JP3581155B2 - Bioelastomer suitable as food additive - Google Patents

Description

この式中、R₁〜R₅は各々のアミノ酸残基の側基を表す。10原子環は１番目のアミノ酸のカルボニル酸素、４番目のアミノ酸のアミノ水素、および２番目と３番目のアミノ酸の介在骨格原子から成る。示されるようなこのモノマー単位中、鎖の残りの骨格原子（４番目のアミノ酸の残り、５番目のアミノ酸、および次のペンタマー単位の１番目のアミノ酸の最初の部分）は隣のβ−ターンの間にぶら下がっている架橋セグメントを構成する。同様な構造が他の長さのエラストマーペプチド単位の中にも存在する。別のペプチド構造、例えばβ−バレルも、バイオエラスティックポリマーに弾性を付与することができる。生物弾性（bioelasticity）は、ポリマーを伸長した時の鎖の動力学の内部減衰（dampening）を付与する、即ち捩れ角もしくは結合の回りを回転する自由または振動が抑えられる、構造によって付与される。この減衰は延びた状態で得られる自由度を減少させる。
このβ−ターン含有構造は、上記に挙げた先行特許および特許出願明細書中に記載されているので、ここで再び詳細に記載する必要なない。弾性を保存するために介在性のぶら下がった架橋セグメントを有する多数のβ−ターンが保持される限り、反復単位中の様々な位置に存在するアミノ酸に相当な変異が可能である。それらのポリマーを製造する工程により課せられるものを除いて、本発明で使われるポリマーの分子量に上限はないと思われる。約250までのペンタマー単位を含むポリマーが組換えDNA法を使ってE.コリ中で合成されている。典型的なポリマーは少なくとも５、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも20のテトラペプチドまたはペンタペプチドモノマーを含み、そして水性溶剤中での粘度を増加させるという理由で、エアゾール缶からフォームを絞り出すためには普通は1000未満、普通は500未満のそのような単位を含むが、生地製造に使うためには任意の長さのものであることができ、得ることが可能な最大の長さが好ましいだろう。更に、それらのモノマー単位が、他の目的でデザインされたペプチドセグメントを含むより長鎖のポリペプチド全体に散在しているポリペプチドを調製することが可能である。例えば、弾性率を増加させるためにまたは特別な整列を達成するために、架橋のために、硬質セグメントを含めることができる。ポリマーの消化率を改善するために、トリプシン消化のためのリジンもしくはアルギニン部位またはペプシン部位のようなプロテアーゼ開裂部位をポリマーに導入することができる。本発明は、他の分子、例えばタンパク質もしくはペプチド、脂質、炭水化物、または他の有機化合物のセグメントの間に散在されたバイオエラストマー単位を有するポリマーを使用することもできる。
ポリマーに結合させることができる置換基の数および種類に対する上限は、弛緩状態でのβ−らせん構造要素を獲得するために正しく折り畳む／組み立てる弾性ポリマーの能力によって影響される。モノマー残基側鎖位置に関するポリマー中の置換基の位置は、弛緩状態でβ−ターンが形成されないようにする限り、重要でない。様々なペプチドについての好ましい位置は、参考として組み込まれる本発明者の研究室からのこの分野での特許および係属中の特許出願において教示される通りである。
原型のポリ（Val¹−Pro²−Gly³−Val⁴−Gly⁵）〔本明細書中「ポリ（VPGVG）」と呼称する〕およびポリ（Val¹−Pro²−Gly³−Gly⁴）分子並びに無数の類似体を包含するそれらのバイオエラストマー材料は、水と混合すると粘弾性相を形成し、その相は架橋せしめると軟質で、迎合性で、弾性のマトリックスをもたらす。弾性マトリックスを形成させるためのポリマー溶液の架橋は、様々な架橋方法、例えば化学的方法、酵素的方法、放射線照射方法を使って行うことができる。米国特許第4,589,882号明細書（参考として本明細書中に組み込まれる）は、酵素架橋性単位を有するブロックポリマーを合成することによる酵素的架橋を教示している。この特許の教示を組換えバイオエラスティックポリペプチドに応用することができる。米国特許第4,589,882号明細書で合成ポリマーについて記載されているようにリジンとグルタミン酸残基の所要比を有するバイオエラスティックポリペプチドをコードするベクターを作製するのに組換え技術が用いられる。この場合、酵素的架橋方法は本来細胞外の酵素であるリジルオキシダーゼの作用により生体内で進行する。あるいは、生体内での架橋は、グルテニンで結合が起こると思われる次第と同様にしてジスルフィド橋を介して起こることができる。この場合、バイオエラスティックポリペプチドは、互いに鎖間ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含むように工作される。
一般に、特定のモノマー単位中のアミノ酸の配列の選択およびモノマー単位の所要比率の選択は、既知のバイオエラストマーの性質を測定し（または調査し）、類似であるが異なるバイオエラストマーを作製し、そして引用した特許および特許出願に記載されたように転移温度（T_t）を測定することで始まる実験的方法により達成することができる。しかしながら、好ましくは、アミノ酸残基（天然のまたは修飾のいずれか）の相対疎水性の表を利用して実験せずに転移温度を計算する。例えば、Y.Nozaki ＆ C.Tanford,J.Biol.Chem.（1971）246:2211−2217またはH.B.Bull ＆ K.Breese,Archives Biochem.Biophys.（1974）161:665−670、並びに疎水性データの特に有用な編集物についてはD.Urry（1993）Angewandte Chemie Omt.Ed.Engl.32:819を参照のこと。例えば、ポリマーのモノマー単位中の各アミノ酸残基の平均疎水性を合計し、そしてその結果を既知の転移温度を有するポリマーについて得られた合計と比較することにより、またはT_tに基づいた疎水性スケール（1994年１月24日出願の米国特許出願08/187,441号の表１を参照のこと）からの転移温度をそのまま合計し、そしてそれを割り算して平均値を得ることにより、転移温度の概算見積を得ることができる。
１成分だけを変更した一連の関連ポリマーについて転移温度を測定することにより、任意の所定のポリマーについてより正確な値を算定することができる。例えば、大部分VPGVGモノマーを含み可変量のVPGXGモノマー（例えば２％、４％および８％Ｘ、ここでＸはいずれかの選ばれたアミノ酸残基である）を含むポリマーを調製し、そして転移温度について試験することができる。この試験は、単にポリマーを未架橋の形で調製し、ポリマーを溶解し、そして溶液からのポリマーの沈殿を示す「濁り」が現れるまで溶液の温度を上昇させることから成る。転移温度をポリマー中のVPGXGモノマーの比率に対してプロットすると直線が得られ、そしてこのグラフから別の所望の温度に必要なVPGXGモノマーの比率（VPGXGモノマー０％から100％により指摘される限界の範囲内）を直接得ることができる。この技術を上述したような疎水性合計を概算見積できることと組み合わせると、液体の水の領域において任意の所望の転移温度を得ることができる。「Ｘ」の位置は上記記載における一例としてだけ選ばれると理解すべきである;Xは反復単位中のいずれの位置にあってもよく、バイオエラストマーの総合性質が保持される限り複数の位置に存在することができる。エラストマー単位およびそこから得られるポリペプチドを合成する個々のアミノ酸の選択は、その結果得られる構造が例えば米国特許第4,474,851号および同第5,064,430号明細書中に記載された特徴を有するエラストマー形成、特にβ−ターン構造を含んで成る限り、無制限である。こうして、エラストマー単位のアミノ酸配列は、得られる食品に所望の性質を提供するように選択される。
バイオエラストマー反復単位の合成は回りくどくなく、ペプチド化学により容易に達成することができる。合成バイオエラストマーは本発明者の特許および特許出願明細書中に記載された方法により製造しそして架橋せしめることができる。その場合、バイオエラストマーポリペプチドは食品の製造の間に食品前駆物質に添加される。バイオエラストマーポリペプチドは、食品の弾性を増加させるのに十分な量で添加されるだろう。用途に応じて普通は１重量％〜99.5重量％が添加され、生地の製造には約10％、そしてホイップクリームには100％に近い量が添加されるだろう。
タンパク質ベースのポリマーの有機合成に代わる方法は、流行の組換えDNA技術を使った生合成アプローチである。このアプローチを使って、所望のペプチド配列をコードする遺伝子を作製し、そして宿主生物中に人工的に挿入し、次いでその宿主生物がペプチドを生産する。宿主は原核生物、例えば細菌、または真核生物、例えば酵母、植物であることができる。組換えDNAを使って、与えられたペプチド配列の多重反復単位をコードする合成遺伝子を作製することができ、そしてそれらの合成遺伝子を自己重合せしめてもっと長いコード配列を作り、長鎖のタンパク質ベースのポリマーを生成することができる。適当な宿主生物中でのそれらの効率的発現に備えて遺伝情報（即ちDNA配列）を操作するには当業界で公知の分子生物学技術が使われる〔例えば、Sambrook他,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor,New York（1989）;Deguchi他（1993）Mat.Res.Soc.Symp.Proc.,292:205−210;Capello,J.（1992）Review Protein Engineering Biomaterial,Curr.Opin.Struct.Biol.,2:582−586;McPherson他（1992）;Perbal,B.（1988）A Practical Guide to Molecular Cloning,第２版,John Wiley ＆ Sons NY;Ausubel,F.M.（1989）Current Protocols in Molecular Biology,第１＆２巻,John Wiley ＆ Sons NYを参照のこと〕。これを可能にする主な道具は当業界で公知であり、その例としてポリヌクレオチドを開裂、連結、複製および他の方法で修飾する酵素が挙げられる。加えて、発現に適する形でこの情報を宿主生物中に導入できるようにするベクターも当業界で知られている。宿主が微生物である時、生産されたタンパク質は醗酵槽中で増殖させた培養物から大量に精製することができ、合成によって製造されたバイオエラストマーと同様な方法で食品前駆物質に添加することができる。ポリ−VPGVGの生産の具体例は、本発明者らの１人の研究室からの刊行物であるMcPherson他,"Production and Purification of a Recombinant Elastomeric Polypeptide,G−（VPGVG）₁₉−VPGV,form Escherichia coli",Biotechnol.Prog.,1992:347−352、並びに「バイオエラスティックポリペプチドの過剰生産」（"Hyperexpression of Bioelastic Polypeptides"）という発明の名称の米国特許出願および「バイオエラスティックポリマーの単純精製法」（"Simple Method for the Purification of Bioelastic Polymers"）という発明の名称の米国特許出願（共に本出願と同日に出願したもの）中に記載されている。それらは本発明の材料の遺伝子生産および精製のための手引きとして使用することができ、参考として本明細書中に組み込まれる。
ある種の作物は、染色体中へのプラスミド媒介DNA挿入を含む技術により、またはDNAでコーティングされた微小発射体を使った植物細胞系のランダム衝撃により、形質転換可能である。後者の方法はクロロプラスト並びに核ゲノムを形質転換せしめるのに使われている。クロロプラストゲノムの多重コピーが各植物細胞に存在するので、遺伝子増幅およびタンパク質過剰生産のためにクロロプラストをターゲッティングするのに有利である。植物により生産される外来タンパク質は、貯蔵タンパク質または細胞内タンパク質の生産を伴うことがあるが、より最近の研究はトランスジェニックタンパク質の分泌に適当なリーダー配列を使用している。
