JP3582717B2 - ４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料 - Google Patents
４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品の褐変は食品と飲料の産業界では重大な問題である。褐変や酸化による黒ずみは、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）等のような酵素の作用による、または酵素の作用ではない化学反応による、例えばいくつかの食品に存在するフェノール化合物の重合による場合がある。高いＰＰＯ活性が、褐変を起こし易い食品、例えば、小エビ、バナナおよびキノコ類に存在する。褐変は食品と飲料の外観とテクスチャに有害な変化を起こす。酵素作用によるものと酵素作用によらない褐変はともに食品産業界にとって重大な問題になっており年間何百万ポンドの廃棄食料製品が生じている。
【０００３】
酵素による褐変は、特に、小エビに黒点を発生させることを特徴とする小エビメラノーシスを起こす要因として、特に多くの研究の課題になっている（Ｆａｕｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９巻、３０２ 〜３１０ 頁、１９５３年）。酵素による褐変は、モノ−およびジフェノール類からｏ−キノン類が生成するＰＰＯ接触酸化反応が行われた結果、これらのキノン類は自発的に重合して、黒ずんだ色の高分子量ポリマーを生成し、特徴的な褐変または黒ずんだスポットの発生をもたらす。
【０００４】
ＰＰＯの熱による不活性化、および食品のｐＨを変化させること等のような種々の化学的処理を含む、褐変を防止するいくつもの方法が開発されてきた。熱による不活性化は、ＰＰＯを不活性化するのに必要な高温は食品の品質とテクスチャを変化させるので、果物類や海産食品等のような生鮮食品に対しては適切ではない。同様に、酸（例えば、クエン酸もしくはリン酸）を添加してｐＨを下げる方法はいくつかの食品の外観と品質に有害な影響を与える。
【０００５】
キノコ類のＰＰＯ接触酵素反応による褐変をクエン酸を用いて制御されることがＭｃＣｏｒｄとＫｉｌａｒａにより、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ， ４８巻、１４７９〜１４８３頁、１９８３年に報告されている。エルサレム・アルチコークス（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ａｒｔｉｃｈｏｋｅｓ） の抽出物のポリフェノールオキシダーゼ活性を種々の亜硫酸塩化合物を用いて阻害する方法がＺａｗｉｓｔｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ． Ｉｎｓｔ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈ． Ｊ． ， ２０（３）巻、１６２ 〜１６４ 頁、１９８７年に報告されている。ケイ皮酸、ｐ−クマリン酸およびフェルラ酸を用いることにより、果物ジュース類の酵素による褐変が制御されることがＪ．Ｒ．Ｌ． Ｗａｌｋｅｒ 、Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １１ 巻、 ３４１〜３４５ 頁、１９７６年に記載されている。Ｔ． Ｃ． Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ． は、フロログルシノールとレゾルシノールおよびその誘導体であるｄ−カテキンとオルシノールは、ＰＰＯのための基質ではないが、モモのＰＰＯによって生成される４−メチル−ｏ−キノンと反応するということをＰｌａｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ４８ 巻、２４〜３０頁、１９７１年に報告している。Ｒ． ＫｕｔｔｎｅｒとＨ． Ｗａｇｒｅｉｃｈ 、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ４３ 巻、８０〜８７頁、１９５２年には、キノコＰＰＯ（カテコラーゼ）は安息香酸と選択された安息香酸誘導体によって阻害されることが報告されている。しかしこれらの方法はいずれも、高価であるか、入手しにくいかまたは性能が劣っているために、完全に満足すべきものであると立証されていない。
【０００６】
ＬａｂｕｚａはＣｅｒｅａｌ Ｆｏｏｄｓ Ｗｏｒｌｄ， ３４（４） 巻、３５３ 頁、１９８９年に、ある種の食品の酵素による褐変を制御するのにプロテアーゼ類、特にフィシンを使用することを記載している。著者はこの作用がこのプロテアーゼのＰＰＯに対する攻撃に起因すると考えている。
【０００７】
食品産業界で広く行われている褐変を減らす別の方法は、食品と飲料に亜硫酸塩を添加する方法である。小エビメラノーシスのようないくつかの形態の酵素による褐変は、小エビなどの食品を亜硫酸水素ナトリウムのような亜硫酸塩の溶液に従来浸漬もしくはコートすることによって処理されてきた。亜硫酸塩類は酸化防止のためぶどう酒にも添加される。亜硫酸塩類はｏ−キノン類をモノ−および／またはジフェノール類を還元することによって褐変反応を阻害する。しかし、食品における亜硫酸塩類の使用は、ある特定の人に対して副作用があるので制限されており、さらに制限強化されるかまたは完全に除去されるかもしれない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、食品と飲料の酸化褐変、特にＰＰＯ活性によって起こる酵素による酸化褐変を阻害する４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、酵素により褐変し易い食品もしくは飲料の褐変を防止または阻害するのに充分な量の４−置換レゾルシノール誘導体で処理されてなる食品もしくは飲料であって、該レゾルシノール誘導体が下記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ ：
【００１０】
【化３】
【００１１】
ここで、Ｒ１ とＲ２ は独立してＨ、ＣＨ３ 、ＣＯＲ’、ＣＲ’、ＰＯ３ Ｒ’Ｒ”およびＳＯ３ Ｒ’Ｒ”からなる群から選択され、但しＲ’とＲ”は独立してＨまたは１〜６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基または置換芳香族化合物である；およびＲ３ はレゾルシノール誘導体が酵素による褐変を阻害するよう選択される、
【００１２】
【化４】
【００１３】
の化合物からなる群より選ばれる、食品もしくは飲料に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、食品と飲料の酸化褐変、特にＰＰＯ活性によって起こる酵素による酸化褐変を阻害する化合物と方法に関する。その化合物は一般式：
【００１５】
【化５】
【００１６】
で表されるレゾルシノール誘導体である。ここで、Ｒ１ とＲ２ は独立してＨ、ＣＨ３ 、ＣＯＲ’、ＣＲ’、ＰＯ３ Ｒ’Ｒ”およびＳＯ３ Ｒ’Ｒ”からなる群から選択され、但しＲ’とＲ”は独立してＨまたは１〜約６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基または置換芳香族化合物である；およびＲ３ は得られる化合物が阻害活性を有するよう選択される有機もしくは無機の置換基である。例えば、Ｒ３ は得られる化合物が阻害活性を有するよう選択されるヘテロ原子、またはヘテロ原子、飽和もしくは不飽和アルキル基、置換芳香族化合物、または有機官能基を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、例えば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンが挙げられる。飽和もしく不飽和アルキル基は、直鎖状、分岐状もしくは環状の形態で、１〜３０個の炭素原子をもっていてもよく、置換芳香族化合物が含まれる。アルキル置換基または有機官能基は、一つもしくは複数個のヘテロ原子、例えば酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンを含有していてもよい。４−アルキルレゾルシノール化合物が、大部分の食品のメラノーシスを阻害するのに特に有効である。例えば、下記式をもつ４−ヘキシルレゾルシノール（ここでＲ１ とＲ２ がともにＨでＲ３ がＣ６ Ｈ１３の化合物である。）：
【００１７】
【化６】
【００１８】
が上記の目的に対しては高度に有効である。
【００１９】
１つの実施態様では、Ｒ３ は一般構造：
【００２０】
【化７】
【００２１】
を有する。ここでｎは１もしくは２であり、およびＺは該化合物が阻害活性を有するように選択されるアルキルまたは他の有機官能基である。Ｚは、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンのごときヘテロ原子を少なくとも１つを含有するアルキル置換基であってもよい。好ましい実施態様では、ＺはＯＨ、ＮＨ２ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨＣＯ２ （ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、アミノ酸、ポリアミン置換基、例えば、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨＲ４ およびＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨＲ４ 、ここでｘとｙは独立して０〜５の整数である；および少なくとも３つのモノマーで構成された高ポリアミンオリゴマーもしくは置換オリゴマーの基からなる群から選択され、ここでこのモノマーは１，ωジアミノアルカンであり、およびＲ４ は下記式：
【００２２】
【化８】
【００２３】
を有する。ここでｎ、Ｒ１ とＲ２ は前記定義と同じである。酸化褐変の特に有効な阻害剤である化合物は一般式：
【００２４】
【化９】
【００２５】
で表されるレゾルシノール誘導体である。ここでｎは１もしくは２であり、Ｒ１ とＲ２ とＺは前記定義と同じである。
【００２６】
酵素による褐変を阻害するのに特に有用なレゾルシノール誘導体は、ｎ＝２であり、Ｒ１ とＲ２ はともにＨであり、ならびにＺはＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨＲ４ （すなわち、ｘ＝４であり、およびＲ４ は前記定義と同じである。）またはＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ（ＣＨ２ ）３ ＮＨＲ４ （ｘ＝４であり、ｙ＝３でありおよびＲ４ は前記定義と同じである。）であるときに得られる。これらの化合物はそれぞれ下記式ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ として表される。
【００２７】
【化１０】
【００２８】
一般式Ｉで表される置換レゾルシノール類には、食品の褐変を阻害するのに非常に有効な種類の化合物が含まれている。４−ヘキシルレゾルシノールは市販されている化合物であるが、この目的に特に有効である。式ＩＩＩ で表される誘導体の化合物のうち３つの化合物は天然の起源から単離され、その構造は標準的な有機化学分析法特に １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法で明白に同定された。これらの３種の特定な誘導体はそれぞれ式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ で表される構造をもっている。式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ は、単離および／または特性決定がなされたことがないポリアミン誘導体を表わすが、式ＩＶは従来天然には見出されたことがないレゾルシノール誘導体を表わす。
【００２９】
レゾルシノール誘導体を含有する抗褐変組成物の製造法も本発明の主題である。特定のレゾルシノール誘導体を合成することにより調製することができ、または天然の起源、例えば植物等から単離することができる。一つの実施態様では、その誘導体は、水抽出、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣの工程によって、例えばイチジクの乳液のような植物起源から単離して均質物にまで精製される。
【００３０】
本化合物を用いて食品の褐変を阻害する方法を説明する。この方法において、例えばある種の貝類、甲殻類動物、果物、野菜、および果物ジュースやぶどう酒等のような飲料等の褐変し易い食品は、褐変反応を阻害するのに充分な量の本レゾルシノール誘導体を含有する組成物で処理される。
【００３１】
一般に式ＩとＩＩＩ により表され、具体的に式ＩＩとＩＶで表される本レゾルシノール誘導体、ならびに具体的に式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ で表されるレゾルシノール−ポリアミン誘導体は、食品の褐変を阻害するのに非常に有効である。本組成物と方法は、粗製の乳液製剤および亜硫酸水素ナトリウムより、酸化褐変を阻害するのに有効である。大部分の食品の褐変を阻害するのに必要な量が、同じレベルの阻害効果を得るために、現在使われている亜硫酸水素ナトリウムの量より少ない量の本組成物が、大部分の食品の褐変を阻害するのに必要となる。本化合物は、食品もしくは飲料の外観、味、テクスチャもしくは品質に有害な影響を与えずに、選択された食品と飲料の褐変を阻害もしくは防止する有効な処理を提供する。
【００３２】
本発明は、ある種類のレゾルシノール誘導体（そのうちのいくつかは植物中で天然に産生する）が食品の褐変を阻害できることを発見したことに基づいている。本化合物は式Ｉで示される一般式をもつレゾルシノール誘導体である。
【００３３】
【化１１】
【００３４】
ここで、Ｒ１ とＲ２ は独立してＨ、ＣＨ３ 、ＣＯＲ’、ＣＲ’、ＰＯ３ Ｒ’Ｒ”およびＳＯ３ Ｒ’Ｒ”からなる群から選択され、但しＲ’とＲ”は独立してＨまたは約１〜約６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基または置換芳香族化合物である；Ｒ３ は、該化合物が阻害活性を有するよう選択される、ヘテロ原子、またはヘテロ原子、飽和もしくは不飽和アルキル基、置換芳香族化合物、または有機官能基を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、例えば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンが挙げられる。飽和もしく不飽和アルキル基は、直鎖状、分岐状もしくは環状の形態で、１〜３０個の炭素原子をもっていてもよく、置換芳香族化合物が含まれる。アルキル置換基または有機官能基は、一つもしくは複数個のヘテロ原子、例えば酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンを含有していてもよい。
【００３５】
アルキルレゾルシノール化合物が、大部分の食品のメラノーシスを阻害するのに特に有効である。例えば、下記式をもつ４−ヘキシルレゾルシノール：
【００３６】
【化１２】
【００３７】
が上記の目的に対しては高度に有効である。
【００３８】
一つの実施態様では、Ｒ３ は一般構造：
【００３９】
【化１３】
【００４０】
をもっている。ここでｎは１もしくは２であり、およびＺは該化合物が阻害活性を有するように選択されるアルキルまたは有機官能基である。Ｚは、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンのごときヘテロ原子を少なくとも１つ含有するアルキル置換基であってもよい。好ましい実施態様では、ＺはＯＨ、ＮＨ２ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨＣＯ２ （ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、アミノ酸（例えば、リジン、オルニチン、セリンまたはシステイン）；ポリアミン置換基、例えば、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨＲ４ およびＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨＲ４ 、ここでｘとｙは０〜５の整数である；および少なくとも３つのモノマーで構成されたポリアミンオリゴマーもしくは置換ポリアミンオリゴマーからなる群から選択され、ここでこのモノマーは１，ωジアミノアルカンであり、およびＲ４ は下記式：
【００４１】
【化１４】
【００４２】
をもつ。ここでｎ、Ｒ１ とＲ２ は前記定義と同じである。
【００４３】
酸化褐変の特に有効な阻害剤である化合物は下記の一般式：
【００４４】
【化１５】
【００４５】
をもつレゾルシノール誘導体である。ここでｎは１もしくは２であり、Ｒ１ とＲ２ とＺは前記定義と同じである。
【００４６】
酵素による褐変を阻害するのに特に有用なレゾルシノール誘導体は、ｎ＝２であり、Ｒ１ とＲ２ はともにＨであり、ならびにＺはＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨＲ４ （ｘ＝４であり、およびＲ４ は前記定義と同じである。）またはＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ（ＣＨ２ ）３ ＮＨＲ４ （ｘ＝４、ｙ＝３であり、およびＲ４ は前記定義と同じである。）であるときに得られる。これらの化合物はそれぞれ下記式ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ として示される。
【００４７】
【化１６】
【００４８】
本発明には上記式（式Ｉ〜ＶＩＩ ）の化合物の機能上の同等物も含まれる。この“機能上の同等物”という用語は、類似の抗褐変活性を有する上記化合物の化学的誘導体もしくは類似体を意味する。ここで、分子が、通常は分子の一部分ではなく付加されるもしくは異なる化学的部分をもっている場合、その分子は他の分子の“誘導体”という。
【００４９】
