JP3598292B2 - Method for measuring protease and thin film used in the method - Google Patents
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Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、プロテアーゼの測定方法に関するものである。より具体的には、癌細胞の浸潤活性や転移活性などの癌の悪性度、歯周炎などの歯周病の進行度、リウマチ性関節炎などにおける破壊性病態などの正確な診断を可能にするプロテアーゼの測定方法に関するものである。
【０００２】
（従来の技術）
腫瘍の良性、悪性の相違を規定する因子の一つとして、間質結合組織への浸潤の有無を挙げることができる。この病態を明らかにするためには、腫瘍細胞自体の増殖動態の変化を観察すると同時に、腫瘍細胞と間質結合組織との相互作用に影響を及ぼす要因を検索することが必要である。特に、腫瘍細胞の浸潤や転移にはプロテアーゼが関与することが明らかにされており、プロテアーゼを制御することによって悪性腫瘍細胞の浸潤や転移を抑制できる可能性がある。このようなプロテアーゼ（細胞外マトリックス分解酵素）のうち、特にマトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が癌細胞の増殖、浸潤、血管新生に重要な役割をはたすことが明らかにされている（鶴尾隆編「癌転移の分子機構」、第８章、宮崎香著「マトリックス・プロテアーゼと癌の浸潤・転移」、ｐｐ．９２−１０７、メジカルビュー社、１９９３年発行を参照）。
【０００３】
一方、歯周病では歯肉溝上皮の破壊及びコラーゲンを主体とした結合組織の破壊が初期病変として進行するが、この組織の破壊にもマトリックス・メタロプロテアーゼが関与していることが知られている（歯周組織破壊におけるプロテアーゼの関与、及び病態とプロテアーゼとの相関については、青野正男監修「歯周治療の科学」、白川正治著、第ＶＩＩ章「歯周組織の病理」、ｐｐ．９９〜１０９、医歯薬出版、並びに、長谷川ら、「歯周病患者における歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）中のゲラチナーゼ活性」、演題Ａ−４４、日本歯周病学会第３７回秋期学術大会などを参照）。
【０００４】
マトリックス・メタロプロテアーゼはコラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、及びゼラチンなどの細胞外基質を分解する酵素であり、ＭＭＰ−１，２，３，７，９及び１０など８種類の存在が明らかにされている。間質型コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１）は最も古くから知られているマトリックス・メタロプロテアーゼであり、繊維芽細胞や軟骨などに分布しており、間質型のコラーゲンを１／４及び１／３に切断する。歯周病においては、主として ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）及びＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）が歯周組織の構成成分であるＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びプロテオグリカンなどを破壊する。なお、マトリックス・メタロプロテアーゼの分泌は、細胞増殖因子であるＥＧＦやＴＧＦ−βによって強く促進されており、他方、組織内の内在性インヒビターによって分泌や活性発現が制御されている。もっとも、増殖因子が関与した場合にその発現がどのように抑制されるのかは必ずしも明らかではない。
【０００５】
また、腫瘍細胞の浸潤や転移に関与する他のプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼであるプラスミノーゲン・アクティベーター（ＰＡ）を挙げることができる。このプラスミノーゲン・アクティベーターはプラスミノーゲンをプラスミンに変換する酵素であり、プラスミノーゲン・アクティベーターの作用により生成したプラスミンがプロメタロプロテアーゼを活性型メタロプロテアーゼに変換する。従って、マトリックス・メタロプロテアーゼとプラスミノーゲン・アクティベーターとの間で形成されるカスケードによって、癌細胞の浸潤や転移が進行ないしは加速されると考えられる。
【０００６】
プロテアーゼは、上記の癌細胞の浸潤及び転移、並びに歯周病の進行のほか、歯槽膿漏による骨組織や歯根膜の破壊、リウマチ性関節炎による骨膜や骨組織の破壊などの破壊性病変に関与している可能性がある（リウマチにおけるプロテアーゼの関与に関しては、日本臨床、５０（３），ｐｐ．４６３−４６７，１９９２を参照）。従って、細胞や組織中のプロテアーゼを定量することによって、浸潤活性及び転移活性などからみた癌細胞の悪性度や歯周病の病態、及びリウマチなどの破壊性病変の進行程度を正確に診断することが可能である（癌細胞の浸潤度とプロテアーゼ活性との相関については、例えば、Ｙａｍａｇａｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，５９，５１，１９９１； Ａｚｚａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８５，１７５８，１９９３； Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１１，１８３，１９９３； Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７，１１２６，１９９３などを参照）。
【０００７】
従来、プロテアーゼの測定方法としては、基質の分解の程度から酵素活性を測定するザイモグラフィー法や各々のプロテアーゼに特異的な抗体を用いたイムノブロティング法などが利用されている。例えば、癌細胞や歯周病化細胞を粉砕した後、抽出液をゼラチン含有ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に付し、電気泳動後のゲルをアミドブラックで染色して、染色されずに白く透明なバンドを与える試料をプロテアーゼ陽性と判定する方法が知られている。しかしながら、この方法では測定毎にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを作成する必要があり、検出までに約３０時間を要するという問題がある。
【０００８】
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動後にゲルをメンブレンに密着させ、ブロッティング後の酵素をモノクローナル抗体で検出する方法もあるが、電気泳動を利用する点で上記の方法と同様の欠点を有しており、それに加えて、操作に熟練を要することと高価なモノクローナル抗体を用いることも問題である。さらに、これらの方法は個々の細胞のプロテアーゼを測定したものではなく、組織全体のプロテアーゼ総量を検出するものであり、個々の癌細胞の浸潤・転移活性の情報を得ることはできないという問題がある。
【０００９】
最近、血管組織中のプロテアーゼ活性をザイモグラフィーの原理により測定する方法が提案された（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９，Ｊｕｌｙ，ｐｐ．９７４−９８０，１９９５）。
この方法では、蛍光性化合物が結合したカゼイン又はゼラチンをプロテアーゼの基質として用い、この基質を含むアガロースの薄膜をスライドグラス上に形成させた後、その薄膜の表面に固定化されていない組織切片（６−１０μｍ）をのせて３７℃で培養し、基質の消化を蛍光顕微鏡下に観察する工程を含んでいる（第９７５頁、右欄第６〜１８行のプロトコールを参照）。この方法は、組織中のプロテアーゼを直接測定できる点では優れているものの、プロテアーゼの基質をスライドグラス上に固定化するためにアガロースを必須成分として用いる必要があり、プロテアーゼによる基質の消化にばらつきが生じてしまい、再現性に乏しいという問題があった。
【００１０】
（発明の開示）
本発明の目的は、簡便かつ正確なプロテアーゼの測定方法を提供することにある。より具体的には、浸潤や転移活性などの癌細胞の悪性度、歯周病などの病態、及びリウマチなどの破壊性病変の進行度を短時間で正確かつ簡便に判定でき、癌の予後や破壊性病変の進行程度などを正確に予測するために有用なプロテアーゼの測定方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の別の目的は、上記の特徴を有するプロテアーゼの測定方法であって、被検組織内に局在する癌細胞などに由来するプロテアーゼを正確に測定する方法を提供することにある。
さらに本発明の別の目的は、上記のプロテアーゼの測定方法に用いる薄膜を提供することにある。
【００１２】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ゼラチンなどのプロテアーゼ基質と硬膜剤とを含む薄膜の表面に癌組織などの組織切片を密着させるか、あるいは歯周病などの病変組織などから採取した滲出液を該薄膜上に滴下すると、試料中に含まれるプロテアーゼが薄膜を消化し薄膜表面に消化痕が形成されることを見いだした。また、上記の方法がアガロースを含む薄膜を用いる方法（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９，Ｊｕｌｙ，ｐｐ．９７４−９８０，１９９５）に比べて非常に再現性に優れており、試料中のプロテアーゼ活性を正確に測定できることを見いだした。さらに、連続した組織切片を用いてそれぞれ組織標本と上記の薄膜標本を作成して比較・比較することにより、組織中の個々の細胞内に発現しているプロテアーゼを測定することができることを見いだした。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【００１３】
すなわち本発明は、プロテアーゼの測定方法であって、（１）プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対してプロテアーゼを含む試料を接触させる工程；及び（２）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程を含む方法を提供するものである。
【００１４】
本発明の第二の態様によれば、プロテアーゼの測定方法であって、（１）プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的に連続した二切片のうちの一つを接触させる工程；（２）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（３）他の一つの切片から調製した組織標本と上記消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の第三の態様によれば、プロテアーゼの測定方法であって、（１）プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つを接触させる工程；（２）プロテアーゼ基質、硬膜剤、及びプロテアーゼ・インヒビターを含み支持体表面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させる工程；（３）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（４）工程（１）で用いた薄膜の消化痕と工程（２）で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。この方法の好ましい態様では、工程（２）において、残りの２以上の各切片をそれぞれ異なる種類のプロテアーゼ・インヒビターを含む薄膜に接触させる工程を含んでいる。
【００１６】
本発明の第四の態様によれば、プロテアーゼの測定方法であって、（１）プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つを接触させる工程；（２）工程（１）で用いた薄膜に含まれるプロテアーゼ基質とは異なるプロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させる工程；（３）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（４）工程（１）で用いた薄膜の消化痕と工程（２）で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。この方法の好ましい態様では、工程（２）において、残りの２以上の各切片をそれぞれ異なる種類のプロテアーゼ基質を含む薄膜に接触させる工程を含んでいる。
【００１７】
