JP3582965B2 - Expression vector for mammalian cells - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物細胞を宿主として高水準に遺伝子組換タンパク質生産を可能にする哺乳動物細胞用発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、特に、大腸菌や酵母を宿主とした遺伝子組換では活性が得られ難いタンパク質の生産に適する。
【０００２】
【従来の技術】
組換タンパク質生産に用いる発現ベクターは数多く開発されており、とくに大腸菌や酵母などの微生物を宿主とした発現系では高い収率が期待できる。しかしながら、これらの微生物を宿主とする発現系ではタンパク質の修飾に問題があったり、哺乳動物タンパク質に固有の特徴が失われたりすることがある。このため、例えば生物学的活性が糖鎖に依存するタンパク質の場合、哺乳動物細胞を宿主としてそのタンパク質を生産することが必要になる。こうした要請にも拘わらず、哺乳動物細胞を宿主とする組換タンパク質発現系の生産性は一般に低く、導入遺伝子の安定性にも問題がある場合が多い。
【０００３】
哺乳動物細胞を宿主とした組換タンパク質生産の事例は、組織性プラスミノーゲンアクチベータ（特開昭５９−１８３６９３号公報；ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年）、エリスロポイエティン（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，２５７頁，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６４６５頁，１９８６年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，６７頁，１９８８年）、ＩＦＮ−γ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８０．４５６４頁，１９８３年）、ＩＦＮ−β（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３頁，１９９０年）などに見られる。また、モノクローナル抗体の遺伝子組換生産に関しても数多くの報告がある（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６９頁，１９９２年；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５，１９１頁，１９８９年； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１４５５頁，１９９２年）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
哺乳動物細胞を用いた組換タンパク質の生産性を上げることはタンパク質性医薬品や診断薬などの製造において非常に重要である。さらに、それらの開発研究にも有効な手段を与える。そのため、哺乳動物細胞とくにチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を宿主として、効率的な遺伝子導入および高生産性の獲得を可能にする発現ベクターが求められている。
【０００５】
効率的な遺伝子導入とは、組換細胞全体に対して目的物質を有効に生産する細胞クローンの数が相対的に小さく、それにより高生産性クローンのセレクションが容易であること、一方目的とするタンパク質を産生する細胞のポピュレーションが小さいにも拘わらず高生産性クローンが出現する期待値が大きいことである。得られる細胞のポピュレーションが大きいとその分セレクションに時間と労力を要することになり効率が悪い。また潜在的に高い生産性をもつクローンを見落とす可能性も高い。
【０００６】
高生産性の獲得とは、遺伝子導入により得られた細胞クローンの組換タンパク質の生産レベルが高いことであり、これはおもに発現ベクターの性質、性能に由来すると考えられる。遺伝子発現のレベルは染色体上の位置により著しく異なることが見出されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，６７９頁，１９９０年）。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、遺伝子導入により組み込まれる遺伝子のコピー数を大きくすることで高発現を達成するのではなく、宿主細胞染色体上の高発現位置にプラスミド遺伝子が組み込まれたものがネオマイシン耐性株として結果的にセレクトされる仕組みをもつ発現ベクターを開発した。遺伝子導入後のＧ４１８耐性株としての初期クローンの高生産性はネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（以下、ＮＥＯｒと記載する）遺伝子発現の仕組みに依存する。また、該発現ベクターはジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと記載する）遺伝子をもち、その発現誘導性を工夫することにより薬剤刺激により効率的な遺伝子増幅を可能にする発現ベクターを開発した。結果、高水準で安定的なタンパク質の産生を可能にする発現ベクターを作製でき、本発明を完成した。
【０００９】
導入されるＮＥＯｒ遺伝子の発現が起こらないかもしくは低すぎると、組換体である宿主細胞はネオマイシン（以下、Ｇ４１８で代表する）に対する耐性を獲得することができない。しかしながら本発明者らがこれまでに行った研究においては、市販のベクターを含みＮＥＯｒ遺伝子をもつ発現ベクターを用いたすべてのケースにおいて非常に多くのＧ４１８耐性株が得られた。このような結果に基づく限り、プラスミドから供与されたＮＥＯｒ遺伝子の発現は、トランスフェクションの結果得られた細胞が形質転換体であるかどうかの選択マーカーとしての役割以外には殆ど寄与していないと推定された。
【００１０】
本発明者らは、ＮＥＯｒ発現の仕組みをさらに制限的にすることにより、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンが宿主細胞染色体上の高発現位置に組み込まれない限りＧ４１８耐性獲得のために必要とするレベルのＮＥＯｒ発現が起こらないように設計した。すなわち、ＮＥＯｒ遺伝子の発現性を極めて劣化・減衰させたものにすることにより、組み込まれるプラスミド遺伝子が染色体上の極めて高い発現性をもつ位置に導入されない限り、形質転換体ではあっても培地中のＧ４１８セレクションに対して生存が困難であるようにした。発現ベクターのＮＥＯｒ遺伝子シストロンに弱いプロモーターを使用した報告はいくつかあるが（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：１２４６頁，１９８３年； Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，２５９３頁，１９８６年； Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７，１２９６頁，１９８７年；ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年）、これらの事例において高生産性の形質転換体が有効かつ十分に選択されているとは考え難い。
【００１１】
本発明は、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンの構成として、発現誘導性を低下させたプロモーターを使用し、かつ該プロモーターとＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域との間にアミノ酸配列をコードし得る配列を少なくとも１組含むことよりなるＤＮＡ配列を挿入（挿入配列）してもつこと、または、遺伝子導入により形質転換された宿主細胞におけるＮＥＯｒの発現機構を著しく消耗させ減衰せしめる点においてこれと同等の構成をもつことにより、遺伝子導入により形質転換された宿主細胞におけるＮＥＯｒの発現機構を著しく消耗させ減衰せしめるものである。本発明の、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンはプロモーターを弱化しただけのものとは異なり、高発現位置へプラスミド遺伝子が導入されたＧ４１８耐性株を特異的に獲得できるよう導くことから、「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロン」と定義する。
【００１２】
すなわち、本発明は、プラスミド中に該消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンおよび強発現誘導性プロモーターを有する発現ベクターを提供する。当該ベクターは、哺乳動物宿主細胞において遺伝子組み換えタンパク質の高生産性を誘導する。
【００１３】
該「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロン」のプロモーターとしては、哺乳動物細胞では通常発現し難いタンパク質遺伝子のプロモーターを由来とするもの、哺乳動物には通常感染し難いウイルス抗原のもつプロモーター、またはそのいずれかのプロモーターからエンハンサーを除去したものを使用でき、より具体的には、ＣＨＯ細胞に対して通常非感染性であるＳＶ４０のウイルス抗原プロモーターからエンハンサー領域を除去したものか（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，２５９３頁，１９８６年）またはこれと同等に発現性の充分に低いプロモーターを使用することが好ましい。また、挿入配列は例えば”トリプレットの構成単位としての開始位置がＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域開始位置に対応するアミノ酸配列をコードし得る配列”を少なくとも１組含んでなる。該挿入配列として好ましくは”トリプレットの構成単位としての開始位置がＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域のものと１塩基または２塩基ずれた位置にあるアミノ酸配列をコードし得る配列”をも含み、そのうち少なくとも２種類を有することが望ましく、さらに好ましくはこれら３種類をすべて含んでなることが望ましい。該挿入配列としてのＤＮＡ配列には、こうした条件をもとに人為的に合成したリンカーを使用できるが、自然に存在する配列で条件に合致するものがあればそれを由来とするものまたはそれを改変したものを用いても良い。例えば、トランスポゾンＴｎ５（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４５，１０７頁，１９８１年）などのトランスポゾン配列中にはトリプレットの構成単位としてそれぞれ開始位置の異なる３種類のアミノ酸配列をコードし得る配列がすべて含まれており、その配列中の適当な領域を使用することにより該条件を満足するものを作製することが可能である。該挿入配列の長さは、ＮＥＯｒの発現を低下させるのに十分なものであればよく、アミノ酸配列をコードし得る配列が何組含まれているかによって変わるものであるが、通常には３０〜１０００塩基、好ましくは１００〜４００塩基である。また、ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域開始位置前後（具体的には（−６），（−３），（＋４））のコザック共通配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，８１９５頁，１９８７年）に該当する位置の塩基はピリミジン塩基であるか、またはピリミジン系塩基に改変されていることが望ましい。
【００１４】
プラスミドＤＮＡの宿主細胞染色体上の強発現性位置への組み込みはＮＥＯｒ遺伝子シストロンのもつ特性からＧ４１８セレクションにより結果的に達成されることになるが、染色体上の当該位置における目的タンパク質の発現自体は強力に誘導される必要がある。このため、タンパク質遺伝子を組み込むマルチクローニングサイト（以下、ＭＣＳと記載する）のプロモーターおよびポリアデニレーションシグナル（以下、ｐｏｌｙＡと称する）には最も強い発現誘導性をもつものの中から選択する。プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウイルスＩｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ（ｈＣＭＶ ＭＩＥ：Ｃｅｌｌ，４１，５２１頁，１９８５年）プロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４８３１頁，１９８７年）、ｐｏｌｙＡシグナルにはウシ成長ホルモン由来のｐｏｌｙＡ配列（ＤＮＡ ５，１１５頁，１９８６年）等があげられる。本明細書中ではこの目的とするタンパク質遺伝子を組み込むＭＣＳをもつシストロンを「ＭＣＳシストロン」と称する。
【００１５】
本発明は、また、タンパク質遺伝子を組み込んだ上記の発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させることを含む、Ｇ４１８耐性細胞クローンであるタンパク質の高生産性形質転換体を得る方法を提供する。
【００１６】
本発現ベクターは好ましくはまたＤＨＦＲ遺伝子シストロンを有する。このベクターは、哺乳動物宿主細胞としてジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞を用い、該プラスミドの遺伝子の該宿主細胞への遺伝子導入後にメトトレキセートによる該プラスミドの遺伝子の効率的な増幅を可能にする。
【００１７】
ＤＨＦＲ遺伝子シストロンにおいては、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンに使用するものと同様に発現誘導性を低下させたプロモーター、例えばＣＨＯ細胞に対して通常非感染性であるＳＶ４０のウイルス抗原プロモーターからエンハンサー領域を除去したものを用いる。より好ましくはＤＨＦＲ遺伝子翻訳領域開始位置前後のコザック共通配列に該当する位置の塩基がピリミジン塩基であるか、またはピリミジン系塩基に改変されていることが望ましい。遺伝子増幅を促進するためには、導入するＤＨＦＲ遺伝子に変異を導入することによりメトトレキセート（以下、ＭＴＸと記載する）への親和性を低下させる方法が知られている（特開昭５９−１９２０８９号公報）が、本発明者らはＤＨＦＲ遺伝子の発現誘導性を弱くするかまたは抑制的にしておくことにより、培地中に含まれるＭＴＸが宿主細胞染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの増幅を促すよう導く方がより効果的と考えた。
【００１８】
本発明は、また、タンパク質遺伝子を組み込んだ上記ＤＨＦＲ遺伝子シストロンも有する発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させることを含む、タンパク質の高生産性形質転換体を得る方法を提供する。
【００１９】
本発明は、さらに、タンパク質遺伝子を組み込んだ上記の発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させ、得られた形質転換体を無血清培地へ馴化させることを含む、無血清培地で安定的に高水準のタンパク質生産をすることのできるタンパク質の高生産性形質転換体を得る方法を提供する。
【００２０】
本発明は、また、上記のＤＨＦＲ遺伝子シストロンおよび強発現誘導性プロモーターを有する遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトを有する発現ベクターを提供する。この発現ベクターは上記消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを有する発現ベクターの構築のために使用できる。
【００２１】
本発明において「発現誘導性の低いプロモーター」とは、タンパク質発現のために一般的に使用されているプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、βアクチンプロモーターなどにより誘導される場合に較べてタンパク質の発現が弱いプロモーターを意味している。「アミノ酸をコードし得る配列」とは、対応する開始コドンと終始コドンをもちその間にペプチドをコードできる遺伝子配列をもつものであって、好ましくは構成するアミノ酸の数が２０前後あるいはそれ以上あるのが望ましい。「シストロン」とは、プロモーター、構造遺伝子、ポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙＡ）を基本構成とする転写・翻訳によりタンパク質を発現する単位を意味するが、これらのいずれかに関連するかもしくは任意のＤＮＡ配列を挿入配列として含んでも良い。「強発現誘導性プロモーター」とは、通常の発現ベクターにおいて、タンパク質発現のために一般的に使用されているプロモーターを意味し、好ましくは、特に発現誘導性が高いヒトサイトメガロウイルスＭａｊｏｒ Ｉｍｍｅｉｄａｔｅｌｙ−Ｅａｒｌｙ抗原プロモーター、β−アクチンプロモーターなどのプロモーターを意味する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明発現ベクターは、バックボーンベクター上に、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン、ＭＣＳシストロンを組み込むことによって、また、さらにＤＨＦＲ遺伝子シストロンを組み込むことによって得ることができる。バックボーンベクターとしての制限は特になく、例えば、大腸菌複製オリジン（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）およびアンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクター（ｐＵＣ系：Ｇｅｎｅ，３３：１０３頁，１９８５年、ｐＢＲ３２２等：Ｇｅｎｅ，２２，２７７頁，１９８３年）が使用できる。
【００２３】
本発明のベクターの使用法として、タンパク質遺伝子を本発明のベクターのＭＣＳに組み込んだ後、リポフェクチン法またはエレクトロポーレーションにより宿主細胞に遺伝子導入を行い、Ｇ４１８に対する耐性だけでセレクションを行い、タンパク質の高生産性形質転換体を得る方法が挙げられる。セレクションで生存した細胞の多くは既に相対的に高い発現レベルを達成しているが、その中からさらに高い生産性をもつ細胞を選択するためタンパク質の発現レベルをアッセイしてもよい。得られた高生産性細胞はクローニングを繰り返した後、継代して安定化させる。さらに高生産性株を得たい場合は、本発明のベクターとしてＤＨＦＲ遺伝子シストロンも有するベクターを使用し、培地中にＭＴＸを加え、宿主細胞内に組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子を刺激することにより遺伝子増幅を行う。一般にＭＴＸはＤＨＦＲ遺伝子の増幅だけでなく、単独あるいはネオマイシンと併せて遺伝子組み込み細胞のセレクションに用いられるが（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，１６５頁，１９８１年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９，６０１頁，１９８２年）、本発明ではＮＥＯｒ遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子の役割は分担するものとした。すなわち、ＮＥＯｒはセレクションのためのものであり、ＤＨＦＲは組み込まれたプラスミドベクター遺伝子を増幅するためのものとした。
【００２４】
以下、本発明発現ベクターの製造方法を具体例を挙げて説明する。なお、この具体例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易である。
【００２５】
＜１＞バックボーンベクター［ｐＢＢＶ］の作製
バックボーンベクターｐＢＢＶは、プラスミドｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３頁，１９８５年）のｌａｃＺ領域を完全に取り除き、開裂部位を新しく合成したマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＢＢＶリンカー）で置換することにより制作する。ｐＢＢＶ作製のフローチャートを図１に示す。ｐＢＢＶは、大腸菌複製オリジン（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）とアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を有する。
【００２６】
＜２＞遺伝子クローニング用プラスミドの作製
（ａ） ＳＶ４０関連遺伝子クローニング用プラスミド［ｐＣＶ３］の作製
プラスミドｐＵＣ１１９（Ｇｅｎｅ，３３，１０３頁，１９８５年）のもつマルチクローニングサイトを、新しく合成したマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＣＶ３リンカー）で置換することにより作製する。ｐＣＶ３作製のフローチャートを図２に示す。
【００２７】
（ｂ） ＭＣＳシストロンをもつ遺伝子クローニング用プラスミド［ｐＣＶ４］の作製
プラスミドｐＵＣ１８の既存のマルチクローニングサイトを除去して、新しく合成したマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＣＶ４リンカー）で置換することにより作製する。これは、ＭＣＳシストロンの作製過程で用いる構築用プラスミドである。ｐＣＶ４作製のフローチャートを図３に示す。
【００２８】
＜３＞カセット構築用プラスミド［ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１，ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２］の作製
ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつプラスミドおよびＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつプラスミドを作製するために、あらかじめプロモーターとポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙＡ）の間にマルチクローニングサイトを有するカセット構築用プラスミドを作製する。ＤＨＦＲ遺伝子シストロン用としてｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用としてｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２を作製する。基本構成は共通で、プロモーターとしてＳＶ４０由来の初期プロモーター（ＳＶ４０複製オリジンを含む）を改変したもの、ポリアデニレーションシグナルとしてＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを採用する。これらをあらかじめ用意されたＳＶ４０関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ３に組み込むことにより作製する。ＤＨＦＲ用とＮＥＯｒ用との違いはＳＶ４０プロモーターの５’末端の制限酵素切断配列が一部異なるだけである。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１作製のフローチャートを図４に、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２作製のフローチャートを図５に示す。
【００２９】
（３−１） ＤＨＦＲ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１の作製
（ａ） プロモーターの選択
ウイルス抗原プロモーター領域からエンハンサー部分を取り除くことによりプロモーターを弱化することができるとの報告をもとに（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，１２４６頁，１９８３年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，２５９３頁，１９８６年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７．１２９６頁，１９８７年）、ＳＶ４０初期プロモーターのエンハンサー部分を除去することにより発現誘導性の低いプロモーターを作製する。具体的には、ＳＶ４０複製オリジン（Ｏｒｉ）を含む初期プロモーター配列を改変して使用する。すなわち、ｐＢＲ３２２上にＢａｍＨＩでライゲートしたＳＶ４０ウイルス全ＤＮＡをもつプラスミドｐＳＢ４０／ＢＲ（広島大学より入手）から、配列番号８および９に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＳＶ４０初期プロモーター配列を切り出し、プラスミドｐＣＶ３のＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩサイト間に組み込む。続いてこの配列中に存在する７２ｂｐ繰返配列中にそれぞれあるＳｐｈＩ間（ＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ）をセルフライゲーションすることによりエンハンサー部分を除去し（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，１２４６頁，１９８３年）、該プロモーターを弱化させる。弱化させたプロモーターをＰＳＶ４０ＤＥ，作製されたプラスミドをｐＳＶＰ１ａと称する。
【００３０】
（ｂ） ｐｏｌｙＡシグナル配列の選択と設定
ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のｐｏｌｙＡシグナルを有するプラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−Ａ（ｐＳＶ４０／ＢＲ由来，広島大学より入手）から８１０塩基を切り出して使用する。発現ベクターにおけるＳＶ４０ ｐｏｌｙＡは、一般的にはターミネーションシグナルを含むことを条件に短いものを使用する傾向にあるが、他のシストロンへの影響を避けるために充分な長さの配列を設定するとよい。この配列の３’末端の制限酵素切断配列は新しく合成したリンカー（ＳＰＳＶ４０リンカー）により変更した後（変更後のプラスミドはｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂ）、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切り出してｐＳＶＰ１ａに組み込むことにより、ＤＨＦＲ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１を作製する。
【００３１】
（３−２）ＮＥＯｒ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２の作製
（ａ） プロモーターの選択
プロモーター配列には、ＤＨＦＲ遺伝子シストロンに使用したものと同じくＳＶ４０プロモーターを弱化させたＰＳＶ４０ＤＥを採用する。これはＤＨＦＲ用と同じ手順でｐＳＶ４０／ＤＲから切り出されるが、５’センスプライマーとしては制限酵素切断配列の一部（ＥｃｏＲＩ）が省略されたもの（配列番号７）を合成して使用する。プロモーター配列からのエンハンサー部分除去もＤＨＦＲ遺伝子シストロンの場合と同様の方法で行い、作製されたプラスミドをｐＳＶＰ１ｂとする。
【００３２】
（ｂ） ｐｏｌｙＡの選択と設定
ｐｏｌｙＡについても、ＤＨＦＲ用の場合と同じ方法でｐＳＶ４０ｐＡ−ＢからＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切り出してｐＳＶＰ１ｂに組み込むことにより、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン構築用ベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２を作製する。
【００３３】
＜４＞ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクター［ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ］の作製
（４−１） 「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロン」を作製するための挿入配列の調製
（ａ） トランスポゾン由来配列の利用
