JP3593384B2

JP3593384B2 - Stabilization of chemiluminescence analysis reagents

Info

Publication number: JP3593384B2
Application number: JP17812295A
Authority: JP
Inventors: 渡辺　　誠; 典緒柴田
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: JPH095241A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、化学発光分析試薬の安定化試薬および方法に関るものである。更に詳しくは安定化した２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬および２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬の安定化技術に関るものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、化学発光を測定系とする全自動分析装置ならびに分析用試薬が、いくつか開発され、臨床検査室で容易に化学発光測定を利用する環境が整いつつある。これらの測定系に用いられる代表的な化学発光物質は、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン（ルミノール）、６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン（イソルミノール）等の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物、ジオキセタンおよびアクリジニウムエステル等が知られている。ルミノール、イソルミノールは、主としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識とした競合法またはサンドウィッチ法のＥＩＡで用いられる。ジオキセタンは、アルカリフォスファターゼを標識としたＥＩＡで、アクリジニウム化合物は、それ自体を標識とした化学発光法で用いられている。
【０００３】
ルミノールおよびイソルミノールは、容易かつ比較的安価に入手可能な原料であり、フェノール化合物等の増感物質によって十分な発光強度が得られる。一般的な測定は、抗体または抗原を結合した固相と検体およびＰＯＤ標識抗体または抗原とを反応させ、サンドウィッチ型の結合物を形成させる。続いて過剰のＰＯＤ標識抗体または抗原を洗浄により除いた後、過酸化水素水および増感物質を含むルミノールまたはイソルミノール溶液を加えて、放出される光の量を測定することからなる。
【発明が解決しようとする問題点】
【０００４】
２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物は溶解直後の非特異発光が高いため、化学発光分析には、１週間程度エイジングした溶解試薬を使用しなければならない。ところが長期保存した溶液を用いると、保存状態が低温（４℃）であっても、発光強度が次第に低下してしまう欠点があった。発光強度の低下はＳ／Ｎ比の低下につながる。
【問題点を解決するための手段】
【０００５】
本発明の課題は、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物による発光試薬を溶液状態で安定化する技術を提供する事にある。そしてその課題は、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物含有発光試薬に無機アジドを０．０１〜０．１％の範囲で添加することによって解決される。この濃度範囲以上の無機アジドの添加は、反応中にＰＯＤ活性を阻害して発光強度の低下をもたらすおそれが生じる。一方、この濃度範囲以下の無機アジド添加は、測定中の発光強度を安定化する作用が期待できるものの（特開平６−３４６３０）、長期保存した２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物溶液の安定化には寄与しない場合がある。
【０００６】
無機アジドとしては、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム等のアルカリ金属アジドおよびアジ化バリウム等のアルカリ土類金属アジドが使用されるが、特に好ましいのは、アジ化ナトリウムである。アジ化ナトリウムは広く一般に防腐剤として用いられているが、本発明の安定化効果は、雑菌汚染を防止することによって達せられたものではない。
【０００７】
溶液組成物の安定化技術として、しばしば特定の緩衝液およびｐＨの効果が取り上げられているが、本発明の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物溶液の安定化技術においては、緩衝液の種類は特に問わない。りん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、くえん酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常用いられる緩衝液から１種またはこれらの２種を組合わせたものから適宜選べばよい。緩衝液のｐＨは５〜１０の範囲内に調整されていれば、安定化効果は変わらない。ｐＨ３以下の酸性条件ではアジ化ナトリウムが分解されるので、安定化効果は得られない。
【０００８】
２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物発光試薬中の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物濃度は特に限定されるものではなく、試薬構成の量的比に合わせて任意に選べばよい。全自動化学発光分析機ＡＬ−１０００（栄研化学販売）用試薬では、洗浄した固相ビーズにＰＯＤ基質である過酸化水素水とルミノール発光試薬をそれぞれ１００μｌ分注するシステムであり、このシステムに適合する発光試薬の適当なルミノール濃度は０．００１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．０１〜１ｍＭである。
化学発光エンハンサ−は、試薬構成上ならびに測定操作の簡便化のため、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物発光試薬に共存させる方が望ましい。フェノール系エンハンサーとしては、４−ヨードフェノール、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノールが特に有効とされるが（特公平３−５５３９）、これらのエンハンサーはいずれも、０．０１〜１０ｍＭの濃度範囲で２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物と同一溶液中に共存させることができる。
【０００９】
以下に実施例を述べる。
【実施例１】
ＣＥＡ測定による無機アジド含有ルミノ−ル試薬の安定化効果
無機アジド無添加ルミノ−ル試薬と無機アジド添加ルミノ−ル試薬をそれぞれ４℃、３７℃に２週間および１カ月間保存し、ルミスポットＣＥＡ（栄研化学製・登録商標）の指示書に記載されたプロトコ−ルにしたがって、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００により免疫反応を実施した。ＣＥＡの酵素免疫反応後のペルオキシダ−ゼ活性を各種ルミノ−ル試薬により測定し、発光強度を比較した。
【００１０】
１−（ａ）固相化抗体
市販の抗ＣＥＡウサギポリクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ製）をＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍｌとした抗体溶液中にポリスチレンビ−ズ（直径１／４インチ，積水化学工業製）を浸漬し４℃で一晩放置した。放置後生理食塩水で洗浄し、０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳに室温３時間浸漬して固相化抗体を得た。
【００１１】
１−（ｂ）ＰＯＤ標識抗体
市販の抗ＣＥＡモノクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ製）を石川らの方法（特願昭５７−３３６６２等）によりＰＯＤ（東洋紡績社製，西洋ワサビ由来）と結合させ、ＰＯＤ標識抗体を作製した。これをセファデックスＧ−２００を用いて分画精製し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで２５０倍に希釈して使用した。
【００１２】
１−（ｃ）発光試薬１、２
３０％過酸化水素水（和光純薬工業製）０．３ｍｌを０．１Ｍ、ｐＨ８．０のりん酸緩衝液１０００ｍｌに溶解し、過酸化水素試薬とした。
ルミノール（東京化成製）２２５ｍｇおよびｐ−ヨードフェノール（和光純薬工業製）１１ｍｇを０．１Ｍ、ｐＨ８．０のりん酸緩衝液１０００ｍｌに溶解し、一部はそのままルミノール試薬Ａとし、一部はさらにアジ化ナトリウム（和光純薬工業製）を０．０２５％となるように加えルミノール試薬Ｂとした。
【００１３】
１−（Ｃ）免疫学的測定法
試料として市販精製ＣＥＡ（ＳＣＲＩＰＰＳ社）を用いこれを０．２％ＢＳＡ加ＰＢＳで使用濃度に希釈して免疫反応に供した。
測定は全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００にて行った。プロトコ−ルは次の通りである。
各免疫反応用チュ−ブにあらかじめ抗体不溶化固相を１コづつ入れておき、その中に被検試料６０μｌと希釈液２００μｌを添加し、３７℃約７分反応させた。
反応後溶液を吸引除去して、ビ−ズをＰＢＳで洗浄し、ＰＯＤ標識抗体４０μｌおよび希釈液１７０μｌを加え３７℃，約７分反応させた。
反応後溶液を除去し、ビ−ズを洗浄した後、前記の過酸化水素試薬、１００μｌおよびルミノール試薬Ａ、１００μｌまたはルミノール試薬Ｂ、１００μｌを加え、発光強度（３秒間の積算値）を測定した。
【００１４】
結果を表１に示す。表中の数値は、検体が精製ＣＥＡの場合は発光の計測値を、また検体が血清の場合はＣＥＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。測定値の右に示される％値は、調製時の試薬による測定値に対する比率である。
低濃度の精製ＣＥＡにおいて、アジ化ナトリウムの顕著な効果が認められた。血清測定値はそれぞれの試薬でキャリブレーションを行った後の測定のため、アジ化ナトリウム添加効果は小さくなるが、測定値の正確性は明らかに無添加試薬より良好との結果が得られた。
【００１５】
【表１】