本発明の第五の態様によれば、プロテアーゼの測定方法であって、（１）少なくとも下記の２層：プロテアーゼ基質、硬膜剤、及びプロテアーゼ・インヒビターを含み支持体表面に形成された（ａ）層と、プロテアーゼ基質及び硬膜剤を含み（ａ）層に積層された（ｂ）層とを含む薄膜に対してプロテアーゼを含む試料を接触させる工程；（２）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（３）（ａ）層の消化痕と（ｂ）層の消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の第六の態様によれば、（１）少なくとも下記の２層：プロテアーゼ基質及び硬膜剤を含み支持体表面に形成された（ａ）層と、（ａ）層に含まれるプロテアーゼ基質とは異なるプロテアーゼ基質及び硬膜剤を含み（ａ）層に積層された（ｂ）層とを含む薄膜に対してプロテアーゼを含む試料を接触させる工程；（２）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び（３）（ａ）層の消化痕と（ｂ）層の消化痕とを対比する工程を含む方法が提供される。
【００１９】
これらの方法では、プロテアーゼを含む試料や生体試料は、支持体に接触することなく薄膜の表面に接触することを特徴としている。
本発明のさらに別の態様によれば、上記の各方法において定義されたプロテアーゼ測定用の薄膜が提供される。
【００２０】
これらの発明の好ましい態様によれば、プロテアーゼ基質が、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及びカゼインからなる群から選ばれる上記の各方法及び薄膜；該試料が患者から分離・採取した生体試料である上記の各方法及び薄膜；生体試料が癌組織切片、歯肉溝滲出液、又は破壊性病変組織切片若しくは抽出液（例えば、リウマチ性病変組織抽出液又は歯槽膿漏組織抽出液）である上記の各方法及び薄膜；プロテアーゼがマトリックス・メタロプロテアーゼである上記の各方法及び薄膜；消化痕を染色により検出する上記の各方法及び薄膜；金属、金属酸化物、顔料、及び染料からなる群から選ばれ、４００ｎｍから７００ｎｍの波長領域の最大透過濃度が０．０１以上の物質の１種又は２種以上を含む薄膜を用いて検出を行う上記の各方法；並びに、プロテアーゼ基質としてゼラチンを用い、消化痕をアミドブラック又はクマジーブルーでゼラチン染色する上記の各方法及び薄膜が提供される。
【００２１】
本発明の薄膜の好ましい態様によれば、金属、金属酸化物、顔料、及び染料からなる群から選ばれ、４００ｎｍから７００ｎｍの波長領域の最大透過濃度が０．０１以上の物質の１種又は２種以上を含む上記薄膜；支持体がスライドグラス又はポリエチレンテレフタレートフイルムから選ばれる上記薄膜；上記支持体と上記薄膜との間に下塗り層が設けられた上記薄膜；並びに、上記薄膜が感光・現像・定着処理後の写真フイルムである上記薄膜も提供される。
【００２２】
本発明の別の態様により、上記のそれぞれの方法において定義された各工程に従ってプロテアーゼが関与する疾患を診断する方法が提供される。この発明の好ましい態様として、該疾患が、癌、リウマチ性疾患、歯周病、及び歯槽膿漏からなる群から選ばれる疾患である上記方法が提供される。
【００２３】
（発明を実施するための最良の形態）
上記の各態様のプロテアーゼの測定方法は、基本的には、プロテアーゼを含む試料を薄膜と接触させる工程（第一工程）と、プロテアーゼの作用により該薄膜上に形成された消化痕を検出する工程（第二工程）を含んでいる。この方法に用いられるプロテアーゼ測定用の薄膜は、基本的には、支持体表面上に単層又は多重層として形成されており、プロテアーゼ基質と硬膜剤とを必須の成分として含むことを特徴としている。従って、本発明の方法に従うと、試料と薄膜との接触工程の当初においては、試料と支持体とが接触しないという特徴がある。また、上記の薄膜は硬膜剤を含有しており、アガロースのようなバインダーが存在しないために、プロテアーゼにより消化されるゼラチンなどのプロテアーゼ基質の膜中密度が高く、例えばゼラチンなどのプロテアーゼ基質の架橋により消化痕の形態の崩れが防止されるので、プロテアーゼの測定感度や測定の再現性に優れるという特徴を有している。
【００２４】
本明細書において用いられる測定方法という用語は、定性及び定量を含めて最も広義に解釈されるべきである。本発明の方法では、試料中に含まれるプロテアーゼによってプロテアーゼ基質が消化され、薄膜上に消化痕が形成される。この消化痕は、例えば、必要に応じて適宜の染色などを行った後に顕微鏡下で検出することができ、試料中のプロテアーゼの存在を証明することができる。
【００２５】
本発明の方法の測定対象となるプロテアーゼとしては、例えば、マトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びマトリックス・セリンプロテアーゼ（ＭＳＰ）を挙げることができる。これらの酵素については、鶴尾隆編「癌転移の分子機構」、ｐｐ．９２−１０７、メジカルビュー社、１９９３年発行に詳細に説明されている。本発明の方法に特に好適なプロテアーゼとして、例えば、間質型コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）、及びゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）などのマトリックス・メタロプロテアーゼ；及びプラスミノーゲン・アクティベーター（ＰＡ）などのマトリックスセリンプロテアーゼを挙げることができるが、本発明の方法の対象はこれらのプロテアーゼに限定されることはない。
【００２６】
プロテアーゼ基質は、プロテアーゼの基質として分解される高分子化合物であれば特に限定されない。例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、又はカゼインなどを用いることができる。好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、又はカゼインを用いることができ、より好ましくはゼラチン、フィブロネクチン、又はカゼインを用いることができる。プロテアーゼ基質は上記の物質の１種を用いてもよいが、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
２種以上の異なるプロテアーゼ基質を組み合わせて用いることにより、生体試料中に含まれるプロテアーゼの種類を正確に特定できる場合がある。例えば、生体試料中の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つをプロテアーゼ基質を含む薄膜に接触させ、残りの切片を上記の薄膜に含まれるプロテアーゼ基質とは異なるプロテアーゼ基質を含む他の薄膜に接触させた後、それぞれの薄膜に形成された消化痕を対比する方法を採用することができる。この方法では、異なるプロテアーゼ基質をそれぞれ含有する３以上の薄膜を用いて測定を行なうことが可能である。また、例えば、プロテアーゼ基質を含有する第一の層と、第一の層に含まれるプロテアーゼ基質とは異なるプロテアーゼ基質を含有する第二の層とを含む単一の薄膜を製造し、プロテアーゼを含む試料を接触させた後に、それぞれの層に形成された消化痕を対比する方法を採用してもよい。この方法では、異なる種類のプロテアーゼをそれぞれ含有する３以上の層を積層した薄膜を用いることも可能である。
【００２８】
また、プロテアーゼ・インヒビターを用いることにより、インヒビターに関連するプロテアーゼの同定やプロテアーゼの特性の判定が容易になる場合もある。
プロテアーゼ・インヒビターとしては、例えば、ティッシュ・インヒビター・オブ・メタプロテアーゼ１（ＴＩＭＰ１）、ティッシュ・インヒビター・オブ・メタプロテアーゼ２（ＴＩＭＰ２）、ラージ・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ（ＬＩＭＰ）、チッキン・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ（ＣｈＩＭＰ）、オポスタチン、血小板第ＩＶ因子（ＰＦ−４）、α２マクログロブリン、ＥＤＴＡ、１，１０− フェナントロリン、ＢＢ９４、ミノサイクリン、マトリスタチン、ＳＣ−４４４６３、又は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などを挙げることができる。例えば、生体試料中の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つをプロテアーゼ基質を含む薄膜に接触させ、残りの切片をプロテアーゼ基質とプロテアーゼ・インヒビターとを含む他の薄膜に接触させた後、それぞれの薄膜に形成された消化痕を対比する方法を採用することができる。また、例えば、プロテアーゼ基質を含有する第一の層と、プロテアーゼ基質とプロテアーゼ・インヒビターとを含有する第二の層を含む単一の薄膜を製造し、プロテアーゼを含む試料を接触させた後に、それぞれの層に形成された消化痕を対比する方法を採用してもよい。プロテアーゼ・インヒビターを用いる上記の方法と、２種以上の異なるプロテアーゼを組み合わせて用いる上記の方法とをさらに組み合わせてもよい。
【００２９】
本発明の薄膜の製造に用いられる硬膜剤は、上記のプロテアーゼ基質の薄膜の製造において薄膜の硬化を促進し、及び／又は形成後の薄膜の膨潤を防止する作用を有している。硬膜剤の種類は、上記の作用を有し、かつ、プロテアーゼとプロテアーゼ基質との反応を実質的に阻害しない限り特に限定されず、無機又は有機の硬膜剤のいずれを用いてもよい。例えば、クロム塩（クロム明ばん、酢酸クロムなど）；アルデヒド類（ホルムアルデヒド、グリオキサール、グリタールアルデヒドなど）；Ｎ−メチロール化合物（ジメチロール尿素、メチロールジメチルヒダントインなど）；ジオキサン誘導体（２，３−ジヒドロキシジオキサンなど）、カルボキシル基を活性化することにより作用する化合物類（カルベニウム、２−ナフタレンスルホナート、１，１−ビスピロリジノ−１−クロロ−、ピリジニウム、１−モルホリノカルボニル−３−（スルホナトアミノメチル）−など）；活性ビニル化合物（１，３−ビスビニルスルホニル−２−プロパノール、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル、ビニルスルホニル基を側鎖に有するビニル系ポリマー、１，３，５−トリアクリロイル−ヘキサヒドロ−ｓ−トリアジン、ビス（ビニルスルホニル）メタンなど）；活性ハロゲン化合物（２，４−ジクロル−６− ヒドロキシ−ｓ− トリアジン及びそのナトリウム塩など）；ムコハロゲン酸類（ムコクロル酸、ムコフェノキシクロル酸など）；イソオキサゾール類；ジアルデヒド澱粉；又は、２−クロル−６− ヒドロキシトリアジニル化ゼラチンなどの硬膜剤を単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、ビニルスルホン酸型硬膜剤が好ましい。硬膜剤の使用量は特に限定されないが、例えば、プロテアーゼ基質としてゼラチンを用いる場合には、検出性能の点からゼラチン１００ｇに対して０．１〜２０ｍｍｏｌ、さらに好ましくは０．３〜１０ｍｍｏｌ程度を配合するのがよい。
本発明の方法に用いる試料としては、例えば、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採取した生体試料を用いることができる。生体試料としては、組織又は組織滲出液などを用いることができる。例えば、肺癌、胃癌、食道癌、乳癌、脳腫瘍などの固形癌組織から手術や組織検査などにより分離・採取した癌組織、リウマチ性関節炎の滑膜や骨組織、及び歯槽膿漏の歯根膜や骨組織などの破壊性病変組織や滲出液、並びに歯周病の歯肉溝滲出液などを用いることができる。
【００３０】
試料が組織の場合には、例えば、液体窒素で急速凍結した試料から凍結切片作成装置を用いて厚さ１〜１０μｍ、好ましくは５μｍ程度の切片を調製し、この切片を薄膜に貼付することによって試料と薄膜とを接触させることができる。また、リウマチ性関節炎の患者から採取した滑膜液を試料として用いる場合には、滑膜液約５〜５０μｌ、好ましくは２０μｌ程度を薄膜上に滴下すればよい。歯周病の歯肉溝滲出液を試料として用いる場合には、歯肉溝内に濾紙を挿入して約５〜１０μｌ程度の歯肉溝滲出液を採取し、該濾紙を薄膜に貼付する方法を採用することができる。歯肉溝滲出液の採取後、必要に応じて蒸留水や適宜の緩衝液（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．５，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，０．２Ｍ ＮａＣｌなど）を用いて濾紙から歯肉溝滲出液を抽出し、抽出液を薄膜上に滴下してもよい。
【００３１】