ＮＥＯｒ遺伝子の発現機構を消耗させるため、プロモーターとＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域の間に任意のアミノ酸配列をコードし得る配列を少なくとも１組好ましくはトリプレットの構成単位としての開始位置が異なる３種類すべてを含んでなる挿入配列をもつが、発明者らは自然に存在する配列であるトランスポゾン配列（Ｔｎ５：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４５，１０７頁，１９８１年；Ｇｅｎｅ，１８，３２７頁，１９８２年）を由来とする配列中にこの挿入配列としての条件を満足する領域があることを見いだした。本発明中の実施例のベクターで使用した３５４塩基からなるトランスポゾン配列部分にはいくつものアミノ酸配列をコードし得る遺伝子配列、すなわち開始コドンと見なし得る”ＡＴＧ”が出現する（合計７個あり、内６個は該配列中に対応する終止コドンを有し、最も下流にある翻訳領域から数えて（−１６）の位置から始まる７個目の”ＡＴＧ”にはＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域の開始コドン直後の”ＡＴＧＡＴＴＧＡ（下線部分）”が終止コドンとして対応し完結する）。また、この配列中には、トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類すべてのアミノ酸配列をコードし得る配列が含まれている。従って、トランスポゾン配列はＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域５’末端から上流に数えて２７０ｂｐないし１９０ｂｐ程度を採用すれば良いが、短い場合でも少なくとも８０ｂｐ程度はあるのが望ましい。また、３’側末端の配列はＮＥＯｒ遺伝子の開始コドンの３つ前（−３）の塩基が”Ｃ”、６つ前（−６）の塩基が”Ｔ”であって、共にピリミジン系塩基でありコザック共通配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，８１９５頁，１９８７年）には該当しない。従ってこのトランスポゾン配列はＰＳＶ４０ＤＥとＮＥＯｒタンパク質をコードする遺伝子との間に位置することにより、ＮＥＯｒ遺伝子の発現機構を効果的に消耗させ減衰させることができると考えられた。
【００３４】
（ｂ）挿入配列としての人工リンカーの調製
挿入配列としては人為的にリンカーを合成して使用することもできる。この場合トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類すべてのアミノ酸配列をコードする配列を含むよう、また各々の長さは２０アミノ酸程度またはそれ以上の長さのものになるように設計する。各々のアミノ酸配列は必ずしも直列である必要は無くオーバーラップした共有部分をもっても良い。このリンカーをＰＳＶ４０ＤＥとＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域との間に挿入することにより、ＮＥＯｒ遺伝子の発現を効果的に減衰させることができると考えられる（以下、このリンカーを挿入リンカーとして記載する）。この合成リンカー挿入配列を用いる実施の形態は後述の＜８＞に記載する。
【００３５】
（４−２） ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯの構築
（ａ） トランスポゾン由来配列を利用する場合
ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターは、Ｐｓｖ４０ＤＥ（プロモーター）、挿入配列（トランスポゾン由来配列）、ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域配列およびＳＶ４０ ｐｏｌｙＡで構成する。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２にはＰＳＶ４０ＤＥとＳＶ４０ ｐｏｌｙＡがすでに組み込まれていることから、この間にＴｎ５由来のＮＥＯｒ遺伝子を含むトランスポゾン配列を組み込む。Ｔｎ５配列は一般的に利用されているｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７頁，１９８２年）に含まれているため、これをもとに切り出して使用する。ｐＳＶ２−ｎｅｏの場合はＮＥＯｒ遺伝子を含むトランスポゾン配列を強い発現誘導性を持つＳＶ４０プロモーターとの組み合わせで使用しており、本発明での利用法とは全く共通性がない。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ作製のフローチャートを図７に示す。
【００３６】
（ｂ） 人為的な合成リンカー挿入配列を使用する場合
ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２にはＰＳＶ４０ＤＥとＳＶ４０ ｐｏｌｙＡがすでに組み込まれていることから、この間に挿入配列としての合成リンカーを組み込むことにより作製できる。また、本発明の実施例のように、トランスポゾン由来配列を挿入配列としてもつよう最終的に作製された発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを使用し、トランスポゾン配列部分を合成リンカー配列に置き換えることにより、発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡを作製することもできる。
【００３７】
（４−３） ＮＥＯｒ遺伝子翻訳配列への変異導入
ＮＥＯｒ遺伝子の翻訳開始部分を好ましくは典型的なＫｏｚａｋ非共通配列にするために、開始コドン”ＡＴＧ”直後の塩基をポイントミューテーションでピリミジン系塩基である”Ｃ”または”Ｔ”に変更する（実際には”Ｃ”に変更した）。これによりＮＥＯｒ遺伝子のＭｅｔの次のアミノ酸は、ＩｌｅからＬｅｕまたはＰｈｅに変更される。この変更導入後のＮＥＯｒ遺伝子をＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子と称する。トランスポゾン配列およびＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子からなる配列を配列番号２６に示す。
【００３８】
＜５＞ＭＣＳシストロンをもつカセットベクター［ｐＥＸＰ−ＢＬ２］の作製
ＭＣＳシストロンは、プロモーター、目的とするタンパク質遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト（ＭＣＳ−Ｂ）およびｐｏｌｙＡで構成する。プロモーターには、最も強力な発現誘導性をもつプロモーターの一つとされているｈＣＭＶ ＭＩＥ抗原プロモーターを由来として使用する（ＰＣＭＶ）。また、ｐｏｌｙＡシグナルにも高生産性でかつ再現性に優れているとの報告のあるウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡシグナル（ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ）を採用する。ＭＣＳシストロンをもつシストロンベクターｐＥＸＰ−ＢＬ２の作製のフローチャートを図８に示す。
【００３９】
（ａ） ＰＣＭＶプロモーターの設定範囲
ＰＣＭＶの配列は、ｈＣＭＶ ＭＩＥ抗原のプロモーター／エンハンサー領域を含む約６ｋｂの配列をｐＳＶ２−Ｎｅｏに組み込むことにより作製されたプラスミドｐＳＶ２−Ｎｅｏ／ＥｃｏＨ（東海大より入手）由来である。ＰＣＭＶの範囲は、ｈＣＭＶ ＭＩＥ遺伝子中で２１ｂ，１９ｂ，１８ｂ，１７ｂの繰り返し配列を全て含むプロモーター／エンハンサー領域とし、配列番号１６および１７に示す塩基配列を有するプライマー（末端に制限酵素切断配列５’：ＥｃｏＲＶ、３’：ＣｌａＩを付けたもの）を用いて切り出し、ＭＣＳ関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ４のＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩサイト間に組み込む。作製されたプラスミドをｐＣＶ４／ＣＭＶと称する。
【００４０】
（ｂ） ｐｏｌｙＡの選択
ウシ肝細胞を由来とするゲノムＤＮＡから、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡを調製する。文献（Ｇｅｎｅ，１１，２９１頁，１９８７年）ではポリアデニレーションシグナル配列のうちＰｖｕＩＩとＫｐｎＩで切り出せる２２９ｂｐを用いて高い生産性でかつ再現性のある結果を得ているが、この間の配列中にターミネーター（”ＡＡＴＡＡＡ”）は１回出現する。基本的にｐｏｌｙＡは１つで充分と考えられるが、ＭＣＳシストロンをさらに安定化しターミネーションが強くかかるようにプラスミドｐＣＶ４／ＣＭＶ中にｂＧＨ ｐｏｌｙＡが二重の配列になるように組み込んでも良い（（ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ）２：配列番号２７）。
【００４１】
（ｃ） ＭＣＳシストロンをもつプラスミド［ＥＸＰ−ＢＬ２］
こうして作製されたプラスミド（ｐＥＸＰ−ＢＬ２）においては、ＰＣＭＶの３’末端制限酵素サイトと（ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ）２の５’末端の制限酵素サイトの間に、目的とするタンパク質遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ−Ｂ）が存在する。すなわち、５’−ＣｌａＩ−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ−３’が利用できる。組み込むタンパク質遺伝子が開始コドンから始まる場合には、５’側に直接つける制限酵素サイトとしてはＣｌａＩまたはＫｐｎＩを選択するのが望ましい。
【００４２】
＜６＞ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつカセットベクター［ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ］の作製
ＤＨＦＲ領域は、ＰＳＶ４０ＤＥ（プロモーター）、ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０ ｐｏｌｙＡより成る。ＰＳＶ４０ＤＥとＳＶ４０ ｐｏｌｙＡはすでにｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１に組み込まれており、これにＤＨＦＲ遺伝子配列を組み込むことにより作製する。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ作製のフローチャートを図６に示す。
【００４３】
ＤＨＦＲ遺伝子は、マウス繊維芽細胞３Ｔ３（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，９５０１頁，１９８１年）を由来として、開始コドンの５’上流６ｂから終止コドンの３’下流約８５ｂまでの範囲をＰＣＲプライマーで切り出す。５’側は開始コドンの直前の６塩基”ＧＣＣＡＴＣ”の”Ｇ”および”Ａ”からピリミジン系塩基に改変し（例えば、”ＴＣＣＣＴＣ”）、さらにその５’側にＰｓｔＩサイトをもつように調製する。３’側は終止コドンの下流８５ｂにあるＢｇｌＩＩサイトまでとする。このＰＣＲプライマーにより、ＤＨＦＲ遺伝子の開始コドンの５’側の（−６）、（−３）および開始コドン直後（＋４）の塩基はオリジナルにはコザック共通配列であるが、それぞれピリミジン系塩基に改変することにより非共通配列を形成する。これによりＤＨＦＲタンパク質の開始コドンの次のアミノ酸はＶａｌからＬｅｕまたはＰｈｅに変更される。この変異導入されたＤＨＦＲ遺伝子をＭｕ−ＤＨＦＲとし、その塩基配列を配列番号２５に示す。
【００４４】
＜７＞発現ベクター［ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ］の作製
予め用意された発現ベクター構築用のバックボーンベクターｐＢＢＶに、同一の転写方向にＮＥＯｒ領域（ＮＥＯｒ遺伝子シストロン）、目的物質組込領域（ＭＣＳシストロン）およびＤＨＦＲ領域（ＤＨＦＲ遺伝子シストロン）の順で組み込むことにより作製する。方法は以下の通りである。ＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲからＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩでＤＨＦＲ遺伝子シストロンを切り出し、バックボーンベクターｐＢＢＶのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩサイト間にライゲートすることによりプラスミドベクターｐＮＯＷ−１を作製し、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯからＣｌａＩおよびＳａｃＩＩでＮＥＯｒ遺伝子シストロンを切り出し、ｐＮＯＷ−１のマルチクローニングサイトのＣｌａＩ−ＳａｃＩＩサイト間にライゲートし、その後ＣｌａＩサイトをつぶしてプラスミドｐＮＯＷ−２を作製し、ｐＥＸＰ−ＢＬ２からＳｐｌＩおよびＥｃｏＲＶでＭＣＳシストロンを切り出し、ｐＮＯＷ−２のマルチクローニングサイトのＳｐｌＩ−ＥｃｏＲＶサイト間にライゲートすることにより発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを作製する。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ作製のフローチャートを図９に、マップを図１０に示す。
【００４５】
＜８＞合成リンカー挿入配列をもつ発現ベクター［ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ］の作製
完成したｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａをもとに、［トランスポゾン配列からＭｕ−ＮＥＯｒ配列に続く配列部分］を［合成リンカー挿入配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した配列］に置換する。
【００４６】
（ａ）合成リンカーの作製
トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類のアミノ酸配列をコードできる配列をすべて含む遺伝子配列を調製するために、それぞれ約５０塩基からなる２つのリンカー（ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ １（＋）， ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ ２（−））およびそれらの相補配列（ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ １（−）， ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ ２（＋））を合成する。これらのリンカーをＰＣＲ増幅させ、ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ １（＋）の末端の”ＣＣＡＡＧＣ”と相補的に対応するＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ ２（−）の末端”ＧＧＴＴＣＧ”とにより接続する。接続された合成リンカー（配列番号２９）は、５’側にＰｓｔＩサイト， ３’側にＥｃｏＲＶサイトをもつ。
【００４７】
（ｂ）トランスポゾン配列から合成リンカー挿入配列への置換
次いで、ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを使用して、別途に合成したプライマーを使用しＭｕ−ＮＥＯｒの５’側から数えて７塩基上流から終始コドンまでを切り出す。接続した合成リンカーの３’末端およびＭｕ−ＮＥＯｒの５’末端にはＥｃｏＲＶが付けられており、これを接続することにより挿入配列としての合成リンカーとＭｕ−ＮＥＯｒを接続した配列を作製する。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａからトランスポゾン配列だけを切り出して置換するための適当な制限酵素切断サイトがないため、準備した［合成リンカー挿入配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した配列］を用いて、対応するｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａの［トランスポゾン配列からＭｕ−ＮＥＯｒ配列に続く配列］を置換する。いずれも５’側にＰｓｔＩサイト，３’側にＥｃｏＲＶをもつため、ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡをＰｓｔＩ， ＥｃｏＲＶで開裂後、同じ制限酵素を用いて［合成リンカー挿入配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した配列］をライゲートする。新しく作製される、消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンの挿入配列が合成リンカーであることを特徴とする発現ベクターをｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡとする。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ作製のためのｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａ作製のフローチャートを図１１に示す。以下、図９にフローチャートを示す作製方法において、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯの代わりにｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａを使用することによりｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡを作製する。また、ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのマップを図１２に示す。
【００４８】
次に、本発明発現ベクター（ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡおよびｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ）の利用方法について説明する。
本発現ベクターは以下の手順によって使用できる。
【００４９】
（１）目的物質（タンパク質）の遺伝子をクローニングした後、（２）本発明発現ベクター（プラスミドベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡまたはｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ）のＭＣＳに組み込む。（３）組み込まれた該発現ベクターを増殖させた後、（４）ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲネガティブ）にリボフェクチン法またはエレクトロポレーションで遺伝子導入し、（５）培地中にＧ４１８を加え培養することによりＧ４１８耐性細胞をセレクトする。（６）得られた細胞を培養しながらクローニングを繰り返し、（７）目的物質の産生量の高いクローンを選択し、（８）さらに増殖速度が速くなり安定化するまで培養を継続する。（９）安定化したクローンの培地をＦＣＳ添加培地から漸次ＦＣＳ量を下げ、無血清培地への馴化を行う。（１０）高生産性のクローンに対して、培地中にＭＴＸ（１０ｎＭ−１μＭ）を段階的にくわえることにより導入されたプラスミド遺伝子を増幅させ、（１１）改めて高生産性クローンを選択し、（１２）さらに増殖速度が早くなり安定化するまで培養を継続する。（１３）安定化したクローンの培地をＦＣＳ添加培地から漸次ＦＣＳ量を下げ、無血清培地への馴化を行う。なお培地の無血清化は（９）と（１３）のいずれの段階で行ってもよい。
【００５０】
以下、本発明発現ベクターの使用例について説明する。
＜１＞発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡによるコングルチニン産生試験
（ａ）コングルチニン遺伝子導入とＧ４１８耐性初期クローンの確立
目的物質として、血清レクチンの一種であるウシコングルチニンを選択した。このタンパク質の活性には糖鎖が必要であり、大腸菌や酵母を宿主とした生産には適さない。ウシコングルチニンの遺伝子をクローニングしｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのマルチクローニングサイトに組み込んだ後、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株（Ｄｒ．Ｇａｉｌ Ｕｒｌａｕｂから譲受）にリポフェクチン法により遺伝子導入した。培地にＧ４１８を加え培養したところ、９６０ウエル中３３ウエルにのみ細胞の生存が見られた（Ｇ４１８耐性株）。生存細胞のほとんどはコングルチニンを有意に高いレベルで産生していたが、これらのうちから生産性の高い細胞として５クローンを選び継代培養したところすべてが７．０μｇ／ｍｌ（４日間）を示し、最も高い産生レベルを示したもの１１．８μｇ／ｍｌであった。これは文献等で報告されている代表的な発現ベクターによる遺伝子増幅前の初期クローンのデータと比較して最も高い水準であった（ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０．１４５５頁，１９９２年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，６６２頁，１９９０年；Ｇｅｎｅ，７６，１９頁，１９８９年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６４頁，１９９１年）。遺伝子増幅による組換細胞のスクリーニングには通常６ヶ月から１年を要しかつ培養条件や増幅刺激剤濃度による差異が大きいため、発現ベクターのプライマリーな性能比較は増幅前の初期クローンの発現レベルで行うのが適当と考えられる。これにより本発明の発現ベクターの性能は極めて高いことが判明した。この結果、「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつ発現ベクター」は、得られるＧ４１８耐性株の数が極めて低い一方、非常に高い効率で目的物質タンパク質の高生産性細胞株の確立を可能にすることが確かめられた。本発明者らは市販の哺乳動物細胞用発現ベクターや独自に開発した発現ベクターを用いてこれまで数多くの試験を行ってきたが、コングルチニン発現量はいずれも最高５０ｎｇ／ｍｌ（４日間）までであり、実用的とは言えなかった。これにより、本発明発現ベクターは非常に高いタンパク質発現レベルを可能にすることが証明された。
【００５１】
＜２＞発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａによるコングルチニン産生試験
（ａ）コングルチニン遺伝子導入とＧ４１８耐性初期クローンの確立
＜１＞と同様の方法で、ウシコングルチニンの遺伝子をｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａのマルチクローニングサイトに組み込んだ後、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株にリポフェクチン法により遺伝子導入した。１０％ＦＣＳを添加した培地にＧ４１８を加え培養したところ、９６０ウエル中４８ウエルに細胞の生存が見られ（Ｇ４１８耐性株）、これら生存細胞のほとんどがコングルチニンを有意に高いレベルで産生していた。クローニングを繰り返しながら培養を継続したところ、１μｇ／ｍｌ（４日間）を越える高水準のコングルチニン産生クローンが多数得られ、うち最も高い産生レベルを示したものは６．８μｇ／ｍｌであった。従って、トランスポゾン配列を由来とするような天然型の配列でも挿入配列としての条件を満たしていれば、高生産性のＧ４１８耐性株を獲得できることが証明された。この実験では、細胞株の安定化後培地中のＦＣＳレベルを下げ無血清培地であるＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ社、ハイポキサンチンとチミジンが含まれていない）への馴化を行ったところ、充分に適応することが判明しコングルチニンの生産性にも有意な低下は認められなかった。
【００５２】
（ｂ）Ｇ４１８耐性細胞株の遺伝子増幅
Ｇ４１８耐性細胞株のうち、コングルチニン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた後に、ＭＴＸによる遺伝子増幅を行った。始めに１０ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間培養後、５０ｎＭのＭＴＸを含む培地でさらに２週間増幅させたところ、コングルチニンの産生レベルは培地当たり１８．６μｇ／ｍｌ（４日間）に上昇した。遺伝子増幅に用いるＭＴＸ濃度は一般に１０ｎＭ〜１０μＭの間の多段階とされ、最終濃度としては１μＭがよく用いられるが、細胞に対する毒性の問題から高濃度暴露は安定な組換細胞株の樹立には問題がある。このため低濃度ＭＴＸで高生産性が達成できることも重要な評価基準となり、本実験では５０ｎＭまでとした。また通常セレクションを含めたＭＴＸ暴露期間は６−１２ヶ月とされるのに対して、本実験では約４週間で行った。こうした実験条件にも拘わらず有効なコングルチニンの産生量増加がみられ、遺伝子増幅系に関しても本発現ベクターの高い性能が確かめられた。多くの論文が示唆するように、毒性がほとんど問題とならない範囲（＜１μＭ）でＭＴＸの濃度レベルを上げるかまたはＭＴＸ暴露時間を長くすることによりさらに高い生産性が期待できる。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００５４】
【実施例１】
（１）バックボーンベクターｐＢＢＶの作製
プラスミドｐＵＣ１８に新たに組み入れるマルチクローニングサイト用のリンカー（ＢＢＶリンカー）として、配列番号１に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号２に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。このリンカーの制限酵素切断配列は，３’−ＮｄｅＩ−ＳａｃＩＩ−ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｐｌＩ−ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ−５’とし、５’末端は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ）とした。プラスミドｐＵＣ１８（宝酒造株式会社、１ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＰｖｕＩＩで処理することによりｌａｃＺをコードする領域を完全に除去した。この溶液に対して、ＢＢＶリンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造株式会社）のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地（東洋紡株式会社）を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＢＢＶリンカーのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＢＢＶとした。
【００５５】
（２）ＳＶ４０関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ３の作製
プラスミドｐＵＣ１１９のマルチクローニングサイトを除去して新たに組み入れるマルチクローニングサイト用のリンカー（ＣＶ３リンカー）として、配列番号３に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号４に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。このリンカーの制限酵素切断配列は、５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ ３’とし、３’末端はＢｌｕｎｔ Ｅｎｄとした。プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造株式会社、１ｎｇ（０．１μｌ））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＣＶ３リンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＣＶ３リンカーのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＣＶ３とした。