生産されたポリペプチドは当業界で周知の技術〔例えば、Scopes,R.K.（1987）Protein Purification,Springer Verlag,NY;McPherson他（1992）〕により単離することができ、そして微生物により発現されたタンパク質について上述したのと同様に利用することができる。あるいは、食品に加工するために選択された宿主、例えば小麦、トウモロコシ、オート麦、ライ麦、キビおよび豆類においてポリペプチドを発現させることができる。植物を形質転換させる方法は当業界で周知である〔Shimamoto,K.他（1989）Nature338:274−277;Datta,S.K.他（1990）Bio/Technology 8:736−740;Cristov,P.他（1991）Bio/Technology 9:957−962;Gordon−Kamm,W.J.他（1990）The Plant Cell 2:603−618;Fromm,M.E.他（1990）Bio/Technology 8:833−839;Vasil,V.他（1992）Bio/Technology 10:667−674;Weeks,J.T.他（1993）Plant Physiol.102:1077−1084;Somers,D.A.他（1992）Bio/Technology 10:1589−1594;Bower,R.およびBirch,R.G.（1992）Plant J.2:409−416;Kung,S.およびWu,R.（1993）Transgenic Plants Engineering and Utilization 1:382;Daniell,H.（1993）Methods in Enzymol.217:536−556〕。
人工のタンパク質ベースのポリマー、例えばエラストマーポリ（VPGVG）〔ポリ（GVGVP）、ポリ（GVPGV）または他の順列として等価に表記される〕のバイオ生産には、細菌中で行われるか植物中で行われるかのいずれにせよ、次のことが有利である：（ｉ）選ばれた発現宿主のコドン選択性に適したコドンを使って、ペプチドコード単位の多数の縦列コピーを有する遺伝子を合成すること、（ii）合成遺伝子がベクタープラスミド中に容易にクローニングでき且つ別の発現ベクターにカセットとして伝達可能であるべきであること、（iii）合成遺伝子が発現宿主に適当な転写および翻訳調節シグナルを使って所望のポリペプチド産物に発現されること、好ましくは（iv）ポリペプチドが精製を可能にする形で発現されること、および（ｖ）VPGVG反復配列に対して外来のアミノ酸が回避されるかまたは発現後に除去されること。
簡単に言えば、例えばエラストマーペプチドの10反復単位をコードする遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドを使って作製し、そして発現ベクター中にクローニングする。バイオエラストマーポリペプチドの遺伝子は、追加のオリゴヌクレオチドとPCR（例えば米国特許第4,683,202号明細書）を使って或る追加の反復単位に更に拡張し、10マー遺伝子を重複せしめることができる。この技術は、該単位の各々の縦列付加を挿入するのに、単位遺伝子（この場合は10マー）の３′末端のところの適当な制限酵素認識部位の存在に頼っている。このモジュールアプローチを使って、追加の１単位ごとにサイズを増加させて連続遺伝子を構築することができる。多重反復コピーを有する遺伝子を作製する際の本質的な問題点の１つは、E.コリ中での組換えと欠失の可能性である。反復配列を使った遺伝子作製方法は、適当な宿主株（例えばrecA^-）中で使用した時はポリ（GVPVG）に対して問題とならない。
あるいは、高分子量ポリマータンパク質の作製には「コンカテマー」ルートが可能である。１つは各々がバイオエラストマーペプチド単位をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドモノマーの使用を含み、そのモノマーを粘着末端を通して連結せしめ、ポリペプチドをコードする多重体配列（コンカテマー）を形成せしめる方法である。別のルートは、モジュールアプローチをコンカテマールートと組み合わせて、開裂させると非回文式粘着末端を残す末端制限酵素部位を有する、ペプチド単位の多重反復配列（例えば10マー）をコードする遺伝子を作製するというルートである。それらの遺伝子モノマーを連結せしめて高分子量ポリマーをコードする多量体（マルチマー）を作製することができる。この別法は、モジュールクローニングアプローチよりも容易で且つ迅速に高分子量遺伝子の作製を可能にする。
最も広い面によれば、本発明は、食品の弾性を増加させるのに十分な量で食品または食品前駆物質にバイオエラスティックポリペプチドを組み込むことにより食品のテクスチャーを改良するための食品添加物および方法を提供する。本発明はまた、食品前駆物質を結着せしめるのに十分な量で食品前駆物質にバイオエラスティックポリペプチドを添加することにより、食品を結着せしめる方法も提供する。
本明細書中で使用される食品添加物は、ヒトまたは動物の消費に適当な食用材料、例えば合成または天然のフレーバー、例えばペパーミント、レモンまたはバニラエッセンス、および甘味料、例えばサッカリン、アスパルテームまたは砂糖の任意の含有を伴って、様々な物理形態に成形することができそして食品またはそれらの前駆物質と共に使用することができる。
本発明の方法により食品またはそれの前駆物質の弾性および伸長性を増加させることにより食品のテクスチャーが改良される。例えば、生地製造における小麦の品質は、水と混合して生地を作る時のそれの伸長性と弾性（これらは主にそれのタンパク質によって付与される性質である）に依存する。それらの品質は一般に、製パン性を調べることにより、例えば製パン性の間接尺度としてSDS沈降速度を測定することにより、測定されている〔Moonen他（1982）Enphytica 31:677−690〕。標準ベーキング試験およびミクロベーキング試験は、例えば、Smak,C.（1972）Cer.Chem.49:554−560またはMeppelink（1981）Getreide,Mehl und Brot 35:107−109により記載されたように行われる。あるいは、生地の粘弾性を直接測定することができる。
改良された生地粘性は次いで改良された食品テクスチャーをもたらし、例えば団粒化（crumbling）や崩壊しにくい食品を作る。これは現在のところ一般に高品質の生地に加工することができない製粉、例えばトウモロコシ、コーンおよびオート麦からの製粉に適する。
この場合、バイオエラストマーは、製粉に直接添加することができ、または作物から得られた製粉にそれらの特定性質（即ち、弾性および伸長性）を導入するためにトランスジェニック植物により発現せしめることができる。VPGVGペンタペプチドモチーフまたは例えばVPGVG,IPGVGおよびVPAVGの組合せに基づいた本質的に弾性のサブユニットは、好ましい弾性モジュールを生じることができる。ベーキングがポリマーのT_tよりも高い温度で行われるように反復単位が選ばれるということのみが重要である。
そのようなサブユニットを鎖間ジスルフィト結合によって天然のタンパク質、例えばグルテンに組み込むことは、パン製造および他の用途に最適な増加された弾性および改善された品質をもたらすだろう。
更に、ポリヘキサペプチド単位をバイオエラストマー中に組み込んで弾性高次構造、例えば（ペンタペプチド）_ｎ（ヘキサペプチド）_ｎ（ペンタペプチド）_ｎの構築を提供することができる。例えば、（GVGVP）_ｎ（GVGIP）_ｎ（GFGVGP）_ｎは、チューインガム基剤として用いることができる軟質ポリマーを提供する。反復単位の比は、ガムを更に軟らかくし得る使用するフレーバーにしばしば依存するだろう。しかしながら、その比は本出願の教示に照らして当業者により容易に決定することができる。
バイオエラストマーは本発明者の特許出願および特許明細書の教示に従って結着性を有するように工作することもできる。それらの性質は食品前駆物質を結着せしめるために使われ、その場合、食品前駆物質に対して約１重量％から99.5重量％のバイオエラストマーが存在し、好ましくは約10重量％〜90重量％、より好ましくは約30重量％〜70重量％存在する。
実施例
実施例１
バイオエラスティックポリマーをコードする遺伝子構成 物の発現
図１に描写される配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使って（GVGVP）₁₂₀を作製した。該オリゴヌクレオチドを、BamH1（G'GATCC）およびPflM 1（CCAGGCGTTGG）制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む配列により隣接させた。この核酸をプラスミドpUC118中に挿入し、そしてE.コリを形質転換せしめるのに使った。増幅させたプラスミドを単離した後、遺伝子挿入断片の配列をDNA配列分析〔Sambrook他,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor,New York（1989）〕により確認した。
次いでこの10マー遺伝子を、高分子量の（GVGVP）_ｎをコードする長鎖遺伝子を作製するためのモジュール単位として使用した。10マー遺伝子を含むプラスミドを調製し、PflM 1で消化した。次いでPflM 1（GVGVP）₁₀遺伝子断片を精製し、〔（GVGVP）₁₀〕_ｎのポリマーを作製するためのその後の連結反応において使用した。また、連鎖した遺伝子断片のその後のクローニングを可能にするために、ユニーク制限部位を有する別個のアダプターオリゴヌクレオチドをこの連結反応に加えた。それらのアダプターオリゴヌクレオチドは高分子量「コンカテマー」の回収に好ましいだろう比率で添加した。この工程は図1Bに概略的に表される。
個々の長さのコンカテマー遺伝子の回収およびクローニングのために、連結混合物をBamH1で消化し、次いでアガローススラブゲルを通して電気泳動して様々な分子量サイズを分画した。次いで様々なサイズ範囲に相当する切片をゲルから切り取り、DNAを回収し、そしてプラスミドpUC118中にクローニングした〔Urry他，“Elastic and Protein−based Polymers:Potential for Industrial Uses"（Am.Chem.Soc.）Div.Polym.Mat.,Sci.＆ Engr.,“Industrial Biotechnological Polymers,"Washington,D.C.,1994〕。このプラスミド中の遺伝子挿入断片を制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、コンカテマー「はしご（ladder）」に隣接したアガロースゲル電気泳動により正確にサイズ分画した。生来のタンパク質ベースのポリマーをE.コリ中で発現させるために、（GVGVP）₁₂₀をコードするコンカテマー遺伝子を、６連ヒスチジンをコードする配列の後ろの遺伝子融合体としてpUC118から発現ベクターpQE−32（Quiagen,Inc.）中にサブクローニングした。このプラスミドを使った発現は、アミノ末端ポリヒスチジン融合を有するタンパク質、具体的にはMRGSH₆GIQTM−（GVGVP）_ｎの生産をもたらした。この融合成分は、金属キレートクロマトグラフィーによりタンパク質をアフィニティー精製する能力を与える。数種類の異なるサイズのコンカテマー遺伝子をpQE−32ベクター中にサブクローニングしそしてE.コリ中で発現させた。生産されたポリ（GVGVP）ポリマーを細菌細胞からアフィニティー精製し、そして逆相クロマトグラフィーにより分離されたアミノ酸のフェニルイソチオシアネート（PITC）誘導体のアミノ酸分析により、ポリ（GVGVP）に期待される比で必要なグリシン、バリンおよびプロリンを有することが証明された。このことにより、高分子量のタンパク質ベースのポリマー、例えば（GVGVP）₂₅₀をコードする遺伝子を作製することができ、そしてE.コリ宿主生物中で効率的に発現せしめることができることが確立された。遺伝子融合および精製アプローチを使って、組換えタンパク質を高純度に精製しそしてそれが所望の生成物であることを証明することも可能であった。
発現産物の精製
アフィニティー精製したMRGSH₆GIQTM−（GVGVP）_ｎを使って、温度を上昇または低下せしめることにりタンパク質ベースのポリマーが可逆的に沈殿する（すなわちコアセルベートとなる）ことが示された。この溶液からの出入りは、液体が濁り次いで透明になるのを観察することにより目視で決定することができる。
