JP2022152733A - Method of enhancing storage stability of antibody-bound magnetic particles - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法に関する。また、本発明は、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液、及び抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液に関する。本発明は、免疫分析方法にも関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for stabilizing storage of antibody-bound magnetic particles. The present invention also relates to a suspension containing antibody-bound magnetic particles and a solution for suspending antibody-bound magnetic particles. The invention also relates to an immunoassay method.
免疫分析（イムノアッセイ）は、抗体を用いて試料に含まれる被検出物質の存在若しくは不存在、又は量を分析する方法である。近年では、この免疫分析において、磁性粒子を用いた全自動測定が行われることが多い。磁性粒子を利用した免疫分析は、以下のような手順で進行する。（１）試料中の被検出物質と特異的に反応する抗体または抗原を固相化した抗体結合磁性粒子を用意する。（２）この抗体結合磁性粒子を試料中の被検出物質と反応させる。（３）被検出物質と特異的に反応する標識された抗原又は抗体などを反応させる。（４）この標識を利用したシグナルを検出して、被検出物質の存在若しくは不存在、又は量を分析する。 Immunoassay (immunoassay) is a method of analyzing the presence or absence or amount of a substance to be detected in a sample using an antibody. In recent years, in this immunoassay, fully automatic measurement using magnetic particles is often performed. Immunoassay using magnetic particles proceeds according to the following procedure. (1) Prepare antibody-bound magnetic particles on which an antibody or antigen that specifically reacts with a substance to be detected in a sample is immobilized. (2) The antibody-bound magnetic particles are reacted with the substance to be detected in the sample. (3) A labeled antigen or antibody that specifically reacts with the substance to be detected is allowed to react. (4) Detecting a signal using this label to analyze the presence or absence or amount of the substance to be detected.
上記のような手順で免疫分析を行うためのキット又は試薬が販売されている。しかし、経時的に物質の活性が低下したり、保存状態によって物質の活性が変化したりすると正確な測定結果は期待できず、大きな問題となる。このような問題を防止するために、抗体結合磁性粒子は、種々の溶液中に懸濁した状態で保存することが提案されている。例えば、特許文献１では、ラクトース及びグリシンを含む溶液中で抗原又は抗体を固定化した粒子を保存することが開示されている（特許文献１）。しかしながら、上記の方法では、溶液中に特定の物質を添加する必要がある。また、液状で長期間保存する場合には、満足な効果が得られない場合もあった。 Kits or reagents for performing immunoassays according to the procedures described above are commercially available. However, if the activity of the substance decreases with time or changes depending on the storage conditions, accurate measurement results cannot be expected, which poses a serious problem. In order to prevent such problems, it has been proposed to store antibody-bound magnetic particles in a suspended state in various solutions. For example, Patent Document 1 discloses preserving antigen or antibody-immobilized particles in a solution containing lactose and glycine (Patent Document 1). However, the above method requires the addition of a specific substance to the solution. Moreover, in the case of long-term storage in liquid form, there were cases in which satisfactory effects could not be obtained.
本発明の目的は、抗体結合磁性粒子に固定化した抗体の安定性を高め、継続的に安定した測定を可能にすることである。 An object of the present invention is to increase the stability of antibodies immobilized on antibody-bound magnetic particles and to enable continuous and stable measurement.
本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意検討した。そして、緩衝液を含む、ｐＨが５．７～６．８である溶液を用いることで、抗体結合磁性粒子を安定的に保存できることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させることを含む、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法であって、
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法。
＜２＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜１＞に記載の保存安定化方法。
＜３＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜１＞又は＜２＞に記載の保存安定化方法。
＜４＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜５＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜６＞
前記溶液が、ブロッキング剤をさらに含む、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜７＞
抗体結合磁性粒子と
緩衝液と
を含み、ｐＨが５．７～６．８である、懸濁液。
＜８＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜７＞に記載の懸濁液。
＜９＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜７＞又は＜８＞に記載の懸濁液。
＜１０＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の懸濁液。
＜１１＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜７＞～＜１０＞のいずれかに記載の懸濁液。
＜１２＞
＜７＞～＜１１＞のいずれかに記載の懸濁液を用いる、抗原の分析方法。
＜１３＞
緩衝液を含み、ｐＨが５．７～６．８である、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液。
＜１４＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜１３＞に記載の懸濁用溶液。
＜１５＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜１３＞又は＜１４＞に記載の懸濁用溶液。
＜１６＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜１３＞～＜１５＞のいずれかに記載の懸濁用溶液。
＜１７＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜１４＞～＜１６＞のいずれかに記載の懸濁用溶液。
In order to solve the above problems, the inventors have made extensive studies. Then, the inventors found that antibody-bound magnetic particles can be stably stored by using a solution containing a buffer solution and having a pH of 5.7 to 6.8, thereby completing the present invention.
Specifically, the present invention is as follows.
<1>
A method for stabilizing storage of antibody-bound magnetic particles, comprising contacting a solution having a pH of 5.7 to 6.8 with the antibody-bound magnetic particles,
The above method, wherein the solution comprises a buffer.
<2>
The storage stabilization method according to <1>, wherein the buffer has a pKa value of 5.0 to 8.2 at 20°C.
<3>
The storage stabilization method according to <1> or <2>, wherein the buffer is MES, PIPES, ACES, ADA, or Bis-Tris.
<4>
The storage stabilization method according to any one of <1> to <3>, wherein the functional group for binding to the antibody on the magnetic particles is an epoxy group or a tosyl group.
<5>
The storage stabilization method according to any one of <1> to <4>, wherein the antibody has an isoelectric point of 5.2 to 8.0.
<6>
The storage stabilization method according to any one of <1> to <5>, wherein the solution further contains a blocking agent.
<7>
A suspension comprising antibody-bound magnetic particles and a buffer and having a pH of 5.7 to 6.8.
<8>
The suspension according to <7>, wherein the buffer has a pKa value of 5.0 to 8.2 at 20°C.
<9>
The suspension according to <7> or <8>, wherein the buffer is MES, PIPES, ACES, ADA, or Bis-Tris.
<10>
The suspension according to any one of <7> to <9>, wherein the functional group for binding to the antibody on the magnetic particles is an epoxy group or a tosyl group.
<11>
The suspension according to any one of <7> to <10>, wherein the antibody has an isoelectric point of 5.2 to 8.0.
<12>
A method for analyzing an antigen, using the suspension according to any one of <7> to <11>.
<13>
A solution for suspending antibody-bound magnetic particles, containing a buffer and having a pH of 5.7 to 6.8.
<14>
The suspension solution according to <13>, wherein the buffer has a pKa value of 5.0 to 8.2 at 20°C.
<15>
The suspension solution according to <13> or <14>, wherein the buffer is MES, PIPES, ACES, ADA, or Bis-Tris.
<16>
The suspension solution according to any one of <13> to <15>, wherein the functional group for binding to the antibody on the magnetic particles is an epoxy group or a tosyl group.
<17>
The suspension solution according to any one of <14> to <16>, wherein the antibody has an isoelectric point of 5.2 to 8.0.
本発明によれば、抗体結合磁性粒子を安定的に保存することができる。 According to the present invention, antibody-bound magnetic particles can be stably stored.
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書においては、発明の態様に分けて説明をしているが、それぞれの態様に記載の事項、語句の定義、及び実施形態は、他の態様においても適用可能である。 The present invention will be described in detail below. In this specification, aspects of the invention are described separately, but the matters, definitions of terms, and embodiments described in each aspect are also applicable to other aspects.