【００５６】
（３）弱化ＳＶ４０プロモーター（ＰＳＶ４０ＤＥ）の作製
（ａ） 弱化ＳＶ４０プロモーター（ＤＨＦＲシストロン用）の作製
プラスミドｐＳＶ４０／ＢＲからＳＶ４０ Ｏｒｉを含むＳＶ４０初期プロモーターを切り出すため、配列番号５に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＳ１）と配列番号６に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＳ２）を合成した。ＰＳ１プライマーの５’側末端には、元の配列のＰｖｕＩＩサイトを変更してＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを付与した。また、ＰＳ２プライマーの３’側末端には、元のＨｉｎｄＩＩＩサイトを変更してＰｓｔＩサイトを付与した。ｐＳＶ４０／ＢＲゲノム（ｐＳＶ４０／ＢＲ由来， 広島大学より入手）１ｎｇ（０．１μｌ）に対して、これらのＰＳ１プライマーとＰＳ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ， １００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ， １０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ），酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＳａｃＩＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＰｓｔＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．３５ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００５７】
プラスミドｐＣＶ３をＳａｃＩＩおよびＰｓｔＩで処理した後の溶液に対して、上記のＤＮＡ溶５μｌを加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振とう培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＳＶ４０プロモーターＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＳＶ０ａとした。さらにこのプラスミドについて制限酵素ＳｐｈＩでセルフライゲーション（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行いエンハンサー部分を除去することにより、５’末端にＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトがついたＰＳＶ４０ＤＥを有するプラスミドｐＳＶＰ１ａを作製した。
【００５８】
（ｂ）弱化ＳＶ４０プロモーター（ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用）の作製
配列番号５に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＳ１）の代わりに、配列番号７に示す塩基配列を有する別の５’センスプライマー（ＰＳ３）を合成して用いた点を除き、上記（ａ）項に記載の弱化ＳＶ４０プロモーター（ＤＨＦＲ遺伝子シストロン用）の作製と同様の方法で、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用の弱化ＳＶ４０プロモーターＰＳＶ４０ＤＥを有するプラスミドｐＳＶＰ１ｂを作製した。このＰＳ３プライマーは、５’末端にＳａｃＩＩサイトのみをつけたものである（ＥｃｏＲＩサイトは付けない）。３’アンチセンスプライマーは同じもの（ＰＳ２：配列番号６）を使用した。
【００５９】
（４）ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡの調製
プラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−ＡのＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナル配列の３’末端ＥｃｏＲＩサイトにＳＰＳＶ４０リンカーをライゲートすることによりＥｃｏＲＩサイトをつぶし、ＡｐａＩ−ＣｌａＩサイトに変更した。まずＳＰＳＶ４０リンカーとして、配列番号８に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号９に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。プラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−Ａ １ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＩでダイジェストした後、得られた溶液に対してＳＰＳＶ４０リンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＳＰＳＶ４０リンカーのＤＮＡが挿入されているものを選びｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂとした。
【００６０】
（５）弱化ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを組み込んだカセットの作製
（ａ） ＤＨＦＲ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１の作製
プラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂ １ｎｇ（０．１μｌ）に制限酵素ＢａｍＨＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＣｌａ Ｉ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いて５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．８ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。一方、プラスミドｐＳＶ１ａを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで処理した後、得られた溶液１ｎｇ／０．１μｌに対して上記のＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振とう培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＳＶ４０ ｐｏｌｙ ＡのＤＮＡが挿入されているものを選びｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１とした。
【００６１】
（ｂ） ＮＥＯｒ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２の作製
上記（ａ）項に記載のｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１作製と同様の方法で、ｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂから得られたＳＶ４０ ｐｏｌｙＡのＤＮＡとプラスミドｐＳＶＰ１ｂをもとに、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用の弱化ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０ ｐｏｌｙＡをもつプラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２を作製した。
【００６２】
（６） ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつカセットベクターの作製
（６−１） ＤＨＦＲ遺伝子のクローニング
（ａ） ＤＨＦＲ ｍＲＮＡの単離
マウス繊維芽細胞株３Ｔ３を培養し１０７ｃｅｌｌｓを得た後、グアニジンイソチオシアネート法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２，２１９頁，１９８７年）によりｍＲＮＡを分離した。まずフラスコ中に細胞を浮遊させ、得られた細胞を滅菌処理したＰＢＳ中に再度浮遊させ遠心分離用チューブに移した。温度条件０℃下で４５０×Ｇ，１０分間の遠心分離を行い、上清は廃棄した。６ＭのＧＴＧ−ＣｓＣｌ，１０ｍＭクエン酸ナトリウム，０．１ｍｌβ−メルカプトエタノールおよび０．５％サルコシルの混合溶液に得られた細胞を加えて懸濁・溶解し、これを１８ゲージの注射針を通してＲＮＡを断片化した。このようにして得たもの２．５ｍｌを、超遠心管中の５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ液２．５ｍｌの上に重層した。これを超遠心機を用いて３５，０００ｒｐｍで８時間遠心し、上清を注意深く捨てた後に、底に沈殿したＲＮＡ分画をフェノールで抽出し飽和させた滅菌水に溶解した。これにエタノールを加えて、１２，０００ｒｐｍの遠心でＲＮＡを沈殿させた。ついで沈澱物をエタノールで３回洗浄したのち風乾した。得られたＲＮＡを３ｍｌのＲＮａｓｅフリーの水に再懸濁した。こうして得られたｍＲＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍの吸光度により、約０．３μｇ／μｌであった。
【００６３】
（ｂ） ＤＨＦＲ ｃＤＮＡの調製
ＤＨＦＲの遺伝子をＰＣＲ増幅するために、配列番号１０に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＤ１）と配列番号１１に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＤ２）を合成した。５’側末端はＰｓｔＩサイトとナンセンスなピリミジン配列”ＴＣＣＣＴＣ”を人為的に結合された配列とし、３’側末端は終止コドンから約８５ｂ下流にあるＢｇｌＩＩサイトまでを含むものとした。ｃＤＮＡを合成するために、２μｇの全ＲＮＡを含む１０μｌの溶液を用いた。滅菌したＲＮａｓｅフリーのチューブに、ＰＣＲバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌ、オリゴｄＴプライマー２．０μｇ、ＰＣＲ逆転写酵素（２００ ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌに０．５μｌのＲＮａｓｅフリーのＤＥＰＣ水を加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした後、７０℃で１５分間加熱し反応を停止させた。得られたｃＤＮＡは、用意したＰＣＲ用の反応液に直接加えた。この溶液にＰＤ１プライマーとＰＤ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ， １００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ， １０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ （１０ｍＭ ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＢｇｌＩＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．６５ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００６４】
（６−２） ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲの構築
プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩでパーシャルダイジェスチョン処理した（これはＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ中にもＰｓｔＩサイトが１ヶ所ふくまれていることによる）。この溶液０．１μｌ（１ｎｇ ＤＮＡ）に対してＤＨＦＲのＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、５’末端はＰｓｔＩで、また３’末端はＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの突出末端で結合させた。このときＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＤＨＦＲのＤＮＡが挿入されており、プラスミドがＡｐａＩの制限酵素サイトをもつものを選んだ。なおこのプラスミドからＤＨＦＲ遺伝子を切り出しシークエンシングすることにより、ＤＨＦＲ遺伝子全配列および開始コドン”ＡＴＧ”から（＋４）の位置の塩基が”Ａ”から”Ｃ”に変わっていることを確認した（Ｍｕ−ＤＨＦＲ、配列番号２５）。
【００６５】
（７）ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターの作製
（ａ）トランスポゾン配列を含むＮＥＯｒ遺伝子の調製
ＮＥＯｒ遺伝子領域には、３５４塩基からなる５’上流のトランスポゾン配列とＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域がつながったものを使用した。この配列はＴｎ５由来でｐＳＶ２−ｎｅｏにふくまれているため切り出して使用した。まず、配列番号１２に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＮ１）と配列番号１３に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＮ２）を合成した。ＰＮ１プライマーの５’側末端には、元の配列のＨｉｎｄＩＩＩサイトを変更してＰｓｔＩサイトを付与した。また、ＰＮ２プライマーの３’側末端には、元のＳｍａＩサイトを変更してＢａｍＨＩサイトを付与した。ｐＳＶ２−ｎｅｏゲノム１ｎｇ（０．１μｌ））に対して、これらのＰＮ１プライマーとＰＮ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しそのうちの１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＢａｍＨＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約１．３ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００６６】
（ｂ） ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯの構築
プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩでパーシャルダイジェスチョン処理した（これはＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ中にもＰｓｔＩサイトが１ケ所ふくまれていることによる）。この溶液０．１μｌ（１ｎｇ ＤＮＡ）に対して ＮＥＯｒ遺伝子のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたに ＮＥＯｒ遺伝子を含むトランスポゾン配列ＤＮＡを挿入されているものをＧ４１８耐性で確認して選んだ。
【００６７】
（ｃ） ＮＥＯｒ遺伝子への部分特異的突然変異導入
ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域開始コドン”ＡＴＧ”の直後の塩基”Ａ”を”Ｃ”に変更するため、配列番号２４に示す塩基配列を有する変異導入用アンチセンスプライマーを合成した。ｐＳＶＰ（Ｄ）／ＮＥＯゲノム１ｎｇ（１μｌ）に対して、このアンチセンスプライマーを１００ｐｍｏｌｅ加え、ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝酒造株式会社）を使用して部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ）を誘導した。Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。作製されたプラスミドベクターをｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯとした。トランスポゾン配列から、ＮＥＯｒ遺伝子からなる配列を切り出し、改めてシーケンシングすることにより、これら全体の塩基配列と、ＮＥＯｒ遺伝子開始コドン”ＡＴＧ”の直後の（＋４）の位置の塩基が”Ａ”から”Ｃ”に変わっていることを確認した（Ｍｕ−ＮＥＯｒ遺伝子）。この配列を配列番号２６に示す。
【００６８】
（８）ＭＣＳシストロンをもつカセットベクターの作製
Ａ．ＭＣＳ関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ４の作製
ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトを除去して新たにＭＣＳ関連遺伝子を組み入れるマルチクローニングサイト用のリンカー（ＣＶ４リンカー）として、配列番号１４に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号１５に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。このリンカーの制限酵素切断配列は、３’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ−ＳｐｌＩ−ＥｃｏＲＩ−５’とした。プラスミドｐＵＣ１８ １ｎｇ（０．１μｌ））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで処理した後、得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＣＶ４リンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＣＶ４リンカーのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＣＶ４とした。
【００６９】
Ｂ．ＰＣＭＶの調製と組み込み
（ａ） ＰＣＭＶの調製
プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ／ＥｃｏＨからＰＣＭＶを切り出すため、配列番号１６に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＣ１）と配列番号１７に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＣ２）を合成した。ＰＣ１プライマーの５’側末端にはＥｃｏＲＶサイトをまたＰＳ２プライマーの３’側末端にはＣｌａＩサイトを付与した。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ／ＥｃｏＨゲノム１ｎｇ（０．１μｌ））に対して、これらのＰＣ１プライマーとＰＣ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しうちの１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＥｃｏＲＶ ２０Ｕ（１μｌ）およびＣｌａＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．６ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００７０】
（ｂ） ＰＣＭＶのＭＣＳシストロン関連遺伝子クローニング用プラスミドへの組み込み
一方、組み込まれる側のプラスミドｐＣＶ４ １ｎｇ（１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＣｌａＩで処理した後、得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＰＣＭＶ ＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＰＣＭＶのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＣＶ４／ＣＭＶとした。
【００７１】
Ｃ．ｂＧＨ ｐｏｌｙＡの調製と組み込み
（ａ） ｂＧＨ ｐｏｌｙＡを含むＤＮＡの単離
採取したウシ肝臓細胞組織をドライアイス上でスライスしながら、１００μｇ／ｍｌになるようにプロティネースＫ溶液を加えたバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），１０ｍＭ ＤＥＴＡ， ０．１％ ＳＤＳ）で抽出し穏やかに混合した。５５℃で１時間インキュベートした後、さらに３７℃で一晩インキュベートした。Ｔｒｉｓで平衡化した中性フェノールを等量加え、室温で２０分間穏やかに混合した。室温で２，０００×Ｇ、１０分間の遠心分離を行い、得られた上層（５ｍｌ）を回収し新しいチューブに移した後、再度同じ条件で遠心分離を行った。再度上層を回収し新しいチューブに移した後、２倍量の１００％エタノールを重層し、ゆっくりとかきまぜながらバッファーとエタノールを混合した。得られたＤＮＡをガラス棒で巻き取って回収した後風乾し、５ｍｌのＴＥ溶液に入れ４℃で一晩おき溶解した。得られたＤＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍの吸光度により約０．５μｇ／μｌであった。
【００７２】
（ｂ） ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ遺伝子のＭＣＳシストロン関連遺伝子クローニング用プラスミドへの組み込み（１）
ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ配列を二重に接続するために、制限酵素サイトの異なる二種類のｂＧＨ ｐｏｌｙＡ配列を作製した。このためあらかじめ、２組の５’センスプライマーと３’アンチセンスプライマー、すなわち、第一の組み合わせの配列番号１８に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＢ１１）と配列番号１９に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＢ１２）、および、第二の組み合わせの配列番号２０に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＢ２１）と配列番号２１に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＢ２２）を合成した。
【００７３】
得られたＤＮＡ試料のうち１００ｎｇを取り出し、ＰＣＲテンプレートを用いて所望の制限酵素切断配列を両端にもつｂＧＨ ｐｏｌｙＡ配列を作製した。まずＤＮＡ試料１００ｎｇ（１μｌ）に対して、第一の組み合わせのセンスプライマーＰＢ１１とアンチセンスプライマーＰＢ１２をそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ， １００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ， １０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ （１０ｍＭ ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しそのうちの１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＸｂａＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＢｇｌＩＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．２３ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００７４】
プラスミドｐＣＶ４をＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで処理した後の溶液０．１μｌ（１ｎｇ ＤＮＡ）に対して、上記のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにｂＧＨ ｐｏｌｙＡ ＤＮＡが挿入されているものを選びｐＣＶ４／ＣＭＶ−ｂＧＨ１とした。
【００７５】
（Ｃ） ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ遺伝子のＭＣＳシストロン関連遺伝子クローニング用プラスミドへの組み込み（２）
続いて、第一のプライマーの組み合わせでＰＣＲ増幅して得られたＤＮＡ試料のうち１ｎｇ（１μｌ）を取り出し、第二の組み合わせのセンスプライマーＰＢ２１とアンチセンスプライマーＰＢ２２をそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＸｂａＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＢｇｌＩＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．４７ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００７６】
プラスミドｐＣＶ４／ＣＭＶ−ｂＧＨ１をＢａｍＨＩおよびＳｐｌＩで処理した後の溶液０．１μｌ（１ｎｇ ＤＮＡ）に対して、上記のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たに第二のｂＧＨ ｐｏｌｙＡ ＤＮＡが挿入されているもの、すなわちｂＧＨ ｐｏｌｙＡが二重に結合して挿入されているもの（（ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ）２）を選び、これをＭＣＳシストロンをもつカセットベクターｐＥＸＰ−ＢＬ２とした。作製されたｐＥＸＰ−ＢＬ２をＸｂａＩとＳｐｌＩで切り出し、改めてシーケンシングし配列を確認した（配列番号２７）。
【００７７】
（９）発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａの構築
（ａ） ＤＨＦＲシストロンを構成するＤＮＡ配列の組み込み（プラスミドｐＮＯＷ−１の作製）プラスミドｐＳＶ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ １００ｎｇ（１μｌ）に１０×Ｈ溶液１μｌを加え、制限酵素ＥｃｏＲＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付し、ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約１．７５ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ配列はＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成するもので、ＰＳＶ４０ＤＥ、Ｍｕ−ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０ ｐｏｌｙＡからなる。
【００７８】
一方、ＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が組み込まれる側のプラスミドｐＢＢＶ １ｎｇ（１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＡｐａＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成する配列のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＥｃｏＲＶ−ＡｐａＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が挿入されているものを選び出しｐＮＯＷ−１とした。
【００７９】
（ｂ） ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列の組み込み（プラスミドｐＮＯＷ−２の作製）
プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ １００ｎｇ（１μｌ）に１０×Ｈ溶液１μｌを加え、制限酵素ＳａｃＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＣｌａＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付し、ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約２．４ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。この配列はＮＥＯｒシストロンを構成するＤＮＡ配列で、ＰＳＶ４０ＤＥ、トランスポゾン配列、Ｍｕ−ＮＥＯｒ遺伝子およびＳＶ４０ ｐｏｌｙＡからなる。
【００８０】
一方、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が組み込まれる側のプラスミドｐＮＯＷ−１ １ｎｇ（１μｌ）を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＣｌａＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液１ｎｇ（０．１μｌ）に対して、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成する配列のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＳａｃＩ−ＣｌａＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱した コンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が挿入されているものを選んだ（ｐＮＯＷ−２Ｐ）。
【００８１】
得られたプラスミドｐＮＯＷ−２ＰのマルチクローニングサイトのＣｌａＩサイトを除去するため、ＡｐａＩ−ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ部分を新たに合成したＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶリンカーで置換することによりＣｌａＩサイトを除去した。まずこのリンカーとして、５’−ＣＧＡＴ−３’の塩基配列を有するセンスＤＮＡと３’−ＣＧＧＧＣＴＡ−５’の塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。プラスミドｐＮＯＷ−２Ｐ １ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＡｐａＩおよびＥｃｏＲＶでダイジェストした後、得られた溶液に対して、ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶリンカーセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＣｌａＩでダイジェストできないものを選び出しｐＮＯＷ−２とした。
【００８２】
（ｃ） ＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列の組み込み（プラスミドｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａの作製）
プラスミドｐＥＸＰ−ＢＬ２ １００ｎｇ（１μｌ）に１０×Ｈ溶液１μｌを加え、制限酵素ＥｃｏＲＶ ２０Ｕ（１μｌ）およびＳｐｌＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約１．１ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ、遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。この配列はＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列で、ＰＣＭＶ、ＭＣＳ−Ｂ、および（ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ）２からなる。
【００８３】
一方、ＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列が組み込まれる側のプラスミドｐＮＯＷ−２ １ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳｐｌＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液１ｎｇ（０．１μｌ）に対して、ＭＳＣシストロンを構成する配列のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｌＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＭＳＣシストロンを構成するＤＮＡ配列が挿入されているものを選んだ。こうして作製された発現ベクターをｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａとした。この発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａについて、構成する各部分を制限酵素により断片化し、それぞれをシーケンシングしつなぎあわせることにより、各遺伝子配列が正しく挿入されていることを確認した。
【００８４】
【実施例２】
（１）合成リンカー挿入配列をもつ発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡの構築
（ａ） 合成リンカーの作製
トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類のアミノ酸配列をコードし得る配列をすべて含むことよりなる遺伝子配列を調製するために、第一配列として、配列番号３０に示す塩基配列を有するリンカー（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ １（＋））と配列番号３１に示すその相補配列（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ １（−））を合成した。次に、第二配列として配列番号３３に示す塩基配列を有するリンカー（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ ２（−））と配列番号３２に示すその相補配列（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ ２（＋））を合成した。ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ １（＋）の５’末端にはＰｓｔＩサイト、３’末端にはＭＳＲ−ｌｉｎｌｅｒ ２とアニーリングして接続するための配列”ＣＣＡＡＧＣ”が付与されている。また、ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ ２（−）の３’末端にはＥｃｏＲＶサイト、５’末端には第一配列とアニーリングして接続するための配列”ＧＧＴＴＣＧ”が付与されている。
【００８５】
（ｂ） ２つのリンカーの接続
ＰＣＲテンプレートを用いて所望の制限酵素切断配列を両端にもつＭＳＲリンカー配列を作製した。第一の組み合わせのセンスＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ １（＋）とアンチセンスＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ １（−）をそれぞれ１００ｐｍｏｌｅを用意し、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ， １００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ， １０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ （１０ｍＭ ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＥｃｏＲＶＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．１ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００８６】
プラスミドｐＵＣ１８をＰｓｔＩおよびＳｍａＩで処理した後の溶液０．１μｌ（１ｎｇ ＤＮＡ）に対して、上記のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＭＳＲリンカーＤＮＡが挿入されているものを選びｐＵＣ１８／ＭＳＲとした。
【００８７】
（ｃ） Ｍｕ−ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域の切り出し
ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯからＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域を切り出すため、配列番号３４に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＮＥＯ−Ｎ’１）と配列番号３５に示す３’アンチセンスプライマー（ＮＥＯ−Ｎ’２）を合成した。ＮＥＯ−Ｎ’１プライマーの５’末端にはＥｃｏＲＶサイトが、ＮＥＯ−Ｎ’２の３’末端にはＢａｍＨＩサイトを付与した。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａゲノム １ｎｇ（０．１μｌ））に対して、これらのＮＥＯ−Ｎ’１プライマーとＮＥＯ−Ｎ’２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＥｃｏＲＶ ２０Ｕ（１μｌ）およびＢａｍＨＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．８ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００８８】
（ｄ） ＭＳＲリンカーとＮＥＯｒの接続
ＰＣＲテンプレートを用いてＭＳＲリンカー配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した。上記（ｂ）および（ｃ）で調製された各配列のＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅを用意し、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ ＤＴＴ １．０μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ０．５μｌ（１０ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ ２０Ｕ（１μｌ）およびＢａｍＨＩ ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．９ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００８９】
（ｅ） ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯへの組み込み得られたＤＮＡ（ＭＳＲリンカーとＮＥＯｒの接続配列）を実施例１で得られたプラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯへ組み込んだ。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩでパーシャルダイジェスチョン処理した（これはＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ中にもＰｓｔＩサイトが１ケ所ふくまれていることによる）。この溶液０．１μｌ（１ｎｇ ＤＮＡ）に対してＮＥＯｒ遺伝子のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＭＳＲリンカー配列に接続されたＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子を含むＤＮＡが挿入されているものをＧ４１８耐性で確認して選んだ（ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａ）。
【００９０】
（ｆ） 発現ベクター ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡの構築
以下、実施例１と同様の方法で、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−ＡからＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列を切り出してプラスミド ｐＮＯＷ−１に組み込むことによりｐＮＯＷ−２ＰＡを作製した。さらに実施例１と同様の方法でｐＮＯＷ−２に対応するｐＮＯＷ−２Ａを作製し、続いてプラスミドｐＥＸＰ−ＢＬ２から切り出したＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列をｐＮＯＷ−２Ａに組み込んだ。こうして作製されたＮＥＯｒ遺伝子シストロンに合成リンカー挿入配列をもつ発現ベクターをｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡとした。この発現ベクターについて、構成する各部分を制限酵素により断片化し、それぞれをシーケンシングしつなぎあわせることにより、各遺伝子配列が正しく挿入されていることが確認した。
【００９１】
【実施例３】
（１）ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡを用いたコングルチニンの産生試験
（ａ） コングルチニンｃＤＮＡの調製とｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡへの組み込み
プラスミドベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのＭＣＳ−Ｂに遺伝子を組み込むために、ウシコングルチニンｃＤＮＡの両端の制限酵素切断配列を配列番号２２に示す塩基配列を有する５’センスプライマーと配列番号２３に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマーを用いて改変した。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ １ｎｇ／０．１μｌを制限酵素ＸｂａＩおよびＮｏｔＩで処理した後、得られたプラスミドを含む溶液１ｎｇ／０．１μｌに対して、コングルチニンｃＤＮＡ末端改変のためのセンスプライマーとアンチセンスプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加えて１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにコングルチニンのＤＮＡが挿入されているものを選んだ。組み込まれたコングルチニン遺伝子を切り出し改めてシーケンシングし塩基配列を確認した（配列番号２８）。
【００９２】
（ｂ） 宿主ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ欠損株）への遺伝子導入
子牛胎児血清（ＦＣＳ， ＧＩＢＣＯ社）を１０％添加したＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を調製し、これにＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞株を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように混合し、直径６０ｍｍのディシュに植え、３７℃， ５％ ＣＯ２の条件で２４時間培養した。培養上清を廃棄し、その代わりにあらかじめリポフェクチン溶液（ＢＲＬ社）と混合した５μｇのＤＮＡ（コングルチニン遺伝子を組み込んだｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ）を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地５ｍｌを加え１６時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理によりディシュより回収し、細胞数を数えた後１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように４００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地に細胞を懸濁し、これを０．１ｍｌ／ウエルになるように９６ウエルのマイクレプレート２枚に播種した。３７℃，５％ ＣＯ２の条件で２週間培養したところ１９２ウエル中３３ウエルにおいてのみ生存細胞がみられＧ４１８耐性を獲得した細胞の増殖をみた。
【００９３】
（２）コングルチニン産生試験
（ａ） Ｇ４１８耐性細胞の増殖とコングルチニン産生レベル測定試験
コングルチニン産生レベルを確認したところ、殆どのＧ４１８耐性株において高水準であったが、これらのうちから代表的な５クローンを選んでクローニングを２回繰り返した。続いて、１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地にＧ４１８耐性細胞を混合し（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度）、細胞クローン５ｍｌをそれぞれ２５ｃｍ２のカルチャーフラスコに植えた。細胞がコンフルエントになるまで培養し細胞数を測定したところ２×１０６ｃｅｌｌｓであった。それぞれのディシュの培養上清を廃棄し、同じ組成の１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地を２ｍｌ加え、４日間培養し、その培養上清を回収した。コングルチニンの産生量を測定したところ、全てのディシュで１４μｇ／２ｍｌを超えていることが判明した。産生量を表１に示す。最も産生レベルの高かったクローン７−３は１１．８μｇ／ｍｌに達した。
【００９４】
【表１】
【実施例４】
（１）ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを用いたコングルチニンの産生試験
（ａ） コングルチニンｃＤＮＡのｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａへの組み込みと宿主ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ欠損株）への遺伝子導入
実施例３と同様の方法で、ウシコングルチニン遺伝子をプラスミドベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡのＭＣＳ−Ｂに組み込んだ。子牛胎児血清（ＦＣＳ， ＧＩＢＣＯ社）を１０％添加したＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を調製し、これにＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞株を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように混合し、直径６０ｍｍのディシュに植え、３７℃， ５％ ＣＯ２の条件で２４時間培養した。培養上清を廃棄し、その代わりにあらかじめリポフェクチン溶液（ＢＲＬ社）と混合した５μｇのＤＮＡ（コングルチニン遺伝子を組み込んだｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ）を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地５ｍｌを加え１６時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理によりディシュより回収し、細胞数を数えた後１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように４００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地に細胞を懸濁し、これを０．１ｍｌ／ウエルになるように９６ウエルのマイクロプレート１０枚に播種した。３７℃，５％ ＣＯ２の条件で２週間培養したところ９６０ウエル中４８ウエルにおいてのみ生存細胞がみられＧ４１８耐性を獲得した細胞の増殖をみた。
【００９６】
（２）コングルチニン産生試験
（ａ） Ｇ４１８耐性細胞の増殖とコングルチニン産生レベル測定試験
コングルチニン産生レベルを確認したところ、殆どのＧ４１８耐性株において高水準であったが、これらのうちから代表的な５ウエルを選んでクローニングを２回繰り返した。続いて、１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地にＧ４１８耐性細胞を混合し（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度）、細胞クローン５ｍｌをそれぞれ２５ｃｍ２のカルチャーフラスコに植えた。細胞がコンフルエントになるまで培養し細胞数を測定したところ２×１０６ｃｅｌｌｓであった。それぞれのディシュの培養上清を廃棄し、同じ組成の１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地を２ｍｌ加え、４日間培養し、その培養上清を回収した。コングルチニンの産生量を測定したところ、全てのディシュで４μｇ／２ｍｌを超えていることが判明した。産生量を表２に示す。最も産生レベルの高かったクローン１１Ａは６．８μｇ／ｍｌに達した。
【００９７】
【表２】
（ｂ） ＭＴＸによるプラスミド遺伝子増幅
コングルチニン産生クローンをさらに継代培養し安定化させた後、低濃度のＭＴＸを培地に加え遺伝子増幅を行った。第一段階として、ＭＴＸ １０ｎＭ，Ｇ４１８ ２００μｇ／ｍｌを加えた１０％ＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社，ハイポキサンチンとチミジンが含まれていない）にセレクトした細胞クローン１１Ａを混合し、２５ｃｍ２のカルチャーフラスコに植えコンフルエントになるまで培養した（２週間）。培養上清を廃棄し、同じ組成のＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地（１０ｎＭ ＭＴＸ，２００μｌ／ｍｌ Ｇ４１８を加えたもの）を２ｍｌ加え４日間培養した後、培養上清を回収しコングルチニンの産生レベルを測定した。続いて、ＭＴＸ ５０ｎＭ，Ｇ４１８ ２００μｇ／ｍｌを加えた１０％ＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地で再度コンフルエントになるまで培養した（２週間）。培養上清を廃棄し、同じ組成のＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地（５０ｎＭ ＭＴＸ，２００μｌ／ｍｌ Ｇ４１８を加えたもの）を２ｍｌ加え４日間培養し、培養上清を回収しコングルチニンの産生レベルを測定した。結果は表３の通りであった。得られた細胞は極めて増殖速度が遅く、アダプテーションが進んで増殖が早くなればさらに高いレベルの生産性に達すると思われた。
【００９９】
【表３】
【実施例５】
（１）ヒトＩＦＮ−β産生試験
実施例４と同様の手順で、ヒトＩＦＮ−β（Ｇｅｎｅ，１０，１１頁，１９８０年）のｃＤＮＡを繊維芽細胞よりクローニングした後ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａに組み込み、さらにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株に遺伝子導入した。Ｇ４１８セレクション後ヒトＩＦＮ−βの産生レベルをみたところ表４の通りであった。なお、ＩＵは抗ウイルス活性により求めた値である。
【０１０１】
【表４】
（２）ＭＴＸによるプラスミド遺伝子増幅
実施例４と同様の手順でヒトＩＦＮ−β産生クローン７２を低濃度のＭＴＸ培地に加え、遺伝子増幅を行った。まずＭＴＸ ５０ｎＭで増幅した後、ヒトＩＦＮ−β産生レベルを測定したところ表５の通りであった。
【０１０３】
【表５】
（３）ヒトＩＦＮ−β産生クローンの無血清培地への馴化
ヒトＩＦＮ−β産生クローン７２を５０ｎＭ ＭＴＸで遺伝子増幅したクローン７２２２について無血清培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ， ＧＩＢＣＯ社， ヒポキサンチンとチミジンが含まれていない）に２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８， ５０ｎＭ ＭＴＸを加えた培地で馴化した。
【０１０５】
馴化後にヒトＩＦＮ−β産生量を測定した結果、４７３，９００ＩＵ／ｍｌであり、１０％ＦＣＳ添加時とほぼ同等の結果を得た。
【０１０６】
（４）無血清培地を用いたヒトＩＦＮ−β産生試験
実施例５（１）で得たヒトＩＦＮ−βｃＤＮＡを組み込んだｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを、無血清培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ， ＧＩＢＣＯ社， ヒポキサンチンとチミジンが含まれていない）で馴化したＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株に遺伝子導入し、同培地に２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を加えた培地でセレクション後、ヒトＩＦＮ−βの産生量を測定したところ、表６の通りであった。
【０１０７】
【表６】
本発明により、哺乳動物細胞を宿主として高水準の遺伝子組換タンパク質生産を可能にする発現ベクターを提供することができる。
【０１０８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バックボーンベクターｐＢＢＶリンカー作製のフローチャートを示す。
【図２】図２は、ｐＣＶ３（ＳＶ４０関連遺伝子クローニング用）作製のフローチャートを示す。
【図３】図３は、ｐＣＶ４（ＭＣＳ関連遺伝子クローニング用）作製のフローチャートを示す。
【図４】図４は、ＤＨＦＲカセット構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１作製のフローチャートを示す。
【図５】図５は、ＮＥＯカセット構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２作製のフローチャートを示す。
【図６】図６は、ＤＨＦＲカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ作製のフローチャートを示す。
【図７】図７は、ＮＥＯカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ作製のフローチャートを示す。
【図８】図８は、ＭＣＳカセットベクターｐＥＸＰ−ＢＬ２作製のフローチャートを示す。
【図９】図９は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ構築のフローチャートを示す。
【図１０】図１０は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａのマップを示す。
【図１１】図１１は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ構築のためのｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａ構築のフローチャートを示す。
【図１２】図１２は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのマップを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an expression vector for a mammalian cell that enables high-level production of a recombinant protein using the mammalian cell as a host. The expression vector of the present invention is particularly suitable for production of a protein whose activity is hardly obtained by genetic recombination using Escherichia coli or yeast as a host.
