JP2001000197A - Measurement of protease activity - Google Patents

Measurement of protease activity

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JP2001000197A
JP2001000197A JP17482699A JP17482699A JP2001000197A JP 2001000197 A JP2001000197 A JP 2001000197A JP 17482699 A JP17482699 A JP 17482699A JP 17482699 A JP17482699 A JP 17482699A JP 2001000197 A JP2001000197 A JP 2001000197A
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protease
antibody
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thin film
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JP17482699A
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Japanese (ja)
Inventor
Riyouichi Nemori
Masahiko Tsuka
正彦 塚
良一 根守
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
富士写真フイルム株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simultaneously carrying out the measurement of protease activities and immunohistchemical by bringing a sample into contact with a thin film containing a protease substrate present on the surface of a supporter, dyeing and detecting a digested mark, and visualizing a specific material in the sample by an antibody.
SOLUTION: This method for simultaneously carrying out the measurement of protease activities and immunohistochemical observation comprises a step for bringing a sample containing a protease into contact with a thin film containing a protease substrate such as gelatin and casein, and detecting the digested marks formed on the thin film by the action of the protease, by dyeing the digested mark with a dye such as Ponceau 3R, and a stop for visualizing a specific material by using an antibody reacting with a specific material in the sample, such as an enzymically labeled antibody, fluorescently labeled antibody and gold-colloidally labeled antibody.
COPYRIGHT: (C)2001,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼの測定方法に関するものである。 BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to method for measuring protease. より具体的には、動脈粥状硬化プラークの破綻の危険性、癌細胞の浸潤活性や転移活性などの癌の悪性度、歯周炎などの歯周病の進行度、 More specifically, the risk of collapse of arterial atherosclerotic plaque, cancer malignancy such as invasion activity and metastasis activity of cancer cells, progress of periodontal diseases such as periodontitis,
リウマチ性関節炎などにおける破壊性病変などの正確な診断を可能にするプロテアーゼ測定方法に関するものである。 Relates protease measuring method allows accurate diagnosis of destructive lesions in such as rheumatoid arthritis.

【0002】 [0002]

【従来の技術】動脈粥状硬化の発生進展やプラークの破綻の危険性、癌細胞の浸潤や転移、歯周炎などの歯周病の進行、リウマチ性関節炎などにおける組織破壊の進行、創傷治癒過程、個体発生過程などにおいて、マトリックスメタロプロテアーゼ、プラスミノーゲンアクティベーターなど種々のプロテアーゼが関与することが知られており、それらのプロテアーゼの検出および定量方法として、抗体を用いたイミュノアッセイ法、免疫組織化学的方法、イミュノブロッティング法、電気泳動ザイモグラフィー法などが知られている。 BACKGROUND OF THE INVENTION risk of occurrence progress of or plaque rupture arterial atherosclerosis, cancer cell invasion and metastasis, progression of periodontal diseases such as periodontitis, progress of tissue destruction such as in rheumatoid arthritis, wound healing process, such as in ontogeny processes, matrix metalloproteinases, it is known that various proteases such as plasminogen activator are involved, as the detection and quantification methods for their protease, immunoblotting assays using antibodies, immune histochemical method, immunoblotting method, is known as electrophoresis zymography method. また、組織中におけるプロテアーゼの活性を測定する方法として、The FASE Further, as a method for measuring the activity of proteases in the tissue, The FASE
B Journal, Vol.9, July, pp.974-980, 1995あるいはWO B Journal, Vol.9, July, pp.974-980, 1995 or WO
97/32035に示されるいわゆるin situ zymography法がある。 97/32035 there is a so-called in situ zymography method shown in.

【0003】 [0003]

【発明が解決しようとする課題】生理現象あるいは病態を詳しく解析するためには、in situ zymography法によるプロテアーゼ活性の測定と同時に、プロテアーゼ蛋白あるいは組織中に存在するその他の物質の存在位置に関しても情報を得たい場合がある。 To detail analyzing THE INVENTION It is an object Solved] physiology or pathology, in situ zymography method simultaneously with the measurement of protease activity by, information with regard location of other substances present in the protease protein or tissue in some cases it is desired to obtain a. しかしながら、The FA However, The FA
SEB Journal, Vol.9, July, pp.974-980, 1995又はWO97 SEB Journal, Vol.9, July, pp.974-980, 1995 or WO97
/32035に示された方法ではプロテアーゼ活性の測定のみが可能であり、プロテアーゼ自体やその他の物質の存在量、分布に関しての情報は得られなかった。 / In the illustrated method 32035 are possible only measurement of protease activity, the abundance of the protease itself or other substances, the information regarding the distribution was not obtained. 本発明の課題は、プロテアーゼ活性の測定方法において、同じ組織上でプロテアーゼ自体やその他の物質の存在部位をプロテアーゼと同時に解析できる方法を提供することにある。 An object of the present invention is a method for measuring protease activity and the presence site of the protease itself or other substances to provide a method that can analyze at the same time as the protease on the same tissue.

【0004】 [0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ゼラチン等の薄膜の染色により消化痕を観察すると同時に、膜上の組織に含まれる目的物質に対する免疫組織化学的観察を併用すると、プロテアーゼ活性の測定と同時に他の目的物質の存在部位などに関する情報を入手でき、診断などをより正確に行うことができることを見いだした。 The present inventors have SUMMARY OF THE INVENTION As a result of intensive studies to solve the above problems, and at the same time observing the trace of digestion by staining a thin film such as gelatin, for target substance contained in the tissue on the membrane When used immunohistochemical observation, simultaneously with the measurement of protease activity can obtain information such as the present site of another target substance, it was found that it is possible to perform diagnosis and more accurate. 本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。 The present invention has been accomplished based on these findings.

【0005】すなわち本発明は、プロテアーゼ活性測定と免疫組織化学的観察とを同時に行う方法であって、 [0005] The present invention is a method for measuring protease activity and immunohistochemical observation and at the same time,
(1)プロテアーゼ基質を含み支持体表面に形成された薄膜に対して、プロテアーゼを含む試料を接触させる工程;(2)プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を、該薄膜を染料で染色することにより検出する工程;及び(3)試料中の特定の物質に反応する抗体を用いて、該物質を可視化する工程を含む方法を提供するものである。 (1) the thin film formed on the support surface comprises a protease substrate, contacting the sample containing the protease; a trace of digestion formed on the thin film by the action of (2) protease, a thin film with a dye step detected by staining; using antibodies reactive to a particular substance and (3) in a sample is a substance intended to provide a method including the step of visualizing.