【００１６】
【実施例２】
ＡＦＰ測定による無機アジド含有ルミノ−ル試薬の安定化効果
前記発光試薬２−Ａと発光試薬２−Ｂをそれぞれ４℃、３７℃に２週間および１カ月間保存し、ルミスポットＡＦＰ（栄研化学製・登録商標）の指示書に記載されたプロトコ−ルにしたがって、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００により免疫反応を実施した。ＡＦＰの酵素免疫反応後のペルオキシダ−ゼ活性を各種ルミノ−ル試薬により測定し、残存発光強度を比較した。
【００１７】
２−（ａ）固相化抗体
市販の抗ＡＦＰウサギポリクロ−ナル抗体（ＵＣＢ社製）をＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍｌとした抗体溶液中にポリスチレンビ−ズ（直径１／４インチ，積水化学工業製）を浸漬し４℃で一晩放置した。放置後、生理食塩水で洗浄し０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳに室温３時間浸漬して固相化抗体を得た。
【００１８】
２−（ｂ）ＰＯＤ標識抗体
市販の抗ＡＦＰモノクロ−ナル抗体（ザイメット社製）を石川らの方法（特願昭５７−３３６６２等）によりＰＯＤ（東洋紡績社製，西洋ワサビ由来）と結合させ、ＰＯＤ標識抗体を作製した。これをセファデックスＧ−２００を用いて分画精製し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈して使用した。
【００１９】
２−（ｃ）免疫学的測定法
試料として市販ＡＦＰ標準（日本バイオテスト研究所製）を用いこれを０．２％ＢＳＡ加ＰＢＳで使用濃度に希釈して免疫反応に供した。
測定は全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００（栄研化学）にて行った。プロトコ−ルは次の通りである。
各免疫反応用チュ−ブにあらかじめ抗体不溶化固相を１コづつ入れておき、その中に被検試料２０μｌと希釈液２５０μｌを添加し、３７℃約７分反応させた反応後溶液を吸引除去して、ビ−ズをＰＢＳで洗浄し、ＰＯＤ標識抗体４０μｌおよび希釈液１７０μｌを加え３７℃、約７分反応させた。
反応後溶液を除去し、ビ−ズを洗浄した後下記の各化学発光試薬を２００μｌ加え、発光強度（３秒間の積算値）を測定した。
【００２０】
結果を表２に示す。表中の数値は、検体がＡＦＰ標準品の場合は発光の計測値を、また検体が血清の場合はＡＦＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。測定値の右に示される％値は、調製時の試薬による測定値に対する比率である。ＡＦＰにおいてもＣＥＡと同様に、アジ化ナトリウムを添加したルミノール試薬の安定性は顕著に向上している。
【００２１】
【表２】