１．抗体結合磁性粒子の保存安定化方法
（抗体結合磁性粒子）
本明細書において、「抗体結合磁性粒子」とは、抗体が結合している磁性粒子を意味する。
磁性粒子は、一般的に免疫分析の分野で使用されるものであれば特に限定されず使用することができる。磁性粒子に含まれる磁性材料としては、例えば四酸化三鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三酸化二鉄（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、又はそれらの合金を挙げることができる。
上述の磁性材料を含む、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、若しくはポリエチレンテレフタレートなどから成る疎水性粒子；又は、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２－オキシエチルアクリレート）、ポリ（２－オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルメタクリレート）、若しくはポリエチレングリコールメタクリレートなどから成る親水性粒子を、磁性粒子として使用することができる。
磁性粒子としては、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用することができる。
磁性粒子の平均粒子径は、以下に限定されるものではないが、粒径１００ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは５００ｎｍ～１００μｍ、より好ましくは１μｍ～１０μｍ、特に好ましくは１μｍ～５μｍの粒子を使用することができる。
1. Method for stabilizing storage of antibody-bound magnetic particles (antibody-bound magnetic particles)
As used herein, the term "antibody-bound magnetic particles" means magnetic particles to which antibodies are bound.
The magnetic particles are not particularly limited as long as they are generally used in the field of immunoassay. Magnetic materials contained in the magnetic particles include, for example, triiron tetraoxide (Fe 3 O 4 ), diiron trioxide (γ-Fe 2 O 3 ), various ferrites, and metals such as iron, manganese, nickel, cobalt, and chromium. , or alloys thereof.
Hydrophobic particles made of polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylonitrile, polymethyl methacrylate, polycapramide, or polyethylene terephthalate, including the magnetic materials described above; or polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyvinyl (2-oxyethyl acrylate), poly(2-oxyethyl methacrylate), poly(2,3-dioxypropyl acrylate), poly(2,3-dioxypropyl methacrylate), or polyethylene glycol methacrylate, etc. Particles can be used as magnetic particles.
As magnetic particles, for example, Dynabeads (registered trademark) M-280 Tosylated (manufactured by Thermo Fisher Scientific) can be used.
The average particle size of the magnetic particles is not limited to the following, but particles having a particle size of 100 nm to 1 mm, preferably 500 nm to 100 μm, more preferably 1 μm to 10 μm, and particularly preferably 1 μm to 5 μm can be used. can.
磁性粒子の表面は、抗体を固定化するために、官能基で修飾されていることが好ましい。官能基は、チオール基、マレイミド基、スクシンイミジル基、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、又はエポキシ基などが好ましく、エポキシ基又はトシル基がより好ましい。 The surface of the magnetic particles is preferably modified with functional groups to immobilize the antibody. The functional group is preferably a thiol group, a maleimide group, a succinimidyl group, a carboxy group, a tosyl group, an amino group, an epoxy group, or the like, and more preferably an epoxy group or a tosyl group.
（抗体）
本発明における抗体結合磁性粒子では、抗体が、磁性粒子に結合している。抗体を結合させる方法に関しては、公知の物理吸着法または化学結合法をあげることができるが、抗体を磁性粒子の表面の官能基を介して、磁性粒子に化学的に結合させることが好ましい。具体的には、官能基と、抗体中のアミノ基又はチオール基とを共有結合させることが好ましい。
(antibody)
In the antibody-bound magnetic particles of the present invention, antibodies are bound to the magnetic particles. As a method for binding the antibody, known physical adsorption methods or chemical binding methods can be mentioned, but it is preferable to chemically bind the antibody to the magnetic particles via the functional groups on the surface of the magnetic particles. Specifically, it is preferable to covalently bond a functional group to an amino group or thiol group in the antibody.
抗体の種類は、本発明の効果が得られる限りにおいて限定されることはなく、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも使用することができるが、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡのいずれであってもよい。
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、本発明の効果が得られる限りにおいて、該モノクローナル抗体の機能を有する断片を含む。例えば、モノクローナル抗体の機能を有する断片としては、モノクローナル抗体の酵素的消化により得られる該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、遺伝子組換えによって作製される該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、及びファージディスプレイ法で作製されたｓｃＦｖを含む機能性断片等が挙げられる。
The type of antibody is not limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies can be used, preferably monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies may be IgG, IgE, IgM, IgD, or IgA.
As used herein, the term "monoclonal antibody" includes functional fragments of the monoclonal antibody as long as the effects of the present invention can be obtained. For example, the functional fragment of a monoclonal antibody includes a functional fragment containing the Fab portion of the monoclonal antibody obtained by enzymatic digestion of the monoclonal antibody, and a functional fragment containing the Fab portion of the monoclonal antibody produced by genetic recombination. Fragments, functional fragments containing scFv produced by phage display method, and the like.
本発明において使用される抗体は、例えば、以下の被検出物質に結合する抗体であることができる。
ＣＫ－ＭＢ、Ｈ－ＦＡＢＰ、トロポニン（トロポニンＩ、トロポニンＴ）、ミオグロビン等の心筋マーカー：フィブリン分解産物（例えばＤダイマー）、可溶性フィブリン、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビン複合体）、ＰＩＣ（プラスミン－プラスミンインヒビター複合体）などの凝固・線溶マーカー：酸化ＬＤＬ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）などの循環関連マーカー：アディポネクチンなどの代謝関連マーカー：ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＩＶＫＡ－II（Protein induced by vitamin K absence or antagonist II）、ムチン型糖タンパク質などの腫瘍マーカー：ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）、ＬＲＧ（ロイシンリッチαグリコプロテイン）、ＴＡＲＣ（Thymus and activation-regulated chemokine）などの炎症関係マーカー：ＭＭＰ－３（マトリックスメタプロテイナーゼ－３）、ＣＡ・ＲＦ（抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体）などの自己免疫関連マーカー：インフルエンザ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、トキソプラズマ、クラミジア、梅毒、黄色ブドウ球菌、大腸菌、プロカルシトニンなどの感染症関連マーカー：ホルモン：薬物：アレルゲン物質。
Antibodies used in the present invention can be, for example, antibodies that bind to the following substances to be detected.
Cardiac markers such as CK-MB, H-FABP, troponin (troponin I, troponin T), myoglobin: fibrin degradation products (eg D-dimer), soluble fibrin, TAT (thrombin-antithrombin complex), PIC (plasmin-plasmin coagulation/fibrinolysis markers such as inhibitor complex): circulation-related markers such as oxidized LDL and BNP (brain natriuretic peptide); metabolism-related markers such as adiponectin: CEA (carcinoembryonic antigen), AFP (α-fetoprotein), PSA (prostate specific antigen), PIVKA-II (Protein induced by vitamin K absence or antagonist II), tumor markers such as mucin-type glycoprotein: CRP (C-reactive protein), LRG (leucine-rich α-glycoprotein), TARC ( Inflammation-related markers such as Thymus and activation-regulated chemokine): Autoimmune-related markers such as MMP-3 (matrix metaproteinase-3), CA RF (anti-galactose-deficient IgG antibody): Influenza, HIV (human immunodeficiency virus) , HBV (Hepatitis B virus), HCV (Hepatitis C virus), Toxoplasma, Chlamydia, Syphilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Procalcitonin, etc.: Hormones: Drugs: Allergen substances.
