JP3583480B2

JP3583480B2 - Phase contrast microscope

Info

Publication number: JP3583480B2
Application number: JP23542094A
Authority: JP
Inventors: 裕石渡
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1994-09-29
Filing date: 1994-09-29
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2019-11-04
Also published as: JPH0894936A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、例えば細胞やバクテリア等の透明な標本を観察するのに用いられる位相差顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
位相差顕微鏡においては、一般に、照明光学系の瞳位置に輪帯状の開口を配置し、この輪帯開口、照明光学系および結像光学系を含めた光学系の全部または一部に関して共役な位置関係にある対物レンズの瞳位置に輪帯状の位相膜を配置して、標本面で回折した光のうちの０次光の位相および振幅に変化を与えて他の回折光と干渉させることにより、標本の位相量を像のコントラストに変えて観察し得るようにしている。
【０００３】
また、位相差顕微鏡による位相差像のコントラストについては、例えば、「”Ｓｏｍｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ” Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．Ｔａｉｒａ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，１２９（１９８３），ｐ．４９−６２」に、その改善方法が記載されている。従来の位相差顕微鏡においては、一般に、輪帯状の位相膜の径を、対物レンズの瞳径の半分程度にすることにより、像コントラストを改善するようにしている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、位相差顕微鏡では、例えば、「 ”位相差顕微鏡の像コントラストに関する考察” 大木裕史，光学，ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９（１９９１），ｐ．５９０−５９４」に記載されているように、位相リングの径と瞳径との比によってカットオフ周波数が決定されるため、通常の明視野顕微鏡と比較して、解像力が劣るという問題がある。
【０００５】
また、生体標本のように、波長と比較して厚い標本の場合には、「”光学顕微鏡の基礎と応用（４）”小松啓、応用物理、Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．１１（１９９１），ｐ．１１３６−１２５４」に記載されているように、ハロー現象が顕著に現れて、位相標本の構造の境界の細部が覆い隠されてしまうという問題があると共に、「 ”顕微鏡における逆問題について” 高橋，根本，電気通信学会技術研究報告ＭＢＥ８８−５８，Ｐ．３５−４２，１９８８」において指摘されているように、本来標本には存在しない空間周波数成分（非線形項）の影響が現れ、正確な位相差像が再現されなくなるという問題もある。
【０００６】
この発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、観察すべき標本が比較的厚い場合に、本来標本には存在しない空間周波数成分（非線形項）の影響を低減し、正確な位相差像を再現できるよう適切に構成した位相差顕微鏡を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、この発明は、照明光学系の瞳位置に輪帯状の開口を配置し、前記照明光学系と結像光学系とを含む光学系の全部もしくは一部に関して、前記輪帯状の開口と標本面を介して共役な位置関係にある前記結像光学系の瞳位置に位相板を配置して、前記標本面に配置される標本を位相差法により観察するようにした位相差顕微鏡において、
前記位相板は、前記結像光学系の光軸を略中心とする第１の半径と該第１の半径より大きな第２の半径との間の第１の領域と、前記第２の半径と該第２の半径より大きな第３の半径との間の第２の領域とを有し、前記第１の領域および前記第２の領域の一方は位相および振幅を変調する領域とし、他方は吸収領域または遮光領域としたことを特徴とするものである。
【００１３】
【作用】
図１は、この発明の原理を説明するための位相差顕微鏡の構成を示すものである。この位相差顕微鏡は、コンデンサレンズ１ａを有する照明光学系１の瞳位置に輪帯開口２を配置し、この輪帯開口２と標本面を介して共役な位置関係にある対物レンズ３ａを有する結像光学系３の瞳位置に位相板４を配置して、標本面に配置される標本５を照明光学系１により照明して、その位相差像を結像光学系３の像面６において観察するものである。
【００１４】
以下、図１に示す位相差顕微鏡の結像について、１次元のモデルを用いて説明する。
いま、結像光学系３の瞳関数をＰ（ξ）、照明光学系１の瞳関数をＱ（ξ）、標本５の位相分布をφ（ｘ）として弱位相近似（ボルン近似）、
ｅｘｐｉ φ（ｘ）＝１＋ｉφ（ｘ）
を行うと、標本５の像強度分布Ｉ（ｘ）は、
【数１】

で与えられる。ただし、Φ（ｆ）はφ（ｘ）のフーリエ変換を表し、ｆは空間周波数を示す。また、結像光学系３の瞳関数Ｐ（ξ）は、下記の（２）式で示す関数の線形結合で表すことができるものとする。
【数２】

【００１５】
ここで、照明光学系１の瞳関数Ｑ（ξ）が、Ｑ（ξ）＝Ｐｂ（ξ）で表せるものとすると、上記（１）式は、
【数３】

但し、ＤＣ＝∫ Ｐｂ（ξ）ｄξ
Ｆ（ｆ）＝∫ Ｐｂ（ξ）Ｐａ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
になる。したがって、位相差顕微鏡における像コントラストは、近似的に（４）式で表される。
【００１６】
上記（４）式をさらに近似展開すると、
【数４】

但し、ＤＣ＝∫ Ｐｂ（ξ）ｄξ
Ｆ（ｆ）＝∫ Ｐｂ（ξ）Ｐａ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
Ｇ（ｆ）＝∫ Ｐｂ（ξ）Ｐｂ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
Ｒ（ｆ，ｆ’）＝∫Ｑ（ξ）Ｐ（ξ＋ｆ）Ｐ（ξ＋ｆ’）ｄξ （但し、ｆ ≠０、ｆ’≠０）
となる。
【００１７】
以上の式展開では、輪帯開口２と位相板４とが一致するものとしているが、輪帯開口２の形状が、
【数５】