式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ の構造の分析は、それぞれジアミノブタン（ＶとＶＩ） およびスペルミジン（ＩＩＩ）にアミド結合で連結されたレゾルシノール部分を示している。ジアミンジアミノブタンおよびポリアミンスペルミジンは、動植物界に広く分布しているアミノ酸由来の脂肪族窒素化合物である。Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ， ２３巻 （Ｅ．Ｅ．Ｃｏｎｎ編集） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク中のＦｌｏｒｅｓ， Ｈ．Ｅ．、Ｐｒｏｔａｃｉｏ， Ｃ．Ｍ．およびＳｉｇｎｓ， Ｍ．Ｗ． 、１９８９年、によるＰｌａｎｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ 。ヒドロキシケイ皮酸アミド（ＨＣＡ）誘導体として、ｐ−クマリルジアミノブタン、フェルリルジアミノブタン、カフェオイルジアミノブタンおよびジ−ｐ−クマリルジアミノブタンのようなジアミノブタン類；ならびにｐ−クマリルスペルミジンのようなスペルミジン類は、１３種の科の高等植物に見出されており（Ｍａｒｔｉｎ−Ｔａｎｇｕｙ， Ｊ． 、Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌ． ， ３巻、３８１ 〜４００ 頁、１９８５年） 、花の成長と関係があると考えられる。上記のＨＣＡ類は、その構造が、式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ に密接に関連している。ＨＣＡ類について多くの研究が現在行われているが、式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ の存在については文献中には、先行報告はない。式ＶとＶＩＩ は新規な天然に生じるポリアミン誘導体である。現時点まで事実上発見されていなかった式ＶＩの化合物も、従来未知のポリアミン誘導体を示す。式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ で表される化合物は、ＰＰＯで触媒されるメラノーシスの阻害剤としての効力の他に、その分布、代謝および生理作用が未知の新規な種類のポリアミン誘導体を示す。
【００５０】
式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ で表される分子は植物から精製することができる。各種の植物起源由来の製剤は特定な酵素反応の有効な阻害剤である。例えば、イチジクの木、フィクス属の種Ｆｉｃｕｓ ｓｐ． （Ｆ．ｓｐ．）から得られる乳液は、プロテアーゼのフィシンを含有している（Ｐ．Ｔ． Ｅｎｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． 、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７巻、１６３ 頁、１９６３年） 。イチジク乳液から調製したフィシン含有抽出物は、酵素による褐変反応の有効な阻害剤であることを示した（Ｌａｂｕｚａ ｅｔ ａｌ． 、Ｃｅｒｅａｌ Ｆｏｏｄｓ Ｗｏｒｌｄ， ３４（４） 巻、３５３ 頁、１９８９年） 。しかしながら、フィシンのタンパク質加水分解活性によって食品中のタンパク質が劣化されるので、フィシンによる処理は、食品のテクスチャと品質に対して有害である。例えば、イチジク乳液から調製された市販用の乳液抽出物は出発物質として使用することができる。イチジク乳液の抽出物は、フィシンと他の化合物を含有するので、“粗製フィシン”または“粗製フィシン抽出物”と呼ばれる。粗製フィシン抽出物は、市販されているので式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ の化合物を得る原料として有用である。粗製フィシン抽出物は、一般的に粉末もしくは錠剤のような固体の形態で入手できる。粗製フィシン製剤は、主要なプロテアーゼ成分がフィシンであり、分子量が約２０， ０００ダルトンのタンパク質であることを特徴とする。フィシンの存在は、例えば、ゲル浸透高速液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）のような分子量に基づいて物質を分離する方法と、フィシン活性の鋭敏な検定法であるベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−ＢＡＰＮＡ）のフィシン触媒加水分解反応によって検出することができる。式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ の化合物を粗製乳液もしくは粗製乳液抽出物から得る方法はそれぞれ実施例２、３および４に記載する。
【００５１】
式Ｉはいくつかの市販されている化合物、例えばアルキルレゾルシノール類を示すが、これらの化合物は他の用途に用いられている。本発明者らは、式Ｉで表される構造を有する化合物は上記のような褐変を起こし易い多くの食品の酸化褐変の有効な阻害剤であることを発見したのである。例えば、４−ヘキシルレゾルシノール（式ＩＩ）は医薬として利用されており、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ ， 第１０版、６８１ 頁、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．、ニューハンプシャー州、ラーウエイ、１９８３年に記載されている。
【００５２】
式ＩＩおよびＩＶ〜ＶＩＩ で表される抗褐変化合物は合成法で調製することができる。
【００５３】
一つの実施態様において、式Ｖの化合物は実施例５に詳細に述べるが、下記の一般的な方法にしたがって合成される。すなわち、７−ヒドロキシクマリンを水素化して７−ヒドロキシジヒドロクマリンとし、次に過剰のジアミノブタンと反応させて式Ｖの化合物（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）が得られる。この合成された化合物は、 １Ｈと１３ＣＮＭＲ、質量スペクトル分析、元素分析およびＴＬＣによって測定すると粗製フィシン抽出物から単離した化合物と同一である。
【００５４】
他の実施態様において、式ＶとＶＩＩ の化合物は下記の図５に概略的に示す手順によって合成することができる。すなわち、レゾルシノール（１，３−ジヒドロキシベンゼン）を、１つのＣ原子を芳香族環に付加する試薬、例えばガッターマン試薬（Ｚｎ（ＣＮ）２ ，ＨＣｌ）またはビルスマイヤー試薬（ＰＯＣｌ３ ／ＤＭＦ）で処理して誘導体化し、アルデヒド基を上記レゾルシノールの環に付加して２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドが製造される。この化合物はさらに、ピリジンおよびピペリジンのような塩基性有機溶媒中、高温下（例えば、約１００°〜１４０℃）でマロン酸（ＣＨ２ （ＣＯＯＨ）２ ）と反応させ、２，４−ジヒドロキシケイ皮酸が得られる。２，４−ジヒドロキシケイ皮酸の側鎖の二重結合を、例えば水素またはパラジウムを用いて水素化して２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸が製造される。この化合物を過剰のジアミノブタンと反応させると式Ｖ（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）が得られ、またスペルミジンと（適切なモル比で）反応させるとビス−フェノール化合物である式ＶＩＩ （ビス−２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルスペルミジン）が得られる。
【００５５】
本レゾルシノール誘導体は、各種の食品と飲料に適用して、褐変を特に酵素による褐変を防止または阻害することができる。ここで用いる“酵素による褐変”という用語は、キノン類を生成するＰＰＯの作用またはキノン類の重合に起因する、ｏ−キノンおよびキノンポリマーの生成、および食品中で自然に生成する他の要素でもたらされる酸化による黒ずみもしくは変色を意味する。
【００５６】
褐変を防止するために、レゾルシノール誘導体は、食品もしくは飲料を処理するのに、褐変を阻害もしくは防止するのに充分な量もしくは濃度で使用される。処理方法は、処理される食品もしくは飲料および所望の結果に依存しており、例えば、浸漬、噴霧、散粉、散液、液浸、混合および／またはソーキングを挙げることができる。これらの化合物は、水性希釈剤、例えば水、塩水もしくは緩衝液に添加して食品に適用してもよく、または生のまま、例えば果物ジュースに添加してもよい。必要量は、食品もしくは飲料の褐変に対する感受性、食品の状態および貯蔵状態による。褐変を防止もしくは阻害するのに充分な量は、食品技術の分野の熟練者によって経験的に決定することができる。
【００５７】
本発明の一つの実施態様において、ピンク小エビを式ＩＩの化合物の水溶液で処理した。式ＩＩを０．０００１〜０．００５％の範囲の濃度で用い、亜硫酸水素ナトリウムおよび海水で処理した小エビと比較した。その結果を図１０に示す。海水で処理した小エビは１〜２日以内にメラノーシスのスポットを発生した。式ＩＩは、重量基準で亜硫酸水素ナトリウムより、小エビの褐変を阻害するのに有効であった。例えば、０．００５重量％という少量の式ＩＩを含有する溶液は、亜硫酸水素ナトリウムの１．２５重量％溶液とほとんど同じ程度に、小エビのメラノーシスを阻害するのに有効であった。約０．１％までの濃度の式ＩＩを褐変を阻害するのに使用できる。
【００５８】
本発明の他の実施態様において、ピンク小エビをここに記載したように調製した式Ｖの水溶液で処理した。式Ｖの化合物を約０．１重量％〜約０．００１重量％の範囲の濃度で用い、亜硫酸水素ナトリウムで処理した小エビおよび未処理の小エビと比較した。その結果を図４に示す。未処理の小エビはすぐに（１〜２日以内）黒色スポットを発生した。式Ｖは、重量基準で亜硫酸水素ナトリウムより小エビの褐変を阻害するのに有効であった。例えば、式Ｖを約０．００５重量％という少量含有する溶液は、亜硫酸水素ナトリウムの１．２５重量％溶液と同じ程度に小エビのメラノーシスを阻害するのに有効であった。約０．１重量％の濃度の本レゾルシノール誘導体はこの目的に対して特に有効である。
【００５９】
本発明の組成物と方法は褐変し易い多くの食品と飲料の褐変を防止または大幅に阻害するのに有用である。このような食品と飲料としては、小エビ等の甲殻類、ジャガイモ、リンゴ、バナナ、レタス、モモ、ぶどう酒およびいくつかの果物ジュースが挙げられるが、これらに制限されない。本組成物は、食品特に小エビの劣化を起こさない。それが完全に起こらない場合、褐変は“防止されている”。未処理食品と比較して、同じ時間枠内で大幅に低い速度で起こる場合、褐変は“大幅に阻害されている”。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００６１】
実施例１〔粗製フィシンの限外濾過によるＹＭ５溶出液の製造〕
粗製ＥＤＣフィシン（Ｅｎｚｅｃｏ Ｆｉｃｉｎ， Ｅｎｚｙｍｅ ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｒｐ．，（ＥＤＣ） ニューヨーク州、ニューヨーク） の５０ｍｇ／ｍＬ溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州、セントルイス）中で調製した。その５ｍＬ部分（ａｌｉｑｕｏｔ）を０．４５μのフィルターで濾過して透明な濾液を作った。その濾液の一部分（ｓｕｂａｌｉｑｕｏｔ）（２．５ｍＬ）をＡｍｉｃｏｎ ５０００ ＭＷＣＯ ＹＭ５膜 （Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．， マサチューセッツ州、ダンバース）を用いて限外濾過を行った。限外濾過により得られた溶出液を“ＹＭ５溶出液”と呼ぶ。０．４５μ濾液とＹＭ５限外濾過物質を、ゲル浸透クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）で分析したところ、フィシンに対応する保持時間の範囲内において２１４ｎｍにおける吸光度がないことが見出された。また発色基質のベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロ−アニリド（Ｌ−ＢＡＰＮＡ）を用いても、ＹＭ５溶出液中にフィシン活性は全く検出されなかった。
【００６２】
限外濾過に引き続いて、粗製フィシン、その０．４５μ濾液およびＹＭ５溶出液を、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害について、下記のモデルシステムを用いて検定した。
【００６３】
そのモデル検定システムは以下の試薬でなされている。
５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；
０．５ｍＭ Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；
ＰＰＯ（キノコ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；
＋／−の変化をさせた濃度の粗製ＥＤＣフィシン；および
ＹＭ５製剤であり、合計容積が１ｍＬとなる。
【００６４】
これらの試薬を混合し、１ｃｍ通路長のキュベット中で２５℃にサーモスタットで調温したＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＵＶ−ＶＩＳ 分光光度計を用い４７５ｎｍにおいて１分間当りの光学濃度の変化（ＯＤ／分）をモニターすることによって、反応速度を測定した。ＰＰＯ活性の阻害作用は、ＰＰＯと緩衝液を含んでいるキュベットへ異なった部分（ａｌｉｑｕｏｔｓ） の試薬溶液を添加させることによって、粗製フィシンとＹＭ５製剤の濃度を変えて検定した。キュベットは２５℃で１分間あらかじめ保温してから、Ｌ−ＤＯＰＡを添加することにより反応を開始した。ＰＰＯの検定は、フィシン製剤およびフィシンなしのＹＭ５溶出液のそれぞれの不存在下および存在下で行った。３種の製剤がすべて同等レベルの阻害性を示した。それ故にＰＰＯ活性の阻害はＰＰＯに対するフィシンの作用に起因するものではないであろう。
【００６５】
実施例２〔粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式ＩＶ）の精製〕
粗製ＥＤＣフィシン（５０ｇ）は４００ｍＬのメタノールで抽出した。その上澄液をロータリーエバポレーターで蒸発させることによって乾固した。得られた固体を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で一部精製した。
【００６６】
逆相ＨＰＬＣは、移動相の疎水性を増大した場合の分子とＨＰＬＣカラム内の疎水性固定相の相互作用によって分子を分離することに基づいた精製法である。この場合、固定相（カラム充填物（ｐａｃｋｉｎｇ））はオクタデシル基（Ｃ１８）でコートされた樹脂であり、移動相（カラム中を流れる溶剤）は、変化させた量のアセトニトリルを存在させる０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であった。精製プロトコールは分析規模で開発され、次いでＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰｒｅｐ ＨＰＬＣ システム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州、ミルフォード）を用いて製造規模に改造した。
【００６７】
アセトニトリル濃度を増大させて直線のグラジエントを展開させたところ、標題の化合物が約２０％のアセトニトリルで溶出された。阻害剤のピーク画分をプールし、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ カラム（１５μ、７．８×３０ｃｍ）を用いＨＰＬＣでさらに精製した。溶出液は２１４ｎｍでモニターされ、阻害剤の存在を確認するために画分を検定した。ピーク画分をプールして濃縮した。式ＩＶの化合物の試料（上記のようにして単離されたかまたは合成されたもの）を １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法等のいくつかの分析法で分析した。その結果は式ＩＶに対応する構造と一致した。
【００６８】
【化１７】
【００６９】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ６．８９ （ｄ，Ｊ＝８ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６）， δ６．２７ （ｄ，Ｊ＝２．８１ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ３）， δ６．２４ （ｄ のｄ，Ｊ＝８．２４， ２．５９ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ５）， δ２．７１６ （ｔ，Ｊ＝７．４ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ８）， δ２．５１５ （ｔ，Ｊ＝７．２４ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ７）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法 （Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ） ） δ１７６．２０ （Ｃ９）， δ１５７．３５ （Ｃ２）， δ１５６．４１ （Ｃ４），δ１３１．６９（−ｖｅ 強度， Ｃ６）， δ１１９．４３ （Ｃ１）， δ１０７．８３ （−ｖｅ 強度， Ｃ５）， δ１０３．５７ （−ｖｅ 強度， Ｃ３），δ３４．８３ （Ｃ８）， δ２５．５０ （Ｃ７）
質量分析 ＥＩ ｍ／ｓ Ｍ ＋ １８２， １６４ （Ｍ ＋ −Ｈ２Ｏ）， １３６， １２３． （高速原子衝突（Ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ））（ＦＡＢ） ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ １８３， １６５ （Ｍ ＋ −Ｈ２Ｏ）．
【００７０】
実施例３〔粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式Ｖ）の精製〕
実施例１で得られたＹＭ５溶出液を、イオン交換クロマトグラフィーとＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。２ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中の実施例１に記載したようにして得られたＹＭ５溶出液の溶液をＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） 樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェーデン、アップサラ）のカラムに注入した。この樹脂に吸着しなかった物質を、２ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を２回カラムに供給して洗い出した。樹脂との相互作用の強度の関数として分子を溶出する塩化ナトリウムの直線グラジエント（０〜０．２Ｍ）をカラムに適用して、あらかじめ吸着した分子を分離した。溶出された物質は２１４ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度でモニターして、２０ｍＬずつの画分を集めた。グラジエントの全容積は２リットルであった。阻害剤の存在について、画分を実施例１に記載のようなモデル検定システムを用いて試験した。分析により５つの阻害のピークが見出された。これらのピークに基づいて見出された画分をプールし、凍結し、凍結乾燥を行った。プールＩＶおよびプールＶと標識された２つのピークは、阻害率のピークサイズに対する比率に基づいて最も強力な阻害剤であると思われ、実施例２に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製するためにそれを選択した。
【００７１】
ＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） のプールＩＶを凍結乾燥した物質を移動相に溶解し、遠心分離して粒子を除き、ＨＰＬＣカラムに注入した。アセトニトリル濃度を増大させて直線のグラジエントを展開させたところ、約１５％のアセトニトリルで阻害剤が溶出した。溶出液は多重チャンネルＵＶ−Ｖｉｓ検出器で２１４ｎｍと２８０ｎｍにおいてモニターされ、阻害剤の存在を確認するのに何回かの試験で画分を検定した。阻害剤のピーク画分を、スピードバック（ＳｐｅｅｄＶａｃ）で濃縮し、凍結し、そして凍結乾燥した。ＴＦＡ／メタノールグラジエントシステムでのＲＰ−ＨＰＬＣによって再分析したところ、回収された阻害剤について高い精製度を示した。
【００７２】
精製されたプールＩＶの阻害剤をいくつかの物理的方法および化学的試験法により分析した。阻害剤のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、芳香族もしくはフェノール化合物の典型的な波長範囲に入っている２８０ｎｍにおいて吸光度の最大値を示した。ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ） およびニンヒドリンとの反応は、それぞれアミド結合と第一級アミンの存在を示した。
【００７３】
阻害剤の試料を １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法等のいくつかの分析法によって分析した。その結果は下記式Ｖに対応する構造と一致した。
【００７４】
【化１８】
【００７５】
１ Ｈ ＭＮＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ７．５ 〜６．５ （拡大 （ｂｒｏａｄ）， ＯＨ）， δ６．９ 〜６．８ （ｂ， ＣＯＮ Ｈ ）， δ６．８６８ （ｄ，Ｊ＝８．１ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６）， δ６．３０４ （ｄ，Ｊ＝２．３ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ３）， δ６．２５９ （ｄ の ｄ， Ｊ＝２．４， ８．０ Ｈ Ｚ ， １Ｈ Ｃ５），δ５．５ 〜４．８ （ｂ， ＮＨ２）， δ３．１１５ （ｑ，Ｊ＝１２．３８， ６．２３ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ１０）， δ２．９０８ （ｂ， ２Ｈ， Ｃ１３）， δ２．７２５ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ８）， δ２．４３９ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ７）， δ１．５１， １．４６ （重複多重線 （ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ），４Ｈ， Ｃ１１， Ｃ１２）
１３ Ｃ ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法）（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ））δ１７６．６８ （Ｃ＝Ｏ）， δ１５５．７４ （Ｃ２）， δ１５５．４１ （Ｃ４），δ１３２．０９ （−ｖｅ 強度， Ｃ６）， δ１１９．５９ （Ｃ１）， δ１０７．９７ （−ｖｅ 強度， Ｃ５）， δ１０３．４９ （−ｖｅ 強度， Ｃ３） δ３９．８１ （Ｃ１３）， δ３９．０４ （Ｃ１０）， δ３６．６９ （Ｃ８）， δ２６．３３ （Ｃ７）， δ２６．０９ （Ｃ１１）， δ２４．６９ （Ｃ１２）
質量分析 ＤＣＩ ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ ２５３， １６５ （Ｍ−ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２） ＥＩ ｍ／ｚ Ｍ＋ ２５２， １６４， （Ｃ９Ｈ８Ｏ３） １３６， １２３，（高速原子衝突（Ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ））（ＦＡＢ））ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ ２５３
【００７６】
実施例４〔粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式ＶＩＩ）の精製〕
実施例２に記載の手順によって得られたＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） のプールＶの凍結乾燥物質をさらにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製条件は実施例２で用いたものと同じであった。アセトニトリル濃度を増大させて直線のグラジエントを展開させたところ、式ＶＩＩ の化合物が約３０％のアセトニトリルで溶出された。溶出液は、多重チャンネルＵＶ−Ｖｉｓ検出器で２１４ｎｍと２８０ｎｍにおいてモニターされ、式ＶＩＩ で表される阻害剤の存在を確認するため、何回か試験し画分を検定した。阻害剤のピーク画分をプールし、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ カラム（１５μ、７．８×３０ｃｍ）を使いＨＰＬＣでさらに精製した。溶出液を２１４ｎｍにおいてモニターし、阻害剤の存在を確認するため画分を検定した。ピークの画分をプールして濃縮した。ＲＰ−ＨＰＬＣで再分析したところ、回収した阻害剤について高い精製度を示した。
【００７７】
式ＶＩＩ の化合物の試料をいくつかの分析法（ １Ｈと質量分析法）で分析したところ、式に対応する構造に一致した。
【００７８】
【化１９】
【００７９】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ） ３００ ＭＨ Ｚ δ６．８６１， ６．８４５（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ６， Ｃ２５）， δ６．２７６ （重複二重線（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅｔｓ））， Ｊ＝２．５６， ２Ｈ， Ｃ３， Ｃ２２）， δ６．２０８， ６．１９７（ 重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ））ｄ の ｄ，Ｊ＝８．１， ２．５７ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ５， Ｃ２４）， δ３．２４１， ３．１８０ （三重線（ｔｒｉｐｌｅｔｓ））， Ｊ＝６．３０， ４Ｈ， Ｃ１０， Ｃ１６），δ２．８９３ 〜２．７１１ （よく分解している（ｗｅｌｌ ｒｅｓｏｌｖｅｄ）） ｍ， ８Ｈ， Ｃ８， Ｃ１３，Ｃ１４， Ｃ１８），δ２．５１， ２．４４ （ｔ，Ｊ＝７．３４， ４Ｈ， Ｃ７， Ｃ１９）， δ１．７６１ （五重線（ｑｕｉｎｔｅｔ））， ２Ｈ， Ｃ１５），δ１．６０１ 〜１．６０４ （分解していない（ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ）） ｍ， ４Ｈ， Ｃ１１， Ｃ１２）
質量分析 ＤＣＩ ｍ／ｚ（弱（ｗｅａｋ））３１０ （Ｍ−Ｃ９Ｈ８Ｏ３）， １６５ （Ｃ９Ｈ８Ｏ３Ｈ＋ ） １４６ （Ｃ７Ｈ１９Ｎ３Ｈ ＋ ） ＥＩ（高分解 （ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）） ｍ／ｚ ３０９ （Ｍ−Ｃ９Ｈ８Ｏ３）， ＦＡＢ ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ ４７４， ３１０ （Ｍ−Ｃ９Ｈ８Ｏ３）
【００８０】
実施例５〔式Ｖの化合物の合成〕
式Ｖで表される化合物（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）：
【００８１】
【化２０】
【００８２】
を下記の手順で合成した。
【００８３】
無水エタノール（２００ｍＬ）中の７−ヒドロキシクマリン（５．０ｇ、０．０３１モル；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ） の溶液を、Ｐａｒｒの装置内で、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒；５００ｍｇ、５０％水、Ｋｏｄａｋ， Ｉｎｃ． 、ニューヨーク州、ロチェスター）上で、５５℃にて２４時間加圧下にて水素化した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；シリカゲル：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）が反応の完了を示した。反応混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ） 床（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ． 、ペンシルベニア州、フィラデルフィア） で濾過し、減圧蒸発させて粗製品（４．５ｇ）を得た。この物質の一部（２．５ｇ）をトルエンにより再結晶させ、減圧乾燥させて７−ヒドロキシジヒドロクマリンを得た。
【００８４】
収量： １．８３ｇ；融点 １３３°〜１３５．５ ℃；
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ７．０１ （ｄ，Ｊ＝８．３ Ｈ Ｚ ， １Ｈ， Ｃ５）， δ６．５５ （ｄ の ｄ， Ｊ＝４．１， ２．４ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６）， δ６．４８ （ｄ，Ｊ＝２．４ Ｈ Ｚ ， １Ｈ， Ｃ８）， δ２．８４７ （ｔ，Ｊ＝７．２ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ３）， δ２．６８５ （ｄ のｄ， Ｊ＝７．７， ６．０ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ６）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法）（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ） δ１６９．８５ （Ｃ２， ＋ｖｅ 強度），δ１５７．５７ （Ｃ７， ＋ｖｅ 強度），δ１５３．６１ （Ｃ９， ＋ｖｅ 強度）， δ１２９．７２ （Ｃ５， −ｖｅ 強度），δ１５７．５７ （Ｃ１０， ＋ｖｅ強度），δ１１２．２１ （Ｃ６， −ｖｅ 強度），δ１０４．４２ （Ｃ８， −ｖｅ 強度），δ３０．０１ （Ｃ３， ＋ｖｅ強度），δ２３．３５ （Ｃ４， ＋ｖｅ 強度）．
【００８５】
ジアミノブタン（３．０ｍＬ：０．３モル；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ）を添加用ロートを取り付けた三ツ口フラスコ内で窒素雰囲気下で５５℃に加温した。メタノール（１５ｍＬ）中の７−ヒドロキシジヒドロクマリン（１．０ｇ、０．００６モル）を滴下して加えた。添加を完了した後、反応混合物を蒸発乾固し、残留物を酢酸エチルを用いて繰り返しトリチュレート（ｔｒｉｔｕｌａｔｅ）した。残留ガム状物を高真空度下で乾燥した。この物質をフラッシュ（ｆｌａｓｈ）カラムクロマトグラフィー（シリカ；２０％ ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ＮＨ４ＯＨ（５％）〜３０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ＮＨ４ＯＨ（５％）のグラジエント溶出液）において精製した。画分をＴＬＣに基づいて組合せて式Ｖ（１．０ｇ）が得られた。 １Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、質量分析および元素分析は、この合成化合物が実施例３で得られたＹＭ５溶出液から単離した化合物と同一のものであることを示した。
【００８６】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ７．５ 〜６．５ （拡大（ｂｒｏａｄ）， ＯＨ）， δ６．９ 〜 ６．８ （ｂ， ＣＯＮＨ ）， δ６．８６８ （ｄ，Ｊ＝８．１ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６），δ６．３０４ （ｄ，Ｊ＝２．３ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ３），δ６．２５９ （ｄ の ｄ， Ｊ＝２．４， ８．０ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ５）， δ５．５ 〜 ４．８（ｂ，ＮＨ２） ，δ３．１１５ （ｑ，Ｊ＝１２．３８，６．２３ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ１０）， δ２．９０８ （ｂ， ２Ｈ， Ｃ１３）， δ２．７２５ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ８），δ２．４３９ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ７）， δ１．５１， １．４６（重複多重線 （ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ））， ４Ｈ， Ｃ１１， Ｃ１２）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ））δ１７６．６８ （Ｃ＝Ｏ）， δ１５５．７４ （Ｃ２）， δ１５５．４１ （Ｃ４），δ１３２．０９ （−ｖｅ 強度， Ｃ６） δ１１９．５９ （Ｃ１），δ１０７．９７ （−ｖｅ 強度， Ｃ５），δ１０３．４９ （−ｖｅ 強度， Ｃ３），δ３９．８１ （Ｃ１３）， δ３９．０４ （Ｃ１０）， δ３６．６９ （Ｃ８）， δ２６．３３ （Ｃ７）， δ２６．０８８ （Ｃ１１）， δ２４．６９ （Ｃ１２）
元素分析 Ｃ１３ Ｈ２０ Ｎ２ Ｏ３ 、 計算値 Ｃ ６１．８８，Ｈ ７．９９， Ｎ １１．１１ 、
実測値 Ｃ ６１．９７， Ｈ ７．９６， Ｎ １１．０１
質量分析 ＤＣＩ ｍ／ｚ Ｍ＋ Ｈ ＋ ２５３， １６５（Ｍ − ＮＨ２（ＣＨ２）４ ＮＨ２）ＥＩ ｍ／ｚ Ｍ ＋ ２５２， １６４， １３６， １２３， ＦＡＢ ｍ／ｚ Ｍ＋ Ｈ ＋ ２５３
【００８７】
実施例６〔式ＶＩの化合物の合成〕
式ＶＩで表される化合物（ビス−２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）を実施例５に記載した方法を修正して合成した。ジアミノブタン（１．０９ｍＬ、５．４８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水エタノールに溶解した。そこに７−ヒドロキシジヒドロクマリン（４．５ｇ）を徐々に添加した。得られた溶液を室温で１時間攪拌した。溶剤をロータリーエバポレーターで除去して赤色のガム状物を得た。過剰の酢酸エチルを添加し次いでロータリーエバポレーターで蒸発させることによりピンク色の固体を得て、これを過剰の酢酸エチルで洗浄し次に減圧デシケーターで乾燥して４．６ｇ（収率８２％）の式ＶＩの化合物を得た。単離した化合物を １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法等のいくつかの分析法で分析した。その結果は式ＶＩに対応する構造と一致した。
【００８８】
【化２１】
【００８９】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ） ３００ ＭＨ Ｚ ． δ６．８４１ （ｄ，Ｊ＝８．１ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ６， Ｃ２２）， δ６．２７７ （ｄ，Ｊ＝２．４ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ３， Ｃ１９）， δ６．２０４ （ｄ のｄ， Ｊ＝８．１， ２．４ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ５ Ｃ２１）， δ３．０８９ （ｂ，４Ｈ， Ｃ１０， Ｃ１３） ，δ２．７７９ （ｔ，Ｊ＝７．４ ＨＺ ， ４Ｈ， Ｃ８， Ｃ１５）， δ２．４２２ （ｔ，Ｊ＝７．４ ＨＺ ， ４Ｈ， Ｃ７， Ｃ１８）， δ１．３５ （ｂ， ４Ｈ，Ｃ１１， Ｃ１２）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ ７５．４７ ＭＨ Ｚ（Ｊ−調節されたスピン・エコー（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ）． δ１７６．０５ （Ｃ９， Ｃ１４， ＋ｖｅ 強度）， δ１５７．７４ （Ｃ２， Ｃ１８，＋ｖｅ 強度）， δ１５７．０２ （Ｃ４， Ｃ２０， ＋ｖｅ 強度）， δ１３１．５８ （Ｃ６， Ｃ２２， −ｖｅ 強度）， δ１１９．５５ （Ｃ１， Ｃ１７，＋ｖｅ 強度）， δ１０７．４７ （Ｃ５， Ｃ２１， −ｖｅ 強度），δ１０３．５９ （Ｃ３， Ｃ１９， −ｖｅ 強度）， δ３９．４９ （Ｃ８， Ｃ１５， ＋ｖｅ 強度）， δ３７．７３ （Ｃ１０， Ｃ１３， ＋ｖｅ 強度），δ２７．５４ （Ｃ１１， Ｃ１２， ＋ｖｅ 強度），δ２７．０１ （Ｃ７， Ｃ１６， ＋ｖｅ 強度）．
質量分析 ＦＡＢ ｍ／ｚ Ｍ＋ Ｈ ＋ ４１７， ３０９ （Ｍ＋ − Ｃ６Ｈ５Ｏ２） ， ２５３ （Ｍ＋ ＝Ｃ９Ｈ９Ｏ３）．
【００９０】
実施例７〔各種レゾルシノール誘導体によるＰＰＯの阻害〕
各種のレゾルシノール化合物がＰＰＯ（キノコ）を阻害する作用を測定するために、実施例１に記載したのと同様の線形分光光度検定システムを使用した。その検定混合物は：
５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５；
０．１３３ｍＭのＬ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）；
ＰＰＯ（キノコ）；および
＋／−の変化をさせた濃度の被検化合物
で構成されていた。反応速度は、４７５ｎｍにおける吸光度の１分間当たりの変化を２５℃にて測定してモニターした。見かけ阻害定数（Ｉ５０） を表１に示す。
【００９１】
【表１】
【００９２】
Ｉ５０は、酵素の５０％の阻害率を得るのに必要な阻害剤の濃度を表わす。その結果は、同レベルの阻害に到達するのにレゾルシノール誘導体は、レゾルシノールと比べてはるかに少ない濃度しか必要としないことを示している。
【００９３】
実施例８〔ＹＭ５溶出物のピンク小エビメラノーシスに対する作用〕
ピンク小エビ〔ペネウス・デュオラルム（Ｐｅｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ） 〕を、フロリダ州、キー・ウエストで捕獲して冷凍し、処理する前に解凍した。メラノーシスは、表２に示すメラノーシスを説明するために開発された等級によって小エビを格付けした。