【発明の効果】
本発明により、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬の保存安定性が向上し、全自動化学発光酵素免疫測定装置への適用が容易となる。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a reagent and a method for stabilizing a chemiluminescence analysis reagent. More specifically, the present invention relates to a stabilized 2,3-dihydro-1,4 phthaladione compound reagent and a technique for stabilizing a 2,3-dihydro-1,4 phthaladione compound reagent.
[0002]
[Prior art]
In recent years, several fully automatic analyzers and analysis reagents using chemiluminescence as a measurement system have been developed, and an environment for easily utilizing chemiluminescence measurement in a clinical laboratory has been set up. Representative chemiluminescent substances used in these measurement systems are 5-amino-2,3-dihydro-1,4 phthaladion (luminol) and 6-amino-2,3-dihydro-1,4 phthaladion (isoluminol). 2,3-Dihydro-1,4 phthaladione compound, dioxetane and acridinium ester. Luminol and isoluminol are mainly used in the competitive method or the sandwich method EIA labeled with peroxidase (POD). Dioxetane is an EIA labeled with alkaline phosphatase, and acridinium compounds are used in a chemiluminescent method using the label itself.
[0003]
Luminol and isoluminol are raw materials that can be obtained easily and relatively inexpensively, and a sufficient luminescence intensity can be obtained by a sensitizer such as a phenol compound. In a general measurement, a solid phase bound with an antibody or an antigen is reacted with a sample and a POD-labeled antibody or an antigen to form a sandwich-type conjugate. Subsequently, after removing excess POD-labeled antibody or antigen by washing, a luminol or isoluminol solution containing aqueous hydrogen peroxide and a sensitizer is added, and the amount of emitted light is measured.
[Problems to be solved by the invention]
[0004]
Since the 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound has a high nonspecific emission immediately after dissolution, a lysis reagent aged for about one week must be used for chemiluminescence analysis. However, when a solution stored for a long period of time is used, there is a disadvantage that the luminescence intensity gradually decreases even when the storage state is low temperature (4 ° C.). A decrease in the emission intensity leads to a decrease in the S / N ratio.
[Means for solving the problem]
[0005]
An object of the present invention is to provide a technique for stabilizing a luminescent reagent using a 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound in a solution state. The problem is solved by adding an inorganic azide in a range of 0.01 to 0.1% to a luminescent reagent containing a 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound. Addition of an inorganic azide in this concentration range or more may inhibit POD activity during the reaction, resulting in a decrease in emission intensity. On the other hand, the addition of an inorganic azide below this concentration range can be expected to stabilize the emission intensity during the measurement (JP-A-6-34630), but the long-term storage of the 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound solution May not contribute to stabilization.
[0006]
As the inorganic azide, an alkali metal azide such as sodium azide and potassium azide and an alkaline earth metal azide such as barium azide are used. Particularly preferred is sodium azide. Although sodium azide is widely used generally as a preservative, the stabilizing effect of the present invention is not achieved by preventing bacterial contamination.
[0007]
As a technique for stabilizing a solution composition, the effect of a specific buffer and pH is often taken up. However, in the technique for stabilizing a 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound solution of the present invention, a buffer solution is used. The type is not particularly limited. The buffer may be appropriately selected from one or a combination of two or more commonly used buffers such as a phosphate buffer, a borate buffer, a citrate buffer, a Tris buffer, and a Good buffer. If the pH of the buffer is adjusted within the range of 5 to 10, the stabilizing effect does not change. Under acidic conditions of pH 3 or less, sodium azide is decomposed, so that a stabilizing effect cannot be obtained.
[0008]
2,3-Dihydro-1,4 phthaladion compound The concentration of the 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound in the luminescent reagent is not particularly limited, and may be arbitrarily selected according to the quantitative ratio of the composition of the reagent. . The reagent for the fully automatic chemiluminescence analyzer AL-1000 (Eiken Chemical Sales) is a system in which 100 μl of a hydrogen peroxide solution and a luminol luminescence reagent, which are POD substrates, are dispensed to the washed solid phase beads. A suitable luminol concentration of a suitable luminescent reagent is 0.001 to 10 mM, preferably 0.01 to 1 mM.