この性質を使って、（GVGVP）_ｎ（ここでｎ＝40,140および250）を含んで成るヒスチジン融合タンパク質を精製した。まず、タンパク質ベースのポリマーを含むE.コリ細胞の冷却（氷上）懸濁液を音波破壊により溶解せしめ、細胞成分を分散させた。低い温度では、ポリ（GVGVP）は広がった可溶性状態のままであり、不溶性細胞破片を遠心により除去することができる。まだ冷却したままで、細胞溶解物を高速遠心して不溶性細胞破片を除去した。次いで回収した上澄み液を37℃に温め、タンパク質ベースのポリマーから目に見える凝集物を形成させ、その時点でそれを遠心分離により可溶性画分から分離した。37℃のそれの転移温度より上に加熱すると、ポリ（GVGVP）種は、残りの溶質からの遠心による選択的除去を考慮に入れた新たな相を形成する。この操作をもう１回洗浄として繰り返すと、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した時にアフィニティー精製材料と同じくらい純粋である生成物をもたらした。こうして、細菌エンドトキシンが90％以上取り除かれた。
実施例２
E.コリ中での未変性ポリ（GVGVP） ₁₂₀ の発現および精製
E.コリ中での未変性のタンパク質ベースのポリマーの発現を達成するために、（GVGVP）₁₂₀をコードするコンカテマー遺伝子を実施例１に記載したpUC118からNco1−BamH1断片として発現ベクターpET−11d（Novagen,Inc.）中にサブクローニングした。前に記載されたアミノ末端親和性成分なしでもこのプラスミドから高レベルでタンパク質が発現された。そのタンパク質も同様に温度誘発凝集方法を使って実施例１に記載した通りに効率的に精製された。
実施例３
タバコクロロプラスト中でのタンパク質ベースの弾性ポ リマー、ポリ（GVGVP）の発現
150の縦列ペンタペプチド単位の範囲のポリ（GVGVP）タンパク質をコードする遺伝子を、10反復単位のGVGVPをコードする合成オリゴヌクレオチドとPCRを使ってタバコ系での発現用に作製する。図２は、最大のコード縮重を維持しながらタバコに最適なコドンを含んで成る遺伝子の配列を示す。該遺伝子は、各々が該遺伝子の半分を少し超えたものを表す２つのオリゴヌクレオチドを使って作製する。それらのオリゴヌクレオチドは相補的な25塩基の重複を有し（図面中の点線の下線）、それをPCR反応により伸長して全長二本鎖配列を形成する。配列の確認と連続した維持のために、PCR生成物をBamH1で消化し、プラスミドpUC119中に挿入した。PflM 1を使ってpUC119から断片を切除し、所望のサイズ範囲で多量化を終わらせるためにアダプター断片を含めて自己連結せしめてコンカテマーを形成させる。
Daniell〔Methods Enzymol.217（1993）536−556〕により本質的に記載された通りに、培養したタバコ細胞のクロロプラスト中にGene Gunを使って合成遺伝子を導入する。³⁵S−メチオニンの存在下でMS塩類培地中で形質転換細胞を連続培養した後、ミニビーズビーダー〔Daniell他（1993）Nucleic Acids Res.21:1503−1504〕を使ってクロロプラストを単離する。高張緩衝液中でクロロプラストを破裂させることにより、可溶性クロロプラストタンパク質を得る。本質的に実施例１に記載されたのと同様にしてバイオエラストマーを精製する。
実施例４
タバコからのタンパク質ベース可塑性ポリマー、ポリ （AVGVP）の発現
タバコ中での発現用の150反復単位の範囲のポリ（AVGVP）をコードする遺伝子の作製には、異なるアプローチを使用する。詳細には、各々が（AVGVP）モノマーをコードする二本鎖単位の一方の鎖を表し、タバコに適したコドン選択を有する２つの15塩基縮重オリゴヌクレオチド、5'−CCNGCNGTNGGNGTN−3'と5'−CNGGNACNCCNACNG−3'を合成する（ここでＮ＝G,A,TまたはＣ）。この２つの鎖は、それらがアニールすると相補的である４〜５塩基の重複末端を残し、５′末端と３′末端との連結を可能にするように、オフセットである。（GVGVP）₁₀遺伝子について上述したように、アニールしたオリゴヌクレオチド、またはカテマーをそれらの相補的末端を通して連結せしめ、長鎖多量体、即ちコンカテマーを形成せしめる。バイオエラストマーポリペプチドの発現および精製は上記と本質的に同様であるが、ただしポリ（AVGVP）の転移温度を使用する。
実施例５
安定なクロロプラストまたは核形質転換後のポリ（VPGV G）の発現
プラスミドpHD203−GUS−EPSPS（EN/polyA）（図３参照）は、aroA遺伝子（グリフォセートに対する耐性を付与するEPSPシンターゼをコードする）を指令し且つ転写物を安定化するためのポリＡ断片により３′末端が隣接されたCaMVの35Sプロモーター／エンハンサー要素を含有する。gstコード配列と融合せしめたＧ−（VPGVG）₁₉−VPGV（20マー）コード配列を、アダプターを使うことによってまたはE.コリDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を使って凹んだ３′末端をフィルインすることにより、pHD203−GUS−EPSPS−（EN/polyA）中のBgl II部位のところに挿入する。gst−EG20マーコード配列を含むEPSPSベクターをタバコ培養細胞中に衝撃し、そしてそれらをグリフォセートの存在下で増殖させることにより、安定な発現が達成される。コード配列は、高頻度の形質転換を達成するためにタバコクロロプラストゲノムのrbcLとORF 52の間の領域に挿入される〔SvabおよびMaliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913−917〕。
クロロプラストの内側でポリマーを発現するトランスジェニックタバコ植物は、無菌増殖させた植物からの葉をクロロプラストベクターで射撃することにより得られる。タバコクロロプラストトランスジェニック植物の選択および再生のための最適条件は当業界で周知である〔Svab他（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8526−8530;StaubおよびMaliga（1992）The Plant Cell 4:39−45;StaubおよびMaliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913−917〕。
クロロプラスト形質転換の分子および生化学分析
当業界で既知の方法によりトランスジェニック植物からクロロプラストDNAを単離する。制限酵素消化したctDNA調製物の臭化エチジウム染色ゲルを調べて、追加のctDNA断片を検出する。タバコctゲノム中へのクロロプラストベクターからのEPSPS/gst−EG20マー断片の挿入は、トランスジェニック植物のctゲノム中への追加の制限部位を導入する。ctDNAを制限酵素で消化し、アガロースゲル上での電気泳動により分離し、そしてナイロン膜上にブロットする。EPSPSまたはgstまたはポリマーコード配列を含む断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用する。全てのトランスジェニック系を、タバコクロロプラストゲノム中のEPSPS−gst−ポリマーコード配列の存在について試験する。実施例３に記載した通りにクロロプラスと抽出物を調製し、タンパク質を精製する。
実施例６
トランスジェニックタバコ中でのタンパク質ベースのポ リマーの安定核内発現
合成gst−Ｇ−（VPGVG）₁₉−VPGV遺伝子カセット（Mc Pherson他）を次のようにしてpKYLXベクター〔Schardl他（1987）Gene 61:1−11〕中に挿入する。該カセットを含むMae I/EcoR1断片を変更して、５′末端へのXho1/Nco1アダプター（5'−TCGAGCCATGG−3'/3'−CGGTACC−5'）の付加によって新規ATGコドンを組み込み、そしてXho1/EcoR1断片としてpKLYX7.1中に移す。Xba1部位がEcoR1部位で置き換えられている、pKYLX7.1〔Daniell他（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:248−255〕の誘導体であるpKLYX7.2を、合成gst−Ｇ−（VPGVG）₁₉−VPGVカセットを収容するために使用する。
若い完全に開いたタバコの本葉〔ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）cv KY 14〕を８週齢植物から採集し、表面を10％クロロックス（chlorox）で10分間、次いで70％％アルコールで３分間滅菌し、そして無菌蒸留水で３回洗浄する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）が媒介する葉面形質転換および茎再生は、Horsch他（1985）Science 227:1229−1231により記載された通りに実施する。簡単に言えば、Svab他〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1990）87:8526−8530〕により記載された通りに、300mg/lのカナマイシンと500mg/lのメフォキシンを含有するMS培地上で推定上の形質転換体を選択する。カナマイシン耐性の茎を発根培地に移す。約50のカナマイシン耐性小植物を分析用に選択する。対照植物はpKYLX7.2のみを用いて形質転換させる。
推定上の形質転換体をサザンハイブリダイゼーションにより確認し、そしてNPT IIホスホトランスフェラーゼ活性並びにgst−Ｇ−（VPGVG）₁₉−VPGVタンパク質（McPherson他）生産についてアッセイする。選択した個々の形質転換体を、野外実験で使用する予定の種子の最初の祖先として使われる同型接合個体の作製のために選択する。約１エーカー（約4047平方メートル）に各タイプのトランスジェニックタバコを栽培する。ベクターのみで形質転換した植物と未形質転換植物を栽培した小試験区は、成長の比較対照としてまたは他の評価対照として役立つ。苗を温室で繁殖させ、検査区に移植物を植えた。実施例１に記載した通りに細胞抽出物を調製し（Scopes他）、ポリマーを精製する。
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたのと同じ程度に参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明を十分記載してきたが、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく多くの変更および修正を行い得ることは当業者にとって明白であろう。 Introduction
Technical field
The present invention relates to substances suitable for improving the texture of food products.
background
Flour prepared from wheat always has a special place in baking and cooking. Fine flour breads and cakes can be made from flour, but not from crushed preparations of other grains (often called other names, such as cornmeal). Protein elasticity is important in determining the functionality of flour and dough. The proteins involved are the major storage proteins, for example glutenin, which make up about 10% of the dry weight of the grain and form a continuous network called gluten when moistening and kneading flour to give dough. This network confines the carbon dioxide produced by the yeast during the fermentation of the dough, causing the dough to swell and form a light, porous, aggregated structure. Thus, fermented bread is, in essence, a protein foam that supports the other flour components, the most important of which is starch.