を満足していれば、Ｆ（ｆ）、Ｇ（ｆ）は、
ＤＣ＝∫Ｑ（ξ）ｄξ
Ｆ（ｆ）＝∫Ｑ（ξ）Ｐａ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
Ｇ（ｆ）＝∫Ｑ（ξ）Ｐｂ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
で与えることができる。
【００１８】
位相差顕微鏡における像コントラストは、（５）式の像コントラストの特性から、それぞれの成分に分解して表すことができる。すなわち、（５）式の各成分を物理的に解釈すると、第１項は位相差像の背景の明るさを表すバックグラウンド成分、第２項は標本の位相量に比例した位相差像のコントラスト成分、第３項は位相板で位相変調を受けない明視野像のコントラスト成分、第４項は０次の非線形成分（ハロー成分）、第５項は２次の非線形成分、第６項は高次の非線形成分をそれぞれ表している。したがって、位相差像のコントラストを改善するためには、（５）式において相対的に第２項を強調すれば良いことになる。
【００１９】
すなわち、標本５が比較的薄い場合には、｜Φ（ｆ）｜^２等の位相の２乗成分が非常に小さくなり、第４項以降の項の影響を無視することができるので、位相板４の透過率Ｃを小さくすることで、第２項を強調することができ、これにより像コントラストを改善することができる。
【００２０】
これに対し、標本５が厚い場合には、｜Φ（ｆ）｜^２等の位相の２乗成分の影響が無視できなくなって、（５）式の第４項以降の影響が現れるため、位相板４の透過率Ｃを小さくするだけでは、位相差像のコントラストを改善することができなくなる。しかも、標本５が厚いと、その特性によって（５）式の各項の強調のされ方が変わってくる。
【００２１】
例えば、標本５に非対称で一定の位相勾配が存在すると、位相勾配付近で標本５で回折される光に偏りが生じて、特定の方向の回折光だけが強調されるため、特定のｆに対して、｜Φ（ｆ）｜^２の値が大きくなり、（５）式の第４項の影響が大きくなる。また、標本５に周期的な位相変化があると、標本５で回折される光が対称となって、Φ（ｆ）＝Φ（−ｆ）となり、位相変化の周期および変化量によって特定のｆに対するΦ（ｆ）およびΦ（−ｆ）の値が大きくなり、（５）式の第５項の影響が大きくなる。
【００２２】
したがって、標本５が厚い場合には、（５）式の第２項が強調されるように、その観察する標本５の特性に応じてＦ（ｆ）およびＧ（ｆ）を適切に選択して、標本５の位相量に比例した位相差像のコントラスト成分を強調すれば良い。このためには、結像光学系３の瞳位置に挿入する位相板４を、位相差像を形成するための位相変調を与える領域と、ハロー成分や非線形成分を減衰するための吸収領域との異なる変調領域をもって構成すれば良い。
【００２３】
ここで、（２）式で示したＰａ（ξ）を、
【数６】

の２つの関数に分解し、新たにこの関数の線形結合として、
Ｐａ（ξ）＝ＰＦ（ξ）＋ＴＰｆ（ξ）（０≦ Ｔ（透過率）＜１）（７）
で表すと、（５）式は、以下のように表すことができる。
【数７】

