JP3614472B2 - Cholesterol determination method and reagent for determination - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、主として臨床検査や食品検査の分野での使用を目的とする微量のコレステロールの定量方法及び定量用試薬に関する。
【０００２】
【発明の背景】
コレステロールは、日常の臨床や健康診断などで良く知られている検査対象であり、一般に動脈硬化の危険因子と言われている。近年、このような成人病に対するコレステロールに関心が高まる中、血清のリポ蛋白の分画であるＨＤＬ（高比重リポ蛋白）やＬＤＬ（低比重リポ蛋白）に存在するコレステロールが測定される機会が多くなっている。更に、最近はレムナント様リポ蛋白分画中のコレステロールも注目され、尿中や唾液中に存在するコレステロールについても臨床研究が進められている。また一方では、日常生活における食事療法に関心が高まっており、食事療法の指標として、食品中に存在するコレステロールの定量分析についても研究開発が進められている。
【０００３】
このように、臨床検査のみならず食品検査の分野でも、コレステロールを定量する機会が増加しているが、従来のコレステロール定量方法はさまざまな問題が指摘されている。従来の方法としては、酵素としてコレステロールオキシダーゼを用いた方法が良く知られている。しかし、この方法では、ビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質の影響を受けやすく、呈色の安定性が良くないという問題がある。他のコレステロール定量方法としては、ガスクロマトグラフィーによる方法があるが、これは酵素を用いる方法に比べ操作が煩雑で、測定精度が低いという欠点がある。
【０００４】
【従来の技術】
本発明者らは、先にコレステロール脱水素酵素を用いた方法（特開平５−１７６７９７号公報参照）を開発し、この方法により前述のコレステロールオキシダーゼを用いた方法での問題を解決できた。
【０００５】
ところで、コレステロールの定量の機会が増える中で、特に微量のコレステロールを定量することが多くなっている。具体的には、例えば尿のように検体中に存在するコレステロール量自体が微量な場合であり、食品検査の場合も同様である。また、臨床検査で小児や老人などは採血量が少ないため、測定時に検体量がごく少量になり、試薬の総量に対して検体としてのコレステロール量が相対的に微量になる場合がある。さらに、抽出操作などで検体が希釈される場合も、測定時はコレステロール量が微量となる。
【０００６】
このような微量のコレステロールを定量するには、前述のコレステロールオキシダーゼを用いた方法では十分な感度が得られないと共に、より一層還元性物質の影響を受けるという問題がある。また、コレステロール脱水素酵素を用いた方法でも、微量のコレステロールを定量する場合、しばしば感度が低いことに遭遇することがある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述のような従来の方法を改良して、微量のコレステロールを定量できる方法及びそのための試薬を提供することにより、とりわけ臨床検査や食品検査の分野に貢献することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先にコレステロール脱水素酵素を用いた方法（特開平５−１７６７９７号公報参照）を開発した際、本酵素が可逆反応を示すことを確認しており、今回さらに本酵素が少なくともチオＮＡＤ（Ｐ）類及びＮＡＤ（Ｐ）類のような別の補酵素にも作用することを解明し、サイクリング反応に適用させることができた。従来から脱水素酵素が全てサイクリング反応に適用できるとは言えず、例えばギ酸脱水素酵素のように可逆反応を示さないものや、乳酸脱水素酵素のように、チオＮＡＤ（Ｐ）類には作用せず、ＮＡＤ（Ｐ）類にのみ作用するものもある。
【０００９】
即ち、上述の目的を達成するために鋭意研究を重ねてきたところ、補酵素の組み合わせによるサイクリング反応下で、コレステロール脱水素酵素を作用させ、そのときの補酵素の変化量を測定することにより問題が解決でき、上述の目的を達成できることを見い出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明のコレステロールの定量方法は、還元型補酵素Ｃ(1')、酸化型補酵素Ｃ(2)（ただし、還元型補酵素Ｃ(1')の酸化型補酵素Ｃ(1)は酸化型補酵素Ｃ(2)とは異なる補酵素である）、及び検体中のコレステロールを基質として△４−コレステノンを生成する可逆反応をなすコレステロール脱水素酵素の存在下で、還元型補酵素Ｃ(1')から酸化型補酵素Ｃ(1)を生成し、酸化型補酵素Ｃ(2)から還元型補酵素Ｃ(2')を生成するサイクリング反応を行って、還元型補酵素Ｃ(1')又は還元型補酵素Ｃ(2')の変化量を測定することを特徴とするものである。
【００１１】
好ましくは、前記酸化型補酵素Ｃ(1)若しくは還元型補酵素Ｃ(2')のいずれか一方の補酵素及びコレステロールには作用せず、他方の補酵素を還元型若しくは酸化型変換物に変換させる脱水素酵素と、該脱水素酵素の基質との存在下で、還元型補酵素Ｃ(1')又は還元型補酵素Ｃ(2')の変化量を測定することを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明のコレステロールの定量用試薬は、還元型補酵素Ｃ(1')、酸化型補酵素Ｃ(2)（ただし、還元型補酵素Ｃ(1')の酸化型補酵素Ｃ(1)は酸化型補酵素Ｃ(2)とは異なる補酵素である）、及び検体中のコレステロールを基質とするコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とするものである。
