028]
[Formula 4]

[0029]
The dehydrogenase (A) is a dehydrogenase that does not act on the oxidized coenzyme (b) and cholesterol, but converts the coenzyme (a) into a reduced form, and regenerates the reduced coenzyme (a). To be added. By using dehydrogenase (A), it becomes possible to reduce the amount of reduced coenzyme (a) added, and without adding reduced coenzyme (a) or oxidizing coenzyme (a). The reaction proceeds by adding a mixture of mold and reduced form.
[0030]
Examples of dehydrogenase (A) and its substrate include alcohol dehydrogenase and ethanol or acetaldehyde, glycerol dehydrogenase and glycerol or dihydroxyacetone, glycerol-3-phosphorus when oxidized coenzyme (a) is an oxidized form of NADs. Acid dehydrogenase and L-glycerol-3-phosphate or dihydroxyacetone phosphate, malate dehydrogenase and L-malate or oxaloacetate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and D-glyceraldehyde phosphate and phosphate or 1,3-diphospho When D-glyceric acid, oxidized coenzyme (a) is an oxidized form of thio-NADPs or NADPs, glucose-6-phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate or gluconolactone-6-phosphate , Lee Citrate dehydrogenase and isocitrate, glyoxylate dehydrogenase and CoA and glyoxylate, phosphogluconate dehydrogenase and 6-phospho-D-glyconic acid, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and D-glyceroaldehyde-3-phosphate and phosphate or 1,3-diphospho-D-glyceric acid, benzaldehyde dehydrogenase, benzaldehyde, and the like can be used.
[0031]
The concentration of dehydrogenase (A) is 20 times (U / ml unit) or more, preferably 1 to 100 U / ml, of the Km value (mM unit) for oxidized coenzyme (a). Further, the concentration of the dehydrogenase (A) substrate is preferably 0.05 to 20 mM. When dehydrogenase (A) is used, cholesterol can be quantified by measuring the amount of reduced coenzyme (b) produced.
[0032]
In the method of the present invention, the reaction of cholesterol dehydrogenase is combined with a reaction for reducing a tetrazolium salt of the reaction formula shown below, and the amount of formazan produced is measured by measuring the increase in absorbance as the initial reaction rate. Therefore, the measurement sensitivity can be further increased.
[0033]
[Chemical formula 5]

[0034]
Examples of the tetrazolium salt include INT [3- (p-iodophenyl) -2- (nitrophenyl) -5-phenyl-2H tetrazolium chloride], MTT [3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H tetrazolium bromide], Neo-TB [3,3 ′-(1,1′-biphenyl-4,4′-diyl) -bis (2,5-diphenyl-2H tetrazolium chloride)], Nitro- TB “3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- (1,1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis [2- (p-nitrophenyl) -5-phenyl-2H tetrazolium chloride ) ", TNTB" 3,3 '-[3,3'-dimethoxy- (1,1'-biphenyl) -4,4'-diyl] -bis [2,5-bis (p-nitrophenyl) -2 H tetrazolium chloride] ”, TB“ 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- (1,1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis (2,5-diphenyl-2H tetrazolium chloride) ” ”, NTB“ 3,3 ′-(3,3′-dimethoxy-4,4′-biphenylene) -bis [2- (p-nitrophenyl) -5-phenyl-2H tetrazolium chloride] ”, etc. Can do. Among these, for example, when INT is used, an increase in absorbance at a wavelength of 490 nm can be measured as an initial reaction rate.
[0035]
The diaphorase concentration is 0.05 to 100 U / ml, preferably 1 to 50 U / ml, and the tetrazolium salt concentration is 0.02 to 100 mM, preferably 0.05 to 30 mM. It is determined appropriately according to the type.
[0036]
In place of the tetrazolium salt, a water-soluble tetrazolium compound (see Japanese Patent Publication No. 4-13351), a water-soluble ditetrazolium compound (see Japanese Patent Publication No. 4-13352), or the like can be used. In place of diaphorase, Meldola blue (9-dimethylaminobenzo-α-phenazoxonium chloride), PMS (phenazine methosulfate), 1-methoxy PMS (1-methoxy-5-methylphenazi) It is also possible to use an electron carrier such as nitromethyl sulfate.
[0037]
Furthermore, it is also preferable to combine a cycling reaction and a tetrazolium salt reduction reaction. For example, as shown in the following reaction formula, when coenzyme NAD is reacted with cholesterol dehydrogenase, the produced NADH (reduced NAD) is phosphorylated using a known NADH kinase, and the produced NADPH ( A method for measuring the rate of formation of formazan by subjecting reduced NADP) to a NADPH cycling reaction using G-6-PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) (see JP-A-4-252200). Cholesterol can also be quantified.
[0038]
[Chemical 6]

