JP3093788B2 - 食品の褐変を阻害する方法 - Google Patents

食品の褐変を阻害する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 背景 食品の褐変は食品と飲料の産業界では重大な問題であ
る。褐変や酸化による黒ずみは、ポリフェノールオキシ
ダーゼ（PPO）等のような酵素の作用による、または酵
素の作用ではない化学反応による、例えばいくつかの食
品に存在するフェノール化合物の重合による場合があ
る。高いPPO活性が、褐変を起こし易い食品、例えば、
小エビ、バナナおよびキノコ類に存在する。褐変は食品
と飲料の外観とテクスチャに有害な変化を起こす。酵素
作用によるものと酵素作用によらない褐変はともに食品
産業界にとって重大な問題になっており年間何百ポンド
の廃棄食料製品が生じている。
酵素による褐変は、特に、小エビに黒点を発生させる
ことを特徴とする小エビメラノーシスを起こす要因とし
て、特に多くの研究の課題になっている（Faulkner et
al.,Advanced Food Research,19巻、302〜310頁、1953
年）。酵素による褐変は、モノ−およびジフェノール類
からｏ−キノン類が生成するPPO接触酸化反応が行われ
た結果、これらのキノン類は自発的に重合して、黒ずん
だ色の高分子量ポリマーを生成し、特徴的な褐変または
黒ずんだスポットの発生をもたらす。
PPOの熱による不活性化、および食品のpHを変化させ
ること等のような種々の化学的処理を含む、褐変を防止
するいくつもの方法が開発されてきた。熱による不活性
化は、PPOを不活性化するのに必要な高温は食品の品質
とテクスチャを変化させるので、果物類や海産食品等の
ような生鮮食品に対しては適切ではない。同様に、酸
（例えば、クエン酸もしくはリン酸）を添加してpHを下
げる方法はいくつかの食品の外観と品質に有害な影響を
与える。
キノコ類のPPO接触酵素反応による褐変をクエン酸を
用いて制御されることがMcCordとKilaraにより、Journa
l of Food Science,48巻、1479〜1483頁、1983年に報告
されている。エルサレム・アルチコークス（Jerusalem
artichokes）の抽出物のポリフェノールオキシダーゼ活
性を種々の亜硫酸塩化合物を用いて阻害する方法がZawi
stowski et al.,Can.Inst.Food Sci.Tech.J.,20（３）
巻、162〜164頁、1987年に報告されている。ケイ皮酸、
ｐ−クマリン酸およびフェルラ酸を用いることにより、
果物ジュース類の酵素による褐変が制御されることがJ.
R.L.Walker、Food Technology,11巻、341〜345頁、1976
年に記載されている。T.C.Wong et al.は、フロログル
シノールとレゾルシノールおよびその誘導体であるｄ−
カテキンとオルシノールは、PPOのための基質ではない
が、モモのPPOによって生成される４−メチル−ｏ−キ
ノンと反応するということをPlant.Physiol.,48巻、24
〜30頁、1971年に報告している。R.KuttnerとH.Wagreic
h、Arch.Biochem.Biophys.,43巻、80〜87頁、1952年に
は、キノコPPO（カテコラーゼ）は安息香酸と選択され
た安息香酸誘導体によって阻害されることが報告されて
いる。しかしこれらの方法はいずれも、高価であるか、
入手しにくいかまたは性能が劣っているために、完全に
満足すべきものであると立証されていない。
LabuzaはCereal Foods World,34（４）巻、353頁、19
89年に、ある種の食品の酵素による褐変を制御するのに
プロテアーゼ類、特にフィシンを使用することを記載し
ている。著者はこの作用がこのプロテアーゼのPPOに対
する攻撃に起因すると考えている。
食品産業界で広く行われている褐変を減らす別の方法
は、食品と飲料に亜硫酸塩を添加する方法である。小エ
ビメラノーシスのようないくつかの形態の酵素による褐
変は、小エビなどの食品を亜硫酸水素ナトリウムのよう
な亜硫酸塩の溶液に従来浸漬もしくはコートすることに
よって処理されてきた。亜硫酸塩類は酸化防止のためぶ
どう酒にも添加される。亜硫酸塩類はｏ−キノン類をモ
ノ−および／またはジフェノール類を還元することによ
って褐変反応を阻害する。しかし、食品における亜硫酸
塩類の使用は、ある特定の人に対して副作用があるので
制限されており、さらに制限強化されるかまたは完全に
除去されるかもしれない。
発明の要約 本発明は、食品と飲料の酸化褐変、特にPPO活性によ
って起こる酵素による酸化褐変を阻害する化合物と方法
に関する。その化合物は一般式： で表されるレゾルシノール誘導体である。ここで、R1と
R2は独立してＨ、CH3、COR′、CR′、PO3、Ｒ′Ｒ″お
よびSO3R′Ｒ″からなる群から選択され、但しＲ′と
Ｒ″は独立してＨまたは１〜約６個の炭素原子を有する
直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基または置
換芳香族化合物である；およびR3は得られる化合物が阻
害活性を有するよう選択される有機もしくは無機の置換
基である。例えば、R3は得られる化合物が阻害活性を有
するよう選択されるヘテロ原子、またはヘテロ原子、飽
和もしくは不飽和アルキル基、置換芳香族化合物、また
は有機官能基を含む基であってもよい。ヘテロ原子とし
ては、例えば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、
リン（Ｐ）、または塩素（Cl）、臭素（Br）、ヨウ素
（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンが挙げられ
る。飽和もしくは不飽和アルキル基は、直鎖状、分岐状
もしくは環状の形態で、１〜30個の炭素原子をもってい
てもよく、置換芳香族化合物が含まれる。アルキル置換
基または有機官能基は、一つもしくは複数個のヘテロ原
子、例えば酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン
（Ｐ）、または塩素（Cl）、臭素（Br）、ヨウ素（Ｉ）
もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンを含有していてもよ
い。４−アルキルレゾルシノール化合物が、大部分の食
品のメラノーシスを阻害するのに特に有効である。例え
ば、下記式をもつ４−ヘキシルレゾルシノール（ここで
R1とR2がともにＨでR3がC6H13の化合物である。）： が上記の目的に対しては高度に有効である。
１つの実施態様では、R3は一般構造： を有する。ここでｎは１もしくは２であり、およびＺは
該化合物が阻害活性を有するように選択されるアルキル
または他の有機官能基である。Ｚは、窒素（Ｎ）、酸素
（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Cl）、
臭素（Br）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハ
ロゲンのごときヘテロ原子を少なくとも１つを含有する
アルキル置換基であってもよい。好ましい実施態様で
は、ＺはOH、NH2、Ｏ（CH2）xCH3、NHCO2（CH2）xCH3、
NH（CH2）xCH3、アミノ酸、ポリアミン置換基、例え
ば、NH（CH2）xNH2、 NH（CH2）xNH（CH2）yNH2、 NH（CH2）xNHR4および NH（CH2）xNH（CH2）yNHR4、ここでｘとｙは独立して０
〜５の整数である；および少なくとも３つのモノマーで
構成された高ポリアミンオリゴマーもしくは置換オリゴ
マーの基からなる群から選択され、ここでこのモノマー
は1,ωジアミノアルカンであり、およびR4は下記式： を有する。ここでｎ、R1とR2は前記定義と同じである。
酸化褐変の特に有効な阻害剤である化合物は一般式： で表されるレゾルシノール誘導体である。ここでｎは１
もしくは２であり、R1とR2とＺは前記定義と同じであ
る。
酵素による褐変を阻害するのに特に有用なレゾルシノ
ール誘導体は、ｎ＝２であり、R1とR2はともにＨであ
り、ならびにＺはOH、NH（CH2）4NH2、 NH（CH2）4NHR4（すなわち、ｘ＝４であり、およびR4は
前記定義と同じである。）または NH（CH2）4NH（CH2）3NHR4（ｘ＝４であり、ｙ＝３であ
りおよびR4は前記定義と同じである。）であるときに得
られる。これらの化合物はそれぞれ下記式IV、Ｖ、VIお
よびVIIとして表される。
一般式Ｉで表される置換レゾルシノール類には、食品
の褐変を阻害するのに非常に有効な種類の化合物が含ま
れている。４−ヘキシルレゾルシノールは市販されてい
る化合物であるが、この目的に特に有効である。式III
で表される誘導体の化合物のうち３つの化合物は天然の
起源から単離され、その構造は標準的な有機化学分析法
特に1Hと13CのNMRおよび質量分析法で明白に同定され
た。これらの３種の特定な誘導体はそれぞれ式IV、Ｖお
よびVIIで表される構造をもっている。式Ｖ、VIおよびV
IIは、単離および／または特性決定がなされたことがな