【００１３】
好ましくは、本発明のコレステロールの定量用試薬は、還元型補酵素Ｃ(1')と、酸化型補酵素Ｃ(2)（ただし、還元型補酵素Ｃ(1')は酸化型補酵素Ｃ(2)の還元型補酵素Ｃ(2')とは異なる補酵素である）と、検体中のコレステロールを基質とするコレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素Ｃ(1)若しくは還元型補酵素Ｃ(2')のいずれか一方の補酵素及びコレステロールには作用せず、他方の補酵素に作用する脱水素酵素と、該脱水素酵素の基質とを含有することを特徴とするものである。
本発明のコレステロールの定量用試薬として、酸化型補酵素Ｃ(1)と、酸化型補酵素Ｃ(2)（ただし、酸化型補酵素Ｃ(1)は還元型補酵素Ｃ(2')の酸化型補酵素Ｃ(2)とは異なる補酵素である）と、検体中のコレステロールを基質とするコレステロール脱水素酵素と、酸化型補酵素Ｃ(1)若しくは還元型補酵素Ｃ(2')のいずれか一方の補酵素及びコレステロールには作用せず、他方の補酵素に作用する脱水素酵素と、該脱水素酵素の基質とを含有することを特徴とするものであっても良い。
【００１４】
本発明方法における検体とは、血清、そのリポ蛋白の分画、尿、唾液などの臨床検査対象物のみならず、食品も含まれる。本発明方法によれば、かかる検体中の微量なコレステロールの定量が可能となり、例えば血清のＨＤＬ分画中のコレステロールでは５０ｍｇ／ｄｌ以下、血清のレムナント様リポ蛋白分画中のコレステロールでは１０ｍｇ／ｄｌ以下、尿中のコレステロールでは５ｍｇ／ｄｌ以下の精度で定量できることが要求されており、本発明方法はかかる要求に応えることができる。
【００１５】
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性コレステロール脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰ）依存性コレステロール脱水素酵素など公知のものが挙げられる。
【００１６】
また、補酵素としては、コレステロール脱水素酵素の反応に関与し、サイクリング反応をなし得るものはすべて用いることができる。例えば、公知のものとしては、チオＮＡＤ（Ｐ）類、ＮＡＤ（Ｐ）類などを挙げることができる。
【００１７】
チオＮＡＤ（Ｐ）類としては、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドフォスフェートなどがある。
【００１８】
また、ＮＡＤ（Ｐ）類としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドフォスフェート、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドフォスフェートなどがある。
【００１９】
これら補酵素は、用いるコレステロール脱水素酵素に応じて適宜選択されるが、とりわけ、チオＮＡＤとＮＡＤとの組み合わせが好ましく、一方は酸化型の補酵素、他方は還元型の補酵素を用いる。
【００２０】
本発明におけるサイクリング反応は、自体公知の反応であり、酸化型及び還元型補酵素の組み合わせにより反応を進め、酸化型又は還元型補酵素の変化量を測定する。補酵素を組み合わせる際、それぞれの測定条件の異なるものを選ぶと検出が容易となる。例えばチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）との組合わせを選択した場合、それぞれの還元型における極大吸収の波長が相違しているため、その一方の波長で吸光度を測定することにより、該波長を極大吸収波長に持つ補酵素の変化量が測定できる。このとき該波長での吸光度の増加を動力学的測定又は終点測定のいずれかで測定すれば良い。
【００２１】
サイクリング反応によるコレステロールを基質とする可逆反応式は、下記の通りである。
【００２２】
【化１】
ここでＣは補酵素を表し、（１） 及び（２） はその酸化型を表す。また（１’）は（１） の還元型変換物を、（２’）は（２） の還元型変換物をそれぞれ表す。例えば、Ｃ（２） をチオＮＡＤ（Ｐ）類の酸化型としたとき、Ｃ（２’）は反応により生じたその還元型変換物を表し、Ｃ（１’）をＮＡＤ（Ｐ）類の還元型としたとき、Ｃ（１） は同様にその酸化型変換物を表す。
【００２４】
Ｃ（１’）及びＣ（２） の濃度は、それぞれ０．０２〜１００ｍＭ、好ましくは０．０５〜３０ｍＭであり、コレステロール脱水素酵素の濃度は、０．０５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌであるが、検体の種類などに応じて適宜決定される。
【００２５】
本発明では、下記に示すように他の脱水素酵素（Ａ）を組み合わせることができる。
【００２６】
【化２】
脱水素酵素（Ａ）は、Ｃ（２） 及びコレステロールに作用せず、Ｃ（１） をＣ（１’）に変換させる脱水素酵素であり、Ｃ（１’）を再生するために添加される。脱水素酵素（Ａ）を用いることによって、Ｃ（１’）の添加量を少なくすることが可能となり、Ｃ（１’）を添加せずに、あるいはＣ（１） とＣ（１’）との混合物を添加することによって、反応が進行する。