【００９４】
【表２】
【００９５】
このメラノーシスの等級は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ が生の小エビを等級分けするのに作成した既存の勧告に関連づけることができる（連邦法施行規則１９８２タイトル５０、パート２６５ 、サブパートＡ、小エビの等級に関する米国一般標準、２６２ 〜２６８ 頁） 。４以上の等級の評価は製品品質のかなり重要な欠陥を示す。８以上の評価は許容できない製品に近い重大な欠陥を表わす。
【００９６】
捕獲は、新鮮な前頭部（ｈｅａｄｓ−ｏｎ）ピンク小エビが捕獲後１２時間以内に船着場で得られるように計画された。小エビはすべて、通常通りに、船上で洗浄され一時的に氷の中に保管された。基本的な手順は、２．５リットルの各種の浸漬組成と濃度の液中で４００〜６００ｇの小エビを１分間すすぎ、次に水きりを行いプラスチックの袋につめて氷の中に保管した。この袋は、氷を解かす各種の影響を排除するために必要であるとみなれた。包装された小エビとともに氷を入れたコンテナーは、３５°Ｆ（１．７℃）の冷蔵状態で１日おきに氷を入れて保管された。
【００９７】
２週間の保管期間中、通常通りにメラノーシスの発生を採点し、写真撮影を行った。検査員が各種の処理を識別できないように、小エビの袋には番号を付けた。１名の経験を積んだ検査員が上記の等級（表２）に関する全ての採点を行った。等級には、メラノーシスの進行段階の通常例を示す予め現像されたカラー写真が添付された。目的は、処理法間の明白な差異を見つけて選別し、次の統計的評価法により最高の処理法を選択することである。
【００９８】
各種の浸漬もしくは化学的処理には、対照としての水道水、１．２５％の濃度の亜硫酸水素ナトリウム、粗製ＥＤＣフィシンおよび実施例１で述べた手順で調製された“Ｆ１００”と命名されたＹＭ５溶出液が含まれた。浸漬溶液は新鮮な水道水であった。
【００９９】
処理（浸漬）と小エビと浸漬溶液の比率を表３に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
処理は、バッチに蒸留水で行ったことが特に指定がない限り、水道水に各種のものを添加して行った。すべての処理において、小エビは６０〜８０秒間浸漬液中に完全に沈め、次いでゆるやかに攪拌しながら短時間（５〜１０秒間）水切り器で水切りを行った。
【０１０２】
その結果を図１および２に示す。図１は、ＹＭ５溶出液、Ｆ１００、がメラノーシスを減少させることについて亜硫酸水素ナトリウムと同じ程度か、またはそれより優れていたことを示す。図２はＦ１００が、メラノーシスを減少させることについて、粗製フィシンと同じ程度に有効で、かつ亜硫酸水素ナトリウムより優れていたことを示す。
【０１０３】
実施例９〔ＹＭ５溶出液を用いてリンゴの酵素による褐変の阻害〕
外界温度（２２〜２４℃）で保持された新鮮なマッキントッシュリンゴ全体を４等分に切って芯を取り去り、１／４インチ厚のスライスに切断した。そのリンゴのスライスを、５秒より少ない時間、１０秒間、１分間、２．５分間および５分間等の各種の時間、表４に示す溶液を用いて、スライス面をブラッシングするかまたは全体を完全に沈めて浸漬することによって処理した。処理に続いて、リンゴのスライスは、外界温度に放置され空気にさらされた。そのスライスを、０、１、２、３、４および２４時間後に褐変を目視で検査した。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
その結果は、ＹＭ５溶出液を使った処理５と６（表４）がリンゴのスライスの褐変の程度を最少にすることを示した。全試料が最初は（ゼロ時間）白色であった。対照試料（表４、処理１〜４）の褐変は１時間後に認められ、最高の褐変は約３時間後に起こった。処理５と６を受けたスライスには、３時間後でも有意な褐変は全く認められなかった。２４時間後に、処理５と６を受けたスライスはわずかに褐変したが、対照試料より大幅に少ない褐変を示した。
【０１０６】
実施例１０〔式Ｖの化合物およびＹＭ５溶出液によるリンゴの褐変の阻害〕
外界温度にて保管されていた２個の新鮮な傷のないマッキントッシュリンゴ全体を、ステンレス鋼製果物ナイフで切って４等分し、芯を除き、１／４インチ厚のスライスに切断した。表５に列挙した、０．８ｍＬの各処理溶液を外界温度にて、新たに切断した白色スライスのさらされた上面に、処理１回当り３回試料液を塗布した。式Ｖの化合物は実施例５に記載されているように合成した。塗布に続いて、スライスを外界温度に放置し、空気と光にさらさせて、１５分間〜４時間にわたって褐変の相対速度と程度を定期的に目視観察した。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
新たに切断された試料はすべて、最初は白色であった。処理してから１５分以内に、溶液３、４および６で処理された試料は白色のままであったが、それを除くすべての試料にある程度の褐変が生じた。１時間後、溶液４と６で処理された試料は依然として白色であったが、他の試料は種々の程度の褐変を示した。他の試料の褐変の程度の、最少から最高の褐変までの順位は３＜２，５＜１，７であった。約３時間後に、最高の程度の褐変が、約１時間後の上記に述べられたランクで、試料１、２、３、５および７に生じた。溶液４と６で処理した試料は白色のままで特に色は変化しなかった。
【０１０９】
上記の試験条件下では、２０ｍＭの濃度の式Ｖの化合物は、ＹＭ５溶出液と粗製フィシンより一層有効にリンゴの褐変を阻害した。ラクトースおよび／または１，４−ジアミノブタンは褐変を防止しなかった。
【０１１０】
実施例１１〔ピンク小エビメラノーシスに対するＹＭ５溶出液と式Ｖの化合物の効果〕
ピンク小エビ（ペネウス・デュオラルム（Ｐｅｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ） ）をフロリダ州、キーウエストで捕獲して凍結し、処理する前に解凍した。メラノーシスは、表２の実施例８に示されたメラノーシスを説明するために開発された等級によって小エビのメラノーシスを評価した。
【０１１１】
基本的な手順は、種々の組成と濃度の浸漬液で小エビを１分間すすぎ（式Ｖの化合物を２種の最高濃度で含有する試験溶液、すなわち０．１％と０．０５％は、この物質が不足していたので、その試験溶液を６匹の個々の小エビに塗布した）、次いで水きりを行いプラスチック製袋内に包装し氷中に保管した。この袋は、解ける氷の種々の影響を排除するために必要であるとみなされた。包装された小エビとともに氷の入ったコンテナは、１日おきに氷を入れ、３５°Ｆ（１．７℃）の冷凍状態で保管した。メラノーシスの発生は、実施例８に記載したものと同様に、保管の７日間の間、通常通りに採点し写真を撮影した。
【０１１２】
種々の浸漬液または化学処理液には、対照としての水道水、１．２５％の濃度の亜硫酸水素ナトリウム、１％の濃度のＹＭ５溶出液（実施例１で調製した）、および図３および４に示す各種の濃度の式Ｖの化合物が含まれていた。図３に示す結果は、０．１重量％の濃度の式Ｖの化合物が、メラノーシスを減少させるのに亜硫酸水素塩と同程度に有効であることを示している。図４は、０．００５％というような少量の式Ｖの化合物が、メラノーシスを減少させるのに亜硫酸水素ナトリウムと同じ程度に有効であったことを示している。
【０１１３】
実施例１２〔新鮮なピンク小エビのメラノーシスに対する式Ｖの化合物の効果〕
ピンク小エビ（ペネウス・デュオラルム（Ｐｅｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ） ）を処理して、新たに捕獲した小エビについて、試験は小エビ捕獲用船上で実施したこと以外は実施例８と同様に評価した。小エビは、各種の濃度の式Ｖの化合物で処理する前に凍結を行わなかった。全溶液を海水で調製した。その結果を図６に示す。式Ｖの化合物は新鮮なピンク小エビのメラノーシスの防止に有効である。
【０１１４】
実施例１３〔式Ｖの性能に対する処理後のすすぎの効果〕
新鮮なピンク小エビを実施例１２に記載したのと同様にして処理し評価した。０．０２５％の式Ｖの化合物で処理した小エビを直接保管するか、または処理後次いで海水ですすいでから保管した。その結果を図７に示したが、処理後のすすぎは、式Ｖの化合物による小エビメラノーシスの阻害に対して有意な効果がないことを示している。
【０１１５】
実施例１４〔式Ｖの化合物の溶液の溶媒として海水または淡水を用いる効果〕
新鮮なピンク小エビを実施例１２に記載したのと同様にして処理し評価した。小エビは、海水もしくは淡水で調製した式Ｖの化合物の０．０１％溶液に浸漬した。データを図８に示すが、溶液が淡水もしくは海水で調製された場合においても、式Ｖの化合物による小エビメラノーシスの阻害の有意な効果はないことを示している。
【０１１６】
実施例１５〔式Ｖの化合物の０．０１％溶液に、小エビを繰り返し浸漬する効果〕
新鮮なピンク小エビを実施例１２に記載したのと同様にして処理し評価した。この実施例では、式Ｖの化合物の同じ１リットル０．０１％溶液の中に、小エビの１ポンドずつの異なるバッチを各々１分間ずつ浸漬した。合計８回浸漬を行った。その結果を図９に示すが、式Ｖの化合物は、同じ０．０１％溶液に８回浸漬を行った後でも依然として有効なメラノーシス阻害剤であることを示している。
【０１１７】
実施例１６〔小エビメラノーシスの発生に対する４−ヘキシルレゾルシノールの効果〕
式ＩＩの化合物（４−ヘキシルレゾルシノール、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） を式Ｖの化合物の代わりに用いることを除いて実施例８に記載したのと同様にして、ピンク小エビを処理し評価した。ピンク小エビは、式ＩＩの化合物の０．０００１％〜０．００５％溶液に浸漬し前述のように保管した。データを図１０のグラフで示すが、式ＩＩの化合物は、０．０００５％という低濃度で小エビメラノーシスの生成の強力な阻害剤であることを示している。
【０１１８】
実施例１７〔小エビメラノーシスの発生に対する式ＶＩの化合物の効果〕
式ＶＩの化合物（実施例６参照）を式Ｖの化合物の代わりに用いること以外は、実施例８に記載したのと同様にしてピンク小エビを処理し評価した。ピンク小エビは、式ＶＩの化合物の０．００１〜０．０２５％溶液に浸漬し、前述のように保管した。データは、図１１のグラフに示したが、式ＶＩの化合物が０．００５％という低濃度で小エビのメラノーシスの強力な阻害剤であることを示している。
【０１１９】
実施例１８〔小エビメラノーシスの発生に対する式ＩＶの化合物の効果〕
式ＩＶの化合物（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸） を式Ｖの化合物の代わりに用いること以外は、実施例８に記載したのと同様にしてピンク小エビを処理し評価した。ピンク小エビは式ＩＶの化合物の０．００１％〜０．１％溶液に浸漬し、前記のようにして保管した。データは、図１２のグラフに示したが、式ＩＶの化合物が０．０５％という低濃度で小エビのメラノーシスの生成の阻害剤であることを示している。
【０１２０】
実施例１９〔新鮮なブラウン小エビのメラノーシスに対する式Ｖの化合物の効果〕
ブラウン小エビ（Ｂｒｏｗｎ ｓｈｒｉｍｐ） を、実施例８でピンク小エビについて記載したのと同様にして処理し評価した。その結果を図１３に示したが、式Ｖの化合物が、ピンク小エビの場合と同様に、ブラウン小エビのメラノーシス発生を阻害するのに有効であることを示している。
【０１２１】
実施例２０〔タイガー小エビから単離したＰＰＯに対する式Ｖの化合物の効果〕
台湾産ブラックタイガー小エビ（Ｂｌａｃｋ Ｔｉｇｅｒ Ｓｈｒｉｍｐ） 〔ペンネウス・モノドン（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ）〕からＰＰＯを以下の方法で単離した。タイガー小エビの頭部を液体窒素で凍結し、次いで微細粉末に粉砕した。粉末状の小エビの頭部を、リン酸塩緩衝液中で攪拌しながら抽出した。粗抽出物を、０〜４０％の硫酸アンモニウム飽和溶液を使って硫酸アンモニウム沈澱に付し、次いで４℃にてフェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ−４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） を用いて疎水性相互作用で分離して精製した。精製されたＰＰＯの画分を限外濾過法で濃縮した。酵素の純度はゲル電気泳動法を用いて測定した（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． 、Ｎａｔｕｒｅ、２２７ 巻、６８０ 〜６８５ 頁、１９７０年）。
【０１２２】
対照試験を以下のように行った。５０μｌ部分の５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を８８０μｌの５ｍＭのＬ−ＤＯＰＡ、５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）に添加した。７０μｌのタイガー小エビＰＰＯ（合計タンパク質が６．３ｍｇの原液）を添加し、直ちにＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ分光光度計を用いて４７５ｎｍにおいて１０分間、３５℃で反応をモニターした。
【０１２３】
阻害剤を試験するために、実施例５に記載したように調製した式Ｖの化合物の溶液（２０ｍＭ）の５０μｌを、８８０μｌのＬ−ＤＯＰＡ溶液に添加した。７０μｌのタイガー小エビＰＰＯの溶液（合計タンパク質が６．３ｍｇの原液）を添加し、直ちに、上記対照試験について記載したのと同様にして分光光度計で反応をモニターした。各試験は３回ずつ行った。
【０１２４】
その結果を表６に示す。
【０１２５】
【表６】
【０１２６】
その結果は式Ｖの化合物によってＰＰＯの活性が実質的に阻害されたことを示している。
【０１２７】
実施例２１〔アボカドの酵素による褐変における式Ｖの化合物の効果〕
アボカドは、損傷を受けたり、切断されたり、またはアボカドパルプをブレンドされると、ＰＰＯ接触褐変反応を受けるが（Ｋａｈｎ， Ｖ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，４２巻、３８〜４３頁、１９７５年）、これは、処理されたアボカド製品の市場性を制限する重大な要因である。式Ｖの化合物のアボカド褐変阻害剤としての機能を、下記のようにして評価した。
【０１２８】
アボカドを２等分して、例えば、０．１％（ｗ／ｗ）の式Ｖ、１％（ｗ／ｗ）レモンジュース、０．１％の式Ｖと１％のレモンジュースの組合せ、および負の対照としての水を含む各種試験溶液の存在下で、フードプロセッサーで混合した。この濃度は、アボカドのブレンド調製物中の最終濃度である。式Ｖは、２％水溶液の原液として調製した。試験溶液は、アボカドをスライスして直ちに行う処理中にアボカドパルプに添加した。約１００ｇのブレンドされたアボカドを各試験試料として使用した。
【０１２９】
試料は、室温で４時間静置し、次いで４℃で保存を続けた。試料は、官能検査員による視覚評価を行った。室温での３時間の保管後では、水およびレモンジュースの対照試料は著しい褐変を示したが、一方式Ｖの試料はごくわずかに褐色になっただけであった。式Ｖ／レモンジュースの試料は褐変の徴候を全く示さなかった。２４時間後では、水およびレモンジュースの対照試料は許容できない褐色を呈したが、これとは反対に式Ｖおよび式Ｖ／レモンジュースの試料は依然として許容できる黄緑色であった。試料を９６時間保管した時点で再評価したところ同じ結果が得られた。すなわち式Ｖの試料はごくわずか変色しただけで式Ｖ／レモンジュースで処理した試料はほとんど変化していなかった。水およびレモンジュースによって処理した対照試料は、黒ずんだ褐色に変色した。０．１％の式Ｖはアボカドの褐変の阻害に有効であり、０．１％の式Ｖと１％のレモンジュースの組合わせはさらに大きな効力を有するという結論が得られた。
【０１３０】
実施例２２〔アボカドの褐変の阻害に対する各種の濃度の式Ｖの化合物の効果〕
アボカドブレンド物中の式Ｖの化合物の最終濃度を変えたことを除いて実施例２１と同様にして、アボカド試料と試験溶液を調製し、処理した試料を評価した。式Ｖの濃度としては０．０５％、０．０２５％、０．００５％および０．００１％を採用した。試験試料と対照試料はすべて１％のレモンジュースを含有させて製造した。試料はすべてブレンドした後４℃で保管した。２４時間後、対照試料だけが顕著に褐変した。０．００１％と０．００５％の式Ｖの試料には、７２時間の冷蔵保管後、わずかに褐変がみとめられたが、対照試料は濃い褐色であった。０．０２５％と０．０５％の式Ｖの試料は、依然として許容できる黄緑色であった。９６時間後では、０．０２５％と０．０５％の式Ｖの試料は酵素による褐変の徴候を引続き全く示さなかったが、低濃度の式Ｖの試料は顕著に褐変を示し、対照試料は非常に濃い褐色になった。０．０２５％と０．０５％の式Ｖは、上記の条件下で少なくとも９６時間はアボカドの褐変を防止するのに非常に有効のようであった。
【０１３１】
【発明の効果】
本発明により、食品と飲料の酸化褐変、特にＰＰＯ活性によって起こる酵素による酸化褐変を阻害する４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度のＹＭ５抽出物（Ｆ１００）の作用を比較するグラフである。
【図２】図２は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度のフィシンおよびＹＭ５抽出物（Ｆ１００）の作用を比較するグラフである。
【図３】図３は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、ＹＭ５抽出物（１重量％）および式Ｖの化合物（０．１重量％）の作用を比較するグラフである。
【図４】図４は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度の式Ｖの化合物の作用を比較するグラフである。
【図５】図５は、式Ｖと式ＶＩＩ の化合物の合成工程を示す概略図である。
【図６】図６は、新鮮なピンク小エビすなわち処理をする前に冷凍しなかった小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、各種濃度の式Ｖの化合物の作用を比較するグラフである。
【図７】図７は、０．０２５％の式Ｖの化合物の小エビメラノーシスの阻害に対する、すすぎなしと処理後の海水すすぎの作用を比較するグラフである。
【図８】図８は、式Ｖの化合物の海水もしくは淡水による０．０１％溶液による小エビメラノーシスの阻害を比較するグラフである。
【図９】図９は、未処理の小エビの異なる１ポンドずつのバッチを繰り返し同じ式Ｖの化合物の０．０１％海水溶液１リットル中に浸漬した場合の、小エビメラノーシスの阻害を比較するグラフである。
【図１０】図１０は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式ＩＩの化合物の作用を比較するグラフである。
【図１１】図１１は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式ＩＩの化合物の作用を比較するグラフである。
【図１２】図１２は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式ＩＶの化合物の作用を比較するグラフである。