【００２４】
上記（８）式においては、第４項の影響を小さくすることによって、ハロー成分を低減することができる。ここで、ハロー成分は、観察する標本５に一定の位相勾配が存在する場合に、標本５をフーリエ変換すると、特定の周波数成分が強調されて発生する。したがって、この特定の周波数成分を選択的に減衰するようなフィルタを、結像光学系の瞳面に挿入すれば、ハロー成分を低減することが可能となる。すなわち、（８）式において、Ｈ’（ｆ）をハロー成分を強調するような特性を持った伝達関数とし、Ｆ’（ｆ）をハロー成分を減衰するような特性を持った伝達関数とし、さらにＴを小さい値に設定すれば、第４項全体の値を小さくすることができ、その影響を低減することができる。
【００２５】
一方、標本５が対称で周期性がある場合には、標本５での回折光は特定の周波数でΦ（ｆ） ≒Φ（−ｆ）となり、また、標本５が厚くなると、Φ（ｆ）およびΦ（−ｆ）の値が大きくなって、Φ（ｆ）・Φ^＊（−ｆ）の値が無視できなくなり、（５）式および（８）式の第５項の影響が現れる。この第５項の影響を小さくするためには、ハロー成分の低減と同様に、位相板４に、位相差像を形成するための位相および振幅を変調する領域と、吸収または遮光する領域との異なる変調領域を形成すれば良い。
【００２６】
このようにすれば、標本５の周波数に対応したＲ（ｆ，−ｆ）の値を小さくでき、したがって（５）式および（８）式の第５項の影響を小さくすることができ、非線形成分の影響を小さくすることができる。すなわち、Ｒ（ｆ，−ｆ）の値は、従来の位相差顕微鏡の理想光学系を仮定すると、ほぼ図２の斜線部の面積に相当することになるが、上記のように、位相板４に、位相差像を形成するための位相および振幅を変調する領域の他に、吸収または遮光する領域を形成すれば、図３に示すように、Ｒ（ｆ，−ｆ）の値に相当する部分の面積が小さくなる。
【００２７】
以上のようなハロー成分や非線形成分の低減方法は、位相板４を照明光学系１の瞳と共役な関係が保たれる瞳位置であれば、何処の瞳位置に配置しても同様の効果が得られる。また、ハロー成分や非線形成分を低減するための吸収または遮光領域を有する変調素子は、上記のように位相差像を形成するための位相膜を有する位相板と一体に形成して同一の瞳面内に配置する他、位相板とは別体に形成して、位相板と変調素子とを同一または別々の瞳位置に配置することもでき、これにより同等の効果を得ることができる。
【００２８】
なお、上記のハロー成分や非線形成分は、観察する標本によって発生の仕方が異なるので、ハロー成分や非線形成分を低減する変調素子は、標本毎に最適化するのが望ましい。このためには、位相板と変調素子とを別体に形成し、これらを同一または別々の瞳位置に配置するのが、観察すべき標本に応じて変調素子のみを交換して、ハロー成分や非線形成分の低減の最適化を行うことができるので、標本に容易に対処することが可能となる。また、変調素子を、例えば、液晶シャッタ等の電気的作用により選択できるように、複数の輪帯状の吸収または遮光領域をもって構成すれば、光学系に変化を生じさせることなく、吸収または遮光領域の選択によって、ハロー成分や非線形成分の低減の最適化を行うことができるので、観察すべき標本に容易かつ迅速に対応することが可能となる。
【００２９】
【実施例】
以下、この発明の実施例について説明する。
この発明の第１実施例においては、図１に示す構成の位相差顕微鏡において、位相板４として、図４に示すように、位相差像を形成するための位相θおよび振幅Ｃを変調させる輪帯状領域４ａと、透過率Ｔがほぼ０の輪帯状の遮光領域４ｂとの２つの領域を形成したものを用いる。
【００３０】
この実施例において、θ＝π／２になるようにすると、上記（８）式は、
【数８】