The ability of wheat gluten protein to trap carbon dioxide and form a foam depends on a combination of two physical properties: elasticity and extensibility. When bread dough is insufficiently elastic (weak and too low elastic modulus) or too elastic (strong and too high elastic modulus), poor quality bread may result, and the proper Balance is important. Gluten elasticity is also important for other wheat applications, including noodle and pasta production.
Wheat gluten is a complex mixture of more than 50 individual proteins that fall into two groups that are present in approximately equal amounts. Gliadin is a monomeric protein that interacts with strong non-covalent forces (mainly hydrogen bonds and hydrophobic interactions) and contributes to gluten elongation. In contrast, glutenin has a high M content stabilized by interchain disulfide bonds._r(About 1-10 × 10⁶ Da) Consists of polymer-forming subunits. These polymers appear to be the major determinants of gluten elasticity, but the exact molecular basis for this is not known. However, two features that may be relevant are the number and distribution of disulfide bonds and the presence of a β-helix-like structure within one group of glutenin subunits.
These proteins are called the high molecular weight (HMW) subunits of glutenin and have been studied in some detail because allelic variations in their composition are associated with differences in the breadmaking properties of wheat [Shewry et al. (1992) ) J. Cereal Sci. 15: 105-120]. Individual proteins range in length from 627 to 827 residues (M_rDiffer from about 67,500 to 88,100) and consist of a non-repetitive N-terminal (84-104 residues) and a central repeat region flanked by C-terminal (42 residues) regions. Repeat regions consist of tandem interspersed repetitive sequences based on nonapeptides (common GYYPTSP or LQQ), hexapeptide (PGQGQQ) and tripeptide (GQQ) motifs, forming a β-helical structure based on repeated β-turns. (Miles et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 68-71). Their helical structure has been proposed to be inherently elastic (by analogy with elastin) [Tatham et al. (1985) Cer. Chem. 62: 405-412; Tatham et al. (1984) FEBS Lett. 177: 205. However, the mechanism is distinctly different [Belton et al. (1994) J. Cereal Sci. 19: 115-121]. The non-repeating N-terminal and C-terminal regions are globular and appear to form crosslinks via disulfide bonds.
Elastin is composed of a single protein that contains a continuous alignment of high alanine, lysine-containing cross-linking sequences alternating with high glycine hydrophobic sequences. Of the known full-length bovine sequences, the most prominent hydrophobic sequences, both in terms of length and composition, are those containing polypentapeptide (PPP) and those containing polyhexapeptide (PHP). Elastin also contains several tetrapeptide (TP) units. As a result of a study performed by one of the inventors, when cross-linked, the polypentapeptide of elastin was found to be elastic, and its polyhexapeptide was found to be inelastic, and the elastic expression It appears to provide a means for aligning and interlocking the strands between. Both elastin polypentapeptide and polytetrapeptide are conformation-dependent elastomers that, when subjected to inverse temperature transition, have entropic elasticity and strength to form a dynamic structure containing regular β-turns Was also found.
More importantly, certain lengths of cross-linked PPP, PTP and its analogs exhibit elastomeric forces at different temperatures ranging up to about 75 ° C., depending on several controllable variables. It is to show. Furthermore, these crosslinked elastomers exhibit near maximum elastic activity over a relatively narrow temperature range. Thus, by synthesizing bioelastomer materials having such units modified with hexameric repeating units with varying molar amounts of the constituent pentamers and tetramers, and by choosing a particular solvent that supports the initial viscoelastic phase, It is possible to strictly control the temperature at which the obtained bioelastomer exhibits elastic activity.
In general, the step of raising the temperature to produce the elastic state is an inverse temperature transition, which, unlike typical rubbers, results in a regular, non-random structure using hydrophobic intramolecular interactions as a characteristic component. This regular structure provides water with β-turns as spacers between the turns of the helix, providing a hydrophobic bond between the turns of the helix, and having a peptide segment hanging between the β-turns. It has been proposed that β-helix is a loose helical structure that includes: The elastic activity of these various bioelastomers develops as their regular structure develops. In addition, loss of the regular structure due to high temperature denaturation results in reduced elastic activity. By choosing different amino acids for different positions of the monomer units, and by changing the cross-linking methods used to make the final product (eg, chemical, photochemical, enzymatic, irradiation methods), The polymers can be prepared with different moisture compositions, a wide range of hydrophobicities, in almost any desired morphology and porosity, and with variable degrees of crosslinking.