いポリアミン誘導体を表わすが、式IVは従来天然には見
出されたことがないレゾルシノール誘導体を表わす。
レゾルシノール誘導体を含有する抗褐変組成物の製造
法も本発明の主題である。特定のレゾルシノール誘導体
を合成することにより調製することができ、または天然
の起源、例えば植物等から単離することができる。一つ
の実施態様では、その誘導体は、水抽出、限外濾過、イ
オン交換クロマトグラフィーおよび逆相HPLCの工程によ
って、例えばイチジクの乳液のような植物起源から単離
して均質物にまで精製される。
本化合物を用いて食品の褐変を阻害する方法を説明す
る。この方法において、例えばある種の貝類、甲殻類動
物、果物、野菜、および果物ジュースやぶどう酒等のよ
うな飲料等の褐変し易い食品は、褐変反応を阻害するの
に充分な量の本レゾルシノール誘導体を含有する組成物
で処理される。
一般に式ＩとIIIにより表され、具体的に式IIとIVで
表される本レゾルシノール誘導体、ならびに具体的に式
Ｖ、VIおよびVIIで表されるレゾルシノール−ポリアミ
ン誘導体は、食品の褐変を阻害するのに非常に有効であ
る。本組成物と方法は、粗製の乳液製剤および亜硫酸水
素ナトリウムより、酸化褐変を阻害するのに有効であ
る。大部分の食品の褐変を阻害するのに必要な量が、同
じレベルの阻害効果を得るために、現在使われている亜
硫酸水素ナトリウムの量より少ない量の本組成物が、大
部分の食品の褐変を阻害するのに必要となる。本化合物
は、食品もしくは飲料の外観、味、テクスチャもしくは
品質に有害な影響を与えずに、選択された食品と飲料の
褐変を阻害もしくは防止する有効な処理を提供する。
図面の簡単な説明 図１は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対す
る、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度のYM5抽出物（F10
0）の作用を比較するグラフである。
図２は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対す
る、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度のフィシンおよび
YM5抽出物（F100）の作用を比較するグラフである。
図３は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対す
る、亜硫酸水素ナトリウム、YM5抽出物（１重量％）お
よび式Ｖの化合物（0.1重量％）の作用を比較するグラ
フである。
図４は、小エビにおけるメラノーシスの発生に対す
る、亜硫酸水素ナトリウムと各種濃度の式Ｖの化合物の
作用を比較するグラフである。
図５は、式Ｖと式VIIの化合物の合成工程を示す概略
図である。
図６は、新鮮なピンク小エビすなわち処理をする前に
冷凍しなかった小エビにおけるメラノーシスの発生に対
する、各種濃度の式Ｖの化合物の作用を比較するグラフ
である。
図７は、0.025％の式Ｖの化合物の小エビメラノーシ
スの阻害に対する、すすぎなしと処理後の海水すすぎの
作用を比較するグラフである。
図８は、式Ｖの化合物の海水もしくは淡水による0.01
％溶液による小エビメラノーシスの阻害を比較するグラ
フである。
図９は、未処理の小エビの異なる１ポンドずつのバッ
チを繰り返し同じ式Ｖの化合物の0.01％海水溶液１リッ
トル中に浸漬した場合の、小エビメラノーシスの阻害を
比較するグラフである。
図10は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に
対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の
式IIの化合物の作用を比較するグラフである。
図11は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に
対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の
式IIの化合物の作用を比較するグラフである。
図12は、ピンク小エビにおけるメラノーシスの発生に
対する、亜硫酸水素ナトリウム、海水および各種濃度の
式IVの化合物の作用を比較するグラフである。
図13は、テキサスブラウン小エビ（Texas brown shri
mp）におけるメラノーシスの発生に対する、亜硫酸水素
ナトリウム、海水および各種濃度の式Ｖの化合物の作用
を比較するグラフである。
発明の詳細な説明 本発明は、ある種類のレゾルシノール誘導体（そのう
ちのいくつかは植物中で天然に産生する）が食品の褐変
を阻害できることを発見したことに基づいている。本化
合物は式Ｉで示される一般式をもつレゾルシノール誘導
体である。
ここで、R1とR2は独立してＨ、CH3、COR′、CR′、PO
3R′Ｒ″およびSO3R′Ｒ″からなる群から選択され、但
しＲ′とＲ″は独立してＨまたは約１〜約６個の炭素原
子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル
基または置換芳香族化合物である;R3は、該化合物が阻
害活性を有するよう選択される、ヘテロ原子、またはヘ
テロ原子、飽和もしくは不飽和アルキル基、置換芳香族
化合物、または有機官能基を含む基であってもよい。ヘ
テロ原子としては、例えば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、
硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Cl）、臭素（B
r）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲン
が挙げられる。飽和もしくは不飽和アルキル基は、直鎖
状、分岐状もしくは環状の形態で、１〜30個の炭素原子
をもっていてもよく、置換芳香族化合物が含まれる。ア
ルキル置換基または有機官能基は、一つもしくは複数個
のヘテロ原子、例えば酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄
（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Cl）、臭素（Br）、
ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハロゲンを含有
していてもよい。
アルキルレゾルシノール化合物が、大部分の食品のメ
ラノーシスを阻害するのに特に有効である。例えば、下
記式をもつ４−ヘキシルレゾルシノール： が上記の目的に対しては高度に有効である。
一つの実施態様では、R3は一般構造： をもっている。ここでｎは１もしくは２であり、および
Ｚは該化合物が阻害活性を有するように選択されるアル
キルまたは有機官能基である。Ｚは、窒素（Ｎ）、酸素
（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、または塩素（Cl）、
臭素（Br）、ヨウ素（Ｉ）もしくはフッ素（Ｆ）等のハ
ロゲンのごときヘテロ原子を少なくとも１つ含有するア
ルキル置換基であってもよい。好ましい実施態様では、
ＺはOH、NH2、Ｏ（CH2）xCH3、NHCO2（CH2）xCH3、NH
（CH2）xCH3、アミノ酸（例えば、リジン、オルニチ
ン、セリンまたはシステイン）；ポリアミン置換基、例
えば、 NH（CH2）xNH2、 NH（CH2）xNH（CH2）yNH2、 NH（CH2）xNHR4および NH（CH2）xNH（CH2）yNHR4、ここでｘとｙは０〜５の整
数である；および少なくとも３つのモノマーで構成され
たポリアミンオリゴマーもしくは置換ポリアミンオリゴ
マーからなる群から選択され、ここでこのモノマーは1,
ωジアミノアルカンであり、およびR4は下記式： をもつ。ここでｎ、R1とR2は前記定義と同じである。
酸化褐変の特に有効な阻害剤である化合物は下記の一
式： をもつレゾルシノール誘導体である。ここでｎは１もし
くは２であり、R1とR2とＺは前記定義と同じである。
酵素による褐変を阻害するのに特に有用なレゾルシノ
ール誘導体は、ｎ＝２であり、R1とR2はともにＨであ
り、ならびにＺはOH、NH（CH2）4NH2、NH（CH2）4NHR4
（ｘ＝４であり、およびR4は前記定義と同じである。）
またはNH（CH2）4NH（CH2）3NHR4（ｘ＝4,y＝３であ
り、およびR4は前記定義と同じである。）であるときに
得られる。これらの化合物はそれぞれ下記式IV、Ｖ、VI
およびVIIとして示される。
本発明には上記式（式Ｉ〜VII）の化合物の機能上の
同等物も含まれる。この“機能上の同等物”という用語
は、類似の抗褐変活性を有する上記化合物の化学的誘導
体もしくは類似体を意味する。ここで、分子が、通常は
分子の一部分ではなく付加されるもしくは異なる化学的
部分をもっている場合、その分子は他の分子の“誘導
体”という。
式Ｖ、VIおよびVIIの構造の分析は、それぞれジアミ
ノブタン（ＶとVI）およびスペルミジン（III）にアミ
ド結合で連結されたレゾルシノール部分を示している。
ジアミンジアミノブタンおよびポリアミンスペルミジン