組織内のプロテアーゼの存在を顕微鏡下で観察できるように、薄膜は透明又は半透明の支持体上に形成されることが好ましい。このような透明又は半透明の支持体としては、例えば、ガラス、又はポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ナイロン、セルロース、若しくはトリアセテート等からなる透明又は半透明プラスチックフイルムなどを用いることができる。ガラスとしては顕微鏡用のスライドグラスを用いることが好ましく、プラスチックフイルムとしてはポリエチレンテレフタレートフイルムを用いることが好ましい。もっとも、支持体はこれらに限定されることはなく、均一な薄膜を製造することができ、検鏡に適するものであればいかなるものを用いてもよい。
【００３２】
また、歯肉溝滲出液などの試料溶液を薄膜表面に滴下すると、滴下により形成される円形の塗布面の円周に沿って消化痕が検出される場合がある。このような場合には必ずしも顕微鏡下での検出を必要としないので、上記の支持体に加えて、不透明な支持体を用いることも可能である。例えば、紙、合成紙、合成樹脂（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンナフタレート等）をラミネートした紙、金属板（例えば、アルミニーウム、アルミニウム合金、亜鉛、鉄、銅などの板）、上記の金属がラミネート又は蒸着された紙やプラスチックフイルムなどを用いることができる。このような態様においては支持体に着色が施されていてもよい。
【００３３】
支持体の厚さは特に限定されないが、ガラスの場合にはスライドグラス程度の厚さのもの（例えば２〜３ｍｍ程度）が好ましく、ポリエチレンテレフタレートフイルムの場合には約１００〜２５０μｍ、より好ましくは約１５０〜２００μｍ、特に好ましくは １７５μｍ程度のものを用いることができる。該支持体上の薄膜は単層又は重層で形成することができるが、薄膜はできる限り均一な表面を与えるように調製すべきである。例えば、乾燥後の膜厚が１〜１０μｍ、好ましくは ４〜６μｍ程度になるように調製することが好ましい。
【００３４】
薄膜の調製には、例えば、水、又はメチレンクロライド、アセトン、メタノール、エタノール、若しくはそれらの混合溶媒などの有機溶媒に分散したプロテアーゼ基質を支持体表面に塗布して乾燥すればよい。塗布方法としては、例えば、ディップ塗布法、ローラー塗布法、カーテン塗布法、押し出し塗布法などを採用することができる。もっとも、薄膜の調製方法はこれらに限定されることはなく、例えば、写真用フイルムの技術分野などにおいて汎用されている薄膜形成方法などを適宜採用することが可能である。なお、プロテアーゼ基質としてゼラチンを用いる場合には、ゼラチンの種類は特に限定されず、例えば、牛骨アルカリ処理ゼラチン、豚皮膚アルカリ処理ゼラチン、牛骨酸処理ゼラチン、牛骨フタル化処理ゼラチン、豚皮膚酸処理ゼラチンなどを用いることができる。
【００３５】
薄膜を支持体上に形成するにあたり、薄膜と支持体との接着を改善するために、薄膜と支持体表面との間に下塗り層を設けてもよい。例えば、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ブタジエン、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、無水マレイン酸等から選ばれるモノマーの１種又は２種以上を重合させて得られる重合体又は共重合体、ポリエチレンイミン、エポキシ樹脂、グラフト化ゼラチン、又はニトロセルロースなどの重合体を下塗り層として形成することができる。また、ポリエステル系支持体を用いる場合には、下塗り層に替えて、支持体表面をコロナ放電処理、紫外線処理、又はグロー放電処理することによっても、支持体と薄膜との接着力を改善できる場合がある。
【００３６】
本明細書において用いられる「支持体表面上に形成された薄膜」という用語またはその同義語については、このような１又は２以上の下塗り層及び／又は支持体表面の処理を排除するものと解釈してはならない。もっとも、薄膜と支持体との接着を改善するための手段は上記のものに限定されることはなく、例えば、写真用フイルムの技術分野などにおいて汎用されている手段を適宜採用することができる。
【００３７】
また、薄膜を製造する際に、上記の成分に加えて、染料、顔料、防腐剤、安定化剤などの成分を適宜配合してもよい。このような成分は、プロテアーゼとプロテアーゼ基質との反応を実質的に阻害しない限り、適宜のものを選択して用いることが可能である。染料としては、例えば、特開平６−１０２６２４号公報に記載された染料（第９頁Ｉ−１より第４７頁６３までの化学構造式により具体的に示された染料）を用いることができ、染料の添加方法は、例えば、特開平５−３１３３０７号公報に記載された方法（第１１頁段落番号［００３７］から第１２頁段落番号［００４４］までに具体的に説明された方法）を採用することができる。染料や顔料を添加することにより消化痕の検出が容易になる場合があるが、このような目的のためには、染料や顔料のほか、金属や金属酸化物を配合してもよい。金属、金属酸化物、染料、顔料などの物質を添加する場合には、製造後の薄膜が４００ｎｍから７００ｎｍまでの波長領域の最大透過濃度が０．０１以上であることが好ましい。これらの物質の１種又は２種以上を薄膜に配合することができ、薄膜を形成する各層にそれぞれ異なる物質、例えば色の異なる染料などを配合してもよい。なお、薄膜の製造にあたりアガロースを用いるとプロテアーゼ検出の再現性が低下するので、本発明の薄膜の製造にアガロースを用いることは好ましくない。
【００３８】
本発明の方法では、例えば、組織切片を薄膜に貼付するか、あるいは液体試料を薄膜上に滴下することによって薄膜とプロテアーゼを含む試料とを接触させた後、好ましくは３７℃の湿潤箱内で、組織切片については例えば１〜２４時間、好ましくは２〜１２時間、さらに好ましくは３〜６時間程度、液状試料については０．５〜１２時間、好ましくは１〜６時間、さらに好ましくは１〜３時間程度インキュベートする。試料中にプロテアーゼが含まれる場合には、薄膜内のプロテアーゼ基質がプロテアーゼによって分解され、薄膜上に消化痕が形成される。必要に応じて薄膜を染色した後、肉眼や顕微鏡下で消化痕を観察することにより、プロテアーゼの存在を証明することができる。また、分光光度計による光分解を利用して評価を行ってもよい。
【００３９】
プロテアーゼ基質としてゼラチンを用いる場合には、ゼラチン染色後に消化痕を観察することが好ましい。ゼラチン染色は、例えば、１％アミドブラックやクマジーブルーなどを用いて、常法に従って行うことができる。例えば、アミドブラックを用いたゼラチン染色では、ゼラチン薄膜は黒紺色に染色されるが、プロテアーゼによりゼラチン薄膜上にゼラチン消化痕が形成されると、その消化痕の部分にはゼラチンが存在しないので、染色されない白抜き部分が現れる。写真用フイルムの表面にはゼラチン薄膜が形成されているので、写真用フイルム（例えばネオパンＦ、富士写真フイルム株式会社製）を感光させて通常の現像、定着、水洗、乾燥処理を行ったものを薄膜として用いてもよい。この場合には、感光した黒色のフイルム上に消化痕が白抜き部分として観察できる。
【００４０】
本発明の方法の別の態様に従えば、癌組織などから連続凍結切片を作成し、実質的に連続した二切片のうちの一方の切片を、例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色切片などの通常の組織標本として調製し、他の切片を本発明の測定方法に従って処理し、両者の観察結果を比較・対比することによって組織中の個々の細胞に由来するプロテアーゼの存在を正確に把握することが可能である。このようなプロテアーゼの測定方法により、組織中に存在する個々の癌細胞の悪性度（浸潤活性及び転移活性など）を正確に判定することが可能であり、癌疾患の予後についての的確な判定が可能になる。また、リウマチ性関節炎の関節液や歯肉溝滲出液などの試料中のプロテアーゼを定量することにより、これらの疾患の病態や進行程度を正確に判定することができるが、試料中のプロテアーゼ定量のためには、予め作成した標準溶液を用いて検量線を作成することが好ましい。
【００４１】
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
例１：プロテアーゼ測定用薄膜の製造
牛骨アルカリ処理ゼラチン１０ｇを純水１２７ｇに溶解し、硬膜剤として１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン（２％）０．８ｍｌを添加した。この溶液を下塗りを施したポリエチレンテレフタレートフイルム上に乾燥膜厚が約５μｍになるように均一に塗布し、乾燥してゼラチン薄膜とした。ゼラチン薄膜は使用時まで室温で保存した。
【００４２】
例２：プロテアーゼ測定用薄膜の製造
例１と同様にして牛骨アルカリ処理ゼラチン溶液を調製し、この溶液をスライドグラス上に乾燥膜厚が約６μｍとなるように均一に塗布し、乾燥してゼラチン薄膜を製造した。また、牛骨アルカリ処理ゼラチンに替えて、豚皮膚アルカリ処理ゼラチン、牛骨酸処理ゼラチン、牛骨フタル化処理ゼラチン、豚皮膚酸処理ゼラチン（シグマ社製＃Ｇ２６２５）、及び豚皮膚酸処理ゼラチン（シグマ社製＃Ｇ２５００）をそれぞれ用いて、同様に各ゼラチン薄膜を製造した。
【００４３】
例３：プロテアーゼ活性測定
プロテアーゼ液体試料として、マトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（ヤガイ社製）をそれぞれ２ｐｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの濃度で含む溶液を用いた。また、生体試料としては、歯周病患者から採取した歯肉、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ： Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ Ｆｌｕｉｄ）、及び歯周病原菌（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＃３８１株； Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ Ｙ４株；及びＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１株）を培養した上清を用いた。例２で得たそれぞれのゼラチン薄膜上に液体試料約１０μｌを滴下し、組織試料は約５μｍの凍結切片として各ゼラチン薄膜上に貼付した。ゼラチン薄膜を湿潤箱内に入れて３７℃で４〜１６時間インキュベートし、その後、クマジーブルーで染色した。
【００４４】
この結果、いずれのゼラチン薄膜にもプロテアーゼによるゼラチンの消化によって染色されない部位（白抜きの部分：ゼラチン消化痕）が認められた。特に、牛骨フタル化処理のゼラチン薄膜は液体試料の場合に顕著なゼラチン消化を与え、豚皮膚酸処理のゼラチン薄膜も液体試料及び組織切片に対して強いゼラチン消化痕を与えた。ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９について、４時間後に２００ｎｇ／ｍｌ、８時間後に２０ｎｇ／ｍｌ、１６時間後に２０−２００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲でプロテアーゼ活性が認められた。歯肉溝滲出液の多くはプロテアーゼ活性を認めるまでに約８〜１６時間を要し、プロテアーゼの量が２ｐｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの範囲であることが示唆された。また、組織切片でのプロテアーゼ活性は、内縁上皮、外縁上皮、及び上皮下結合組織中の炎症性細胞浸潤が強い部位に認められた。
【００４５】
例４：癌組織のプロテアーゼ活性測定
被検組織試料として舌扁平上皮癌、肺癌、及び食道癌の手術標本を厚さ約０．５ｃｍ×幅２ｃｍの大きさに切り出し、液体窒素で急速凍結して−８０℃で保存した。この標本から凍結切片作成装置を用いて厚さ５μｍの連続切片を作成し、一枚をスライドグラスに張り付けて乾燥させた後、１０％ホルマリンで５分間固定し、その後、常法に従ってヘマトキシリン・エオシン染色を行った。他の連続切片を例２及び例３で製造した各ゼラチン薄膜上に貼付し、湿潤箱に入れて３７℃で３〜６時間インキュベートした。
インキュベート終了後にゼラチン薄膜を１％アミドブラック溶液で染色し、乾燥した後に検鏡した。プロテアーゼ活性が発現している部分は白抜きのゼラチン消化痕を与えており、一方、他の部分は濃い青黒色であった。いずれの癌組織にも癌胞巣を形成する個々の癌細胞にゼラチン消化痕が認められたが、特に癌胞巣辺縁に位置する細胞に強いゼラチン消化痕が認められた。正常扁平細胞ではゼラチンの消化が弱いながらも認められたが、この上皮が異型増殖するに従ってゼラチンの消化が強く認められた。
【００４６】
例５：症例（口腔上顎歯肉癌）
標本中の癌細胞は胞巣構造を形成する低分化型扁平上皮癌で、骨組織を破壊して強い浸潤を示していた。癌胞巣中の癌細胞に対応するゼラチン薄膜は消化されてゼラチン薄膜標本上に白抜きのゼラチン消化痕を与えていたが、特に癌胞巣の辺縁に位置する細胞に対応する部位に強いゼラチン消化痕が認められた。標本中の巣状の炎症性細胞浸潤部位に対応する部分には、強い顆粒状のゼラチン消化痕が生じていた。癌胞巣を拡大して観察すると、癌胞巣辺縁に位置する増殖域の細胞に強いゼラチン消化痕が認められ、癌胞巣に隣接する間質の繊維芽細胞にも顆粒状にゼラチンの消化痕が認められた。