【図１３】図１３は、テキサスブラウン小エビ（Ｔｅｘａｓ ｂｒｏｗｎ ｓｈｒｉｍｐ） におけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式Ｖの化合物の作用を比較するグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品の褐変は食品と飲料の産業界では重大な問題である。褐変や酸化による黒ずみは、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）等のような酵素の作用による、または酵素の作用ではない化学反応による、例えばいくつかの食品に存在するフェノール化合物の重合による場合がある。高いＰＰＯ活性が、褐変を起こし易い食品、例えば、小エビ、バナナおよびキノコ類に存在する。褐変は食品と飲料の外観とテクスチャに有害な変化を起こす。酵素作用によるものと酵素作用によらない褐変はともに食品産業界にとって重大な問題になっており年間何百万ポンドの廃棄食料製品が生じている。
【０００３】
酵素による褐変は、特に、小エビに黒点を発生させることを特徴とする小エビメラノーシスを起こす要因として、特に多くの研究の課題になっている（Ｆａｕｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９巻、３０２ 〜３１０ 頁、１９５３年）。酵素による褐変は、モノ−およびジフェノール類からｏ−キノン類が生成するＰＰＯ接触酸化反応が行われた結果、これらのキノン類は自発的に重合して、黒ずんだ色の高分子量ポリマーを生成し、特徴的な褐変または黒ずんだスポットの発生をもたらす。
【０００４】
ＰＰＯの熱による不活性化、および食品のｐＨを変化させること等のような種々の化学的処理を含む、褐変を防止するいくつもの方法が開発されてきた。熱による不活性化は、ＰＰＯを不活性化するのに必要な高温は食品の品質とテクスチャを変化させるので、果物類や海産食品等のような生鮮食品に対しては適切ではない。同様に、酸（例えば、クエン酸もしくはリン酸）を添加してｐＨを下げる方法はいくつかの食品の外観と品質に有害な影響を与える。
【０００５】
キノコ類のＰＰＯ接触酵素反応による褐変をクエン酸を用いて制御されることがＭｃＣｏｒｄとＫｉｌａｒａにより、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ， ４８巻、１４７９〜１４８３頁、１９８３年に報告されている。エルサレム・アルチコークス（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ａｒｔｉｃｈｏｋｅｓ） の抽出物のポリフェノールオキシダーゼ活性を種々の亜硫酸塩化合物を用いて阻害する方法がＺａｗｉｓｔｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ． Ｉｎｓｔ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈ． Ｊ． ， ２０（３）巻、１６２ 〜１６４ 頁、１９８７年に報告されている。ケイ皮酸、ｐ−クマリン酸およびフェルラ酸を用いることにより、果物ジュース類の酵素による褐変が制御されることがＪ．Ｒ．Ｌ． Ｗａｌｋｅｒ 、Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １１ 巻、 ３４１〜３４５ 頁、１９７６年に記載されている。Ｔ． Ｃ． Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ． は、フロログルシノールとレゾルシノールおよびその誘導体であるｄ−カテキンとオルシノールは、ＰＰＯのための基質ではないが、モモのＰＰＯによって生成される４−メチル−ｏ−キノンと反応するということをＰｌａｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ４８ 巻、２４〜３０頁、１９７１年に報告している。Ｒ． ＫｕｔｔｎｅｒとＨ． Ｗａｇｒｅｉｃｈ 、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ４３ 巻、８０〜８７頁、１９５２年には、キノコＰＰＯ（カテコラーゼ）は安息香酸と選択された安息香酸誘導体によって阻害されることが報告されている。しかしこれらの方法はいずれも、高価であるか、入手しにくいかまたは性能が劣っているために、完全に満足すべきものであると立証されていない。
【０００６】
ＬａｂｕｚａはＣｅｒｅａｌ Ｆｏｏｄｓ Ｗｏｒｌｄ， ３４（４） 巻、３５３ 頁、１９８９年に、ある種の食品の酵素による褐変を制御するのにプロテアーゼ類、特にフィシンを使用することを記載している。著者はこの作用がこのプロテアーゼのＰＰＯに対する攻撃に起因すると考えている。
【０００７】
食品産業界で広く行われている褐変を減らす別の方法は、食品と飲料に亜硫酸塩を添加する方法である。小エビメラノーシスのようないくつかの形態の酵素による褐変は、小エビなどの食品を亜硫酸水素ナトリウムのような亜硫酸塩の溶液に従来浸漬もしくはコートすることによって処理されてきた。亜硫酸塩類は酸化防止のためぶどう酒にも添加される。亜硫酸塩類はｏ−キノン類をモノ−および／またはジフェノール類を還元することによって褐変反応を阻害する。しかし、食品における亜硫酸塩類の使用は、ある特定の人に対して副作用があるので制限されており、さらに制限強化されるかまたは完全に除去されるかもしれない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、食品と飲料の酸化褐変、特にＰＰＯ活性によって起こる酵素による酸化褐変を阻害する４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、酵素により褐変し易い食品もしくは飲料の褐変を防止または阻害するのに充分な量の４−置換レゾルシノール誘導体で処理されてなる食品もしくは飲料であって、該レゾルシノール誘導体が下記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ ：
【００１０】
【化３】
ここで、Ｒ１ とＲ２ は独立してＨ、ＣＨ３ 、ＣＯＲ’、ＣＲ’、ＰＯ３ Ｒ’Ｒ”およびＳＯ３ Ｒ’Ｒ”からなる群から選択され、但しＲ’とＲ”は独立してＨまたは１〜６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基または置換芳香族化合物である；およびＲ３ はレゾルシノール誘導体が酵素による褐変を阻害するよう選択される、
【００１２】
【化４】
の化合物からなる群より選ばれる、食品もしくは飲料に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、食品と飲料の酸化褐変、特にＰＰＯ活性によって起こる酵素による酸化褐変を阻害する化合物と方法に関する。その化合物は一般式：
【００１５】
【化５】
で表されるレゾルシノール誘導体である。ここで、Ｒ１ とＲ２ は独立してＨ、ＣＨ３ 、ＣＯＲ’、ＣＲ’、ＰＯ３ Ｒ’Ｒ”およびＳＯ３ Ｒ’Ｒ”からなる群から選択され、但しＲ’とＲ”は独立してＨまたは１〜約６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基または置換芳香族化合物である；およびＲ３ は得られる化合物が阻害活性を有するよう選択される有機もしくは無機の置換基である。例えば、Ｒ３ は得られる化合物が阻害活性を有するよう選択されるヘテロ原子、またはヘテロ原子、飽和もしくは不飽和アルキル基、置換芳香族化合物、または有機官能基を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、例えば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンが挙げられる。飽和もしく不飽和アルキル基は、直鎖状、分岐状もしくは環状の形態で、１〜３０個の炭素原子をもっていてもよく、置換芳香族化合物が含まれる。アルキル置換基または有機官能基は、一つもしくは複数個のヘテロ原子、例えば酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンを含有していてもよい。４−アルキルレゾルシノール化合物が、大部分の食品のメラノーシスを阻害するのに特に有効である。例えば、下記式をもつ４−ヘキシルレゾルシノール（ここでＲ１ とＲ２ がともにＨでＲ３ がＣ６ Ｈ１３の化合物である。）：
【００１７】
【化６】
が上記の目的に対しては高度に有効である。
【００１９】
１つの実施態様では、Ｒ３ は一般構造：
【００２０】
【化７】
を有する。ここでｎは１もしくは２であり、およびＺは該化合物が阻害活性を有するように選択されるアルキルまたは他の有機官能基である。Ｚは、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンのごときヘテロ原子を少なくとも１つを含有するアルキル置換基であってもよい。好ましい実施態様では、ＺはＯＨ、ＮＨ２ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨＣＯ２ （ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、アミノ酸、ポリアミン置換基、例えば、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨＲ４ およびＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨＲ４ 、ここでｘとｙは独立して０〜５の整数である；および少なくとも３つのモノマーで構成された高ポリアミンオリゴマーもしくは置換オリゴマーの基からなる群から選択され、ここでこのモノマーは１，ωジアミノアルカンであり、およびＲ４ は下記式：
【００２２】
【化８】
を有する。ここでｎ、Ｒ１ とＲ２ は前記定義と同じである。酸化褐変の特に有効な阻害剤である化合物は一般式：
【００２４】
【化９】
で表されるレゾルシノール誘導体である。ここでｎは１もしくは２であり、Ｒ１ とＲ２ とＺは前記定義と同じである。
【００２６】
酵素による褐変を阻害するのに特に有用なレゾルシノール誘導体は、ｎ＝２であり、Ｒ１ とＲ２ はともにＨであり、ならびにＺはＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨＲ４ （すなわち、ｘ＝４であり、およびＲ４ は前記定義と同じである。）またはＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ（ＣＨ２ ）３ ＮＨＲ４ （ｘ＝４であり、ｙ＝３でありおよびＲ４ は前記定義と同じである。）であるときに得られる。これらの化合物はそれぞれ下記式ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ として表される。
【００２７】
【化１０】
一般式Ｉで表される置換レゾルシノール類には、食品の褐変を阻害するのに非常に有効な種類の化合物が含まれている。４−ヘキシルレゾルシノールは市販されている化合物であるが、この目的に特に有効である。式ＩＩＩ で表される誘導体の化合物のうち３つの化合物は天然の起源から単離され、その構造は標準的な有機化学分析法特に １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法で明白に同定された。これらの３種の特定な誘導体はそれぞれ式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ で表される構造をもっている。式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ は、単離および／または特性決定がなされたことがないポリアミン誘導体を表わすが、式ＩＶは従来天然には見出されたことがないレゾルシノール誘導体を表わす。
【００２９】
レゾルシノール誘導体を含有する抗褐変組成物の製造法も本発明の主題である。特定のレゾルシノール誘導体を合成することにより調製することができ、または天然の起源、例えば植物等から単離することができる。一つの実施態様では、その誘導体は、水抽出、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣの工程によって、例えばイチジクの乳液のような植物起源から単離して均質物にまで精製される。
【００３０】
本化合物を用いて食品の褐変を阻害する方法を説明する。この方法において、例えばある種の貝類、甲殻類動物、果物、野菜、および果物ジュースやぶどう酒等のような飲料等の褐変し易い食品は、褐変反応を阻害するのに充分な量の本レゾルシノール誘導体を含有する組成物で処理される。
【００３１】
一般に式ＩとＩＩＩ により表され、具体的に式ＩＩとＩＶで表される本レゾルシノール誘導体、ならびに具体的に式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ で表されるレゾルシノール−ポリアミン誘導体は、食品の褐変を阻害するのに非常に有効である。本組成物と方法は、粗製の乳液製剤および亜硫酸水素ナトリウムより、酸化褐変を阻害するのに有効である。大部分の食品の褐変を阻害するのに必要な量が、同じレベルの阻害効果を得るために、現在使われている亜硫酸水素ナトリウムの量より少ない量の本組成物が、大部分の食品の褐変を阻害するのに必要となる。本化合物は、食品もしくは飲料の外観、味、テクスチャもしくは品質に有害な影響を与えずに、選択された食品と飲料の褐変を阻害もしくは防止する有効な処理を提供する。
【００３２】
本発明は、ある種類のレゾルシノール誘導体（そのうちのいくつかは植物中で天然に産生する）が食品の褐変を阻害できることを発見したことに基づいている。本化合物は式Ｉで示される一般式をもつレゾルシノール誘導体である。
【００３３】
【化１１】
ここで、Ｒ１ とＲ２ は独立してＨ、ＣＨ３ 、ＣＯＲ’、ＣＲ’、ＰＯ３ Ｒ’Ｒ”およびＳＯ３ Ｒ’Ｒ”からなる群から選択され、但しＲ’とＲ”は独立してＨまたは約１〜約６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基または置換芳香族化合物である；Ｒ３ は、該化合物が阻害活性を有するよう選択される、ヘテロ原子、またはヘテロ原子、飽和もしくは不飽和アルキル基、置換芳香族化合物、または有機官能基を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、例えば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンが挙げられる。飽和もしく不飽和アルキル基は、直鎖状、分岐状もしくは環状の形態で、１〜３０個の炭素原子をもっていてもよく、置換芳香族化合物が含まれる。アルキル置換基または有機官能基は、一つもしくは複数個のヘテロ原子、例えば酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンを含有していてもよい。
【００３５】
アルキルレゾルシノール化合物が、大部分の食品のメラノーシスを阻害するのに特に有効である。例えば、下記式をもつ４−ヘキシルレゾルシノール：
【００３６】
【化１２】
が上記の目的に対しては高度に有効である。
【００３８】
一つの実施態様では、Ｒ３ は一般構造：
【００３９】
【化１３】
をもっている。ここでｎは１もしくは２であり、およびＺは該化合物が阻害活性を有するように選択されるアルキルまたは有機官能基である。Ｚは、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンのごときヘテロ原子を少なくとも１つ含有するアルキル置換基であってもよい。好ましい実施態様では、ＺはＯＨ、ＮＨ２ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨＣＯ２ （ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＣＨ３ 、アミノ酸（例えば、リジン、オルニチン、セリンまたはシステイン）；ポリアミン置換基、例えば、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨＲ４ およびＮＨ（ＣＨ２ ）ｘ ＮＨ（ＣＨ２ ）ｙ ＮＨＲ４ 、ここでｘとｙは０〜５の整数である；および少なくとも３つのモノマーで構成されたポリアミンオリゴマーもしくは置換ポリアミンオリゴマーからなる群から選択され、ここでこのモノマーは１，ωジアミノアルカンであり、およびＲ４ は下記式：
【００４１】
【化１４】
をもつ。ここでｎ、Ｒ１ とＲ２ は前記定義と同じである。
【００４３】
酸化褐変の特に有効な阻害剤である化合物は下記の一般式：
【００４４】
【化１５】
をもつレゾルシノール誘導体である。ここでｎは１もしくは２であり、Ｒ１ とＲ２ とＺは前記定義と同じである。
【００４６】
酵素による褐変を阻害するのに特に有用なレゾルシノール誘導体は、ｎ＝２であり、Ｒ１ とＲ２ はともにＨであり、ならびにＺはＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ２ 、ＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨＲ４ （ｘ＝４であり、およびＲ４ は前記定義と同じである。）またはＮＨ（ＣＨ２ ）４ ＮＨ（ＣＨ２ ）３ ＮＨＲ４ （ｘ＝４、ｙ＝３であり、およびＲ４ は前記定義と同じである。）であるときに得られる。これらの化合物はそれぞれ下記式ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ として示される。
【００４７】
【化１６】
本発明には上記式（式Ｉ〜ＶＩＩ ）の化合物の機能上の同等物も含まれる。この“機能上の同等物”という用語は、類似の抗褐変活性を有する上記化合物の化学的誘導体もしくは類似体を意味する。ここで、分子が、通常は分子の一部分ではなく付加されるもしくは異なる化学的部分をもっている場合、その分子は他の分子の“誘導体”という。
【００４９】
式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ の構造の分析は、それぞれジアミノブタン（ＶとＶＩ） およびスペルミジン（ＩＩＩ）にアミド結合で連結されたレゾルシノール部分を示している。ジアミンジアミノブタンおよびポリアミンスペルミジンは、動植物界に広く分布しているアミノ酸由来の脂肪族窒素化合物である。Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ， ２３巻 （Ｅ．Ｅ．Ｃｏｎｎ編集） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク中のＦｌｏｒｅｓ， Ｈ．Ｅ．、Ｐｒｏｔａｃｉｏ， Ｃ．Ｍ．およびＳｉｇｎｓ， Ｍ．Ｗ． 、１９８９年、によるＰｌａｎｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ 。ヒドロキシケイ皮酸アミド（ＨＣＡ）誘導体として、ｐ−クマリルジアミノブタン、フェルリルジアミノブタン、カフェオイルジアミノブタンおよびジ−ｐ−クマリルジアミノブタンのようなジアミノブタン類；ならびにｐ−クマリルスペルミジンのようなスペルミジン類は、１３種の科の高等植物に見出されており（Ｍａｒｔｉｎ−Ｔａｎｇｕｙ， Ｊ． 、Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌ． ， ３巻、３８１ 〜４００ 頁、１９８５年） 、花の成長と関係があると考えられる。上記のＨＣＡ類は、その構造が、式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ に密接に関連している。ＨＣＡ類について多くの研究が現在行われているが、式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ の存在については文献中には、先行報告はない。式ＶとＶＩＩ は新規な天然に生じるポリアミン誘導体である。現時点まで事実上発見されていなかった式ＶＩの化合物も、従来未知のポリアミン誘導体を示す。式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ で表される化合物は、ＰＰＯで触媒されるメラノーシスの阻害剤としての効力の他に、その分布、代謝および生理作用が未知の新規な種類のポリアミン誘導体を示す。