【0006】また、本発明の別の態様によれば、プロテアーゼ活性測定と免疫組織化学的観察とを同時に行う方法であって、(1)プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して、プロテアーゼを含む試料を接触させる工程;(2)プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を、該薄膜を染料で染色することにより検出する工程;及び(3)試料中の特定の物質に反応する抗体を用いて、該物質を可視化する工程を含む方法が提供される。 [0006] According to another aspect of the present invention, there is provided a method of performing measuring protease activity and immunohistochemical observation and at the same time, forming a support surface and a (1) a protease substrate and a hardening agent against thin films, contacting a sample containing protease; (2) the traces of digestion formed on the thin film by the action of a protease, the process is detected by staining the thin membrane with a dye; and (3) using antibodies that react to a specific substance in a sample, comprising the step of visualizing is provided a substance.

【0007】さらに、本発明の別の態様によれば、プロテアーゼ活性測定と免疫組織化学的観察とを同時に行う方法であって、(1)プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して生体試料の実質的に連続した2以上の切片のうちの一つを接触させる工程;(2)プロテアーゼ基質、硬膜剤、及びプロテアーゼ・インヒビターを含み支持体表面に形成された薄膜に対して残りの切片を接触させる工程;(3)プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を、該薄膜を染料で染色することにより検出する工程;(4)工程(1)で用いた薄膜の消化痕と工程(2)で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程;及び(5)試料中の特定の物質に反応する抗体を用いて、該物質を可視化する工程を含む方法が提供さ [0007] Furthermore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method of performing measuring protease activity and immunohistochemical observation and at the same time, forming a support surface and a (1) a protease substrate and a hardening agent contacting one of the two or more substantially continuous slices against the thin film of the biological sample is: (2) protease substrate, is formed on the hardener, and the support surface comprises a protease inhibitor contacting the remaining sections the thin film was; (3) the traces of digestion formed on the thin film by the action of a protease, the process is detected by staining the thin membrane with a dye; (4) step (1) a step of comparing the thin film of traces of digestion using a thin film trace of digestion and process using in (2); and (5) using an antibody that reacts with a specific substance in a sample, the step of visualizing the substance the method is provided of which includes る。 That. この発明の好ましい態様では、工程(2)においてプロテアーゼ・インヒビターがキレート剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、 In a preferred embodiment of the invention, the protease inhibitor is a chelating agent in the step (2), matrix metalloproteinase inhibitors,
セリンプロテアーゼ阻害剤である上記方法が提供される。 The method is provided a serine protease inhibitor.

【0008】これらの発明の好ましい態様によれば、該試料が患者又は疾患が疑われるヒトおよび他の哺乳動物から分離・採取した生体試料、あるいは実験動物から分離・採取した生体試料である上記方法;生体試料が組織又は体液中の細胞である上記方法;生体試料が動脈粥状硬化組織、癌組織、リンパ節、歯周病組織、破壊性病変組織、皮膚、子宮内膜、子宮粘膜組織、喀痰、尿沈査である上記方法;プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼである上記方法;薄膜がマトリックスメタロプロテアーゼ基質又はセリンプロテアーゼ基質を含む薄膜である上記方法;薄膜の消化を可視染料又は蛍光染料により可視化する上記方法;染料が赤色、橙色、及び黄色からなる群から選ばれる染料(最大吸収波長が4 [0008] The above method is preferred according to the embodiment, the biological sample sample is separated and collected from humans and other mammals suspected patient or disease, or biological samples separated and collected from the experimental animals, these inventive ; the method the biological sample is a cell of a tissue or body fluid; biological sample arterial atherosclerotic tissue, cancerous tissue, lymph node, periodontal disease tissue, destructive lesion tissue, skin, endometrial, uterine mucosal tissue, by visible dyes or fluorescent dyes in the digestion of the thin film; the method is a thin film membrane comprises a matrix metalloproteinase substrate or serine protease substrates; the process is protease matrix metalloproteinase or a serine protease; sputum, the method is urine sediment the method for visualizing; dyes red, orange, and dye (maximum absorption wavelength selected from the group consisting of yellow 4 0nm〜580nm)である上記方法;染料がポンソー3Rである上記方法;抗体がモノクローナル抗体である上記方法が提供される。 The method is 0nm~580nm); the method the dye is Ponceau 3R; the method the antibody is a monoclonal antibody is provided.

【0009】別の好ましい態様によれば、試料中の特定の物質に反応する抗体が酵素標識抗体、蛍光標識抗体、 According to another preferred embodiment, the antibody is enzyme-labeled antibody reacting to a specific substance in the sample, fluorescently labeled antibody,
又は金コロイド標識抗体である上記方法;試料中の特定の物質に反応する抗体に対して特異的に結合する標識抗体又は抗体酵素複合体を用いて試料中の特定の物質の存在部位を可視化する上記方法;試料中の特定の物質に反応する抗体と特異的に反応する酵素標識抗体、蛍光標識抗体、又は金コロイド標識抗体を2次抗体として用いる上記方法;2次抗体としてビオチン標識抗体を用い、該2次抗体を酵素標識アビジン、蛍光標識アビジン、又は金コロイド標識アビジンを用いて可視化する上記方法; To visualize the presence site of a particular substance with a labeled antibody or antibody-enzyme conjugate in the sample that specifically binds to an antibody that reacts to a specific substance in the sample; the methods or colloidal gold-labeled antibody said method; specific antibodies reactive to substances that react specifically enzyme-labeled antibody in a sample, the method used fluorescent labeled antibodies, or colloidal gold-labeled antibody as a secondary antibody; with biotin-labeled antibody as a secondary antibody the method of visualizing with the secondary antibody enzyme-labeled avidin, a fluorescent labeled avidin, or a colloidal gold-labeled avidin;
プロテアーゼ基質がゼラチン又はカゼインである上記方法:画像処理装置を用いて消化痕の定量又は数値化、あるいは特定の物質の定量又は数値化を行う上記方法が提供される。 The method protease substrate is gelatin or casein: quantifying or digitizing the trace of digestion with the image processing apparatus or the method for the quantitative or quantify a specific substance. また、別の観点から、これらの方法に使用する薄膜が本発明により提供される。 Further, from another point of view, a thin film for use in these methods are provided by the present invention.

