JP3580836B2

JP3580836B2 - Neutropenia treatment agent

Info

Publication number: JP3580836B2
Application number: JP13613193A
Authority: JP
Inventors: 辰也渡辺; 純枝吉富; 玲子佐々田
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-06-08
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 2004-10-27
Anticipated expiration: 2019-10-27
Also published as: JPH06183993A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト神経成長因子２（ＮＧＦ−２）を含有する好中球減少症治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経栄養因子群は、神経成長因子（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）がレヴィーモンタルチーニ（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｎｔａｌｃｉｎｉ），アニュアルニューヨークアカデミーオブサイエンス（Ａｎｕ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）５５，３３０（１９５２）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ４０，１０１４（１９５４）によって見出されて以来、多数の因子が見い出されている。これらの因子は、神経細胞の分化、成熟、生存、機能維持、増殖などの多様な機能を担っているものと考えられている。これらの因子は具体的には、先に上げたＮＧＦ以外に、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎｄｅｖｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒＢＤＮＦ，ＢａｒｄｅＹ−Ａ，ｅｔａｌ，エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ．）１，５４９−５５３（１９８２）），毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ，Ｗａｔｔｅｒｓ．Ｄ．ｅｔａｌ，ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．）４９，７０５−７１３，（１９８７）などが報告されている。
ヒト神経成長因子２（ＮＧＦ−２）は、ヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報にポリペプチド（Ｉ）として示され、また、フェブス・レターズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ），２６６，１８７−１９１（１９９０）に発表されている。これと同じ因子が、Ｈｏｈｎら，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３４４，３９９（１９９０）などの文献にＮＴ−３として発表されており、またＰＣＴ公開ＷＯ９１／０３５６９号公報に示されている。
該ヒト神経成長因子２を、本明細書においては、ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３と略称することもある。ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３については、（１）ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子は腎臓および脳中の海馬，小脳に強く発現している。（２）成熟動物よりも新生仔の方が発現が強い。（３）ＮＧＦ，ＢＤＮＦが作用を示さないか弱い作用を示すような神経細胞（例えばｎｏｄｏｓｅｇａｎｇｌｉｏｎ由来神経細胞）に作用を示す。これらのことから、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３は神経系の発達時に重要な働きをしていると考えられる。
血球の分化においては、まず多能性幹細胞がリンパ系幹細胞と骨髄系幹細胞に分化する。次にリンパ系幹細胞はいくつかの過程を経て、Ｔリンパ球および形質細胞へと分化する。また骨髄系幹細胞は、いくつかの分化過程を経て好塩基球，好酸球，単球およびマクロファージ，好中球，巨核球および赤血球へと分化する。これらの各分化過程には多数の造血因子（コロニー刺激因子およびインターロイキンなど）が関与していることが分っており、そのうちいくつかの因子は臨床的に有用であることが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
各種コロニー刺激因子やインターロイキンなどの造血因子は血球の分化過程に働く因子であり、末梢血中の最終分化過程にある血球、例えば好塩基球，好酸球，単球，好中球などに作用し、これらを増殖せしめるものは非常に少ない。例えばＮＧＦに末梢血リンパ球のコロニー形成を促進することが知られている〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ８５，６５０８（１９８８）〕だけである。
ＮＧＦ−２／ＮＴ−３は中枢神経系諸疾患の治療への応用が試みられているが、本発明はこの因子が末梢血中の血球を増殖せしめる作用を有することを応用し、この因子を好中球減少症さらには感染症および腫瘍に対する治療剤として用いることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に挙げたＮＧＦとは構造的に異なるＮＧＦ−２／ＮＴ−３が末梢血中の分化した血球の増殖を刺激する活性をもつことを見い出し、これを動物に投与すると顕著な血球の増加が引き起こされ、好中球減少症の治療に著効を示すことを見い出し、さらに感染症および腫瘍の治療にも有効であろうと考えられ、これらの知見に基づいて鋭意研究した結果、本発明を完成した。
【０００５】
本発明は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含有する好中球減少症治療剤である。
上記ＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性物質としては、神経栄養因子活性、すなわち神経細胞の分化，生存，機能維持などの作用を有する物質であればいずれでもよい。例えば動物体内や動物細胞で産生される天然のＮＧＦ−２／ＮＴ−３、遺伝子組換え技術で生産されるＮＧＦ−２／ＮＴ−３、あるいはこれらの関連物質が挙げられる。上記ＮＧＦ−２／ＮＴ−３やこれらの関連物質は、そのペプチド鎖に糖鎖を有していてもよくまた無くてもよい。
具体的には、例えば〔図２２〕（配列番号１２。図２２においてＸはＡｒｇまたはＡｒｇＴｈｒである。）で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ）（ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３）（ＥＰ−３８６，７５２，特開平３−２０４８９７）や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよい。上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端から５個のアミノ酸残基を欠くフラグメント（ヨーロッパ特許公開４９９，９９３号）やカルボキシル末端部の数個のアミノ酸残基を欠くフラグメントなどが挙げられる。さらに〔図２２〕で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ）のムテインも本発明において用いることができる。
【０００６】
このようなＮＧＦ−２／ＮＴ−３のムテインは主に本来のペプチドもしくは蛋白質のアミノ酸配列の改変によって得られる。このような改変としては単数もしくは複数のアミノ酸の付加、単数もしくは複数の構成アミノ酸の欠失、および単数もしくは複数の構成アミノ酸の他のアミノ酸での置換などが挙げられる。更に、グリコシル化位置で導入されるＮＧＦ−２／ＮＴ−３のムテインもこの改変の中に含まれるものである。
上記のアミノ酸の付加としては、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の活性が失なわれない範囲内で、ペプチド発現のためもしくはシグナルペプチドとして使用される開始コドンに由来するメチオニンもその対象として、少なくとも１個のアミノ酸の付加をいう。ＮＧＦ−２／ＮＴ−３と同様の活性を示すＮＧＦやＢＤＮＦとの類似性を有す蛋白質のアミノ酸配列のいくつかもしくは全てが、付加のための好ましいアミノ酸として挙げられる。
上記の欠失されるアミノ酸は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の活性が失なわれない範囲内でかつシステインを除く、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３構成アミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸の欠失が挙げられる。ポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端から１〜７個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失したムテインや、ポリペプチド（Ｉ）の４１〜４８番目、５７〜６１番目および９１〜９４番目のアミノ酸領域から１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失したムテインがその例として挙げられる。
【０００７】