となる。
【００３１】
図５は、第１実施例において、照明光学系１の瞳位置に配置される輪帯開口２の内径ＮＡ_ｉ’ および外径ＮＡ_Ｏ’、位相板４における輪帯状領域４ａの内径ＮＡ_ｉおよび外径ＮＡ_Ｏ、同じく位相板４における遮光領域４ｂの内径ＮＡｆおよび外径ＮＡＦを、結像光学系３の瞳の半径を１に規格化した座標を用いて、それぞれ、ＮＡ_ｉ’ ＝０．３、ＮＡ_Ｏ’＝０．４、ＮＡ_ｉ＝０．３、ＮＡ_Ｏ＝０．４、ＮＡｆ＝０．２５、ＮＡＦ＝０．３としたとき、上記（９）式によって計算したＦ’（ｆ）およびＧ’（ｆ）のそれぞれの伝達関数を示すものである。ここで、λは観察時の波長、ＮＡは対物レンズ３ａの開口数を示す。なお、比較のために、図６に、従来の位相差顕微鏡において、ＮＡ_ｉ＝０．３、ＮＡ_Ｏ＝０．４としたときのＦ（ｆ）およびＧ（ｆ）の伝達関数を示す。
【００３２】
図５および図６に示すＦ’（ｆ）およびＦ（ｆ）を比較すると、低周波数において、Ｆ’（ｆ）はＦ（ｆ）よりも小さくなることがわかる。したがって、この周波数帯域での位相差像のコントラストは、（１０）式から明らかなように、従来の位相差顕微鏡におけるよりも低下することになるが、Ｆ’（ｆ）が小さくなることで、ハローの影響が低減されるので、Ｃの値を小さく設定しても、ハローの影響が小さくなり、相対的にコントラストの高い位相差像を得ることができる。なお、ハローの影響を低減するためには、ＮＡ_ｉ＝０．２５、ＮＡ_Ｏ＝０．４とするだけでも、同様の効果が得られるが、この場合には、Ｇ’（ｆ）＜Ｇ（ｆ）となって、上記（１０）式の第３項の明視野成分の影響が大きくなり、相対的に位相差像のコントラストを低下させることになる。
【００３３】
このように、この実施例によれば、位相板４に、位相差像を形成するための位相θおよび振幅Ｃを変調させる輪帯状領域４ａと、透過率Ｔがほぼ０の輪帯状の遮光領域４ｂとの２つの領域を形成したので、観察すべき標本が比較的厚い場合に、ハロー成分や非線形成分を低減することができ、位相差像のコントラストを改善することができる。
【００３４】
この発明の第２実施例においては、図１に示す構成の位相差顕微鏡において、位相板４として、図７に示す構成のものを用いる。この位相板４は、図４に示す位相板４において、透過率Ｔがほぼ０の輪帯状の遮光領域４ｂを、位相差像を形成するための位相θおよび振幅Ｃを変調させる輪帯状領域４ａの外側に形成したものである。
【００３５】
図８は、第２実施例において、結像光学系３の瞳の半径を１に規格化した座標を用い、位相板４の輪帯状領域４ａの内径ＮＡ_ｉおよび外径ＮＡ_Ｏを、ＮＡ_ｉ＝０．３，ＮＡ_Ｏ＝０．４、遮光領域４ｂの内径ＮＡｆおよび外径ＮＡＦを、ＮＡｆ＝０．４，ＮＡＦ＝０．４５としたときのＦ’（ｆ）およびＧ’（ｆ）のそれぞれの伝達関数を示すものである。なお、図８には、比較のために、図７において遮光領域４ｂを形成しないときのＦ（ｆ）の伝達関数をも示す。
【００３６】
図８から明らかなように、この実施例においても、第１実施例におけると同様に、Ｆ’（ｆ）の伝達関数を、低周波数において遮光領域４ｂを有しないＦ（ｆ）よりも低くなる。したがって、第１実施例におけると同様に、比較的厚い標本を観察する場合に、ハロー成分や非線形成分を低減することができ、位相差像のコントラストを改善することができる。
【００３７】
図９は、この発明とともに開発した第１参考例を示すものである。この参考例は、図１に示す構成において、対物レンズ３ａの瞳をリレーするリレー光学系７を設け、対物レンズ３ａの瞳位置（１次瞳位置）に位相膜を有する位相板４を配置し、リレー光学系７によってリレーされる瞳位置（２次瞳位置）に遮光膜を有する変調素子８を配置したものである。ここで、照明光学系１の瞳位置に配置された輪帯開口２と、結像光学系３の１次瞳位置に配置された位相板４の位相膜とは、互いに共役関係を有するように、例えば、輪帯開口２および位相膜のそれぞれの内径Na_iおよび外径NA_oを、NA_i＝０．３、NA_o＝０．４で一致させる。
【００３８】
図１０は、この参考例において、結像光学系３の２次瞳位置に配置する変調素子８における遮光膜の内径NAf および外径NAF を、NAf ＝０．２，NAF ＝０．２５としたときのF'(f) およびG'(f) のそれぞれの伝達関数を示し、図１１は、NAf ＝０．５，NAF ＝０．５５としたときのF'(f) およびG'(f) のそれぞれの伝達関数を示す。なお、図１０および図１１には、比較のために、図９において変調素子８を有しないときのF(f)の伝達関数をも示してある。
【００３９】
図１０および図１１から明らかなように、いずれの場合においても、Ｆ’（ｆ）の伝達関数は、低周波数において変調素子８を有しないＦ（ｆ）よりも低くなる。したがって、第１実施例におけると同様に、比較的厚い標本を観察する場合には、ハロー成分や非線形成分を低減することができ、位相差像のコントラストを改善することができる。しかも、Ｆ’（ｆ）は、変調素子８の遮光膜の内径および外径によって、その変化が異なるので、観察する標本に応じて最適な遮光膜を有する変調素子８を配置することにより、ハロー成分や非線形成分をより有効に低減することができる。
【００４０】
この発明とともに開発した第２参考例においては、変調素子８として、図１２ＡおよびＢに示す構成のものを用いる。この変調素子８は、液晶シャッタをもって構成したもので、図１２Ｂに断面図を示すように、共通の透明電極９を形成した硝子基板１０ａと、図１２Ａに平面図を示すように、複数の輪帯状の透明電極１１を形成した硝子基板１０ｂとで液晶１２をサンドイッチすると共に、硝子基板１０ａ，１０ｂの液晶１２とは反対側の面に、それぞれパラニコルの状態となるように偏光板１３ａ，１３ｂを設けたものである。
【００４１】
この参考例によれば、観察すべき標本に応じて、変調素子８の電圧を印加する輪帯状の透明電極１１を選択することにより、吸収または遮光する領域を選択することができるので、第１参考例におけるよりも、観察すべき標本に容易かつ迅速に対処でき、ハロー成分や非線形成分を有効に低減することができる。
【００４３】
なお、第１および第２参考例においては、対物レンズ３ａの１次瞳位置に位相板４を配置し、２次瞳位置に変調素子８を配置するようにしたが、逆に、１次瞳位置に変調素子８を、２次瞳位置に位相板４を配置することもできる。
【００４４】
付記
１．請求項１記載の位相差顕微鏡において、前記位相板は、位相差像を形成するための位相変調を与える領域と、ハロー成分や非線形成分を減衰する吸収領域とを有することを特徴とする位相差顕微鏡。
【００４５】
【発明の効果】
以上のように、この発明によれば、結像光学系の瞳位置に配置される位相板を、結像光学系の光軸を略中心とする第１の半径と該第１の半径より大きな第２の半径との間の第１の領域と、第２の半径と該第２の半径より大きな第３の半径との間の第２の領域とを有し、第１の領域および第２の領域の一方は位相差像を形成するための位相および振幅を変調する領域とし、他方は吸収領域または遮光領域としたので、観察する標本が比較的厚い場合に発生するハロー成分や非線形成分を低減でき、位相差像のコントラストを改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の原理を説明するための位相差顕微鏡の構成を示す図ある。
【図２】従来の位相差顕微鏡によるR(f,-f) の値を説明するための図である。
【図３】この発明の位相差顕微鏡によるR(f,-f) の値を説明するための図である。
【図４】この発明の第１実施例による位相板の構成を示す図である。
【図５】第１実施例における光学系の伝達関数の一例を示す図である。
【図６】従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数を示す図である。
【図７】この発明の第２実施例による位相板の構成を示す図である。
【図８】第２実施例における光学系の一例の伝達関数と、従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数とを比較して示す図である。
【図９】この発明とともに開発した第１参考例を示す図である。
【図１０】第１参考例における光学系の一例の伝達関数と、従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数とを比較して示す図である。
【図１１】第１参考例における光学系の他の例の伝達関数と、従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数とを比較して示す図である。
【図１２】この発明とともに開発した第２参考例による変調素子の構成を示す図である。
【符号の説明】
１照明光学系
１ａコンデンサレンズ
２輪帯開口
３結像光学系
３ａ対物レンズ
４位相板
５標本
６像面[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a phase contrast microscope used for observing a transparent specimen such as a cell or a bacterium.
[0002]
[Prior art]
In a phase contrast microscope, generally, a ring-shaped opening is arranged at a pupil position of an illumination optical system, and a position conjugate with respect to all or a part of the optical system including the ring-shaped aperture, the illumination optical system, and the imaging optical system. By disposing a ring-shaped phase film at the pupil position of the objective lens having a relationship, by changing the phase and amplitude of the zero-order light of the light diffracted on the sample surface to interfere with other diffracted light, The phase amount of the sample is changed to the contrast of the image so that observation can be performed.
