JP3584055B2 - Novel compound B1371A or B1371B and process for producing them - Google Patents

Description

【００１２】
（２）物性
１）性質；中性脂溶性の白色、吸湿性粉末。アルカリ性溶液では室温で不安定。
【００１３】
２）溶解性；メタノールに易溶、水、クロロホルム、ヘキサンに難溶。
【００１４】
３）呈色試験；坂口反応、ニンヒドリン反応、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ 反応に陰性。
【００１５】
４）分子式；Ｃ_４６Ｈ_６７Ｎ_５Ｏ_１１
５）分子量；ＬＳＩ−ＭＡＳＳ法により決定（Ｍ＋Ｈ）^＋
８６６．４９１８（測定値）
８６６．４９１５（計算値）
６）比施光度（測定値）；〔α〕_Ｄ ^２５ −２６．４°（Ｃ ０．２７，メタノール）
７）紫外線吸収スペクトル；λｍａｘ ｎｍ（ ε）
メタノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは以下に示す通りである。
２２７．４（３．４５×１０^３）
２２３．６（１．９１×１０^４）
８）赤外線吸収スペクトル；νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１
ＫＢｒ ディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは以下の極大吸収を示す。
【００１６】
１５１６．９３９，１５３６．６２６，１６６８．２８４，１７４７．７３１，２９３１．５５９，２９６２．５８２，３３１５．９６３
９）^１ Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳ（テトラメチルシラン）を使用して測定した^１ Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００ ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００１７】
０．９０（３Ｈ，ｔ），０．９５（６Ｈ，ｄ），１．０２（３Ｈ，ｄ），１．０７（３Ｈ，ｄ），１．２−１．５０（１２Ｈ，ｍ），１．９８（１Ｈ，ｍ），２．１４（１Ｈ，ｍ），２．２５−２．５０（４Ｈ，ｍ），２．７３（１Ｈ，ｄｄ），２．８６（１Ｈ，ｄｄ），２．９３（３Ｈ，ｓ），３．２１（２Ｈ，ｍ），３．８０−４．１０（５Ｈ，ｍ），４．２０（１Ｈ，ｄ），４．４０（１Ｈ，ｄ），４．５２（１Ｈ，ｄｄ），４．７９（１Ｈ，ｍ），６．２５（１Ｈ，ｄ），６．４５（１Ｈ，ｄｄ），６．７０（２Ｈ，ｄ），６．７５（２Ｈ，ｄ），７．０２（２Ｈ，ｄ），７．０８（２Ｈ，ｄ）
１０）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳを使用して測定した^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（４００ ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００１８】
１４．４（１Ｃ，ｑ），１６．５ （１Ｃ，ｑ），１８．６ （１Ｃ，ｑ），１９．９ （１Ｃ，ｑ），２０．０ （１Ｃ，ｑ），２３．７ （１Ｃ，ｔ），２６．７ （１Ｃ，ｔ），３０．０ （１Ｃ，ｄ），３０．４ （１Ｃ，ｔ），３０．７ （１Ｃ，ｔ），３１．３ （１Ｃ，ｄ），３３．０ （１Ｃ，ｔ），３４．６ （１Ｃ，ｔ），３７．６ （１Ｃ，ｔ），３８．３ （１Ｃ，ｔ），４０．２ （１Ｃ，ｑ），４２．０ （１Ｃ，ｔ），４４．６ （１Ｃ，ｔ），５０．４ （１Ｃ，ｄ），５６．４ （１Ｃ，ｄ），５９．４ （１Ｃ，ｄ），６０．４ （１Ｃ，ｄ），６４．３ （１Ｃ，ｔ），６８．２ （１Ｃ，ｄ），６９．８ （１Ｃ，ｄ），７０．０ （１Ｃ，ｄ），１１６．２（２Ｃ，ｄ），１１６．６（２Ｃ，ｄ），１２６．１（１Ｃ，ｄ），１２９．９（１Ｃ，ｓ），１３０．５（１Ｃ，ｓ），１３１．２（４Ｃ，ｄ），１４１．１（１Ｃ，ｄ），１５５．５（１Ｃ，ｓ），１５６．０（１Ｃ，ｓ），１６９．０（１Ｃ，ｓ），１７０．８（１Ｃ，ｓ）１７１．５ （１Ｃ，ｓ），１７１．７（１Ｃ，ｓ），１７３．２（１Ｃ，ｓ），１７３．６（１Ｃ，ｓ）
１１）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム；μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ_１８−１００Ａ（カラムサイズ、Φ３．９×１５０ｍｍ，ウオーターズ社製）
溶媒； ３７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
流速； １．０ｍｌ／分
検出； ＵＶ２２０ｎｍ
保持時間； ９．６８分
［Ｂ１３７１Ｂ］
１）構造式
【００１９】
【化６】

【００２０】
２）性質；中性脂溶性の白色、吸湿性粉末。アルカリ性溶液では室温で不安定。
【００２１】
３）溶解性；メタノールに易溶、水、クロロホルム、ヘキサンに難溶。
【００２２】
４）呈色試験；ニンヒドリン反応、坂口反応、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ 反応に陰性。
【００２３】
５）分子式；Ｃ_５６Ｈ_８３Ｎ_７Ｏ_１４
６）分子量；ＬＳＩ−ＭＡＳＳ法により決定（Ｍ＋Ｈ）^＋
１０７８．６０８３ （測定値）
１０７８．６０７６ （計算値）
７）比施光度（測定値）；〔α〕_Ｄ ^２５ −３８．０°（Ｃ０．３７，メタノール）
８）紫外線吸収スペクトル；λｍａｘ ｎｍ（ ε）
メタノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは以下に示す通りである。
【００２４】
２７８．２（２．９３×１０^３）
２２３．５（２．１６×１０^４）
９）赤外線吸収スペクトル；νｍａｘ ｃｍ^−１
臭化カリウム（ＫＢｒ） ディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、以下の極大吸収を示す通りである。
【００２５】
１５１６．６９４，１５３４．７０１，１６４２．７７５，１７４６．６４２，２９２９．２４０，２９６２．４９８，３３１０−３３３０，３３６０−３４００
１０）^１ Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳを使用して測定した^１ Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００ ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００２６】
０．８９（３Ｈ，ｔ），０．９５（６Ｈ，ｄ），０．９８（６Ｈ，ｄ），０．９９（３Ｈ，ｄ），１．０４（３Ｈ，ｄ），１．２０−１．４２（８Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｍ），２．０３（２Ｈ，ｍ），２．１０−２．２５（２Ｈ，ｍ），２．３２−２．５５（４Ｈ，ｍ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ），２．８２（１Ｈ，ｄｄ），２．９２（３Ｈ，ｓ），２．９７（２Ｈ，ｄ），３．１６（１Ｈ，ｄｄ），３．２２（１Ｈ，ｄｄ），３．５６（１Ｈ，ｄｄ），３．６６（１Ｈ，ｄｄ），３．９０（１Ｈ，ｍ），３．９５（１Ｈ，ｄｄ），４．０１（１Ｈ，ｄｄ），４．０５−４．１８（３Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｄ），４．２３（１Ｈ，ｍ），４．４２（１Ｈ，ｄ），４．４８（１Ｈ，ｄｄ），４．７５（１Ｈ，ｍ），５．４２（１Ｈ，ｍ），５．５４（１Ｈ，ｍ），６．２５（１Ｈ，ｄ），６．４５（１Ｈ，ｄｄ），６．６６（２Ｈ，ｄ），６．７０（２Ｈ，ｄ），７．００（２Ｈ，ｄ），７．０４（２Ｈ，ｄ）
１１）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳを使用して測定した^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（４００ ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００２７】
１４．４（１Ｃ，ｑ），１４．８（１Ｃ，ｑ），１６．６（１Ｃ，ｑ），１８．４（１Ｃ，ｑ），１８．６（１Ｃ，ｑ），１９．９（１Ｃ，ｑ），２０．０（１Ｃ，ｑ），２３．７（１Ｃ，ｔ），２８．４（１Ｃ，ｔ），３０．１（１Ｃ，ｔ），３０．１（１Ｃ，ｄ），３０．５（１Ｃ，ｔ），３１．２（１Ｃ，ｄ），３１．３（１Ｃ，ｄ），３２．９（１Ｃ，ｔ），３４．６（１Ｃ，ｔ），３５．６（１Ｃ，ｔ），３７．８（１Ｃ，ｔ），４０．２（１Ｃ，ｑ），４１．７（１Ｃ，ｔ），４１．８（１Ｃ，ｔ），５０．４（１Ｃ，ｄ），５６．０（１Ｃ，ｄ），５６．３（１Ｃ，ｄ），５９．３（１Ｃ，ｄ），６０．５（１Ｃ，ｄ），６１．３（１Ｃ，ｄ），６２．４（１Ｃ，ｔ），６４．２（１Ｃ，ｔ），６８．０（１Ｃ，ｄ），６８．５（１Ｃ，ｄ），７０．０（１Ｃ，ｄ），１１６．２（２Ｃ，ｄ），１１６．３（２Ｃ，ｄ），１２３．１（１Ｃ，ｄ），１２６．１（１Ｃ，ｄ），１２９．８（１Ｃ，ｓ），１３０．５（１Ｃ，ｓ），１３１．３（４Ｃ，ｄ），１３４．７（１Ｃ，ｄ），１４１．１（１Ｃ，ｄ），１５６．９（１Ｃ，ｓ），１５７．６（１Ｃ，ｓ），１７０．９（１Ｃ，ｓ），１７３．１（１Ｃ，ｓ）１７３．２（１Ｃ，ｓ），１７３．３（１Ｃ，ｓ），１７４．１（２Ｃ，ｓ），１７４．５（１Ｃ，ｓ），１７４．６（１Ｃ，ｓ）
１２）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム；μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ_１８−１００Ａ（カラムサイズ、Φ３
．９×１５０ｍｍ，ウオーターズ社製）
溶媒； ３７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
流速； １．０ｍｌ／分
検出； ＵＶ２２０ｎｍ
保持時間； １４．２８分
本発明のペプチド系化合物Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを生産する上記ＳＡＮＫ７０９９２株は宮城県の牡鹿半島の海岸で採取したアオノリから分離した海洋細菌である。Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ Ｂの生産菌であるＳＡＮＫ７０９９２株の菌学的性状は次の通りである。