These bioelastomer polypeptides are a relatively new discovery arising from one of the inventors' laboratories and have been disclosed in a series of prior patents and patent applications. For example, U.S. Pat. No. 4,474,851 describes a number of tetrapeptide and pentapeptide repeat units that can be used to make bioelastic polymers. Specific bioelastic polymers are also described in U.S. Patent Nos. 4,132,746, 4,187,852, 4,589,882, and 4,870,055. U.S. Pat. No. 5,064,430 discloses a polynonapeptide bioelastomer. Bioelastic polymers have also been disclosed in related patents directed to polymers containing peptide repeat units that are prepared for other purposes but may also include bioelastic polymers in the final polymer. U.S. Pat. Nos. 4,605,413, 4,976,734 and 4,693,718; U.S. Pat. No. 4,898,926 entitled "Bioelastomer Containing Tetra / Pentapeptide Units"; "Elastin U.S. Pat. No. 4,783,523 entitled "Temperature Correlated Force and Structure Development of Elastin Polytetrapeptide"; "For the interconversion of chemical and mechanical work" U.S. Pat. No. 5,032,271 entitled "Reversible Mechanochemical Engines Comprised of Bioelastomers Capable of Modulable Temperature Transitions for the Interconversion of Chemical and Mechanical Work" Nos. 5,085,055 and 5,255,518; "Polype U.S. Patent No. 4,500,700 entitled "Elastomeric Composite Material Comprising a Polypeptide"; and U.S. Patent No. 5,250,516. Numerous other bioelastic materials and methods of their use are described in pending U.S. patent applications, including "Elastomeric polytetrafluoroethylene suitable for preventing the adhesion of biological materials. U.S. Application No. 184,873 filed on April 22, 1988, entitled "Elastomeric Polytetrapeptide Matrices Suitable for Preventing Adhesion of Biological Materials" (U.S. Application No. 07 / 962,608, filed October 16, 1992) No. 08 / 187,441, filed Jan. 24, 1994; and US Ser. No. 08 / 246,874, filed May 20, 1994. Since those patents and patent applications describe the bioelastomers and / or their components and their preparation in detail, they are all incorporated herein by reference. This information can be used in the preparation and use of the compositions of the invention and in the methods of the invention.
Wheat varieties are screened for properties that are favorable for food processing (cereal protein is primarily a storage protein stored for germination), but they have elasticity, which makes them ideal for making bread, noodles, and cakes. Properties such as extensibility were not sorted during evolution. Recent developments in the routine transformation of wheat [Vasil et al. (1992) Bio / Technology 10: 667-675; Weeks et al. (1993) Plant Physiology 102: 1077-1084] consider the manipulation of wheat proteins by genetic engineering. Put in. Milling doughs, especially those made from other economically valuable cereals that are less commonly used, such as corn, oats, rye and millet, to improve the texture of breads, cakes and other spices made from crops There remains a need to improve milling quality.
Related literature
Belton, P.S., et al., (1994)¹H and^TwoH NMR relaxation studies indicate that the elasticity of the HMW subunits of glutenin is not elastin-like.J. Cereal Sci. 19: 115-121.
Miles, M.J., et al., (1991) Scanning tunnelling microscopy of a wheat gluten protein reveals details of a spiral supersecondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 68-71.
Moonen, J.E., et al., (1982) Use of the SDS-sedimentation test and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for screening breeder's samples of wheat for bread-making quality.Euphytica 31: 677-690.
Payne, P.I. (1987) Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread-making quality.Plant Physiol. 38: 141-153.
Payne, PI, et al., (1981) Correlations between the inheritance of certain high-molecular weight subunits of glutenin and bread-making quality in progenies of six crosses of bread wheat.J.Sci.Food Agric. 32: 51-60 .
Pomeranz, Y and Willams. P.C. (1990) Advances in Cereal Science and Technology, 10: 492-501, Eds Pomeranz, Y., American Association of Cereal Chemists Inc., St. Paul, MN.
Shewry, P.R., et al., (1992) The high molecular weight subunits of wheat glutenin. (Critical Review Article) J. Cereal Sci. 15: 105-120.
Tatham, A.S., et al., (1985) The β-turn conformation in wheat gluten proteins: relation to gluten elasticity.Cer. Chem. 62: 405-412.
Tatham, A.S., et al., (1984) Wheat gluten elasticity: a similar molecular basis to elastin? FEBS Lett. 177: 205-208.
Vasil, V., et al., (1992) Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Bio / Technology 10: 667-675.
Weeks, J.T., et al., (1993) Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat.Plant Physiology 102: 1077-1084.
Summary of the Invention
The present invention provides a method of improving food texture by incorporating a bioelastic polymer in the food or in a precursor of the food in an amount sufficient to increase the elasticity of the food.
The present invention provides a method for binding a food precursor by adding a bioelastomer polymer to the food precursor in an amount sufficient to bind the food precursor.
The present invention also provides a formulation comprising a bioelastic polymer comprising a tetrapeptide or pentapeptide repeat unit or a mixture thereof, and an edible material suitable for human or animal consumption. The formulation can be modified in structure to provide a variety of different properties and is available in a variety of physical forms such as sheets, gels, foams or powders, thus making it a considerable potential for use in the food industry Has the property.
[Brief description of the drawings]
The present invention may be better understood with reference to the following detailed description of specific embodiments, together with the drawings, which form a part of this specification.
Figure 1 is (GVGVP)_n1 is a schematic diagram of the gene cloning step.
A. 1. Has an adjacent outer BamH1 and inner PflM1 restriction endonuclease recognition site (GVGVP)_TenFor synthetic genes. The gene and plasmid pUC118 were each cleaved with BamH1 and mixed with ligase to recircularize the plasmid into which the gene was inserted. The plasmid containing the cloned gene was amplified in E. coli. 2. Cleavage of large-scale plasmid preparation with PflMI and free (GVGVP)_TenThe fragment was purified. 3. The purified PflM1 fragment was self-ligated to prepare a concatemer gene. 4. Add the adapter oligonucleotide to the ligation reaction and add (GVGVP)_TenTerminal sequences were provided which contained the necessary restriction sites for cloning the gene in various expression plasmids. Genes are referred to in multiples of 10, but eventually because the adapter oligonucleotide provides additional pentameric sequences [(10)_n] +1.
B. Illustration of the process described in A.
Figure 2 shows the tobacco (GVGVP)_Ten1 shows the sequence of a gene.
FIG. 3 is a schematic diagram of the plasmid pHD203-GUS-EPSPS (EN / polyA).
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Incorporating protein-based elastic polymers into foods or food precursors to provide the desired properties of texture and consistency, or to deprive and replace undesirable properties such as fat, calories, etc. Can be. Protein-based elastic polymers are not only edible, but can also be made with a variety of different physical forms. For example, they can be squeezed out of aerosol cans as foams, which have the potential to replace whipped cream or are used to make meringues. As they can be utilized, for example, in pasty layers and coatings, they can be flavored as gels, foams, malleable materials, such as gums, sheets and viscoelastic substrates, just as they can be doped with drugs. (See U.S. Patent Application No. 07 / 962,608, filed October 16, 1992, which is incorporated herein by reference). The adhesive properties of protein-based elastic polymers can be exploited so that the polymer acts as a binder to adhere other processed crops.
Now that the availability of these protein-based elastomeric polymers in food is clear, expansion to countless applications is not hard to imagine. The use of the present invention is environmentally friendly in terms of production and disposal, and also in terms of nutrition, which is a protein instead of fat. In addition, the sufficiently low cost of bioproduction of protein-based elastic polymers makes the consumables especially consumable when used in combination with economically effective crops that would otherwise give products with less desirable properties. Provide inexpensive resources for
Bioelastic polypeptides have been previously characterized and have been described in numerous patents and patent applications mentioned above. These materials contain either tetrapeptide, pentapeptide or nonapeptide monomers that individually act as elastomeric units within the total polypeptide containing monomeric units. The elasticity of this monomeric unit is determined by the series of βs in the protein secondary structure (ie, the conformation of its peptide chain) separated by dynamic (as opposed to rigid) bridging segments that hang during the β-turn. -Probably due to the presence of the turn. The β-turn is characterized by a hydrogen bonded 10 atom ring of the formula:

Where R₁~ R_FiveRepresents a side group of each amino acid residue. The 10-atom ring consists of the carbonyl oxygen of the first amino acid, the amino hydrogen of the fourth amino acid, and the intervening skeletal atoms of the second and third amino acids. In this monomer unit as shown, the remaining skeletal atoms of the chain (the rest of the fourth amino acid, the fifth amino acid, and the first part of the first amino acid of the next pentamer unit) are It constitutes a bridging segment hanging between. Similar structures exist in elastomer peptide units of other lengths. Other peptide structures, such as β-barrels, can also impart elasticity to the bioelastic polymer. Bioelasticity is imparted by a structure that imparts an internal damping of the dynamics of the chain when the polymer is stretched, i.e., is free from or twists around a torsion angle or bond. This damping reduces the degree of freedom obtained in the extended state.