上記の他のアミノ酸で構成アミノ酸を置換するものとしては、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の活性が失なわれない範囲で、システインを除く少なくともの１個のＮＧＦ−２／ＮＴ−３構成アミノ酸を少なくとも１個の異なったアミノ酸で置換するものが挙げられる。これらの被置換構成アミノ酸としては、イソロイシン、リジン、スレオニン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、グルタミン酸、アルギニン、グリシンおよびアスパラギンが挙げられ、その置換位置としては、図２２のアミノ酸配列の内、アミノ酸残基番号４１〜４８番、５７〜６１番および９１〜９４番の領域での置換が好ましいものとして挙げられる。
例えば、構成アミノ酸がイソロイシンであるとき、置換アミノ酸としてはアスパラギン、スレオニン、バリン、リジン、グリシン、セリンおよびプロリンが挙げられる。
構成アミノ酸がアルギニンであるとき、置換アミノ酸としてはグルタミン酸、リジンおよびアラニンが挙げられる。
構成アミノ酸がグリシンであるとき、置換アミノ酸としてはスレオニン、イソロイシン、リジン、グリシン、セリン、アスパラギン、プロリンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がセリンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、グルタミン酸、スレオニン、グリシン、アスパラギン、プロリン、バリンおよびリジンが挙げられる。
【０００８】
構成アミノ酸がバリンであるとき、置換アミノ酸としてはセリン、イソロイシン、プロリン、グリシン、スレオニン、リジンおよびアスパラギンが挙げられる。
構成アミノ酸がリジンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、セリン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、アルギニンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がスレオニンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、リジン、グリシン、アスパラギン、セリン、プロリンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がアスパラギンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、スレオニン、グリシン、リジン、セリン、プロリン、グルタミン酸およびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がプロリンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、リジン、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がアラニンであるとき、置換アミノ酸としてはグルタミン酸、リジンおよびアルギニンが挙げられる。
構成アミノ酸がグルタミン酸であるとき、置換アミノ酸としてはアラニン、リジン、セリン、アスパラギンおよびアルギニンが挙げられる。
【０００９】
上記置換においては、少なくとも２つの構成アミノ酸の置換を同時に行なうことができ、特に２もしくは３の構成アミノ酸の置換が好ましい。
上記の付加、欠失および置換の２もしくは３個の組合せによってムテインを得ることもできる。
これらのムテインを得るために、部位指向突然変異を用いることができる。この技術はＲ．Ｆ．ＬａｔｈｅｒおよびＪ．Ｐ．Ｌｅｃｏｑのジェネティク・エンジニアリング（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），３１−５０頁、アカデミック・プレス（１９８３）に記載されて、よく知られているものである。オリゴヌクレオチドに対する突然変異は、Ｍ．ＳｍｉｔｈおよびＳ．Ｇｉｌｌａｍのジェネティク・エンジニアリング：プリンシプルズ・アンド・メソッズ（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ），３巻，１〜３２頁、プレナム・プレス（１９８１）に記載されている。
【００１０】
また上記ＮＧＦ−２／ＮＴ−３は、ポリエチレングリコール誘導体など、化学修飾されたものでもよい。
とりわけ、本発明においては〔図２２〕で示されるアミノ酸配列を有するヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を用いるのが好ましく、この場合そのアミノ末端にさらにメチオニン残基（Ｍｅｔ）を有するものと有さないものとの混合物であってもよく、またアミノ末端にＭｅｔを有さずチロシン（Ｔｙｒ）で始まるもの（ヨーロッパ特許公開４９９，９９３号）でもよい。
【００１１】
本発明におけるＮＧＦ−２／ＮＴ−３は低毒性であるので安全に使用することができる。
本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３は末梢血中の血球、たとえば好塩基球，好酸球，単球，好中球などを増加せしめ、その機能を亢進させる。従って、本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３は動物の好中球減少症に対する治療剤として用いることができ、さらに感染症や腫瘍に対する治療剤として用いることができる。
該動物としては温血哺乳動物があげられ、その例としては、たとえばマウス、ネコ、牛、羊、ヤギ、ブタ、ウサギ、ヒトなどがあげられる。
【００１２】
本発明の治療剤は動物に投与することにより、その好中球減少症、さらに感染症に伴なう症状を改善し、治癒を促進する。本発明の治療剤は動物に投与することにより、さらに、抗腫瘍作用をも示す。
該投与は、一般に非経口的におこなわれ、たとえば本発明の治療剤を該動物に注射投与することにより好ましく実施できる。
本発明の治療剤の使用量は、その使用方法，使用目的などにより異なるが、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３のタンパク質量として、注射投与して用いる場合には、たとえば１日量約０．０２μｇ／ｋｇ〜０．０２ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。
【００１３】
本発明の治療剤を水溶液として調製する場合は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を水性溶剤（例、蒸留水），水溶性溶剤（例、生理的食塩水，リンゲル液），油性溶剤（例、ゴマ油，オリーブ油）等の溶剤，または所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム），緩衝液（例、クエン酸ナトリウム，グリセリン），等張化剤（例、ブドウ糖，転化糖），安定剤（例、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコール），保存剤（例、ベンジルアルコール，フェノール），無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカイン）等の添加剤と共に用いて、常套手段により製造される。
また、該水溶液におけるｐＨは、約３〜８に、さらに好ましくは約５〜７に調整される。上記ｐＨ範囲に調整するためには、たとえば希酸（例、希塩酸）や希アルカリ（例、希水酸化ナトリウム，希炭酸水素ナトリウム）などを添加することにより行なわれる。
また、本発明の治療剤を固型状のものとして調製する場合は、たとえばＮＧＦ−２／ＮＴ−３を凍結乾燥するか、あるいは固型状（例、粉末状）のＮＧＦ−２／ＮＴ−３に希釈剤（例、蒸留水，生理的食塩水，ブドウ糖），賦形剤（例、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），アルギン酸ナトリウム），保存剤（例、ベンジルアルコール，塩化ベンザルコニウム，フェノール），無痛化剤（ブドウ糖，グルコン酸カルシウム，塩酸プロカイン）等を混合し、常套手段により、固型状筋肉内注射用製剤に製造することができる。
【００１４】
本発明の治療剤の製剤化にあたって、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含有する水溶剤にさらにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合し、溶液状態でｐＨ３〜８を示すように調整すると、保存中および凍結や凍結乾燥操作におけるＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性の低下が少なく、また凍結乾燥品においてはその再溶解時の溶状が澄明であるので好都合である。
ＨＳＡとしては、いかなるものでもよいが、本組成物を臨床応用するためには、非経口投与に用いる程度の品質のものが好ましい。
例えば、健康人血漿を原料としてＣｏｈｎのエタノール分画第６法によって、分画精製したものが用いられる。
また安定剤としてアセチルトリプトファンナトリウムや、カプリル酸ナトリウムを含有するものであってもよい。
ＨＳＡは、各成分を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌ当り約０．１ｍｇ〜５０ｍｇ、とりわけ約０．５ｍｇ〜２０ｍｇ含有させることが好ましい。
【００１５】
本発明の治療剤の製剤化にあたっては、上記ＨＳＡに加えさらにグリシン，グルタミン酸，アスパラギン酸，アラニン，プロリンなどのアミノ酸、とりわけモノアミノ脂肪族アミノ酸、もしくは環状アミノ酸，ブドウ糖，マンノースなどの単糖類，ソルビット，マンニット等の糖アルコール類，およびこれらの生理学的に許容できる塩もしくは誘導体の１種または２種以上を配合してもよい。
上記配合剤は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌ当り、単糖類または糖アルコール類に関しては約１０〜１００ｍｇ，アミノ酸に関しては約５〜５０ｍｇ配合することが好ましい。