【００２８】
１．形態学的性状
マリンアガー（ディフコ社製）上で２３℃、２４時間培養後の観察では、細胞は直径０．３〜０．４μｍ、長さ１．５〜２．０μｍ、螺旋形である。単極毛を有し、運動する。大型球状細胞（ｃｏｃｃｏｉｄ ｂｏｄｙ） を形成しない。胞子を形成せず、グラム染色は陰性である。
【００２９】
２．マリンアガー上での生育状態
２３℃で、４８時間培養したコロニーはいくぶんピンク白をおびた灰白色、不透明で円形、全縁である。水溶性の色素を生成しない。
【００３０】
３．生理学的性状
１）海水の要求性（プロテオースペプトンＮｏ．３（ディフコ社製）０．１％、酵母エキス（ディフコ社製）０．１％、ファイトンペプトン（ＢＢＬ社製）０．１％の組成の培地を用いた場合）：生育に海水を要求する。
【００３１】
２）Ｏ−Ｆ（オキシダティブ−ファーメンタティブ）テスト〔ヒュー・レイフソン（Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆｓｏｎ） 法、酵母エキス（ディフコ社製）０．０５％添加、７５％人工海水で調整］：グルコースを酸化的に分解する。
【００３２】
３）カタラーゼ：＋
４）酸素に対する挙動：好気的
５）硝酸塩の還元：−
６）デンプンの加水分解：−
７）寒天の分解：−
８）ゼラチンの液化：−
９）生育温度：８℃では微弱に生育し、１２℃〜４０℃では良好な生育を示す。５０℃では生育しない。
【００３３】
１０）栄養要求性（ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） ，１０７巻，２６８−２９４頁（１９７１年）記載の基礎培地を用いた場合）：酵母エキスを要求する。
【００３４】
１１）炭素化合物の利用性（ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） ，１０７巻，２６８−２９４頁（１９７１年）記載の基礎培地に酵母エキスを０．０２％加え、７日間静置培養を行った場合）：Ｌ−アラビノース −，蔗糖 −，Ｄ−キシロース −，コハク酸ソーダ ＋，Ｄ−グルコース ＋，酢酸ソーダ ＋，麦芽糖 −，グリセロール ＋
４．化学分類学的性状
１）ＤＮＡのＧ＋Ｃ（グアニン＋シトシン）含量：４９．８モル％（ＨＰＬＣ法）
２）キノン系：ユビキノンＱ−１０
以上の菌学的性状を有するＳＡＮＫ７０９９２株はバージーズ マニュアル オブ システマティック バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） ，１巻（１９８４年）の分類にしたがえば、海洋環境から分離され、生育に海水を要求、細胞が螺旋状、ＤＮＡのＧ＋Ｃの含量が４９．８％であることからオーシャノスピリレム（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属にもっとも近いと考えられる。しかし、ＳＡＮＫ７０９９２の鞭毛は単極毛で細胞の一方の極のみ着生されるのに対し、オーシャノスピリレム属細菌の鞭毛は多極毛、稀に単極毛であるが細胞の両極に着生される。また、ＳＡＮＫ７０９９２株は糖から好気的に酸を生成するのに対し、オーシャノスピリレム属細菌は酸を生成しない。さらに、ＳＡＮＫ７０９９２株にはオーシャノスピリレム属細菌に観察される大型球状細胞はみられない。それ故、本発明者らは本菌をオーシャノスピリレム属に近い新属、新種の海洋細菌ＳＡＮＫ７０９９２株（寄託機関、工業技術院生命工学工業技術研究所：寄託番号、微工研条寄第４１５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１５８）号：寄託日、平成５年（１９９３年）１月５日）とした。
【００３５】
以上、ＳＡＮＫ７０９９２株について説明したが、海洋細菌の諸性質は一定したものではなく、自然的、人工的に容易に変化することは周知の通りであり、本発明で使用しうる菌株は海洋細菌に属するＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを生産する全ての菌株を包含するものである。
【００３６】
本発明の化合物Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの効率的な工業的製造法は該化合物の生産能を有するＳＡＮＫ７０９９２株を好適な培地で培養し、その培養物から分離する方法である。
【００３７】
本発明物質を製造するのに使用される培地は、液体培地による振盪培養または通気攪拌培養が最も適しているが、これに限定されない。培地はＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂ生産菌が生育して培地中に該化合物を蓄積するものが望ましい。例えば、炭素源としてはグルコース、グリセリン、糖蜜、有機酸類などが使用できる。また窒素源としては、例えばバクトトリプトン、イーストエキストラクト、ペプトン、アミノ酸類、アンモニウム塩、硝酸塩その他の各種有機あるいは無機窒素化合物が用いられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムや、各種燐酸塩等を添加してもよい。また、菌の成育及びＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの生産を促進するようなビタミン類、補酵素類等を添加してもよい。
【００３８】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂ生産菌の培養における培養温度、培養期間、攪拌速度、通気量、培養液のｐＨなどの条件は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの蓄積量が最大となるように適当に選択、調節される。例えば、通常の通気攪拌培養の場合、培養温度２３℃〜３０℃、１〜３日間の培養が好ましく、また培養液のｐＨはｐＨ５．０〜８．５に調節するのが好ましい。
【００３９】
培養の経過に伴って培養液中に蓄積されるＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの量の経時変化は、後述の阻害活性或いは逆相ＨＰＬＣにより測定することができる。通常は、４８時間から７２時間の培養でその生産量は最大に達する。培養終了後、主としてその液体部分に蓄積するＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂは、菌体その他の固形部分を濾過操作または遠心分離によって除去し、その濾液または上清液から分離するのが好ましいが、必要に応じて菌体を除去することなく培養液から該化合物を分離することも可能である。培養液からのＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの分離、精製には、その物理化学的特性に基づく種々の方法を用いることができる。例えば、濾液または上清中に存在するＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂは、中性ｐＨ条件下で水と混和しない有機溶媒、例えば酢酸エチル、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレンなどの単独またはそれらの組み合わせにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤として、例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱（株）製）等が使用される。Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを含む含む画分を、上記の吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、または、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを吸着させた後、メタノール水、アセトン水などを用いて溶出させることにより該化合物を得ることができる。更にシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー（株）製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ２５（ファルマシア社製）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィー、および順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーなどでＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを精製することができる。
【００４０】
本発明は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを有効成分とする、抗脳梗塞剤、抗心筋梗塞剤、抗血栓症剤、抗白内障剤、抗筋ジストロフィー剤、抗炎症剤、抗骨粗鬆症剤または癌転移防止剤に関するものである。
【００４１】
本発明のＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを抗脳梗塞剤、抗心筋梗塞剤、抗血栓症剤、抗白内障剤、抗筋ジストロフィー剤、抗炎症剤、抗骨粗鬆症剤または癌転移防止剤として用いる場合、種々の形態で投与される。その投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与また注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、座薬等による非経口投与を挙げることができる。
【００４２】
これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、縣濁剤、コーティング剤等既知の医薬製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが通常は成人に対して１日５０ｍｇ乃至１０００ｍｇを投与することができる。
【００４３】
【実施例】
次に実施例、及び製剤例をあげて本発明を更に具体的に説明する。
【００４４】
（実施例１）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの精製
（Ａ）培養
ＳＡＮＫ７０９９２株を滅菌した後述の組成の培地１リットルを含む５リットルの三角フラスコ（種フラスコ）に接種した。次いでこれを２６℃で３日間、２００ｒｐｍのロータリー振盪機で前培養した。更に同培地１００ リットルを含む２００ リットルタンクに、この種培養液を１ リットル入れ、２６℃で４７時間、通気量１．０ｖｖｍで攪拌速度を１１０ｒｐｍにして攪拌培養した。