[0002]
[Prior art]
Many expression vectors used for recombinant protein production have been developed, and high yields can be expected particularly in expression systems using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as hosts. However, expression systems using these microorganisms as hosts may have problems in protein modification or lose characteristics unique to mammalian proteins. Therefore, for example, in the case of a protein whose biological activity depends on a sugar chain, it is necessary to produce the protein using a mammalian cell as a host. Despite these demands, the productivity of a recombinant protein expression system using mammalian cells as a host is generally low, and there are often problems with the stability of the transgene.
[0003]
Examples of recombinant protein production using mammalian cells as a host include tissue plasminogen activator (JP-A-59-183693; DNA, p. 7,651, 1988), erythropoietin (J. Fermentation Bioengineering). Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6465, 1986; Biotechnology, 6, 67, 1988), IFN-γ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80.4564, 1983), IFN-β (Cytotechnology, 4, 173, 1990) and the like. There are also many reports on recombinant production of monoclonal antibodies (Biotechnology, 10, 169, 1992; J. Immunol. Methods, 125, 191, 1989; Biotechnology, 10, 1455, 1992). ).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Increasing the productivity of a recombinant protein using mammalian cells is very important in the production of proteinaceous drugs, diagnostics, and the like. It also provides an effective means for their development research. Therefore, there is a need for an expression vector that enables efficient gene transfer and high productivity using mammalian cells, particularly Chinese hamster ovary cells (CHO cells) as a host.
[0005]
Efficient gene transfer means that the number of cell clones that effectively produce the target substance in the whole recombinant cells is relatively small, thereby facilitating selection of high-productivity clones. The expected value for the appearance of high-productivity clones is high despite the small population of protein-producing cells. If the population of the obtained cells is large, the selection requires much time and labor and the efficiency is low. It is also likely that clones with potentially high productivity will be overlooked.
[0006]
Acquisition of high productivity means that the production level of the recombinant protein of the cell clone obtained by gene transfer is high, and this is considered to be mainly due to the properties and performance of the expression vector. The level of gene expression has been found to vary significantly with chromosomal location (Annu. Rev. Cell Biol., 6, 679, 1990).
[0007]
[Means for Solving the Problems]
[0008]
The present inventors did not achieve high expression by increasing the copy number of the gene to be integrated by gene transfer, but a plasmid gene integrated at a high expression position on the host cell chromosome was used as a neomycin resistant strain. As a result, we have developed an expression vector with a mechanism to be selected. The high productivity of the initial clone as a G418 resistant strain after gene transfer was determined by neomycin phosphotransferase (hereinafter NEO). r Depends on the mechanism of gene expression. In addition, the expression vector has a dihydrofolate reductase (hereinafter referred to as DHFR) gene, and by devising its expression inducibility, an expression vector that enables efficient gene amplification by drug stimulation was developed. As a result, an expression vector capable of producing a stable protein at a high level could be produced, and the present invention was completed.
[0009]
NEO to be introduced r If the gene expression does not occur or is too low, the recombinant host cell will not be able to acquire resistance to neomycin (hereinafter represented by G418). However, the work we have done so far has shown that NEO containing commercially available vectors r In all cases using gene-containing expression vectors, a very large number of G418 resistant strains were obtained. Based on these results, NEO provided by the plasmid r It was presumed that the expression of the gene hardly contributed to the cells obtained as a result of transfection, except for its role as a selection marker for determining whether or not the cells were transformants.
[0010]
We have developed NEO r By making the mechanism of expression even more restrictive, NEO r Unless the gene cistron is integrated into a high expression position on the host cell chromosome, the level of NEO required for G418 resistance acquisition r It was designed so that no expression occurred. That is, NEO r By making the expression of the gene extremely degraded and attenuated, even if it is a transformant, it can be selected for G418 selection in the medium, unless the plasmid gene to be integrated is introduced into a position having extremely high expression on the chromosome. On the other hand, it was difficult to survive. NEO of expression vector r There have been several reports using a weak promoter for the gene cistron (Mol. Cell Biol., 3: 1246, 1983; Mol. Cell Biol., 6, 2593, 1986; Mol. Cell Biol., 7). , P. 1296, 1987; DNA, p. 7, 651, 1988). In these cases, it is unlikely that a highly productive transformant has been effectively and sufficiently selected.
[0011]
The present invention relates to NEO r As a constitution of the gene cistron, a promoter with reduced expression inducibility is used, and the promoter and NEO are used. r Insertion (insertion sequence) of a DNA sequence comprising at least one set of sequences capable of encoding an amino acid sequence with the gene translation region, or NEO in a host cell transformed by gene transfer r Has a similar structure in that the expression mechanism of E. coli is significantly depleted and attenuated, so that NEO in a host cell transformed by gene transfer is reduced. r Is significantly consumed and attenuated. NEO of the present invention r The gene cistron is different from the gene having only a weakened promoter, and leads to specifically obtain a G418-resistant strain in which a plasmid gene has been introduced into a high expression position. r Gene cistron "is defined.
[0012]
That is, the present invention relates to the method of r An expression vector having a gene cistron and a strong expression inducible promoter is provided. The vector induces high productivity of the recombinant protein in a mammalian host cell.
[0013]
The “consumable NEO” r The gene cistron promoter is derived from a promoter of a protein gene that is normally not easily expressed in mammalian cells, a promoter of a virus antigen that is normally difficult to infect mammals, or an enhancer is removed from any of these promoters. More specifically, whether the enhancer region has been removed from the viral antigen promoter of SV40, which is normally non-infectious to CHO cells (Mol. Cell Biol., 6, 2593, 1986) ) Or a promoter with a sufficiently low expression level is preferably used. The insertion sequence is, for example, “NEO as the starting unit as a constituent unit of a triplet. r The insertion sequence preferably comprises at least one sequence which can encode an amino acid sequence corresponding to the start position of the gene translation region. r A sequence that can encode an amino acid sequence that is shifted by one or two bases from that of the gene translation region ”, preferably having at least two types, more preferably including all three types. For the DNA sequence as the insertion sequence, a linker artificially synthesized based on such conditions can be used, but if a naturally occurring sequence that satisfies the conditions is derived from it. For example, a transposon sequence such as transposon Tn5 (Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 45, 107, 1981) may be used as a constitutional unit of a triplet. Contains all sequences that can code for three different amino acid sequences at different positions Cage, it is possible to produce those which satisfy the conditions by using a suitable region of the sequence. The length of the insertion inlet sequence, NEO r It may be sufficient as long as it reduces the expression of the amino acid sequence, and varies depending on the number of sequences that can encode the amino acid sequence, but is usually 30 to 1000 nucleotides, preferably 100 to 400 nucleotides. It is. NEO r The bases at positions corresponding to the Kozak consensus sequence (Nucleic Acids Res., 15, 8195, 1987) before and after the gene translation region start position (specifically, (−6), (−3), (+4)) are Desirably, it is a pyrimidine base or modified to a pyrimidine base.
[0014]
Integration of the plasmid DNA into a strongly expressing location on the host cell chromosome is performed by NEO r Due to the properties of the gene cistron, G418 selection is eventually achieved, but the expression itself of the target protein at that position on the chromosome needs to be strongly induced. For this reason, a promoter and a polyadenylation signal (hereinafter, referred to as polyA) of a multicloning site (hereinafter, referred to as MCS) incorporating a protein gene are selected from those having the strongest expression inducibility. Examples of the promoter include a human cytomegalovirus Immediate Early (hCMV MIE: Cell, 41, 521, 1985) promoter, β-actin promoter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4831, 1987), The polyA signal includes a polyA sequence derived from bovine growth hormone (DNA,
[0015]
The present invention also provides a method for obtaining a highly productive transformant of a protein that is a G418-resistant cell clone, comprising transforming a host cell by gene transfer using the above-described expression vector into which the protein gene has been incorporated. I do.
[0016]
The expression vector preferably also has a DHFR gene cistron. This vector uses CHO cells deficient in dihydrofolate reductase as mammalian host cells, and allows efficient amplification of the plasmid gene by methotrexate after gene transfer of the plasmid gene into the host cell.
[0017]
In the DHFR gene cistron, NEO r As in the case of the gene cistron, a promoter whose expression inducibility has been reduced, for example, a promoter obtained by removing the enhancer region from the SV40 virus antigen promoter which is normally non-infectious to CHO cells is used. More preferably, the base at the position corresponding to the Kozak consensus sequence before and after the start position of the DHFR gene translation region is a pyrimidine base or modified to a pyrimidine base. In order to promote gene amplification, a method is known in which the affinity for methotrexate (hereinafter, referred to as MTX) is reduced by introducing a mutation into the DHFR gene to be introduced (JP-A-59-192089). Publication), the present inventors weaken or suppress the expression inducibility of the DHFR gene, thereby guiding MTX contained in the medium to promote the amplification of plasmid DNA integrated into the host cell chromosome. I thought it was more effective.
[0018]
The present invention also provides a method for obtaining a highly productive transformant of a protein, which comprises transforming a host cell by gene transfer using an expression vector also having the DHFR gene cistron into which the protein gene has been incorporated.
[0019]
The present invention further comprises transforming a host cell by gene transfer using the above-described expression vector into which a protein gene has been incorporated, and adapting the resulting transformant to a serum-free medium, which is stable in a serum-free medium. The present invention provides a method for obtaining a highly productive transformant of a protein capable of producing a high-level protein.
[0020]
The present invention also provides an expression vector having a multicloning site for gene integration having the DHFR gene cistron and a strong expression inducible promoter. This expression vector contains the consumable NEO r It can be used for the construction of an expression vector having a gene cistron.
[0021]
In the present invention, “a promoter with low expression inducibility” refers to a promoter generally used for protein expression, for example, the expression of a protein as compared to the case where it is induced by an SV40 promoter, an LTR promoter, a β-actin promoter, or the like. Means a weak promoter. The term "sequence capable of encoding an amino acid" refers to a sequence having a corresponding initiation codon and a termination codon and having a gene sequence capable of encoding a peptide between the initiation codon and the initiation codon. Is desirable. The term “cistron” means a unit that expresses a protein by transcription / translation based on a promoter, a structural gene, and a polyadenylation signal (polyA), and is related to any of these or an arbitrary DNA sequence. May be included as an insertion sequence. The term "strong expression inducible promoter" refers to a promoter generally used for protein expression in a normal expression vector, and is preferably a human cytomegalovirus Major Immediately-Early having particularly high expression inducibility. It means a promoter such as an antigen promoter and a β-actin promoter.
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The expression vector of the present invention comprises NEO on a backbone vector. r It can be obtained by incorporating a gene cistron, MCS cistron, and further incorporating a DHFR gene cistron. There is no particular limitation on the backbone vector. For example, a plasmid vector having an E. coli replication origin (ColE1 ori) and an ampicillin resistance gene (pUC system: Gene, 33: 103, 1985, pBR322 etc .: Gene, 22, 277, 1983) can be used.
[0023]
As a method of using the vector of the present invention, after incorporating a protein gene into the MCS of the vector of the present invention, the gene is introduced into a host cell by the lipofectin method or electroporation, and selection is performed only by resistance to G418. A method for obtaining a productive transformant is exemplified. Many of the cells that survived the selection have already achieved relatively high expression levels, but protein expression levels may be assayed to select for cells with higher productivity. The obtained highly productive cells are repeatedly passaged and stabilized after repeated cloning. When it is desired to obtain a strain having a higher productivity, a vector having a DHFR gene cistron is used as the vector of the present invention, and MTX is added to the medium to stimulate the DHFR gene integrated in the host cell, thereby amplifying the gene. Do. In general, MTX is used not only for amplification of the DHFR gene, but also for selection of gene-incorporated cells alone or in combination with neomycin (J. Mol. Appl. Genet., 1, 165, 1981; J. Mol. Biol. , 159, 601 (1982)). r The roles of the gene and the DHFR gene were assumed to be shared. That is, NEO r Is for selection and DHFR is for amplifying the integrated plasmid vector gene.
[0024]
Hereinafter, the method for producing the expression vector of the present invention will be described with reference to specific examples. Note that it is easy for those skilled in the art to replace the starting plasmid, promoter, and other components used in this specific example with equivalent components.
[0025]
<1> Construction of backbone vector [pBBV]
The backbone vector pBBV is obtained by completely removing the lacZ region of the plasmid pUC18 (Gene, 33, p. 103, 1985) and replacing the cleavage site with a newly synthesized linker having a multiple restriction enzyme cleavage site (BBV linker). Produce. FIG. 1 shows a flowchart of pBBV production. pBBV is composed of E. coli replication origin (ColE1 ori) and ampicillin resistance gene (Amp r ).
[0026]
<2> Preparation of plasmid for gene cloning
(A) Construction of plasmid [pCV3] for cloning SV40-related gene
It is prepared by replacing the multiple cloning site of the plasmid pUC119 (Gene, 33, p. 103, 1985) with a newly synthesized linker having a multiple restriction enzyme cleavage site (CV3 linker). FIG. 2 shows a flowchart of the production of pCV3.
[0027]
(B) Preparation of plasmid [pCV4] for gene cloning having MCS cistron
The plasmid pUC18 is prepared by removing the existing multiple cloning site and replacing it with a linker (CV4 linker) having a newly synthesized multiple restriction enzyme cleavage site. This is a construction plasmid used in the process of producing MCS cistron. FIG. 3 shows a flowchart of the production of pCV4.
[0028]
<3> Preparation of cassette construction plasmids [pSVP (D) S-1, pSVP (D) S-2]
Plasmid with DHFR gene cistron and NEO r In order to prepare a plasmid having a gene cistron, a plasmid for constructing a cassette having a multiple cloning site between a promoter and a polyadenylation signal (polyA) is prepared in advance. PSVP (D) S-1, NEO for DHFR gene cistron r PSVP (D) S-2 is prepared for gene cistron. The basic configuration is common, and an SV40-derived early promoter (including the SV40 replication origin) is modified as a promoter, and SV40 polyA is employed as a polyadenylation signal. These are prepared by incorporating them into a previously prepared plasmid pCV3 for cloning the SV40-related gene. For DHFR and NEO r The only difference is that the restriction enzyme cleavage sequence at the 5 'end of the SV40 promoter is partially different. FIG. 4 shows a flowchart for producing pSVP (D) S-1 and FIG. 5 shows a flowchart for producing pSVP (D) S-2.
[0029]
(3-1) Preparation of plasmid pSVP (D) S-1 for DHFR gene cistron construction
(A) Selection of promoter
Based on the report that the promoter can be weakened by removing the enhancer portion from the viral antigen promoter region (Mol. Cell Biol., 3, 1246, 1983; Mol. Cell Biol., 6, 2593). Cell Biol., 7.1296, 1987), by removing the enhancer portion of the SV40 early promoter to produce a promoter with low expression inducibility. Specifically, an early promoter sequence containing the SV40 replication origin (Ori) is used after being modified. Specifically, the SV40 early promoter sequence was excised from a plasmid pSB40 / BR (obtained from Hiroshima University) having the SV40 virus total DNA ligated with BamHI on pBR322 using primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 8 and 9. Integration between the SacII-PstI site of pCV3. Subsequently, the enhancer portion was removed by self-ligation between SphI (SphI-SphI) in the 72 bp repeat sequence present in this sequence (Mol. Cell Biol., 3, 1246, 1983). The promoter is weakened. The weakened promoter is P SV40DE The resulting plasmid is called pSVP1a.
[0030]
(B) Selection and setting of polyA signal sequence
810 bases are cut out from plasmid pSV40pA-A (derived from pSV40 / BR, obtained from Hiroshima University) having a polyA signal derived from the SV40 virus genome, and used. In general, SV40 polyA in an expression vector tends to use a short one on condition that it contains a termination signal, but it is preferable to set a sequence long enough to avoid affecting other cistrons. The restriction enzyme cleavage sequence at the 3 'end of this sequence was changed with a newly synthesized linker (SPSV40 linker) (the changed plasmid was pSV40pA-B), and then cut out with BamHI and ClaI and incorporated into pSVP1a to obtain a DHFR gene cistron. The construction plasmid pSVP (D) S-1 is prepared.