【0010】 [0010]

【発明の実施の形態】本明細書において用いられる測定方法という用語は、定性及び定量を含めて最も広義に解釈されるべきである。 The term measuring methods used in the Detailed Description of the Invention The present specification should be interpreted in its broadest sense, including qualitative and quantitative. 本発明のプロテアーゼの測定方法では、試料中に含まれるプロテアーゼによってプロテアーゼ基質が消化され、薄膜中に消化痕が形成される。 In the measurement method of the protease of the invention, the protease substrate is digested by proteases contained in the sample, traces of digestion are formed in the thin film. この消化痕は染料による薄膜の染色により、濃度の低い部分として顕微鏡下で検出することができ、試料中のプロテアーゼ活性の存在を証明することができる。 The traces of digestion is staining of the thin film by the dye, can be detected under a microscope as a lower part of the concentration, it is possible to prove the existence of protease activity in the sample. また、同じ試料中に含まれる特定の物質を、該物質に対して結合する抗体、好ましくは該物質に特定的に結合するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的に検出することにより、プロテアーゼ活性測定と免疫組織化学的観察とを同時に行い、プロテアーゼ活性の存在と特定の物質の存在との関係を調べることができる。 Further, a specific substance contained in the same sample, antibodies which bind to the substance, preferably by immunohistochemical detection using a monoclonal antibody that specifically binds to the substance, measuring protease activity and performed immunohistochemical observation and at the same time, it is possible to examine the relationship between the presence of protease activity and the presence of a particular substance. 本発明の方法に用いる薄膜としては、WO97/32035に記載されたものを用いることができる。 The thin film used in the method of the present invention, it is possible to use those described in WO97 / 32035. 硬膜剤又はプロテアーゼインヒビターなども上記文献に記載のものを用いることができる。 Such hardeners or protease inhibitors may also be used those described in the above literature. 上記 the above
WO97/32035の開示を参考として本明細書の開示に含める。 The disclosure of WO97 / 32035 included in the disclosure herein as reference.

【0011】本発明の対象となるプロテアーゼとしては、例えばマトリックス・メタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼを挙げることができ、これらの酵素については、鶴尾隆編「癌転移の分子機構」、pp.92-107、 [0011] As subject to proteases of the present invention, for example, can be mentioned matrix metalloprotease and serine protease, for these enzymes, Tsuruo Takashihen "molecular mechanisms of cancer metastasis", Pp.92-107 ,
メジカルビュー社、1993年発行に詳細に説明されている。 Medical View Co., Ltd., are described in detail in the issue in 1993. 本発明の方法に特に好適なプロテアーゼとして、例えば、間質型コラーゲナーゼ(MMP-1)、ゼラチナーゼA Particularly suitable protease in the methods of the present invention, for example, interstitial-type collagenase (MMP-1), gelatinase A
(MMP-2)、及びゼラチナーゼB (MMP-9)などのマトリックス・メタロプロテアーゼ;及びプラスミノーゲン・アクティベーター(PA)、トリプシンなどのセリンプロテアーゼを挙げることができるが、本発明の方法の対象は上記の特定のプロテアーゼに限定されることはない。 (MMP-2), and matrix metalloproteinases, such as gelatinase B (MMP-9); and plasminogen activator (PA), can be exemplified serine proteases such as trypsin, the subject method of the present invention and it is not limited to the specific protease.

【0012】プロテアーゼ基質は、プロテアーゼの基質として分解される高分子化合物であれば特に限定されない。 [0012] protease substrate is not particularly limited as long as it is a polymer compound which is decomposed as a substrate for proteases. 例えばコラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、 For example, collagen, gelatin, proteoglycan,
フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、またはカゼインなどを用いることができる。 It can be used fibronectin, laminin, elastin or casein and the like. 好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、又はカゼインを用いることができ、より好ましくはゼラチンまたはカゼインを用いることができる。 Preferably, it is possible to use collagen, gelatin, fibronectin, or casein, more preferably it is possible to use gelatin or casein. 2種以上の異なるプロテアーゼ基質を組み合わせて用いることにより、生体試料中に含まれるプロテアーゼの種類を正確に特定できる場合がある。 By using a combination of two or more different protease substrates, there is a case where the type of protease contained in a biological sample can be accurately identified. 例えば、カゼインとプラスミノーゲンを混合して基質薄膜を作製することにより、プラスミノーゲンアクティベーター類の活性を測定することができる。 For example, by manufacturing a substrate film by mixing casein and plasminogen can be measured the activity of the plasminogen activator class. プロテアーゼ基質を含む薄膜の膜厚は、乾燥後の膜厚が1〜10 The film thickness of the thin film containing a protease substrate, the film thickness after drying is 1 to 10
μ、好ましくは4〜7μのものを用いることが好適である。 mu, preferably preferably used in consideration of 4~7Myu.

【0013】本発明の方法に用いる試料としては、患者又は疾患が疑われるヒト及びそれ以外の哺乳動物から分離・採取した生体試料、あるいは実験動物から分離・採取した生体試料を用いることができる。 [0013] The sample used in the methods of the present invention, it is possible to use human and biological samples separated and collected from other biological samples were separated and collected from the mammal or experimental animals, suspected patient or disease. 例えば、動脈粥状硬化性病変の他、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、肝臓癌、口腔癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌などの癌組織から手術や組織検査などにより分離・採取した病変部組織、またはリンパ節、歯周病組織、リウマチ性関節炎の滑膜や骨組織などの組織から手術や組織検査などにより分離・採取した組織、または乳腺異常分泌液、尿、喀痰などに含まれる細胞を用いることができる。 For example, other arterial atherosclerotic lesions, lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, liver cancer, oral cancer, prostate cancer, renal cancer, cancer tissues, such as bladder cancer separation and collection due operation or histological examination from the lesion tissue, or lymph node, periodontal disease tissue, tissue separated and collected by such operation or histological examination from tissues such as synovial and bone tissue of rheumatoid arthritis, or mammary abnormal secretion, urine, it can be used cells contained like sputum.