【００４５】
【表１】
培地組成
バクトトリプトン（ディフコ社製） １６ｇ
イーストエキストラクト（ディフコ社製） １０ｇ
……………………………………………………………………………………………
人工海水 Ｊａｍａｒｉｎ Ｓ （ジャーマリン・ラボラトリー製） １０００ｍｌ
ｐＨ６．８
（Ｂ）単離
Ｉｓｈｉｇｕｒｏ， Ｈ．らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２６，２８６３−２８７０（１９８７））に準じ、ウシ腎臓より調製したＩＩ型カルパインに対する阻害活性を測定することにより、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを単離精製した。
【００４６】
ＩＩ型カルパインの活性はＹｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｎ らの方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５８，８８８３−８８８９（１９８３））に準じた下記の方法により測定した。
【００４７】
０．２５％カゼイン、５ｍＭシステイン、５ｍＭ ＣａＣｌ_２ 、１００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液に酵素標品を添加し、反応を開始した。最終液量は５００μｌとした。３０℃、３０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ_２８０ を測定した。５ｍＭ ＣａＣｌ_２ の代わりにＥＤＴＡを５ｍＭとして反応させたものをブランクとして差し引き、ＩＩ型カルパイン活性とした。この方法で測定し、Ａ_２８０ を１増加させるＩＩ型カルパイン活性を１酵素単位と定義した。
【００４８】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、０．１酵素単位を含む上記反応液に、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加して同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。
【００４９】
５０％阻害に必要なＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの濃度を算出し、ＩＣ_５０（μｇ／ｍｌ）値とした。
【００５０】
２００ リットルタンク２基分の培養液２００ リットルを連続遠心分離し、得られた上清１９０ リットルを塩酸でｐＨ７．０に調整した後、２００ リットルの酢酸エチルエステルを添加し、抽出操作を行った。酢酸エチルエステル層を無水硫酸ナトリウムによる脱水後、濃縮し、１０７ｇの黒色シロップ状物質を得た。この黒色シロップ状物質をジクロロメタンに溶解し、ジクロロメタンで平衡化したシリカゲルを充填した４００ｍｌのカラムに供与し、ジクロロメタンで洗浄後、ジクロロメタン／メタノール（７５／２５：ｖ／ｖ ）の混合液で溶出した。カルパイン阻害活性画分を集め濃縮し、４３ｇの黒色シロップ状物質を得た。この黒色シロップ状物質をメタノールに溶解した後、３０％メタノール溶液になるように調製し、同じ組成の溶媒で平衡化したＣｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ_１８−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）製）カラムに供与し、同じ溶媒で洗浄後、６０％メタノールで溶出した。カルパイン阻害活性画分を集め濃縮し、２３．６ｇの褐色シロップ状物質を得た。この褐色シロップ状の物質をアセトニトリルに溶解した。この画分を３０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸溶液になるように調製し、同じ組成の溶媒で平衡化したＣｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ_１８−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）製）カラムにこの画分を供与し、同じ溶媒で洗浄後、５０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸で溶出した。阻害活性画分を集め濃縮し、褐色シロップ状物質１７．６ｇを得た。このものを分取用逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。すなわち、一回の操作において約２ｇの上述の褐色シロップ状物質をメタノールに溶解した後、分取用逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ，直径２１．５ｍｍ×長さ３００ｍｍ，東ソー（株）製）に供与し、室温、流速９．９ｍｌ／分，３０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄後、３７％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸で溶出し、保持時間が５４分（Ｂ１３７１Ａが溶出）、及び９６分（Ｂ１３７１Ｂが溶出）前後の画分をそれぞれ集めた。残りの褐色シロップ状物質についても同様な操作を行い、採取した溶出液をそれぞれプールした。それぞれの溶出液を減圧下において濃縮、凍結乾燥し、Ｂ１３７１Ａは９．１ｍｇ、Ｂ１３７１Ｂは２７．３ｍｇの白色粉末を得た。
【００５１】
（製剤例１）経口用カプセル剤
【００５２】
【表２】

上記処方の粉末を混合し、３０メッシュのふるいを通したのち、この粉末３５０ｍｇをゼラチンカプセルにいれ、カプセル剤とした。
【００５３】
【発明の効果】
次に試験例を挙げて本発明の効果を説明する。
【００５４】
（試験例１）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＩＩ型カルパインに対する阻害活性
実施例１で得られたＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂについて、ＩＩ型カルパインに対する阻害活性を実施例１に記載した方法で測定した。
【００５５】
０．２５％カゼイン、５ｍＭシステイン、５ｍＭ ＣａＣｌ_２ 、１００ｍＭ
イミダゾール塩酸（Ｉｍｉｄａｚｏｌ−ＨＣｌ：ｐＨ７．５）を含む溶液に０．１酵素単位ＩＩ型カルパインを添加し、反応を開始した。最終液量は５００μｌとした。３０℃、３０分反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ_２８０ を測定した。５ｍＭ ＣａＣｌ_２ の代わりにＥＤＴＡを５ｍＭとして反応させたものをブランクとして差し引き、ＩＩ型カルパイン活性とした。
【００５６】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加し、最終液量を５００μｌとして同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。ロイペプチン、及びＥ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ_５０値で表す）を以下に示す。
【００５７】
【表３】
ＩＩ型カルパイン阻害活性（ＩＣ_５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ ０．０３８
Ｂ１３７１Ｂ ０．０８０
ロイペプチン ０．１１９
Ｅ−６４ ０．３００
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢはＩＩ型カルパインに対して、ロイペプチン及びＥ−６４より強い阻害活性を示した。
【００５８】
（試験例２）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＩ型カルパインに対する阻害活性
Ｉ型カルパインはウシ腎臓より、Ｉｎｏｍａｔａ， Ｍ． らの方法（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ９３，２９１−２９４（１９８３））に準じて調製した。
【００５９】
Ｉ型カルパインの活性はＹｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｎ らの方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２５８，８８８３−８８８９（１９８３））に準じた下記の方法により測定した。
【００６０】
０．２５％カゼイン、５ｍＭシステイン、５ｍＭ ＣａＣｌ_２ 、１００ｍＭ
イミダゾール塩酸（Ｉｍｉｄａｚｏｌ−ＨＣｌ：ｐＨ７．５）を含む溶液に０．１酵素単位Ｉ型カルパインを添加し、反応を開始した。最終液量は５００μｌとした。３０℃、３０分反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ_２８０ を測定した。５ｍＭ ＣａＣｌ_２ の代わりにＥＤＴＡを５ｍＭとして反応させたものをブランクとして差し引き、Ｉ型カルパイン活性とした。
【００６１】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加し、最終液量を５００μｌとして同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。Ｅ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ_５０値で表す）を以下に示す。
【００６２】
【表４】
Ｉ型カルパイン阻害活性（ＩＣ_５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ ０．０４０
Ｂ１３７１Ｂ ０．０９１
Ｅ−６４ ０．２９５
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢはＩ型カルパインに対して、Ｅ−６４より強い阻害活性を示した。
【００６３】
（試験例３）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂのカテプシンに対する阻害活性
カテプシンＢの活性はＢａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８０，５３５−５６１（１９８１））に準じて測定した。