【００４７】
例６：症例（舌癌）
標本中の癌細胞は未分化型扁平上皮癌で大小の癌胞巣が存在していた。癌胞巣の辺縁部の癌細胞に対応する部位にいずれにも強いゼラチン消化痕が認めら、癌の増殖域の細胞に相当する部位ではゼラチンの消化痕が顕著であった。巣状の炎症性細胞浸潤巣に対応する部分にも顆粒状のゼラチン消化痕が認められた。
【００４８】
例７：症例（口腔粘膜の高度上皮異形成症）
ヘマトキシリン・エオシン染色標本では、上皮に高度上皮異形成症が認められ、棘細胞層の肥厚と基底細胞の重層化が生じていた。特に基底細胞には多形成や異型性の細胞増殖が認められた。ゼラチン薄膜上では、肥厚した棘細胞層及び顆粒細胞層に対応する部分に強いゼラチン消化痕を認めたが、基底細胞層では点状にゼラチン消化痕を認めたのみであった。この結果は、上皮細胞のターンオーバーが盛んに行われており、一方、基底細胞では上皮化結合織への浸潤が生じていることを示している。
棘細胞の肥厚と重層化した基底細胞を拡大して観察すると、いずれの細胞層に対応する部分にもゼラチン消化痕が認められたが、特に、棘細胞と重層化基底細胞に対応する部分ではゼラチンが顕著に消化されていた。一方、単層又は２層の基底細胞ではゼラチンの消化が重層化基底細胞より弱かった。また、重層化した基底細胞は紡錘形となり、細胞の多形成や異型性が認められたが、異型性を示す増殖傾向の細胞に対応する部分はゼラチン薄膜上に強いゼラチン消化痕を形成していた。
【００４９】
例８：液状試料のプロテアーゼ活性測定
リウマチ患者の滑膜液約２０μｌをゼラチン薄膜上に滴下し、３７℃の湿潤箱内で１〜３時間インキュベートした。その後、ゼラチン薄膜を１％アミドブラックで染色したところ、滴下によりゼラチン薄膜上に形成された円形の塗布跡の円周に強いゼラチン消化痕が認められた。特に、牛骨フタル化処理のゼラチン薄膜を用いた場合には特に顕著なゼラチン消化痕が観察できた。
【００５０】
例９：歯周病におけるプロテアーゼ活性測定
歯面の唾液及びプラークを可及的に綿球で除去して簡易防湿した後、ペリオペーパーを歯肉溝に挿入して９０秒間静置し、歯肉溝滲出液（約５〜１０μｌ程度）をペリオペーパーに吸い取らせた。このペリオペーパーを１５０μｌの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，０．２Ｍ ＮａＣｌ）で抽出して試料溶液とし、例３と同様の方法に従ってプロテアーゼの測定を行った。この結果、歯肉溝滲出液の滴下によりゼラチン薄膜上に形成された円形の塗布跡の円周に沿って強いゼラチン消化痕が認められた。
【００５１】
例１０：プロテアーゼ測定用薄膜の製造
牛骨アルカリ処理ゼラチン１５ｇを純水１２３ｇに溶解し、硬膜剤として１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン（４％ 水溶液）０．６ｍｌを添加した。この溶液をスライドグラス上に乾燥膜厚が約７μｍになるように均一ワイヤーバーコーターを使って塗布し、乾燥して薄膜（単層薄膜：試料１０１）とした。薄膜は使用時まで室温で保存した。また、牛骨アルカリ処理ゼラチンの代わりに表１に示したプロテアーゼ基質を使用し、硬膜剤、添加剤、支持体を変更又は追加して、試料１０１と同様にして試料１０２〜１３０を作成した。なお、塗布の際には必要に応じて塗布助剤を使用した。なお、表中の染料１はアミドブラックを示し、顔料１は銅フタロシアニンを示す。
【００５２】
【表１】
例１１：プロテアーゼ測定用薄膜の製造
コラーゲンＩ溶液（和光純薬株式会社製、３ｍｇ／ｍｌ）をスライドグラス上に乾燥膜厚が約１μｍになるように均一ワイヤーバーコーターを使って塗布し、乾燥して薄膜（単層薄膜：試料１３１）とした。薄膜は使用時まで室温で保存した。また、コラーゲンＩの代わりに表２に示したプロテアーゼ基質を使用し、硬膜剤、添加剤、支持体を変更又は追加して、試料１３１と同様にして試料１３２〜１６０を作成した。なお、塗布の際には必要に応じて塗布助剤を使用した。
【００５４】
【表２】
塗布の際にワイヤーバーコーターの代わりにスライドコーターを使用した他は試料１２１〜１３０と同様にして試料１６１〜１７０を作成した。なお、乾燥条件は、必要に応じて１０℃にいったん冷却した後、常温常湿で乾燥する方法を採用した。
例１２：プロテアーゼ活性測定 プロテアーゼ液体試料として例３に記載したＭＭＰ−２を用い、例１１で得たそれぞれの薄膜上に約１０μｌを滴下した。薄膜を湿潤箱内に入れて３７℃で４〜１６時間インキュベートし、その後、透明な試料はアミドブラック溶液で染色した。活性の評価方法としては、それぞれの試料に対して、▲１▼目視による判定、▲２▼ミクロデンシトメトリーによる微小部分の濃度測定による判定、及び▲３▼接触式膜厚測定機による膜厚測定による判定を行った。結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
【表４】
【表５】
プロテアーゼ・インヒビターを添加しなかった膜膜では、いずれについてもプロテアーゼによりプロテアーゼ基質が消化された白抜きの部分（消化痕）が認められ、この部分の光学濃度及び膜厚は周辺部に比べて減少していた。一方、プロテアーゼ・インヒビターを添加した試料についてはプロテアーゼ活性が抑制されたために消化痕を認めなかった。また、スライドコーターによって作成した試料１６０〜１７０はバーコーターによって作成した試料と同様の結果を与えた。
例１３：プロテアーゼ活性測定 プロテアーゼ液体試料として、マトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１、をそれぞれ２ｐｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの濃度で含む溶液を用い、例１１で得た試料１０１に対して例１２と同様の方法により測定を行って検量線を作成した。結果を表４に示す。
【００６０】
【表６】
表４の結果をグラフ上にプロットし、生体試料を用いた場合の消化痕の光学濃度（２．６）を与えるマトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１の濃度を求めた。この結果、生体試料中のプロテアーゼの濃度は約４０ｐｇ／ｍｌであった。
例１４：プロテアーゼ活性測定 生体試料として、歯周病患者から採取した歯肉、歯肉溝滲出液、及び歯周病の組織試料を約５μｍの凍結切片として薄膜試料１０１〜１６０の上に貼付した。薄膜を湿潤箱内に入れて３７℃で４〜１６時間インキュベートし、その後、透明な試料はアミドブラック溶液で染色した。活性の評価方法としては、それぞれの試料に対してはっきりと活性が認められる箇所について、▲１▼目視による判定、▲２▼ミクロデンシトメトリーによる微小部分の濃度測定による判定、及び▲３▼接触式膜厚測定機による膜厚測定による判定を行った。結果を表５に示す。
【００６２】
【表７】
【表８】
【表９】
生体試料の凍結切片を直接設置する方法においても、各薄膜にはプロテアーゼによるプロテアーゼ基質の消化痕（白抜きの部分）が形成されており、この部分の光学濃度と膜厚は周辺部に比べて減少していた。
【００６６】
例１５：プロテアーゼ測定用薄膜の製造
牛骨アルカリ処理ゼラチン１５ｇを純水１２３ｇに溶解し、硬膜剤として１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン（４％）０．６ｍｌを添加した。この溶液をスライドグラス上に乾燥膜厚が約７μｍになるように均一ワイヤーバーコーターを使って塗布し、乾燥して薄膜とした。牛骨アルカリ処理ゼラチン１５ｇを純水１２３ｇに溶解し、硬膜剤として１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン（４％）０．６ｍｌとポリメチルメタクリレート粒子（平均粒径２μｍ）を添加した。この溶液を、すでに作成した乾燥薄膜の表面に乾燥膜厚が約７μｍになるように均一ワイヤーバーコーターを使って塗布し、乾燥して薄膜とした（多層薄膜：試料３０１）。薄膜は使用時まで室温で保存した。また、プロテアーゼ基質、硬膜剤、変更又は追加して、表６に示す薄膜を作成した。なお、塗布の際には必要に応じて塗布助剤、粘度調整剤を使用し、表中の青色染料１、緑色染料１、及び赤色染料としては、それぞれ以下の化合物を用いた。
【００６７】
【化１】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
塗布の際にワイヤーバーコーターの代わりにスライドコーターを使用した他は試料３０１〜３３０と同様にして試料３３１〜３６０を作成した。なお、乾燥条件は必要に応じて１０℃にいったん冷却した後常温常湿にて乾燥する方法を採用した。
例１６：プロテアーゼ活性測定 例１２と同様の方法でプロテアーゼの活性測定を行った。結果を表７に示す。この結果から、多層の薄膜においてもプロテアーゼ活性を非常に明確に判定可能であることがわかった。スライドコーターによって作成した試料３３１〜３６０はバーコーターによって作成した試料と同様の結果を示した。
【００７２】
【表１３】
例１７：プロテアーゼ測定用薄膜の製造とプロテアーゼ活性測定
牛骨アルカリ処理ゼラチン１５ｇを純水１２３ｇに溶解し、硬膜剤として１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン（４％）０．６ｍｌを添加した。この溶液をバック層にスライドコーターを使って塗布し、乾燥して薄膜とした他は試料３３１〜３６０と同様にして試料５０１〜５３０を作成した。また、試料５０１〜５３０のバック層の上にポリマーラテックス層を塗布、乾燥した試料５３１〜５６０を作成した。これらの試料について試料３３１〜３６０と同様にプロテアーゼ活性測定を行ったところ、同様な評価結果が得られた。また、これらの試料はカールなどが起きず、薄膜の取扱い性において非常に良好であった。
【００７４】
例１８：写真用フイルムを用いたプロテアーゼの測定
ネオパンＦ（写真用黒白フイルム：富士写真フイルム株式会社製）を完全に感光させた後、通常の方法に従って現像、定着、及び水洗を行った後に乾燥させた。この写真用フイルムをプロテアーゼ測定用のゼラチン薄膜として用い、フイルム上に実施例４で調製した癌組織の切片を貼付して、実施例４と同様の方法に従ってプロテアーゼ活性の測定を行った。この結果、プロテアーゼの存在しない部分は黒色のままであったが、実施例４で染色により調製した薄膜上に認められた消化痕と同様の消化痕が白抜き部分として認められた。ただし、例１、例２、例１０、例１１、例１５、及び例１７で製造した薄膜に比べると検出性能は劣っていた。
【００７５】
例１９：ラジオグラフィ用乳剤を用いたプロテアーゼの測定および測定結果（比較例）
生体試料として、歯周病患者から採取した歯肉、歯肉溝滲出液、及び歯周病の組織試料を約５μｍの凍結切片としてスライドグラス上設置した。その上に水で希釈したラジオグラフィ用乳剤ＮＲＭ２又はＮＲＨ２（コニカ株式会社製）を塗布し、乾燥して薄膜を形成した。薄膜を湿潤箱内に入れて３７℃で１６時間〜１４日間インキュベートし、その後、アミドブラックで染色するか、または黒白現像処理をした。その結果、プロテアーゼの活性はほとんど検出できなかった。１４日間インキュベートした後に黒白現像処理した試料においてわずかに活性らしいものを示したが、活性部の表示が非常に曖昧であり、本発明の薄膜に比べてプロテアーゼの検出能は著しく劣っていた。
【００７６】
（産業上の利用可能性）
本発明の方法は、組織中に局在する特定部位や組織中の個々の細胞に由来するプロテアーゼを正確かつ簡便に測定することができ、しかも短時間に判定できるという特徴がある。従って、本発明の方法は、浸潤や転移活性などの癌細胞の悪性度、歯周炎などの歯周病の進行度、リウマチや歯槽膿漏などの破壊性病態などの正確な診断に有用である。また、本発明の方法に従えば、極めて微量の試料からプロテアーゼ活性を測定することが可能であり、判定後の薄膜を固定標本として永久保存することもできる。[0001]
(Technical field)
The present invention relates to a method for measuring a protease. More specifically, it enables accurate diagnosis of malignancy of cancer such as invasive activity and metastatic activity of cancer cells, progression of periodontal disease such as periodontitis, destructive pathology of rheumatoid arthritis, etc. The present invention relates to a method for measuring a protease.