等電点とはタンパク質の有効電荷が０になるときのｐＨである。一般的に、タンパク質の等電点と、タンパク質を含む溶液のｐＨとの間に極端な差がある場合に、タンパク質が変性する可能性があることが知られている。磁性粒子上に結合した抗体についても、同様の現象が生じる可能性がある。本発明において使用される抗体の等電点は、例えば、好ましくは５．２～８．０、より好ましくは５．７～７．５、最も好ましくは５．９～７．３である。抗体の等電点は、等電点電気泳動により測定することができる。 The isoelectric point is the pH at which the protein net charge is zero. It is generally known that proteins can be denatured when there is an extreme difference between the isoelectric point of the protein and the pH of the solution containing the protein. A similar phenomenon may occur for antibodies bound on magnetic particles. The isoelectric point of the antibody used in the present invention is, for example, preferably 5.2-8.0, more preferably 5.7-7.5, and most preferably 5.9-7.3. The isoelectric point of an antibody can be measured by isoelectric focusing.
（溶液）
本発明において使用される溶液のｐＨは、５．７～６．８である。ｐＨを上記範囲内にすることにより、抗体結合磁性粒子を安定的に保存することができる。
本発明者らは、抗体結合磁性粒子を、緩衝液を含む溶液において高温（３７℃）で保存する加速試験を行った。その結果、上記範囲内の溶液においては、抗体結合磁性粒子が安定的に保存され、免疫分析に使用した場合に感度の低下が抑制されていた。ｐＨが７．０の溶液で保存した比較例１に関しては、感度が８０％以下に低下し、ｐＨが５．５の溶液で保存した比較例２に関しては、感度が６０％以下に低下した。
抗体結合磁性粒子を溶液に懸濁させて保存する場合、溶液のｐＨは、前述の特許文献のように中性（ｐＨ７．０）に設定されるか、又は弱アルカリ性（ｐＨ７．０～８．０）に設定されることが多い。本発明において使用される溶液のように、ｐＨが５．７～６．８と弱酸性の溶液で良好な保存安定性が得られたのは驚くべきことである。
本発明において使用される溶液のｐＨは、下限が、好ましくは５．８、より好ましくは５．９、最も好ましくは６．０である。上限が、好ましくは６．７、より好ましくは６．６、最も好ましくは６．５である。具体的な範囲としては、好ましくは５．８～６．７、より好ましくは５．９～６．６、最も好ましくは６．０～６．５である。
上記具体的な範囲の上限は、６．４であってもよい。
(solution)
The pH of the solutions used in the present invention is 5.7-6.8. By setting the pH within the above range, the antibody-bound magnetic particles can be stably stored.
The present inventors conducted an accelerated test in which antibody-bound magnetic particles were stored at a high temperature (37°C) in a solution containing a buffer. As a result, in the solution within the above range, the antibody-bound magnetic particles were stably preserved, and reduction in sensitivity was suppressed when used for immunoassay. For Comparative Example 1 stored in a pH 7.0 solution, the sensitivity decreased to 80% or less, and for Comparative Example 2 stored in a pH 5.5 solution, the sensitivity decreased to 60% or less.
When the antibody-bound magnetic particles are suspended in a solution and stored, the pH of the solution is set to neutral (pH 7.0) as in the above-mentioned patent documents, or weakly alkaline (pH 7.0 to 8.0). 0) is often set. It is surprising that a weakly acidic solution with a pH of 5.7-6.8, such as the solution used in the present invention, provided good storage stability.
The pH of the solution used in the present invention preferably has a lower limit of 5.8, more preferably 5.9 and most preferably 6.0. The upper limit is preferably 6.7, more preferably 6.6, most preferably 6.5. A specific range is preferably 5.8 to 6.7, more preferably 5.9 to 6.6, and most preferably 6.0 to 6.5.
The upper limit of the above specific range may be 6.4.
本明細書において、「緩衝液」は、ｐＨの緩衝作用を有する溶液を意味する。本発明において用いられる緩衝液は、以下に限定されるものではないが、例えば、ＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ４４３２－３１－９）、ＰＩＰＥＳ（piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ５６２５－３７－６）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ７３６５－８２－４）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ２６２３９－５５－４）、Ｂｉｓ―Ｔｒｉｓ（2,2-Bis(hydroxyethyl)-(iminotris)-(hydroxymethyl)-methane：ＣＡＳ Ｎｏ ６９７６－３７－０）、Ｔｒｉｓ（tris(hydroxymethyl)aminomethane：ＣＡＳ Ｎｏ ７７－８６－１）、ＭＯＰＳ（3-Morpholinopropanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ １１３２－６１－２）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ７３６５－４５－９）、クエン酸緩衝液、又はリン酸緩衝液などの公知の緩衝液を適宜用いることができる。本発明において用いられる緩衝液は、好ましくはＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓであり、より好ましくはＭＥＳ又はＰＩＰＥＳであり、最も好ましくはＭＥＳである。
緩衝液のｐＫａ値（酸解離定数）は、本発明の効果が得られる限りは特に限定されないが、溶液中で強い緩衝作用が得られるように、使用されるｐＨに近いｐＫａを選択し、保存温度によるｐＨ変化を抑制して抗体結合磁性粒子を一定条件下で保存できるように、考慮することが好ましい。例えば、２０℃において、５．０～８．２、好ましくは５．５～８．２、より好ましくは５．８～７．５、最も好ましくは６．０～７．０である。
As used herein, "buffer" means a solution that has a pH buffering effect. The buffer solution used in the present invention is not limited to the following, but examples include MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid: CAS No 4432-31-9), PIPES (piperazine-N, N' -bis(2-ethanesulfonic acid: CAS No. 5625-37-6), ACES (N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid: CAS No. 7365-82-4), ADA (N-(2-Acetamido) iminodiacetic acid: CAS No. 26239-55-4), Bis-Tris (2,2-Bis(hydroxyethyl)-(iminotris)-(hydroxymethyl)-methane: CAS No. 6976-37-0), Tris(tris(hydroxymethyl) aminomethane: CAS No. 77-86-1), MOPS (3-Morpholinopropanesulfonic acid: CAS No. 1132-61-2), HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid: CAS No. 7365-45-9) , citrate buffer, phosphate buffer, etc. The buffer used in the present invention is preferably MES, PIPES, ACES, ADA, or Bis-Tris, MES or PIPES is more preferred, and MES is most preferred.
The pKa value (acid dissociation constant) of the buffer solution is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained. It is preferable to consider so that the antibody-bound magnetic particles can be stored under constant conditions by suppressing pH changes due to temperature. For example, at 20°C, it is 5.0 to 8.2, preferably 5.5 to 8.2, more preferably 5.8 to 7.5, most preferably 6.0 to 7.0.
緩衝液の濃度は、本発明の効果が得られる限りは特に限定されないが、たとえば、１ｍＭ～５００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ～４００ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ～３００ｍＭ、最も好ましくは５０ｍＭ～２００ｍＭである。
本発明において使用される緩衝液のｐＨは、下限が、好ましくは５．８、より好ましくは５．９、最も好ましくは６．０である。上限が、好ましくは６．７、より好ましくは６．６、最も好ましくは６．５である。具体的な範囲としては、好ましくは５．８～６．７、より好ましくは５．９～６．６、最も好ましくは６．０～６．５である。
上記具体的な範囲の上限は、６．４であってもよい。
The concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but is, for example, 1 mM to 500 mM, preferably 5 mM to 400 mM, more preferably 10 mM to 300 mM, and most preferably 50 mM to 200 mM.