【００２８】
脱水素酵素（Ａ）及びその基質としては、例えばＣ（１） がＮＡＤ類の酸化型の場合、アルコールデヒドロゲナーゼとエタノール又はアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼとグリセロール又はジヒドロキシアセトン、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼとＬ−グリセロール−３−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとＬ−リンゴ酸又はオキザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼとＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸又は１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、Ｃ（１） がＮＡＤＰ類の酸化型の場合、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸又はグルコノラクトン−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼとイソクエン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼとＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼと６−ホスホ−Ｄ−グリコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼとＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸又は１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼとベンズアルデヒドなどを用いることができる。
【００２９】
脱水素酵素（Ａ）の濃度は、Ｃ（１） に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（Ｕ／ｍｌ単位）以上、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌである。また、脱水素酵素（Ａ）の基質の濃度は、０．０５〜２０ｍＭが好ましい。脱水素酵素（Ａ）を用いた場合、Ｃ（２’）の生成量を測定することによって、コレステロールの定量を行うことができる。
【００３０】
本発明のコレステロールの定量用試薬は、▲１▼コレステロール脱水素酵素、Ｃ（１’）、及びＣ（２） を含む組成物、▲２▼コレステロール脱水素酵素、脱水素酵素（Ａ）、Ｃ（１） 単独又はＣ（１） とＣ（１’）との混合物、及びＣ（２） を含む組成物の２種類の組み合わせが考えられる。本発明の試薬は、正反応／逆反応の至適ｐＨの間のｐＨ条件に調整し得るように、緩衝剤を含んでいてもよい。
【００３１】
従来、コレステロール脱水素酵素とサイクリング反応とを組み合わせた報告はなく、本発明者らにより初めて、コレステロール脱水素酵素とサイクリング反応を組み合わせた結果、微量のコレステロールを定量できることが明らかになった。
【００３２】
本発明方法は、コレステロール脱水素酵素のみを用いた従来の方法に比べて格段に測定感度を増大させることが可能となり、本発明の試薬は、本発明方法を実施するための好適な試薬である。ここで得られる感度は、用いる緩衝液の種類、ｐＨなどの条件で異なり、また補酵素やコレステロール脱水素酵素の量、反応時間などに依存することが分かった。そして臨床検査で日常使用する自動分析装置での測定でも、高感度に測定できることが判明した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、検体中に存在するコレステロール量自体が微量な場合、又は検体量自体がごく少量の場合であっても、コレステロールを正確に定量できるようになり、臨床検査や食品検査の分野で有用性が高い。
【００３４】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例及び比較例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３５】
〔実施例１〕
以下の試薬を調製した。
ｐＨ６．５〜９．５の範囲で調製した試薬を用いて、ｐＨにおける感度の変動について検討した。６ｍｇ／ｄｌに調製した標準液１０μｌを、予め３７℃の恒温にした４００μｌの試薬−１に添加し、波長４１５ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化量を求め、その結果を図１に示した。図１に示されるように、ｐＨを変動させることによって、感度を調節できることが分かる。
【００３７】
〔実施例２〕
以下の試薬を調製した。
６ｍｇ／ｄｌに調製したコレステロール標準液１０μｌを、予め３７℃の恒温にした４００μｌの試薬−２に添加し、波長４１５ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化量をチオＮＡＤ＋ の濃度別に測定し、その結果を図２に示した。図２に示されるように、チオＮＡＤ＋ の濃度を変動させることによって、感度を調節できることが分かる。