[0003]
The contrast of a phase contrast image obtained by a phase contrast microscope is described, for example, in "Some improvements in the phase contrast microscopy" by K. Yamamoto, A. Taira, J. Microscopy, 129 (1983), pp. 49-62. And how to improve it. In a conventional phase contrast microscope, the image contrast is generally improved by setting the diameter of the annular phase film to about half the pupil diameter of the objective lens.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the phase contrast microscope, for example, as described in "" Consideration on Image Contrast of Phase Contrast Microscope ", Hiroshi Oki, Optics, Vol. 20, No. 9 (1991), pp. 590-594" Since the cutoff frequency is determined by the ratio between the diameter of the phase ring and the pupil diameter, there is a problem that the resolution is inferior to that of a normal bright-field microscope.
[0005]
Further, in the case of a specimen thicker than the wavelength, such as a biological specimen, ““ Basics and Application of Optical Microscope (4) ”” by Kei Komatsu, Applied Physics, Vol. 60, No. 11 (1991), p. As described in "1136-1254", there is a problem that the halo phenomenon appears remarkably, and the details of the boundary of the structure of the phase sample are obscured. , Nemoto, IEICE Technical Report MBE 88-58, P. 35-42, 1988 ”, the influence of spatial frequency components (non-linear terms) that are not originally present in the sample appears, There is also a problem that the phase difference image cannot be reproduced.
[0006]
The present invention has been made in view of the above points, and has as its object to reduce the effects of spatial frequency components (non-linear terms) that do not originally exist in a sample when the sample to be observed is relatively thick. Another object of the present invention is to provide a phase-contrast microscope appropriately configured to reproduce an accurate phase-contrast image.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention provides an annular optical system in which a ring-shaped aperture is arranged at a pupil position of an illumination optical system, and all or a part of an optical system including the illumination optical system and the image forming optical system includes the annular annular shape. A phase plate is arranged at a pupil position of the imaging optical system which is in a conjugate positional relationship with the aperture of the sample through the sample surface, and a sample arranged on the sample surface is observed by a phase difference method. In a microscope,
The phase plate has a first region between a first radius substantially centered on the optical axis of the imaging optical system and a second radius larger than the first radius, and the second radius A second region between the second region and a third radius that is larger than the second radius, wherein one of the first region and the second region is a region that modulates phase and amplitude, and the other is an absorption region. It is characterized in that it is an area or a light shielding area.
[0013]
[Action]
FIG. 1 shows the configuration of a phase contrast microscope for explaining the principle of the present invention. In this phase contrast microscope, an annular aperture 2 is arranged at the pupil position of an illumination optical system 1 having a condenser lens 1a, and an objective lens 3a having a conjugate positional relationship with the annular aperture 2 via a specimen surface. The phase plate 4 is arranged at the pupil position of the image optical system 3, the sample 5 arranged on the sample surface is illuminated by the illumination optical system 1, and the phase difference image is observed on the image plane 6 of the image forming optical system 3. Is what you do.
[0014]
Hereinafter, an image formed by the phase contrast microscope shown in FIG. 1 will be described using a one-dimensional model.
Now, assuming that the pupil function of the imaging optical system 3 is P (ξ), the pupil function of the illumination optical system 1 is Q (ξ), the phase distribution of the sample 5 is φ (x), weak phase approximation (Born approximation),
exp i φ (x) = 1 + iφ (x)
Is performed, the image intensity distribution I (x) of the sample 5 becomes
(Equation 1)