The pH of the buffer used in the present invention preferably has a lower limit of 5.8, more preferably 5.9, and most preferably 6.0. The upper limit is preferably 6.7, more preferably 6.6, most preferably 6.5. A specific range is preferably 5.8 to 6.7, more preferably 5.9 to 6.6, and most preferably 6.0 to 6.5.
The upper limit of the above specific range may be 6.4.
（ブロッキング剤）
本発明において使用される溶液は、ブロッキング剤をさらに含むことが好ましい。本明細書において「ブロッキング剤」とは、抗体を磁性粒子に結合した後、試料中のタンパク質等が磁性粒子へ非特異的に吸着するのを防止するために溶液に添加する、抗体に対して免疫学的に反応しない物質、例えば、ポリマー、タンパク質等を意味する。本発明において使用されるブロッキング剤は、試料中のタンパク質等が磁性粒子へ非特異的に吸着するのを防止できれば限定されることはないが、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン等の生体由来高分子を用いてもよく、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（登録商標） ＣＥ２１０（株式会社医学生物学研究所）、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（株式会社医学生物学研究所）、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）シリーズ（例えば、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００シリーズ、ＢＬ２００シリーズ、ＢＬ４００シリーズ、ＢＬ５００シリーズ、ＢＬ７００シリーズ、ＢＬ８００シリーズ、ＢＬ１０００シリーズ、又はＢＬ１２００シリーズ、ＢＬ１３００シリーズ）（日油株式会社）、ブロッキング試薬Ｎ１０１（日油株式会社）、ブロッキング試薬Ｎ１０２（日油株式会社）などの市販されているものを使用することもできる。
本発明において使用される溶液は、試薬ブランク反応の低減を考慮して、好ましくは、ブロッキング剤としてＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０及び／又はＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０を含み、さらに好ましくはＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０を含み、さらに好ましくはＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の両方を含む。
ブロッキング剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．０１質量％～１０質量％、０．０５質量％～８質量％、０．１質量％～５質量％、０．２質量％～４質量％、又は０．５質量％～２質量％であることができる。なお、上記濃度は、複数のブロッキング剤を含む場合は、合計の濃度である。また、上記濃度は、ブロッキング剤に含まれる有効成分の濃度である。
(blocking agent)
Preferably, the solution used in the present invention further contains a blocking agent. As used herein, the term "blocking agent" refers to an antibody that is added to a solution after binding an antibody to magnetic particles to prevent non-specific adsorption of proteins, etc. in the sample to the magnetic particles. Substances that do not react immunologically, such as polymers, proteins, and the like. The blocking agent used in the present invention is not limited as long as it can prevent non-specific adsorption of proteins and the like in the sample to the magnetic particles. Examples include bovine serum albumin (BSA), casein, gelatin, and the like. Blockmaster (registered trademark) CE210 (Medical and Biological Laboratories, Inc.), Blockmaster CE510 (Medical and Biological Laboratories, Inc.), Lipidure (registered trademark) series (e.g., LIPIDURE ( Registered trademark)-BL100 series, BL200 series, BL400 series, BL500 series, BL700 series, BL800 series, BL1000 series, or BL1200 series, BL1300 series) (NOF Corporation), blocking reagent N101 (NOF Corporation), blocking Commercially available reagents such as reagent N102 (NOF CORPORATION) can also be used.
In consideration of the reduction of reagent blank reaction, the solution used in the present invention preferably contains Blockmaster CE210 and/or Blockmaster CE510, more preferably Blockmaster CE210, more preferably Blockmaster CE210 and bovine Includes both serum albumin (BSA).
The concentration of the blocking agent is, for example, 0.01% by mass to 10% by mass, 0.05% by mass to 8% by mass, 0.1% by mass to 5% by mass, based on the antibody-bound magnetic particle suspension solution. It can be from 0.2 wt% to 4 wt%, or from 0.5 wt% to 2 wt%. In addition, the said density|concentration is a total density|concentration when several blocking agents are included. Moreover, the above concentration is the concentration of the active ingredient contained in the blocking agent.
本発明において使用される溶液は、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、塩類、及び糖類などの成分を含むことができる。
本発明において使用される溶液は、最も好ましくは、ブロッキング剤として、０．１質量％～０．５質量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０、及び０．１質量％～１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。
Solutions used in the present invention may contain ingredients such as preservatives, surfactants, chelating agents, salts, and sugars.
The solutions used in the present invention most preferably contain 0.1% to 0.5% by weight Blockmaster CE210 and 0.1% to 1% by weight bovine serum albumin (BSA) as blocking agents. include.
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。市販の界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：ＣＡＳ Ｎｏ ９００５－６４－５）、陰イオン性界面活性剤のデモール（登録商標）ＮＬ（β‐ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩：ＣＡＳ Ｎｏ ９０８４－０６－４）などを使用することができる。
界面活性剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．００１質量％～１質量％、又は０．００５質量％～０．０２質量％であることができる。
Surfactants include nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants and the like. Commercially available surfactants include, for example, nonionic surfactant Tween (registered trademark) 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate: CAS No. 9005-64-5), anionic surfactant Demol (registered trademark) NL (β-naphthalenesulfonic acid formalin condensate sodium salt: CAS No. 9084-06-4) and the like can be used.
The concentration of the surfactant can be, for example, 0.001% to 1% by weight, or 0.005% to 0.02% by weight, based on the solution for suspending the antibody-bound magnetic particles.
防腐剤としては、ＰｒｏＣｌｉｎ１５０、ＰｒｏＣｌｉｎ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ３００、又はＰｒｏＣｌｉｎ９５０（全てメルク社）などを使用することができる。
防腐剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．０１質量％～１質量％、又は０．０２質量％～０．１質量％であることができる。
ProClin 150, ProClin 200, ProClin 300, or ProClin 950 (all Merck) can be used as antiseptics.
The concentration of the preservative can be, for example, 0.01% to 1% by weight, or 0.02% to 0.1% by weight, based on the solution for suspending the antibody-bound magnetic particles.
キレート剤としては、ＥＤＴＡ－３Ｎａ（エデト酸三ナトリウム）、ＥＤＴＡ－２Ｎａ（エデト酸二ナトリウム）、ＥＤＴＡ－２Ｋ（エデト酸二カリウム）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、又はＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）などを使用することができる。
キレート剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～１００ｍＭ、又は２ｍＭ～１０ｍＭであることができる。
Chelating agents include EDTA-3Na (trisodium edetate), EDTA-2Na (disodium edetate), EDTA-2K (dipotassium edetate), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), or EGTA (glycol ether diamine tetraacetic acid). ), etc. can be used.
The concentration of the chelating agent can be, for example, 1 mM to 100 mM, or 2 mM to 10 mM.
塩類としては、塩化ナトリウム、又は塩化カリウムなどが挙げられる。
塩類の濃度は、例えば、１ｍＭ～１０００ｍＭ、又は５０ｍＭ～５００ｍＭであることができる。
Salts include sodium chloride, potassium chloride, and the like.
The salt concentration can be, for example, 1 mM to 1000 mM, or 50 mM to 500 mM.
糖類としては、ショ糖、シクロデキストリンなどが挙げられる。 Sugars include sucrose, cyclodextrin, and the like.
上記各成分の濃度は、抗体結合磁性粒子懸濁液基準の濃度であることもできる。 The concentration of each component described above can also be the standard concentration of the antibody-binding magnetic particle suspension.