[0031]
(3-2) NEO r Preparation of plasmid pSVP (D) S-2 for construction of gene cistron
(A) Selection of promoter
The promoter sequence contains a P40 with a weakened SV40 promoter, similar to the one used for the DHFR gene cistron. SV40DE Is adopted. This is cut out from pSV40 / DR in the same procedure as for DHFR, but a 5 'sense primer from which a part of the restriction enzyme cleavage sequence (EcoRI) is omitted (SEQ ID NO: 7) is synthesized and used. Removal of the enhancer part from the promoter sequence is also performed in the same manner as in the case of the cistron of the DHFR gene, and the resulting plasmid is designated as pSVP1b.
[0032]
(B) Selection and setting of polyA
PolyA was also cut out from pSV40pA-B with BamHI and ClaI in the same manner as for DHFR and incorporated into pSVP1b to obtain NEO. r A vector pSVP (D) S-2 for constructing a gene cistron is prepared.
[0033]
<4> NEO r Construction of cassette vector [pSVP (D) S / NEO] having gene cistron
(4-1) "Consumable NEO" r Preparation of Insertion Sequence for Genetic Gene Cistron
(A) Use of transposon-derived sequences
NEO r In order to deplete the expression mechanism of the gene, at least one set of sequences capable of encoding any amino acid sequence between the promoter and the NEOr gene translation region, preferably all three types having different starting positions as constituent units of triplets, are included. Although they have an inserted sequence, the inventors have found that a transposon sequence (Tn5: Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 45, 107, 1981; Gene, 18, 327, 1982) is a naturally occurring sequence. ) Was found to have a region satisfying the conditions for this inserted sequence. In the transposon sequence portion consisting of 354 bases used in the vectors of the examples of the present invention, a gene sequence capable of encoding any number of amino acid sequences, that is, "ATG" which can be regarded as an initiation codon appears (there are seven in total, and Six have the corresponding stop codon in the sequence, and the seventh "ATG" starting from position (-16) counted from the most downstream translation region has NEO r "ATGATTGA (underlined portion)" immediately after the start codon of the gene translation region corresponds to the stop codon and is completed.) In addition, this sequence includes a sequence capable of encoding all three types of amino acid sequences having different starting positions as a constituent unit of a triplet. Therefore, the transposon sequence is NEO r Although it may be about 270 bp to 190 bp counted upstream from the 5 'end of the gene translation region, at least about 80 bp is desirable even in a short case. The sequence at the 3 'end is NEO. r The base three (-3) before the start codon of the gene is "C", and the base six before (-6) is "T", both of which are pyrimidine bases and have a Kozak common sequence (Nucleic Acids Res. , 15, 8195, 1987). Therefore, this transposon sequence is SV40DE And NEO r By being located between the gene encoding the protein, NEO r It was thought that the gene expression mechanism could be effectively consumed and attenuated.
[0034]
(B) Preparation of artificial linker as insertion sequence
A linker can be artificially synthesized and used as the insertion sequence. In this case, the triplet is designed so as to include, as constituent units of the triplet, sequences encoding all three types of amino acid sequences having different starting positions, and to have a length of about 20 amino acids or more. Each amino acid sequence does not necessarily have to be tandem and may have overlapping shared portions. This linker is P SV40DE And NEO r NEO can be inserted between the gene translation region and NEO. r It is considered that the expression of the gene can be effectively attenuated (hereinafter, this linker is described as an insertion linker). An embodiment using this synthetic linker insertion sequence will be described in <8> below.
[0035]
(4-2) Construction of pSVP (D) S / NEO
(A) When using transposon-derived sequences
NEO r The cassette vector having the gene cistron is P sv40DE (Promoter), insertion sequence (transposon-derived sequence), NEO r It is composed of a gene translation region sequence and SV40 polyA. pSVP (D) S-2 has P SV40DE And SV40 polyA have already been incorporated. r Incorporate the transposon sequence containing the gene. The Tn5 sequence is included in the commonly used pSV2-neo (J. Mol. Appl. Genet., 1, 327, 1982), and is used after being cut out based on this. NEO for pSV2-neo r Since the transposon sequence containing the gene is used in combination with the SV40 promoter having strong expression inducibility, there is no commonality with the use in the present invention. FIG. 7 shows a flowchart of the production of pSVP (D) S / NEO.
[0036]
(B) When using artificial synthetic linker insertion sequence
pSVP (D) S-2 has P SV40DE And SV40 polyA have already been incorporated, and thus can be prepared by incorporating a synthetic linker as an insertion sequence between them. Also, as in the examples of the present invention, the expression vector pNOW / CMV-A finally prepared so as to have a transposon-derived sequence as an insertion sequence was used, and the transposon sequence was replaced with a synthetic linker sequence to express the expression. The vector pNOW / CMV-AA can also be made.
[0037]
(4-3) NEO r Mutagenesis into gene translation sequence
NEO r In order to make the translation initiation part of the gene preferably a typical non-Kozak non-consensus sequence, the base immediately after the start codon "ATG" is changed by point mutation to a pyrimidine base "C" or "T" (actually, Was changed to "C".) By this, NEO r The next amino acid after Met in the gene is changed from Ile to Leu or Phe. NEO after the introduction of this change r Gene is Mu-NEO r It is called a gene. Transposon sequence and Mu-NEO r The sequence consisting of the gene is shown in SEQ ID NO: 26.
[0038]
<5> Construction of cassette vector [pEXP-BL2] having MCS cistron
The MCS cistron is composed of a promoter, a multiple cloning site for integration of a target protein gene (MCS-B), and polyA. As the promoter, the hCMV MIE antigen promoter, which is regarded as one of the promoters having the strongest expression inducibility, is used as the origin (P CMV ). In addition, a bovine growth hormone polyA signal (bGH polyA), which has been reported to have high productivity and excellent reproducibility, is also used for the polyA signal. FIG. 8 shows a flowchart for preparing the cistron vector pEXP-BL2 having the MCS cistron.
[0039]
(A) P CMV Promoter setting range
P CMV Is derived from a plasmid pSV2-Neo / EcoH (obtained from Tokai Univ.) Prepared by incorporating an approximately 6 kb sequence containing the promoter / enhancer region of the hCMV MIE antigen into pSV2-Neo. P CMV Range is a promoter / enhancer region containing all of the repeat sequences of 21b, 19b, 18b, and 17b in the hCMV MIE gene, and has a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 16 and 17 (restriction enzyme cleavage sequence 5 'at the end: (With EcoRV, 3 ': ClaI), and insert the plasmid between the EcoRV-ClaI sites of the plasmid pCV4 for cloning the MCS-related gene. The prepared plasmid is called pCV4 / CMV.
[0040]
(B) Selection of polyA
BGH polyA is prepared from genomic DNA derived from bovine hepatocytes. In the literature (Gene, p. 11, 291, 1987), among the polyadenylation signal sequences, 229 bp that can be cut out with PvuII and KpnI have been used to obtain highly productive and reproducible results. The terminator ("AATAAA") appears once. Basically, it is considered that only one polyA is sufficient. However, bGH polyA may be incorporated into the plasmid pCV4 / CMV so as to have a double sequence ((bGH polyA ) 2 : SEQ ID NO: 27).
[0041]
(C) Plasmid with MCS cistron [EXP-BL2]
In the plasmid (pEXP-BL2) thus prepared, P CMV 3'-end restriction enzyme site and (bGH polyA) 2 There is a multiple cloning site (MCS-B) for integrating the protein gene of interest between the 5'-terminal restriction enzyme sites. That is, 5'-ClaI-NotI-KpnI-XbaI-3 'can be used. When the protein gene to be incorporated starts from the initiation codon, it is desirable to select ClaI or KpnI as the restriction enzyme site directly attached to the 5 ′ side.
[0042]
<6> Preparation of cassette vector [pSVP (D) S / DHFR] having DHFR gene cistron
The DHFR region is P SV40DE (Promoter), DHFR gene and SV40 polyA. P SV40DE And SV40 polyA are already incorporated into pSVP (D) S-1, and are prepared by incorporating the DHFR gene sequence into this. FIG. 6 shows a flowchart for preparing pSVP (D) S / DHFR.
[0043]
The DHFR gene is derived from mouse fibroblast 3T3 (J. Biol. Chem., 256, 9501, 1981) and has a range of PCR from 5 'upstream 6b of the start codon to about 85b 3' downstream of the stop codon. Cut out with primer. The 5 'side is modified from "G" and "A" of 6 bases "GCCATC" immediately before the start codon to a pyrimidine base (for example, "TCCCTC"), and further prepared to have a PstI site on the 5' side. I do. The 3 'end is to the BglII site at 85b downstream of the stop codon. With this PCR primer, the bases (−6), (−3) and the base immediately after the start codon (+4) of the start codon of the DHFR gene are originally Kozak consensus sequences, but are respectively modified to pyrimidine bases. To form a non-common sequence. This changes the amino acid following the start codon of the DHFR protein from Val to Leu or Phe. This mutated DHFR gene is called Mu-DHFR, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
[0044]
<7> Construction of expression vector [pNOW / CMV-A]
NEO was added to the previously prepared backbone vector pBBV for constructing the expression vector in the same transcription direction. r Area (NEO r Gene cistron), target substance integration region (MCS cistron) and DHFR region (DHFR gene cistron) in this order. The method is as follows. The DHFR gene cistron was excised from SVP (D) S / DHFR with EcoRI and ApaI, and ligated between the EcoRI-ApaI site of the multicloning site of the backbone vector pBBV to prepare a plasmid vector pNOW-1 to obtain pSVP (D) S / NEO with ClaI and SacII to NEO r The gene cistron was excised, ligated between the ClaI-SacII sites of the pNOW-1 multiple cloning site, and then the ClaI site was crushed to produce the plasmid pNOW-2. The expression vector pNOW / CMV-A is prepared by ligating between the SplI-EcoRV site of the -2 multicloning site. FIG. 9 shows a flowchart of pNOW / CMV-A production, and FIG. 10 shows a map.
[0045]
<8> Preparation of Expression Vector [pNOW / CMV-AA] Having Synthetic Linker Insertion Sequence
Based on the completed pNOW / CMV-A, [from transposon sequence to Mu-NEO r The sequence part following the sequence] is changed to [Synthetic linker insertion sequence and Mu-NEO r To the connected array].
[0046]
(A) Preparation of synthetic linker
In order to prepare a gene sequence containing all sequences capable of encoding three types of amino acid sequences having different starting positions as constituent units of a triplet, two linkers each consisting of about 50 bases (MSR-Linker 1 (+), MSR-Linker) 2 (-)) and their complementary sequences (MSR-Linker 1 (-), MSR-Linker 2 (+)). These linkers are PCR-amplified and connected with the "CCAAGC" at the end of MSR-Linker 1 (+) and the corresponding "GGTTCG" at the end of MSR-Linker 2 (-) which is complementary. The connected synthetic linker (SEQ ID NO: 29) has a PstI site on the 5 ′ side and an EcoRV site on the 3 ′ side.
[0047]
(B) Replacement of transposon sequence with synthetic linker insertion sequence
Then, using pNOW / CMV-A, Mu-NEO using a separately synthesized primer r From the 5 'side to the termination codon from 7 bases upstream. 3 'end of connected synthetic linker and Mu-NEO r Has an EcoRV attached to its 5 ′ end, and by connecting it, a synthetic linker as an insertion sequence and Mu-NEO are inserted. r Is prepared. Since there is no appropriate restriction enzyme cleavage site for excision and replacement of only the transposon sequence from pNOW / CMV-A, the prepared [Synthetic linker insertion sequence and Mu-NEO r Using the sequence connected sequences], the corresponding pNOW / CMV-A [transposon sequence to Mu-NEO r The sequence following the sequence]. Since all have a PstI site on the 5 ′ side and an EcoRV on the 3 ′ side, pNOW / CMV-A is cleaved with PstI and EcoRV, and then the same restriction enzyme is used [the synthetic linker insertion sequence and Mu-NEO r Array connected to an array]. Newly made, consumable NEO r An expression vector characterized in that the insertion sequence of the gene cistron is a synthetic linker is referred to as pNOW / CMV-AA. FIG. 11 shows a flowchart of pSVP (D) S / NEO-A production for pNOW / CMV-AA production. Hereinafter, pNOW / CMV-AA is manufactured by using pSVP (D) S / NEO-A instead of pSVP (D) S / NEO in the manufacturing method shown in the flowchart in FIG. FIG. 12 shows a map of pNOW / CMV-AA.
[0048]
Next, a method for using the expression vectors of the present invention (pNOW / CMV-A and pNOW / CMV-AA) will be described.
This expression vector can be used according to the following procedure.
[0049]
(1) After cloning the gene of the target substance (protein), (2) incorporating it into the MCS of the expression vector of the present invention (plasmid vector pNOW / CMV-A or pNOW / CMV-AA). (3) After the integrated expression vector is propagated, (4) the gene is introduced into CHO cells (DHFR negative) by the ribofectin method or electroporation, and (5) G418 is added to the medium and cultured. Select resistant cells. (6) Cloning is repeated while culturing the obtained cells, (7) A clone with a high yield of the target substance is selected, and (8) Culture is continued until the growth rate is further increased and stabilized. (9) The medium of the stabilized clone is gradually reduced from the FCS-supplemented medium to the FCS-containing medium, and is adapted to a serum-free medium. (10) The introduced plasmid gene was amplified by adding MTX (10 nM-1 μM) to the medium stepwise with respect to the high-productivity clone, and (11) a high-productivity clone was selected again. 12) Continue culturing until the growth rate further increases and stabilizes. (13) The medium of the stabilized clone is gradually reduced from the FCS-supplemented medium to the FCS-containing medium, and is adapted to a serum-free medium. The serum-free medium may be used in any of the steps (9) and (13).
[0050]
Hereinafter, use examples of the expression vector of the present invention will be described.
<1> Conglutinin production test using expression vector pNOW / CMV-AA
(A) Introduction of conglutinin gene and establishment of G418-resistant early clone
Bovine conglutinin, a kind of serum lectin, was selected as the target substance. The activity of this protein requires a sugar chain and is not suitable for production using Escherichia coli or yeast as a host. After cloning the bovine conglutinin gene into the pNOW / CMV-AA multicloning site, the gene was introduced into a DHFR-deficient CHO cell line (acquired from Dr. Gail Urlaub) by the lipofectin method. When G418 was added to the medium and cultured, the cells survived only in 33 of the 960 wells (G418 resistant strain). Most of the surviving cells produced significantly higher levels of conglutinin, but among them, 5 clones were selected as highly productive cells and subcultured, and all showed 7.0 μg / ml (4 days). The highest production level was 11.8 μg / ml. This was the highest level as compared with the data of the initial clone before gene amplification by a typical expression vector reported in the literature (DNA, 7,651 pages, 1988; Biotechnology, 10.1455). Biotechnology, 8, 662, 1990; Gene, 76, 19, 1989; Biotechnology, 9, 64, 1991). Screening of recombinant cells by gene amplification usually requires 6 months to 1 year, and the differences depending on culture conditions and amplification stimulant concentration are large. Therefore, the primary performance comparison of expression vectors is based on the expression level of the initial clone before amplification. It seems appropriate to do so. This proved that the performance of the expression vector of the present invention was extremely high. As a result, "consumable NEO r It has been confirmed that the “expression vector having a gene cistron” enables establishment of a cell line that produces a protein of interest at a very high efficiency while the number of G418-resistant strains obtained is extremely low. The present inventors have carried out a number of tests using commercially available expression vectors for mammalian cells and independently developed expression vectors, but the conglutinin expression level is up to 50 ng / ml (4 days). Yes, it was not practical. This proved that the expression vector of the present invention enables very high protein expression levels.
[0051]
<2> Conglutinin production test using expression vector pNOW / CMV-A
(A) Introduction of conglutinin gene and establishment of G418-resistant early clone
After the bovine conglutinin gene was integrated into the pNOW / CMV-A multicloning site in the same manner as in <1>, the gene was introduced into a DHFR-deficient CHO cell line by the lipofectin method. When G418 was added to the medium supplemented with 10% FCS and cultured, cells survived in 48 of 960 wells (G418 resistant strain), and most of these surviving cells produced significantly higher levels of conglutinin. . When culturing was continued while cloning was repeated, many high-level conglutinin-producing clones exceeding 1 μg / ml (4 days) were obtained, and 6.8 μg / ml showed the highest production level. Therefore, it has been proved that a G418-resistant strain with high productivity can be obtained even if a natural sequence derived from a transposon sequence satisfies the conditions as an inserted sequence. In this experiment, after stabilization of the cell line, the FCS level in the medium was lowered, and the cells were adapted to serum-free CHO-S-SFM II medium (GIBCO, containing no hypoxanthine and thymidine). It was found that the adaptation was sufficient, and no significant decrease was observed in the productivity of conglutinin.
[0052]
(B) Gene amplification of G418 resistant cell line
Among the G418-resistant cell lines, the clone with the highest conglutinin production was subcultured and stabilized, and then subjected to gene amplification by MTX. After initially culturing in a medium containing 10 nM MTX for 2 weeks and then further amplifying in a medium containing 50 nM MTX for another 2 weeks, the production level of conglutinin increased to 18.6 μg / ml per medium (4 days). The concentration of MTX used for gene amplification is generally multi-step between 10 nM and 10 μM, and a final concentration of 1 μM is often used. However, exposure to high concentrations is difficult to establish a stable recombinant cell line due to the toxicity of cells. There's a problem. Therefore, achievement of high productivity at low concentration MTX is also an important evaluation criterion, and was set to 50 nM in this experiment. In addition, the MTX exposure period including the normal selection was set to 6 to 12 months, whereas the experiment was performed in about 4 weeks. Despite these experimental conditions, an effective increase in the production of conglutinin was observed, and the high performance of this expression vector was also confirmed in a gene amplification system. As many papers suggest, higher productivity can be expected by increasing the concentration level of MTX or prolonging the MTX exposure time in a range where toxicity is of little concern (<1 μM).
[0053]
【Example】
Hereinafter, examples of the present invention will be described.