【００６４】
１ｍＭ ＥＤＴＡ、７５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．０４５％Ｂｒｉｊ３５、２ｍＭ ＤＴＴ，１μｇ／ｍｌカテプシンＢを含む溶液に、１０μＭ Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｃｂｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を添加し、最終液量を１０００μｌとして反応を開始した。３０℃、３０分間反応させた後、５０％トリクロロ酢酸１００μｌを加えて反応を停止させた。遊離したアミノメチルクマリンを蛍光光度計にて測定した（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ： ３７０ｎｍ、Ｅｍｍｉｓｓｉｏｎ：４６０ｎｍ）。
【００６５】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、上記反応液よりＣｂｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ を除いたものに、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌ を添加し３０℃、５分間インキュベートした後、Ｃｂｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ を添加し、同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。ロイペプチン、Ｅ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ_５０値で表す）を以下に示す。
【００６６】
【表５】
カテプシンＢ阻害活性（ＩＣ_５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ ０．００３４
Ｂ１３７１Ｂ ０．０１２１
ロイペプチン ０．００７０
Ｅ−６４ ０．０１８９
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢはカテプシンＢに対して、Ｅ−６４より強い阻害活性を示した。
【００６７】
（試験例４）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂのパパインに対する阻害活性
パパインの活性はＯｇｕｒａ，Ｋ．らの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．４９，７９９−８０５（１９８５））に準じて測定した。
【００６８】
０．２５％カゼイン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭシステインを含む溶液に、０．１酵素単位パパインを添加し、最終液量は５００μｌとして反応を開始した。３７℃、１０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ_２８０ を測定した。なお、この方法で測定し、Ａ_２８０ を１増加させるパパイン活性を１酵素単位と定義した。
【００６９】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、該化合物を含まないＤＭＳＯ溶液のみを加えたときの比較によって求めた。対照としてロイペプチン、Ｅ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ_５０値で表す）を以下に示す。
【００７０】
【表６】
パパイン阻害活性（ＩＣ_５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ ０．２７
Ｂ１３７１Ｂ ０．４０
ロイペプチン ０．２２
Ｅ−６４ ０．０９
（試験例５）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂのトリプシンに対する阻害活性
トリプシンの活性はＯｇｕｒａ，Ｋ．らの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．４９，７９９−８０５（１９８５））に準じて測定した。
【００７１】
０．２５％カゼイン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む溶液に、０．１酵素単位トリプシンを添加し、最終液量は５００μｌとして反応を開始した。３７℃、１０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ_２８０ を測定した。なお、この方法で測定し、Ａ_２８０ を１増加させるトリプシン活性を１酵素単位と定義した。
【００７２】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加し、最終液量を５００μｌとして同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。ロイペプチン、及びＥ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ_５０値で表す）を以下に示す。
【００７３】
【表７】
トリプシン阻害活性（ＩＣ_５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ ＞２５０
Ｂ１３７１Ｂ ＞３５０
ロイペプチン ０．８６
Ｅ−６４ ＞３６０
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂはロイペプチンと異なり、トリプシンに対して阻害活性を示さなかった。[0001]
[Industrial applications]
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel peptide compound B1371A or B1371B exhibiting cysteine protease enzyme inhibitory activity, a method for producing the same, a producing bacterium and a use thereof.
[0002]
[Prior art]
Calpain, a type of cysteine protease, is normally present in cells, and under neutral conditions,²⁺Is an enzyme activated by²⁺There are two molecular species with different requirements: type I (μ calpain) and type II (m calpain). Normally, both type I and type II exist as inactive precursors composed of subunits having a molecular weight of about 80K and a common 30K,²⁺As the concentration increases, the precursor becomes Ca²⁺And convert to the active form. However, for some reason, such as ischemia, Ca²⁺Excessive influx into cells activates calpain randomly. As a result, the processing of proteins in the cytoplasm is unnecessarily enhanced, and enzymes and proteins essential for maintaining cell functions and structures are irreversibly cleaved and degraded. Such diseases based on the unregulated activation of calpain include muscular dystrophy, cerebral infarction, myocardial infarction, cataract, thrombus, inflammation and the like (Kawashima, S. et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, 37, 2144-2160, ( 1992)).
[0003]
On the other hand, cathepsin B, a kind of cysteine protease, is contained abundantly in lysosomes of phagocytes such as neutrophils and macrophages, and plays a role of decomposing and digesting foreign substances inside and outside cells. However, if the activity of cathepsin B is increased more than necessary, not only foreign substances but also self tissues are decomposed and digested. Diseases based on such increased cathepsin B activity include inflammation, muscular dystrophy, osteoporosis, cancer metastasis and the like (Katsunuma, N. et al., Experimental Medicine, 5, 926-930, (1987)). Therefore, it is possible to prevent or treat the progress of the disease state using a substance that inhibits the enzyme activity of cysteine protease such as calpain and cathepsin B for these diseases.