上記の製剤化にあたっては、水溶液を溶液状態でｐＨ約３〜８，好ましくはｐＨ約５〜７に示すように調整するために、グルタミン酸などの酸性アミノ酸を配合する場合は該物質を上記所定量加えることにより所定のｐＨに調整でき、また所望により、または上記酸性アミノ酸を配合しない場合は塩酸，リン酸等の鉱酸、もしくはコハク酸，酒石酸，クエン酸等の緩衝剤で所定のｐＨに調整する。
【００１６】
本発明の治療剤は、水溶液，凍結品または凍結乾燥品の形態が好ましく、とりわけ凍結乾燥品が好ましい。
本発明の治療剤は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性物質の減弱を防止するために、たとえば以下の方法によってより好ましくは製造することができる。
ＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性物質を含有する水溶液に、所望によりＨＳＡを前記所定の濃度になるように加え、前記した方法でｐＨ調整を行なう。
また、所望により、単糖類，糖アルコール類，アミノ酸などもそこに記載した濃度として加えることもできる。また所望により等張化剤，界面活性剤なども加えることができる。なお、ＨＳＡ以外の物質を添加する場合には、最終水溶液のｐＨが前記ｐＨを示すように、前記した方法でｐＨ調整を行う。かくして得られる水溶液としての本発明の治療剤は、下記の凍結および凍結乾燥品の原料としても用いることができる。
【００１７】
凍結品としての本発明の治療剤は、とえば上記水溶液を通常約−８０〜−２０℃で凍結することにより製造できる。該凍結組成物は約−８０〜−１０℃で保管することが好ましい。
凍結乾燥品としての本発明の治療剤は、例えば上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか上記水溶液または上記凍結組成物の融解により得られる水溶液を、所望により小分けし、上記同様凍結した後、常法により減圧乾燥することにより製造することができる。
また前記の方法により製造した凍結乾燥品を、例えば前記した単糖類，等アルコール類，アミノ酸等を含有し、所望により塩酸等でｐＨ調整された溶解液によつて再溶解することによって溶液状態の本発明の治療剤を製造することができる。
【００１８】
注射用製剤としての本発明の凍結乾燥した治療剤を製造する場合は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の水溶液および配合剤含有水溶液をそれぞれ除菌ろ過して混合するか、これらの混合液を小分けする前に除菌ろ過等により精製し、無菌操作によりバイアル瓶等に分注小分けした後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。この場合、容器の空間部を真空にするか、窒素ガス置換することにより、該組成物の安定性を高めることができる。
また、アミノ酸や単糖類あるいは糖アルコール類を含有する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場合には、その水溶液は除菌ろ過し、無菌操作によりアンプル等に分注小分後、常法により蒸気滅菌したものを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の治療剤を投与するには、該組成物が水溶液のものである場合には、そのまま注射用溶解液として用いる。
該組成物が凍結乾燥により固型状のものである場合には、蒸留水もしくは生理的食塩水などを用いて溶解し注射用溶解液として用いる。なお、所望により前記したと同様の単糖類，糖アルコール類，アミノ酸等を含有し、前記と同様にｐＨ調整された溶解液で溶解後使用することも出来る。
本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３からなる治療剤は、末梢血中の血球を著しく増加せしめ、機能を亢進する。
したがつて、本発明の治療剤は、好中球減少症の治療に有効であり、さらに感染症および腫瘍の治療に使用することが可能である。
【００２０】
本願発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次にあげる。またアミノ酸に関して光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡデオキシリボ核酸
Ａアデニン
Ｃシトニン
Ｇグアニン
Ｔチミン
Ａｌａ：アラニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｃｙｓ：システイン
Ｇｌｎ：グルタミン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
Ｇｌｙ：グリシン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｌｙｓ：リジン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｐｈｅ：フェニールアラニン
Ｐｒｏ：プロリン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｖａｌ：バリン
後述の参考例９で得られた形質転換体ＣＨＯ−Ｎ２−１は、平成３年１月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ５０３０７として寄託されており、また該形質転換体は平成３年１月２９日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−３２５５として寄託されている。
【００２１】
参考例１ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（１）
ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムライブラリー〔クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社〕を大腸菌ＮＭ５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１０^４クローンずつ撒いた。プラークをナイロンメンブラン（アマシャム社、ハイボンド−Ｎ）上に移した後、０．５ＮＮａＯＨ−１．５ＭＮａＣｌ溶液に６分間浸し、ファージＤＮＡを変性させた後、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１．５ＭＮａＣｌ溶液に６分間浸した。本メンブランを２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理することによりＤＮＡをメンブランに固定した。
一方、既知〔アルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０３，８２１（１９８３）〕のヒトＮＧＦ遺伝子を参考にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ（０．３８ｋｂ）を化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット（ニッポンジーン社）を用いて^３２Ｐで標識したものをプローブとした。
ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブを含む、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム），５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，０．５％ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０ｍｌ中で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フィルターを２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で５分ずつ３回、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液中で、６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プローブと反応するクローンを検索した。この方法により得られたクローンλβＬＮ２１１３よりデイヴィス（Ｄａｖｉｓ）らの方法（Ｄａｖｉｓら、〔アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス（ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ）〕，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８０）によりファージＤＮＡを抽出した。
次にλβＬＮ２１１３をＳｍａＩとＡｐａＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ（約１ｋｂ）を切り出し、プラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（＋は上付き）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社，ＵＳＡ）のＳｍａＩ，ＡｐａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＧＦ１０７Ｇを得た。
また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ￣（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳｍａＩ，ＡｐａＩ部位に同ＤＮＡ断片を挿入することによりｐＮＧＦＰ１０８Ｇを得た。ｐＮＧＦＰ１０７ＧおよびｐＮＧＦＰ１０８Ｇに挿入された部分の塩基配列をシークナーゼ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｒｉｏｎ）を用いて決定した。決定された塩基配列はネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３０３，８２１（１９８３）に記載されている配列と、蛋白コード領域では完全に一致した。