【００３９】
〔実施例３〕
以下の試薬を調製した。
３及び６ｍｇ／ｄｌに調製したコレステロール標準液を１０μｌとり、２５０μｌの試薬−３に添加する。５分間恒温後、１００μｌの試薬−４を添加する。添加後、１分目から３分目までの波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、１分間あたりの吸光度変化量を求め、その結果を図３に示した。図３に示されるように、ＣＤＨ量を変動させることによって、感度を調節できる。
【００４２】
実施例１〜３の結果から、目的とする検体中のコレステロール濃度に対応して、感度を調節できることが分かる。
【００４３】
〔実施例４〕
以下の試薬を調製した。
さらに比較対照試薬として、Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ａ（カラー法，国際試薬株式会社製）、Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ｋ「コクサイ」（ＵＶ法，国際試薬株式会社製）及びデタミナーＴＣＬ（カラー法，協和メディクス社製）を準備した。
【００４５】
約５６，４２，２８，１４，７，３．５，１．４及び０．７ｍｇ／ｄｌのコレステロールを含有する各検体を調製し、実施例３と同様の操作により、試薬−４及び試薬−５を用いて、吸光度変化量を測定した。また、比較対照試薬（カラー法及びＵＶ法）については、使用説明書に従って操作した。なお、各操作法における反応液中のコレステロール濃度を同じにするために、試薬容量／検体容量の比を３６／１とした。その結果を図４（コレステロール値：約５６〜７ｍｇ／ｄｌ）及び図５（コレステロール値：約１４〜０．７ｍｇ／ｄｌ）に示す。但し、比較対照試薬を用いた方法では、微量のコレステロール濃度における吸光度変化量の信頼性が低かったので、図５においては記載を省略した。
【００４６】
また、約１ｍｇ／ｄｌのコレステロールを含有する検体を調製し、上記の各操作法を複数回（１０回）行った際の各操作法における平均値、変動係数及び標準偏差を求め、表１にまとめた。
【００４７】
【表１】
図４及び図５に示されるように、本発明方法によれば、高感度にコレステロールを測定することが可能となり、また表１に示されるように、約１ｍｇ／ｄｌのコレステロールを測定するときの再現性が明らかに、他法に比べて、向上することが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるｐＨ変動に対する感度の変動を示す図である。
【図２】実施例２におけるチオＮＡＤ＋ 濃度変動に対する感度の変動を示す図である。
【図３】実施例３における試薬中のＣＤＨ量変動に対する感度の変動を示す図である。
【図４】実施例４におけるコレステロール値変動（約５６〜７ｍｇ／ｄｌ）に対する感度の変動を示す図である。
【図５】実施例４におけるコレステロール値変動（約１４〜０．７ｍｇ／ｄｌ）に対する感度の変動を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for quantifying a trace amount of cholesterol and a reagent for quantification, which are mainly intended for use in the fields of clinical testing and food testing.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Cholesterol is a well-known test object in daily clinical practice and medical examinations and is generally said to be a risk factor for arteriosclerosis. In recent years, interest in cholesterol for adult diseases has increased, and there are many opportunities to measure cholesterol present in HDL (high density lipoprotein) and LDL (low density lipoprotein), which are fractions of serum lipoproteins. It has become. Furthermore, recently, cholesterol in the remnant-like lipoprotein fraction has attracted attention, and clinical research is also being conducted on cholesterol present in urine and saliva. On the other hand, there is a growing interest in dietary therapy in daily life, and research and development is also underway for quantitative analysis of cholesterol present in foods as an index of dietary therapy.