は、動植物界に広く分布しているアミノ酸由来の脂肪族
窒素化合物である。Recent Advances in Phytochemistr
y,23巻（E.E.Conn編集）Plenum Press、ニューヨーク中
のFlores,H.E.、Protacio,C.M.およびSigns,M.W.、1989
年、によるPlant Nitrogen Metabolism。ヒドロキシケ
イ皮酸アミド（HCA）誘導体として、ｐ−クマリルジア
ミノブタン、フェルリルジアミノブタン、カフェオイル
ジアミノブタンおよびジ−ｐ−クマリルジアミノブタン
のようなジアミノブタン類；ならびにｐ−クマリルスペ
ルミジンのようなスペルミジン類は、13種の科の高等植
物に見出されており（Martin−Tanguy,J.、Plant Growt
h Regul.,3巻、381〜400頁、1985年）、花の成長と関係
があると考えられる。上記のHCA類は、その構造が、式
Ｖ、VIおよびVIIに密接に関連している。HCA類について
多くの研究が現在行れているが、式Ｖ、VIおよびVIIの
存在については文献中には、先行報告はない。式ＶとVI
Iは新規な天然に生じるポリアミン誘導体である。現時
点まで事実上発見されていなかった式VIの化合物も、従
来未知のポリアミン誘導体を示す。式Ｖ、VIおよびVII
で表される化合物は、PPOで触媒されるメラノーシスの
阻害剤としての効力の他に、その分布、代謝および生理
作用が未知の新規な種類のポリアミン誘導体を示す。
式IV、ＶおよびVIIで表される分子は植物から精製す
ることができる。各種の植物起源由来の製剤は特定な酵
素反応の有効な阻害剤である。例えば、イチジクの木、
フィクス属の種Ficus sp.（F.sp.）から得られる乳液
は、プロテアーゼのフィシンを含有している（P.T.Engl
und et al.、Biochemistry,7巻、163頁、1963年）。イ
チジク乳液から調製したフィシン含有抽出物は、酵素に
よる褐変反応の有効な阻害剤であることを示した（Labu
za et al.、Cereal Foods World,34（４）巻、353頁、1
989年）。しかしながら、フィシンのタンパク質加水分
解活性によって食品中のタンパク質が劣化されるので、
フィシンによる処理は、食品のテクスチャと品質に対し
て有害である。例えば、イチジク乳液から調製された市
販用の乳液抽出物は出発物質として使用することができ
る。イチジク乳液の抽出物は、フィシンと他の化合物を
含有するので、“粗製フィシン”または“粗製フィシン
抽出物”と呼ばれる。粗製フィシン抽出物は、市販され
ているので式IV、ＶおよびVIIの化合物を得る原料とし
て有用である。粗製フィシン抽出物は、一般的に粉末も
しくは錠剤のような固体の形態で入手できる。粗製フィ
シン製剤は、主要なプロテアーゼ成分がフィシンであ
り、分子量が約20,000ダルトンのタンパク質であること
を特徴とする。フィシンの存在は、例えば、ゲル浸透高
速液体クロマトグラフィー（GPC−HPLC）のような分子
量に基づいて物質を分離する方法と、フィシン活性の鋭
敏な検定法であるベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニ
トロアニリド（Ｌ−BAPNA）のフィシン触媒加水分解反
応によって検出することができる。式IV、ＶおよびVII
の化合物を粗製乳液もしくは粗製乳液抽出物から得る方
法はそれぞれ実施例２、３および４に記載する。
式Ｉはいくつかの市販されている化合物、例えばアル
キルレゾルシノール類を示すが、これらの化合物は他の
用途に用いられている。本発明者らは、式Ｉで表される
構造を有する化合物は上記のような褐変を起こし易い多
くの食品の酸化褐変の有効な阻害剤であることを発見し
たのである。例えば、４−ヘキシルレゾルシノール（式
II）は医薬として利用されており、The Merck Index,第
10版、681頁、Merck ＆ Co.,Inc.、ニューハンプシャー
州、ラーウエイ、1983年に記載されている。
式IIおよびIV〜VIIで表される抗褐変化合物は合成法
で調製することができる。
一つの実施態様において、式Ｖの化合物は実施例５に
詳細に述べるが、下記の一般的な方法にしたがって合成
される。すなわち、７−ヒドロキシクマリンを水素化し
て７−ヒドロキシジヒドロクマリンとし、次に過剰のジ
アミノブタンと反応させて式Ｖの化合物（2,4−ジヒド
ロキシフェニルプロピオニルジアミノブタン）が得られ
る。この合成された化合物は、1Hと13CNMR、質量スペク
トル分析、元素分析およびTLCによって測定すると粗製
フィシン抽出物から単離した化合物と同一である。
他の実施態様において、式ＶとVIIの化合物は下記の
図５に概略的に示す手順によって合成することができ
る。すなわち、レゾルシノール（1,3−ジヒドロキシベ
ンゼン）を、１つのＣ原子を芳香族環に付加する試薬、
例えばガッターマン試薬（Zn（CN）2,HCl）またはビル
スマイヤー試薬（POCl3/DMF）で処理して誘導体化し、
アルデヒド基を上記レゾルシノールの環に付加して2,4
−ジヒドロキシベンズアルデヒドが製造される。この化
合物はさらに、ピリジンおよびピペリジンのような塩基
性有機溶媒中、高温下（例えば、約100゜〜140℃）でマ
ロン酸（CH2（COOH）２）と反応させ、2,4−ジヒドロキ
シケイ皮酸が得られる。2,4−ジヒドロキシケイ皮酸の
側鎖の二重結合を、例えば水素またはパラジウムを用い
て水素化して2,4−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸
が製造される。この化合物を過剰のジアミノブタンと反
応させると式Ｖ（2,4−ジヒドロキシフェニルプロピオ
ニルジアミノブタン）が得られ、またスペルミジンと
（適切なモル比で）反応させるとビス−フェノール化合
物である式VII（ビス−2,4−ジヒドロキシフェニルプロ
ピオニルスペルミジン）が得られる。
本レゾルシノール誘導体は、各種の食品と飲料に適用
して、褐変を特に酸素による褐変を防止または阻害する
ことができる。ここで用いる“酵素による褐変”という
用語は、キノン類を生成するPPOの作用またはキノン類
の重合に起因する、ｏ−キノンおよびキノンポリマーの
生成、および食品中で自然に生成する他の要素でもたら
される酸化による黒ずみもしくは変色を意味する。
褐変を防止するために、レゾルシノール誘導体は、食
品もしくは飲料を処理するのに、褐変を阻害もしくは防
止するのに充分な量もしくは濃度で使用される。処理方
法は、処理される食品もしくは飲料および所望の結果に
依存しており、例えば、浸漬、噴霧、散粉、散液、液
浸、混合および／またはソーキングを挙げることができ
る。これらの化合物は、水性希釈剤、例えば水、塩水も
しくは緩衝液に添加して食品に適用してもよく、または
生のまま、例えば果物ジュースに添加してもよい。必要
量は、食品もしくは飲料の褐変に対する感受性、食品の
状態および貯蔵状態による。褐変を防止もしくは阻害す
るのに充分な量は、食品技術の分野の熟練者によって経
験的に決定することができる。
本発明の一つの実施態様において、ピンク小エビを式
IIの化合物の水溶液で処理した。式IIを0.0001〜0.005
％の範囲の濃度で用い、亜硫酸水素ナトリウムおよび海
水で処理した小エビと比較した。その結果を図10に示
す。海水で処理した小エビは１〜２日以内にメラノーシ
スのスポットを発生した。式IIは、重量基準で亜硫酸水
素ナトリウムより、小エビの褐変を阻害するのに有効で
あった。例えば、0.005重量％という少量の式IIを含有
する溶液は、亜硫酸水素ナトリウムの1.25重量％溶液と
ほとんど同じ程度に、小エビのメラノーシスを阻害する
のに有効であった。約0.1％までの濃度の式IIを褐変を
阻害するのに使用できる。
本発明の他の実施態様において、ピンク小エビをここ
に記載したように調製した式Ｖの水溶液で処理した。式
Ｖの化合物を約0.1重量％〜約0.001重量％の範囲の濃度
で用い、亜硫酸水素ナトリウムで処理した小エビおよび
未処理の小エビと比較した。その結果を図４に示す。未
処理の小エビはすぐに（１〜２日以内）黒色スポットを
発生した。式Ｖは、重量基準で亜硫酸水素ナトリウムよ
り小エビの褐変を阻害するのに有効であった。例えば、
式Ｖを約0.005重量％という少量含有する溶液は、亜硫
酸水素ナトリウムの1.25重量％溶液と同じ程度に小エビ
のメラノーシスを阻害するのに有効であった。約0.1重
量％の濃度の本レゾルシノール誘導体はこの目的に対し
て特に有効である。
本発明の組成物と方法は褐変し易い多くの食品と飲料
の褐変を防止または大幅に阻害するのに有用である。こ
のような食品と飲料としては、小エビ等の甲殻類、ジャ
ガイモ、リンゴ、バナナ、レタス、モモ、ぶどう酒およ
びいくつかの果物ジュースが挙げられるが、これらに制
限されない。本組成物は、食品特に小エビの劣化を起こ
さない。それが完全に起こらない場合、褐変は“防止さ
れている”。未処理食品と比較して、同じ時間枠内で大
幅に低い速度で起こる場合、褐変は“大幅に阻害されて
いる”。
本発明を以下に示される実施例により、さらに説明す
る。