[0039]
Thus, by combining the method of the present invention with a cycling reaction and / or a tetrazolium salt reduction reaction, it becomes possible to increase the measurement sensitivity of cholesterol. As a result, even in a small amount of sample, a specific fraction in the lipoprotein can be obtained. Cholesterol can be quantified.
[0040]
If the amount of the sample is very small, the initial absorbance at the time of measuring the initial reaction rate can be lowered, so that the substantial measurement range can be expanded. Furthermore, the fact that the sample may be in a very small amount is also advantageous when there is a limit in the amount of blood collected such as children and the elderly.
[0041]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, in order to separate a specific fraction of lipoprotein in serum, the lipoprotein fraction other than the specific fraction is aggregated, and the turbidity generated at that time is left as it is, and then directly Cholesterol in a specific fraction can be quantified. As a result, the centrifugation operation conventionally required in the agglutination method is no longer necessary, so it becomes possible to process a large number of samples in a short time, and the measurement using an automatic analyzer can be performed in daily clinical laboratory work. It becomes possible.
[0042]
In addition, the risk of virus infection can be reduced because the chance of directly touching the specimen is significantly reduced when handling the specimen. Furthermore, since the amount of the specimen can be made very small, measurement is possible even when the blood collection amount is limited such as children and the elderly. Therefore, the method of the present invention is extremely useful in the field of clinical examination, and can contribute to the improvement of work efficiency in daily work of clinical examination.
[0043]
【Example】
In order to explain the present invention in more detail, examples and comparative examples will be given, but the present invention is not limited to these examples.
[0044]
[Example 1]
5 μl of serum and 50 mM BES [N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid] -BisTris [bis (2-hydroxyethyl) imino-tris (hydroxymethyl) methane] buffer (pH 7) 0.0) in 5 mM MgCl ₂ , 12% (w / v) polyethylene glycol (PEG-4000), 1% (w / v) BSA, 0.5% (w / v) sodium phosphotungstate , 1.0 mM NAD and 0.1 μm NTB containing 250 μl of the first reagent, and after 5 minutes of warming, 12% (w / v) in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) PEG-4000, 2.5 U / ml CE, 13.5 U / ml ChDH (cholesterol dehydrogenase), 1% (w / v) BSA and 2.5 U / ml And adding a second reagent 100μl containing die follower hydrolase, HDL cholesterol levels The remaining (mg / dl) was determined by measuring the absorbance metric at 540 nm.
[0045]
The results of measuring 10 human sera with reference to known sera were compared with the conventional method [precipitation method using polyethylene glycol (product name “HDL-choles (PG)”, manufactured by Kokusai Reagent Co., Ltd.)] The results are shown in Table 1.
[0046]
[Table 1]

[0047]
y = 0.955x + 14.26 R = 0.95
x: Value according to conventional method (unit: mg / dl)
y: Value according to Example 1 (unit: mg / dl)
R: correlation coefficient
[Example 2]
5 μl of serum and 5 mM MgCl ₂ , 12% (w / v) PEG-4000, 1% (w / v) BSA, 0.5% in 50 mM BES-BisTris buffer (pH 7.0) w / v) Mixing 250 μl of the first reagent containing sodium phosphotungstate, 1.0 mM NAD and 0.1 mM NTB, heating for 5 minutes, and then in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) 1. 12% (w / v) PEG-4000, 3.5 U / ml CE, 1.0 U / ml ChDH, 2.5 U / ml diaphorase, 2.5 U / ml NADH kinase and 100 μl of a second reagent containing 5 U / ml G-6-PDH was added, and the remaining HDL cholesterol concentration (mg / dl) was determined by measuring the amount of absorbance at 540 nm.
[0049]
The results of measuring 10 human sera with reference to known sera and the conventional method in Example 1 are compared, and the results are shown in Table 2.
[0050]
[Table 2]