上記のファージλβＬＮ２１１３ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮＡ断片（１．８ｋｂ）を単離した。一方、動物細胞用の発現ベクターｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、上記のヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１．８ｋｂ）とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この反応液を用いてエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体の１つ〔エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＭＮＧＦ１０１〕から単離したプラスミドをｐＭＮＧＦ１０１と命名した。
【００２２】
参考例２ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（２）
参考例１で得られたプラスミドｐＮＧＦＰ１０７Ｇを制限酵素ＢｃｌＩおよびＡｐａＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（０．８ｋｂ）を単離した。この０．８ｋｂＢｃｌＩ−ＡｐａＩ断片と化学合成アダプターＳＮ１，ＳＮ２およびＳＮ３とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、ＢｇｌＩＩで切断することによって０．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩＤＮＡ断片が得られた。
【００２３】

プラスミドｐＳＶ２−ｇｐｔ〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２０９，１４２２（１９８０）〕を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＳＶ４０プロモーターを含む２．６ｋｂＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片を単離した。次にプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２９４，２２８（１９８１）〕よりｐｏｌｙＡ付加領域を含む１．６ｋｂＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。
上記のＳＶ４０プロモーターを含む２．６ｋｂＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片、ヒトＮＧＦ遺伝子を含む０．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩＤＮＡ断片およびｐｏｌｙＡ付加領域を含む１．６ｋｂＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この反応液を用いてエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体〔エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＭＮＧＦ２０１〕から単離したプラスミドをｐＭＮＧＦ２０１と命名した。
【００２４】
参考例３ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（３）
参考例２で得られたプラスミドｐＭＮＧＦ２０１をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメント反応により平滑化したのち、ＢｇｌＩＩで切断して約０．８ｋｂＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドｐＴＢ３９９（特開昭６１−６３２８２に記載）をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント反応により平滑化したのち、ＢｇｌＩＩで切断して約３．９ｋｂＤＮＡ断片を得た。これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環状化し、プラスミドｐＴＢ１０５４を得た。
【００２５】
参考例４ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３発現ベクターの構築
（１）ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＨＮＴ２（ヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報参照）を制限酵素ＳｔｕＩで切断し、ＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで切断することにより、ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３ｃＤＮＡを含む１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミドｐＴＢ３９９（セル・ストラクチャー・アンド・ファンクション（ＣｅｌｌＳｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．）１２，２０５（１９８７））を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、約３．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させプラスミドｐＴＢ１０５５を得た。
次に、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴＢ３４８（特開昭６１−６３２８２に記載）を制限酵素ＳａｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これにプラスミドｐＴＢ１０５５を制限酵素ＳａｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによって得られた約２．６ｋｂＤＮＡ断片を連結することにより、プラスミドｐＴＢ１０５９を得た（〔図１〕参照）。
【００２６】
（２）上記（１）項記載のプラスミドｐＨＮＴ２に含まれるヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子は５′上流にｉｎｆｒａｍｅのＡＴＧ配列が存在する（ヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報の第２図参照）。このＡＴＧ配列を除くために以下の２つのＤＮＡオリゴマーを合成した。
【００２７】
Ｐｒｉｍｅｒ１：５′ＴＡＣＡＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＧ３′（配列番号：４）
Ｐｒｉｍｅｒ２：５′ＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣ３′（配列番号：５）
Ｐｒｉｍｅｒ１および２を用いて、以下の手順でポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行った。プラスミドｐＨＮＴ２を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し直鎖状にし、フェノール抽出後、エタノールで抽出、蒸発乾固し、蒸留水に溶解した。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＤＮＡ増幅試薬マキット（パーキン・エルマー・シータスＵＳＡ）を用い、鋳型ＤＮＡとして前述の直鎖状ｐＨＮＴ２を０．３ｎｇ，プライマーとしてＰｒｉｍｅｒ１，２を各１．０μＭ加えて行った。反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー・シータス）を用い、９４℃，１分，５５℃，２分，７２℃，３分を３０回くり返すことによって行った。その結果、約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができた。Ｐｒｉｍｅｒ１，２には、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位が存在するので、得られた断片をＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。この組換えプライマーｐＴＢ１３３７を大腸菌ＭＶ１１８４株に導入して得られる一本鎖ＤＮＡから塩基配列を確認したところ、一塩基の誤りもなく遺伝子が増幅されていたことがわかった。このｐＴＢ１３３７を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで切り出し０．２３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。上記（１）項記載のプラスミドｐＴＢ１０５５を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで切断して得られる約４．６ｋｂのＤＮＡに、この０．２３ｋｂのＤＮＡを連結し、プラスミドｐＴＢ１３３８を得た。
ｐＴＢ１３３８を制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記（１）項と同様の方法でハムスターＤＨＦＲ遺伝子を導入し、発現プラスミドｐＴＢ１３３９を得た（〔図２〕〜〔図３〕参照）。
このプラスミドｐＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ−２／ＮＴ−３のプロ領域をコードするＤＮＡ，ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを〔図７−１〕〜〔図７−２〕に示す（配列番号：６）。
【００２８】
参考例５ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３の生物活性の測定