[0004]
Representative examples of conventionally known low molecular weight inhibitors for cysteine protease include leupeptin (Aoyagi, T. et al., J. Antibiot., Vol. 22, 558-568, (1969)), E-64. (Hanada, K. et al., Agric. Biol. Chem., Vol. 42 (3), 523-528 (1978)), and carpeptin (Tsujinaka, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 1208 (1988)), streptin (Ogura, K. et al., Agric. Biol. Chem., Vol. 49, 799-805, (1985)), stuccopine (Saito, M. et al., Agric. Biol. Chem, v. ol. 51 (3), 861-868, (1987)), etc., all of which have an aldehyde group below C.
[0005]
As analogs of E-64, E-64d (Tamai, M. et al., J. Pharmacobio-Dyn., Vol. 9, 672-677, (1986)), NCO-700 (Takano, H. et al., Biochem). Med .. Metab. Biol., Vol.45 (1), 41-47, (1991)), all of which have epoxysuccinic acid as an active center. These compounds do not inhibit serine proteases, but do not always have a strong inhibitory activity on cysteine proteases.
[0006]
From such a viewpoint, a bioactive substance having a novel structure and not showing a strong cysteine protease-specific inhibitory activity, instead of a leupine derivative or an E-64 analog, is desired for cysteine protease.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive searches to find a physiologically active substance having a novel structure and exhibiting an enzyme inhibitory activity of calpain, a kind of cysteine protease, from microbial metabolites. As a result, it has been found that novel physiologically active substances B1371A and B1371B exhibiting enzyme inhibitory activity against cysteine protease are produced from a culture solution of a marine bacterium SANK70992 strain isolated from Aonori collected on the coast of Oshika Peninsula, Miyagi Prefecture, Japan. The present invention has been completed.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1) Novel compound B1371A,
(2) Novel compound B1371B,
(3) a method for producing B1371A or B1371B, which comprises culturing the marine bacterium SANK70992 and collecting a novel compound B1371A or B1371B from the culture;
(4) A marine bacterium, SANK70992.
[0009]
B1371A or B1371B of the present invention has the following structural formula and properties.
[0010]
[B1371A]
(1) Structural formula
[0011]
Embedded image

[0012]
(2) Physical properties
1) Properties: neutral fat-soluble white, hygroscopic powder. Unstable at room temperature with alkaline solution.
[0013]
2) Solubility; easily soluble in methanol, poorly soluble in water, chloroform and hexane.
[0014]
3) Color test; negative for Sakaguchi reaction, ninhydrin reaction, and Fluorescamine reaction.
[0015]
4) Molecular formula; C₄₆H₆₇N₅O₁₁
5) Molecular weight; determined by LSI-MASS method (M + H)⁺
866.4918 (measured)
866.4915 (calculated value)
6) Specific light intensity (measured value); [α]_D ²⁵  -26.4 ° (C 0.27, methanol)
7) UV absorption spectrum; λmax nm (ε)
The ultraviolet absorption spectrum measured in methanol is as shown below.
227.4 (3.45 × 10³)
223.6 (1.91 × 10⁴)
8) Infrared absorption spectrum; νmax (KBr) cm^-1
An infrared absorption spectrum measured on a KBr disk shows the following maximum absorptions.
[0016]
1516.939, 1536.626, 1668.284, 1747.731, 2931.559, 2962.582, 3315.963
9)¹  H-nuclear magnetic resonance spectrum; (δ: PPM)
Measured in heavy methanol using TMS (tetramethylsilane) as internal standard¹  The H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) is as shown below.
[0017]
0.90 (3H, t), 0.95 (6H, d), 1.02 (3H, d), 1.07 (3H, d), 1.2-1.50 (12H, m), 1 .98 (1H, m), 2.14 (1H, m), 2.25-2.50 (4H, m), 2.73 (1H, dd), 2.86 (1H, dd), 2. 93 (3H, s), 3.21 (2H, m), 3.80-4.10 (5H, m), 4.20 (1H, d), 4.40 (1H, d), 4.52 (1H, dd), 4.79 (1H, m), 6.25 (1H, d), 6.45 (1H, dd), 6.70 (2H, d), 6.75 (2H, d) , 7.02 (2H, d), 7.08 (2H, d)
10)^ThirteenC-nuclear magnetic resonance spectrum; (δ: PPM)
Measured in heavy methanol using TMS as internal standard^ThirteenThe C-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) is as shown below.
[0018]
14.4 (1C, q), 16.5 (1C, q), 18.6 (1C, q), 19.9 (1C, q), 20.0 (1C, q), 23.7 (1C , T), 26.7 (1C, t), 30.0 (1C, d), 30.4 (1C, t), 30.7 (1C, t), 31.3 (1C, d), 33 0.0 (1C, t), 34.6 (1C, t), 37.6 (1C, t), 38.3 (1C, t), 40.2 (1C, q), 42.0 (1C, t) t), 44.6 (1C, t), 50.4 (1C, d), 56.4 (1C, d), 59.4 (1C, d), 60.4 (1C, d), 64. 3 (1C, t), 68.2 (1C, d), 69.8 (1C, d), 70.0 (1C, d), 116.2 (2C, d), 116.6 (2C, d) ), 126.1 ( C, d), 129.9 (1C, s), 130.5 (1C, s), 131.2 (4C, d), 141.1 (1C, d), 155.5 (1C, s), 156.0 (1C, s), 169.0 (1C, s), 170.8 (1C, s) 171.5 (1C, s), 171.7 (1C, s), 173.2 (1C, s) s), 173.6 (1C, s)
11) High performance liquid chromatography
Separation column; μBondasphere 5 μC₁₈-100A (column size, Φ3.9 × 150mm, manufactured by Waters)
Solvent: 37% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection; UV 220nm
Retention time: 9.68 minutes
[B1371B]
1) Structural formula
[0019]
Embedded image

[0020]
2) Properties: neutral fat-soluble white, hygroscopic powder. Unstable at room temperature with alkaline solution.
[0021]
3) Solubility; easily soluble in methanol, poorly soluble in water, chloroform and hexane.
[0022]
4) Color test; negative for ninhydrin reaction, Sakaguchi reaction, and Fluorescamine reaction.
[0023]
5) molecular formula; C₅₆H₈₃N₇O₁₄
6) Molecular weight; determined by LSI-MASS method (M + H)⁺
1078.6083 (measured value)
1078.6076 (calculated value)
7) Specific light intensity (measured value); [α]_D ²⁵  -38.0 ° (C0.37, methanol)
8) UV absorption spectrum; λmax nm (ε)
The ultraviolet absorption spectrum measured in methanol is as shown below.
[0024]
278.2 (2.93 × 10³)
223.5 (2.16 × 10⁴)
9) infrared absorption spectrum; νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured on a potassium bromide (KBr) disk shows the following maximum absorption.
[0025]
1516.694, 1534.701, 1642.775, 1746.642, 2929.240, 296.498, 3310-3330, 3360-3400
10)¹  H-nuclear magnetic resonance spectrum; (δ: PPM)
Measured in heavy methanol using TMS as internal standard¹  The H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) is as shown below.