（接触）
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子との接触は、抗体結合磁性粒子が安定的に保存できる限り、いずれの方法を用いてもよい。
例えば、ｐＨが５．７～６．８である溶液に抗体結合磁性粒子を添加することができる。抗体結合磁性粒子は、事前に他の分散液に分散された形態で、ｐＨが５．７～６．８である溶液に添加されてもよい。また、ｐＨが５．７～６．８以外である溶液に抗体結合磁性粒子を添加した後にｐＨ調整を行い、ｐＨを５．７～６．８にしてもよい。ｐＨ調整剤としては、公知のもの、例えば、水酸化ナトリウム又は塩酸などを使用することができる。当業者であれば、測定用試薬の構成、被検出物質等を考慮して好ましい接触の形態を採用することができる。抗体結合磁性粒子が安定的に保存できるように、ｐＨが５．７～６．８である溶液に抗体結合磁性粒子を添加することが好ましい。
抗体結合磁性粒子を、懸濁液における抗体結合磁性粒子の濃度が、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬとなるように、ｐＨが５．７～６．８である溶液と接触させることができる。
(contact)
Any method may be used for contacting the antibody-bound magnetic particles with a solution having a pH of 5.7 to 6.8 as long as the antibody-bound magnetic particles can be stably stored.
For example, antibody-bound magnetic particles can be added to a solution having a pH of 5.7-6.8. Antibody-bound magnetic particles may be previously dispersed in another dispersion liquid and added to a solution having a pH of 5.7 to 6.8. Alternatively, the pH may be adjusted to 5.7 to 6.8 after adding the antibody-bound magnetic particles to a solution having a pH other than 5.7 to 6.8. As a pH adjuster, a known one such as sodium hydroxide or hydrochloric acid can be used. A person skilled in the art can adopt a preferred form of contact in consideration of the composition of the reagent for measurement, the substance to be detected, and the like. It is preferable to add the antibody-bound magnetic particles to a solution with a pH of 5.7 to 6.8 so that the antibody-bound magnetic particles can be stably stored.
The concentration of the antibody-bound magnetic particles in the suspension is, for example, 0.01 mg/mL to 100 mg/mL, preferably 0.05 mg/mL to 50 mg/mL, more preferably 0.1 mg/mL. -25 mg/mL, more preferably 0.25 mg/mL to 10 mg/mL, most preferably 0.5 mg/mL to 5 mg/mL, with a solution having a pH of 5.7 to 6.8 be able to.
（保存容器）
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させて、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を調製する。調製した抗体結合磁性粒子を含む懸濁液は、任意の保存容器に保存することができる。保存容器の形態としては、ハードタイプまたはソフトタイプのいずれでもよく、チューブ、ボトル、アンプル、バイアル、ソフトバッグ、ガラス瓶などが例示される。
保存容器の材質は、抗体結合磁性粒子を安定的に保存でき、そして密封ができれば特に限定されないが、少なくとも抗体結合磁性粒子を含む懸濁液との接触部分の一部又は全部が、プラスチック［例えば、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、フッ素樹脂、塩素系樹脂（ポリ塩化ビニルなど）、ポリアミド系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリフェニレンエーテル系樹脂（変性ポリフェニレンエーテルなど）、ポリアリレート、ポリスルホン、ポリイミド系樹脂、セルロース系樹脂（セルロースアセテートなど）、炭化水素系樹脂（ハロゲン原子置換品を含む）など］、又はガラスであることができる。
(storage container)
A solution having a pH of 5.7 to 6.8 is brought into contact with the antibody-bound magnetic particles to prepare a suspension containing the antibody-bound magnetic particles. The suspension containing the prepared antibody-bound magnetic particles can be stored in any storage container. The form of the storage container may be either hard type or soft type, and examples thereof include tubes, bottles, ampoules, vials, soft bags, and glass bottles.
The material of the storage container is not particularly limited as long as it can stably store the antibody-bound magnetic particles and can be tightly sealed. , olefin resins, styrene resins, acrylic resins, polyester resins, polycarbonate resins, fluorine resins, chlorine resins (such as polyvinyl chloride), polyamide resins, polyacetal resins, polyphenylene ether resins (modified polyphenylene ether etc.), polyarylates, polysulfones, polyimide-based resins, cellulose-based resins (cellulose acetate, etc.), hydrocarbon-based resins (including halogen atom-substituted products), etc.], or glass.
（保存安定化）
本明細書において、「保存安定化」又は「安定的に保存する」は、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を特定の温度で長期間保存した後、この抗体結合磁性粒子を用いて免疫分析を行った場合でも、保存前と比較して感度が低下しないことを意味する。感度が低下するとは、免疫分析に供する試料には相当量の被検出物質が含まれているにもかかわらず、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を保存する前と比較して、標識物質に由来するシグナルが十分に得られない（あるいは、競合法の場合は、過度に得られる）ことである。
「長期間」とは、例えば、１週間以上、又は３週間以上である。「特定の温度」とは、例えば室温、又は３７℃での加速試験が挙げられる。
本発明の抗体結合磁性粒子の保存安定化方法では、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を３７℃で３週間保存して、この抗体結合磁性粒子を用いて免疫分析を行った場合の感度が、好ましくは、保存せずに免疫分析を行った場合の感度の８０％以上、より好ましくは８２％以上、さらに好ましくは８４％以上、最も好ましくは８６％以上である。
(storage stabilization)
As used herein, the term “storage stabilization” or “stable storage” refers to the long-term storage of a suspension containing antibody-bound magnetic particles at a specific temperature, followed by immunoassay using the antibody-bound magnetic particles. It means that the sensitivity does not decrease compared to before storage even when Decrease in sensitivity means that although the sample subjected to immunoassay contains a considerable amount of the substance to be detected, compared to before the suspension containing the antibody-bound magnetic particles was stored, the labeling substance Not enough (or, in the case of competitive methods, too much) of the derived signal.
"Long term" is, for example, one week or longer, or three weeks or longer. "Specific temperature" includes, for example, room temperature or an accelerated test at 37°C.
In the method for stabilizing the storage of antibody-bound magnetic particles of the present invention, the suspension containing the antibody-bound magnetic particles is stored at 37° C. for 3 weeks, and the sensitivity is improved when immunoassay is performed using the antibody-bound magnetic particles. , preferably at least 80%, more preferably at least 82%, even more preferably at least 84%, most preferably at least 86% of the sensitivity of immunoassays performed without storage.
２．懸濁液
本発明の懸濁液は、抗体結合磁性粒子とｐＫａ値が５．０～８．２である緩衝液とを含む。本発明の懸濁液のｐＨは、５．７～６．８である。
2. Suspension The suspension of the present invention comprises antibody-bound magnetic particles and a buffer solution with a pKa value of 5.0-8.2. The pH of the suspension of the invention is between 5.7 and 6.8.
本発明の懸濁液は、懸濁液のみからなる試薬の形態であってもよく、複数の試薬からなる試薬形態（すなわち、試薬キット）であってもよい。
試薬キットは、本発明の懸濁液以外に、反応時の溶液として使用する反応用緩衝液、抗体結合磁性粒子に含まれる抗体に結合する、標識抗体溶液（標識試薬）、検体希釈液、基質溶液、及び内部標準試薬等をさらに含んでもよい。
The suspension of the present invention may be in the form of a reagent consisting only of the suspension, or in the form of a reagent consisting of a plurality of reagents (ie reagent kit).