ニワトリ有精卵を３７．５℃でふ卵器で８日〜１０日揺卵して胚発生を行った胎児から後根神経節（Ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ，以下ＤＲＧ）を摘出した。ＤＲＧを０．１２５％トリプシン−ＰＢＳ溶液で３７℃、２０分処理し、ピペッティングを行うことで、細胞を分散させた。これを、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地−５０μｇ／ｍｌカナマイシンに懸濁し、３７℃，５％ＣＯ_２存在下２〜４時間培養することにより線維芽細胞等を培養シャーレに付着させ、非付着細胞のみを分取した。非付着細胞を遠心（８００ｒｐｍ，５分）により集め、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地（混合比１：１）−１μＭサイトシンアラビノシド（ＡｒａＣ，シグマ社，ＵＳＡ）−５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培地に１００００細胞／ｍｌとなるように再懸濁し、０．５ｍｌ／ウェルずつ、ポリＬーオルニチンコート済み４８穴プレートに播種した。この培地にサンプルとなる溶液を０．５〜２０μｌ加え、３７℃，５％ＣＯ_２存在下で３日間培養し、生存細胞数を計測した。
【００２９】
参考例６ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３発現ベクターの構築
プラスミドｐＨＮＴ５（ｐＨＮＴ２のＥｃｏＲＩ挿入断片の方向が逆向き）を大腸菌ＭＶ１１８３に導入することにより（−）鎖一本鎖ＤＮＡを常法により調製した。一方プラスミドｐＮＧＦＰ１０８Ｇ（参考例１参照）を用いヒトＮＧＦ（−）鎖一本鎖ＤＮＡを調製した。これらに対し、
ｏｌｉｇｏ１；５′ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡ３′（配列番号：７）
ｏｌｉｇｏ２；５′ＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＣＡＴ３′（配列番号：８）
を合成し、これを用いて部位特異的な塩基変異を導入し、ＮＧＦおよびＮＧＦ−２／ＮＴ−３のそれぞれに制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩの認識部位（ＡＧＣＧＣＴ）を導入した。この反応は、ｉｎＶｉｔｒｏＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒ．２．０（アマシャム，ＵＫ）を使用した。この結果、ヒトＮＧＦ遺伝子中にＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を有するプラスミドｐＴＢ１３４０，ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子中にＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を有するプラスミドｐＴＢ１３４１を得た。ｐＴＢ１３４０を制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで切断することにより約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ｐＴＢ１３４１を制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで切断することにより、０．６７ｋｂのＤＮＡの断片を得た。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させることにより、プレプロ領域がＮＧＦ，ｍａｔｕｒｅ領域がＮＧＦ−２／ＮＴ−３となるハイブリッドタンパクをコードする遺伝子を持つプラスミドｐＴＢ１３４２を得た。ｐＴＢ１３４２を制限酵素ＳｔｕＩで切断後、合成ＢａｌＩＩリンカーを連結し、これを制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩで切断することにより０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩでｐＴＢ１０５４（参考例３参照）を切断して得られる約４．１ｋｂのＤＮＡ断片に挿入し、発現プラスミドｐＴＢ１３４３を得た（〔図４〕〜〔図６〕参照）。さらにこれをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して得た約２．６ｋｂのＤＮＡ断片をｐＴＢ３４８のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによりｐＴＢ１３４４を得た（〔図４〕〜〔図６〕参照）。
該プラスミドｐＴＢ１３４４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを〔図８−１〕〜〔図８−２〕に示す（配列番号：９）。
【００３０】
参考例７ＣＨＯ細胞の形質転換およびクローニング
ハムスターＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ−）を５％牛胎児血清を含むＨａｍＦ−１２培地でファルコンシャーレ（径６ｃｍ）に４×１０^５個まいた。５％ＣＯ_２存在下３７℃で一晩培養後、培地を交換し、さらに４時間培養を行い、参考例１で得られたヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３発現プラスミドｐＴＢ１０５９，ｐＴＢ１３３９，ｐＴＢ１３４４をそれぞれ、シャーレ一枚あたり１０μｇリン酸カルシウム法（グラハムらウィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６−４６７（１９７３））によりＣＨＯ細胞に導入した。培養４時間後、培地を交換し一晩培養後、選択培地（５％牛胎仔血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地−５０μｇ／ｍｌカナマイシン−３５μｇ／ｍｌプロリン）に培地を置き換え培養を続けた。１０〜１５日後ＤＨＦＲ＋（＋は上つき）となった細胞がコロニーを形成したので、シングルコロニーアイソレーションを行いクローニングした。
【００３１】
参考例８形質転換体によるヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子の発現
参考例２によって得られたＣＨＯ形質転換体の培養上清を採取し、参考例５に示した方法で培養上清中のヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性を測定した。この結果、ｐＴＢ１０５９，ｐＴＢ１３３９，ｐＴＢ１３４４のいずれによって形質転換した場合にも生物活性が認められた。
【００３２】
参考例９ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３高産生ＣＨＯ細胞株の確立
参考例７，８で示した形質転換株をそれぞれ、１００ｎＭメトトレキセートを含む選択培地（参考例７に記載）で培養した。この培地で生存してきたクローンについては、更に選択培地中のメトトレキセート濃度を１μＭ，１０μＭへと段階的に上げながら培養を続けた。その結果、プラスミドｐＴＢ１０５９によって形質転換した株Ａ１００２，プラスミドｐＴＢ１３３９によって形質転換した株ＣＨＯ−ｄＮ２−１７およびＣＨＯ−ｄＮ２−１９，プラスミドｐＴＢ１３４４によって形質転換した株ＣＨＯ−Ｎ２−１（ＩＦＯ５０３０７，ＦＥＲＭＢＰ−３２５５）およびＣＨＯ−Ｎ２−３７を得た。これらのＮＧＦ−２／ＮＴ−３の産生量）は以下のとおりであった。

この表において産生量は参考例５に示した生物活性測定方法によって、マウスβＮＧＦ当量として算出した。この例では、限界希釈点を０．０２ｎｇ／ｍｌ βＮＧＦ当量点とした。
【００３３】
参考例１０ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３の単離
参考例９で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｎ２−１を５％牛胎児血清、３５μｇ／ｍｌプロリン，５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変培地で２×１０^４細胞／ｃｍ^２の濃度で播種し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃，７日間培養した。ニワトリ胚ＤＲＧに対する活性測定から、この培地中には、１０μｇＮＧＦ−１当量以上の組換え型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３が産生されていることがわかった。この培養液は、使用時まで−２０℃で凍結保存した。