[0026]
0.89 (3H, t), 0.95 (6H, d), 0.98 (6H, d), 0.99 (3H, d), 1.04 (3H, d), 1.20-1 .42 (8H, m), 1.95 (1H, m), 2.03 (2H, m), 2.10-2.25 (2H, m), 2.32-2.55 (4H, m ), 2.71 (1H, dd), 2.82 (1H, dd), 2.92 (3H, s), 2.97 (2H, d), 3.16 (1H, dd), 3.22. (1H, dd), 3.56 (1H, dd), 3.66 (1H, dd), 3.90 (1H, m), 3.95 (1H, dd), 4.01 (1H, dd) , 4.05-4.18 (3H, m), 4.21 (1H, d), 4.23 (1H, m), 4.42 (1H, d), 4.48 (1H, dd), 4.75 (1H, m), 5.42 (1H m), 5.54 (1H, m), 6.25 (1H, d), 6.45 (1H, dd), 6.66 (2H, d), 6.70 (2H, d), 7. 00 (2H, d), 7.04 (2H, d)
11)^ThirteenC-nuclear magnetic resonance spectrum; (δ: PPM)
Measured in heavy methanol using TMS as internal standard^ThirteenThe C-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) is as shown below.
[0027]
14.4 (1C, q), 14.8 (1C, q), 16.6 (1C, q), 18.4 (1C, q), 18.6 (1C, q), 19.9 (1C , Q), 20.0 (1C, q), 23.7 (1C, t), 28.4 (1C, t), 30.1 (1C, t), 30.1 (1C, d), 30 .5 (1C, t), 31.2 (1C, d), 31.3 (1C, d), 32.9 (1C, t), 34.6 (1C, t), 35.6 (1C, t). t), 37.8 (1C, t), 40.2 (1C, q), 41.7 (1C, t), 41.8 (1C, t), 50.4 (1C, d), 56. 0 (1C, d), 56.3 (1C, d), 59.3 (1C, d), 60.5 (1C, d), 61.3 (1C, d), 62.4 (1C, t) ), 64.2 (1C, t), 68.0 (1C, d), 68. (1C, d), 70.0 (1C, d), 116.2 (2C, d), 116.3 (2C, d), 123.1 (1C, d), 126.1 (1C, d) , 129.8 (1C, s), 130.5 (1C, s), 131.3 (4C, d), 134.7 (1C, d), 141.1 (1C, d), 156.9 ( 1C, s), 157.6 (1C, s), 170.9 (1C, s), 173.1 (1C, s), 173.2 (1C, s), 173.3 (1C, s), 174 .1 (2C, s), 174.5 (1C, s), 174.6 (1C, s)
12) High performance liquid chromatography
Separation column; μBondasphere 5 μC₁₈-100A (column size, Φ3
. 9 × 150mm, Waters)
Solvent: 37% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection; UV 220nm
Retention time: 14.28 minutes
The above-mentioned SANK70992 strain producing the peptide-based compound B1371A or B1371B of the present invention is a marine bacterium isolated from Aonori collected on the coast of Oshika Peninsula in Miyagi Prefecture. The mycological properties of the SANK70992 strain, which is a B1371A or B1371B producing bacterium, are as follows.
[0028]
1. Morphological properties
When observed on a marine agar (manufactured by Difco) after culturing at 23 ° C. for 24 hours, the cells are 0.3 to 0.4 μm in diameter, 1.5 to 2.0 μm in length, and spiral. Has unipolar hair and exercises. Does not form large spheroid cells (coccoid bodies). No spores are formed and Gram staining is negative.
[0029]
2. Growth on marine agar
Colonies cultured at 23 ° C. for 48 hours are somewhat pinkish grayish white, opaque, round, full-edge. Does not form water-soluble dyes.
[0030]
3. Physiological properties
1) Requirement of seawater (proteose peptone No. 3 (manufactured by Difco) 0.1%, yeast extract (manufactured by Difco) 0.1%, phyton peptone (manufactured by BBL) 0.1% When using a medium): Requires seawater for growth.
[0031]
2) OF (oxidative-fermentative) test [Hugh Leifson method, yeast extract (manufactured by Difco) 0.05% added, adjusted with 75% artificial seawater]: glucose is oxidized Decompose.
[0032]
3) Catalase: +
4) Behavior to oxygen: aerobic
5) Reduction of nitrate:-
6) Starch hydrolysis:-
7) Decomposition of agar:-
8) Liquefaction of gelatin:-
9) Growth temperature: It grows slightly at 8 ° C and shows good growth at 12 ° C to 40 ° C. Does not grow at 50 ° C.
[0033]
10) auxotrophy (when using a basal medium described in Journal of Bacteriology, Vol. 107, pp. 268-294 (1971)): Require yeast extract.
[0034]
11) Utilization of carbon compounds (0.02% of yeast extract in a basal medium described in Journal of Bacteriology, Vol. 107, pp. 268-294 (1971)), followed by stationary culture for 7 days ): L-arabinose-, sucrose-, D-xylose-, sodium succinate +, D-glucose +, sodium acetate +, maltose-, glycerol +
4. Chemical taxonomic properties
1) G + C (guanine + cytosine) content of DNA: 49.8 mol% (HPLC method)
2) Quinones: Ubiquinone Q-10
The SANK70992 strain having the above mycological properties is separated from the marine environment according to the classification of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology), Volume 1 (1984), and seawater is used for growth. The requirement is that the cells are helical and the G + C content of the DNA is 49.8%, so it is considered to be closest to the genus Oceanospirilum. However, the flagellum of SANK70992 is monopolar, and only one pole of the cell is formed. On the other hand, the flagella of the genus Oceanospirilem are multipolar, and rarely monopolar, but are attached to both poles of the cell. Be born. In addition, the SANK70992 strain aerobically produces an acid from sugar, whereas the genus Oceanospirilem does not produce an acid. Further, the SANK70992 strain does not show the large spherical cells observed in bacteria belonging to the genus Oceanospirilem. Therefore, the present inventors proposed that this bacterium be a new genus close to the genus Oceanospirilem, a new species of marine bacterium, SANK70992 (deposited by the National Institute of Bioscience and Human Technology: Deposit No. 4158 (FERM BP-4158): the date of deposit, January 5, 1993.
[0035]
Although the SANK70992 strain has been described above, it is well known that various properties of marine bacteria are not constant, and are easily changed naturally and artificially. It is well known that marine bacteria can be used in the present invention. It encompasses all strains producing B1371A or B1371B belonging thereto.
[0036]
An efficient industrial production method of the compound B1371A or B1371B of the present invention is a method of culturing SANK70992 strain capable of producing the compound in a suitable medium and isolating it from the culture.
[0037]
The medium used for producing the substance of the present invention is most preferably, but not limited to, shaking culture or aeration-agitation culture using a liquid medium. The medium is preferably one in which B1371A or B1371B-producing bacteria grow and accumulate the compound in the medium. For example, glucose, glycerin, molasses, organic acids and the like can be used as the carbon source. As the nitrogen source, for example, bactotryptone, yeast extract, peptone, amino acids, ammonium salts, nitrates and other various organic or inorganic nitrogen compounds are used. As the inorganic salt, sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, various phosphates and the like may be added. Further, vitamins, coenzymes and the like which promote the growth of bacteria and the production of B1371A or B1371B may be added.
[0038]
Conditions such as culturing temperature, culturing period, stirring speed, aeration rate, and pH of the culture solution in culturing B1371A or B1371B-producing bacteria are appropriately selected and adjusted so that the accumulated amount of B1371A or B1371B is maximized. For example, in the case of ordinary aeration and stirring culture, the culture is preferably performed at a culture temperature of 23 ° C. to 30 ° C. for 1 to 3 days, and the pH of the culture solution is preferably adjusted to pH 5.0 to 8.5.