[0002]
(Conventional technology)
One of the factors that determine the difference between benign and malignant tumors is the presence or absence of infiltration into stromal connective tissue. In order to elucidate this pathological condition, it is necessary to observe changes in the growth kinetics of tumor cells themselves and to search for factors that influence the interaction between tumor cells and stromal connective tissue. In particular, it has been clarified that protease is involved in invasion and metastasis of tumor cells, and there is a possibility that invasion and metastasis of malignant tumor cells can be suppressed by controlling protease. Among such proteases (extracellular matrix-degrading enzymes), it has been revealed that matrix metalloprotease (MMP) plays an important role in the growth, invasion and angiogenesis of cancer cells (Tsuru Tsuruo) "Molecular Mechanisms of Cancer Metastasis", Chapter 8, by Kaoru Miyazaki, "Matrix Protease and Cancer Invasion and Metastasis", pp. 92-107, published by Medical View, 1993).
[0003]
On the other hand, in periodontal disease, the destruction of the gingival sulcus epithelium and the destruction of connective tissue mainly composed of collagen progress as early lesions, and it is known that matrix metalloproteinase is also involved in the destruction of this tissue. (For the involvement of protease in periodontal tissue destruction, and the correlation between the disease state and protease, see Masao Aono, "Science of Periodontal Therapy," written by Masaharu Shirakawa, Chapter VII, "Pathology of Periodontal Tissue," pp. 99- 109, Medical and Dental Medicine Publishing, and see Hasegawa et al., "Gelatinase Activity in Gingival Crevicular Fluid (GCF) in Periodontal Disease Patients", Abstract A-44, 37th Annual Meeting of the Japanese Society of Periodontology, etc. ).
[0004]
Matrix metalloprotease is an enzyme that degrades extracellular matrix such as collagen, proteoglycan, laminin, fibronectin, and gelatin. Eight types such as MMP-1,2,3,7,9 and 10 have been identified. I have. Stromal collagenase (MMP-1) is the oldest known matrix metalloprotease, distributed in fibroblasts, cartilage, etc., and reduces stromal collagen to 1/4 and 1/3. Cut into pieces. In periodontal disease, MMP-2 (gelatinase A) and MMP-9 (gelatinase B) mainly destroy type IV collagen, laminin, fibronectin, proteoglycan, and the like, which are components of periodontal tissue. The secretion of matrix metalloprotease is strongly promoted by cell growth factors EGF and TGF-β, while secretion and activity expression are controlled by endogenous inhibitors in tissues. However, it is not always clear how the expression is suppressed when a growth factor is involved.
[0005]
Another protease involved in tumor cell invasion and metastasis includes plasminogen activator (PA), which is a serine protease. This plasminogen activator is an enzyme that converts plasminogen into plasmin, and plasmin generated by the action of the plasminogen activator converts prometalloprotease into active metalloprotease. Therefore, it is thought that the cascade formed between the matrix metalloprotease and the plasminogen activator promotes or accelerates the invasion and metastasis of cancer cells.
[0006]
Protease is involved in destructive lesions such as invasion and metastasis of the above-mentioned cancer cells, progression of periodontal disease, destruction of bone tissue and periodontal ligament due to alveolar pyorrhea, and destruction of periosteum and bone tissue due to rheumatoid arthritis. (For the involvement of proteases in rheumatism, see Japanese clinical study, 50 (3), pp. 463-467, 1992). Therefore, by quantifying proteases in cells and tissues, it is possible to accurately diagnose the degree of malignancy of cancer cells, pathological conditions of periodontal disease, and the degree of progress of destructive lesions such as rheumatism from the viewpoint of invasive activity and metastatic activity. (For correlation between the degree of invasion of cancer cells and protease activity, see, for example, Yamagata, et al., Cancer Lett., 59, 51, 1991; Azzam, et al., J. Natl., Cancer Inst. , 85, 1758, 1993; Brown, et al., Clin. Exp. Metastasis, 11, 183, 1993; Davies, et al., Br. J. Cancer, 67, 1126, 1993, etc.).
[0007]
Conventionally, as a method for measuring a protease, a zymography method for measuring enzyme activity from the degree of decomposition of a substrate, an immunoblotting method using an antibody specific to each protease, and the like have been used. For example, after crushing cancer cells and periodontal diseased cells, the extract is subjected to electrophoresis using SDS-polyacrylamide gel containing gelatin, and the gel after electrophoresis is stained with amide black, and is not stained. A method is known in which a sample that gives a white and transparent band is determined to be protease positive. However, in this method, it is necessary to prepare an SDS-polyacrylamide gel for each measurement, and there is a problem that it takes about 30 hours to detect.
[0008]
There is also a method in which the gel is adhered to the membrane after electrophoresis by SDS-PAGE, and the enzyme after blotting is detected with a monoclonal antibody. However, it has the same drawbacks as the above method in using electrophoresis. In addition, there is a problem that the operation requires skill and that an expensive monoclonal antibody is used. Furthermore, these methods do not measure the protease of individual cells, but detect the total amount of protease in the whole tissue, and have the problem that information on the invasive / metastatic activity of individual cancer cells cannot be obtained. .
[0009]
Recently, a method for measuring the protease activity in vascular tissue based on the principle of zymography has been proposed (The FASEB Journal, Vol. 9, July, pp. 974-980, 1995).
In this method, casein or gelatin to which a fluorescent compound is bound is used as a substrate for a protease, a thin film of agarose containing the substrate is formed on a slide glass, and then a tissue section not fixed to the surface of the thin film ( 6-10 μm) and culturing at 37 ° C., and observing the digestion of the substrate under a fluorescent microscope (see the protocol on page 975, right column, lines 6-18). Although this method is excellent in that it can directly measure protease in tissue, it requires the use of agarose as an essential component in order to immobilize the protease substrate on a slide glass. This causes a problem of poor reproducibility.
[0010]
(Disclosure of the Invention)
An object of the present invention is to provide a simple and accurate method for measuring a protease. More specifically, malignancy of cancer cells such as invasiveness and metastatic activity, pathological conditions such as periodontal disease, and the progress of destructive lesions such as rheumatism can be accurately and easily determined in a short time, and the prognosis of cancer and It is an object of the present invention to provide a method for measuring a protease useful for accurately predicting the degree of progress of a destructive lesion.
[0011]
Another object of the present invention is to provide a method for measuring a protease having the above characteristics, which method accurately measures a protease derived from a cancer cell or the like localized in a test tissue. .
Still another object of the present invention is to provide a thin film used in the above-described method for measuring a protease.
[0012]
The present inventors have made intensive efforts to solve the above-mentioned problems, and as a result, a tissue section such as a cancer tissue is brought into close contact with the surface of a thin film containing a protease substrate such as gelatin and a hardening agent, or a periodontal disease or the like. It was found that when exudate collected from a diseased tissue or the like was dropped onto the thin film, the protease contained in the sample digested the thin film and formed a digestion mark on the thin film surface. In addition, the above method is much more reproducible than the method using a thin film containing agarose (The FASEB Journal, Vol. 9, July, pp. 974-980, 1995), and the protease activity in the sample is reduced. We found that we could measure accurately. Furthermore, it was found that the protease expressed in each cell in the tissue can be measured by preparing the tissue sample and the above-mentioned thin film sample using successive tissue sections and comparing and comparing them. . The present invention has been completed based on these findings.
[0013]
That is, the present invention relates to a method for measuring a protease, comprising the steps of: (1) contacting a sample containing a protease with a thin film formed on the surface of a support containing a protease substrate and a hardening agent; and (2) a protease. To detect a digestion mark formed on the thin film by the action of the method.
[0014]
According to a second aspect of the present invention, there is provided a method for measuring a protease, comprising the steps of: (1) providing a biological sample substantially continuous with a thin film formed on a surface of a support containing a protease substrate and a hardening agent; Contacting one of the two sections; (2) detecting a digestion mark formed on the thin film by the action of a protease; and (3) a tissue specimen prepared from another section and the digestion mark. And a method comprising the steps of:
[0015]
According to a third aspect of the present invention, there is provided a method for measuring a protease, wherein (1) a biological sample is substantially continuous with a thin film containing a protease substrate and a hardening agent and formed on the surface of a support. Contacting one of the two or more sections; (2) contacting the remaining section with a thin film formed on the surface of the support including a protease substrate, a hardener, and a protease inhibitor; ( 3) detecting digestion marks formed on the thin film by the action of protease; and (4) comparing the digestion marks of the thin film used in step (1) with the digestion marks of the thin film used in step (2). A method comprising the steps is provided. In a preferred embodiment of the method, the step (2) includes a step of contacting each of the remaining two or more sections with a thin film containing a different type of protease inhibitor.
[0016]
According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a method for measuring a protease, wherein (1) a biological sample is substantially continuous with a thin film formed on a surface of a support containing a protease substrate and a hardening agent. A step of bringing one of the two or more sections into contact with each other; (2) a thin film formed on the surface of the support containing a protease substrate different from the protease substrate contained in the thin film used in step (1) and a hardening agent (3) detecting digestion marks formed on the thin film by the action of protease; and (4) digesting marks of the thin film used in step (1) with step (2). ) Is provided. In a preferred embodiment of the method, the step (2) includes a step of contacting the remaining two or more sections with thin films each containing a different type of protease substrate.
[0017]
According to a fifth aspect of the present invention, there is provided a method for measuring a protease, comprising: (1) at least the following two layers: a substrate containing a protease substrate, a hardening agent, and a protease inhibitor; A) contacting a sample containing a protease with a thin film containing a layer and a (b) layer laminated on the (a) layer containing a protease substrate and a hardening agent; (2) contacting the thin film with the action of the protease Detecting a formed digestion mark; and (3) comparing the digestion mark of the (a) layer with the digestion mark of the (b) layer.
[0018]
According to a sixth aspect of the present invention, (1) at least the following two layers: a (a) layer formed on the surface of a support containing a protease substrate and a hardening agent, and a protease substrate contained in the (a) layer Contacting a sample containing protease with a thin film containing a protease substrate and a hardening agent different from (a) and a layer (b) laminated on the layer; (2) forming the thin film by the action of protease (3) comparing the digestion marks of the layer (a) with the digestion marks of the layer (b).
[0019]
These methods are characterized in that a sample containing a protease or a biological sample contacts the surface of the thin film without contacting the support.