実施例 実施例１ 粗製フィシンの限外濾過によるYM5溶出液の製造 粗製EDCフィシン（Enzeco Ficin,Enzyme Development
Corp.,（EDC）ニューヨーク州、ニューヨーク）の50mg
/mL溶液を、50mMリン酸ナトリウム、pH6.5（Sigma Chem
ical Co.、ミズーリ州、セントルイス）中で調製した。
その5mL部分（aliquot）を0.45μのフィルターで濾過し
て透明な濾液を作った。その濾液の一部分（subaliquo
t）（2.5mL）をAmicon 5000 MWCO YM5膜（Amicon Cor
p.,マサチューセッツ州、ダンバース）を用いて限外濾
過を行った。限外濾過により得られた溶出液を“YM5溶
出液”と呼ぶ。0.45μ濾液とYM5限外濾過物質を、ゲル
浸透クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー
（GPC−HPLC）で分析したところ、フィシンに対応する
保持時間の範囲内において214nmにおける吸光度がない
ことが見出された。また発色基質のベンゾイル−Ｌ−ア
ルギニン−ｐ−ニトロ−アニリド（Ｌ−BAPNA）を用い
ても、YM5溶出液中にフィシン活性は全く検出されなか
った。
限外濾過に引き続いて、粗製フィシン、その0.45μ濾
液およびYM5溶出液を、ポリフェノールオキシダーゼ（P
PO）の阻害について、下記のモデルシステムを用いて検
定した。
そのモデル検定システムは以下の試薬でなされてい
る。
50mMリン酸ナトリウム、pH6.5（Sigma Chemical C
o.）； 0.5mM Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−DOP
A;sigma Chemical Co.）； PPO（キノコ、Sigma Chemical Co.）； ＋／−の変化をさせた濃度の粗製EDCフィシン；およ
び YM5製剤であり、合計容積が1mLとなる。
これらの試薬を混合し、1cm通路長のキュベット中で2
5℃にサーモスタットで調温したPerkin Elmer UV−VIS
分光光度計を用い475nmにおいて１分間当りの光学濃度
の変化（OD/分）をモニターすることによって、反応速
度を測定した。PPO活性の阻害作用は、PPOと緩衝液を含
んでいるキュベットへ異なった部分（aliquots）の試薬
溶液を添加させることによって、粗製フィシンとYM5製
剤の濃度を変えて検定した。キュベットは25℃で１分間
あらかじめ保温してから、Ｌ−DOPAを添加することによ
り反応を開始した。PPOの検定は、フィシン製剤および
フィシンなしのYM5溶出液のそれぞれの不存在下および
存在下で行った。３種の製剤がすべて同等レベルの阻害
性を示した。それ故にPPO活性の阻害はPPOに対するフィ
シンの作用に起因するものではないであろう。
実施例２ 粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式IV）の精製 精製EDCフィシン（50g）は400mLのメタノールで抽出
した。その上澄液をロータリーエバポレーターで蒸発さ
せることによって乾固した。得られた固体を逆相HPLC
（RP−HPLC）で一部精製した。
逆相HPLCは、移動相の疎水性を増大した場合の分子と
HPLCカラム内の疎水性固定相の相互作用によって分子を
分離することに基づいた精製法である。この場合、固定
相（カラム充填物（packing））はオクタデシル基
（C18）でコートされた樹脂であり、移動相（カラム中
を流れる溶剤）は、変化させた量のアセトニトリルを存
在させる0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）であった。精
製プロトコールは分析規模で開発され、次いでWaters D
eltaPrep HPLCシステム（Waters Associates,Millipore
Corp.、マサチューセッツ州、ミルフォード）を用いて
製造規模に改造した。
アセトニトリル濃度を増大させて直線のグラジエント
を展開させたところ、標題の化合物が約20％のアセトニ
トリルで溶出された。阻害剤のピーク画分をプールし、
Waters Delta Pakカラム（15μ、7.8×30cm）を用いHPL
Cでさらに精製した。溶出液は214nmでモニターされ、阻
害剤の存在を確認するために画分を検定した。ピーク画
分をプールして濃縮した。式IVの化合物の試料（上記の
ようにして単離されたかまたは合成されたもの）を1Hと
13CのNMRおよび質量分析法等のいくつかの分析法で分析
した。その結果は式IVに対応する構造と一致した。
1H NMR（CD3CN）300MHZδ6.89（d,J＝8H2,1H,C6），
δ6.27（d,J＝2.81HZ,1H,C3），δ6.24（ｄのd,J＝8.2
4,2.59HZ,1H,C5），δ2.716（t,J＝7.4HZ,2H,C8），δ
2.515（t,J＝7.24HZ,2H,C7）．13 C NMR（CD3CN）75.47MHZ（Ｊ＝調節されたスピン・エ
コー法（Ｊ−Modulated spin echo method））δ176.20
（C9），δ157.35（C2），δ156.41（C4），δ131.69
（−ve強度,C6），δ119.43（C1），δ107.83（−ve強
度,C5），δ103.57（−ve強度,C3），δ34.83（C8），
δ25.50（C7） 質量分析 EI m/s M+182,164（M+−H2O）,136,123.（高
速原子衝突（Fast atom bombardment））（FAB）m/z M+
H+183,165（M+−H2O）． 実施例３ 粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式Ｖ）の精製 実施例１で得られたYM5溶出液を、イオン交換クロマ
トグラフィーとRP−HPLCによってさらに精製した。2mM
リン酸ナトリウム（pH6.5）中の実施例１に記載したよ
うにして得られたYM5溶出液の溶液をSP−セファデック
ス（Sephadex）樹脂（Pharmacia,スウェーデン、アップ
サラ）のカラムに注入した。この樹脂に吸着しなかった
物質を、2mMリン酸ナトリウム（pH6.5）を２回カラムに
供給して洗い出した。樹脂との相互作用の強度の関数と
して分子を溶出する塩化ナトリウムの直線グラジエント
（０〜0.2M）をカラムに適用して、あらかじめ吸着した
分子を分離した。溶出された物質は214nmと280nmにおけ
る吸光度でモニターして、20mLずつの画分を集めた。グ
ラジエントの全容積は２リットルであった。阻害剤の存
在について、画分を実施例１に記載のようなモデル検定
システムを用いて試験した。分析により５つの阻害のピ
ークが見出された。これらのピークに基づいて見出され
た画分をプールし、凍結し、凍結乾燥を行った。プール
IVおよびプールＶと標識された２つのピークは、阻害率
のピークサイズに対する比率に基づいて最も強力な阻害
剤であると思われ、実施例２に記載したようにRP−HPLC
でさらに精製するためにそれを選択した。
SP−セファデックス（Sephadex）のプールIVを凍結乾
燥した物質を移動相に溶解し、遠心分離して粒子を除
き、HPLCカラムに注入した。アセトニトリル濃度を増大
させて直線のグラジエントを展開させたところ、約15％
のアセトニトリルで阻害剤が溶出した。溶出液は多重チ
ャンネルUV−Vis検出器で214nmと280nmにおいてモニタ
ーされ、阻害剤の存在を確認するのに何回かの試験で画
分を検定した。阻害剤のピーク画分を、スピードバック
（SpeedVac）で濃縮し、凍結し、そして凍結乾燥した。
TFA/メタノールグラジエントシステムでのRP−HPLCによ
って再分析したところ、回収された阻害剤について高い
精製度を示した。
精製されたプールIVの阻害剤をいくつかの物理的方法
および化学的試験法により分析した。阻害剤のUV−Vis
スペクトルは、芳香族もしくはフェノール化合物の典型
的な波長範囲に入っている280nmにおいて吸光度の最大
値を示した。ビシンコニン酸（bicinchonic acid）およ
びニンヒドリンとの反応は、それぞれアミド結合と第一
級アミンの存在を示した。
阻害剤の試料を1Hと13CのNMRおよび質量分析法等のい
くつかの分析法によって分析した。その結果は下記式Ｖ
に対応する構造と一致した。
1H MNR（CD3CN）300MHzδ7.5〜6.5（拡大（broad）,O
H），δ6.9〜6.8（b,CONH），δ6.868（d,J＝8.1Hz,1H,
C6），δ6.304（d,J＝2.3Hz,1H,C3），δ6.259（ｄのd,
J＝2.4,8.0Hz,1H C5），δ5.5〜4.8（b,NH2），δ3.115
（q,J＝12.38,6.23Hz,2H,C10），δ2.908（b,2H,
C13），δ2.725（t,J＝6.8Hz,2H,C8），δ2.439（t,J＝
6.8Hz,2H,C7），δ1.51,1.46（重複多重線（overlappin
g multiplets）,4H,C11,C12） 13C MNR（D20）75.47MHz（Ｊ−調節されたスピン・エ
コー法）（Ｊ−Modulated spin echo method））δ176.