In addition to the suspension of the present invention, the reagent kit includes a reaction buffer used as a solution during the reaction, a labeled antibody solution (labeling reagent) that binds to the antibody contained in the antibody-bound magnetic particles, a sample diluent, a substrate It may further contain a solution, an internal standard reagent, and the like.
標識抗体に結合した標識物質としては、例えば金属錯体、酵素、不溶性粒子、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、又はアビジンが挙げられる。例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素がＨＲＰの場合には、例えばＯ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）あるいは３，３’，５，５’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＬＰの場合にはｐ-ニトロフェニル・ホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合には、モノクローナル抗体をビオチンで標識し、酵素、色素、又は蛍光標識（好ましくはＨＲＰ）で標識したアビジン又はストレプトアビジンを反応させることもできる。 Labeling substances bound to labeled antibodies include, for example, metal complexes, enzymes, insoluble particles, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, or avidin. For example, when an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (ALP) is used as a labeling substance, a specific substrate of the enzyme (when the enzyme is HRP, for example, O-phenylenediamine (OPD) Alternatively, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), p-nitrophenyl phosphate in the case of ALP, etc.) can be used to measure enzymatic activity. When biotin is used as a labeling substance, a monoclonal antibody can be labeled with biotin and reacted with avidin or streptavidin labeled with an enzyme, dye, or fluorescent label (preferably HRP).
本発明の懸濁液は、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ法）、を行うための試薬であることが好ましい。 The suspension of the present invention is an electrochemiluminescence immunoassay method (ECLIA method), a chemiluminescence enzyme immunoassay method (CLEIA method), a chemiluminescence immunoassay method (CLIA method), or an enzyme immunoassay method (ELISA method), It is preferably a reagent for performing a fluorescent enzyme immunoassay (FLEIA method).
ＥＣＬＩＡ法とは、通電により標識物質を発光させ、その発光量を検出することで被検出物質の量を測定する方法を意味する。
ＥＣＬＩＡ法の測定を行うための試薬キットである場合は、以下の試薬（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と電気化学発光物質（例えば、ルテニウム錯体等）とのコンジュゲートを含む標識試薬、及び
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
The ECLIA method means a method of measuring the amount of a substance to be detected by causing a labeling substance to emit light when electricity is applied and detecting the amount of light emitted.
A reagent kit for measuring the ECLIA method can contain the following reagents (A) and (B).
(A) a labeling reagent containing a conjugate of a second antibody that binds to the substance to be detected and an electrochemiluminescent substance (e.g., ruthenium complex, etc.), and (B) a first antibody that binds to the substance to be detected are immobilized. A suspension containing magnetic particles.
被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子に、試料を添加して反応させた後、続いてコンジュゲートを添加して反応させる。磁性粒子を洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させる。続いて、標識物質の発光量を測定することにより、被検出物質を分析することができる。ある一つの様態では、磁性粒子と試料を反応させた後、試料を除去して洗浄することもできる。 After the sample is added to the magnetic particles on which the first antibody that binds to the substance to be detected is immobilized and allowed to react, the conjugate is subsequently added and allowed to react. After washing the magnetic particles, electrical energy is applied to cause them to emit light. Subsequently, the substance to be detected can be analyzed by measuring the amount of light emitted from the labeled substance. In one aspect, the sample can be removed and washed after allowing the magnetic particles to react with the sample.
ＣＬＥＩＡ法とは、固定化した抗体に対して抗原を反応させた後、酵素標識した抗体を抗原に反応させ、化学発光基質を加えて発光強度を測定する方法である。ＣＬＥＩＡ法の測定を行うための試薬キットである場合は、以下の試薬（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と酵素（例えば、アルカリフォスタファーゼ等）とのコンジュゲートを含む標識試薬、及び
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
また、（Ｃ）として、反応時の溶液として使用する反応用緩衝液を含むこともできる。（Ｄ）として、酵素の基質溶液（例えば、２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－（５－クロロトリシクロ［３．３．１．１３．７］デカン］）－４－イル］－１－フェニルリン酸二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ 登録商標））を含んでもよい。
被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子に、試料を添加して反応させた後、続いてコンジュゲートを添加して反応させる。磁性粒子を洗浄後、酵素の基質を加えて反応させる。続いて、発光量を測定することにより、被検出物質を分析することができる。ある一つの様態では、磁性粒子と試料を反応させた後、試料を除去して洗浄することもできる。
The CLEIA method is a method of reacting an immobilized antibody with an antigen, reacting an enzyme-labeled antibody with the antigen, adding a chemiluminescent substrate, and measuring the luminescence intensity. A reagent kit for measuring the CLEIA method can contain the following reagents (A) and (B).
(A) a labeling reagent containing a conjugate of a second antibody that binds to the substance to be detected and an enzyme (e.g., alkaline phostaphase, etc.); and (B) a magnetism immobilized with the first antibody that binds to the substance to be detected Suspension containing particles.
In addition, as (C), a reaction buffer used as a solution during the reaction can also be included. As (D), an enzyme substrate solution (for example, 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2′-(5-chlorotricyclo[ 3.3.1.13 .7 ]decane])-4-yl]-1-phenyl phosphate disodium (CDP-Star®)).
After the sample is added to the magnetic particles on which the first antibody that binds to the substance to be detected is immobilized and allowed to react, the conjugate is then added and allowed to react. After washing the magnetic particles, the enzyme substrate is added and reacted. Subsequently, the substance to be detected can be analyzed by measuring the amount of light emitted. In one aspect, the sample can be removed and washed after allowing the magnetic particles to react with the sample.
ＣＬＩＡ法とは、固定化した抗体に対して抗原を反応させた後、化学発光物質で標識した抗体を抗原に反応させ、その後、化学発光物質の発光強度を測定する方法である。化学発光物質としては、アクリジニウムなどを用いることができる。
酵素ではなく、化学発光物質で標識する以外は、キットに含まれる試薬（Ａ）及び（Ｂ）の内容は、ＣＬＥＩＡ法と同様である。
The CLIA method is a method of reacting an immobilized antibody with an antigen, reacting a chemiluminescent substance-labeled antibody with the antigen, and then measuring the luminescence intensity of the chemiluminescent substance. Acridinium or the like can be used as the chemiluminescent substance.
The contents of the reagents (A) and (B) included in the kit are the same as in the CLEIA method, except that they are labeled with a chemiluminescent substance instead of an enzyme.
ＥＬＩＳＡ法とは、試料中に含まれる被検出物質である抗原又は抗体を、前記被検出物質に対する抗体又は抗原を利用して捕捉した後に、酵素反応を利用して検出する方法を意味する。ＥＬＩＳＡ法の測定を行うための試薬キットである場合は、以下の試薬（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と酵素（ＨＲＰ又はＡＬＰ等）とのコンジュゲートを含む標識試薬
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
このようなキットでは、まず、第一抗体を固定化した磁性粒子に試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識試薬を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。発色を測定することにより、被検出物質を分析することができる。
ＦＬＥＩＡ法の測定原理は、蛍光基質を加えて蛍光強度を計測する以外は、ＥＬＩＳＡ法と同様である。
The ELISA method means a method in which an antigen or antibody, which is a substance to be detected contained in a sample, is captured using an antibody or antigen against the substance to be detected, and then detected using an enzymatic reaction. A reagent kit for performing ELISA measurements can contain the following reagents (A) and (B).