[0003]
As described above, opportunities for quantifying cholesterol are increasing not only in clinical tests but also in the field of food inspection, but various problems have been pointed out with conventional cholesterol quantification methods. As a conventional method, a method using cholesterol oxidase as an enzyme is well known. However, this method has a problem that it is easily affected by reducing substances such as bilirubin and ascorbic acid, and the coloration stability is not good. As another cholesterol quantification method, there is a gas chromatography method. However, this method has disadvantages that the operation is complicated and the measurement accuracy is low as compared with the method using an enzyme.
[0004]
[Prior art]
The inventors of the present invention have previously developed a method using cholesterol dehydrogenase (see JP-A-5-176797), and by this method, the problem with the method using cholesterol oxidase described above could be solved.
[0005]
By the way, as the chances of quantifying cholesterol increase, a particularly small amount of cholesterol is often quantified. Specifically, for example, the amount of cholesterol present in a specimen is very small, such as urine, and the same applies to food inspection. In addition, children and elderly people in clinical tests have a small amount of blood collected, so the amount of sample is very small at the time of measurement, and the amount of cholesterol as a sample may be relatively small relative to the total amount of reagents. Furthermore, even when the specimen is diluted by an extraction operation or the like, the amount of cholesterol is very small during measurement.
[0006]
In order to quantify such a small amount of cholesterol, the above-described method using cholesterol oxidase has a problem that sufficient sensitivity cannot be obtained and it is further influenced by a reducing substance. Even in the method using cholesterol dehydrogenase, when a small amount of cholesterol is quantified, it is often encountered that the sensitivity is low.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to contribute to the field of clinical examination and food inspection, among others, by improving the conventional method as described above and providing a method capable of quantifying a trace amount of cholesterol and a reagent therefor.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have previously confirmed that the enzyme exhibits a reversible reaction when a method using cholesterol dehydrogenase (see JP-A-5-176797) has been developed. It was elucidated that it also acts on other coenzymes such as thio-NAD (P) s and NAD (P) s, and was able to be applied to cycling reactions. Conventionally, it cannot be said that all dehydrogenases can be applied to cycling reactions. For example, those that do not show a reversible reaction such as formate dehydrogenase and act on thio-NAD (P) s such as lactate dehydrogenase. Some of them only act on NAD (P) s.
[0009]
In other words, as a result of intensive research to achieve the above-mentioned objective, it is problematic to measure the amount of change in the coenzyme at the time when cholesterol dehydrogenase is allowed to act in a cycling reaction by a combination of coenzymes. Has been found to be able to solve the above problems and achieve the above-mentioned object, and the present invention has been completed through further research.
[0010]
The cholesterol quantification method of the present invention comprises reduced coenzyme C (1 ′) and oxidized coenzyme C (2) (however, oxidized coenzyme C (1) of reduced coenzyme C (1 ′) is oxidized) Reduced coenzyme C (2)), and reduced coenzyme C in the presence of cholesterol dehydrogenase that undergoes a reversible reaction to produce Δ4-cholesterone using cholesterol in the sample as a substrate. A cycling reaction is carried out to produce oxidized coenzyme C (1) from (1 ') and reduced coenzyme C (2') from oxidized coenzyme C (2). 1 ′) or a change amount of reduced coenzyme C (2 ′) is measured.