【0014】試料が組織の場合には、例えば、液体窒素で急速凍結した試料から凍結切片作成装置を用いて厚さ1〜10μm、好ましくは4〜6μmの切片を調製し、 [0014] When the sample is a tissue, for example, a thickness of 1~10μm a freeze sectioning device from rapidly frozen samples in liquid nitrogen, preferably prepared Sections of 4 to 6 [mu] m,
この切片を薄膜に貼付することによって試料と薄膜とを接触させることができる。 The sections can be contacted with the sample and the thin film by sticking the thin film. 穿刺吸引により採取した組織検体についても、コンパウンドと共に液体窒素で急速凍結し、同様に切片を作製して用いることができる。 For even tissue specimen collected by aspiration, snap frozen in liquid nitrogen with compounds, it can be used to prepare a similar sectioned. また、穿刺吸引により採取した組織検体について細胞診を行う場合には、吸引した検体をプロテアーゼ基質を含む薄膜の上に吐出して分散状態で接着させることで試料と薄膜とを接触させることができる。 Further, when the cytology for tissue sample obtained by needle aspiration can be brought into contact with the sample and the thin film by causing the sucked specimen is ejected on the thin film containing a protease substrate is bonded in a dispersed state . さらに、組織検体の場合は、採取した組織の水分を軽く拭った後、プロテアーゼ基質を含む薄膜の上に軽く押しつけることで試料の細胞の一部を薄膜表面に転写させ薄膜と接触させることができる。 Furthermore, in the case of tissue specimens, after wiping lightly water collected tissue, the portion of the sample of cells can be contacted with the thin film is transferred onto the thin film surface by pressing lightly on the thin film containing a protease substrate .

【0015】本発明の方法では、例えば、プロテアーゼ基質を含む薄膜にプロテアーゼを含む試料を接触させた後、プロテアーゼ活性の発現に適した温度、例えば37 [0015] In the process of the present invention, for example, after contacting a sample containing a protease to a thin film containing a protease substrate, a temperature suitable for expression of protease activity, for example 37
℃の飽和湿度条件下で基質の消化に必要な時間インキュベートする。 ℃ incubated for the times required for digestion of the substrate with a saturated humidity conditions. 必要な時間は試料によって異なるが、好ましくは、例えば組織切片あるいは細胞については37℃ Although the required time varies depending on the sample, preferably, 37 ° C. for example tissue sections or cells
で1〜48時間、さらに好ましくは6〜30時間インキュベートし、試料中のプロテアーゼによって薄膜中に消化痕を形成させる。 In 1 to 48 hours, more preferably incubated 6-30 hours, to form traces of digestion on the thin film by a protease in the sample. その後、薄膜を染料で染色し光学顕微鏡などを用いて消化痕を観察することができる。 Then, thin film can be observed traces of digestion by using a light microscope and stained with a dye. さらに、試料中の特定の物質を検出するために、該物質に特異的に反応する抗体を用いて免疫組織化学的な染色を行う。 Furthermore, in order to detect a specific substance in a sample, it performed immunohistochemical staining using an antibody that specifically reacts with the substance.

【0016】プロテアーゼ基質を含む薄膜の染色に好ましい染料として、赤色、橙色、及び黄色からなる群から選ばれる1種又は2種以上の染料を用いることができる。 [0016] Preferred dyes for dyeing a thin film containing a protease substrate, it is possible to use red, orange, and one or more dyes selected from the group consisting of yellow. 本明細書において用いられる赤色、橙色、又は黄色という用語はもっとも広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 The term red, orange, or yellow as used herein should be interpreted most broadly, should not be construed in any limitative way. このような染料は、一般的には、吸収極大が400 nm〜580 nmの範囲である。 Such dyes are generally the absorption maximum is in the range of 400 nm~580 nm. 赤色染料としてはAcid Red 1 (CI1805 The red dye Acid Red 1 (CI1805
0), Acid Red 4(CI14710), Acid Red 8 (CI1490 0), Acid Red 4 (CI14710), Acid Red 8 (CI1490
0), Acid Red 37 (CI17045), Acid Red 40(CI180 0), Acid Red 37 (CI17045), Acid Red 40 (CI180
70), Acid Red 44 ,Acid Red 106 (CI18110), Acid 70), Acid Red 44, Acid Red 106 (CI18110), Acid
Red 183 (CI18800), Xylidin Ponceau 2R(CI1615 Red 183 (CI18800), Xylidin Ponceau 2R (CI1615
0), Mordant Red 19, Nitro Red、およびポンソー3 0), Mordant Red 19, Nitro Red, and Ponceau 3
Rをあげることができ、特にポンソー3Rが好ましい。 It is possible to increase the R, especially Ponceau 3R is preferable.
橙色の染料としてはMethyl Orange, Ethyl Orange, C As the dye orange Methyl Orange, Ethyl Orange, C
rocein Orange G, Orange II, Orange G, Acid Oran rocein Orange G, Orange II, Orange G, Acid Oran
ge 8 (CI15575), Acid Orange 74 (CI18745)が挙げられ、黄色の染料としてはMordant Yellow 10, Morda ge 8 (CI15575), Acid Orange 74 (CI18745) can be mentioned, Mordant Yellow 10 as a yellow dye, Morda
nt Yellow 7, Acid Yellow 99(CI13900), Acid Yello nt Yellow 7, Acid Yellow 99 (CI13900), Acid Yello
w 65(CI14170), Acid Yellow 17 (CI18965), Nit w 65 (CI14170), Acid Yellow 17 (CI18965), Nit
razine Yellow(CI14890)が好ましく使用できる。 razine Yellow (CI14890) can be preferably used.

【0017】抗体を用いて可視化する試料中の物質の種類は特に限定されないが、例えば、細胞表面あるいは細胞内の各種レセプターや抗原などを挙げることができ、 [0017] Although not particularly limited on the kind of material in a sample visualized using antibodies, for example, it can be mentioned various receptor or antigen on the cell surface or intracellularly,
癌細胞、免疫系細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞などに特異的に存在する物質を対象とすることができる。 Cancer cells, immune system cells, fibroblasts, epithelial cells, can be directed to a substance that specifically present in such smooth muscle cells. また、MMPやPAその他の酵素を対象とすることができ、各種コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどの細胞外マトリックスや接着分子を対象としてもよい。 Further, it is possible to target MMP and PA other enzymes, various collagens, fibronectin, may be directed to the extracellular matrix and adhesion molecules, such as vitronectin.