The chemiluminescence enhancer is preferably coexisted with a 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound luminescent reagent in terms of the composition of the reagent and simplification of the measurement operation. As the phenolic enhancer, 4-iodophenol, 4-phenylphenol, and 2-chloro-4-phenylphenol are particularly effective (Japanese Patent Publication No. 3-5539). It can coexist in the same solution with the 2,3-dihydro-1,4 phthaladione compound in a concentration range of 10 mM.
[0009]
Examples will be described below.
Embodiment 1
Stabilizing effect of inorganic azide-containing luminol reagent by CEA measurement. Inorganic azide-free luminol reagent and inorganic azide-added luminol reagent were stored at 4 ° C. and 37 ° C. for 2 weeks and 1 month, respectively. According to the protocol described in the instruction manual (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), an immune reaction was performed by a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay system AL-1000. The peroxidase activity after the enzyme immunoreaction of CEA was measured with various luminol reagents, and the luminescence intensities were compared.
[0010]
1- (a) Immobilized antibody A commercially available anti-CEA rabbit polyclonal antibody (manufactured by DAKO) was diluted with PBS to 1 μg / ml in an antibody solution, and a polystyrene bead (1/4 inch in diameter, Sekisui Chemical) was used. (Manufactured by Kogyo Co., Ltd.) and left at 4 ° C. overnight. After standing, it was washed with physiological saline and immersed in PBS containing 0.3% BSA at room temperature for 3 hours to obtain an immobilized antibody.
[0011]
1- (b) POD-labeled antibody A commercially available anti-CEA monoclonal antibody (manufactured by DAKO) was bound to POD (manufactured by Toyobo Co., Ltd., derived from horseradish) by the method of Ishikawa et al. (Japanese Patent Application No. 57-33662). A POD-labeled antibody was prepared. This was fractionated and purified using Sephadex G-200, and diluted 250-fold with PBS containing 2% BSA before use.
[0012]
1- (c) Luminescent reagents 1 and 2
0.3 ml of 30% aqueous hydrogen peroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was dissolved in 1000 ml of a 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) to obtain a hydrogen peroxide reagent.
225 mg of luminol (manufactured by Tokyo Chemical Industry) and 11 mg of p-iodophenol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) are dissolved in 1000 ml of a 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), a part of which is used as a luminol reagent A, and a part of which is used as luminol reagent A. Further, sodium azide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a concentration of 0.025% to obtain a luminol reagent B.
[0013]
1- (C) Immunoassay As a sample, commercially available purified CEA (SCRIPPS) was used, diluted with PBS containing 0.2% BSA to a working concentration, and subjected to an immune reaction.
The measurement was performed with a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay device AL-1000. The protocol is as follows.
One tube of the antibody-insolubilized solid phase was placed in advance in each immunoreaction tube, and 60 μl of the test sample and 200 μl of the diluent were added thereto, and reacted at 37 ° C. for about 7 minutes.
After the reaction, the solution was removed by suction, the beads were washed with PBS, 40 µl of the POD-labeled antibody and 170 µl of the diluent were added, and reacted at 37 ° C for about 7 minutes.
After the reaction, the solution was removed, and the beads were washed. Then, 100 μl of the above-mentioned hydrogen peroxide reagent and 100 μl of luminol reagent A or 100 μl of luminol reagent B were added, and the luminescence intensity (integrated value for 3 seconds) was measured. .
[0014]
Table 1 shows the results. The numerical values in the table indicate measured values of luminescence when the sample is purified CEA, and indicate the CEA concentration (ng / ml) when the sample is serum. The% value shown to the right of the measured value is the ratio to the measured value of the reagent at the time of preparation.
At low concentrations of purified CEA, a remarkable effect of sodium azide was observed. Since the serum measurement value was measured after calibration with each reagent, the effect of adding sodium azide was small, but the accuracy of the measurement value was clearly higher than that of the reagent without addition.
[0015]
[Table 1]