[0011]
Preferably, it does not act on either one of the oxidized coenzyme C (1) or reduced coenzyme C (2 ′) and cholesterol, and the other coenzyme is converted into a reduced or oxidized converted product. Measuring the amount of change of reduced coenzyme C (1 ′) or reduced coenzyme C (2 ′) in the presence of a dehydrogenase to be converted and a substrate of the dehydrogenase It is.
[0012]
The cholesterol quantification reagent of the present invention comprises reduced coenzyme C (1 ′) and oxidized coenzyme C (2) (however, oxidized coenzyme C (1 ′) of reduced coenzyme C (1 ′)). ) Is a coenzyme different from oxidized coenzyme C (2)), and cholesterol dehydrogenase using cholesterol in the sample as a substrate.
[0013]
Preferably, the cholesterol quantification reagent of the present invention comprises reduced coenzyme C (1 ′) and oxidized coenzyme C (2) (where reduced coenzyme C (1 ′) is oxidized coenzyme C). (2) is a different coenzyme from reduced coenzyme C (2 ′)), and cholesterol dehydrogenase using oxidized cholesterol as a substrate, oxidized coenzyme C (1) or reduced coenzyme C It contains a dehydrogenase that does not act on any one of the coenzymes and cholesterol of (2 ′) but acts on the other coenzyme, and a substrate for the dehydrogenase.
As the cholesterol quantification reagent of the present invention, oxidized coenzyme C (1) and oxidized coenzyme C (2) (however, oxidized coenzyme C (1) is reduced coenzyme C (2 ') It is a different coenzyme from oxidized coenzyme C (2)), cholesterol dehydrogenase using cholesterol in the sample as a substrate, and oxidized coenzyme C (1) or reduced coenzyme C (2 ') It may be characterized by containing a dehydrogenase that does not act on any one of the coenzymes and cholesterol but acts on the other coenzyme, and a substrate for the dehydrogenase.
[0014]
The specimen in the method of the present invention includes not only clinical test objects such as serum, its lipoprotein fraction, urine and saliva, but also food. According to the method of the present invention, it is possible to quantify a very small amount of cholesterol in a specimen. For example, cholesterol in serum HDL fraction is 50 mg / dl or less, and cholesterol in serum remnant-like lipoprotein fraction is 10 mg / dl. Hereinafter, it is required that cholesterol in urine can be quantified with an accuracy of 5 mg / dl or less, and the method of the present invention can meet such a requirement.
[0015]
Examples of cholesterol dehydrogenase in the present invention include known ones such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) -dependent cholesterol dehydrogenase and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) -dependent cholesterol dehydrogenase. .
[0016]
Any coenzyme that can participate in the reaction of cholesterol dehydrogenase and can undergo a cycling reaction can be used. For example, as known ones, thio NAD (P) s, NAD (P) s and the like can be mentioned.
[0017]
As thioNAD (P), thionicotinamide adenine dinucleotide (thioNAD), thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate (thioNADP), thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide, thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate and so on.
[0018]
NAD (P) s include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), acetylpyridine adenine dinucleotide, acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide. Nicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate.
[0019]
These coenzymes are appropriately selected depending on the cholesterol dehydrogenase to be used, and in particular, a combination of thio-NAD and NAD is preferable, one using an oxidized coenzyme and the other using a reduced coenzyme.
[0020]
The cycling reaction in the present invention is a reaction known per se, and proceeds by a combination of oxidized and reduced coenzymes, and measures the amount of change in oxidized or reduced coenzymes. When combining coenzymes, detection is facilitated by selecting different measurement conditions. For example, when a combination of thio-NAD (P) and NAD (P) is selected, the wavelength of the maximum absorption in each reduced form is different. Therefore, by measuring the absorbance at one wavelength, The amount of change in coenzyme having a maximum absorption wavelength can be measured. At this time, the increase in absorbance at the wavelength may be measured by either kinetic measurement or end point measurement.