【００５０】
式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ で表される分子は植物から精製することができる。各種の植物起源由来の製剤は特定な酵素反応の有効な阻害剤である。例えば、イチジクの木、フィクス属の種Ｆｉｃｕｓ ｓｐ． （Ｆ．ｓｐ．）から得られる乳液は、プロテアーゼのフィシンを含有している（Ｐ．Ｔ． Ｅｎｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． 、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７巻、１６３ 頁、１９６３年） 。イチジク乳液から調製したフィシン含有抽出物は、酵素による褐変反応の有効な阻害剤であることを示した（Ｌａｂｕｚａ ｅｔ ａｌ． 、Ｃｅｒｅａｌ Ｆｏｏｄｓ Ｗｏｒｌｄ， ３４（４） 巻、３５３ 頁、１９８９年） 。しかしながら、フィシンのタンパク質加水分解活性によって食品中のタンパク質が劣化されるので、フィシンによる処理は、食品のテクスチャと品質に対して有害である。例えば、イチジク乳液から調製された市販用の乳液抽出物は出発物質として使用することができる。イチジク乳液の抽出物は、フィシンと他の化合物を含有するので、“粗製フィシン”または“粗製フィシン抽出物”と呼ばれる。粗製フィシン抽出物は、市販されているので式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ の化合物を得る原料として有用である。粗製フィシン抽出物は、一般的に粉末もしくは錠剤のような固体の形態で入手できる。粗製フィシン製剤は、主要なプロテアーゼ成分がフィシンであり、分子量が約２０， ０００ダルトンのタンパク質であることを特徴とする。フィシンの存在は、例えば、ゲル浸透高速液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）のような分子量に基づいて物質を分離する方法と、フィシン活性の鋭敏な検定法であるベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−ＢＡＰＮＡ）のフィシン触媒加水分解反応によって検出することができる。式ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ の化合物を粗製乳液もしくは粗製乳液抽出物から得る方法はそれぞれ実施例２、３および４に記載する。
【００５１】
式Ｉはいくつかの市販されている化合物、例えばアルキルレゾルシノール類を示すが、これらの化合物は他の用途に用いられている。本発明者らは、式Ｉで表される構造を有する化合物は上記のような褐変を起こし易い多くの食品の酸化褐変の有効な阻害剤であることを発見したのである。例えば、４−ヘキシルレゾルシノール（式ＩＩ）は医薬として利用されており、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ ， 第１０版、６８１ 頁、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．、ニューハンプシャー州、ラーウエイ、１９８３年に記載されている。
【００５２】
式ＩＩおよびＩＶ〜ＶＩＩ で表される抗褐変化合物は合成法で調製することができる。
【００５３】
一つの実施態様において、式Ｖの化合物は実施例５に詳細に述べるが、下記の一般的な方法にしたがって合成される。すなわち、７−ヒドロキシクマリンを水素化して７−ヒドロキシジヒドロクマリンとし、次に過剰のジアミノブタンと反応させて式Ｖの化合物（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）が得られる。この合成された化合物は、 １Ｈと１３ＣＮＭＲ、質量スペクトル分析、元素分析およびＴＬＣによって測定すると粗製フィシン抽出物から単離した化合物と同一である。
【００５４】
他の実施態様において、式ＶとＶＩＩ の化合物は下記の図５に概略的に示す手順によって合成することができる。すなわち、レゾルシノール（１，３−ジヒドロキシベンゼン）を、１つのＣ原子を芳香族環に付加する試薬、例えばガッターマン試薬（Ｚｎ（ＣＮ）２ ，ＨＣｌ）またはビルスマイヤー試薬（ＰＯＣｌ３ ／ＤＭＦ）で処理して誘導体化し、アルデヒド基を上記レゾルシノールの環に付加して２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドが製造される。この化合物はさらに、ピリジンおよびピペリジンのような塩基性有機溶媒中、高温下（例えば、約１００°〜１４０℃）でマロン酸（ＣＨ２ （ＣＯＯＨ）２ ）と反応させ、２，４−ジヒドロキシケイ皮酸が得られる。２，４−ジヒドロキシケイ皮酸の側鎖の二重結合を、例えば水素またはパラジウムを用いて水素化して２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸が製造される。この化合物を過剰のジアミノブタンと反応させると式Ｖ（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）が得られ、またスペルミジンと（適切なモル比で）反応させるとビス−フェノール化合物である式ＶＩＩ （ビス−２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルスペルミジン）が得られる。
【００５５】
本レゾルシノール誘導体は、各種の食品と飲料に適用して、褐変を特に酵素による褐変を防止または阻害することができる。ここで用いる“酵素による褐変”という用語は、キノン類を生成するＰＰＯの作用またはキノン類の重合に起因する、ｏ−キノンおよびキノンポリマーの生成、および食品中で自然に生成する他の要素でもたらされる酸化による黒ずみもしくは変色を意味する。
【００５６】
褐変を防止するために、レゾルシノール誘導体は、食品もしくは飲料を処理するのに、褐変を阻害もしくは防止するのに充分な量もしくは濃度で使用される。処理方法は、処理される食品もしくは飲料および所望の結果に依存しており、例えば、浸漬、噴霧、散粉、散液、液浸、混合および／またはソーキングを挙げることができる。これらの化合物は、水性希釈剤、例えば水、塩水もしくは緩衝液に添加して食品に適用してもよく、または生のまま、例えば果物ジュースに添加してもよい。必要量は、食品もしくは飲料の褐変に対する感受性、食品の状態および貯蔵状態による。褐変を防止もしくは阻害するのに充分な量は、食品技術の分野の熟練者によって経験的に決定することができる。
【００５７】
本発明の一つの実施態様において、ピンク小エビを式ＩＩの化合物の水溶液で処理した。式ＩＩを０．０００１〜０．００５％の範囲の濃度で用い、亜硫酸水素ナトリウムおよび海水で処理した小エビと比較した。その結果を図１０に示す。海水で処理した小エビは１〜２日以内にメラノーシスのスポットを発生した。式ＩＩは、重量基準で亜硫酸水素ナトリウムより、小エビの褐変を阻害するのに有効であった。例えば、０．００５重量％という少量の式ＩＩを含有する溶液は、亜硫酸水素ナトリウムの１．２５重量％溶液とほとんど同じ程度に、小エビのメラノーシスを阻害するのに有効であった。約０．１％までの濃度の式ＩＩを褐変を阻害するのに使用できる。
【００５８】
本発明の他の実施態様において、ピンク小エビをここに記載したように調製した式Ｖの水溶液で処理した。式Ｖの化合物を約０．１重量％〜約０．００１重量％の範囲の濃度で用い、亜硫酸水素ナトリウムで処理した小エビおよび未処理の小エビと比較した。その結果を図４に示す。未処理の小エビはすぐに（１〜２日以内）黒色スポットを発生した。式Ｖは、重量基準で亜硫酸水素ナトリウムより小エビの褐変を阻害するのに有効であった。例えば、式Ｖを約０．００５重量％という少量含有する溶液は、亜硫酸水素ナトリウムの１．２５重量％溶液と同じ程度に小エビのメラノーシスを阻害するのに有効であった。約０．１重量％の濃度の本レゾルシノール誘導体はこの目的に対して特に有効である。
【００５９】
本発明の組成物と方法は褐変し易い多くの食品と飲料の褐変を防止または大幅に阻害するのに有用である。このような食品と飲料としては、小エビ等の甲殻類、ジャガイモ、リンゴ、バナナ、レタス、モモ、ぶどう酒およびいくつかの果物ジュースが挙げられるが、これらに制限されない。本組成物は、食品特に小エビの劣化を起こさない。それが完全に起こらない場合、褐変は“防止されている”。未処理食品と比較して、同じ時間枠内で大幅に低い速度で起こる場合、褐変は“大幅に阻害されている”。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００６１】
実施例１〔粗製フィシンの限外濾過によるＹＭ５溶出液の製造〕
粗製ＥＤＣフィシン（Ｅｎｚｅｃｏ Ｆｉｃｉｎ， Ｅｎｚｙｍｅ ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｒｐ．，（ＥＤＣ） ニューヨーク州、ニューヨーク） の５０ｍｇ／ｍＬ溶液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州、セントルイス）中で調製した。その５ｍＬ部分（ａｌｉｑｕｏｔ）を０．４５μのフィルターで濾過して透明な濾液を作った。その濾液の一部分（ｓｕｂａｌｉｑｕｏｔ）（２．５ｍＬ）をＡｍｉｃｏｎ ５０００ ＭＷＣＯ ＹＭ５膜 （Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．， マサチューセッツ州、ダンバース）を用いて限外濾過を行った。限外濾過により得られた溶出液を“ＹＭ５溶出液”と呼ぶ。０．４５μ濾液とＹＭ５限外濾過物質を、ゲル浸透クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）で分析したところ、フィシンに対応する保持時間の範囲内において２１４ｎｍにおける吸光度がないことが見出された。また発色基質のベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロ−アニリド（Ｌ−ＢＡＰＮＡ）を用いても、ＹＭ５溶出液中にフィシン活性は全く検出されなかった。
【００６２】
限外濾過に引き続いて、粗製フィシン、その０．４５μ濾液およびＹＭ５溶出液を、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害について、下記のモデルシステムを用いて検定した。
【００６３】
そのモデル検定システムは以下の試薬でなされている。
５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；
０．５ｍＭ Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；
ＰＰＯ（キノコ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；
＋／−の変化をさせた濃度の粗製ＥＤＣフィシン；および
ＹＭ５製剤であり、合計容積が１ｍＬとなる。
【００６４】
これらの試薬を混合し、１ｃｍ通路長のキュベット中で２５℃にサーモスタットで調温したＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＵＶ−ＶＩＳ 分光光度計を用い４７５ｎｍにおいて１分間当りの光学濃度の変化（ＯＤ／分）をモニターすることによって、反応速度を測定した。ＰＰＯ活性の阻害作用は、ＰＰＯと緩衝液を含んでいるキュベットへ異なった部分（ａｌｉｑｕｏｔｓ） の試薬溶液を添加させることによって、粗製フィシンとＹＭ５製剤の濃度を変えて検定した。キュベットは２５℃で１分間あらかじめ保温してから、Ｌ−ＤＯＰＡを添加することにより反応を開始した。ＰＰＯの検定は、フィシン製剤およびフィシンなしのＹＭ５溶出液のそれぞれの不存在下および存在下で行った。３種の製剤がすべて同等レベルの阻害性を示した。それ故にＰＰＯ活性の阻害はＰＰＯに対するフィシンの作用に起因するものではないであろう。
【００６５】
実施例２〔粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式ＩＶ）の精製〕
粗製ＥＤＣフィシン（５０ｇ）は４００ｍＬのメタノールで抽出した。その上澄液をロータリーエバポレーターで蒸発させることによって乾固した。得られた固体を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で一部精製した。
【００６６】
逆相ＨＰＬＣは、移動相の疎水性を増大した場合の分子とＨＰＬＣカラム内の疎水性固定相の相互作用によって分子を分離することに基づいた精製法である。この場合、固定相（カラム充填物（ｐａｃｋｉｎｇ））はオクタデシル基（Ｃ１８）でコートされた樹脂であり、移動相（カラム中を流れる溶剤）は、変化させた量のアセトニトリルを存在させる０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であった。精製プロトコールは分析規模で開発され、次いでＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰｒｅｐ ＨＰＬＣ システム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州、ミルフォード）を用いて製造規模に改造した。
【００６７】
アセトニトリル濃度を増大させて直線のグラジエントを展開させたところ、標題の化合物が約２０％のアセトニトリルで溶出された。阻害剤のピーク画分をプールし、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ カラム（１５μ、７．８×３０ｃｍ）を用いＨＰＬＣでさらに精製した。溶出液は２１４ｎｍでモニターされ、阻害剤の存在を確認するために画分を検定した。ピーク画分をプールして濃縮した。式ＩＶの化合物の試料（上記のようにして単離されたかまたは合成されたもの）を １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法等のいくつかの分析法で分析した。その結果は式ＩＶに対応する構造と一致した。
【００６８】
【化１７】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ６．８９ （ｄ，Ｊ＝８ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６）， δ６．２７ （ｄ，Ｊ＝２．８１ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ３）， δ６．２４ （ｄ のｄ，Ｊ＝８．２４， ２．５９ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ５）， δ２．７１６ （ｔ，Ｊ＝７．４ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ８）， δ２．５１５ （ｔ，Ｊ＝７．２４ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ７）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法 （Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ） ） δ１７６．２０ （Ｃ９）， δ１５７．３５ （Ｃ２）， δ１５６．４１ （Ｃ４），δ１３１．６９（−ｖｅ 強度， Ｃ６）， δ１１９．４３ （Ｃ１）， δ１０７．８３ （−ｖｅ 強度， Ｃ５）， δ１０３．５７ （−ｖｅ 強度， Ｃ３），δ３４．８３ （Ｃ８）， δ２５．５０ （Ｃ７）
質量分析 ＥＩ ｍ／ｓ Ｍ ＋ １８２， １６４ （Ｍ ＋ −Ｈ２Ｏ）， １３６， １２３． （高速原子衝突（Ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ））（ＦＡＢ） ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ １８３， １６５ （Ｍ ＋ −Ｈ２Ｏ）．
【００７０】
実施例３〔粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式Ｖ）の精製〕
実施例１で得られたＹＭ５溶出液を、イオン交換クロマトグラフィーとＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。２ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中の実施例１に記載したようにして得られたＹＭ５溶出液の溶液をＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） 樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェーデン、アップサラ）のカラムに注入した。この樹脂に吸着しなかった物質を、２ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を２回カラムに供給して洗い出した。樹脂との相互作用の強度の関数として分子を溶出する塩化ナトリウムの直線グラジエント（０〜０．２Ｍ）をカラムに適用して、あらかじめ吸着した分子を分離した。溶出された物質は２１４ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度でモニターして、２０ｍＬずつの画分を集めた。グラジエントの全容積は２リットルであった。阻害剤の存在について、画分を実施例１に記載のようなモデル検定システムを用いて試験した。分析により５つの阻害のピークが見出された。これらのピークに基づいて見出された画分をプールし、凍結し、凍結乾燥を行った。プールＩＶおよびプールＶと標識された２つのピークは、阻害率のピークサイズに対する比率に基づいて最も強力な阻害剤であると思われ、実施例２に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製するためにそれを選択した。
【００７１】
ＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） のプールＩＶを凍結乾燥した物質を移動相に溶解し、遠心分離して粒子を除き、ＨＰＬＣカラムに注入した。アセトニトリル濃度を増大させて直線のグラジエントを展開させたところ、約１５％のアセトニトリルで阻害剤が溶出した。溶出液は多重チャンネルＵＶ−Ｖｉｓ検出器で２１４ｎｍと２８０ｎｍにおいてモニターされ、阻害剤の存在を確認するのに何回かの試験で画分を検定した。阻害剤のピーク画分を、スピードバック（ＳｐｅｅｄＶａｃ）で濃縮し、凍結し、そして凍結乾燥した。ＴＦＡ／メタノールグラジエントシステムでのＲＰ−ＨＰＬＣによって再分析したところ、回収された阻害剤について高い精製度を示した。
【００７２】
精製されたプールＩＶの阻害剤をいくつかの物理的方法および化学的試験法により分析した。阻害剤のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、芳香族もしくはフェノール化合物の典型的な波長範囲に入っている２８０ｎｍにおいて吸光度の最大値を示した。ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ） およびニンヒドリンとの反応は、それぞれアミド結合と第一級アミンの存在を示した。
【００７３】
阻害剤の試料を １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法等のいくつかの分析法によって分析した。その結果は下記式Ｖに対応する構造と一致した。
【００７４】
【化１８】
１ Ｈ ＭＮＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ７．５ 〜６．５ （拡大 （ｂｒｏａｄ）， ＯＨ）， δ６．９ 〜６．８ （ｂ， ＣＯＮ Ｈ ）， δ６．８６８ （ｄ，Ｊ＝８．１ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６）， δ６．３０４ （ｄ，Ｊ＝２．３ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ３）， δ６．２５９ （ｄ の ｄ， Ｊ＝２．４， ８．０ Ｈ Ｚ ， １Ｈ Ｃ５），δ５．５ 〜４．８ （ｂ， ＮＨ２）， δ３．１１５ （ｑ，Ｊ＝１２．３８， ６．２３ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ１０）， δ２．９０８ （ｂ， ２Ｈ， Ｃ１３）， δ２．７２５ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ８）， δ２．４３９ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ７）， δ１．５１， １．４６ （重複多重線 （ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ），４Ｈ， Ｃ１１， Ｃ１２）
１３ Ｃ ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法）（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ））δ１７６．６８ （Ｃ＝Ｏ）， δ１５５．７４ （Ｃ２）， δ１５５．４１ （Ｃ４），δ１３２．０９ （−ｖｅ 強度， Ｃ６）， δ１１９．５９ （Ｃ１）， δ１０７．９７ （−ｖｅ 強度， Ｃ５）， δ１０３．４９ （−ｖｅ 強度， Ｃ３） δ３９．８１ （Ｃ１３）， δ３９．０４ （Ｃ１０）， δ３６．６９ （Ｃ８）， δ２６．３３ （Ｃ７）， δ２６．０９ （Ｃ１１）， δ２４．６９ （Ｃ１２）
質量分析 ＤＣＩ ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ ２５３， １６５ （Ｍ−ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２） ＥＩ ｍ／ｚ Ｍ＋ ２５２， １６４， （Ｃ９Ｈ８Ｏ３） １３６， １２３，（高速原子衝突（Ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ））（ＦＡＢ））ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ ２５３
【００７６】
実施例４〔粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式ＶＩＩ）の精製〕
実施例２に記載の手順によって得られたＳＰ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） のプールＶの凍結乾燥物質をさらにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製条件は実施例２で用いたものと同じであった。アセトニトリル濃度を増大させて直線のグラジエントを展開させたところ、式ＶＩＩ の化合物が約３０％のアセトニトリルで溶出された。溶出液は、多重チャンネルＵＶ−Ｖｉｓ検出器で２１４ｎｍと２８０ｎｍにおいてモニターされ、式ＶＩＩ で表される阻害剤の存在を確認するため、何回か試験し画分を検定した。阻害剤のピーク画分をプールし、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ カラム（１５μ、７．８×３０ｃｍ）を使いＨＰＬＣでさらに精製した。溶出液を２１４ｎｍにおいてモニターし、阻害剤の存在を確認するため画分を検定した。ピークの画分をプールして濃縮した。ＲＰ−ＨＰＬＣで再分析したところ、回収した阻害剤について高い精製度を示した。
【００７７】
式ＶＩＩ の化合物の試料をいくつかの分析法（ １Ｈと質量分析法）で分析したところ、式に対応する構造に一致した。
【００７８】
【化１９】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ） ３００ ＭＨ Ｚ δ６．８６１， ６．８４５（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ６， Ｃ２５）， δ６．２７６ （重複二重線（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅｔｓ））， Ｊ＝２．５６， ２Ｈ， Ｃ３， Ｃ２２）， δ６．２０８， ６．１９７（ 重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ））ｄ の ｄ，Ｊ＝８．１， ２．５７ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ５， Ｃ２４）， δ３．２４１， ３．１８０ （三重線（ｔｒｉｐｌｅｔｓ））， Ｊ＝６．３０， ４Ｈ， Ｃ１０， Ｃ１６），δ２．８９３ 〜２．７１１ （よく分解している（ｗｅｌｌ ｒｅｓｏｌｖｅｄ）） ｍ， ８Ｈ， Ｃ８， Ｃ１３，Ｃ１４， Ｃ１８），δ２．５１， ２．４４ （ｔ，Ｊ＝７．３４， ４Ｈ， Ｃ７， Ｃ１９）， δ１．７６１ （五重線（ｑｕｉｎｔｅｔ））， ２Ｈ， Ｃ１５），δ１．６０１ 〜１．６０４ （分解していない（ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ）） ｍ， ４Ｈ， Ｃ１１， Ｃ１２）
質量分析 ＤＣＩ ｍ／ｚ（弱（ｗｅａｋ））３１０ （Ｍ−Ｃ９Ｈ８Ｏ３）， １６５ （Ｃ９Ｈ８Ｏ３Ｈ＋ ） １４６ （Ｃ７Ｈ１９Ｎ３Ｈ ＋ ） ＥＩ（高分解 （ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）） ｍ／ｚ ３０９ （Ｍ−Ｃ９Ｈ８Ｏ３）， ＦＡＢ ｍ／ｚ Ｍ ＋ Ｈ ＋ ４７４， ３１０ （Ｍ−Ｃ９Ｈ８Ｏ３）
【００８０】
実施例５〔式Ｖの化合物の合成〕
式Ｖで表される化合物（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）：
【００８１】
【化２０】
を下記の手順で合成した。
【００８３】
無水エタノール（２００ｍＬ）中の７−ヒドロキシクマリン（５．０ｇ、０．０３１モル；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ） の溶液を、Ｐａｒｒの装置内で、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒；５００ｍｇ、５０％水、Ｋｏｄａｋ， Ｉｎｃ． 、ニューヨーク州、ロチェスター）上で、５５℃にて２４時間加圧下にて水素化した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；シリカゲル：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）が反応の完了を示した。反応混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ） 床（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ． 、ペンシルベニア州、フィラデルフィア） で濾過し、減圧蒸発させて粗製品（４．５ｇ）を得た。この物質の一部（２．５ｇ）をトルエンにより再結晶させ、減圧乾燥させて７−ヒドロキシジヒドロクマリンを得た。
【００８４】
収量： １．８３ｇ；融点 １３３°〜１３５．５ ℃；
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ７．０１ （ｄ，Ｊ＝８．３ Ｈ Ｚ ， １Ｈ， Ｃ５）， δ６．５５ （ｄ の ｄ， Ｊ＝４．１， ２．４ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６）， δ６．４８ （ｄ，Ｊ＝２．４ Ｈ Ｚ ， １Ｈ， Ｃ８）， δ２．８４７ （ｔ，Ｊ＝７．２ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ３）， δ２．６８５ （ｄ のｄ， Ｊ＝７．７， ６．０ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ６）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法）（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ） δ１６９．８５ （Ｃ２， ＋ｖｅ 強度），δ１５７．５７ （Ｃ７， ＋ｖｅ 強度），δ１５３．６１ （Ｃ９， ＋ｖｅ 強度）， δ１２９．７２ （Ｃ５， −ｖｅ 強度），δ１５７．５７ （Ｃ１０， ＋ｖｅ強度），δ１１２．２１ （Ｃ６， −ｖｅ 強度），δ１０４．４２ （Ｃ８， −ｖｅ 強度），δ３０．０１ （Ｃ３， ＋ｖｅ強度），δ２３．３５ （Ｃ４， ＋ｖｅ 強度）．
【００８５】
ジアミノブタン（３．０ｍＬ：０．３モル；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ）を添加用ロートを取り付けた三ツ口フラスコ内で窒素雰囲気下で５５℃に加温した。メタノール（１５ｍＬ）中の７−ヒドロキシジヒドロクマリン（１．０ｇ、０．００６モル）を滴下して加えた。添加を完了した後、反応混合物を蒸発乾固し、残留物を酢酸エチルを用いて繰り返しトリチュレート（ｔｒｉｔｕｌａｔｅ）した。残留ガム状物を高真空度下で乾燥した。この物質をフラッシュ（ｆｌａｓｈ）カラムクロマトグラフィー（シリカ；２０％ ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ＮＨ４ＯＨ（５％）〜３０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ＮＨ４ＯＨ（５％）のグラジエント溶出液）において精製した。画分をＴＬＣに基づいて組合せて式Ｖ（１．０ｇ）が得られた。 １Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、質量分析および元素分析は、この合成化合物が実施例３で得られたＹＭ５溶出液から単離した化合物と同一のものであることを示した。
【００８６】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ） ３００ ＭＨ Ｚ δ７．５ 〜６．５ （拡大（ｂｒｏａｄ）， ＯＨ）， δ６．９ 〜 ６．８ （ｂ， ＣＯＮＨ ）， δ６．８６８ （ｄ，Ｊ＝８．１ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ６），δ６．３０４ （ｄ，Ｊ＝２．３ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ３），δ６．２５９ （ｄ の ｄ， Ｊ＝２．４， ８．０ ＨＺ ， １Ｈ， Ｃ５）， δ５．５ 〜 ４．８（ｂ，ＮＨ２） ，δ３．１１５ （ｑ，Ｊ＝１２．３８，６．２３ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ１０）， δ２．９０８ （ｂ， ２Ｈ， Ｃ１３）， δ２．７２５ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ８），δ２．４３９ （ｔ，Ｊ＝６．８ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ７）， δ１．５１， １．４６（重複多重線 （ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ））， ４Ｈ， Ｃ１１， Ｃ１２）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ （Ｊ−調節されたスピン・エコー法（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ｍｅｔｈｏｄ））δ１７６．６８ （Ｃ＝Ｏ）， δ１５５．７４ （Ｃ２）， δ１５５．４１ （Ｃ４），δ１３２．０９ （−ｖｅ 強度， Ｃ６） δ１１９．５９ （Ｃ１），δ１０７．９７ （−ｖｅ 強度， Ｃ５），δ１０３．４９ （−ｖｅ 強度， Ｃ３），δ３９．８１ （Ｃ１３）， δ３９．０４ （Ｃ１０）， δ３６．６９ （Ｃ８）， δ２６．３３ （Ｃ７）， δ２６．０８８ （Ｃ１１）， δ２４．６９ （Ｃ１２）
元素分析 Ｃ１３ Ｈ２０ Ｎ２ Ｏ３ 、 計算値 Ｃ ６１．８８，Ｈ ７．９９， Ｎ １１．１１ 、
実測値 Ｃ ６１．９７， Ｈ ７．９６， Ｎ １１．０１
質量分析 ＤＣＩ ｍ／ｚ Ｍ＋ Ｈ ＋ ２５３， １６５（Ｍ − ＮＨ２（ＣＨ２）４ ＮＨ２）ＥＩ ｍ／ｚ Ｍ ＋ ２５２， １６４， １３６， １２３， ＦＡＢ ｍ／ｚ Ｍ＋ Ｈ ＋ ２５３
【００８７】
実施例６〔式ＶＩの化合物の合成〕
式ＶＩで表される化合物（ビス−２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）を実施例５に記載した方法を修正して合成した。ジアミノブタン（１．０９ｍＬ、５．４８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水エタノールに溶解した。そこに７−ヒドロキシジヒドロクマリン（４．５ｇ）を徐々に添加した。得られた溶液を室温で１時間攪拌した。溶剤をロータリーエバポレーターで除去して赤色のガム状物を得た。過剰の酢酸エチルを添加し次いでロータリーエバポレーターで蒸発させることによりピンク色の固体を得て、これを過剰の酢酸エチルで洗浄し次に減圧デシケーターで乾燥して４．６ｇ（収率８２％）の式ＶＩの化合物を得た。単離した化合物を １Ｈと１３ＣのＮＭＲおよび質量分析法等のいくつかの分析法で分析した。その結果は式ＶＩに対応する構造と一致した。
【００８８】
【化２１】
１ Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ） ３００ ＭＨ Ｚ ． δ６．８４１ （ｄ，Ｊ＝８．１ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ６， Ｃ２２）， δ６．２７７ （ｄ，Ｊ＝２．４ ＨＺ ， ２Ｈ， Ｃ３， Ｃ１９）， δ６．２０４ （ｄ のｄ， Ｊ＝８．１， ２．４ Ｈ Ｚ ， ２Ｈ， Ｃ５ Ｃ２１）， δ３．０８９ （ｂ，４Ｈ， Ｃ１０， Ｃ１３） ，δ２．７７９ （ｔ，Ｊ＝７．４ ＨＺ ， ４Ｈ， Ｃ８， Ｃ１５）， δ２．４２２ （ｔ，Ｊ＝７．４ ＨＺ ， ４Ｈ， Ｃ７， Ｃ１８）， δ１．３５ （ｂ， ４Ｈ，Ｃ１１， Ｃ１２）．
１３ Ｃ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ） ７５．４７ ＭＨ Ｚ ７５．４７ ＭＨ Ｚ（Ｊ−調節されたスピン・エコー（Ｊ−Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ）． δ１７６．０５ （Ｃ９， Ｃ１４， ＋ｖｅ 強度）， δ１５７．７４ （Ｃ２， Ｃ１８，＋ｖｅ 強度）， δ１５７．０２ （Ｃ４， Ｃ２０， ＋ｖｅ 強度）， δ１３１．５８ （Ｃ６， Ｃ２２， −ｖｅ 強度）， δ１１９．５５ （Ｃ１， Ｃ１７，＋ｖｅ 強度）， δ１０７．４７ （Ｃ５， Ｃ２１， −ｖｅ 強度），δ１０３．５９ （Ｃ３， Ｃ１９， −ｖｅ 強度）， δ３９．４９ （Ｃ８， Ｃ１５， ＋ｖｅ 強度）， δ３７．７３ （Ｃ１０， Ｃ１３， ＋ｖｅ 強度），δ２７．５４ （Ｃ１１， Ｃ１２， ＋ｖｅ 強度），δ２７．０１ （Ｃ７， Ｃ１６， ＋ｖｅ 強度）．
質量分析 ＦＡＢ ｍ／ｚ Ｍ＋ Ｈ ＋ ４１７， ３０９ （Ｍ＋ − Ｃ６Ｈ５Ｏ２） ， ２５３ （Ｍ＋ ＝Ｃ９Ｈ９Ｏ３）．
【００９０】
実施例７〔各種レゾルシノール誘導体によるＰＰＯの阻害〕
各種のレゾルシノール化合物がＰＰＯ（キノコ）を阻害する作用を測定するために、実施例１に記載したのと同様の線形分光光度検定システムを使用した。その検定混合物は：
５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５；
０．１３３ｍＭのＬ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）；
ＰＰＯ（キノコ）；および
＋／−の変化をさせた濃度の被検化合物
で構成されていた。反応速度は、４７５ｎｍにおける吸光度の１分間当たりの変化を２５℃にて測定してモニターした。見かけ阻害定数（Ｉ５０） を表１に示す。
【００９１】
【表１】
Ｉ５０は、酵素の５０％の阻害率を得るのに必要な阻害剤の濃度を表わす。その結果は、同レベルの阻害に到達するのにレゾルシノール誘導体は、レゾルシノールと比べてはるかに少ない濃度しか必要としないことを示している。
【００９３】
実施例８〔ＹＭ５溶出物のピンク小エビメラノーシスに対する作用〕
ピンク小エビ〔ペネウス・デュオラルム（Ｐｅｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ） 〕を、フロリダ州、キー・ウエストで捕獲して冷凍し、処理する前に解凍した。メラノーシスは、表２に示すメラノーシスを説明するために開発された等級によって小エビを格付けした。
【００９４】
【表２】
このメラノーシスの等級は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ が生の小エビを等級分けするのに作成した既存の勧告に関連づけることができる（連邦法施行規則１９８２タイトル５０、パート２６５ 、サブパートＡ、小エビの等級に関する米国一般標準、２６２ 〜２６８ 頁） 。４以上の等級の評価は製品品質のかなり重要な欠陥を示す。８以上の評価は許容できない製品に近い重大な欠陥を表わす。