68（Ｃ＝０），δ155.74（C2），δ155.41（C4），δ13
2.09（−ve強度,C6），δ119.59（C1），δ107.97（−v
e強度,C5），δ103.49（−ve強度,C3）δ39.81
（C13），δ39.04（C10），δ36.69（C8），δ26.33（C
7），δ26.09（C11），δ24.69（C12） 質量分析 DCL m/z M+H+253,165（Ｍ−NH（CH2）4N
H2）EI m/z M+252,164,（C9H8O3）136,123,（高速原子
衝突（Fast atom bombardment））（FAB））m/z M+H+25
3 実施例４ 粗製フィシンのメラノーシス阻害剤（式VII）の精製 実施例２に記載の手順によって得られたSP−セファデ
ックス（Sephadex）のプールＶの凍結乾燥物質をさらに
RP−HPLCにより精製した。精製条件は実施例２で用いた
ものと同じであった。アセトニトリル濃度を増大させて
直線のグラジエントを展開させたところ、式VIIの化合
物が約30％のアセトニトリルで溶出された。溶出液は、
多重チャンネルUV−Vis検出器で214nmと280nmにおいて
モニターされ、式VIIで表される阻害剤の存在を確認す
るため、何回か試験し画分を検定した。阻害剤のピーク
画分をプールし、Waters Delta Pakカラム（15μ、7.8
×30cm）を使いHPLCでさらに精製した。溶出液を214nm
においてモニターし、阻害剤の存在を確認するため画分
を検定した。ピークの画分をプールして濃縮した。RP−
HPLCで再分析したところ、回収した阻害剤について高い
精製度を示した。
式VIIの化合物の試料をいくつかの分析法（1Hと質量
分析法）で分析したところ、式に対応する構造に一致し
た。
1H MNR（CD30D）300MHzδ6.861,6.845（d,J＝8.16Hz,
2H,C6,C25），δ6.276（重複二重線（overlapping doub
lets））,J＝2.56,2H,C3,C22），δ6.208,6.197（重複
（overlapping）ｄのd,J＝8.1,2.57Hz,2H,C5,C24），δ
3.241,3.180（三重線（triplets））,J＝6.30,4H,C10,C
16），δ2.893〜2.711（よく分解している（well resol
ved）（m,8H,C8,C13,C14,C18），δ2.51,2.44（t,J＝7.
34,4H,C7,C19），δ1.761（五重線（quintet））,2H,C
15），δ1.601〜1.604（分解していない（unresolve
d））m,4H,C11,C12） 質量分析 DCLIm/z（弱（weak）310（Ｍ−C9H8O3）,1
65（C9H8O3H+）146（C7H19N3H+）EI（高分解（high res
olution））m/z 309（Ｍ−C9H8O3）,FAB m/z M+H+474,3
10（Ｍ−C9H8O3） 実施例５ 式Ｖの化合物の合成 式Ｖで表される化合物（2,4−ジヒドロキシフェニル
プロピオニルジアミノブタン）： を下記の手順で合成した。
無水エタノール（200mL）中の７−ヒドロキシクマリ
ン（5.0g、0.031モル;Aldrich Chemical Company）の溶
液を、Parrの装置内で、10％Pd/C（触媒;500mg、50％
水、Kodak,Inc.、ニューヨーク州、ロチェスター）上
で、55℃にて24時間加圧下にて水素化した。薄層クロマ
トグラフィー（TLC;シリカゲル:EtOAc/ヘキサン＝1:1）
が反応の完了を示した。反応混合物をセライト（Celit
e）床（Rohm and Haas Co.、ペンシルベニア州、フィラ
デルフィア）で濾過し、減圧蒸発させて粗製品（4.5g）
を得た。この物質の一部（2.5g）をトルエンにより再結
晶させ、減圧乾燥させて７−ヒドロキシジヒドロクマリ
ンを得た。
収量:1.83g;融点133゜〜135.5℃； 1H NHR（CD3CN）300MHzδ7.01（d,J＝8.3Hz,1H,
C5），δ6.55（ｄのd,J＝4.1,2.4Hz,1H C6），δ6.48
（d,J＝2.4Hz,1H,C8），δ2.847（t,J＝7.2Hz,2H,
C3），δ2.685（ｄのd,J＝7.7,6.0Hz,2H,C6）． 13C NMR（CD3CN）75.47MHz（Ｊ−調節されたスピン・
エコー法）（Ｊ−Modulated spin echo method） δ169.85（C2,＋ve強度），δ157.57（C7,＋ve強度），
δ153.61（C9,＋ve強度），δ129.72（C5,−ve強度），
δ157.57（C10,＋ve強度），δ112.21（C6,−ve強
度），δ104.42（C8,−ve強度），δ30.01（C3,＋ve強
度），δ23.35（C4,＋ve強度）． ジアミノブタン（3.0mL:0.3モル;Aldrich Chemical C
o.）を添加用ロートを取り付けた三ツ口フラスコ内で窒
素雰囲気下で55℃に加温した。メタノール（15mL）中の
７−ヒドロキシジヒドロクマリン（1.0g、0.006モル）
を滴下して加えた。添加を完了した後、反応混合物を蒸
発乾固し、残留物を酢酸エチルを用いて繰り返しトリチ
ュレート（tritulate）した。残留ガム状物を高真空度
下で乾燥した。この物質をフラッシュ（flash）カラム
クロマトグラフィー（シリカ;20％MeOH/EtOAc/NH4OH
（５％）〜30％MeOH/EtOAc/NH4OH（５％）のグラジエン
ト溶出液）において精製した。画分をTLCに基づいて組
合せて式Ｖ（1.0g）が得られた。1H−NMR、13C−NMR、
質量分析および元素分析は、この合成化合物が実施例３
で得られたYM5溶出液から単離した化合物と同一のもの
であることを示した。
1H MNR（CD3CN）300MHzδ7.5〜6.5（拡大（broad）,O
H），δ6.9〜6.8（b,CONH），δ6.868（d,J＝8.1Hz,1H,
C6），δ6.304（d,J＝2.3Hz,1H,C3），δ6.259（ｄのd,
J＝2.4,8.0Hz,1H,C5），δ5.5〜4.8（b,NH2），δ3.115
（q,J＝12.38,6.23Hz,2H,C10），δ2.908（b,2H,
C13），δ2.725（t,J＝6.8Hz,2H,C8），δ2.439（t,J＝
6.8Hz,2H,C7），δ1.51,1.46（重複多重線（overlappin
g multiplets））,4H,C11,C12）． 13C MNR（D20）75.47MHz（Ｊ−調節されたスピン・エ
コー法）（Ｊ−Modulated spin echo method）） δ176.68（Ｃ＝０），δ155.74（C2），δ155.41
（C4），δ132.09（−ve強度,C6），δ119.59（C1），
δ107.97（−ve強度,C5），δ103.49（−ve強度,C3），
δ39.81（C13），δ39.04（C10），δ36.69（C8），δ2
6.33（C7），δ26.088（C11），δ24.69（C12） 元素分析 C13H20N2O3、計算値 C61.88,H7.99,N11.1
1、実測値 C61.97,H7.96,N11.01 質量分析 DLC m/z M+H+253,165（Ｍ−NH（CH2）4N
H2）EI m/z M+252,164,136,123,FAB m/z M+H+253 実施例６ 式VIの化合物の合成 式VIで表される化合物（ビス−2,4−ジヒドロキシフ
ェニルプロピオニルジアミノブタン）を実施例５に記載
した方法を修正して合成した。ジアミノブタン（1.09m
L、5.48mmol）を30mLの無水エタノールに溶解した。そ
こに７−ヒドロキシジヒドロクマリン（4.5g）を徐々に
添加した。得られた溶液を室温で１時間攪拌した。溶剤
をロータリーエバポレーターで除去して赤色のガム状物
を得た。過剰の酢酸エチルを添加し次いでロータリーエ
バポレーターで蒸発させることによりピンク色の固体を
得て、これを過剰の酢酸エチルで洗浄し次に減圧デシケ
ーターで乾燥して4.6g（収率82％）の式VIの化合物を得
た。単離した化合物を1Hと13CのNMRおよび質量分析法等
のいくつかの分析法で分析した。その結果は式VIに対応
する構造と一致した。
1H MNR（CD30D）300MHz.δ6.841（d,J＝8.1Hz,2H,C6,
C22），δ6.277（d,J＝2.4Hz,2H,C3,C19），δ6.204
（ｄのd,J＝8.1,2.4Hz,2H,C5,C21），δ3.089,（b,4H,C
10,C13），δ2.779（t,J＝7.4Hz,4H,C8,C15），δ2.42
2,（t,J＝7.4Hz,4H,C7,C18），δ1.35（b,4H,C11,
C12）． 13C NMR（CD3CN）75.47MHz 75.47MHz（Ｊ−調節され
たスピンエコー法）（Ｊ−Modulated spin echo. δ176.05（C9,C14,＋ve強度），δ157.74（C2,C18,＋ve
強度），δ157.02（C4,C20,＋ve強度），δ131.58（C6,
C22,−ve強度），δ119.55（C1,C17,＋ve強度），δ10
7.471（C5,C21,−ve強度），δ103.59（C3,C19,−ve強
度），δ39.49（C8,C15,＋ve強度），δ37.73（C10,
C13,＋ve強度），δ27.54（C11,C12,＋ve強度），δ27.