[0021]
The reversible reaction formula using cholesterol as a substrate by the cycling reaction is as follows.
[0022]
[Chemical 1]
Here, C represents a coenzyme, and (1) and (2) represent its oxidized form. (1 ′) represents the reduced conversion product of (1), and (2 ′) represents the reduced conversion product of (2). For example, when C (2) is an oxidized form of thio-NAD (P) s, C (2 ′) represents a reduced conversion product produced by the reaction, and C (1 ′) is converted to NAD (P) s. When converted to the reduced form, C (1) represents the oxidized conversion product.
[0024]
The concentration of C (1 ′) and C (2) is 0.02 to 100 mM, preferably 0.05 to 30 mM, respectively, and the concentration of cholesterol dehydrogenase is 0.05 to 100 U / ml, preferably 1 Although it is ˜50 U / ml, it is appropriately determined according to the type of specimen.
[0025]
In the present invention, other dehydrogenases (A) can be combined as shown below.
[0026]
[Chemical 2]
Dehydrogenase (A) is a dehydrogenase that does not act on C (2) and cholesterol and converts C (1) to C (1 ′), and is added to regenerate C (1 ′). The By using the dehydrogenase (A), it becomes possible to reduce the amount of C (1 ′) added, without adding C (1 ′), or with C (1) and C (1 ′). The reaction proceeds by adding a mixture of
[0028]
Examples of the dehydrogenase (A) and its substrate include alcohol dehydrogenase and ethanol or acetaldehyde, glycerol dehydrogenase and glycerol or dihydroxyacetone, glycerol-3-phosphate dehydrogenase and L when C (1) is an oxidized form of NADs. -Glycerol-3-phosphate or dihydroxyacetone phosphate, malate dehydrogenase and L-malate or oxaloacetate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and D-glyceraldehyde phosphate and phosphate or 1,3-diphospho-D-glycerol When the acid C (1) is an oxidized form of NADPs, glucose-6-phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate or gluconolactone-6-phosphate, isocitrate dehydrogenase and isocitrate, glio Silate dehydrogenase and CoA and glyoxylate, phosphogluconate dehydrogenase and 6-phospho-D-glyconic acid, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and D-glyceraldehyde-3-phosphate and phosphate or 1,3-diphospho-D- Glyceric acid, benzaldehyde dehydrogenase, benzaldehyde, and the like can be used.
[0029]
The concentration of dehydrogenase (A) is 20 times (U / ml unit) or more, preferably 1 to 100 U / ml, of the Km value (mM unit) relative to C (1). Further, the concentration of the dehydrogenase (A) substrate is preferably 0.05 to 20 mM. When dehydrogenase (A) is used, cholesterol can be quantified by measuring the amount of C (2 ′) produced.
[0030]
The reagent for quantifying cholesterol of the present invention comprises (1) a composition comprising cholesterol dehydrogenase, C (1 ′) and C (2), (2) cholesterol dehydrogenase, dehydrogenase (A), C (1) Two kinds of combinations of a composition containing C (1) alone or a mixture of C (1) and C (1 ′) and C (2) are conceivable. The reagent of the present invention may contain a buffering agent so that it can be adjusted to a pH condition between the optimum pH of the forward reaction / reverse reaction.
[0031]
Conventionally, there has been no report combining cholesterol dehydrogenase and cycling reaction, and for the first time as a result of combining cholesterol dehydrogenase and cycling reaction, the present inventors have quantified a trace amount of cholesterol.
[0032]
The method of the present invention can greatly increase the measurement sensitivity compared with the conventional method using only cholesterol dehydrogenase, and the reagent of the present invention is a suitable reagent for carrying out the method of the present invention. . It was found that the sensitivity obtained here varies depending on the type of buffer used, the pH, and the like, and also depends on the amount of coenzyme and cholesterol dehydrogenase, the reaction time, and the like. It was also found that measurement can be performed with high sensitivity even with measurement using an automatic analyzer that is used daily in clinical examinations.