[0051]
y = 0.774x + 19.94 R = 0.978
x: Value according to conventional method (unit: mg / dl)
y: Value according to Example 2 (unit: mg / dl)
R: correlation coefficient
Example 3
5 μl of serum and 5 mM MgCl ₂ , 12% (w / v) PEG-4000, 1% (w / v) BSA, 0.5% in 50 mM BES-BisTris buffer (pH 7.0) w / v) 250 μl of the first reagent containing sodium phosphotungstate and 1.25 mM thio-NAD was mixed and warmed for 5 minutes, then 12% (w) in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) / V) PEG-4000, 2.5 U / ml CE, 1 U / ml ChDH, 1% (w / v) BSA and 100 μl of a second reagent containing 3.5 mM NADH remain. The HDL cholesterol concentration (mg / dl) was determined by measuring the amount of absorbance at 405 nm.
[0053]
The results of measuring 15 human sera with reference to known sera were compared with the conventional method in Example 1, and the results are shown in Table 3.
[0054]
[Table 3]

[0055]
y = 0.865x + 15.81 R = 0.941
x: Value according to conventional method (unit: mg / dl)
y: Value according to Example 3 (unit: mg / dl)
R: correlation coefficient
Example 4
3 μl of serum, 5 mM MgCl ₂ , 15% (w / v) PEG-4000, 1% (w / v) BSA, 0.5% in 50 mM BES-BisTris buffer (pH 7.0) w / v) 250 μl of a first reagent containing sodium phosphotungstate, 0.7% (w / v) sucrose and 1.25 mM thioNAD, heated for 5 minutes, and then 25 mM Tris-HCl 1% (w / v) BSA, 0.7% (w / v) sucrose, 40 U / ml CE (including LPL activity), 20 U / ml in buffer (pH 8.5) 100 μl of a second reagent containing ChDH and 3.5 mM NADH was added, and the remaining HDL cholesterol concentration (mg / dl) was determined by measuring the amount of absorbance at 405 nm.
[0057]
The results of measuring 15 human sera with reference to known sera are compared with the conventional method in Example 1, and the results are shown in Table 4.
[0058]
[Table 4]

[0059]
y = 0.956x + 1.867 R = 0.992
x: Value according to conventional method (unit: mg / dl)
y: Value according to Example 4 (unit: mg / dl)
R: correlation coefficient
From the results of Examples 1 to 4 above, it can be seen that the method of the present invention has a good correlation with the conventional method, and cholesterol in the HDL fraction of lipoprotein can be accurately quantified.

Claims

A method for quantifying cholesterol in a specific lipoprotein fraction of lipoprotein in serum, in which cholesterol dehydrogenase and oxidized coenzyme are placed in the reaction system, and the absorbance is increased based on the absorption wavelength of the produced reduced coenzyme A method for quantifying cholesterol in a lipoprotein fraction, characterized by measuring a rate.

The method for quantifying cholesterol in a lipoprotein fraction according to claim 1, wherein a lipoprotein fraction other than the specific fraction of lipoprotein in serum is aggregated, and the enzymatic reaction is carried out without removing or dissolving the aggregate.

The method for quantifying cholesterol in a lipoprotein fraction according to claim 1 or 2, wherein a cycling reaction is combined.

The method for quantifying cholesterol in a lipoprotein fraction according to any one of claims 1 to 3, wherein a reduction reaction of tetrazolium salt is combined and a change in the amount of formazan produced is measured as a rate of increase in absorbance.

The reagent kit used for the determination method of the cholesterol in the lipoprotein fraction as described in any one of Claims 1-4.