【0018】これらの物質に特異的に反応する抗体としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いてもよいが、好ましくはモノクローナル抗体を用いることができる。 [0018] may be either polyclonal or monoclonal antibodies as an antibody which specifically reacts with these substances, but can be preferably used monoclonal antibody. 抗体としては、マウス、ラット、 As the antibody, a mouse, rat,
ウサギ、犬、羊、ヤギ、馬等の動物で産生されたIgGが好ましい。 Rabbits, dogs, sheep, goats, animal IgG produced in such as horse preferred. さらにこれらの抗体を検出するための2次抗体として、抗マウスIgG、抗ラットIgG、抗ウサギIgG 、 Further as a secondary antibody to detect these antibodies, anti-mouse IgG, anti-rat IgG, anti-rabbit IgG,
抗イヌIgG 、抗ヒツジIgG 、抗ヤギIgG 、抗ウマIgGなどの抗体を、金コロイド、蛍光色素、酵素、又はビオチンなどで修飾したものを好適に用いることができる。 Anti-dog IgG, anti-sheep IgG, anti-goat IgG, antibodies such as anti-horse IgG, colloidal gold, fluorescent dyes, enzymes, or biotin can be preferably used a material obtained by modifying the like. 2
次抗体としてビオチン標識抗体を用いる場合には、それを検出するために金コロイド、蛍光色素、酵素などと結合させたアビジンを用いることができる。 In the case of using a biotin-labeled antibody as the next antibody can be used colloidal gold, avidin fluorescent dye is bonded such an enzyme in order to detect it.

【0019】金コロイドを結合させた抗体を用いる場合には、光学顕微鏡でその存在を検出することができるが、さらに銀による信号の増強を行うことができ、例えばAmersham社よりSilver Enhancement Kitの名称で市販されているものを用いることができる。 [0019] When using a was bound gold colloid antibody can be detected the presence an optical microscope, it is possible for further enhancement of the signal with silver, for example, Amersham Corporation than Silver Enhancement Kit Name in can be used those commercially available. 蛍光色素を結合させた抗体を用いる場合には蛍光顕微鏡でその存在を検出することができる。 When using antibodies conjugated with fluorescent dye can detect its presence in a fluorescence microscope. また、酵素を結合させた抗体を用いる場合には、その酵素に適した発色基質を用いて発色反応を行わせることによりその存在を検出することができる。 In the case of using an antibody conjugated with enzyme, it can detect the presence by causing color reaction with a chromogenic substrate suitable for the enzyme. 代表的な基質として、例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には3-amino-9-ethylcarbazol Typical substrates include, for example, in the case of using peroxidase as the enzyme 3-amino-9-ethylcarbazol
e, 3,3'-diaminobenzizine, 3,3',5,5'-tetramethylben e, 3,3'-diaminobenzizine, 3,3 ', 5,5'-tetramethylben
zizineなど、アルカリフォスファターゼを用いる場合には5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-toluidine Such zizine, 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-toluidine in the case of using alkaline phosphatase
saltとnitroblue tetrazolium chlorideとの混合物、na A mixture of salt and nitroblue tetrazolium chloride, na
phthol-AS-phosphateなど、βーガラクトシダーゼを用いる場合には5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galact phthol-AS-phosphate, etc., in the case of using the beta-galactosidase 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galact
oside, halogenated indolyl-β-D-galactosideなどを用いることができる。 Oside, or the like can be used halogenated indolyl-β-D-galactoside.

【0020】本発明の方法で試料に含まれるプロテアーゼ活性を測定し、同時に試料中の特定の物質の存在位置を可視化して観察することができるが、プロテアーゼ活性及び特定の物質の免疫組織化学的観察には、光学顕微鏡下で目視で判定する方法、分光器により消化痕の光学濃度を測定する方法、光学顕微鏡で得られる画像をコンピューターに取り込み、画像解析の方法により消化痕における各種の数値化を行う方法などを利用することができる。 [0020] measuring the protease activity contained in a sample by the method of the present invention, at the same time the location of a particular substance in a sample can be observed by visualizing, immunohistochemical protease activity and specific substances the observation method of determining visually under an optical microscope, a method of measuring the optical density of traces of digestion by the spectrometer, takes in an image obtained by an optical microscope into a computer, various numerical values ​​of the trace of digestion by a method of image analysis it can be utilized such as the way to do.

【0021】 [0021]

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。 EXAMPLES Following is a more detailed explanation of the present invention through examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples. 例1:動脈粥状硬化巣のプロテアーゼ活性とマクロファージの分布観察 (1)動脈粥状硬化巣組織とゼラチン薄膜との反応 外科手術あるいは剖検により摘出し凍結した動脈検体を、凍結切片作製装置を用いて-25℃で厚さ4μに薄切しWO97/32035に開示されたゼラチン薄膜に接着させた。 Example 1: Arterial atherosclerosis nest protease activity and macrophage distribution observed (1) Frozen artery specimens were removed from the reaction surgery or autopsy the arterial atherosclerotic lesion tissue and gelatin thin membrane, using frozen sectioning device sliced ​​to a thickness of 4μ at -25 ° C. Te and adhered to a gelatin thin film disclosed in WO97 / 32035. ゼラチンの膜厚は6μのものを用いた。 The film thickness of the gelatin used was a 6 [mu. このゼラチン膜を37℃、相対湿度100%で30時間インキュベートした。 The gelatin film 37 ° C., and 30 hours at a relative humidity of 100%.