[0039]
The time-dependent change in the amount of B1371A or B1371B accumulated in the culture solution over the course of the culture can be measured by the below-described inhibitory activity or reverse-phase HPLC. Usually, the production reaches its maximum in culture for 48 to 72 hours. After completion of the culturing, B1371A or B1371B mainly accumulated in the liquid portion is preferably obtained by removing bacterial cells and other solid portions by filtration or centrifugation, and separating from the filtrate or supernatant, if necessary. It is also possible to separate the compound from the culture solution without removing the cells. For separation and purification of B1371A or B1371B from the culture solution, various methods based on its physicochemical properties can be used. For example, B1371A or B1371B present in the filtrate or supernatant is an organic solvent that is immiscible with water under neutral pH conditions, such as ethyl acetate, n-butanol, dichloromethane, chloroform, ethylene chloride, methylene chloride, etc., or alone. Can be extracted and purified. Alternatively, for example, Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Corporation) or the like is used as the adsorbent. The fraction containing B1371A or B1371B is passed through the above-mentioned layer of the adsorbent to remove impurities by adsorption, or after adsorbing B1371A or B1371B, eluted with methanol water, acetone water or the like. Thus, the compound can be obtained. Further, adsorption column chromatography using a carrier such as silica gel or florisil, distribution column chromatography using Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia), Toyopearl HW-40 (manufactured by Tosoh Corporation), and Sephadex G25 B1371A or B1371B can be purified by gel filtration chromatography using (Pharmacia) or high-performance liquid chromatography using a normal phase or reverse phase column.
[0040]
The present invention relates to an anti-cerebral infarction agent, an anti-myocardial infarction agent, an anti-thrombotic agent, an anti-cataract agent, an anti-muscular dystrophy agent, an anti-inflammatory agent, an anti-osteoporosis agent or a cancer metastasis inhibitor comprising B1371A or B1371B as an active ingredient. It is.
[0041]
When B1371A or B1371B of the present invention is used as an anti-cerebral infarction agent, an anti-myocardial infarction agent, an anti-thrombotic agent, an anti-cataract agent, an anti-muscular dystrophy agent, an anti-inflammatory agent, an anti-osteoporosis agent or a cancer metastasis inhibitor, in various forms. Is administered. Examples of the administration form include oral administration by tablets, capsules, granules, syrups and the like, and parenteral administration by injections (intravenous, intramuscular, subcutaneous), eye drops, suppositories and the like.
[0042]
These various preparations can be usually used in the field of known pharmaceutical preparations such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, coating agents, etc. in the main drug according to a conventional method. It can be formulated using known auxiliaries. The amount used depends on symptoms, age, body weight, administration method, dosage form, etc., but usually 50 mg to 1000 mg per day can be administered to an adult.
[0043]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to Examples and Preparation Examples.
[0044]
(Example 1) Purification of B1371A or B1371B
(A) Culture
The SANK70992 strain was inoculated into a 5-liter Erlenmeyer flask (seed flask) containing 1 liter of a sterilized medium having the composition described below. This was then pre-cultured at 26 ° C. for 3 days on a rotary shaker at 200 rpm. Further, 1 liter of this seed culture solution was placed in a 200 liter tank containing 100 liters of the same medium, and cultured under stirring at 26 ° C. for 47 hours with aeration of 1.0 vvm and a stirring speed of 110 rpm.
[0045]
[Table 1]
Medium composition
Bacto Tripton (Difco) 16g
Yeast Extract (Difco) 10g
…………………………………………………………………………
Artificial seawater Jamarin S (manufactured by Jarmarin Laboratory) 1000ml
pH 6.8
(B) Isolation
Ishiguro, H .; B1371A or B1371B was isolated and purified by measuring the inhibitory activity on type II calpain prepared from bovine kidney according to the method of Biochemistry, vol. 26, 2863-2870 (1987).
[0046]
The activity of type II calpain was measured by the following method according to the method of Yoshimura, N. et al. (J. Biol. Chem., Vol. 258, 8883-8889 (1983)).
[0047]
0.25% casein, 5 mM cysteine, 5 mM CaCl₂  , 100 mM Imidazol-HCl (pH 7.5) was added with an enzyme preparation to initiate a reaction. The final liquid volume was 500 μl. After reacting at 30 ° C. for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 500 μl of 10% trichloroacetic acid, left at 4 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged.₂₈₀  Was measured. 5 mM CaCl₂  What reacted with 5 mM of EDTA instead of was subtracted as a blank, and the result was defined as type II calpain activity. Measured by this method, A₂₈₀  The type II calpain activity that increases by 1 was defined as 1 enzyme unit.
[0048]
The inhibitory activity of B1371A or B1371B was determined by adding 5 μl of a DM137 solution of B1371A or B1371B to the above reaction solution containing 0.1 enzyme unit, and was determined by comparison with a control (DMSO).
[0049]
The concentration of B1371A or B1371B required for 50% inhibition was calculated and IC₅₀(Μg / ml).
[0050]
200 liters of the culture solution for two 200 liter tanks was continuously centrifuged, and 190 liters of the obtained supernatant was adjusted to pH 7.0 with hydrochloric acid, and then 200 liters of ethyl acetate was added to perform an extraction operation. . The ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and then concentrated to obtain 107 g of a black syrup. This black syrup was dissolved in dichloromethane, applied to a 400 ml column packed with silica gel equilibrated with dichloromethane, washed with dichloromethane, and eluted with a mixture of dichloromethane / methanol (75/25: v / v). . The calpain inhibitory activity fractions were collected and concentrated to obtain 43 g of a black syrup-like substance. After dissolving this black syrup-like substance in methanol, Cosmosil 140C prepared to be a 30% methanol solution and equilibrated with a solvent of the same composition.₁₈It was applied to an -OPN (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) column, washed with the same solvent, and eluted with 60% methanol. The fractions with calpain inhibitory activity were collected and concentrated to give 23.6 g of a brown syrup. This brown syrup was dissolved in acetonitrile. This fraction was prepared to be a 30% acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid solution, and Cosmosil 140C equilibrated with a solvent having the same composition.₁₈This fraction was applied to an -OPN (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) column, washed with the same solvent, and eluted with 50% acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid. Fractions with inhibitory activity were collected and concentrated to give 17.6 g of a brown syrup. This was further purified by preparative reverse phase HPLC. That is, after dissolving about 2 g of the above brown syrup-like substance in methanol in one operation, reverse phase HPLC for preparative separation (TSKgel ODS-120T, 21.5 mm in diameter × 300 mm in length, manufactured by Tosoh Corporation) After washing with 30% acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid at room temperature and at a flow rate of 9.9 ml / min, elution was performed with 37% acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid, and the retention time was 54 minutes (B1371A). Eluted) and the fractions before and after 96 minutes (B1371B eluted). The same operation was performed on the remaining brown syrup-like substances, and the collected eluates were pooled. Each eluate was concentrated and lyophilized under reduced pressure to obtain 9.1 mg of B1371A and 27.3 mg of B1371B as white powder.
[0051]
(Formulation Example 1) Oral capsule
[0052]
[Table 2]

After mixing the powder having the above formulation and passing through a 30-mesh sieve, 350 mg of this powder was placed in a gelatin capsule to prepare a capsule.