According to yet another aspect of the present invention there is provided a thin film for measuring a protease as defined in each of the above methods.
[0020]
According to a preferred embodiment of these inventions, the protease substrate is selected from the group consisting of collagen, gelatin, proteoglycan, fibronectin, laminin, elastin, and casein, and the above-described method and a thin film; Each of the above methods and thin films that are biological samples; the biological sample is a cancer tissue section, a gingival crevicular fluid, or a destructive lesion tissue section or extract (eg, a rheumatic lesion tissue extract or an alveolar purulent tissue extract). A group consisting of each of the above methods and thin films; each of the above methods and thin films in which the protease is a matrix metalloprotease; each of the above methods and thin films for detecting digestion marks by staining; and metals, metal oxides, pigments, and dyes A substance having a maximum transmission concentration of 0.01 or more in the wavelength region of 400 nm to 700 nm selected from the group consisting of Are provided each of the above-described methods of performing detection using a thin film containing two or more types; and each of the above-described methods and a thin film, in which gelatin is stained with amide black or Coomassie blue using gelatin as a protease substrate, and digestion marks are stained with gelatin. .
[0021]
According to a preferred embodiment of the thin film of the present invention, one or two of a substance selected from the group consisting of a metal, a metal oxide, a pigment, and a dye and having a maximum transmission density of 0.01 or more in a wavelength region of 400 nm to 700 nm is 0.01 or more. A thin film containing a seed or more; a thin film wherein the support is selected from a slide glass or a polyethylene terephthalate film; a thin film having an undercoat layer provided between the support and the thin film; The above thin film, which is a photographic film after the fixing process, is also provided.
[0022]
According to another aspect of the present invention there is provided a method of diagnosing a disease associated with a protease according to each step defined in each of the above methods. As a preferred embodiment of the present invention, there is provided the above method, wherein the disease is a disease selected from the group consisting of cancer, rheumatic disease, periodontal disease, and alveolar pyorrhea.
[0023]
(Best Mode for Carrying Out the Invention)
The method for measuring a protease according to each of the above embodiments basically includes a step of bringing a sample containing a protease into contact with a thin film (first step) and a step of detecting a digestion mark formed on the thin film by the action of the protease. (Second step). The thin film for measuring protease used in this method is basically formed as a single layer or multiple layers on the surface of a support, and comprises a protease substrate and a hardening agent as essential components. I have. Therefore, according to the method of the present invention, at the beginning of the step of contacting the sample with the thin film, the sample is not in contact with the support. In addition, the thin film contains a hardening agent, and since there is no binder such as agarose, the density in the membrane of a protease substrate such as gelatin digested by a protease is high, for example, a protease substrate such as gelatin. Since cross-linking prevents the shape of digestion marks from being disrupted, it has the characteristic of being excellent in protease measurement sensitivity and measurement reproducibility.
[0024]
The term measurement method as used herein should be interpreted in the broadest sense, including qualitative and quantitative. In the method of the present invention, a protease substrate is digested by a protease contained in a sample, and a digestion mark is formed on a thin film. This digestion mark can be detected under a microscope, for example, after performing appropriate staining as necessary, and the presence of the protease in the sample can be proved.
[0025]
Examples of the protease to be measured in the method of the present invention include matrix metalloprotease (MMP) and matrix serine protease (MSP). These enzymes are described in "Molecular Mechanisms of Cancer Metastasis", edited by Takashi Tsuruo, pp. 139-143. 92-107, Medical View Inc., published 1993. Particularly suitable proteases for the method of the present invention are, for example, matrix metalloproteases such as stromal collagenase (MMP-1), gelatinase A (MMP-2) and gelatinase B (MMP-9); Matrix serine proteases such as gene activator (PA) can be mentioned, but the subject of the method of the present invention is not limited to these proteases.
[0026]
The protease substrate is not particularly limited as long as it is a polymer compound that is degraded as a protease substrate. For example, collagen, gelatin, proteoglycan, fibronectin, laminin, elastin, casein, or the like can be used. Preferably, collagen, gelatin, fibronectin, elastin, or casein can be used, and more preferably, gelatin, fibronectin, or casein can be used. As the protease substrate, one of the above substances may be used, or two or more of them may be used in combination.
[0027]
By using two or more different protease substrates in combination, the type of protease contained in a biological sample may be accurately specified in some cases. For example, one of two or more substantially continuous sections in a biological sample may be contacted with a thin film containing a protease substrate, and the remaining slices may contain a protease substrate different from the protease substrate contained in the thin film. After contact with the thin films, a method of comparing digestion marks formed on each thin film can be adopted. In this method, measurement can be performed using three or more thin films each containing a different protease substrate. In addition, for example, a single thin film including a first layer containing a protease substrate and a second layer containing a protease substrate different from the protease substrate contained in the first layer is produced, and a protease containing a protease is produced. After contacting the sample, a method of comparing digestion marks formed in each layer may be adopted. In this method, it is also possible to use a thin film in which three or more layers each containing a different type of protease are stacked.
[0028]
In some cases, the use of a protease inhibitor facilitates identification of a protease associated with the inhibitor and determination of the properties of the protease.
Examples of the protease inhibitor include tissue inhibitor of metaprotease 1 (TIMP1), tissue inhibitor of metaprotease 2 (TIMP2), large inhibitor of metalloprotease (LIMP), and chicken inhibitor. Of metalloprotease (ChIMP), opostatin, platelet factor IV (PF-4), α 2 Examples include macroglobulin, EDTA, 1,10-phenanthroline, BB94, minocycline, matristatin, SC-44463, and dithiothreitol (DTT). For example, one of two or more substantially continuous sections of a biological sample is contacted with a membrane containing a protease substrate, and the remaining sections are contacted with another membrane containing a protease substrate and a protease inhibitor. Thereafter, a method of comparing digestion marks formed on each thin film can be adopted. Also, for example, after producing a single thin film including a first layer containing a protease substrate and a second layer containing a protease substrate and a protease inhibitor, and contacting a sample containing a protease, May be adopted. The above method using a protease inhibitor and the above method using a combination of two or more different proteases may be further combined.
[0029]
The hardener used in the production of the thin film of the present invention has an action of accelerating the curing of the thin film and / or preventing the swelling of the formed thin film in the production of the above-mentioned protease substrate thin film. The type of hardener is not particularly limited as long as it has the above-mentioned action and does not substantially inhibit the reaction between the protease and the protease substrate, and any of inorganic or organic hardeners may be used. For example, chromium salts (chromium alum, chromium acetate, etc.); aldehydes (formaldehyde, glyoxal, glutaraldehyde, etc.); N-methylol compounds (dimethylolurea, methyloldimethylhydantoin, etc.); dioxane derivatives (2,3-dihydroxydioxane) And the like, which act by activating a carboxyl group (carbenium, 2-naphthalenesulfonate, 1,1-bispyrrolidino-1-chloro-, pyridinium, 1-morpholinocarbonyl-3- (sulfonatoaminomethyl) An active vinyl compound (1,3-bisvinylsulfonyl-2-propanol, 1,2-bis (vinylsulfonylacetamide) ethane, bis (vinylsulfonylmethyl) ether, a vinyl having a vinylsulfonyl group in the side chain. Polymers, 1,3,5-triacryloyl-hexahydro-s-triazine, bis (vinylsulfonyl) methane, etc.); active halogen compounds (2,4-dichloro-6-hydroxy-s-triazine and its sodium salt, etc.) ); Mucohalogenic acids (mucochloric acid, mucophenoxycyclolic acid, etc.); isoxazoles; dialdehyde starch; or hardening agents such as 2-chloro-6-hydroxytriazinylated gelatin alone or in combination of two or more Can be used in combination. Of these, vinyl sulfonic acid type hardeners are preferred. The amount of the hardener used is not particularly limited. For example, when gelatin is used as a protease substrate, 0.1 to 20 mmol, more preferably about 0.3 to 10 mmol per 100 g of gelatin is used from the viewpoint of detection performance. It is good to mix.
As a sample used in the method of the present invention, for example, a biological sample separated and collected from mammals including humans can be used. As the biological sample, tissue or tissue exudate can be used. For example, cancer tissues separated and collected from solid cancer tissues such as lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, breast cancer, and brain tumor by surgery or histological examination, synovium and bone tissue of rheumatoid arthritis, and periodontal ligament and bone of alveolar pyorrhea Destructive lesion tissues such as tissues and exudates, gingival crevicular exudates of periodontal disease, and the like can be used.
[0030]
When the sample is a tissue, for example, a section having a thickness of 1 to 10 μm, preferably about 5 μm is prepared from a sample that has been rapidly frozen with liquid nitrogen using a frozen section preparation apparatus, and the section is attached to a thin film. The sample and the thin film can be brought into contact. When a synovial fluid collected from a patient with rheumatoid arthritis is used as a sample, about 5 to 50 μl, preferably about 20 μl, of the synovial fluid may be dropped on the thin film. When using a gingival crevicular fluid for periodontal disease as a sample, a method of inserting a filter paper into the gingival sulcus, collecting about 5 to 10 μl of the gingival crevicular fluid, and applying the filter paper to a thin film is adopted. be able to. After collecting the gingival crevicular fluid, if necessary, distilled water or an appropriate buffer (eg, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM CaCl 2) 2 , 0.2 M NaCl) to extract the gingival crevicular fluid from the filter paper and drop the extract onto the thin film.
[0031]
The thin film is preferably formed on a transparent or translucent support so that the presence of the protease in the tissue can be observed under a microscope. As such a transparent or translucent support, for example, glass or a transparent or translucent plastic film made of polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, nylon, cellulose, triacetate, or the like can be used. As the glass, it is preferable to use a slide glass for a microscope, and as the plastic film, it is preferable to use a polyethylene terephthalate film. However, the support is not limited to these, and any support can be used as long as it can produce a uniform thin film and is suitable for microscopy.
[0032]
In addition, when a sample solution such as gingival crevicular fluid is dropped on the surface of the thin film, digestion marks may be detected along the circumference of the circular application surface formed by the dropping. In such a case, detection under a microscope is not necessarily required, so that an opaque support can be used in addition to the above-described support. For example, paper, synthetic paper, paper laminated with synthetic resin (eg, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene naphthalate, etc.), metal plate (eg, plate of aluminum, aluminum alloy, zinc, iron, copper, etc.) Paper or plastic film on which metal is laminated or deposited can be used. In such an embodiment, the support may be colored.
[0033]
The thickness of the support is not particularly limited, but in the case of glass, it is preferably about the thickness of a slide glass (for example, about 2 to 3 mm), and in the case of a polyethylene terephthalate film, it is about 100 to 250 μm, more preferably about 100 μm. Those having a size of 150 to 200 μm, particularly preferably about 175 μm can be used. The thin film on the support can be formed in a single layer or a multilayer, but the thin film should be prepared so as to give as uniform a surface as possible. For example, it is preferable to adjust the film thickness after drying to 1 to 10 μm, preferably 4 to 6 μm.
[0034]
For preparing the thin film, for example, a protease substrate dispersed in water or an organic solvent such as methylene chloride, acetone, methanol, ethanol, or a mixed solvent thereof may be applied to the surface of the support and dried. As a coating method, for example, a dip coating method, a roller coating method, a curtain coating method, an extrusion coating method, or the like can be adopted. However, the method for preparing the thin film is not limited to these, and for example, a thin film forming method widely used in the technical field of photographic films and the like can be appropriately adopted. When gelatin is used as the protease substrate, the type of gelatin is not particularly limited. For example, beef bone alkali-treated gelatin, pork skin alkali-treated gelatin, bovine acid-treated gelatin, bovine phthalated gelatin, pork skin Acid-treated gelatin can be used.