Given by Here, Φ (f) represents the Fourier transform of φ (x), and f represents the spatial frequency. It is assumed that the pupil function P (の) of the imaging optical system 3 can be represented by a linear combination of the functions represented by the following equation (2).
(Equation 2)

[0015]
Here, assuming that the pupil function Q (ξ) of the illumination optical system 1 can be expressed by Q (ξ) = Pb (ξ), the above equation (1) becomes
(Equation 3)

However, DC = {Pb (ξ) d}
F (f) = {Pb ($) Pa ($ + f) d} / DC
become. Therefore, the image contrast in the phase contrast microscope is approximately expressed by equation (4).
[0016]
By further approximating the above equation (4),
(Equation 4)

However, DC = {Pb (ξ) d}
F (f) = {Pb ($) Pa ($ + f) d} / DC
G (f) = {Pb (ξ) Pb (ξ + f) d} / DC
R (f, f ') = {Q (ξ) P (ξ + f) P (ξ + f') d} (however, f ≠ 0, f '≠ 0)
It becomes.
[0017]
In the above formula development, it is assumed that the orbicular zone opening 2 and the phase plate 4 match, but the shape of the orbicular zone opening 2 is
(Equation 5)

Is satisfied, F (f) and G (f) are
DC = {Q (ξ) d}
F (f) = {Q (ξ) Pa (ξ + f) d} / DC
G (f) = {Q (ξ) Pb (ξ + f) d} / DC
Can be given by
[0018]
The image contrast in the phase contrast microscope can be expressed by being decomposed into respective components from the characteristics of the image contrast of Expression (5). That is, when each component of the equation (5) is physically interpreted, the first term is a background component representing the brightness of the background of the phase difference image, and the second term is the contrast of the phase difference image proportional to the phase amount of the sample. Component, the third term is a contrast component of a bright-field image not subjected to phase modulation by the phase plate, the fourth term is a zero-order nonlinear component (halo component), the fifth term is a second-order nonlinear component, and the sixth term is high. The following non-linear components are shown respectively. Therefore, in order to improve the contrast of the phase difference image, the second term should be relatively emphasized in the equation (5).
[0019]
That is, when the sample 5 is relatively thin, the square component of the phase such as | Φ (f) | ² becomes very small, and the influence of the fourth and subsequent terms can be neglected. By reducing the transmittance C of No. 4, the second term can be emphasized, whereby the image contrast can be improved.
[0020]
On the other hand, when the sample 5 is thick, the effect of the square component of the phase such as | Φ (f) | ² cannot be ignored, and the effects of the fourth and subsequent terms of the equation (5) appear. The contrast of the phase difference image cannot be improved only by reducing the transmittance C of the plate 4. In addition, when the sample 5 is thick, the manner in which each term of the expression (5) is emphasized changes depending on its characteristics.
[0021]
For example, if the sample 5 has an asymmetric and constant phase gradient, the light diffracted by the sample 5 will be biased near the phase gradient, and only the diffracted light in a specific direction will be emphasized. Te, ^| Φ (f) | ² values increases, increases the influence of the fourth term of equation (5). If the sample 5 has a periodic phase change, the light diffracted by the sample 5 becomes symmetrical, and Φ (f) = Φ (−f). And the values of Φ (f) and Φ (−f) increase, and the effect of the fifth term in equation (5) increases.
[0022]
Therefore, when the sample 5 is thick, F (f) and G (f) are appropriately selected according to the characteristics of the sample 5 to be observed so that the second term of the expression (5) is emphasized. The contrast component of the phase difference image proportional to the phase amount of the sample 5 may be enhanced. For this purpose, the phase plate 4 inserted at the pupil position of the imaging optical system 3 is provided with a region for providing phase modulation for forming a phase contrast image and an absorption region for attenuating a halo component and a non-linear component. What is necessary is just to comprise with a different modulation area.
[0023]
Here, Pa (ξ) expressed by equation (2) is
(Equation 6)

Into two functions, and newly as a linear combination of these functions,
Pa (ξ) = PF (ξ) + TPf (ξ) (0 ≦ T (transmittance) <1) (7)
Equation (5) can be expressed as follows.
(Equation 7)

[0024]
In the above equation (8), the halo component can be reduced by reducing the effect of the fourth term. Here, when the sample 5 to be observed has a certain phase gradient and the sample 5 is Fourier-transformed, a specific frequency component is emphasized and generated. Therefore, if a filter that attenuates the specific frequency component is inserted into the pupil plane of the imaging optical system, the halo component can be reduced. That is, in equation (8), H '(f) is a transfer function having a characteristic that emphasizes the halo component, and F' (f) is a transfer function having a characteristic that attenuates the halo component. Further, if T is set to a small value, the value of the entire fourth term can be reduced, and its influence can be reduced.
[0025]
On the other hand, when the sample 5 is symmetric and periodic, the diffracted light at the sample 5 becomes Φ (f) ≒ Φ (−f) at a specific frequency, and when the sample 5 becomes thicker, Φ (f) And the value of Φ (−f) increases, the value of Φ (f) · Φ ^* (− f) cannot be ignored, and the effect of the fifth term in the equations (5) and (8) appears. In order to reduce the influence of the fifth term, similarly to the reduction of the halo component, the phase plate 4 is provided with a region for modulating a phase and an amplitude for forming a phase difference image and a region for absorbing or blocking light. What is necessary is just to form a different modulation area.
[0026]
By doing so, the value of R (f, -f) corresponding to the frequency of the sample 5 can be reduced, so that the effect of the fifth term in the equations (5) and (8) can be reduced, and The effect of the components can be reduced. That is, assuming the ideal optical system of the conventional phase contrast microscope, the value of R (f, -f) substantially corresponds to the area of the hatched portion in FIG. In addition, if a region for absorbing or blocking light is formed in addition to a region for modulating the phase and amplitude for forming a phase difference image, as shown in FIG. 3, it corresponds to the value of R (f, -f). The area of the part is reduced.
[0027]
The above-described method of reducing the halo component and the non-linear component can provide the same effect as long as the phase plate 4 is disposed at a pupil position where a conjugate relationship with the pupil of the illumination optical system 1 is maintained. Is obtained. Further, the modulation element having an absorption or light-blocking region for reducing a halo component and a non-linear component is formed integrally with a phase plate having a phase film for forming a phase difference image as described above to form the same pupil plane. In addition, the phase plate and the modulation element can be formed separately from the phase plate, and the phase plate and the modulation element can be disposed at the same or different pupil positions, whereby the same effect can be obtained.
[0028]
Since the above-mentioned halo components and non-linear components occur in different ways depending on the sample to be observed, it is desirable to optimize the modulation element for reducing the halo and non-linear components for each sample. For this purpose, the phase plate and the modulating element are formed separately, and they are arranged at the same or different pupil positions. Since the reduction of the nonlinear component can be optimized, it is possible to easily deal with the sample. Further, if the modulation element is configured with a plurality of annular absorption or light-shielding regions so that it can be selected by, for example, an electric action of a liquid crystal shutter or the like, the absorption or light-shielding region is not changed without causing a change in the optical system. By the selection, the reduction of the halo component and the nonlinear component can be optimized, so that it is possible to easily and quickly respond to the sample to be observed.
[0029]
【Example】
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
In the first embodiment of the present invention, in the phase contrast microscope having the configuration shown in FIG. 1, as the phase plate 4, as shown in FIG. 4, a wheel for modulating the phase θ and the amplitude C for forming a phase difference image. A structure in which two regions, that is, a band-shaped region 4a and a ring-shaped light-shielding region 4b whose transmittance T is substantially 0 is used.
[0030]
In this embodiment, if θ = π / 2, the above equation (8) becomes
(Equation 8)