[0033]
【The invention's effect】
According to the present invention, cholesterol can be accurately quantified even when the amount of cholesterol present in a sample is very small, or even when the amount of sample is very small, and is useful in the field of clinical tests and food tests. High nature.
[0034]
【Example】
In order to explain the present invention in more detail, examples and comparative examples will be given, but the present invention is not limited to these examples.
[0035]
[Example 1]
The following reagents were prepared:
Using a reagent prepared in the range of pH 6.5 to 9.5, variation in sensitivity at pH was examined. 10 μl of a standard solution prepared to 6 mg / dl was added to 400 μl of Reagent-1 that was previously maintained at a constant temperature of 37 ° C., and the amount of change in absorbance per minute at a wavelength of 415 nm was determined. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 1, it can be seen that the sensitivity can be adjusted by changing the pH.
[0037]
[Example 2]
The following reagents were prepared:
Cholesterol standard solution 10 μl prepared to 6 mg / dl was added to 400 μl of Reagent-2 that had been kept at a constant temperature of 37 ° C., and the change in absorbance per minute at a wavelength of 415 nm was measured according to the concentration of thio NAD +. Is shown in FIG. As shown in FIG. 2, it can be seen that the sensitivity can be adjusted by varying the concentration of thio-NAD + .
[0039]
Example 3
The following reagents were prepared:
Take 10 μl of cholesterol standard solution prepared at 3 and 6 mg / dl and add to 250 μl of reagent-3. After incubating for 5 minutes, 100 μl of reagent-4 is added. After the addition, the absorbance at a wavelength of 405 nm from the first minute to the third minute was measured to determine the amount of change in absorbance per minute, and the result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, the sensitivity can be adjusted by varying the amount of CDH.
[0042]
From the results of Examples 1 to 3, it can be seen that the sensitivity can be adjusted according to the target cholesterol concentration in the specimen.
[0043]
Example 4
The following reagents were prepared:
Furthermore, as comparative control reagents, T-CHO reagent A (color method, manufactured by Kokusai Reagent Co., Ltd.), T-CHO reagent K, Kokusai (UV method, manufactured by Kokusai Reagent Co., Ltd.), and determiner TCL (color method, Kyowa) Prepared by Medics).
[0045]
Respective specimens containing about 56, 42, 28, 14, 7, 3.5, 1.4 and 0.7 mg / dl cholesterol were prepared, and reagent-4 and reagent- were prepared in the same manner as in Example 3. 5 was used to measure the amount of change in absorbance. Further, the comparative control reagents (color method and UV method) were operated according to the instruction manual. In addition, in order to make the cholesterol concentration in the reaction solution in each operation method the same, the ratio of reagent volume / sample volume was set to 36/1. The results are shown in FIG. 4 (cholesterol level: about 56-7 mg / dl) and FIG. 5 (cholesterol level: about 14-0.7 mg / dl). However, in the method using the comparative control reagent, the reliability of the change in absorbance at a very small amount of cholesterol concentration was low, so the description was omitted in FIG.
[0046]
In addition, a sample containing about 1 mg / dl cholesterol was prepared, and the average value, coefficient of variation, and standard deviation in each operation method when each of the above operation methods was performed a plurality of times (10 times) were obtained. Summarized.
[0047]
[Table 1]
As shown in FIG. 4 and FIG. 5, according to the method of the present invention, it becomes possible to measure cholesterol with high sensitivity, and as shown in Table 1, when measuring about 1 mg / dl cholesterol. It can be seen that the reproducibility is clearly improved compared to other methods.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing fluctuations in sensitivity to pH fluctuations in Example 1. FIG.
FIG. 2 is a diagram showing fluctuations in sensitivity with respect to fluctuations in thio NAD + concentration in Example 2.
FIG. 3 is a graph showing changes in sensitivity to changes in the amount of CDH in a reagent in Example 3.
FIG. 4 is a graph showing changes in sensitivity to changes in cholesterol level (about 56-7 mg / dl) in Example 4.
FIG. 5 is a graph showing changes in sensitivity to changes in cholesterol level (about 14 to 0.7 mg / dl) in Example 4.
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