01（C7,C16,＋ve強度）． 質量分析 FAB m/z M+H+417,309（M+−C6H5O2）253
（M+＝C9H9O3）． 実施例７ 各種レゾルシノール誘導体によるPPOの阻害 各種のレゾルシノール化合物がPPO（キノコ）を阻害
する作用を測定するために、実施例１に記載したのと同
様の線形分光光度検定システムを使用した。その検定混
合物： 5mMのリン酸ナトリウム、pH6.5; 0.133mMのＬ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−D
OPA）； PPO（キノコ）；および ＋／−の変化をさせた濃度の被検化合物 で構成されていた。反応速度は、475nmにおける吸光度
の１分間当たりの変化を25℃にて測定してモニターし
た。見かけ阻害定数（I50）を表１に示す。
表１ 化合物 I50,μＭ レゾルシノール 2700 式II 0.5 式IV 25 式Ｖ ５ 式VI ５ 式VII ５ ４−エチルレゾルシノール 0.8 ４−ｎ−プロピルレゾルシノール 1.8 ４−ドデシルレゾルシノール 0.3 ４−シクロヘキシルレゾルシノール 0.2 ４−ヘキサノイルレゾルシノール 750 ４−カルボキシレゾルシノール （2,4−ジヒドロキシ安息香酸） 150 I50は、酵素の50％の阻害率を得るのに必要な阻害剤
の濃度を表わす。その結果は、同レベルの阻害に到達す
るのにレゾルシノール誘導体は、レゾルシノールと比べ
てはるかに少ない濃度しか必要としないことを示してい
る。
実施例８ YM5溶出物のピンク小エビメタノーシスに対する作用 ピンク小エビ〔ペネウス・デュオラルム（Penaeus du
orarum）〕を、フロリダ州、キー・ウエストで捕獲して
冷凍し、処理する前に解凍した。メラノーシスは、表２
に示すメラノーシスを説明するために開発された等級に
よって小エビを格付けした。
表2.ピンク小エビにおけるメラノーシス（黒色スポッ
ト）の発生を説明し評価するのに用いる等級 メラノーシスの等級 ０ なし ２ いくつかの小エビにわずかに認められる ４ ほとんどの小エビにわずかに認められる ６ ほとんどの小エビに中位に認められる ８ ほとんどの小エビに多量に認められる 10 全体に許容できない程度に多量に認められる このメラノーシスの等級は、National Marine Fisher
ies Serviceが生の小エビを等級分けするのに作成した
既存の勧告に関連づけることができる（連邦法施行規則
1982タイトル50、パート265、サブパートＡ、小エビの
等級に関する米国一般標準、262〜268頁）。４以上の等
級の評価は製品品質のかなり重要な欠陥を示す。８以上
の評価は許容できない製品に近い重大な欠陥を表わす。
捕獲は、新鮮な前頭部（heads−on）ピンク小エビが
捕獲後12時間以内に船着場で得られるように計画され
た。小エビはすべて、通常通りに、船上で洗浄され一時
的に氷の中に保管された。基本的な手順は、2.5リット
ルの各種の浸漬組成と濃度の液中で400〜600gの小エビ
を１分間すすぎ、次に水きりを行いプラスチックの袋に
つめて氷の中に保管した。この袋は、氷を解かす各種の
影響を排除するために必要であるとみなれた。包装され
た小エビとともに氷を入れたコンテナーは、35゜F（1.7
℃）の冷蔵状態で１日おきに氷を入れて保管された。
２週間の保管期間中、通常通りにメラノーシスの発生
を採点し、写真撮影を行った。検査員が各種の処理を識
別できないように、小エビの袋には番号を付けた。１名
の経験を積んだ検査員が上記の等級（表２）に関する全
ての採点を行った。等級には、メラノーシスの進行段階
の通常例を示す予め現像されたカラー写真が添付され
た。目的は、処理法間の明白な差異を見つけて選別し、
次の統計的評価法により最高の処理法を選択することで
ある。
各種の浸漬もしくは化学的処理には、対照としての水
道水、1.25％の濃度の亜硫酸水素ナトリウム、粗製EDC
フィシンおよび実施例１で述べた手順で調製された“F1
00"と命名されたYM5溶出液が含まれた。浸漬溶液は新鮮
な水道水であった。
処理（浸漬）と小エビと浸漬溶液の比率を表３に示
す。
処理は、バッチに蒸留水で行ったことが特に指定がな
い限り、水道水に各種のものを添加して行った。すべて
の処理において、小エビは60〜80秒間浸漬液中に完全に
沈め、次いでゆるやかに攪拌しながら短時間（５〜10秒
間）水切り器で水切りを行った。
その結果を図１および２に示す。図１は、YM5溶出
液、F100、がメラノーシスを減少させることについて亜
硫酸水素ナトリウムと同じ程度か、またはそれより優れ
ていたことを示す。図２はF100が、メラノーシスを減少
させることについて、粗製フィシンと同じ程度に有効
で、かつ亜硫酸水素ナトリウムより優れていたことを示
す。
実施例９ YM5溶出液を用いてリンゴの酵素による褐変の阻害 外界温度（22〜24℃）で保持された新鮮なマッキント
ッシュリンゴ全体を４等分に切って芯を取り去り、1/4
インチ厚のスライスに切断した。そのリンゴのスライス
を、５秒より少ない時間、10秒間、１分間、2.5分間お
よび５分間等の各種の時間、表４に示す溶液を用いて、
スライス面をブラッシングするかまたは全体を完全に沈
めて浸漬することによって処理した。処理に続いて、リ
ンゴのスライスは、外界温度に放置され空気にさらされ
た。そのスライスを、０、１、２、３、４および24時間
後に褐変を目視で検査した。
表３ リンゴの処理 対照 １）液体なし、即ち空気のみ ２）脱イオン水、pH5.8 ３）50mM、リン酸ナトリウム緩衝液、pH6.7 ４）50mM、リン酸緩衝液、pH2.7（4.0N NaOHを用いてp
H2.0から上昇させた） 試験 ５）YM5溶出液、pH6.3、約100mg/mL、リン酸ナトリウム
溶液中の粗製フィシン（200mg/mL）から実施例１に記載
したように調製されたもの ６）YM5溶出液、最終pH4.6、約100mg/mL、粗製フィシン
のリン酸緩衝液（50mM）、pH2.7（4.0N NaOHを用い
て、pH2.0から上昇させた）による溶液（200mg/mL）か
ら実施例１に記載したように調製されたもの その結果は、YM5溶出液を使った処理５と６（表４）
がリンゴのスライスの褐変の程度を最少にすることを示
した。全試料が最初は（ゼロ時間）白色であった。対照
試料（表４、処理１〜４）の褐変は１時間後に認めら
れ、最高の褐変は約３時間後に起こった。処理５と６を
受けたスライスには、３時間後でも有意な褐変は全く認
められなかった。24時間後に、処理５と６を受けたスラ
イスはわずかに褐変したが、対照試料より大幅に少ない
褐変を示した。
実施例10 式Ｖの化合物およびYM5溶出液によるリンゴの褐変の阻
害 外界温度にて保管されていた２個の新鮮な傷のないマ
ッキントッシュリンゴ全体を、ステンレス鋼製果物ナイ
フで切って４等分し、芯を除き、1/4インチ厚のスライ
スに切断した。表５に列挙した、0.8mL各処理溶液を外
界温度にて、新たに切断した白色スライスのさらされた
上面に、処理１回当り３回試料液を塗布した。式Ｖの化
合物は実施例５に記載されているように合成した。塗布
に続いて、スライスを外界温度に放置し、空気と光にさ
らさせて、15分間〜４時間にわたって褐変の相対速度と
程度を定期的に目視観察した。
表５ リンゴの処理 制御pH:6.7〜7.0 １）リン酸ナトリウム緩衝液（5mM） ２）リン酸ナトリウム緩衝液（5mM）＋ラクトース
＊（9.0％） ３）リン酸ナトリウム緩衝液（5mM）＋ラクトース
＊（9.0％）＋YM5（1.0％；ラクトースなし） ４）リン酸ナトリウム緩衝液（5mM）＋ラクトース
＊（9.0％）＋式Ｖ、0.5重量％、（20mM） ５）リン酸ナトリウム緩衝液（5mM）＋ラクトース
＊（9.0％）＋1,4−ジアミノブタン、50mL/100mL（5m
M） ６）リン酸ナトリウム緩衝液（5mM）＋式Ｖ、0.5％、
（20mM） ７）空気のみ＊ 粗製フィシン製剤には、供給者が希釈するために使用
したラクトース固体が含有されているためにラクトース
を添加した。
新たに切断された試料はすべて、最初は白色であっ
た。処理してから15分以内に、溶液３、４および６で処
理された試料は白色のままであったが、それを除くすべ
ての試料にある程度の褐変が生じた。１時間後、溶液４
と６で処理された試料は依然として白色であったが、他