[0054]
(1) Construction of backbone vector pBBV
As a linker (BBV linker) for a multicloning site to be newly incorporated into the plasmid pUC18, a sense DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an antisense DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 were synthesized. The restriction enzyme cleavage sequence of this linker was 3'-NdeI-SacII-ClaI-EcoRV-SplI-EcoRI-ApaI-5 ', and the 5' end was a blunt end. The region encoding lacZ was completely removed by treating plasmid pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd., 1 ng (0.1 μl) with restriction enzymes NdeI and PvuII. The BBV linker sense DNA and antisense DNA were added to this solution. Was added, and 2.0 μl of Solution I of DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added, and the mixture was reacted for 30 minutes at 16 ° C. The reaction solution was added to E. coli competent cell XL1-BLUE (STRATAGENE) 0 After reacting on ice for 30 minutes, heat shock was applied for 60 seconds at 42 ° C. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium (Toyobo Co., Ltd.) was added, and the mixture was added at 37 ° C. for 1 minute. After culturing on a shaker for an hour, the mixture was centrifuged at 5,000 rpm for 1 minute and the supernatant was discarded The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. Among the plasmids obtained from the colonies, those into which the DNA of the BBV linker was newly inserted were selected and designated as pBBV.
[0055]
(2) Construction of plasmid pCV3 for cloning SV40-related gene
As a linker (CV3 linker) for a multiple cloning site for removing the multiple cloning site of the plasmid pUC119 and newly incorporating the same, a sense DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and an antisense DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 are used. Synthesized. The restriction enzyme cleavage sequence of this linker was 5′-HindIII-SacII-PstI-BamHI-
[0056]
(3) The weakened SV40 promoter (P SV40DE ) Fabrication
(A) Construction of a weakened SV40 promoter (for DHFR cistron)
In order to cut out the SV40 early promoter containing SV40 Ori from the plasmid pSV40 / BR, a 5 ′ sense primer (PS1) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a 3 ′ antisense primer (PS2) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 Was synthesized. The SacII-EcoRI restriction enzyme site was added to the 5 ′ end of the PS1 primer by changing the PvuII site of the original sequence. In addition, a PstI site was added to the 3 ′ end of the PS2 primer by changing the original HindIII site. To 1 ng (0.1 μl) of the pSV40 / BR genome (derived from pSV40 / BR, obtained from Hiroshima University), 100 pmole of each of these PS1 and PS2 primers was added, and Taq polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 2.5 U (0. 5 μl) and PCR buffer solution (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C.), 375 mM KCl, 15 mM MgCl) 2 ) 20 μl, 100 mM DTT 1.0 μl, 10 mM dNTP 0.5 μl (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml), and sterile water to a final volume of 100 μl. Was. One drop of mineral oil (Sigma Chemical) was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The aqueous phase was taken out of the PCR reaction solution, 2 μl of a 10 × H solution was added to 10 μl of the aqueous phase, 20 U (1 μl) of restriction enzymes SacII and 20 U (1 μl) of PstI were added, and 7 μl of sterilized water was added. Allowed to react for hours. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm, and a band of about 0.35 kb detected was cut out. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution.
[0057]
To the solution obtained by treating the plasmid pCV3 with SacII and PstI, 5 μl of the above DNA solution was added, and then the DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE (Stratagene), reacted on ice for 30 minutes, and then subjected to heat shock at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing overnight at 37 ° C., a plasmid obtained by newly inserting the SV40 promoter DNA was selected from plasmids obtained from the resulting colonies and designated as pSV0a. Further, the plasmid was subjected to self-ligation with a restriction enzyme SphI to remove the enhancer portion, whereby a Pac having a SacII-EcoRI site at the 5 ′ end was obtained. SV40DE A plasmid pSVP1a having the following sequence was prepared.
[0058]
(B) The weakened SV40 promoter (NEO r Production of gene cistron)
Except that the 5 ′ sense primer (PS3) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 was synthesized and used in place of the 5 ′ sense primer (PS1) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, NEO was prepared in the same manner as in the preparation of the weakened SV40 promoter (for the DHFR gene cistron) described in section a). r Attenuated SV40 promoter P for gene cistron SV40DE A plasmid pSVP1b having the following sequence was prepared. This PS3 primer has only a SacII site at the 5 ′ end (an EcoRI site is not added). The same 3 ′ antisense primer (PS2: SEQ ID NO: 6) was used.
[0059]
(4) Preparation of SV40 polyA
The EcoRI site was crushed by ligating an SPSV40 linker to the 3'-terminal EcoRI site of the SV40 polyA signal sequence of the plasmid pSV40pA-A, and changed to an ApaI-ClaI site. First, as an SPSV40 linker, a sense DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 and an antisense DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 were synthesized. After digesting 1 ng (0.1 μl) of the plasmid pSV40pA-A with the restriction enzyme EcoRI, 100 pmole of each of the sense DNA and antisense DNA of the SPSV40 linker was added to the obtained solution, and then the DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing overnight at 37 ° C., a plasmid having a newly inserted SPSV40 linker DNA among plasmids obtained from the resulting colonies was selected and named pSV40pA-B.
[0060]
(5) Preparation of cassette incorporating weakened SV40 promoter and SV40 polyA
(A) Preparation of plasmid pSVP (D) S-1 for DHFR gene cistron construction
To 1 ng (0.1 μl) of plasmid pSV40pA-B, 20 U (1 μl) of restriction enzymes BamHI and 20 U (1 μl) of Cla I were added, and 7 μl of sterilized water was added, followed by reaction at 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 0.8 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution. On the other hand, after treating plasmid pSV1a with restriction enzymes BamHI and ClaI, 0.5 μl of the above DNA solution was added to 1 ng / 0.1 μl of the obtained solution, and DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. The cells were cultured overnight at 37 ° C., and among the plasmids obtained from the resulting colonies, those newly inserted with SV40 polyA DNA were selected and designated as pSVP (D) S-1.
[0061]
(B) NEO r Preparation of plasmid pSVP (D) S-2 for construction of gene cistron
NEO was prepared based on the SV40 polyA DNA obtained from pSV40pA-B and plasmid pSVP1b in the same manner as in the preparation of pSVP (D) S-1 described in (a) above. r A plasmid pSVP (D) S-2 having a weakened SV40 promoter for gene cistron and SV40 polyA was prepared.
[0062]
(6) Preparation of cassette vector having DHFR gene cistron
(6-1) Cloning of DHFR gene
(A) Isolation of DHFR mRNA
After culturing the mouse fibroblast cell line 3T3, 10 7 After obtaining the cells, mRNA was separated by the guanidine isothiocyanate method (Meth. Enzymol., 152, 219, 1987). First, cells were suspended in a flask, and the obtained cells were suspended again in sterilized PBS and transferred to a centrifuge tube. Centrifugation was performed at 450 × G for 10 minutes under the temperature condition of 0 ° C., and the supernatant was discarded. The cells obtained were added to a mixed solution of 6M GTG-CsCl, 10 mM sodium citrate, 0.1 ml β-mercaptoethanol and 0.5% sarkosyl, suspended and lysed, and the RNA was passed through an 18-gauge injection needle to transfer RNA. Fragmented. 2.5 ml of the thus obtained solution was overlaid on 2.5 ml of a 5.7 M CsCl, 0.1 M EDTA solution in an ultracentrifuge tube. This was centrifuged at 35,000 rpm for 8 hours using an ultracentrifuge, the supernatant was carefully discarded, and the RNA fraction precipitated at the bottom was dissolved in sterilized water that had been extracted with phenol and saturated with phenol. Ethanol was added thereto, and RNA was precipitated by centrifugation at 12,000 rpm. Then, the precipitate was washed with ethanol three times and air-dried. The obtained RNA was resuspended in 3 ml of RNase-free water. The concentration of the mRNA sample thus obtained was about 0.3 μg / μl according to the absorbance at 260 nm.
[0063]
(B) Preparation of DHFR cDNA
In order to amplify the DHFR gene by PCR, a 5 ′ sense primer (PD1) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a 3 ′ antisense primer (PD2) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 were synthesized. The 5 'end was a sequence artificially linked with a non-sense pyrimidine sequence "TCCCTC" to the PstI site, and the 3' end contained a region from the stop codon to the BglII site about 85b downstream. To synthesize cDNA, 10 μl of a solution containing 2 μg of total RNA was used. In a sterile RNase-free tube, place PCR buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) 20 μl, 100 mM DTT 1.0 μl, 10 mM dNTP 0.5 μl (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), BSA acetate (4 mg / ml) 0.25 μl, oligo dT primer 2.0 μg, PCR reverse transcriptase (200 units) / Μl) To 0.5 μl was added 0.5 μl of RNase-free DEPC water. These were incubated at 37 ° C. for 60 minutes, and then heated at 70 ° C. for 15 minutes to stop the reaction. The obtained cDNA was directly added to the prepared reaction solution for PCR. To this solution were added 100 pmole of PD1 primer and 100 pmole of PD2 primer, respectively, followed by 2.5 U (0.5 μl) of Taq polymerase (Takara Shuzo) and PCR buffer solution (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C.), 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) 20 μl, 100 mM DTT 1.0 μl, 10 mM dNTP 0.5 μl (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml), and sterile water to a final volume of 100 μl. Was. One drop of mineral oil (Sigma Chemical) was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The aqueous phase was taken out of the PCR reaction solution, 2 μl of a 10 × H solution was added to 10 μl of the aqueous phase, 20 U (1 μl) of restriction enzymes PstI and 20 U (1 μl) of BglII were added, and 7 μl of sterile water was added. Allowed to react for hours. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 0.65 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution.
[0064]
(6-2) Construction of cassette vector pSVP (D) S / DHFR having DHFR gene cistron
Plasmid pSVP (D) S-1 was partially digested with restriction enzymes PstI and BamHI (this is because one PstI site is included in SV40 polyA). 0.5 μl of a DHFR DNA solution was added to 0.1 μl (1 ng DNA) of this solution, and the 5 ′ end was bound with PstI and the 3 ′ end was bound with the protruding ends of BamHI and BglII. At this time, the DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C. overnight, a plasmid obtained from the resulting colony, in which DHFR DNA was newly inserted, and which had an ApaI restriction enzyme site, was selected. The DHFR gene was cut out from this plasmid and sequenced to confirm that the entire sequence of the DHFR gene and the base at position (+4) from the start codon "ATG" were changed from "A" to "C" (Mu). -DHFR, SEQ ID NO: 25).
[0065]
(7) NEO r Construction of cassette vector with gene cistron
(A) NEO containing transposon sequence r Gene preparation
NEO r In the gene region, a 5 'upstream transposon sequence consisting of 354 bases and NEO r The one in which the gene translation regions were connected was used. Since this sequence was derived from Tn5 and contained in pSV2-neo, it was cut out and used. First, a 5 ′ sense primer (PN1) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 and a 3 ′ antisense primer (PN2) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 were synthesized. The PstI site was added to the 5 ′ end of the PN1 primer by changing the HindIII site of the original sequence. In addition, a BamHI site was added to the 3 ′ end of the PN2 primer by changing the original SmaI site. 100 pmole of each of these PN1 and PN2 primers was added to 1 ng (0.1 μl) of pSV2-neo genome, and then 2.5 U (0.5 μl) of Taq polymerase and a PCR buffer solution (250 mM Tris-HCl (25 ° C.) PH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) 20 μl, 1.0 μl of 100 mM DTT, 0.5 μl of 10 mM dNTP (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml), and sterilized water to a final volume of 100 μl. Was. One drop of mineral oil was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The aqueous phase was taken out of the PCR reaction solution, 2 μl of a 10 × H solution was added to 10 μl thereof, 20 U (1 μl) of restriction enzymes PstI and 20 U (1 μl) of BamHI were added, and 7 μl of sterile water was added, followed by 1 hour at 37 ° C. Reacted. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm, and a band of about 1.3 kb detected was cut out. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution.
[0066]
(B) NEO r Construction of cassette vector pSVP (D) S / NEO having gene cistron
Plasmid pSVP (D) S-2 was partially digested with PstI and BamHI (because one PstI site was included in SV40 polyA). NEO to 0.1 μl (1 ng DNA) of this solution r 0.5 μl of a DNA solution of the gene was added and ligated between the PstI-BamHI sites. In this reaction, DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C overnight, NEO was newly added to the plasmids obtained from the resulting colonies. r Those into which the transposon sequence DNA containing the gene was inserted were confirmed by G418 resistance and selected.
[0067]
(C) NEO r Partial mutagenesis into genes
NEO r In order to change the base "A" immediately after the start codon "ATG" of the gene translation region to "C", an antisense primer for mutation introduction having the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 was synthesized. To 1 ng (1 μl) of pSVP (D) / NEO genome, 100 pmole of this antisense primer was added, and site-directed mutagenesis was induced using PCR in vitro Mutagenesis Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). did. 2.5 U (0.5 μl) of Taq polymerase and PCR buffer solution (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C.), 375 mM KCl, 15 mM MgCl) 2 ) 20 μl, 1.0 μl of 100 mM DTT, 0.5 μl of 10 mM dNTP (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml), and sterilized water to a final volume of 100 μl. Was. One drop of mineral oil was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The prepared plasmid vector was designated as pSVP (D) S / NEO. From the transposon sequence, NEO r By excising the sequence consisting of the gene and resequencing it, r It was confirmed that the base at position (+4) immediately after the gene start codon "ATG" was changed from "A" to "C" (Mu-NEO). r gene). This sequence is shown in SEQ ID NO: 26.
[0068]
(8) Preparation of cassette vector having MCS cistron
A. Preparation of plasmid pCV4 for cloning MCS-related gene
As a linker (CV4 linker) for a multicloning site for removing a multicloning site of pUC18 and newly incorporating an MCS-related gene, a sense DNA having a base sequence shown in SEQ ID NO: 14 and an antisense having a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 Sense DNA was synthesized. The restriction enzyme cleavage sequence of this linker was 3'-HindIII-EcoRV-ClaI-NotI-KpnI-XbaI-BglII-SplI-EcoRI-5 '. After treating 1 ng (0.1 μl) of plasmid pUC18 with restriction enzymes HindIII and EcoRI, 100 pmole of each of sense DNA and antisense DNA of CV4 linker was added to a solution containing the obtained plasmid, and then DNA ligation kit Ver . 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C. overnight, a plasmid having a newly inserted CV4 linker DNA was selected from plasmids obtained from the resulting colonies and designated as pCV4.
[0069]
B. P CMV Preparation and integration
(A) P CMV Preparation of
Plasmid pSV2-neo / EcoH to
[0070]
(B) P CMV Of Escherichia coli into a plasmid for cloning MCS cistron-related genes
On the other hand, after 1 ng (1 μl) of the plasmid pCV4 to be integrated was treated with restriction enzymes EcoRV and ClaI, a solution containing the obtained plasmid was added to the resulting solution. CMV 0.5 μl of the DNA solution was added and ligated between EcoRV-ClaI sites. In this reaction, DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing overnight at 37 ° C., the plasmid P CMV Was inserted and selected as pCV4 / CMV.
[0071]
C. Preparation and incorporation of bGH polyA
(A) Isolation of DNA containing bGH polyA
While slicing the collected bovine liver cell tissue on dry ice, a buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM DETA, 0.1 mM) containing a proteinase K solution at 100 μg / ml was added. % SDS) and mixed gently. After incubating at 55 ° C. for 1 hour, it was further incubated at 37 ° C. overnight. An equal volume of neutral phenol equilibrated with Tris was added and mixed gently for 20 minutes at room temperature. After centrifugation at 2,000 × G for 10 minutes at room temperature, the obtained upper layer (5 ml) was collected, transferred to a new tube, and centrifuged again under the same conditions. After the upper layer was collected again and transferred to a new tube, a double volume of 100% ethanol was overlaid, and the buffer and ethanol were mixed with gentle stirring. The obtained DNA was collected by winding it up with a glass rod, air-dried, put in 5 ml of TE solution, and dissolved at 4 ° C. overnight. The concentration of the obtained DNA sample was about 0.5 μg / μl according to the absorbance at 260 nm.
[0072]
(B) Integration of bGH polyA gene into MCS cistron-related gene cloning plasmid (1)
In order to connect the bGH polyA sequences doubly, two kinds of bGH polyA sequences having different restriction enzyme sites were prepared. For this purpose, two sets of 5 ′ sense primer and 3 ′ antisense primer, that is, the 5 ′ sense primer (PB11) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 of the first combination and the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 A 3 ′ antisense primer (PB12) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 of the second combination and a 3 ′ antisense primer (PB22) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 ) Was synthesized.
[0073]
From the obtained DNA sample, 100 ng was taken out, and a bGH polyA sequence having a desired restriction enzyme cleavage sequence at both ends was prepared using a PCR template. First, to 100 ng (1 μl) of a DNA sample, 100 pmole of each of the sense primer PB11 and the antisense primer PB12 of the first combination was added, and 2.5 U (0.5 μl) of Taq polymerase and a PCR buffer solution (250 mM Tris-HCl (25 mM)) were added. At pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) 20 μl, 100 mM DTT 1.0 μl, 10 mM dNTP 0.5 μl (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml), and sterile water to a final volume of 100 μl. Was. One drop of mineral oil was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The aqueous phase was taken out of the PCR reaction solution, 2 μl of a 10 × H solution was added to 10 μl thereof, 20 U (1 μl) of restriction enzymes XbaI and 20 U (1 μl) of BglII were added, and 7 μl of sterile water was added, followed by 1 hour at 37 ° C. Reacted. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm, and a band of about 0.23 kb detected was cut out. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution.
[0074]
To 0.1 μl (1 ng DNA) of the solution obtained by treating the plasmid pCV4 with XbaI and BglII, 0.5 μl of the above DNA solution was added, and then the DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C. overnight, a plasmid having bGH polyA DNA newly inserted therein was selected from plasmids obtained from the resulting colonies and designated as pCV4 / CMV-bGH1.