This β-turn containing structure has been described in the above-listed prior patents and patent applications and need not be described again in detail here. Significant mutations are possible in amino acids present at various positions in the repeat unit, as long as multiple β-turns with intervening hanging bridging segments to preserve elasticity are retained. It is believed that there is no upper limit on the molecular weight of the polymers used in the present invention, except as imposed by the process of making those polymers. Polymers containing up to about 250 pentameric units have been synthesized in E. coli using recombinant DNA methods. A typical polymer comprises at least 5, preferably at least 10, and more preferably at least 20, tetrapeptide or pentapeptide monomers, and for squeezing foam from an aerosol can because of increasing viscosity in aqueous solvents. Contains usually less than 1000, usually less than 500 such units, but can be of any length for use in fabric production, with the largest possible length being preferred Would. In addition, it is possible to prepare polypeptides whose monomeric units are interspersed throughout a longer polypeptide, including peptide segments designed for other purposes. For example, hard segments can be included for cross-linking to increase modulus or achieve special alignment. To improve the digestibility of the polymer, a protease cleavage site such as a lysine or arginine site or a pepsin site for trypsin digestion can be introduced into the polymer. The invention can also use polymers having bioelastomer units interspersed between segments of other molecules, such as proteins or peptides, lipids, carbohydrates, or other organic compounds.
The upper limit on the number and type of substituents that can be attached to the polymer is affected by the ability of the resilient polymer to properly fold / assemble to obtain a β-helical structural element in the relaxed state. The position of the substituents in the polymer with respect to the monomer residue side chain position is not critical as long as the β-turn is not formed in a relaxed state. Preferred locations for the various peptides are as taught in patents in this field and pending patent applications from our laboratory which are incorporated by reference.
Prototype Poly (Val¹−Pro^Two−Gly^Three−Val^Four−Gly^Five) [Herein referred to as "poly (VPGVG)"] and poly (Val¹−Pro^Two−Gly^Three−Gly^Four2.) Those bioelastomeric materials, including molecules as well as myriad analogs, form a viscoelastic phase upon mixing with water, which when crosslinked results in a soft, compliant, elastic matrix. Crosslinking of the polymer solution to form the elastic matrix can be performed using various crosslinking methods, for example, chemical methods, enzymatic methods, and irradiation methods. U.S. Pat. No. 4,589,882, which is incorporated herein by reference, teaches enzymatic cross-linking by synthesizing a block polymer having enzymatic cross-linkable units. The teachings of this patent can be applied to recombinant bioelastic polypeptides. Recombinant technology is used to create vectors encoding bioelastic polypeptides having the required ratio of lysine to glutamic acid residues as described for synthetic polymers in US Patent No. 4,589,882. In this case, the enzymatic crosslinking method proceeds in vivo by the action of lysyl oxidase, which is an extracellular enzyme. Alternatively, cross-linking in vivo can occur via a disulfide bridge in the same way that glutenin is believed to occur. In this case, the bioelastic polypeptide is engineered to include cysteine residues that can form interchain disulfide bonds with each other.
In general, the choice of the sequence of amino acids in a particular monomer unit and the selection of the required ratio of monomer units measures (or investigates) the properties of a known bioelastomer, creates similar but different bioelastomers, and As described in the cited patents and patent applications, the transition temperature (T_t) Can be achieved by experimental methods starting with measuring Preferably, however, the transition temperature is calculated without experiment using a table of the relative hydrophobicity of the amino acid residues (either natural or modified). For example, Y. Nozaki & C. Tanford, J. Biol. Chem. (1971) 246: 2211-2217 or HB Bull & K. Breese, Archives Biochem. Biophys. (1974) 161: 665-670, and hydrophobicity data. See D. Urry (1993) Angewandte Chemie Omt. Ed. Engl. For example, by summing the average hydrophobicity of each amino acid residue in the monomer units of the polymer and comparing the result to the sum obtained for a polymer having a known transition temperature, or_tThe transition temperature from a hydrophobicity scale based on the following (see Table 1 of US patent application Ser. No. 08 / 187,441, filed Jan. 24, 1994), and divide it to obtain an average value. Gives an approximate estimate of the transition temperature.
By measuring the transition temperature for a series of related polymers with only one component changed, a more accurate value can be calculated for any given polymer. For example, a polymer is prepared that contains a variable amount of VPGXG monomer (eg, 2%, 4%, and 8% X, where X is any selected amino acid residue), including the majority of the VPGVG monomer, and Can be tested for temperature. This test consists simply in preparing the polymer in an uncrosslinked form, dissolving the polymer, and increasing the temperature of the solution until "turbidity" appears, indicating precipitation of the polymer from the solution. When the transition temperature is plotted against the percentage of VPGXG monomer in the polymer, a straight line is obtained, and from this graph the percentage of VPGXG monomer required for another desired temperature (the limit pointed out by 0-100% VPGXG monomer). Within the range) can be obtained directly. When this technique is combined with the ability to estimate the total hydrophobicity as described above, any desired transition temperature in the region of liquid water can be obtained. It is to be understood that the position of "X" is chosen only as an example in the above description; X may be in any position in the repeating unit and may be in multiple positions as long as the overall properties of the bioelastomer are retained. Can exist. The choice of the elastomer units and the individual amino acids from which the resulting polypeptide is synthesized depends on the formation of the elastomer, especially the resulting structure having the characteristics described in U.S. Patent Nos. 4,474,851 and 5,064,430. It is unlimited as long as it comprises a β-turn structure. Thus, the amino acid sequence of the elastomeric unit is selected to provide the desired properties to the resulting food.
The synthesis of bioelastomer repeat units is not roundabout and can be easily achieved by peptide chemistry. Synthetic bioelastomers can be prepared and crosslinked by the methods described in our patents and patent applications. In that case, the bioelastomer polypeptide is added to the food precursor during the production of the food. The bioelastomer polypeptide will be added in an amount sufficient to increase the elasticity of the food. Depending on the application, typically 1% to 99.5% by weight will be added, about 10% for dough production and close to 100% for whipped cream.
An alternative to organic synthesis of protein-based polymers is a biosynthetic approach using prevalent recombinant DNA technology. Using this approach, a gene encoding the desired peptide sequence is created and artificially inserted into a host organism, which then produces the peptide. The host can be a prokaryote, such as a bacterium, or a eukaryote, such as a yeast, a plant. Recombinant DNA can be used to create synthetic genes that encode multiple repetitive units of a given peptide sequence, and then self-polymerize those synthetic genes to produce longer coding sequences that can be used to produce long, protein-based proteins. Can be produced. Manipulation of genetic information (ie, DNA sequences) for their efficient expression in a suitable host organism employs molecular biology techniques known in the art [eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory. Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York (1989); Deguchi et al. (1993) Mat. Res. Soc. Symp. Proc., 292: 205-210; Capello, J. (1992) Review Protein Engineering Biomaterial, Curr. Opin. Struct. Biol., 2: 582-586; McPherson et al. (1992); Perbal, B. (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons NY; Ausubel, FM (1989). ) See Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 & 2, John Wiley & Sons NY]. The main tools that make this possible are known in the art, and include enzymes that cleave, ligate, replicate and otherwise modify polynucleotides. In addition, vectors that allow this information to be introduced into a host organism in a form suitable for expression are known in the art. When the host is a microorganism, the protein produced can be purified in large amounts from cultures grown in fermenters and added to food precursors in a manner similar to synthetically produced bioelastomers. it can. A specific example of the production of poly-VPGVG is described in McPherson et al., "Production and Purification of a Recombinant Elastomeric Polypeptide, G- (VPGVG), a publication from one of the inventors' laboratories.₁₉-VPGV, form Escherichia coli ", Biotechnol. Prog., 1992: 347-352, and a U.S. patent application entitled" Hyperexpression of Bioelastic Polypeptides "and It is described in a U.S. patent application entitled "Simple Method for the Purification of Bioelastic Polymers" (both filed on the same date as the present application). They can be used as a guide for the gene production and purification of the material of the present invention and are incorporated herein by reference.
Certain crops can be transformed by techniques involving plasmid-mediated DNA insertion into the chromosome, or by random bombardment of plant cell lines with DNA-coated microprojectiles. The latter method has been used to transform chloroplasts as well as nuclear genomes. Since multiple copies of the chloroplast genome are present in each plant cell, it is advantageous to target chloroplasts for gene amplification and protein overproduction. Although foreign proteins produced by plants may involve the production of storage or intracellular proteins, more recent studies have used appropriate leader sequences for secretion of transgenic proteins.
The polypeptide produced can be isolated by techniques well known in the art [eg, Scopes, RK (1987) Protein Purification, Springer Verlag, NY; McPherson et al. (1992)], and the protein expressed by the microorganism. Can be used in the same manner as described above. Alternatively, the polypeptide can be expressed in a host selected for processing into food, for example, wheat, corn, oats, rye, millet, and legumes. Methods for transforming plants are well known in the art [Shimamoto, K. et al. (1989) Nature 338: 274-277; Datta, SK et al. (1990) Bio / Technology 8: 736-740; Cristov, P. et al. 1991) Bio / Technology 9: 957-962; Gordon-Kamm, WJ et al. (1990) The Plant Cell 2: 603-618; Fromm, ME et al. (1990) Bio / Technology 8: 833-839; Vasil, V. et al. (1992) Bio / Technology 10: 667-674; Weeks, JT et al. (1993) Plant Physiol. 102: 1077-1084; Somers, DA et al. (1992) Bio / Technology 10: 1589-1594; Bower, R. and Birch. , RG (1992) Plant J. 2: 409-416; Kung, S. and Wu, R. (1993) Transgenic Plants Engineering and Utilization 1: 382; Daniell, H. (1993) Methods in Enzymol. 217: 536- 556].