の試料は種々の程度の褐変を示した。他の試料の褐変の
程度の、最少から最高の褐変までの順位は３＜2,5＜1,7
であった。約３時間後に、最高の程度の褐変が、１時間
後に上記に述べられたランクで、試料１、２、３、５お
よび７に生じた。溶液４と６で処理した試料は白色のま
まで特に色は変化しなかった。
上記の試験条件下では、20mMの濃度の式Ｖの化合物
は、YM5溶出液と粗製フィシンより一層有効にリンゴの
褐変を阻害した。ラクトースおよび／または14−ジアミ
ノブタンは褐変を防止しなかった。
実施例11 ピンク小エビメラノーシスに対するYM5溶出液と式Ｖの
化合物の効果 ピンク小エビ（ペネウス・デュオラルム（Penaeus du
orarum））をフロリダ州、キーウエストで捕獲して凍結
し、処理する前に解凍した。メラノーシスは、表２の実
施例８に示されたメラノーシスを説明するために開発さ
れた等級によって小エビのメラノーシスを評価した。
基本的な手順は、種々の組成と濃度の浸漬液で小エビ
を１分間すすぎ（式Ｖの化合物を２種の最高濃度で含有
する試験溶液、すなわち0.1％と0.05％は、この物質が
不足していたので、その試験溶液を６匹の個々の小エビ
に塗布した）、次いで水きりを行いプラスチック製袋内
に包装し氷中に保管した。この袋は、解ける氷の種々の
影響を排除するために必要であるとみなされた。包装さ
れた小エビとともに氷の入ったコンテナは、１日おきに
氷を入れ、35゜F（1.7℃）の冷凍状態で保管した。メラ
ノーシスの発生は、実施例８に記載したものと同様に、
保管の７日間の間、通常通りに採点し写真を撮影した。
種々の浸漬液または化学処理液には、対照としての水
道水、1.25％の濃度の亜硫酸水素ナトリウム、１％の濃
度のYM5溶出液（実施例１で調製した）、および図３お
よび４に示す各種の濃度の式Ｖの化合物が含まれてい
た。図３に示す結果は、0.1重量％の濃度の式Ｖの化合
物が、メラノーシスを減少させのに亜硫酸水素塩と同程
度に有効であることを示している。図４は、0.005％と
いうような少量の式Ｖの化合物が、メラノーシスを減少
させるのに亜硫酸水素ナトリウムと同じ程度に有効であ
ったことを示している。
実施例12 新鮮なピンク小エビのメラノーシスに対する式Ｖの化合
物の効果 ピンク小エビ（ペネウス・デュオラルム（Penaeus du
orarum））を処理して、新たに捕獲した小エビについ
て、試験は小エビ捕獲用船上で実施したこと以外は実施
例８と同様に評価した。小エビは、各種の濃度の式Ｖの
化合物で処理する前に凍結を行わなかった。全溶液を海
水で調製した。その結果を図６に示す。式Ｖの化合物は
新鮮なピンク小エビのメラノーシスの防止に有効であ
る。
実施例13 式Ｖの性能に対する処理後のすすぎの効果 新鮮なピンク小エビを実施例12に記載したのと同様に
して処理し評価した。0.025％の式Ｖの化合物で処理し
た小エビを直接保管するか、または処理後次いで海水で
すすいでから保管した。その結果を図７に示したが、処
理後のすすぎは、式Ｖの化合物による小エビメラノーシ
スの阻害に対して有意な効果がないことを示している。
実施例14 式Ｖの化合物の溶液の溶媒として海水または淡水を用い
る効果 新鮮なピンク小エビを実施例12に記載したのと同様に
して処理し評価した。小エビは、海水もしくは淡水で調
製した式Ｖの化合物の0.01％溶液に浸漬した。データを
図８に示すが、溶液が淡水もしくは海水で調製された場
合においても、式Ｖの化合物による小エビメラノーシス
の阻害の有意な効果はないことを示している。
実施例15 式Ｖの化合物の0.01％溶液に、小エビを繰り返し浸漬す
る効果 新鮮なピンク小エビをを実施例12に記載したのと同様
して処理し評価した。この実施例では、式Ｖの化合物の
同じ１リットル0.01％溶液の中に、小エビの１ポンドず
つの異なるバッチを各々１分間ずつ浸漬した。合計８回
浸漬を行なった。その結果を図９に示すが、式Ｖの化合
物は、同じ0.01％溶液に８回浸漬を行った後でも依然と
して有効なメラノーシス阻害剤であることを示してい
る。
実施例16 小エビメラノーシスの発生に対する４−ヘキシルレゾル
シノールの効果 式IIの化合物（４−ヘキシルレゾルシノール、Sigma
Chemical Co.）を式Ｖの化合物の代わりに用いることを
除いて実施例８に記載したのと同様にして、ピンク小エ
ビを処理し評価した。ピンク小エビは、式IIの化合物の
0.0001％〜0.005％溶液に浸漬し前述のように保管し
た。データを図10のグラフで示すが、式IIの化合物は、
0.0005％という低濃度で小エビメラノーシスの生成の強
力な阻害剤であることを示している。
実施例17 小エビメラノーシスの発生に対する式VIの化合物の効果 式VIの化合物（実施例６参照）を式Ｖの化合物の代わ
りに用いること以外は、実施例８に記載したのと同様に
してピンク小エビを処理し評価した。ピンク小エビは、
式VIの化合物の0.001〜0.025％溶液に浸漬し、前述のよ
うに保管した。データは、図11のグラフに示したが、式
VIの化合物が0.005％という低濃度で小エビのメラノー
シスの強力な阻害剤であることを示している。
実施例18 小エビメラノーシスの発生に対する式IVの化合物の効果 式IVの化合物（2,4−ジヒドロキシフェニルプロピオ
ン酸）を式Ｖの化合物の代わりに用いること以外は、実
施例８に記載したのと同様にしてピンク小エビを処理し
評価した。ピンク小エビは式IVの化合物の0.001％〜0.1
％溶液に浸漬し、前記のようにして保管した。データ
は、図12のグラフに示したが、式IVの化合物が0.05％と
いう低濃度で小エビのメラノーシスの生成の阻害剤であ
ることを示している。
実施例19 新鮮なブラウン小エビのメラノーシスに対する式Ｖの化
合物の効果 ブラウン小エビ（Brown shrimp）を、実施例８でピン
ク小エビについて記載したのと同様にして処理し評価し
た。その結果を図13に示したが、式Ｖの化合物が、ピン
ク小エビの場合と同様に、ブラウン小エビのメラノーシ
ス発生を阻害するのに有効であることを示している。
実施例20 タイガー小エビから単離したPPOに対する式Ｖの化合物
の効果 台湾産ブラックタイガー小エビ（Black Tiger Shrim
p）〔ペンネウス・モノドン（Penaeus monodon）〕から
PPOを以下の方法で単離した。タイガー小エビの頭部を
液体窒素で凍結し、次いで微細粉末に粉砕した。粉末状
の小エビの頭部を、リン酸塩緩衝液中で攪拌しながら抽
出した。粗抽出物を、０〜40％の硫酸アンモニウム飽和
溶液を使って硫酸アンモニウム沈澱に付し、次いで４℃
にてフェニルセファロース（Phenyl−Sepharose）CL−4
B（Pharmacia）を用いて疎水性相互作用で分離して精製
した。精製されたPPOの画分を限外濾過法で濃縮した。
酵素の純度はゲル電気泳動法を用いて測定した（Laemml
i,U.K.、Nature、227巻、680〜685頁、1960年）。
対照試験を以下のように行った。50μｌ部分の1mMリ
ン酸ナトリウム（pH6.5）を880μｌの5mMのＬ−DOPA、5
mMのリン酸ナトリウム（pH6.5）に添加した。70μｌの
タイガー小エビPPO（合計タンパク質が6.3mgの原液）を
添加し、直ちにBeckman DU分光光度計を用いて475nmに
おいて10分間、35℃で反応をモニターした。
阻害剤を試験するために、実施例５に記載したように
調製した式Ｖの化合物の溶液（20mM）の50μｌを、880
μｌのＬ−DOPA溶液に添加した。70μｌのタイガー小エ
ビPPOの溶液（合計タンパク質が6.3mgの原液）を添加
し、直ちに、上記対照試験について記載したのと同様に
して分光光度計で反応をモニターした。各試験は３回ず
つ行った。
その結果を表６に示す。
その結果は式Ｖの化合物によってPPOの活性が実質的
に阻害されたことを示している。
実施例21 アボカドの酵素による褐変における式Ｖの化合物の効果 アボカドは、損傷を受けたり、切断されたり、または
アボカドパルプをブレンドされると、PPO接触褐変反応
を受けるが（Kahn,V.、Journal of the Science of Foo
d and Agriculture,42巻、38〜43頁、1975年）、これ
は、処理されたアボカド製品の市場性を制限する重大な