[0016]
Embodiment 2
Stabilizing effect of inorganic azide-containing luminol reagent by AFP measurement The luminescent reagent 2-A and luminescent reagent 2-B were stored at 4 ° C. and 37 ° C. for 2 weeks and 1 month, respectively, and Lumispot AFP (Eiken Chemical Co., Ltd.) The immunoreaction was carried out by a fully-automated chemiluminescent enzyme immunoassay system AL-1000 according to the protocol described in the instructions of the company (registered trademark). The peroxidase activity after the enzyme immunoreaction of AFP was measured with various luminol reagents, and the residual luminescence intensity was compared.
[0017]
2- (a) Immobilized Antibody A commercially available anti-AFP rabbit polyclonal antibody (manufactured by UCB) was diluted with PBS to 1 μg / ml, and a polystyrene bead (1/4 inch in diameter; (Manufactured by Chemical Industry Co., Ltd.) and left at 4 ° C. overnight. After standing, it was washed with physiological saline and immersed in PBS containing 0.3% BSA at room temperature for 3 hours to obtain an immobilized antibody.
[0018]
2- (b) POD-labeled antibody A commercially available anti-AFP monoclonal antibody (manufactured by Zymet) is bound to POD (manufactured by Toyobo Co., Ltd., derived from horseradish) by the method of Ishikawa et al. (Japanese Patent Application No. 57-33662). And POD-labeled antibodies. This was fractionated and purified using Sephadex G-200, and diluted 1000-fold with PBS containing 2% BSA before use.
[0019]
2- (c) Immunological measurement method A commercially available AFP standard (manufactured by Nippon Biotest Laboratories) was used as a sample, which was diluted with PBS containing 0.2% BSA to a working concentration, and subjected to an immune reaction.
The measurement was performed with a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay system AL-1000 (Eiken Chemical). The protocol is as follows.
One solid phase of the antibody-insolubilized solid phase was previously placed in each immunoreaction tube, and 20 μl of the test sample and 250 μl of the diluent were added thereto, and the mixture was reacted at 37 ° C. for about 7 minutes. After the reaction, the solution was removed by suction. Then, the beads were washed with PBS, 40 µl of POD-labeled antibody and 170 µl of diluent were added, and reacted at 37 ° C for about 7 minutes.
After the reaction, the solution was removed, and the beads were washed. Then, 200 μl of each of the following chemiluminescent reagents was added, and the luminescence intensity (integrated value for 3 seconds) was measured.
[0020]
Table 2 shows the results. Numerical values in the table indicate measured values of luminescence when the sample is an AFP standard product, and indicate the AFP concentration (ng / ml) when the sample is serum. The% value shown to the right of the measured value is the ratio to the measured value of the reagent at the time of preparation. In AFP, as in CEA, the stability of the luminol reagent to which sodium azide has been added is significantly improved.
[0021]
[Table 2]

【The invention's effect】
According to the present invention, the storage stability of the 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound reagent is improved, and application to a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay is facilitated.

Claims

A method for stabilizing a reagent composition for a 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound, comprising 0.01 to 0.1% of an inorganic azide in a reagent composition for chemiluminescence analysis using chemiluminescence as a signal.

2. The method for stabilizing a 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound reagent composition according to claim 1 , wherein the inorganic azide is sodium azide.

The method for stabilizing a 2,3-dihydro-1,4 phthaladion compound reagent composition according to claim 1 , further comprising a luminescence enhancer.