It becomes.
[0031]
5, in the first embodiment, the inner diameter NA _i 'and the outer diameter NA _O' of the annular aperture 2 disposed at the pupil position of the illumination optical system 1, the inner diameter NA _i of the annular region 4a in the phase plate 4 and The outer diameter NA _O , the inner diameter NAf and the outer diameter NAF of the light-shielding region 4b in the phase plate 4 are respectively set to NA _i ′ = 0.0 using coordinates obtained by standardizing the radius of the pupil of the imaging optical system 3 to 1. 3, when NA _O ′ = 0.4, NA _i = 0.3, NA _O = 0.4, NAf = 0.25, and NAF = 0.3, F ′ ( f) and G ′ (f). Here, λ indicates the wavelength at the time of observation, and NA indicates the numerical aperture of the objective lens 3a. For comparison, FIG. 6 shows the transfer functions of F (f) and G (f) when NA _i = 0.3 and NA _O = 0.4 in a conventional phase contrast microscope.
[0032]
Comparing F '(f) and F (f) shown in FIGS. 5 and 6, it can be seen that F' (f) is smaller than F (f) at low frequencies. Therefore, the contrast of the phase contrast image in this frequency band is lower than that of the conventional phase contrast microscope, as is apparent from the equation (10). However, as F ′ (f) becomes smaller, Since the effect of halo is reduced, even if the value of C is set small, the effect of halo is reduced, and a phase contrast image with relatively high contrast can be obtained. In order to reduce the influence of the halo, a similar effect can be obtained by simply setting NA _i = 0.25 and NA _O = 0.4. In this case, G ′ (f) <G (F), the effect of the bright field component in the third term of the above equation (10) becomes large, and the contrast of the phase difference image is relatively lowered.
[0033]
As described above, according to this embodiment, the annular plate-shaped region 4a for modulating the phase θ and the amplitude C for forming the phase difference image, and the annular band-shaped light-shielding region having the transmittance T of almost 0 are formed on the phase plate 4. Since the two