[0035]
In forming the thin film on the support, an undercoat layer may be provided between the thin film and the surface of the support to improve the adhesion between the thin film and the support. For example, polymers or copolymers obtained by polymerizing one or more monomers selected from vinyl chloride, vinylidene chloride, butadiene, methacrylic acid, acrylic acid, itaconic acid, maleic anhydride, etc., polyethyleneimine, A polymer such as an epoxy resin, grafted gelatin, or nitrocellulose can be formed as a subbing layer. When a polyester-based support is used, instead of the undercoat layer, the surface of the support may be subjected to corona discharge treatment, ultraviolet treatment, or glow discharge treatment to improve the adhesive strength between the support and the thin film. There is.
[0036]
As used herein, the term "thin film formed on a support surface" or a synonym thereof is to be interpreted as excluding one or more such subbing layers and / or treatment of the support surface. should not be done. However, the means for improving the adhesion between the thin film and the support is not limited to the above, and for example, means commonly used in the technical field of photographic films and the like can be appropriately employed.
[0037]
In producing a thin film, components such as a dye, a pigment, a preservative, and a stabilizer may be appropriately blended in addition to the above components. Such components can be appropriately selected and used as long as they do not substantially inhibit the reaction between the protease and the protease substrate. As the dye, for example, a dye described in JP-A-6-102624 (a dye specifically represented by a chemical structural formula from page 9, I-1 to page 47, 63) can be used. As a method for adding the dye, for example, a method described in JP-A-5-313307 (a method specifically described from page 11, paragraph number [0037] to page 12, paragraph number [0044]) is employed. can do. In some cases, the detection of digestion marks is facilitated by adding a dye or pigment. For such a purpose, a metal or metal oxide may be blended in addition to the dye or pigment. When a substance such as a metal, a metal oxide, a dye, or a pigment is added, it is preferable that the manufactured thin film has a maximum transmission density of 0.01 or more in a wavelength region from 400 nm to 700 nm. One or more of these substances can be blended in the thin film, and different substances, for example, dyes of different colors, may be blended in each layer forming the thin film. The use of agarose in the production of the thin film of the present invention is not preferred because the use of agarose in the production of the thin film lowers the reproducibility of protease detection.
[0038]
In the method of the present invention, for example, after the tissue section is attached to the thin film, or the liquid sample is dropped on the thin film and the thin film and the sample containing the protease are brought into contact with each other, preferably in a wet box at 37 ° C. For tissue sections, for example, 1 to 24 hours, preferably 2 to 12 hours, more preferably about 3 to 6 hours, and for liquid samples, 0.5 to 12 hours, preferably 1 to 6 hours, more preferably 1 to 6 hours. Incubate for about 3 hours. When a protease is contained in the sample, the protease substrate in the thin film is decomposed by the protease, and a digestion mark is formed on the thin film. After staining the thin film as necessary, the presence of the protease can be proved by observing the digestion marks with the naked eye or under a microscope. Further, the evaluation may be performed by utilizing photolysis by a spectrophotometer.
[0039]
When using gelatin as a protease substrate, it is preferable to observe digestion marks after gelatin staining. Gelatin staining can be performed, for example, using 1% amide black or Coomassie blue according to a conventional method. For example, in gelatin staining using amide black, the gelatin thin film is stained in dark blue, but when protease forms a trace of gelatin digestion on the gelatin thin film, gelatin is not present in the digestive trace, White areas that are not stained appear. Since a thin gelatin film is formed on the surface of the photographic film, the photographic film (for example, Neopan F, manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) is exposed to light and subjected to normal development, fixing, washing, and drying. It may be used as a thin film. In this case, digestion marks can be observed as white portions on the exposed black film.
[0040]
According to another aspect of the method of the present invention, a serial frozen section is prepared from cancer tissue or the like, and one of two substantially continuous sections is cut into a normal tissue such as a hematoxylin-eosin stained section. Prepared as a specimen, treated other sections according to the measurement method of the present invention, and by comparing and comparing the results of both observations, it is possible to accurately grasp the presence of proteases derived from individual cells in the tissue. is there. By such a protease measurement method, it is possible to accurately determine the malignancy (invasive activity and metastatic activity, etc.) of individual cancer cells present in a tissue, and to accurately determine the prognosis of a cancer disease. Will be possible. In addition, by quantifying proteases in samples such as rheumatoid arthritis synovial fluid and gingival crevicular fluid, the pathology and progress of these diseases can be accurately determined. In this case, it is preferable to prepare a calibration curve using a standard solution prepared in advance.
[0041]
(Example)
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
Example 1: Production of thin film for protease measurement
10 g of beef alkali-treated gelatin was dissolved in 127 g of pure water, and 0.8 ml of 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane (2%) was added as a hardening agent. This solution was evenly applied to an undercoated polyethylene terephthalate film so as to have a dry film thickness of about 5 μm, and dried to form a gelatin thin film. The gelatin thin film was stored at room temperature until use.
[0042]
Example 2: Production of a thin film for protease measurement
In the same manner as in Example 1, a beef bone alkali-treated gelatin solution was prepared, and this solution was uniformly coated on a slide glass so as to have a dry film thickness of about 6 μm, and dried to produce a gelatin thin film. Further, instead of the alkali-treated gelatin from bovine bone, alkali-treated gelatin from pig skin, gelatin from bovine acid, gelatin from bovine bone, gelatin from pig skin (# G2625 manufactured by Sigma), and gelatin from pig skin ( Each gelatin thin film was similarly produced using each of # G2500 (manufactured by Sigma).
[0043]
Example 3: Protease activity measurement
As the protease liquid sample, a solution containing matrix metalloprotease (MMP) -1, MMP-2 and MMP-9 (manufactured by Yagai) at a concentration of 2 pg / ml to 200 ng / ml was used. Examples of the biological sample include gingiva, gingival crevicular fluid (GCF) collected from a periodontal disease patient, and periodontal pathogens (P. gingivalis # 381 strain; A. actinomycetemcomitans Y4 strain; and P. intermedia) (ATCC 25611 strain) was used. About 10 μl of the liquid sample was dropped on each of the gelatin thin films obtained in Example 2, and the tissue sample was stuck on each gelatin thin film as a frozen section of about 5 μm. The gelatin films were incubated in a humid box at 37 ° C. for 4-16 hours, and then stained with Coomassie blue.
[0044]
As a result, sites not stained by the digestion of gelatin by the protease (open portions: traces of gelatin digestion) were observed in any of the gelatin thin films. In particular, the bovine bone phthalated gelatin film gave significant gelatin digestion in the case of the liquid sample, and the pork skin acid treated gelatin film also gave strong gelatin digestion marks on the liquid sample and tissue sections. For MMP-1, MMP-2 and MMP-9, protease activity was observed at a concentration range of 200 ng / ml after 4 hours, 20 ng / ml after 8 hours, and 20-200 pg / ml after 16 hours. Most of the gingival crevicular fluid required about 8-16 hours to detect protease activity, suggesting that the amount of protease was in the range of 2 pg / ml to 20 ng / ml. In addition, protease activity in the tissue section was observed in the lining epithelium, the rim epithelium, and the subepithelial connective tissue where inflammatory cell infiltration was strong.
[0045]
Example 4: Measurement of protease activity in cancer tissue
Surgical specimens of tongue squamous cell carcinoma, lung cancer, and esophageal cancer were cut out as test tissue samples to a size of about 0.5 cm thick × 2 cm wide, rapidly frozen with liquid nitrogen, and stored at -80 ° C. A continuous section of 5 μm in thickness was prepared from this specimen using a frozen section preparation apparatus, and one piece was attached to a slide glass, dried, fixed with 10% formalin for 5 minutes, and then hematoxylin-eosin according to a conventional method. Staining was performed. Other serial sections were affixed on each of the gelatin films prepared in Examples 2 and 3 and placed in a wet box and incubated at 37 ° C for 3-6 hours.
After the incubation, the gelatin thin film was stained with a 1% amide black solution, dried, and then examined under a microscope. The part where the protease activity was expressed gave a white trace of gelatin digestion, while the other parts were dark blue-black. In each of the cancer tissues, traces of gelatin digestion were observed in individual cancer cells forming cancer nests, and particularly, strong gelatin traces were observed in cells located at the periphery of the cancer nests. In normal squamous cells, weak digestion of gelatin was observed, but as the epithelium grew abnormally, strong digestion of gelatin was observed.
[0046]
Example 5: Case (Oral maxillary gingival cancer)
The cancer cells in the specimen were poorly differentiated squamous cell carcinomas that formed alveolar structures, destructing bone tissue and showing strong invasion. The gelatin thin film corresponding to the cancer cells in the cancer nest was digested to give a white gelatin digestion mark on the gelatin thin film specimen, but it was particularly strong at the site corresponding to the cells located at the margin of the cancer nest. Traces of gelatin digestion were observed. A strong granular gelatin digestion mark was formed in the portion corresponding to the nested inflammatory cell infiltration site in the specimen. When the cancer nest was enlarged and observed, strong gelatin digestion marks were observed in cells in the proliferative zone located at the periphery of the cancer nest, and gelatinous fibroblasts adjacent to the cancer nest also became granular in gelatin. Digestion marks were observed.
[0047]
Example 6: Case (tongue cancer)
The cancer cells in the specimen were undifferentiated squamous cell carcinomas with large and small cancer nests. Strong traces of gelatin digestion were observed at the sites corresponding to the cancer cells at the margins of the cancer cell nests, and traces of gelatin digestion were remarkable at sites corresponding to cells in the growth zone of the cancer. Granular gelatin digestion marks were also observed in the area corresponding to the nest-like inflammatory cell infiltration nest.
[0048]
Example 7: Case (Severe epithelial dysplasia of the oral mucosa)
Hematoxylin and eosin-stained specimens showed severe epithelial dysplasia in the epithelium, with thickening of the spinous cell layer and stratification of basal cells. In particular, basal cells showed pluripotency and atypical cell proliferation. On the gelatin thin film, strong gelatin digestion marks were observed in portions corresponding to the thickened spine cell layer and granule cell layer, but only dot-like gelatin digestion marks were observed in the basal cell layer. This result indicates that epithelial cells are actively turned over while basal cells are invading epithelialized connective tissue.
When the thickened spike cells and the stratified basal cells were enlarged and observed, traces of gelatin digestion were observed in the portions corresponding to all cell layers, but in particular, in the portions corresponding to the spike cells and stratified basal cells, Gelatin was significantly digested. On the other hand, gelatin digestion was weaker in monolayer or bilayer basal cells than in stratified basal cells. In addition, the stratified basal cells were spindle-shaped, and polyplasia and atypia of the cells were observed.However, portions corresponding to atypically proliferating cells had strong traces of gelatin digestion on the gelatin thin film. .
[0049]
Example 8: Protease activity measurement of liquid sample
About 20 μl of a synovial fluid from a rheumatic patient was dropped on a gelatin thin film and incubated in a humid box at 37 ° C. for 1 to 3 hours. Thereafter, when the gelatin thin film was stained with 1% amide black, strong gelatin digestion marks were observed on the circumference of the circular coating mark formed on the gelatin thin film by dropping. In particular, when the gelatin thin film of the bovine bone phthalation treatment was used, particularly remarkable traces of gelatin digestion were observed.