【００９６】
捕獲は、新鮮な前頭部（ｈｅａｄｓ−ｏｎ）ピンク小エビが捕獲後１２時間以内に船着場で得られるように計画された。小エビはすべて、通常通りに、船上で洗浄され一時的に氷の中に保管された。基本的な手順は、２．５リットルの各種の浸漬組成と濃度の液中で４００〜６００ｇの小エビを１分間すすぎ、次に水きりを行いプラスチックの袋につめて氷の中に保管した。この袋は、氷を解かす各種の影響を排除するために必要であるとみなれた。包装された小エビとともに氷を入れたコンテナーは、３５°Ｆ（１．７℃）の冷蔵状態で１日おきに氷を入れて保管された。
【００９７】
２週間の保管期間中、通常通りにメラノーシスの発生を採点し、写真撮影を行った。検査員が各種の処理を識別できないように、小エビの袋には番号を付けた。１名の経験を積んだ検査員が上記の等級（表２）に関する全ての採点を行った。等級には、メラノーシスの進行段階の通常例を示す予め現像されたカラー写真が添付された。目的は、処理法間の明白な差異を見つけて選別し、次の統計的評価法により最高の処理法を選択することである。
【００９８】
各種の浸漬もしくは化学的処理には、対照としての水道水、１．２５％の濃度の亜硫酸水素ナトリウム、粗製ＥＤＣフィシンおよび実施例１で述べた手順で調製された“Ｆ１００”と命名されたＹＭ５溶出液が含まれた。浸漬溶液は新鮮な水道水であった。
【００９９】
処理（浸漬）と小エビと浸漬溶液の比率を表３に示す。
【０１００】
【表３】
処理は、バッチに蒸留水で行ったことが特に指定がない限り、水道水に各種のものを添加して行った。すべての処理において、小エビは６０〜８０秒間浸漬液中に完全に沈め、次いでゆるやかに攪拌しながら短時間（５〜１０秒間）水切り器で水切りを行った。
【０１０２】
その結果を図１および２に示す。図１は、ＹＭ５溶出液、Ｆ１００、がメラノーシスを減少させることについて亜硫酸水素ナトリウムと同じ程度か、またはそれより優れていたことを示す。図２はＦ１００が、メラノーシスを減少させることについて、粗製フィシンと同じ程度に有効で、かつ亜硫酸水素ナトリウムより優れていたことを示す。
【０１０３】
実施例９〔ＹＭ５溶出液を用いてリンゴの酵素による褐変の阻害〕
外界温度（２２〜２４℃）で保持された新鮮なマッキントッシュリンゴ全体を４等分に切って芯を取り去り、１／４インチ厚のスライスに切断した。そのリンゴのスライスを、５秒より少ない時間、１０秒間、１分間、２．５分間および５分間等の各種の時間、表４に示す溶液を用いて、スライス面をブラッシングするかまたは全体を完全に沈めて浸漬することによって処理した。処理に続いて、リンゴのスライスは、外界温度に放置され空気にさらされた。そのスライスを、０、１、２、３、４および２４時間後に褐変を目視で検査した。
【０１０４】
【表４】
その結果は、ＹＭ５溶出液を使った処理５と６（表４）がリンゴのスライスの褐変の程度を最少にすることを示した。全試料が最初は（ゼロ時間）白色であった。対照試料（表４、処理１〜４）の褐変は１時間後に認められ、最高の褐変は約３時間後に起こった。処理５と６を受けたスライスには、３時間後でも有意な褐変は全く認められなかった。２４時間後に、処理５と６を受けたスライスはわずかに褐変したが、対照試料より大幅に少ない褐変を示した。
【０１０６】
実施例１０〔式Ｖの化合物およびＹＭ５溶出液によるリンゴの褐変の阻害〕
外界温度にて保管されていた２個の新鮮な傷のないマッキントッシュリンゴ全体を、ステンレス鋼製果物ナイフで切って４等分し、芯を除き、１／４インチ厚のスライスに切断した。表５に列挙した、０．８ｍＬの各処理溶液を外界温度にて、新たに切断した白色スライスのさらされた上面に、処理１回当り３回試料液を塗布した。式Ｖの化合物は実施例５に記載されているように合成した。塗布に続いて、スライスを外界温度に放置し、空気と光にさらさせて、１５分間〜４時間にわたって褐変の相対速度と程度を定期的に目視観察した。
【０１０７】
【表５】
新たに切断された試料はすべて、最初は白色であった。処理してから１５分以内に、溶液３、４および６で処理された試料は白色のままであったが、それを除くすべての試料にある程度の褐変が生じた。１時間後、溶液４と６で処理された試料は依然として白色であったが、他の試料は種々の程度の褐変を示した。他の試料の褐変の程度の、最少から最高の褐変までの順位は３＜２，５＜１，７であった。約３時間後に、最高の程度の褐変が、約１時間後の上記に述べられたランクで、試料１、２、３、５および７に生じた。溶液４と６で処理した試料は白色のままで特に色は変化しなかった。
【０１０９】
上記の試験条件下では、２０ｍＭの濃度の式Ｖの化合物は、ＹＭ５溶出液と粗製フィシンより一層有効にリンゴの褐変を阻害した。ラクトースおよび／または１，４−ジアミノブタンは褐変を防止しなかった。
【０１１０】
実施例１１〔ピンク小エビメラノーシスに対するＹＭ５溶出液と式Ｖの化合物の効果〕
ピンク小エビ（ペネウス・デュオラルム（Ｐｅｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ） ）をフロリダ州、キーウエストで捕獲して凍結し、処理する前に解凍した。メラノーシスは、表２の実施例８に示されたメラノーシスを説明するために開発された等級によって小エビのメラノーシスを評価した。
【０１１１】
基本的な手順は、種々の組成と濃度の浸漬液で小エビを１分間すすぎ（式Ｖの化合物を２種の最高濃度で含有する試験溶液、すなわち０．１％と０．０５％は、この物質が不足していたので、その試験溶液を６匹の個々の小エビに塗布した）、次いで水きりを行いプラスチック製袋内に包装し氷中に保管した。この袋は、解ける氷の種々の影響を排除するために必要であるとみなされた。包装された小エビとともに氷の入ったコンテナは、１日おきに氷を入れ、３５°Ｆ（１．７℃）の冷凍状態で保管した。メラノーシスの発生は、実施例８に記載したものと同様に、保管の７日間の間、通常通りに採点し写真を撮影した。
【０１１２】
種々の浸漬液または化学処理液には、対照としての水道水、１．２５％の濃度の亜硫酸水素ナトリウム、１％の濃度のＹＭ５溶出液（実施例１で調製した）、および図３および４に示す各種の濃度の式Ｖの化合物が含まれていた。図３に示す結果は、０．１重量％の濃度の式Ｖの化合物が、メラノーシスを減少させるのに亜硫酸水素塩と同程度に有効であることを示している。図４は、０．００５％というような少量の式Ｖの化合物が、メラノーシスを減少させるのに亜硫酸水素ナトリウムと同じ程度に有効であったことを示している。
【０１１３】
実施例１２〔新鮮なピンク小エビのメラノーシスに対する式Ｖの化合物の効果〕
ピンク小エビ（ペネウス・デュオラルム（Ｐｅｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ） ）を処理して、新たに捕獲した小エビについて、試験は小エビ捕獲用船上で実施したこと以外は実施例８と同様に評価した。小エビは、各種の濃度の式Ｖの化合物で処理する前に凍結を行わなかった。全溶液を海水で調製した。その結果を図６に示す。式Ｖの化合物は新鮮なピンク小エビのメラノーシスの防止に有効である。
【０１１４】
実施例１３〔式Ｖの性能に対する処理後のすすぎの効果〕
新鮮なピンク小エビを実施例１２に記載したのと同様にして処理し評価した。０．０２５％の式Ｖの化合物で処理した小エビを直接保管するか、または処理後次いで海水ですすいでから保管した。その結果を図７に示したが、処理後のすすぎは、式Ｖの化合物による小エビメラノーシスの阻害に対して有意な効果がないことを示している。
【０１１５】
実施例１４〔式Ｖの化合物の溶液の溶媒として海水または淡水を用いる効果〕
新鮮なピンク小エビを実施例１２に記載したのと同様にして処理し評価した。小エビは、海水もしくは淡水で調製した式Ｖの化合物の０．０１％溶液に浸漬した。データを図８に示すが、溶液が淡水もしくは海水で調製された場合においても、式Ｖの化合物による小エビメラノーシスの阻害の有意な効果はないことを示している。
【０１１６】
実施例１５〔式Ｖの化合物の０．０１％溶液に、小エビを繰り返し浸漬する効果〕
新鮮なピンク小エビを実施例１２に記載したのと同様にして処理し評価した。この実施例では、式Ｖの化合物の同じ１リットル０．０１％溶液の中に、小エビの１ポンドずつの異なるバッチを各々１分間ずつ浸漬した。合計８回浸漬を行った。その結果を図９に示すが、式Ｖの化合物は、同じ０．０１％溶液に８回浸漬を行った後でも依然として有効なメラノーシス阻害剤であることを示している。
【０１１７】
実施例１６〔小エビメラノーシスの発生に対する４−ヘキシルレゾルシノールの効果〕
式ＩＩの化合物（４−ヘキシルレゾルシノール、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） を式Ｖの化合物の代わりに用いることを除いて実施例８に記載したのと同様にして、ピンク小エビを処理し評価した。ピンク小エビは、式ＩＩの化合物の０．０００１％〜０．００５％溶液に浸漬し前述のように保管した。データを図１０のグラフで示すが、式ＩＩの化合物は、０．０００５％という低濃度で小エビメラノーシスの生成の強力な阻害剤であることを示している。
【０１１８】
実施例１７〔小エビメラノーシスの発生に対する式ＶＩの化合物の効果〕
式ＶＩの化合物（実施例６参照）を式Ｖの化合物の代わりに用いること以外は、実施例８に記載したのと同様にしてピンク小エビを処理し評価した。ピンク小エビは、式ＶＩの化合物の０．００１〜０．０２５％溶液に浸漬し、前述のように保管した。データは、図１１のグラフに示したが、式ＶＩの化合物が０．００５％という低濃度で小エビのメラノーシスの強力な阻害剤であることを示している。
【０１１９】
実施例１８〔小エビメラノーシスの発生に対する式ＩＶの化合物の効果〕
式ＩＶの化合物（２，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸） を式Ｖの化合物の代わりに用いること以外は、実施例８に記載したのと同様にしてピンク小エビを処理し評価した。ピンク小エビは式ＩＶの化合物の０．００１％〜０．１％溶液に浸漬し、前記のようにして保管した。データは、図１２のグラフに示したが、式ＩＶの化合物が０．０５％という低濃度で小エビのメラノーシスの生成の阻害剤であることを示している。
【０１２０】
実施例１９〔新鮮なブラウン小エビのメラノーシスに対する式Ｖの化合物の効果〕
ブラウン小エビ（Ｂｒｏｗｎ ｓｈｒｉｍｐ） を、実施例８でピンク小エビについて記載したのと同様にして処理し評価した。その結果を図１３に示したが、式Ｖの化合物が、ピンク小エビの場合と同様に、ブラウン小エビのメラノーシス発生を阻害するのに有効であることを示している。
【０１２１】
実施例２０〔タイガー小エビから単離したＰＰＯに対する式Ｖの化合物の効果〕
台湾産ブラックタイガー小エビ（Ｂｌａｃｋ Ｔｉｇｅｒ Ｓｈｒｉｍｐ） 〔ペンネウス・モノドン（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ）〕からＰＰＯを以下の方法で単離した。タイガー小エビの頭部を液体窒素で凍結し、次いで微細粉末に粉砕した。粉末状の小エビの頭部を、リン酸塩緩衝液中で攪拌しながら抽出した。粗抽出物を、０〜４０％の硫酸アンモニウム飽和溶液を使って硫酸アンモニウム沈澱に付し、次いで４℃にてフェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ−４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） を用いて疎水性相互作用で分離して精製した。精製されたＰＰＯの画分を限外濾過法で濃縮した。酵素の純度はゲル電気泳動法を用いて測定した（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． 、Ｎａｔｕｒｅ、２２７ 巻、６８０ 〜６８５ 頁、１９７０年）。
【０１２２】
対照試験を以下のように行った。５０μｌ部分の５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を８８０μｌの５ｍＭのＬ−ＤＯＰＡ、５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）に添加した。７０μｌのタイガー小エビＰＰＯ（合計タンパク質が６．３ｍｇの原液）を添加し、直ちにＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ分光光度計を用いて４７５ｎｍにおいて１０分間、３５℃で反応をモニターした。
【０１２３】
阻害剤を試験するために、実施例５に記載したように調製した式Ｖの化合物の溶液（２０ｍＭ）の５０μｌを、８８０μｌのＬ−ＤＯＰＡ溶液に添加した。７０μｌのタイガー小エビＰＰＯの溶液（合計タンパク質が６．３ｍｇの原液）を添加し、直ちに、上記対照試験について記載したのと同様にして分光光度計で反応をモニターした。各試験は３回ずつ行った。
【０１２４】
その結果を表６に示す。
【０１２５】
【表６】
その結果は式Ｖの化合物によってＰＰＯの活性が実質的に阻害されたことを示している。
【０１２７】
実施例２１〔アボカドの酵素による褐変における式Ｖの化合物の効果〕
アボカドは、損傷を受けたり、切断されたり、またはアボカドパルプをブレンドされると、ＰＰＯ接触褐変反応を受けるが（Ｋａｈｎ， Ｖ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，４２巻、３８〜４３頁、１９７５年）、これは、処理されたアボカド製品の市場性を制限する重大な要因である。式Ｖの化合物のアボカド褐変阻害剤としての機能を、下記のようにして評価した。
【０１２８】
アボカドを２等分して、例えば、０．１％（ｗ／ｗ）の式Ｖ、１％（ｗ／ｗ）レモンジュース、０．１％の式Ｖと１％のレモンジュースの組合せ、および負の対照としての水を含む各種試験溶液の存在下で、フードプロセッサーで混合した。この濃度は、アボカドのブレンド調製物中の最終濃度である。式Ｖは、２％水溶液の原液として調製した。試験溶液は、アボカドをスライスして直ちに行う処理中にアボカドパルプに添加した。約１００ｇのブレンドされたアボカドを各試験試料として使用した。
【０１２９】
試料は、室温で４時間静置し、次いで４℃で保存を続けた。試料は、官能検査員による視覚評価を行った。室温での３時間の保管後では、水およびレモンジュースの対照試料は著しい褐変を示したが、一方式Ｖの試料はごくわずかに褐色になっただけであった。式Ｖ／レモンジュースの試料は褐変の徴候を全く示さなかった。２４時間後では、水およびレモンジュースの対照試料は許容できない褐色を呈したが、これとは反対に式Ｖおよび式Ｖ／レモンジュースの試料は依然として許容できる黄緑色であった。試料を９６時間保管した時点で再評価したところ同じ結果が得られた。すなわち式Ｖの試料はごくわずか変色しただけで式Ｖ／レモンジュースで処理した試料はほとんど変化していなかった。水およびレモンジュースによって処理した対照試料は、黒ずんだ褐色に変色した。０．１％の式Ｖはアボカドの褐変の阻害に有効であり、０．１％の式Ｖと１％のレモンジュースの組合わせはさらに大きな効力を有するという結論が得られた。
【０１３０】
実施例２２〔アボカドの褐変の阻害に対する各種の濃度の式Ｖの化合物の効果〕
アボカドブレンド物中の式Ｖの化合物の最終濃度を変えたことを除いて実施例２１と同様にして、アボカド試料と試験溶液を調製し、処理した試料を評価した。式Ｖの濃度としては０．０５％、０．０２５％、０．００５％および０．００１％を採用した。試験試料と対照試料はすべて１％のレモンジュースを含有させて製造した。試料はすべてブレンドした後４℃で保管した。２４時間後、対照試料だけが顕著に褐変した。０．００１％と０．００５％の式Ｖの試料には、７２時間の冷蔵保管後、わずかに褐変がみとめられたが、対照試料は濃い褐色であった。０．０２５％と０．０５％の式Ｖの試料は、依然として許容できる黄緑色であった。９６時間後では、０．０２５％と０．０５％の式Ｖの試料は酵素による褐変の徴候を引続き全く示さなかったが、低濃度の式Ｖの試料は顕著に褐変を示し、対照試料は非常に濃い褐色になった。０．０２５％と０．０５％の式Ｖは、上記の条件下で少なくとも９６時間はアボカドの褐変を防止するのに非常に有効のようであった。
【０１３１】
【発明の効果】
本発明により、食品と飲料の酸化褐変、特にＰＰＯ活性によって起こる酵素による酸化褐変を阻害する４−置換レゾルシノール誘導体で処理された食品および飲料を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度のＹＭ５抽出物（Ｆ１００）の作用を比較するグラフである。
【図２】図２は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度のフィシンおよびＹＭ５抽出物（Ｆ１００）の作用を比較するグラフである。
【図３】図３は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、ＹＭ５抽出物（１重量％）および式Ｖの化合物（０．１重量％）の作用を比較するグラフである。
【図４】図４は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度の式Ｖの化合物の作用を比較するグラフである。
【図５】図５は、式Ｖと式ＶＩＩ の化合物の合成工程を示す概略図である。
【図６】図６は、新鮮なピンク小エビすなわち処理をする前に冷凍しなかった小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、各種濃度の式Ｖの化合物の作用を比較するグラフである。
【図７】図７は、０．０２５％の式Ｖの化合物の小エビメラノーシスの阻害に対する、すすぎなしと処理後の海水すすぎの作用を比較するグラフである。
【図８】図８は、式Ｖの化合物の海水もしくは淡水による０．０１％溶液による小エビメラノーシスの阻害を比較するグラフである。
【図９】図９は、未処理の小エビの異なる１ポンドずつのバッチを繰り返し同じ式Ｖの化合物の０．０１％海水溶液１リットル中に浸漬した場合の、小エビメラノーシスの阻害を比較するグラフである。
【図１０】図１０は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式ＩＩの化合物の作用を比較するグラフである。
【図１１】図１１は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式ＩＩの化合物の作用を比較するグラフである。
【図１２】図１２は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式ＩＶの化合物の作用を比較するグラフである。
【図１３】図１３は、テキサスブラウン小エビ（Ｔｅｘａｓ ｂｒｏｗｎ ｓｈｒｉｍｐ） におけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の式Ｖの化合物の作用を比較するグラフである。
Claims (1)
- 酵素により褐変し易い食品もしくは飲料の褐変を防止または阻害するのに充分な量の４−置換レゾルシノール誘導体で処理されてなる食品もしくは飲料であって、該レゾルシノール誘導体が下記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ ：
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