要因である。式Ｖの化合物のアボカド褐変阻害剤として
の機能を、下記のようにして評価した。
アボカドを２等分して、例えば、0.1％（w/w）の式
Ｖ、１％（w/w）レモンジュース、0.1％の式Ｖと１％の
レモンジュースの組合せ、および負の対照としての水を
含む各種試験溶液の存在下で、フードプロセッサーで混
合した。この濃度は、アボカドのブレンド調製物中の最
終濃度である。式Ｖは、２％水溶液の原液として調製し
た。試験溶液は、アボカドをスライスして直ちに行う処
理中にアボカドパルプに添加した。約100gのブレンドさ
れたアボカドを各試験試料として使用した。
試料は、室温で４時間静置し、次いで４℃で保存を続
けた。試料は、官能検査員による視覚評価を行った。室
温での３時間の保管後では、水およびレモンジュースの
対照試料は著しい褐変を示したが、一方式Ｖの試料はご
くわずかに褐色になっただけであった。式V/レモンジュ
ースの試料は褐変の徴候を全く示さなかった。24時間後
では、水およびレモンジュースの対照試料は許容できな
い褐色を呈したが、これとは反対に式Ｖおよび式V/レモ
ンジュースの試料は依然として許容できる黄緑色であっ
た。試料を96時間保管した時点で再評価したところ同じ
結果が得られた。すなわち式Ｖの試料はごくわずか変色
しただけで式V/レモンジュースで処理した試料はほとん
ど変化していながった。水およびレモンジュースによっ
て処理した対照試料は、黒ずんだ褐色に変色した。0.1
％の式Ｖはアボカドの褐変の阻害に有効であり、0.1％
の式Ｖと１％のレモンジュースの組合わせはさらに大き
な効力を有するという結論が得られた。
実施例22 アボカドの褐変の阻害に対する各種の濃度の式Ｖの化合
物の効果 アボカドブレンド物中の式Ｖの化合物の最終濃度を変
えたことを除いて実施例21と同様にして、アボカド試料
と試験溶液を調製し、処理した試料を評価した。式Ｖの
濃度としては0.05％、0.025％、0.005％および0.001％
を採用した。試験試料と対照試料はすべて１％のレモン
ジュースを含有させて製造した。試料はすべてブレンド
した後４℃で保管した。24時間後、対照試料だけが顕著
に褐変した。0.001％と0.005％の式Ｖの試料には、72時
間の冷蔵保管後、わずかに褐変がみとめられたが、対照
試料は濃い褐色であった。0.025％と0.05％の式Ｖの試
料は、依然として許容できる黄緑色であった。96時間後
では、0.025％と0.05％の式Ｖの試料は酵素による褐変
の徴候を引続き全く示さなかったが、低濃度の式Ｖの試
料は顕著に褐変を示し、対照試料は非常に濃い褐色にな
った。0.025％と0.05％の式Ｖは、上記の条件下で少な
くとも96時間はアボカドの褐変を防止入するのに非常に
有効のようであった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イェンガー，ラダ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02178 ベルモント，フレット ロード 43 (72)発明者 グロス，アキヴァ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02167 ニュートン，ヴァイン ストリ ート 78 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A23L 3/3463 - 3/3553 A23B 7/00 A23L 1/272 A23L 2/44 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】食品の褐変を阻害するのに充分な量の４−
    置換レゾルシノール誘導体を食品もしくは飲料に適用す
    ることからなり、該レゾルシノール誘導体が下記の一般
    式を有するものである、褐変し易い食品もしくは飲料の
    酵素による褐変の阻害方法： ここで、R1とR2は独立してＨ、CH2、COR′、CR′、PO
    3R′Ｒ″およびSO3R′Ｒ″からなる群から選択され、但
    しＲ′とＲ″は独立してＨまたは１〜６個の炭素原子を
    有する直鎖状、分岐状もしくは環状形態のアルキル基ま
    たは置換芳香族化合物である；およびR3はレゾルシノー
    ル誘導体が酵素による褐変を阻害するよう選択される。
  2. 【請求項２】R3がヘテロ原子、飽和または不飽和アルキ
    ル基、置換芳香族基またはヘテロ原子を含む有機官能基
    からなる請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】（ａ）R3が酸素、窒素、硫黄、リン、塩
    素、臭素、ヨウ素およびフッ素からなる群より選ばれる
    少なくとも一つのヘテロ原子からなる；または （ｂ）R3が約１〜約30個の炭素原子を有する直鎖状、分
    岐状もしくは環状形態の飽和または不飽和アルキル基で
    ある；または （ｃ）R3がアルキル基、または酸素、窒素、硫黄、リ
    ン、塩素、臭素、ヨウ素およびフッ素からなる群より選
    ばれるヘテロ原子を含む有機官能基である、 請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】R1およびR2がともにＨである請求項１〜３
    いずれか記載の方法。
  5. 【請求項５】食品の褐変を阻害するのに充分な量の４−
    置換レゾルシノール誘導体を食品もしくは飲料に適用す
    ることからなり、該レゾルシノール誘導体が下記の式： を有するものである、褐変し易い食品もしくは飲料の酵
    素による褐変の阻害方法。
  6. 【請求項６】食品の褐変を阻害するのに充分な式IIの化
    合物の量が、約0.0001〜約0.1重量％である請求項５記
    載の方法。
  7. 【請求項７】食品の褐変を阻害するのに充分な量の４−
    置換レゾルシノール誘導体を食品もしくは飲料に適用す
    ることからなり、該レゾルシノール誘導体が下記の一般
    式を有するものである、褐変し易い食品もしくは飲料の
    酵素による褐変の阻害方法： ここで、ｎは１または２であり;R1とR2は独立してＨ、C
    H3、COR′、CR′、PO3R′Ｒ″および SO3R′Ｒ″からなる群から選択され、但しＲ′とＲ″は
    独立してＨ、１〜６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐
    状もしくは環状形態のアルキル基または置換芳香族化合
    物である；およびＺはアルキルまたはレゾルシノール誘
    導体が酵素による褐変を阻害するよう選択される有機官
    能基である。
  8. 【請求項８】ＺがOH、NH2、Ｏ（CH2）xCH3、NHCO2（C
    H2）xCH3、NH（CH2）xCH3、アミノ酸、 NH（CH2）xNH2, NH（CH2）xNH（CH2）yNH2, NH（CH2）xNHR4および NH（CH2）xNH（CH2）yNHR4からなる群より選ばれるポリ
    アミン置換基、ここでｘとｙは独立して０〜５の整数で
    あり、および 少なくとも３つの1,ωジアミノアルカンモノマーで構成
    された高ポリアミンオリゴマーもしくは置換オリゴマー
    からなる群から選択され、R4は下記式： をもつ、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】レゾルシノール誘導体が、下記の式IV、
    Ｖ、VIまたはVII: を有するものである請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】食品または飲料が甲殻類動物、貝類、果
    物、野菜、果物ジュースおよびワインからなる群より選
    ばれる請求項１〜９いずれか記載の方法。
  11. 【請求項１１】酵素がポリフェノールオキシダーゼであ
    る請求項１〜10いずれか記載の方法。
  12. 【請求項１２】褐変を阻害するのに充分なレゾルシノー
    ル誘導体の量が約0.001〜約0.1重量％である請求項７〜
    11いずれか記載の方法。
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