[0050]
Example 9: Measurement of protease activity in periodontal disease
After removing the saliva and plaque on the tooth surface with a cotton ball as much as possible and performing simple moisture proofing, insert perio paper into the gingival sulcus and allow to stand for 90 seconds to remove gingival crevicular fluid (about 5 to 10 μl). Suck on paper. This perio paper was mixed with 150 μl of a buffer solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM CaCl 2). 2 , 0.2 M NaCl) to prepare a sample solution, and the protease was measured in the same manner as in Example 3. As a result, strong gelatin digestion marks were observed along the circumference of the circular coating mark formed on the gelatin thin film due to the dripping of the gingival crevicular fluid.
[0051]
Example 10: Production of thin film for protease measurement
15 g of beef bone alkali-treated gelatin was dissolved in 123 g of pure water, and 0.6 ml of 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane (4% aqueous solution) was added as a hardener. This solution was applied on a slide glass using a uniform wire bar coater so as to have a dry film thickness of about 7 μm, and dried to form a thin film (single-layer thin film: sample 101). The films were stored at room temperature until use. Samples 102 to 130 were prepared in the same manner as Sample 101, except that the protease substrates shown in Table 1 were used instead of the alkali-processed bovine bone gelatin, and the hardening agents, additives, and supports were changed or added. . At the time of coating, a coating aid was used as needed. Dye 1 in the table indicates amide black, and Pigment 1 indicates copper phthalocyanine.
[0052]
[Table 1]
Example 11: Production of a thin film for protease measurement
A collagen I solution (3 mg / ml, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is applied on a slide glass using a uniform wire bar coater so as to have a dry film thickness of about 1 μm, and dried to form a thin film (single-layer thin film: sample) 131). The films were stored at room temperature until use. Samples 132 to 160 were prepared in the same manner as Sample 131, except that the protease substrates shown in Table 2 were used instead of collagen I, and the hardening agents, additives, and supports were changed or added. At the time of coating, a coating aid was used as needed.
[0054]
[Table 2]
Samples 161 to 170 were prepared in the same manner as Samples 121 to 130 except that a slide coater was used instead of a wire bar coater at the time of coating. In addition, the drying conditions employ | adopted the method of once cooling to 10 degreeC as needed, and drying at normal temperature and normal humidity.
Example 12: Measurement of protease activity Using MMP-2 described in Example 3 as a protease liquid sample, about 10 µl was dropped on each thin film obtained in Example 11. The membrane was incubated in a humid box at 37 ° C. for 4-16 hours, after which the clear samples were stained with amide black solution. The activity was evaluated by (1) visual judgment, (2) microdensitometric measurement of the concentration of minute parts, and (3) film thickness using a contact-type film thickness measuring device. Judgment by measurement was performed. Table 3 shows the results.
[0056]
[Table 3]
[Table 4]
[Table 5]
In each of the membranes to which no protease inhibitor was added, a hollow portion (digestion mark) in which the protease substrate was digested by the protease was observed, and the optical density and the film thickness of this portion were smaller than those in the peripheral portion. Was. On the other hand, in the sample to which the protease inhibitor was added, no trace of digestion was observed because the protease activity was suppressed. Samples 160 to 170 prepared by the slide coater gave similar results to the samples prepared by the bar coater.
Example 13: Measurement of protease activity As a protease liquid sample, a solution containing matrix metalloprotease (MMP) -1 at a concentration of 2 pg / ml to 200 ng / ml, respectively, was used. The measurement was performed in the same manner as described above to prepare a calibration curve. Table 4 shows the results.
[0060]
[Table 6]
The results in Table 4 were plotted on a graph to determine the concentration of matrix metalloprotease (MMP) -1 that gave the optical density (2.6) of the digestion trace when a biological sample was used. As a result, the concentration of the protease in the biological sample was about 40 pg / ml.
Example 14: Measurement of protease activity As a biological sample, a tissue sample of gingiva, gingival crevicular fluid, and periodontal disease collected from a periodontal disease patient was affixed as a frozen section of about 5 μm on the thin film samples 101 to 160. The membrane was incubated in a humid box at 37 ° C. for 4-16 hours, after which the clear samples were stained with amide black solution. The activity was evaluated by: (1) visual judgment, (2) microdensitometric concentration measurement of minute parts, and (3) contact with respect to places where activity was clearly observed in each sample. Judgment was made by measuring the film thickness with a film thickness measuring device. Table 5 shows the results.
[0062]
[Table 7]
[Table 8]
[Table 9]
Even in the method of directly setting a frozen section of a biological sample, traces of digestion of protease substrate (open areas) are formed on each thin film, and the optical density and film thickness of this area are smaller than those of the surrounding area. Had decreased.
[0066]
Example 15: Production of a thin film for protease measurement
15 g of beef bone alkali-treated gelatin was dissolved in 123 g of pure water, and 0.6 ml of 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane (4%) was added as a hardening agent. This solution was applied on a slide glass using a uniform wire bar coater so that the dry film thickness was about 7 μm, and dried to form a thin film. 15 g of beef bone alkali-treated gelatin was dissolved in 123 g of pure water, and 0.6 ml of 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane (4%) and polymethyl methacrylate particles (average particle size: 2 μm) were added as hardening agents. . This solution was applied using a uniform wire bar coater on the surface of the already formed dry thin film so that the dry film thickness was about 7 μm, and dried to form a thin film (multilayer thin film: sample 301). The films were stored at room temperature until use. Further, thin films shown in Table 6 were prepared by changing or adding a protease substrate, a hardening agent, and the like. At the time of coating, a coating aid and a viscosity adjuster were used as needed, and the following compounds were used as blue dye 1, green dye 1 and red dye in the table, respectively.
[0067]
Embedded image
[Table 10]
[Table 11]
[Table 12]
Samples 331 to 360 were prepared in the same manner as Samples 301 to 330 except that a slide coater was used instead of a wire bar coater at the time of coating. In addition, the drying conditions employ | adopted the method of once cooling to 10 degreeC and drying at normal temperature and normal humidity as needed.
Example 16: Measurement of protease activity Protease activity was measured in the same manner as in Example 12. Table 7 shows the results. From this result, it was found that the protease activity can be determined very clearly even in a multilayer thin film. The samples 331 to 360 prepared by the slide coater showed the same results as the samples prepared by the bar coater.
[0072]
[Table 13]
Example 17: Production of protease measurement thin film and measurement of protease activity
15 g of beef bone alkali-treated gelatin was dissolved in 123 g of pure water, and 0.6 ml of 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane (4%) was added as a hardening agent. Samples 501 to 530 were prepared in the same manner as Samples 331 to 360 except that this solution was applied to the back layer using a slide coater and dried to form a thin film. In addition, polymer latex layers were applied on the back layers of samples 501 to 530, and dried samples 531 to 560 were prepared. When the protease activity of these samples was measured in the same manner as in Samples 331 to 360, similar evaluation results were obtained. In addition, these samples did not cause curling or the like, and were very good in handling of the thin film.
[0074]
Example 18: Measurement of protease using photographic film
After completely exposing Neopan F (black-and-white film for photography: manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.), the film was developed, fixed, washed with water and dried in a usual manner. The photographic film was used as a gelatin thin film for protease measurement. A section of the cancer tissue prepared in Example 4 was attached to the film, and protease activity was measured in the same manner as in Example 4. As a result, a portion where no protease was present remained black, but a digestion mark similar to the digestion mark observed on the thin film prepared by staining in Example 4 was recognized as a white portion. However, the detection performance was inferior to those of the thin films produced in Examples 1, 2, 10, 10, 11, and 17.
[0075]
Example 19: Measurement of protease using radiographic emulsion and measurement results (Comparative Example)
As biological samples, gingiva, gingival crevicular fluid, and periodontal disease tissue samples collected from periodontal disease patients were placed on slide glasses as frozen sections of about 5 μm. A radiographic emulsion NRM2 or NRH2 (manufactured by Konica Corporation) diluted with water was applied thereon and dried to form a thin film. The films were incubated in a humid box at 37 ° C for 16 hours to 14 days before staining with amide black or black and white development. As a result, almost no protease activity could be detected. Although the sample that had been subjected to black-and-white development after incubation for 14 days showed a slight activity, the indication of the active portion was very ambiguous, and the protease detection ability was significantly inferior to that of the thin film of the present invention.
[0076]
(Industrial applicability)
The method of the present invention is characterized in that a protease derived from a specific site located in a tissue or an individual cell in a tissue can be accurately and simply measured, and the determination can be made in a short time. Therefore, the method of the present invention is useful for accurate diagnosis of malignancy of cancer cells such as invasiveness and metastatic activity, progression of periodontal disease such as periodontitis, and destructive pathology such as rheumatism and alveolar pyorrhea. is there. Further, according to the method of the present invention, the protease activity can be measured from an extremely small amount of sample, and the thin film after the determination can be permanently stored as a fixed sample.
Claims (11)
（１）プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して組織切片を接触させる工程；及び
（２）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程
を含む方法
[ただし、
（１１）プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的に連続した二切片のうちの一つを接触させる工程；
（１２）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び
（１３）他の一つの切片から調製した組織標本と上記消化痕とを対比する工程を含むプロテアーゼの測定方法を除く]。A method for measuring a protease,
(1) a step of bringing a tissue section into contact with a thin film formed on the surface of a support containing a protease substrate and a hardening agent; and (2) a step of detecting a digestion mark formed on the thin film by the action of a protease. Methods including
[However,
(11) contacting one of two substantially continuous pieces of the biological sample with a thin film formed on the surface of the support, which comprises a protease substrate and a hardener;
(12) a method for measuring protease comprising a step of detecting a digestion mark formed on the thin film by the action of a protease; and (13) a step of comparing the digestion mark with a tissue specimen prepared from another slice. except].
（１）プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つを接触させる工程；
（２）工程（１）で用いた薄膜に含まれるプロテアーゼ基質とは異なるプロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させる工程；
（３）プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び
（４）工程（１）で用いた薄膜の消化痕と工程（２）で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程
を含む方法。A method for measuring a protease,
(1) contacting one of two or more substantially continuous sections of the biological sample with a thin film formed on the surface of a support containing a protease substrate and a hardener;
(2) a step of bringing the remaining section into contact with a thin film formed on the surface of the support, which comprises a protease substrate different from the protease substrate contained in the thin film used in step (1) and a hardening agent;
(3) detecting digestion marks formed on the thin film by the action of protease; and (4) comparing the digestion marks of the thin film used in step (1) with the digestion marks of the thin film used in step (2). A method comprising the steps of:
(1) プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つを接触させる工程；
(2) プロテアーゼ基質、硬膜剤、及びプロテアーゼ・インヒビターを含み支持体表面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させる工程；
(3) プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を検出する工程；及び
(4) 工程(1)で用いた薄膜の消化痕と工程(2)で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程
を含む方法。A method for measuring a protease,
(1) contacting one of two or more substantially continuous sections of the biological sample with a thin film formed on the surface of the support, which comprises a protease substrate and a hardening agent;
(2) contacting the remaining section with a thin film formed on the surface of the support, which comprises a protease substrate, a hardening agent, and a protease inhibitor;
(3) detecting a digestion mark formed on the thin film by the action of the protease; and
(4) A method including a step of comparing the digestion mark of the thin film used in the step (1) with the digestion mark of the thin film used in the step (2).
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