Bioproduction of artificial protein-based polymers, such as elastomeric poly (VPGVG) [equivalently denoted as poly (GVGVP), poly (GVPGV) or other permutations], may be performed in bacteria or performed in plants. Regardless, it is advantageous to: (i) synthesize a gene with multiple tandem copies of the peptide coding unit using codons appropriate for the codon preference of the chosen expression host. (Ii) the synthetic gene should be easily cloned into a vector plasmid and transferable as a cassette to another expression vector, and (iii) the synthetic gene should use transcription and translation control signals appropriate for the expression host. Preferably expressed in a desired polypeptide product, preferably (iv) the polypeptide is expressed in a form that allows for purification, and (v) VPGVG repeats. It is removed after or expression amino foreign are avoided for the column.
Briefly, a gene encoding, for example, 10 repeat units of an elastomeric peptide is made using synthetic oligonucleotides and cloned into an expression vector. The bioelastomer polypeptide gene can be further extended to additional repeat units using additional oligonucleotides and PCR (eg, US Pat. No. 4,683,202) to overlap the 10-mer gene. This technique relies on the presence of an appropriate restriction site at the 3 'end of the unit gene (in this case, a 10-mer) to insert each tandem addition of the unit. Using this modular approach, continuous genes can be constructed with increasing size for each additional unit. One of the essential problems in generating genes with multiple repeated copies is the possibility of recombination and deletion in E. coli. A method for producing a gene using a repetitive sequence can be performed by using a suitable host strain (eg, recA^-When used in ()), there is no problem for poly (GVPVG).
Alternatively, a “concatemer” route is possible for the production of high molecular weight polymer proteins. One involves the use of double-stranded oligonucleotide monomers, each encoding a bioelastomer peptide unit, and linking the monomers through sticky ends to form a multimeric sequence (concatemer) encoding the polypeptide. Another route combines a modular approach with the concatemer route to create genes encoding multiple repeats of peptide units (eg, 10-mers) with terminal restriction sites that when cleaved leave non-palindromic sticky ends. The route is. By linking those gene monomers, a multimer encoding a high molecular weight polymer can be prepared. This alternative allows for the production of high molecular weight genes easier and faster than the modular cloning approach.
According to the broadest aspect, the present invention relates to a food additive for improving the texture of a food by incorporating a bioelastic polypeptide into the food or food precursor in an amount sufficient to increase the elasticity of the food and Provide a method. The present invention also provides a method of binding a food by adding a bioelastogenic polypeptide to the food precursor in an amount sufficient to bind the food precursor.
Food additives as used herein include edible materials suitable for human or animal consumption, such as synthetic or natural flavors, such as peppermint, lemon or vanilla essence, and sweeteners, such as saccharin, aspartame or sugar. With optional inclusion, they can be formed into various physical forms and used with food products or their precursors.
The method of the present invention improves the texture of a food product by increasing the elasticity and extensibility of the food product or its precursor. For example, the quality of wheat in dough production depends on its extensibility and elasticity when mixed with water to make dough, which are properties primarily provided by its protein. Their quality is generally measured by examining the baking quality, for example by measuring the SDS sedimentation rate as an indirect measure of baking quality [Moonen et al. (1982) Enphytica 31: 677-690]. Standard and micro baking tests are performed, for example, as described by Smak, C. (1972) Cer. Chem. 49: 554-560 or Meppelink (1981) Getreide, Mehl und Brot 35: 107-109. . Alternatively, the viscoelasticity of the dough can be measured directly.
The improved dough viscosity then results in improved food texture, for example, making the food less resistant to crumbling and disintegration. It is suitable for milling, which currently cannot generally be processed into high-quality dough, for example, from corn, corn and oats.
In this case, the bioelastomers can be added directly to the mill, or can be expressed by the transgenic plant to introduce their specific properties (ie, elasticity and extensibility) into the mill obtained from the crop. . Essentially elastic subunits based on the VPGVG pentapeptide motif or a combination of, for example, VPGVG, IPGVG and VPAVG can yield a preferred elastic module. Baking is polymer T_tIt is only important that the repeating unit is chosen to be performed at a higher temperature.
Incorporation of such subunits into natural proteins, such as gluten, by interchain disulphide bonds will result in increased elasticity and improved quality, which are optimal for bread making and other applications.
Furthermore, a polyhexapeptide unit is incorporated into a bioelastomer to form an elastic higher-order structure such as (pentapeptide)_n(Hexapeptide)_n(Pentapeptide)_nCan be provided. For example, (GVGVP)_n(GVGIP)_n(GFGVGP)_nProvides a soft polymer that can be used as a chewing gum base. The ratio of repeating units will often depend on the flavor used, which can further soften the gum. However, the ratio can be readily determined by one skilled in the art in light of the teachings of the present application.
The bioelastomer can also be engineered to have binding properties according to the teachings of the present inventors' patent applications and patent specifications. These properties are used to bind the food precursor, where about 1% to 99.5% by weight of the bioelastomer is present, preferably about 10% to 90% by weight of the food precursor. , More preferably about 30% to 70% by weight.
Example
Example 1
Gene composition encoding bioelastic polymer Expression of things
Using a synthetic oligonucleotide having the sequence depicted in FIG. 1 (GVGVP)₁₂₀Was prepared. The oligonucleotide was flanked by sequences containing BamH1 (G'GATCC) and PflM1 (CCAGGCGTTGG) restriction endonuclease recognition sites. This nucleic acid was inserted into plasmid pUC118 and used to transform E. coli. After isolation of the amplified plasmid, the sequence of the gene insert was confirmed by DNA sequence analysis [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York (1989)].
This 10-mer gene is then converted to a high molecular weight (GVGVP)_nWas used as a module unit for preparing a long chain gene encoding A plasmid containing the 10-mer gene was prepared and digested with PflM1. Then PflM 1 (GVGVP)_TenThe gene fragment was purified and [(GVGVP)_Ten]_nWas used in a subsequent ligation reaction to make a polymer of Also, a separate adapter oligonucleotide with a unique restriction site was added to the ligation reaction to allow for subsequent cloning of the linked gene fragment. The adapter oligonucleotides were added at a ratio that would be preferable for recovery of the high molecular weight "concatemer". This step is schematically represented in FIG. 1B.
For recovery and cloning of individual length concatemer genes, the ligation mixture was digested with BamH1 and then electrophoresed through an agarose slab gel to fractionate different molecular weight sizes. Sections corresponding to various size ranges were then excised from the gel, DNA was recovered and cloned into plasmid pUC118 [Urry et al., "Elastic and Protein-based Polymers: Potential for Industrial Uses" (Am. Chem. Soc. ) Div. Polym. Mat., Sci. & Engr., "Industrial Biotechnological Polymers," Washington, DC, 1994]. The gene insert in this plasmid was analyzed by restriction endonuclease digestion and correctly size fractionated by agarose gel electrophoresis adjacent to the concatamer "ladder". To express native protein-based polymers in E. coli (GVGVP)₁₂₀Was subcloned from pUC118 into the expression vector pQE-32 (Quiagen, Inc.) as a gene fusion behind the sequence encoding the hexahistidine. Expression using this plasmid is for proteins with amino-terminal polyhistidine fusions, specifically MRGSH₆GIQTM- (GVGVP)_nProduced. This fusion component provides the ability to affinity purify the protein by metal chelate chromatography. Several different sized concatemer genes were subcloned into the pQE-32 vector and expressed in E. coli. The poly (GVGVP) polymer produced is affinity-purified from bacterial cells, and amino acid analysis of phenylisothiocyanate (PITC) derivatives of amino acids separated by reverse phase chromatography requires the expected ratio of poly (GVGVP) Glycine, valine and proline. This allows high molecular weight protein-based polymers such as (GVGVP)₂₅₀It has been established that a gene encoding E. coli can be produced and can be efficiently expressed in an E. coli host organism. Using a gene fusion and purification approach, it was also possible to purify the recombinant protein to high purity and prove that it was the desired product.
Purification of expression products
Affinity purified MRGSH₆GIQTM- (GVGVP)_nWas used to show that protein-based polymers precipitate reversibly (ie, become coacervates) by raising or lowering the temperature. Ingress and egress from this solution can be determined visually by observing that the liquid becomes turbid and then clear.
Using this property, (GVGVP)_nThe histidine fusion protein comprising (where n = 40, 140 and 250) was purified. First, a cooled (on ice) suspension of E. coli cells containing a protein-based polymer was lysed by sonication to disperse the cell components. At lower temperatures, the poly (GVGVP) remains in a spread soluble state and insoluble cell debris can be removed by centrifugation. While still cool, the cell lysate was centrifuged at high speed to remove insoluble cell debris. The collected supernatant was then warmed to 37 ° C. to form visible aggregates from the protein-based polymer, at which point it was separated from the soluble fraction by centrifugation. Upon heating above its transition temperature of 37 ° C., the poly (GVGVP) species forms a new phase that allows for selective removal of the remaining solutes by centrifugation. This procedure was repeated one more wash, resulting in a product that was as pure as the affinity purified material when analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Thus, more than 90% of bacterial endotoxin was removed.