凍結保存培養上清１リットルを遠心８０００ｒｐｍ，１５分，４℃または濾過（東洋濾紙Ｎｏ．２）することで細胞残渣を除き、これを終濃度が１ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳとなるように調整し、２Ｎ酢酸でｐＨ６．０に補正した。これを再び遠心又は濾過し、不溶性画分を除き陽イオン交換樹脂に通した。陽イオン交換樹脂としては、Ｓ−セファロースファーストフロー（ファルマシアＬＫＢ，スウェーデン）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０−１ｍＭＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで平衡化し、これを径２．６ｃｍ高さ１０ｃｍのカラムに詰めたものを用いた。調製済み培養上清を４℃で６０ｍｌ／ｈｒの流速でこのカラムを通すことにより、吸着を行った。吸着後、カラムを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０−１ｍＭＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳを流速６０ｍｌ／ｈｒで４時間洗浄し、０．５ＭＮａＣｌ−０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）−１ｍＭＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳを流速５０ｍｌ／ｈｒで流すことにより溶出を行った。ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含む画分をヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報の参考例１に記載の抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングにより決定し、これを集めウルトラフリー２０（ミリポア，ＵＳＡ）により約２０倍濃縮した。得られた濃縮液を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−０．１５ＭＮａＣｌ−１ｍＭＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで平衡化させたセファクリルＳ−１００ＨＲ（ファルマシアＬＫＢ，スウェーデン）カラム（径１．６ｃｍ×８５ｃｍ）によりゲル濾過した。先に示したのと同様に、ウェスタンブロッティングによりヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３画分を同定し、この画分をウルトラフリー２０で約２０倍に濃縮した。得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦ−２を精製した。即ち、この濃縮液をＡｓａｈｉｐａｋＯＤＰ−５０（旭化成，日本，径８ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムを通し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む０−９０％アセトニトリルの濃度勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を約６０μｇ得た。
こうして得られた組換え型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％（３５．１：１））により分析したところ、分子量１４０００付近にほぼ単一なバンドとして検出された〔図９〕。また、これはＥＰ−３８６，７５２の参考例１に示す抗体と反応した〔図１０〕。
〔図９〕では、この精製過程をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色を行った図を示し、〔図１０〕ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタンブロッティングを行ったものを示した。〔図９〕，〔図１０〕ともレーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報に記載の方法で得られたポリペプチド（Ｉ）を、レーン２は上記の逆相クロマトグラフィーにかけたサンプルを、レーン３は逆相クロマトグラフィーで素通しした画分を、レーン４は逆相クロマトグラフィーでアセトニトリルの濃度勾配をかけることによって溶出されてきた画分（ＮＧＦ−２／ＮＴ−３画分）をそれぞれ示す。
【００３４】
参考例１１ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子の動物細胞での発現（ＩＩ）
参考例４で得られたプラスミドｐＴＢ１０５９，ｐＴＢ１３３９，および参考例１で得られたｐＴＢ１３４４についてサルＣＯＳ−７細胞での発現を検討した。遺伝子導入は参考例７で示したリン酸カルシウム法により行った。ただし、培地としては１０％牛胎仔血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用い、遺伝子導入後は、０．５％牛胎仔血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用いた。遺伝子導入４８時間後に培地を採集した。１００μｌの培養上清に１０μｌの１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加え冷却（０℃，１０分）することによりタンパクを沈殿させ、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ウエスタン・ブロッティングを常法により行い、ＥＰ−３８６，７５２の参考例１に示した抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体を用いて組換え体を検出した〔図１１〕。この系ではｐＴＢ１３３９が最もよく組換え体を産生した。〔図１１〕において、レーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報に記載の方法で得られたポリペプチド（Ｉ）の、レーン２はプラスミドｐＴＢ１０５９によるＣＯＳ上清の、レーン３はプラスミドｐＴＢ１３４４によるＣＯＳ上清の、レーン４はプラスミドｐＴＢ１３３９によるＣＯＳ上清の結果をそれぞれ示す。
【００３５】
参考例１２
参考例９で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株をそれぞれ用い大量培養による調製を行った。調製法を参考例１０を基にし、一部以下のように改変した。
培養は５％牛胎仔血清，３５μｇ／ｍｌプロリン，５０μｇ／ｍｌカナマイシン，２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地で２×１０^４／ｃｍ^２の濃度で播種し、５％ＣＯ_２存在下，３７℃，７日間培養した。培養上清を採集後、１％牛胎児血清−３５μｇ／ｍｌプロリン−５０μｇ／ｍｌカナマイシン−２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地（１：１混合培地）（以下、調製培地と略す）に置き換え３〜４日間培養した。この培養上清を採集後、さらに調製培地で３〜４日培養し培養上清を採集した。１２０枚の１０ｃｍシャーレからこの一連の培養で５リットルの培養上清を得ることができた。これを２回くり返し１０リットルの培養上清を得た。培養上清は−２０℃で保管した。参考例１０記載の方法で培養上清を処理し、Ｓ−セファロースカラム（径５ ×２０ｃｍ）にかけた。参考例１０に記載した方法により活性画分を溶出し、１２ｍｌ／フラクションずつ分画した〔図１２〕。この画分に対し、５０％飽和になるように硫安を加え、０℃で２時間放置し、遠心（１００００ｒｐｍ，１５分，４℃，サーバルＳＳ３４ローター（ＵＳＡ））により沈殿を回収した。沈殿を４０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１ｍＭＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳに溶解した。ゲル濾過を行う前に遠心（１５０００ｒｐｍ，１５分，４℃，サーバルＳＳ３４ローター）し、不溶性物質を除いた。ゲル濾過は参考例１０に記載の方法で行った。ただし、カラムは径２．６ｃｍ×９０ｃｍのものを用い、流速は１００ｍｌ／ｈ，サンプル量１０ｍｌにした〔図１３〕。溶出画分はウルトラフリー２０（ミリポア，ＵＳＡ）で濃縮した。これを参考例１０記載の方法で逆相クロマトグラフィーを行い精製した（１ｍｌ／フラクション）〔図１４〕。これらの各ステップでの精製過程を表１に示す。
これらについてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図を〔図１５〕および〔図１６〕に示した。最終標品は、ほぼ単一のバンドを示した。以上のことから、約１０リットルの培養上清から組換え標品が２１０μｇ得られたことがわかった。
なお、〔図１５〕は銀染色の結果を、〔図１６〕は、ウエスタンブロッティングの結果をそれぞれ示す。〔図１５〕および〔図１６〕において、レーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報に記載の方法で得られたポリペプチド（Ｉ）０．０１μｇについての、レーン２はＣＨＯ−Ｎ２−１細胞培養上清１０μｇについての、レーン３はＳ−セファロース素通し画分１０μｇについての、レーン４はＳ−セファロース溶出画分１μｇについての、レーン５は硫安沈殿画分１μｇについての、レーン６はゲル濾過溶出画分０．１μｇについての、レーン７は逆相ＨＰＬＣ溶出画分０．１μｇについての結果をそれぞれ示す。
なお、精製開始時は、総タンパクの０．００１〜０．０１％程度のものが、最終的には純度９５％以上にまで精製（効率１０^４倍）されていることを示すためにウエスタンブロッティング〔図１６〕と銀染色〔図１５〕を並置した。
【００３６】
【表１】

【００３７】
参考例１３精製組換え体の生物活性（Ｉ）
参考例１２で得られた最終精製標品について、参考例５で示した方法により生物活性を測定した。コントロールとしてマウスβＮＧＦ（和光純薬）を用いた。結果を〔図１７〕に示す。〔図１７〕において■はマウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ−２／ＮＴ−３の結果をそれぞれ示す。〔図１７〕に示すようにＮＧＦ−２／ＮＴ−３は、この系においてβＮＧＦよりも活性が弱いことがわかった。
【００３８】
参考例１４精製組換え体の生物活性（ＩＩ）
ラットＰＣ１２細胞に対する生物活性を測定した。活性測定法はバイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ１７１巻１１６〜１２２頁（１９９０年）に記載の方法により行った。この結果を〔図１８〕に示した。〔図１８〕において、■はマウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ−２／ＮＴ−３の結果をそれぞれ示す。組換え型ＮＧＦ−２はＰＣ１２細胞に対し神経突起の伸長を惹き起こす活性は非常に低く、マウスβＮＧＦ（和光純薬）に対して１／１０^３かそれ以下の活性であることがわかった。
【００３９】
参考例１５