[0053]
【The invention's effect】
Next, effects of the present invention will be described with reference to test examples.
[0054]
(Test Example 1) Inhibitory activity of B1371A or B1371B on type II calpain
For B1371A or B1371B obtained in Example 1, the inhibitory activity against type II calpain was measured by the method described in Example 1.
[0055]
0.25% casein, 5 mM cysteine, 5 mM CaCl₂  , 100 mM
Imidazole-HCl:(pH 7.5) was added to the solution containing 0.1 enzyme unit type II calpain to initiate the reaction. The final liquid volume was 500 μl. After reacting at 30 ° C. for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 500 μl of 10% trichloroacetic acid, and left at 4 ° C. for 30 minutes, followed by centrifugation.₂₈₀  Was measured. 5 mM CaCl₂  What reacted with 5 mM of EDTA instead of was subtracted as a blank, and the result was defined as type II calpain activity.
[0056]
The inhibitory activity of B1371A or B1371B was determined by adding 5 μl of a DM137 solution of B1371A or B1371B, making the final volume 500 μl, and measuring similarly, and comparing with the control (DMSO). The inhibitory activities of leupeptin and E-64 were simultaneously measured. Result (IC₅₀Are shown below.
[0057]
[Table 3]
Type II calpain inhibitory activity (IC₅₀; Μg / ml)
B1371A 0.038
B1371B 0.080
Leupeptin 0.119
E-64 0.300
B1371A or B1371B showed stronger inhibitory activity against type II calpain than leupeptin and E-64.
[0058]
(Test Example 2) Inhibitory activity of B1371A or B1371B on type I calpain
Type I calpain was obtained from bovine kidney by Inomata, M .; It was prepared according to the method of J. Biochem., Vol. 93, 291-294 (1983).
[0059]
The activity of type I calpain was measured by the following method according to the method of Yoshimura, N. et al. (J. Biol. Chem., Vol. 258, 8883-8889 (1983)).
[0060]
0.25% casein, 5 mM cysteine, 5 mM CaCl₂  , 100 mM
Imidazole-HCl:(pH 7.5) was added to the solution containing 0.1 enzyme unit type I calpain to initiate the reaction. The final liquid volume was 500 μl. After reacting at 30 ° C. for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 500 μl of 10% trichloroacetic acid, and left at 4 ° C. for 30 minutes, followed by centrifugation.₂₈₀  Was measured. 5 mM CaCl₂  What was reacted with 5 mM of EDTA instead of was subtracted as a blank to determine the type I calpain activity.
[0061]
The inhibitory activity of B1371A or B1371B was determined by adding 5 μl of a DM137 solution of B1371A or B1371B, making the final volume 500 μl, and measuring similarly, and comparing with the control (DMSO). E-64 inhibitory activity was also measured. Result (IC₅₀Are shown below.
[0062]
[Table 4]
Type I calpain inhibitory activity (IC₅₀; Μg / ml)
B1371A 0.040
B1371B 0.091
E-64 0.295
B1371A or B1371B showed stronger inhibitory activity against type I calpain than E-64.
[0063]
(Test Example 3) Inhibitory activity of B1371A or B1371B on cathepsin
Cathepsin B activity is described in Barrett, A .; J. The measurement was carried out according to the method of these methods (Methods in Enzymology, vol. 80, 535-561 (1981)).
[0064]
In a solution containing 1 mM EDTA, 75 mM phosphate buffer (pH 6.0), 0.045% Brij35, 2 mM DTT, 1 μg / ml cathepsin B, 10 μM Carbobenzoxy-L-Arginyl-L-Argine-4-Methyl-Coumaryl- 7-Amide (Cbz-Arg-Arg-MCA) was added, and the reaction was started with a final volume of 1000 μl. After reacting at 30 ° C. for 30 minutes, 100 μl of 50% trichloroacetic acid was added to stop the reaction. The released aminomethyl coumarin was measured with a fluorometer (Excitation: 370 nm, Emission: 460 nm).
[0065]
The inhibitory activity of B1371A or B1371B was determined by adding 5 μl of a DMSO solution of B1371A or B1371B to the above reaction solution from which Cbz-Arg-Arg-MCA had been removed and incubating at 30 ° C. for 5 minutes, followed by Cbz-Arg-Arg- MCA was added, measured similarly, and determined by comparison with a control (DMSO). The inhibitory activities of leupeptin and E-64 were measured at the same time. Result (IC₅₀Are shown below.
[0066]
[Table 5]
Cathepsin B inhibitory activity (IC₅₀; Μg / ml)
B1371A 0.0034
B1371B 0.0121
Leupeptin 0.0070
E-64 0.0189
B1371A or B1371B showed stronger inhibitory activity against cathepsin B than E-64.
[0067]
(Test Example 4) Inhibitory activity of B1371A or B1371B on papain
Papain activity is described in Ogura, K. et al. The measurement was performed according to the method of Agric. Biol. Chem, vol. 49, 799-805 (1985).
[0068]
0.1 enzyme unit papain was added to a solution containing 0.25% casein, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM EDTA, and 5 mM cysteine, and the reaction was started at a final volume of 500 μl. After reacting at 37 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by adding 500 μl of 10% trichloroacetic acid, left at 4 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged.₂₈₀  Was measured. In addition, it measures by this method and A₂₈₀  The papain activity that increases by one was defined as one enzyme unit.
[0069]
The inhibitory activity of B1371A or B1371B was determined by comparison when only a DMSO solution not containing the compound was added. As a control, the inhibitory activities of leupeptin and E-64 were simultaneously measured. Result (IC₅₀Are shown below.
[0070]
[Table 6]
Papain inhibitory activity (IC₅₀; Μg / ml)
B1371A 0.27
B1371B 0.40
Leupeptin 0.22
E-64 0.09
(Test Example 5) B1371A or B1371B inhibitory activity against trypsin
The activity of trypsin is described in Ogura, K .; The measurement was carried out according to the method of Agric. Biol. Chem, vol. 49, 799-805 (1985).
[0071]
0.1 enzyme unit trypsin was added to a solution containing 0.25% casein and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), and the reaction was started with a final volume of 500 μl. After reacting at 37 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by adding 500 μl of 10% trichloroacetic acid, left at 4 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged.₂₈₀  Was measured. In addition, it measures by this method and A₂₈₀  Was defined as one enzyme unit.
[0072]
The inhibitory activity of B1371A or B1371B was determined by adding 5 μl of a DM137 solution of B1371A or B1371B, making the final volume 500 μl, and measuring similarly, and comparing with the control (DMSO). The inhibitory activities of leupeptin and E-64 were simultaneously measured. Result (IC₅₀Are shown below.
[0073]
[Table 7]
Trypsin inhibitory activity (IC₅₀; Μg / ml)
B1371A> 250
B1371B> 350
Leupeptin 0.86
E-64> 360
B1371A or B1371B showed no inhibitory activity against trypsin, unlike leupeptin.

Claims (4)

A novel compound B1371A represented by the formula (I).

A novel compound B1371B represented by the formula (II). :

The marine bacterium SANK70992 (FERM BP-4158) was cultured, and the following formula (I) or (II) was obtained from the culture.

A method for producing B1371A or B1371B, which comprises collecting compound B1371A or B1371B represented by the formula: A marine bacterium, SANK70992 (FERM BP-4158) , which produces the novel compound B1371A represented by the formula (I) of claim 1 or the novel compound B1371B represented by the formula (II) of claim 2 .