【0022】(2)マクロファージの免疫染色 インキュベートを完了した薄膜をPBSで洗浄し、1% [0022] (2) thin film was completed immunostaining incubated macrophages were washed with PBS, 1%
過酸化水素メタノール溶液に10分間浸漬した。 It was immersed for 10 minutes in hydrogen peroxide methanol solution. PBS PBS
で洗浄後、10%正常ウサギ血清に30分間浸漬した。 After in washing it was immersed in 10% normal rabbit serum for 30 minutes.
余分な水分を拭き取った後、抗マクロファージモノクローナル抗体(HAM56)のPBS溶液を動脈切片上に滴下し、4℃で一晩反応させた。 After wiping off excess water, the PBS solution of the anti-macrophage monoclonal antibody (HAM56) was dropped onto the artery sections were reacted overnight at 4 ° C.. PBSで洗浄後余分な水分を拭き取り、ビオチン標識抗マウスIgG抗体のPBS After washing with PBS wiping excess water, the biotin-labeled anti-mouse IgG antibody PBS
溶液を滴下した。 The solution was added dropwise. 室温で10分間反応させた後、PBS After reacting at room temperature for 10 minutes, PBS
で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンのPBS溶液を滴下した。 In washing, it was added dropwise peroxidase-labeled streptavidin in PBS. 5分間の反応の後PBSで洗浄し、3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochlorideと過酸化水素を含む溶液を滴下した。 After reaction for 5 minutes and washed with PBS, and added dropwise to a solution containing 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride and hydrogen peroxide. 10分間の反応の後水洗した。 And then washed with water in the reaction of 10 minutes.

【0023】(3)ゼラチン膜の染色 染色液としては6%のトリクロロ酢酸水溶液に濃度0. [0023] (3) concentration of 0 to trichloroacetic acid aqueous solution of 6% as a staining staining solution gelatin film.
8%になるようにポンソー3Rを溶解させた液とエタノールを3対7で混合した液を用い、薄膜を室温で3分間浸漬して染色した。 Using mixed liquid and liquid and ethanol by dissolving Ponceau 3R so as to 8% 3 to 7, and stained by dipping for 3 minutes at room temperature a thin film. 10分間水洗した後70%エタノール、純エタノールの順番で各3分間ずつ浸漬、組織切片を覆うようにカバーグラスをキシレンで溶いた封入剤を用いて貼り付け動脈切片を封入した。 70% washed with water 10 minutes ethanol, soaked by 3 minutes each in the order of pure ethanol, a cover glass to cover the tissue section was filled with paste artery sections using encapsulant beaten with xylene. このフィルムの裏面(組織接着面の裏面)を組織切片用スライドガラスに封入剤を用いて張り付け,光学顕微鏡を用いて観察すると動脈粥状硬化病変組織切片中、ゼラチンの分解によりポンソーの赤色が薄くなった部分と、マクロファージの存在を示す茶色の発色が同時に観察できた。 Affixed to the back surface of the film (back surface of the tissue adhesive surface) using the encapsulant glass slides for tissue sections, arterial atherosclerotic lesion tissue sections when observed with an optical microscope, thin red Ponceau by degradation of gelatin It became part and, coloring brown indicating the presence of macrophages could be observed simultaneously.

【0024】例2:動脈粥状硬化巣のプロテアーゼ活性と平滑筋アクチンの分布観察 (1)動脈粥状硬化巣組織とゼラチン薄膜との反応 外科手術あるいは剖検により摘出し凍結した動脈粥状硬化巣を有する血管組織を、凍結切片作製装置を用いて- [0024] Example 2: arterial atherosclerotic lesions of the protease activity and the smooth muscle actin distribution observed (1) arterial atherosclerotic lesion tissue excised by reaction surgery or autopsy of gelatin films frozen arterial atherosclerotic lesions vascular tissue with, a freeze sectioning device -
25℃で厚さ5μに薄切しWO97/32035に開示されたゼラチン薄膜に接着させた。 Sliced ​​to a thickness of 5μ at 25 ° C. was adhered to a gelatin thin membrane disclosed in WO97 / 32035. ゼラチンの膜厚は6μのものを用いた。 The film thickness of the gelatin used was a 6 [mu. このゼラチン膜を37℃、相対湿度100%で The gelatin film 37 ° C., 100% relative humidity
30時間インキュベートした。 And incubated for 30 hours.

【0025】(2)平滑筋アクチンの免疫染色 インキュベートを完了した薄膜を0.8%牛血清アルブミンとゼラチン(アマシャム社、IGSS仕様)を含むPBS [0025] (2) smooth 0.8% the muscle thin completing immunostaining incubation actin bovine serum albumin and gelatin (Amersham, IGSS specification) containing PBS
で10分間洗浄し、0.2%正常ウサギ血清に30分間浸漬した。 In washing 10 minutes, was immersed for 30 minutes in 0.2% normal rabbit serum. 余分な水分を拭き取った後、抗アクチンマウスモノクローナル抗体の1%牛血清アルブミン含有PBS After wiping off excess water, 1% bovine serum albumin-containing PBS of anti-actin mouse monoclonal antibody
溶液を動脈切片上に滴下し、室温で90分反応させた。 The solution was dropped onto the artery sections were reacted for 90 minutes at room temperature.
10分間3回の洗浄の後金コロイド標識された抗マウスIgGヤギ抗体と60分間ずつ液を新しく換えて2回反応、PBSで洗浄後蒸留水で洗浄し、フィルム上で切片を2%グルタルアルデヒドで10分間固定した。 Ten minutes three anti-mouse IgG goat antibody and 60 minutes, which is the posterior colloidal label in the wash replaced the liquid new and 2 times the reaction was washed with washing after distilled water at PBS, 2% glutaraldehyde sections on the film fixed in 10 minutes. 蒸留水で洗浄した後、アマシャム社のIntenSETM M Silver Enh After washing with distilled water, Amersham IntenSETM M Silver Enh
ancement Kitを用いてアルミホイル遮光下で10分間反応させ、蒸留水で洗浄した。 Ancement Kit reacted for 10 minutes under aluminum foil shielding using, washed with distilled water.