参考例９で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株を、参考例１０と同様に播種，培養した。培地を無血清培地（Ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ；コスモバイオ社）に交換し、さらに２日間培養した。１リッターの培養上清を１００個の１０−ｃｍ皿から集めた。０．５ｍＭＰＭＳＦと１ｍＭのベンズアミジンを集められた培養上清とカラムの緩衝液に加えて、参考例１０と同様の方法でＮＧＦ−２／ＮＴ−３を精製した。逆相ＨＰＬＣによって、保持時間が２４分（Ｐ１），２６分（Ｐ２）および２８分（Ｐ３）の３つのピークを与えた〔図１９〕。
Ｐ２とＰ３は、ニワトリ胎仔ＤＲＧ神経に対する生物的活性を有していたが、Ｐ１は有していなかった。Ｐ２蛋白質は、ＰＡＧＥにおいて大腸菌により生産された組換えＮＧＦ−２と同時に移動したが、Ｐ３蛋白質はそれらより少しさらに速く移動した〔図２１〕。Ｐ２蛋白質のみが、ウエスタン・ブロッティングにより、抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ−末端ペプチド抗体（ＥＰ−Ａ−３８６，７５２の参考例２で得られたもの）を認識した〔図２０〕。〔図２０〕において、レーン（ａ）は大腸菌形質転換体により生産されたＮＧＦ−２を、レーン（ｂ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２４（Ｐ１）を、レーン（ｃ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２６（Ｐ２）を、レーン（ｄ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２８（Ｐ３）をそれぞれ示す。
〔図２１〕において、レーン（ｅ）は大腸菌形質転換体により生産されたＮＧＦを、レーン（ｆ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２５を、レーン（ｇ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２６（Ｐ２）を、レーン（ｈ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２７を、レーン（ｉ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２８（Ｐ３）を、レーン（ｊ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２９をそれぞれ示す。
Ｎ末端アミノ酸を分析したところ、Ｐ２は成熟型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３のＮ末端配列と一致したが、Ｐ３はＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３に相当することが分かった〔表２〕。
【００４０】
【表２】

【００４１】
実施例１（ヒト末梢血リンパ球に対するＮＧＦ−２／ＮＴ−３の効果）
ヒト静脈より採取したヒト末梢血を、ＬＳＭ（リンホサイトセパレーティングメディウム，ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａＣｏｒｐ．）上に重層し、２０００ｒｐｍで３０分間室温にて遠心分離に付した。界面の、リンパ球からなる白濁層を集め、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５００ｒｐｍ，５分間の遠心操作を２回繰り返して洗浄した。このリンパ球画分をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、あらかじめ牛胎児血清（ＦＣＳ）でコーティングしておいてプラスチックディッシュ上に播種した。５％炭酸ガスふ卵器内で、３７℃，１時間インキュベートしたのち、シャーレ器壁に接着しなかった細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔｃｅｌｌｓ）を集めＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。このようにして調製したヒト末梢血由来リンパ球細胞を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（組換え型，Ｇｅｎｚｙｍｅ社）５，５０および５００Ｕ／ｍｌまたはヒトＮＧＦ（組換え型，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１，１１６（１９９０））５，５０および５００ｎｇ／ｍｌまたは上述の参考例１２で得られたＮ末端５残基欠失型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３５，５０および５００ｎｇ／ｍｌをそれぞれ含む寒天培地（０．３％バクトアガー，２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し（１×１０^６細胞／ｍｌ）、径３５ｍｍディッシュあたり１ｍｌを播種した。
寒天が固化したのち、炭酸ガスふ卵器（５％ＣＯ_２）内で、３７℃にて２週間培養し、細胞数が５０ケ以上となったコロニー数を計数した結果を〔図２３〕に示した。
〔図２３〕から明らかな如く、Ｎ末端５残基欠失型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の添加により、ヒト末梢血リンパ球のコロニー形成は、ＧＭ−ＣＳＦまたはＮＧＦを添加した場合と同様に明らかに促進された。
【００４２】
実施例２注射剤の製造
１ｍｌあたり参考例１２で得られたＮ末端５残基欠失型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３０．５ｍｇ，シュークロース１０ｍｇおよびクエン酸ナトリウム１５ｍｇを含む水溶液（ｐＨ７．４）を調製して、安定な注射液を得る。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含有する治療剤は、動物の末梢血中の血球に作用し増殖促進作用を示す。したがって、本発明の治療剤は、様々の原因による好中球減少症に対して有効な治療剤として用いることができ、さらに、感染症や腫瘍の治療にも有効である。
【００４４】
【００４５】
【配列表】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【００５５】

【図面の簡単な説明】
【図１】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１０５９の構築図を示す。
【図２】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９の構築図を示す。
【図３】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９の構築図を示す。
【図４】参考例６で得られた、プラスミドｐＴＢ１３４４の構築図を示す。
【図５】参考例６で得られた、プラスミドｐＴＢ１３４４の構築図を示す。
【図６】参考例６で得られた、プラスミドｐＴＢ１３４４の構築図を示す。
【図７−１】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ−２／ＮＴ−３のプロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図７−２】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ−２／ＮＴ−３のプロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図８−１】参考例６で得られたプラスミドｐＴＢ１３４４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ，ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図８−２】参考例６で得られたプラスミドｐＴＢ１３４４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ，ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図９】参考例１０で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１０】参考例１０で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１】参考例１１で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１２】参考例１２で得られた、ＣＨＯ−Ｎ２−１株の培養上清のＳ−セファロースカラムの溶出画分を示す。
【図１３】参考例１２で得られた、ゲル濾過の溶出画分を示す。
【図１４】参考例１２で得られた、逆相クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１５】参考例１２で得られた、各精製過程における生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１６】参考例１２で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１７】参考例１３で得られた、生物活性の測定結果を示す。
【図１８】参考例１４で得られた、生物活性の測定結果を示す。
【図１９】参考例１５で得られた、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２０】参考例１５で得られた、ウエスタン・ブロッティングの結果を示す。
【図２１】参考例１５で得られた、ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２２】ヒトＮＧＦ−２のアミノ酸配列を示す。