Example 2
E. Native poly (GVGVP) in coli ₁₂₀ Expression and purification
E. To achieve expression of a native protein-based polymer in E. coli (GVGVP)₁₂₀Was subcloned from pUC118 described in Example 1 as an Nco1-BamH1 fragment into the expression vector pET-11d (Novagen, Inc.). High levels of protein were expressed from this plasmid without the previously described amino terminal affinity component. The protein was also efficiently purified as described in Example 1 using the temperature-induced aggregation method.
Example 3
Protein-based elastic gel in tobacco chloroplast Expression of limmer, poly (GVGVP)
Genes encoding poly (GVGVP) proteins ranging from 150 tandem pentapeptide units are generated for expression in a tobacco system using PCR with synthetic oligonucleotides encoding 10 repeat units of GVGVP. FIG. 2 shows the sequence of a gene comprising codons optimal for tobacco while maintaining maximum coding degeneracy. The gene is made using two oligonucleotides, each representing slightly more than half of the gene. These oligonucleotides have a complementary 25 base overlap (dotted underline in the figure), which is extended by a PCR reaction to form a full-length double-stranded sequence. The PCR product was digested with BamH1 and inserted into plasmid pUC119 for sequence confirmation and continuous maintenance. The fragment is excised from pUC119 using PflM1 and self-ligated to form a concatamer, including the adapter fragment, to terminate multimerization in the desired size range.
The synthetic gene is introduced using the Gene Gun into the chloroplasts of cultured tobacco cells essentially as described by Daniell [Methods Enzymol. 217 (1993) 536-556].³⁵After continuous culture of the transformed cells in MS saline medium in the presence of S-methionine, chloroplasts are isolated using a mini-bead beader (Daniell et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 1503-1504). Rupture of the chloroplast in a hypertonic buffer results in a soluble chloroplast protein. The bioelastomer is purified essentially as described in Example 1.
Example 4
Protein-based plastic polymer from tobacco, poly (AVGVP) expression
A different approach is used to generate genes encoding poly (AVGVP) in the range of 150 repeat units for expression in tobacco. In particular, two 15 base degenerate oligonucleotides, each representing one strand of a double-stranded unit encoding (AVGVP) monomer and having codon choices suitable for tobacco, 5'-CCNGCNGTNGGNGTN-3 'and 5' '-CNGGNACNCCNACNG-3' is synthesized (where N = G, A, T or C). The two strands are offset so as to allow a ligation between the 5 'and 3' ends, leaving an overlapping end of 4-5 bases that are complementary upon annealing. (GVGVP)_TenAs described above for the genes, the annealed oligonucleotides, or catemers, are ligated through their complementary termini, forming long-chain multimers, or concatemers. Expression and purification of the bioelastomer polypeptide is essentially the same as above, but using the transition temperature of poly (AVGVP).
Example 5
Stable chloroplasts or poly (VPGV) after nuclear transformation G) expression
Plasmid pHD203-GUS-EPSPS (EN / polyA) (see FIG. 3) contains a polyA fragment that directs the aroA gene (encoding EPSP synthase that confers resistance to glyphosate) and stabilizes the transcript. It contains the 35S promoter / enhancer element of CaMV flanked at the 3 'end. G- (VPGVG) fused with gst coding sequence₁₉-PHD203-GUS-EPSPS- (EN / polyA) by coding the VPGV (20-mer) coding sequence by using an adapter or by filling in the concave 3 'end with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I Insert at the Bgl II site. Stable expression is achieved by bombarding EPSPS vectors containing the gst-EG20 mercoding sequence into cultured tobacco cells and growing them in the presence of glyphosate. The coding sequence is inserted into the tobacco chloroplast genome in the region between rbcL and ORF 52 to achieve high frequency transformation [Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913. −917].
Transgenic tobacco plants expressing the polymer inside the chloroplast are obtained by bombarding leaves from aseptically grown plants with the chloroplast vector. Optimal conditions for selection and regeneration of tobacco chloroplast transgenic plants are well known in the art [Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Staub and Maliga (1992) The Plant Cell 4: 39-45; Staub and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917].
Molecular and biochemical analysis of chloroplast transformation
Chloroplast DNA is isolated from transgenic plants by methods known in the art. Examine the ethidium bromide stained gel of the restriction enzyme digested ctDNA preparation to detect additional ctDNA fragments. Insertion of the EPSPS / gst-EG20 mer fragment from the chloroplast vector into the tobacco ct genome introduces additional restriction sites into the ct genome of the transgenic plant. ctDNA is digested with restriction enzymes, separated by electrophoresis on an agarose gel, and blotted onto a nylon membrane. Fragments containing EPSPS or gst or polymer coding sequences are used as hybridization probes. All transgenic lines are tested for the presence of the EPSPS-gst-polymer coding sequence in the tobacco chloroplast genome. Prepare chloroplus and extract as described in Example 3 and purify the protein.
Example 6
Protein-based porting in transgenic tobacco Stable nuclear expression of limers
Synthetic gst-G- (VPGVG)₁₉-Insert the VPGV gene cassette (Mc Pherson et al.) Into the pKYLX vector [Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11] as follows. The Mae I / EcoR1 fragment containing the cassette was modified to incorporate a new ATG codon by adding a Xho1 / Nco1 adapter (5′-TCGAGCCATGG-3 ′ / 3′-CGGTACC-5 ′) to the 5 ′ end, and Transfer into pKLYX7.1 as Xho1 / EcoR1 fragment. PKLYX7.2, a derivative of pKYLX7.1 [Daniell et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 248-255], in which the Xba1 site has been replaced by an EcoR1 site, was synthesized with synthetic gst-G- ( VPGVG)₁₉-Used to house VPGV cassettes.
Young fully opened tobacco leaves [Nicotian tabacum (Nicotiana tabacum) Cv KY 14] is collected from 8-week old plants, the surface is sterilized with 10% chlorox for 10 minutes, then with 70%% alcohol for 3 minutes and washed three times with sterile distilled water. Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) -Mediated leaf transformation and stem regeneration are performed as described by Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231. Briefly, on MS medium containing 300 mg / l kanamycin and 500 mg / l mefoxin as described by Svab et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 8526-8530]. Select putative transformants with. Transfer kanamycin resistant stems to rooting medium. Approximately 50 kanamycin resistant plantlets are selected for analysis. Control plants are transformed with pKYLX7.2 alone.
Putative transformants were confirmed by Southern hybridization and NPT II phosphotransferase activity as well as gst-G- (VPGVG)₁₉-Assay for VPGV protein (McPherson et al.) Production. The selected individual transformants are selected for the production of homozygous individuals to be used as first ancestors of the seed to be used in field experiments. Cultivate each type of transgenic tobacco on about 1 acre (about 4047 square meters). Small plots grown with the vector alone and untransformed plants serve as growth controls or other evaluation controls. Seedlings were bred in the greenhouse and transplanted in the test plot. Prepare cell extracts (Scopes et al.) And purify the polymer as described in Example 1.
All publications and patent applications mentioned herein are referenced by the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated herein by reference. Incorporated herein.
Having fully described the invention, it will be apparent to one skilled in the art that many changes and modifications may be made without departing from the spirit or scope of the appended claims.

Claims (16)

A method of improving the texture of a food, comprising incorporating a bioelastic polypeptide into the food or a precursor of the food in an amount sufficient to increase the elasticity of the food. A method wherein the polypeptide comprises a tetrapeptide, pentapeptide or nonapeptide repeat unit or a mixture thereof, and wherein said repeat unit is in a β-turn conformation. The method of claim 1, wherein the bioelastic polypeptide is added to the precursor during manufacture of the food. 2. The method of claim 1, wherein said bioelastic polypeptide is a recombinant protein. 4. The method of claim 3, wherein said recombinant protein further comprises glutenin. 4. The method of claim 3, wherein said recombinant protein is expressed in a host selected for processing into said food. 6. The method of claim 5, wherein said host is selected from the group consisting of wheat, corn, oats, rye, millet and beans. A method for binding a food precursor, comprising adding a bioelastic polypeptide in an amount sufficient to bind the food precursor, wherein the bioelastic polypeptide is a tetra A method comprising a peptide or pentapeptide repeating unit or a mixture thereof, and wherein said repeating unit is in a conformation having a β-turn. A food additive, comprising a tetra- or penta-peptide repeating unit or a mixture thereof, wherein said repeating unit is in a conformation having a β-turn; Food additives comprising edible ingredients suitable for consumption. 9. The food additive of claim 8, wherein said bioelastic polypeptide is used as a foam. 9. The food additive of claim 8, wherein said bioelastic polypeptide is a malleable material. 9. The food additive of claim 8, wherein said bioelastic polypeptide is a gel. 9. The food additive of claim 8, wherein said bioelastic polypeptide is a sheet. 9. The food additive of claim 8, wherein said bioelastic polypeptide is substantially cross-linked. 9. The food additive of claim 8, wherein said bioelastic polypeptide is substantially uncrosslinked. 9. The food additive of claim 8, wherein said bioelastic polypeptide further comprises a hexapeptide repeat unit. 9. The food additive of claim 8, wherein said edible material is selected from the group consisting of saccharin, sugar, peppermint and aspartame.

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