【0026】(3)ゼラチン膜の染色 染色液としては6%のトリクロロ酢酸水溶液に濃度0. [0026] (3) concentration of 0 to trichloroacetic acid aqueous solution of 6% as a staining staining solution gelatin film.
8%になるようにポンソー3Rを溶解させた液とエタノールを3対7で混合した液を用い、薄膜を室温で3分間浸漬して染色した。 Using mixed liquid and liquid and ethanol by dissolving Ponceau 3R so as to 8% 3 to 7, and stained by dipping for 3 minutes at room temperature a thin film. 10分間水洗した後70%エタノール、純エタノールの順番で各3分間ずつ浸漬、組織切片を覆うようにカバーグラスをキシレンで溶いた封入剤を用いて貼り付け動脈切片を封入した。 70% washed with water 10 minutes ethanol, soaked by 3 minutes each in the order of pure ethanol, a cover glass to cover the tissue section was filled with paste artery sections using encapsulant beaten with xylene. このフィルムの裏面(組織接着面の裏面)を組織切片用スライドガラスに封入剤を用いて張り付け,光学顕微鏡を用いて観察すると動脈粥状硬化病変組織切片中、ゼラチンの分解によりポンソーの赤色が薄くなった部分と、平滑筋アクチンの存在を示す黒色の発色が同時に観察できた。 Affixed to the back surface of the film (back surface of the tissue adhesive surface) using the encapsulant glass slides for tissue sections, arterial atherosclerotic lesion tissue sections when observed with an optical microscope, thin red Ponceau by degradation of gelatin It became part and, coloring black indicating the presence of smooth muscle actin could be observed simultaneously.

【0027】例3:乳癌組織のプロテアーゼ活性とサイトケラチン19の分布観察 (1)乳癌組織とゼラチン薄膜との反応 外科手術あるいは剖検により摘出し凍結した乳癌検体を、凍結切片作製装置を用いて−25℃で厚さ4μに薄切しWO97/32035に開示されたゼラチン薄膜に接着させた。 [0027] Example 3: Distribution Observation of breast cancer tissue protease activity and cytokeratin 19 (1) breast cancer specimens frozen excised by reaction surgery or autopsy of breast cancer tissue and the gelatin film, using a frozen section preparing apparatus - sliced ​​to a thickness of 4μ at 25 ° C. was adhered to a gelatin thin membrane disclosed in WO97 / 32035. ゼラチンの膜厚は6μのものを用いた。 The film thickness of the gelatin used was a 6 [mu. このゼラチン膜を37℃、相対湿度100%で16時間インキュベートした。 The gelatin film 37 ° C., and incubated for 16 hours at a relative humidity of 100%.

【0028】(2)サイトケラチン19の免疫染色 インキュベートを完了した薄膜をPBSで洗浄し、1% [0028] (2) thin film was completed immunostaining incubated cytokeratin 19 were washed with PBS, 1%
過酸化水素メタノール溶液に10分間浸漬した。 It was immersed for 10 minutes in hydrogen peroxide methanol solution. PBS PBS
で洗浄後、10%正常ウサギ血清に30分間浸漬した。 After in washing it was immersed in 10% normal rabbit serum for 30 minutes.
余分な水分を拭き取った後、抗サイトケラチン19マウスモノクローナル抗体のPBS溶液を乳癌切片上に滴下し、4℃で一晩反応させた。 After wiping off excess water, the PBS solution of the anti-cytokeratin 19 murine monoclonal antibody was dropped onto breast slices, and reacted overnight at 4 ° C.. PBSで洗浄後余分な水分を拭き取り、ビオチン標識抗マウスIgG抗体のPBS After washing with PBS wiping excess water, the biotin-labeled anti-mouse IgG antibody PBS
溶液を滴下した。 The solution was added dropwise. 10分間3回の洗浄の後金コロイド標識された抗マウスIgGヤギ抗体と60分間ずつ液を新しく換えて2回反応、PBSで洗浄後蒸留水で洗浄し、 Ten minutes three anti-mouse IgG goat antibody and 60 minutes, which is the posterior colloidal label in the wash replaced the liquid new and 2 times the reaction was washed with washing after distilled water with PBS, and
フィルム上で切片を2%グルタルアルデヒドで10分間固定した。 Sections on the film were fixed for 10 minutes with 2% glutaraldehyde. 蒸留水で洗浄した後、アマシャム社のIntenS After washing with distilled water, Amersham IntenS
ETM M Silver Enhancement Kitを用いてアルミホイル遮光下で10分間反応させ、蒸留水で洗浄した。 ETM M Silver Enhancement Kit reacted for 10 minutes under aluminum foil shielding using, washed with distilled water.

【0029】(3)ゼラチン膜の染色 染色液としては6%のトリクロロ酢酸水溶液に濃度0. [0029] (3) concentration of 0 to trichloroacetic acid aqueous solution of 6% as a staining staining solution gelatin film.
8%になるようにポンソー3Rを溶解させた液とエタノールを3対7で混合した液を用い、薄膜を室温で3分間浸漬して染色した。 Using mixed liquid and liquid and ethanol by dissolving Ponceau 3R so as to 8% 3 to 7, and stained by dipping for 3 minutes at room temperature a thin film. 10分間水洗した後70%エタノール、純エタノールの順番で各3分間ずつ浸漬、組織切片を覆うようにカバーグラスをキシレンで溶いた封入剤を用いて貼り付け動脈切片を封入した。 70% washed with water 10 minutes ethanol, soaked by 3 minutes each in the order of pure ethanol, a cover glass to cover the tissue section was filled with paste artery sections using encapsulant beaten with xylene. このフィルムの裏面(組織接着面の裏面)を組織切片用スライドガラスに封入剤を用いて張り付け,光学顕微鏡を用いて観察すると動脈粥状硬化病変組織切片中、ゼラチンの分解によりポンソーの赤色が薄くなった部分と、サイトケラチン19 Affixed to the back surface of the film (back surface of the tissue adhesive surface) using the encapsulant glass slides for tissue sections, arterial atherosclerotic lesion tissue sections when observed with an optical microscope, thin red Ponceau by degradation of gelatin It became part and, cytokeratin 19
の存在を示す黒色の発色が同時に観察できた。 Color black indicating the presence of a could be observed simultaneously.