(A) Labeling reagent containing a conjugate of a second antibody that binds to the substance to be detected and an enzyme (HRP, ALP, etc.) (B) Suspension containing magnetic particles immobilized with the first antibody that binds to the substance to be detected liquid.
In such a kit, first, a sample is added to magnetic particles on which a primary antibody is immobilized, followed by incubation, removal of the sample, and washing. Next, a labeling reagent is added, incubated, and a substrate is added for color development. The substance to be detected can be analyzed by measuring color development.
The measurement principle of the FLEIA method is the same as that of the ELISA method, except that a fluorescent substrate is added and the fluorescence intensity is measured.
サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、二次抗体を用いることもできる。二次抗体を用いる場合、本発明の分析キットは、以下（Ａ）～（Ｄ）を含むことができる。
（Ａ）一次抗体としての、被検出物質に結合する第二抗体
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液
（Ｃ）酵素（ＨＲＰ又はＡＬＰ等）で標識した、第二抗体に対する抗体（二次抗体）を含む標識試薬
（Ｄ）酵素の基質（ＯＰＤ、ＴＭＢ、又はｐ－ニトロフェニル・ホスフェートなど）
このようなキットでは、まず、第一抗体を固定化した磁性粒子に適宜処理し希釈した試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行う。さらに酵素で標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。その後、基質を加えて発色させる。発色を測定することにより、被検出物質を分析することができる。
A secondary antibody can also be used in a sandwich ELISA. When using a secondary antibody, the analysis kit of the present invention can contain the following (A) to (D).
(A) a secondary antibody that binds to the substance to be detected as the primary antibody; (B) a suspension containing magnetic particles immobilized with the primary antibody that binds to the substance to be detected; (C) an enzyme (HRP, ALP, etc.) (D) a substrate for the enzyme (OPD, TMB, or p-nitrophenyl phosphate, etc.) containing an antibody against the second antibody (secondary antibody) labeled with
In such a kit, first, a sample that has been appropriately treated and diluted is added to the magnetic particles on which the primary antibody is immobilized, followed by incubation, removal of the sample, and washing. Subsequently, the primary antibody is added, followed by incubation and washing. Furthermore, an enzyme-labeled secondary antibody is added and incubated. Substrate is then added for color development. The substance to be detected can be analyzed by measuring color development.
（試料）
本発明において、被検出物質を含有する可能性のある試料としては、主に生物由来の生体試料やそれらから被検出物質を抽出した抽出液等が挙げられる。液体飲料、半固形食品、及び固形食品等に代表される食品検体、土壌、河川、及び海水等の自然界からのサンプリング検体、並びに工場内の生産ライン又はクリーンルームのふき取り検体も、被検出物質を含有する可能性のある試料として使用することが可能である。生物由来の物質としては、具体的には、血液（全血）、血清、血漿、リンパ液、尿、糞便、腹水、胸水、組織、又は細胞などが挙げられる。生体試料には、前記全血などから、遠心分離、ろ過、若しくは精製などの手段により分離若しくは分画された測定試料成分、有機溶媒などにより抽出された測定試料成分、界面活性剤などにより可溶化された測定試料成分、緩衝液などにより希釈された測定試料成分、又は化学反応などにより修飾若しくは改変された測定試料成分などが含まれる。
生体試料を採取する対象は、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、及びハムスター）を含み、好ましくはヒトである。
(sample)
In the present invention, samples that may contain the substance to be detected mainly include biological samples derived from living organisms and extracts obtained by extracting the substance to be detected from them. Food specimens represented by liquid beverages, semi-solid foods, solid foods, etc., sampling specimens from the natural world such as soil, rivers, and seawater, and swab specimens from production lines or clean rooms in factories also contain substances to be detected. It is possible to use it as a sample that has the possibility of Specific examples of biological substances include blood (whole blood), serum, plasma, lymph, urine, feces, ascites, pleural effusion, tissues, cells, and the like. Biological samples include measurement sample components separated or fractionated from whole blood by means of centrifugation, filtration, purification, etc., measurement sample components extracted with an organic solvent, etc., and solubilized with surfactants, etc. measurement sample components diluted with a buffer solution or the like; or measurement sample components modified or altered by a chemical reaction or the like.
Subjects from which biological samples are collected include humans or animals (eg, monkeys, dogs, cats, mice, guinea pigs, rats, and hamsters), preferably humans.
抗原としては、前述の抗体で分析可能な抗原が挙げられる。 Antigens include antigens that can be analyzed with the aforementioned antibodies.
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明のない限り、％は質量％を意味する。 EXAMPLES Next, the present invention will be specifically described with reference to examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention. In addition, % means % by mass unless otherwise specified.
≪実施例１ 抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液の調製≫
１－１ 使用した試薬等
・３０ｍｇ／ｍＬ磁性粒子（積水メディカル社製、平均粒子径３μｍ）
・抗ＢＮＰモノクローナル抗体
・ＰＢＳ（ｐＨ７．８）
・３Ｍ硫酸アンモニウム液（ｉｎ ＰＢＳ）
・ブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）
・洗浄・保存液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）
<<Example 1 Preparation of anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension>>
1-1 Reagents used 30 mg/mL magnetic particles (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd., average particle size 3 μm)
・Anti-BNP monoclonal antibody ・PBS (pH 7.8)
・ 3M ammonium sulfate solution (in PBS)
・Blocking solution (PBS/1% BSA)
・Washing/preserving solution (PBS/1% BSA/0.05% Tween20)
１－２ 操作
ＰＢＳを用いて抗ＢＮＰモノクローナル抗体を終夜透析した。次に、ＰＢＳを使用して、磁性粒子３０ｍｇを洗浄した。抗体濃度を０．７５Ａｂｓに調整し、この抗体溶液を磁性粒子３０ｍｇに添加して撹拌した。さらに３Ｍ硫酸アンモニウム液を加えて撹拌した。２５℃で１６～２４時間回転撹拌した。次に、抗体溶液を除去し、洗浄した。ブロッキング液を磁性粒子液に添加して、２５℃で３時間回転撹拌した。ブロッキング液を除去して洗浄液で洗浄した。洗浄液を除去した後、保存液を添加して、必要に応じて３７℃で２日間エージングした後、４℃で保存して、３０ｍｇ／ｍＬ濃度の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を調製した。
上記の操作により調製した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を以下の表１の組成を有する懸濁用溶液に、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように懸濁させ、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を調製した。
1-2 Operation
Anti-BNP monoclonal antibody was dialyzed overnight using PBS. PBS was then used to wash 30 mg of the magnetic particles. The antibody concentration was adjusted to 0.75 Abs, and this antibody solution was added to 30 mg of magnetic particles and stirred. Further, 3M ammonium sulfate solution was added and stirred. Rotate and stir at 25° C. for 16-24 hours. The antibody solution was then removed and washed. The blocking solution was added to the magnetic particle solution, and the mixture was rotationally stirred at 25° C. for 3 hours. The blocking solution was removed and washed with a washing solution. After removing the washing solution, a storage solution was added, and if necessary, aged at 37° C. for 2 days and then stored at 4° C. to prepare a solution containing anti-BNP antibody-bound magnetic particles with a concentration of 30 mg/mL.
The anti-BNP antibody-bound magnetic particle-containing solution prepared by the above operation was suspended in a suspension solution having the composition shown in Table 1 below so that the concentration of the anti-BNP antibody-bound magnetic particles was 1.0 mg/mL. , an anti-BNP antibody-coupled magnetic particle suspension was prepared.