[0075]
(C) Integration of bGH polyA gene into MCS cistron-related gene cloning plasmid (2)
Subsequently, 1 ng (1 μl) of the DNA sample obtained by PCR amplification using the first primer combination was taken out, 100 pmole of each of the sense primer PB21 and the antisense primer PB22 of the second combination was added, and then
[0076]
To 0.1 μl (1 ng DNA) of the solution obtained by treating the plasmid pCV4 / CMV-bGH1 with BamHI and SplI, 0.5 μl of the above DNA solution was added, and then the DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. Cultured overnight at 37 ° C., plasmids obtained from the resulting colonies, into which the second bGH polyA DNA is newly inserted, ie, those into which bGH polyA is double-bonded and inserted (( bGH polyA) 2 ) Was selected as a cassette vector pEXP-BL2 having an MCS cistron. The prepared pEXP-BL2 was excised with XbaI and SplI, sequenced again, and the sequence was confirmed (SEQ ID NO: 27).
[0077]
(9) Construction of expression vector pNOW / CMV-A
(A) Incorporation of DNA sequence constituting DHFR cistron (Preparation of plasmid pNOW-1) 1 μl of 10 × H solution was added to 100 ng (1 μl) of plasmid pSV (D) S / DHFR, and 20 U (1 μl) of restriction enzyme EcoRI was added. At 37 ° C. for 1 hour. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel, and the gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 1.75 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution. This DNA sequence constitutes the DHFR gene cistron, SV40DE , Mu-DHFR gene and SV40 polyA.
[0078]
On the other hand, 1 ng (1 μl) of the plasmid pBBV on the side into which the DNA sequence constituting the DHFR gene cistron was inserted was treated with the restriction enzymes EcoRV and ApaI. To the solution containing the obtained plasmid, 0.5 μl of a DNA solution of a sequence constituting the DHFR gene cistron was added, and ligated between the EcoRV-ApaI site. In this reaction, DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing overnight at 37 ° C., a plasmid into which a DNA sequence constituting the DHFR gene cistron was inserted was selected from plasmids obtained from the resulting colonies, and was used as pNOW-1.
[0079]
(B) NEO r Incorporation of DNA sequence constituting gene cistron (production of plasmid pNOW-2)
To 100 ng (1 μl) of the plasmid pSVP (D) S / NEO, 1 μl of a 10 × H solution was added, 20 U (1 μl) of restriction enzymes SacI and 20 U (1 μl) of ClaI were added, and reacted for 1 hour. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel, and the gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 2.4 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution. This array is NEO r The DNA sequence that constitutes the cistron, P SV40DE , Transposon sequence, Mu-NEO r It consists of the gene and SV40 polyA.
[0080]
On the other hand, NEO r One ng (1 μl) of the plasmid pNOW-1 into which the DNA sequence constituting the gene cistron was integrated was treated with restriction enzymes SacII and ClaI. NEO was added to 1 ng (0.1 μl) of the solution containing the obtained plasmid. r 0.5 μl of a DNA solution of the sequence constituting the gene cistron was added, and ligated between the SacI and ClaI sites. In this reaction, DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C. overnight, NEO was obtained from plasmids obtained from the resulting colonies. r The one into which the DNA sequence constituting the gene cistron was inserted was selected (pNOW-2P).
[0081]
In order to remove the ClaI site from the multicloning site of the obtained plasmid pNOW-2P, the ClaI site was removed by replacing the ApaI-ClaI-EcoRV portion with a newly synthesized ApaI-EcoRV linker. First, as this linker, a sense DNA having a base sequence of 5′-CGAT-3 ′ and an antisense DNA having a base sequence of 3′-CGGGCTA-5 ′ were synthesized. After digesting 1 ng (0.1 μl) of plasmid pNOW-2P with restriction enzymes ApaI and EcoRV, 100 pmole of ApaI-EcoRV linker sense DNA and antisense DNA were added to the resulting solution, and then DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing overnight at 37 ° C., a plasmid which could not be digested with ClaI newly was selected from plasmids obtained from the resulting colonies and designated as pNOW-2.
[0082]
(C) Incorporation of DNA sequence constituting MCS cistron (production of plasmid pNOW / CMV-A)
To 100 ng (1 μl) of plasmid pEXP-BL2, 1 μl of a 10 × H solution was added, 20 U (1 μl) of restriction enzymes EcoRV and 20 U (1 μl) of SplI were added, and the mixture was reacted for 1 hour. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 1.1 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution. This sequence is the DNA sequence that constitutes the MCS cistron. CMV , MCS-B, and (bGH polyA) 2 Consists of
[0083]
On the other hand, 1 ng (0.1 μl) of the plasmid pNOW-2 into which the DNA sequence constituting the MCS cistron was integrated was treated with the restriction enzymes EcoRV and SplI. To 1 ng (0.1 μl) of a solution containing the obtained plasmid, 0.5 μl of a DNA solution of a sequence constituting the MSC cistron was added, and ligated between EcoRV-SplI sites. In this reaction, DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C. overnight, a plasmid having a DNA sequence constituting MSC cistron inserted therein was selected from plasmids obtained from the resulting colonies. The expression vector thus produced was designated as pNOW / CMV-A. With respect to this expression vector pNOW / CMV-A, each constituent part was fragmented with a restriction enzyme, and each was sequenced and joined to confirm that each gene sequence was correctly inserted.
[0084]
(1) Construction of expression vector pNOW / CMV-AA having synthetic linker insertion sequence
(A) Preparation of synthetic linker
In order to prepare a gene sequence comprising all sequences capable of encoding three types of amino acid sequences having different starting positions as constituent units of a triplet, a linker (MSR having the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 as the first sequence) -Linker 1 (+)) and its complementary sequence shown in SEQ ID NO: 31 (MSR-linker 1 (-)) were synthesized. Next, a linker (MSR-linker 2 (-)) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 as the second sequence and its complementary sequence (MSR-linker 2 (+)) shown in SEQ ID NO: 32 were synthesized. A PstI site is provided at the 5 'end of MSR-linker 1 (+), and a sequence "CCAAGC" is provided at the 3' end for annealing and connecting to MSR-
[0085]
(B) Connection of two linkers
Using a PCR template, an MSR linker sequence having the desired restriction enzyme cleavage sequence at each end was prepared. 100 pmole of each of the sense MSR-linker 1 (+) and the antisense MSR-linker 1 (-) of the first combination was prepared, and 2.5 U (0.5 μl) of Taq polymerase and a PCR buffer solution (250 mM Tris-HCl ( PH 8.3 at 25 ° C.), 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) 20 μl, 100 mM DTT 1.0 μl, 10 mM dNTP 0.5 μl (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml), and sterile water to a final volume of 100 μl. Was. One drop of mineral oil was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The aqueous phase was removed from the PCR reaction solution, 2 μl of a 10 × H solution was added to 10 μl of the aqueous phase, 20 U (1 μl) of restriction enzymes PstI and 20 U (1 μl) of EcoRVI were added, and 7 μl of sterile water was added. Allowed to react for hours. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 0.1 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution.
[0086]
To 0.1 μl (1 ng DNA) of the solution obtained by treating the plasmid pUC18 with PstI and SmaI, 0.5 μl of the above DNA solution was added, and then the DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing overnight at 37 ° C., a plasmid obtained by inserting a new MSR linker DNA from plasmids obtained from the resulting colonies was selected as pUC18 / MSR.
[0087]
(C) Mu-NEO r Extraction of gene translation region
pSVP (D) S / NEO to Mu-NEO r In order to cut out the gene translation region, a 5 'sense primer (NEO-N'1) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 and a 3' antisense primer (NEO-N'2) shown in SEQ ID NO: 35 were synthesized. An EcoRV site was added to the 5 'end of the NEO-N'1 primer, and a BamHI site was added to the 3' end of NEO-N'2. 1 ng (0.1 μl) of the pNOW / CMV-A genome, 100 pmole of each of these NEO-N′1 and NEO-N′2 primers, 2.5 U (0.5 μl) of Taq polymerase and PCR buffer Solution (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C.), 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) 20 μl, 1.0 μl of 100 mM DTT, 0.5 μl of 10 mM dNTP (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml), and sterilized water to a final volume of 100 μl. Was. One drop of mineral oil was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The aqueous phase was removed from the PCR reaction solution, 2 μl of a 10 × H solution was added to 10 μl of the aqueous phase, 20 U (1 μl) of restriction enzymes EcoRV and 20 U (1 μl) of BamHI were added, and 7 μl of sterile water was added. Allowed to react for hours. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 0.8 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution.
[0088]
(D) MSR linker and NEO r Connection
MSR linker sequence and Mu-NEO using PCR template r The arrays were connected. 100 pmole of the DNA of each sequence prepared in the above (b) and (c) was prepared, and 2.5 U (0.5 μl) of Taq polymerase and a PCR buffer solution (250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C.)) , 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ) 20 μl, 100 mM DTT 1.0 μl, 10 mM dNTP 0.5 μl (10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.25 μl of BSA acetate (4 mg / ml) were added, and sterilized water was added to a final volume of 100 μl. . One drop of mineral oil was added to these mixed solutions, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C. for 4 minutes, three steps of 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, followed by treatment at 72 ° C. for 10 minutes to terminate the reaction. The aqueous phase was removed from the PCR reaction solution, 2 μl of a 10 × H solution was added to 10 μl thereof, 20 U (1 μl) of restriction enzymes PstI and 20 U (1 μl) of BamHI were added, and 7 μl of sterile water was added. Allowed to react for hours. The reaction solution was subjected to electrophoresis at 50 mA for 30 minutes using a 0.8% agarose gel. The gel was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 360 nm to cut out a band of about 0.9 kb detected. This agarose fragment was placed in a 1.5 ml tube, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes with a centrifuge, and the obtained aqueous solution was separated with a pipette to obtain a DNA solution.
[0089]
(E) NEO r Integration into cassette vector pSVP (D) S / NEO having gene cistron The resulting DNA (MSR linker and NEO r Was connected to the plasmid pSVP (D) S / NEO obtained in Example 1. pSVP (D) S / NEO was partially digested with PstI and BamHI (this is due to the inclusion of one PstI site in SV40 polyA). NEO was added to 0.1 μl (1 ng DNA) r 0.5 μl of a DNA solution of the gene was added and ligated between the PstI-BamHI sites. In this reaction, DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour on a shaker. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C. overnight, Mu-NEO newly connected to the MSR linker sequence among plasmids obtained from the resulting colonies was used. r Those into which DNA containing the gene was inserted were confirmed by G418 resistance and selected (pSVP (D) S / NEO-A).
[0090]
(F) Construction of expression vector pNOW / CMV-AA
Hereinafter, pSVP (D) S / NEO-A is converted to NEO in the same manner as in Example 1. r The DNA sequence constituting the gene cistron was cut out and incorporated into plasmid pNOW-1 to prepare pNOW-2PA. Further, pNOW-2A corresponding to pNOW-2 was prepared in the same manner as in Example 1, and subsequently, a DNA sequence constituting MCS cistron cut out from plasmid pEXP-BL2 was incorporated into pNOW-2A. NEO thus produced r The expression vector having a synthetic linker insertion sequence in the gene cistron was designated as pNOW / CMV-AA. With respect to this expression vector, each constituent part was fragmented with a restriction enzyme, and each was sequenced and joined, thereby confirming that each gene sequence was correctly inserted.
[0091]
(1) Conglutinin production test using pNOW / CMV-AA
(A) Preparation of conglutinin cDNA and incorporation into pNOW / CMV-AA
In order to integrate the gene into MCS-B of plasmid vector pNOW / CMV-AA, the restriction enzyme cleavage sequences at both ends of bovine conglutinin cDNA are represented by the 5 'sense primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23. It was modified using a 3 ′ antisense primer having a base sequence. After treating 1 ng / 0.1 μl of pNOW / CMV-AA with restriction enzymes XbaI and NotI, a sense primer and an antisense primer for modifying the end of conglutinin cDNA were added to 1 ng / 0.1 μl of a solution containing the obtained plasmid. Was added to the DNA ligation kit Ver. 2.0 μl of Solution I was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was added to 0.1 ml of E. coli competent cell XL1-BLUE, reacted on ice for 30 minutes, and then heat-shocked at 42 ° C. for 60 seconds. After placing on ice for 2 minutes, 0.9 ml of SOC medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. After centrifugation at 5,000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded. The competent cells precipitated with the solution remaining in the tube were suspended and spread on two ampicillin plates containing 100 μg / ml ampicillin at a ratio of 1:10. After culturing at 37 ° C. overnight, a plasmid having conglutinin DNA newly inserted therein was selected from plasmids obtained from the resulting colonies. The integrated conglutinin gene was cut out and sequenced again to confirm the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 28).
[0092]
(B) Gene transfer into host CHO cells (DHFR-deficient strain)
An F12 medium (GIBCO) supplemented with 10% calf fetal serum (FCS, GIBCO) was prepared, and a CHO cell line deficient in the DHFR gene was added thereto at 1 × 10 5 5 cells / ml, planted in a dish with a diameter of 60 mm, 37 ° C., 5
[0093]
(2) Conglutinin production test
(A) Proliferation of G418 resistant cells and conglutinin production level measurement test
When the level of conglutinin production was confirmed, the level was high in most of the G418-resistant strains. From these, five representative clones were selected and cloning was repeated twice. Subsequently, G418-resistant cells were mixed with F12 medium supplemented with 10% FCS (2 × 10 5 cells / ml) and 5 ml of cell clone 2 Planted in a culture flask. The cells were cultured until they became confluent, and the number of cells was measured. 6 cells. The culture supernatant of each dish was discarded, and 2 ml of 10% FCS-supplemented F12 medium having the same composition was added, followed by culturing for 4 days, and the culture supernatant was collected. When the amount of conglutinin produced was measured, it was found that the amount exceeded 14 μg / 2 ml in all dishes. Table 1 shows the production amount. Clone 7-3, which produced the highest levels, reached 11.8 μg / ml.
[0094]
[Table 1]
(1) Conglutinin production test using pNOW / CMV-A
(A) Integration of conglutinin cDNA into pNOW / CMV-A and gene transfer into host CHO cells (DHFR-deficient strain)
In the same manner as in Example 3, the bovine conglutinin gene was inserted into MCS-B of the plasmid vector pNOW / CMV-A. An F12 medium (GIBCO) supplemented with 10% calf fetal serum (FCS, GIBCO) was prepared, and a CHO cell line deficient in the DHFR gene was added thereto at 1 × 10 5 5 cells / ml, planted in a dish with a diameter of 60 mm, 37 ° C., 5
[0096]
(2) Conglutinin production test
(A) Proliferation of G418 resistant cells and conglutinin production level measurement test
When the conglutinin production level was confirmed, the level was high in most of the G418-resistant strains. From these, a
[0097]
[Table 2]
(B) Plasmid gene amplification by MTX
After the conglutinin-producing clone was further subcultured and stabilized, low-concentration MTX was added to the medium to perform gene amplification. As a first step, the selected cell clone 11A was mixed with 10% FCS-supplemented I-MEM medium (GIBCO, containing no hypoxanthine and thymidine) supplemented with MTX 10 nM and
[0099]
[Table 3]
(1) Human IFN-β production test
In the same manner as in Example 4, cDNA of human IFN-β (Gene, p. 10, p. 11, 1980) was cloned from fibroblasts, incorporated into pNOW / CMV-A, and further transformed into a DHFR-deficient CHO cell line. Introduced. Table 4 shows the production levels of human IFN-β after G418 selection. In addition, IU is a value obtained by antiviral activity.
[0101]
[Table 4]
(2) Amplification of plasmid gene by MTX
In the same manner as in Example 4, human IFN-β producing clone 72 was added to a low-concentration MTX medium, and gene amplification was performed. After amplification with MTX 50 nM, the production level of human IFN-β was measured.
[0103]
[Table 5]
(3) Adaptation of human IFN-β producing clone to serum-free medium
The human IFN-β producing clone 72 was cloned into a serum-free medium (CHO-S-SFM II, GIBCO, excluding hypoxanthine and thymidine) at 200 μg / ml G418 and 50 nM MTX for clone 7222 in which gene was amplified with 50 nM MTX. Conditioned in the added medium.
[0105]
As a result of measuring the amount of human IFN-β produced after acclimation, it was 473,900 IU / ml, and the result was almost the same as when 10% FCS was added.
[0106]
(4) Human IFN-β production test using serum-free medium
PNOW / CMV-A incorporating human IFN-β cDNA obtained in Example 5 (1) was conditioned with a serum-free medium (CHO-S-SFM II, GIBCO, containing no hypoxanthine and thymidine). The gene was introduced into a DHFR-deficient CHO cell line, and the cells were selected in a medium containing 200 μg / ml G418 in the same medium. The amount of human IFN-β produced was measured.
[0107]
[Table 6]
According to the present invention, it is possible to provide an expression vector capable of producing a high-level recombinant protein using a mammalian cell as a host.
[0108]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a flow chart for preparing a backbone vector pBBV linker.
FIG. 2 shows a flowchart for preparing pCV3 (for cloning SV40-related genes).
FIG. 3 shows a flowchart for preparing pCV4 (for cloning MCS-related genes).
FIG. 4 shows a flowchart for preparing a plasmid pSVP (D) S-1 for constructing a DHFR cassette.
FIG. 5 shows a flowchart for preparing a plasmid pSVP (D) S-2 for constructing a NEO cassette.
FIG. 6 shows a flowchart for preparing a DHFR cassette vector pSVP (D) S / DHFR.
FIG. 7 shows a flowchart of the preparation of the NEO cassette vector pSVP (D) S / NEO.
FIG. 8 shows a flowchart for preparing an MCS cassette vector pEXP-BL2.
FIG. 9 shows a flowchart of construction of the expression vector pNOW / CMV-A of the present invention.
FIG. 10 shows a map of the expression vector pNOW / CMV-A of the present invention.
FIG. 11 shows a flowchart of the construction of pSVP (D) S / NEO-A for the construction of the expression vector pNOW / CMV-AA of the present invention.
FIG. 12 shows a map of the expression vector pNOW / CMV-AA of the present invention.
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