regions

4b and 4b are formed, when the sample to be observed is relatively thick, the halo component and the non-linear component can be reduced, and the contrast of the phase difference image can be improved.
[0034]
In the second embodiment of the present invention, in the phase contrast microscope having the configuration shown in FIG. 1, the phase plate 4 having the configuration shown in FIG. 7 is used. This phase plate 4 is different from the phase plate 4 shown in FIG. 4 in that a ring-shaped light-shielding region 4b having a transmittance T of substantially 0 is changed to a ring-shaped region 4a for modulating a phase θ and an amplitude C for forming a phase difference image. It is formed outside.
[0035]
8, in the second embodiment, using the coordinates obtained by normalizing the radius of the pupil of the image-forming optical system 3 to 1, the inner diameter NA _i and outside diameter NA _O of the annular region 4a of the phase plate 4, NA _i = 0.3, NA _O = 0.4, F ′ (f) and G ′ (f) when the inner diameter NAf and outer diameter NAF of the light-shielding region 4b are NAf = 0.4, NAF = 0.45. 3 shows respective transfer functions. FIG. 8 also shows, for comparison, the transfer function of F (f) when the light-shielding region 4b is not formed in FIG.
[0036]
As is clear from FIG. 8, also in this embodiment, as in the first embodiment, the transfer function of F ′ (f) is lower than F (f) without the light shielding area 4b at low frequencies. . Therefore, as in the first embodiment, when observing a relatively thick sample, the halo component and the non-linear component can be reduced, and the contrast of the phase difference image can be improved.
[0037]
FIG. 9 shows a first reference example developed with the present invention. In this reference example, in the configuration shown in FIG. 1, a relay optical system 7 for relaying a pupil of an objective lens 3a is provided, and a phase plate 4 having a phase film is arranged at a pupil position (primary pupil position) of the objective lens 3a. And a modulation element 8 having a light shielding film at a pupil position (secondary pupil position) relayed by the relay optical system 7. Here, the annular aperture 2 arranged at the pupil position of the illumination optical system 1 and the phase film of the phase plate 4 arranged at the primary pupil position of the imaging optical system 3 have a conjugate relationship with each other. , for example, the respective inner diameter Na _i and outside diameter NA _o of the annular aperture 2 and the phase films, NA _i = 0.3, it is consistent with NA _o = 0.4.
[0038]
FIG. 10 shows that, in this reference example, the inner diameter NAf and outer diameter NAF of the light-shielding film in the modulation element 8 arranged at the secondary pupil position of the imaging optical system 3 are NAf = 0.2 and NAF = 0.25. FIG. 11 shows the respective transfer functions of F ′ (f) and G ′ (f), and FIG. 11 shows F ′ (f) and G ′ (f) when NAf = 0.5 and NAF = 0.55. ) Are shown below. 10 and 11 also show, for comparison, the transfer function of F (f) when the modulation element 8 is not provided in FIG.
[0039]
As is clear from FIGS. 10 and 11, in any case, the transfer function of F ′ (f) is lower than F (f) without the modulation element 8 at low frequencies. Therefore, as in the first embodiment, when observing a relatively thick sample, the halo component and the non-linear component can be reduced, and the contrast of the phase difference image can be improved. In addition, since F ′ (f) varies depending on the inner diameter and outer diameter of the light-shielding film of the modulation element 8, by arranging the modulation element 8 having the optimal light-shielding film according to the sample to be observed, the halo can be reduced. Components and non-linear components can be reduced more effectively.
[0040]
In the second reference example developed with the present invention, the modulator 8 having the configuration shown in FIGS. 12A and 12B is used. The modulation element 8 includes a liquid crystal shutter, and includes a glass substrate 10a on which a common transparent electrode 9 is formed as shown in a cross-sectional view in FIG. 12B, and a plurality of rings as shown in a plan view in FIG. The liquid crystal 12 is sandwiched between the liquid crystal 12 and the glass substrate 10b on which the strip-shaped transparent electrode 11 is formed. It is provided.
[0041]
According to this reference example, by selecting the ring-shaped transparent electrode 11 to which the voltage of the modulation element 8 is applied according to the sample to be observed, the region to be absorbed or shielded can be selected. The sample to be observed can be dealt with more easily and quickly than in the reference example, and the halo component and the non-linear component can be reduced effectively.
[0043]
In the first and second reference examples, the phase plate 4 is arranged at the primary pupil position of the objective lens 3a and the modulation element 8 is arranged at the secondary pupil position. The modulation element 8 can be arranged at the position, and the phase plate 4 can be arranged at the secondary pupil position.
[0044]
Appendix 1 2. The phase contrast microscope according to claim 1, wherein the phase plate has a region for giving a phase modulation for forming a phase difference image and an absorption region for attenuating a halo component and a non-linear component. microscope.
[0045]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the phase plate disposed at the pupil position of the imaging optical system is provided with the first radius substantially centered on the optical axis of the imaging optical system and the first radius larger than the first radius. A first region between the second radius and a second region between the second radius and a third radius greater than the second radius, wherein the first region and the second region; One of the regions is a region that modulates the phase and amplitude for forming a phase contrast image, and the other is an absorption region or a light-shielding region, so halo components and nonlinear components that occur when the sample to be observed is relatively thick are Thus, the contrast of the phase difference image can be improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a phase contrast microscope for explaining the principle of the present invention.
FIG. 2 is a diagram for explaining a value of R (f, -f) measured by a conventional phase contrast microscope.
FIG. 3 is a diagram for explaining a value of R (f, -f) by a phase contrast microscope of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing a configuration of a phase plate according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a diagram illustrating an example of a transfer function of the optical system according to the first embodiment.
FIG. 6 is a diagram showing a transfer function of an optical system in a conventional phase contrast microscope.
FIG. 7 is a diagram showing a configuration of a phase plate according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing a comparison between a transfer function of an example of an optical system in the second embodiment and a transfer function of an optical system in a conventional phase contrast microscope.
FIG. 9 is a diagram showing a first reference example developed with the present invention.
FIG. 10 is a diagram showing a comparison between a transfer function of an example of an optical system in a first reference example and a transfer function of an optical system in a conventional phase contrast microscope.
FIG. 11 is a diagram showing a comparison between a transfer function of another example of the optical system in the first reference example and a transfer function of the optical system in a conventional phase contrast microscope.
FIG. 12 is a diagram showing a configuration of a modulation element according to a second reference example developed with the present invention.
[Explanation of symbols]
Reference Signs List 1 illumination optical system 1a condenser lens 2 annular aperture 3 imaging optical system 3a objective lens 4 phase plate 5 sample 6 image plane

Claims

A ring-shaped opening is arranged at the pupil position of the illumination optical system, and a position conjugate to the whole or a part of the optical system including the illumination optical system and the imaging optical system via the sample opening and the ring-shaped opening. A phase-contrast microscope in which a phase plate is arranged at a pupil position of the imaging optical system in relation to observe a sample arranged on the sample surface by a phase-contrast method.
The phase plate has a first region between a first radius substantially centered on the optical axis of the imaging optical system and a second radius larger than the first radius; A second region between the second region and a third radius larger than the second radius, one of the first region and the second region being a region that modulates phase and amplitude, and the other being an absorption region. A phase-contrast microscope characterized in that it is an area or a light-shielding area.