また、実施例１とは緩衝液の種類、緩衝液のｐＫａ値、緩衝液の濃度、及び懸濁用溶液のｐＨを変更して、実施例２～１２、及び比較例１～２の懸濁用溶液を調製した。各懸濁用溶液に含まれる緩衝液の種類、緩衝液のｐＫａ値、緩衝液の濃度、及び懸濁用溶液のｐＨを表４及び５に示す。 In addition, by changing the type of buffer, the pKa value of the buffer, the concentration of the buffer, and the pH of the suspension solution from Example 1, suspensions of Examples 2 to 12 and Comparative Examples 1 and 2 A solution for use was prepared. Tables 4 and 5 show the type of buffer contained in each suspending solution, the pKa value of the buffer, the concentration of the buffer, and the pH of the suspending solution.
≪実施例２ 抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液の保存とＥＣＬ分析による感度への影響確認≫
実施例２～１２、及び比較例１～２の各々の懸濁用溶液に対して、実施例１の１－２で調製した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を実施例１と同様に添加して、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を調製した。これらの抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を３７℃で１週間又は３週間保存した。保存０日、１週間後、及び３週間後に、各々の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いて、ＥＣＬ分析を行い、感度を比較した。試料としては、低値検体（５１．５ｐｇ／ｍＬ）、中値検体（１００ｐｇ／ｍＬ）、高値検体（２３６１．１ｐｇ／ｍＬ又は５０００ｐｇ／ｍＬ）を用いた。
<<Example 2 Storage of anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension and confirmation of effect on sensitivity by ECL analysis>>
In the same manner as in Example 1, the anti-BNP antibody-bound magnetic particle-containing solution prepared in 1-2 of Example 1 was added to each of the suspension solutions of Examples 2-12 and Comparative Examples 1-2. to prepare an anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension. These anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspensions were stored at 37° C. for 1 week or 3 weeks. After 0 days, 1 week, and 3 weeks of storage, each anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension was used for ECL analysis to compare sensitivities. As samples, a low level specimen (51.5 pg/mL), a medium level specimen (100 pg/mL), and a high level specimen (2361.1 pg/mL or 5000 pg/mL) were used.
測定装置の所定の場所に、装置指定の容器に入れた抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液と、ルテニウム標識抗ＢＮＰ抗体溶液をセットした。測定装置指定の反応用容器に、反応用緩衝液を５０μＬ分注し、次に測定試料を３０μＬ投入した。測定試料が入った反応用容器を測定装置の所定の場所にセットし、測定準備を完了させた。装置測定をスタートすると、測定試料が入った反応用容器に抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液２５μＬが投入され、２８℃で約７分間抗原抗体反応が行われた（第一反応）。次にルテニウム標識抗ＢＮＰ抗体溶液が５０μＬ投入され、２８℃で約３分間抗原抗体反応が行われた（第二反応）。その後、装置指定のＢＦ洗浄液でＢＦ分離が行われ、未反応の試料及びルテニウム標識抗体が除去された。反応によって生成された抗原抗体サンドイッチ複合体を装置指定の発光基質（トリプロピルアミン）溶液に懸濁し、装置の所定の場所にて電気を加え、化学発光（ＥＣＬ発光）させた。試験は、ＢＮＰ含有量が少ない低値検体（ＢＮＰ：５１．５ｐｇ／ｍＬ）、中値検体（ＢＮＰ：１００ｐｇ／ｍＬ）、高値検体（ＢＮＰ：２３６１．１ｐｇ／ｍＬ）を用いて行った。 An anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension and a ruthenium-labeled anti-BNP antibody solution in a container designated by the device were set at predetermined locations on the measurement device. 50 μL of the reaction buffer solution was dispensed into a reaction vessel designated by the measurement device, and then 30 μL of the measurement sample was added. The reaction container containing the measurement sample was set at a predetermined location in the measurement device to complete the preparation for measurement. When the device measurement was started, 25 μL of the anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension was added to the reaction container containing the measurement sample, and antigen-antibody reaction was performed at 28° C. for about 7 minutes (first reaction). Next, 50 μL of the ruthenium-labeled anti-BNP antibody solution was added, and an antigen-antibody reaction was performed at 28° C. for about 3 minutes (second reaction). After that, BF separation was performed with a BF washing solution specified by the apparatus to remove unreacted sample and ruthenium-labeled antibody. An antigen-antibody sandwich complex produced by the reaction was suspended in a luminescence substrate (tripropylamine) solution designated by the device, and electricity was applied at a predetermined location of the device to cause chemiluminescence (ECL luminescence). The test was performed using a low level specimen (BNP: 51.5 pg/mL), a medium level specimen (BNP: 100 pg/mL), and a high level specimen (BNP: 2361.1 pg/mL) with low BNP content.
なお、反応用緩衝液（表２）及びルテニウム標識抗ＢＮＰ抗体溶液（表３）の組成は、以下の通りである。 The compositions of the reaction buffer (Table 2) and the ruthenium-labeled anti-BNP antibody solution (Table 3) are as follows.
結果を以下の表４及び５に示す。結果（％）は、保存０日を１００とした場合の値である。 The results are shown in Tables 4 and 5 below. The result (%) is a value when 0 days of storage is set to 100.
表４には、緩衝液としてＭＥＳを用い、濃度又はｐＨを変更して行った結果を示している。ｐＨが６．０～６．４である実施例１～４は、３７℃で３週間保存した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合において、保存０日の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合に対して、低値検体及び高値検体のいずれも８０％以上の感度を示した。
ｐＨが、それぞれ７．０及び５．５である比較例１及び２は、３７℃で３週間保存した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合において、保存０日の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合に対して、低値検体及び高値検体のいずれも８０％未満の感度を示した。
Table 4 shows the results obtained by using MES as a buffer and changing the concentration or pH. Examples 1 to 4 with a pH of 6.0 to 6.4 are anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspensions stored at 37° C. for 3 weeks, and the anti-BNP antibody-bound magnetic particles are stored for 0 days. Both low-value and high-value samples showed a sensitivity of 80% or more compared to the suspension.
Comparative Examples 1 and 2, whose pH is 7.0 and 5.5, respectively, use the anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension stored at 37° C. for 3 weeks. Both low and high analytes showed less than 80% sensitivity relative to the magnetic particle suspension.
表５には、緩衝液の種類及びｐＨを変更して行った結果を示している。実施例５～１２は、３７℃で３週間保存した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合において、保存０日の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合に対して、中値検体及び高値検体のいずれも８０％未満の感度を示した。 Table 5 shows the results obtained by changing the type and pH of the buffer solution. In Examples 5 to 12, in the case of using the anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension stored at 37° C. for 3 weeks, the anti-BNP antibody-bound magnetic particle suspension stored for 0 days was used. Both intermediate and high samples showed a sensitivity of less than 80%.
本発明によれば、抗体結合磁性粒子を安定的に保存することができる。 According to the present invention, antibody-bound magnetic particles can be stably stored.
Claims (17)
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法。 A method for stabilizing storage of antibody-bound magnetic particles, comprising contacting a solution having a pH of 5.7 to 6.8 with the antibody-bound magnetic particles,
The above method, wherein the solution comprises a buffer.
緩衝液と
を含み、ｐＨが５．７～６．８である、懸濁液。 A suspension comprising antibody-bound magnetic particles and a buffer and having a pH of 5.7 to 6.8.
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