【0030】 [0030]

【発明の効果】本発明の方法によれば、試料に含まれるプロテアーゼ活性を測定し、同時にプロテアーゼ蛋白や他の物質の存在に関して存在量や分布の情報を得ることができる。 According to the method of the present invention, by measuring the protease activity contained in the sample, it is possible to obtain the abundance and distribution information regarding the presence of protease proteins or other substances at the same time.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/543 521 G01N 33/543 521 525 525W 525U 33/573 33/573 A 33/577 33/577 A 33/68 33/68 //(C12Q 1/37 C12R 1:91) Fターム(参考) 2G045 AA25 AA26 BA14 BB01 BB14 BB22 BB24 BB46 BB50 BB51 CA11 CB17 CB26 DA77 DA78 FA16 FA18 FB01 FB03 FB07 FB11 FB12 GC12 GC15 JA01 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ79 QR16 QS03 QS33 QX02 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) G01N 33/543 521 G01N 33/543 521 525 525W 525U 33/573 33/573 a 33/577 33/577 a 33/68 33/68 // (C12Q 1/37 C12R 1:91) F-term (reference) 2G045 AA25 AA26 BA14 BB01 BB14 BB22 BB24 BB46 BB50 BB51 CA11 CB17 CB26 DA77 DA78 FA16 FA18 FB01 FB03 FB07 FB11 FB12 GC12 GC15 JA01 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ79 QR16 QS03 QS33 QX02

Claims (12)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 プロテアーゼ活性測定と免疫組織化学的観察とを同時に行う方法であって、 (1)プロテアーゼ基質を含み支持体表面に形成された薄膜に対して、プロテアーゼを含む試料を接触させる工程; (2)プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を、該薄膜を染料で染色することにより検出する工程;及び (3)試料中の特定の物質に反応する抗体を用いて、該物質を可視化する工程を含む方法。 1. A method of performing measuring protease activity and immunohistochemical observation and at the same time, (1) a step of the thin film formed on the support surface comprises a protease substrate, contacting the sample containing the protease ; (2) the traces of digestion formed on the thin film by the action of a protease, the process is detected by staining the thin membrane with a dye; and (3) using an antibody that reacts with a specific substance in a sample, the comprising the step of visualizing the material.
  2. 【請求項2】 プロテアーゼ活性測定と免疫組織化学的観察とを同時に行う方法であって、 (1)プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して、プロテアーゼを含む試料を接触させる工程; (2)プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を、該薄膜を染料で染色することにより検出する工程;及び (3)試料中の特定の物質に反応する抗体を用いて、該物質を可視化する工程を含む方法。 2. A method of performing measuring protease activity and immunohistochemical observation and at the same time, the thin film formed on the support surface includes a (1) a protease substrate and a hardening agent, containing protease antibodies reactive with specific substances and (3) in the sample; contacting the sample; (2) traces of digestion formed on the thin film by the action of a protease, the process is detected by staining the thin membrane with a dye using the method of the material comprising the step of visualizing.
  3. 【請求項3】 プロテアーゼ活性測定と免疫組織化学的観察とを同時に行う方法であって、 (1)プロテアーゼ基質と硬膜剤とを含み支持体表面に形成された薄膜に対して、生体試料の実質的に連続した2以上の切片の内の一つを接触させる工程; (2)プロテアーゼ基質、硬膜剤、及びプロテアーゼ・ 3. A measuring protease activity and immunohistochemical observation and methods of performing simultaneously (1) the thin film formed on the support surface and a protease substrate and a hardening agent, a biological sample substantially contacting one of continuous two or more sections; (2) protease substrate, a hardening agent, and protease
    インヒビターを含み支持体表面に形成された薄膜に対して、残りの切片を接触させる工程; (3)プロテアーゼの作用により該薄膜に形成された消化痕を、該薄膜を染料で染色することにより検出する工程; (4)工程(1)で用いた薄膜の消化痕と工程(2)で用いた薄膜の消化痕とを対比する工程;及び (5)試料中の特定の物質に反応する抗体を用いて、該物質を可視化する工程含む方法。 The thin film formed on the support surface comprises an inhibitor, contacting the remaining sections; detected by staining the traces of digestion formed on the thin film by the action of (3) protease, the thin film with a dye and (5) an antibody that reacts with a specific substance in the sample; to process; (4) a step of comparing the thin trace of digestion used in step (1) thin trace of digestion and steps used in (2) used, the method comprising steps visualizing substance.
  4. 【請求項4】 抗体が試料中の特定の物質に特異的に反応するモノクローナル抗体である請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。 4. A method according to any one of claims 1 to 3 antibody is a monoclonal antibody which specifically reacts with a specific substance in the sample.
  5. 【請求項5】 試料中の特定の物質に反応する抗体が酵素標識抗体、蛍光標識抗体、又は金コロイド標識抗体である請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 Wherein the antibody is enzyme-labeled antibody reacting to a particular substance in a sample, the method according to claims 1 to any one of the 4 is a fluorescence-labeled antibody, or colloidal gold-labeled antibody.
  6. 【請求項6】 試料中の特定の物質に反応する抗体と特異的に反応する酵素標識抗体、蛍光標識抗体、又は金コロイド標識抗体を2次抗体として用いる請求項1から4 6. enzyme-labeled antibody which is specifically reactive with antibodies reactive to specific substance in the sample, from claim 1 for use fluorescent-labeled antibody, or the colloidal gold-labeled antibody as a secondary antibody 4
    のいずれか1項に記載の方法。 The method according to any one of.
  7. 【請求項7】 2次抗体としてビオチン標識抗体を用い、該2次抗体を酵素標識アビジン、蛍光標識アビジン、又は金コロイド標識アビジンを用いて可視化する請求項6に記載の方法。 7. with biotin-labeled antibody as a secondary antibody, the method of claim 6, visualized using the second antibody an enzyme labeled avidin, fluorescent labeled avidin, or a colloidal gold-labeled avidin.
  8. 【請求項8】 プロテアーゼ基質がゼラチン又はカゼインである請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。 8. The method according to any one of claims 1 7 protease substrate is gelatin or casein.
  9. 【請求項9】 染料が赤色、橙色、及び黄色からなる群から選ばれる1種又は2種以上の染料である請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。 9. The method according to any one of dye red, orange, and from claim 1 wherein one or more dyes selected from the group consisting of yellow 8.
  10. 【請求項10】 染料がポンソー3Rである請求項9に記載の方法。 10. A method according to claim 9 dye is Ponceau 3R.
  11. 【請求項11】 生体試料がヒトを含む哺乳類から得られた組織又は体液中の細胞である請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。 11. The method according to claim 1, any one of 10 which is a cell of the biological sample in a tissue or body fluid obtained from a mammal, including humans.
  12. 【請求項12】 請求項1から11のいずれか1項に記載の方法に使用するための薄膜。 12. The thin film for use in a method according to any one of claims 1 to 11.
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