【図２３】実施例１で得られた、ヒト末梢血リンパ球に対するＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の効果を示す。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a therapeutic agent for neutropenia containing human nerve growth factor 2 (NGF-2).
[0002]
[Prior art]
The neurotrophic factor group includes nerve growth factor (NGF) in Levi-Montartini, Annual New York Academy of Science (Anu. NY Acad. Sci) 55, 330 (1952) and Coen. Cohen et al., A number of factors have been discovered since they were found by the Proc. Of Natl. Acad. Sci. USA 40, 1014 (1954). These factors are thought to be responsible for various functions such as differentiation, maturation, survival, function maintenance, and proliferation of nerve cells. Specific examples of these factors are, in addition to NGF mentioned above, brain-derived neurotrophic factor BDNF, Barde YA, et al, Embo Journal (EMBO J.). 1 , 549-553 (1982)), ciliary neurotrophic factor; CNTF, Watters. D. et al, Journal of Neurochemistry. 49 , 705-713, (1987).
Human nerve growth factor 2 (NGF-2) is shown as polypeptide (I) in European Patent Application Publication No. 386,752, and is also known as FEBS Letters, 266 , 187-191 (1990). The same factors are described by Hohn et al., Nature, 344 , 399 (1990) and the like, and is disclosed in PCT Publication WO 91/03569 as NT-3.
The human nerve growth factor 2 may be abbreviated as human NGF-2 / NT-3 in this specification. Regarding human NGF-2 / NT-3, (1) the human NGF-2 / NT-3 gene is strongly expressed in the hippocampus and cerebellum in the kidney and brain. (2) Expression is stronger in neonates than in mature animals. (3) NGF and BDNF exert an effect on nerve cells that show no or weak effect (for example, neurons derived from nodose ganglion). These facts suggest that NGF-2 / NT-3 plays an important role during the development of the nervous system.
In blood cell differentiation, pluripotent stem cells first differentiate into lymphoid stem cells and myeloid stem cells. The lymphoid stem cells then undergo several processes to differentiate into T lymphocytes and plasma cells. Myeloid stem cells undergo differentiating processes into basophils, eosinophils, monocytes and macrophages, neutrophils, megakaryocytes and erythrocytes. A number of hematopoietic factors (such as colony stimulating factors and interleukins) have been shown to be involved in each of these differentiation processes, some of which are known to be clinically useful. .
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Hematopoietic factors such as various colony stimulating factors and interleukins are factors that act in the differentiation process of blood cells, and are used in the blood cells in the peripheral differentiation process in peripheral blood, such as basophils, eosinophils, monocytes, and neutrophils. Very few act and cause them to multiply. For example, it is known that NGF promotes peripheral blood lymphocyte colony formation [Proceding of National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 85 , 6508 (1988)].
NGF-2 / NT-3 has been attempted to be applied to the treatment of various diseases of the central nervous system, but the present invention applies the fact that this factor has the effect of causing blood cells in peripheral blood to proliferate. It is intended to be used as a therapeutic agent for neutropenia and also for infections and tumors.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that NGF-2 / NT-3, which is structurally different from the above-mentioned NGF, has an activity of stimulating the proliferation of differentiated blood cells in peripheral blood. It was found that it caused a marked increase in blood cells and was very effective in treating neutropenia, and was thought to be effective in treating infectious diseases and tumors. As a result, the present invention has been completed.
[0005]
The present invention is a therapeutic agent for neutropenia containing NGF-2 / NT-3.
As the NGF-2 / NT-3 active substance, any substance may be used as long as it has a neurotrophic factor activity, that is, an action such as differentiation, survival and function maintenance of nerve cells. For example, natural NGF-2 / NT-3 produced in animals or animal cells, NGF-2 / NT-3 produced by genetic recombination technology, and related substances thereof can be mentioned. The above NGF-2 / NT-3 and related substances may or may not have a sugar chain in the peptide chain.
Specifically, for example, a polypeptide (I) having an amino acid sequence represented by [FIG. 22] (SEQ ID NO: 12, where X is Arg or Arg Thr) (human NGF-2 / NT-3) (EP-386,752, JP-A-3-204897) or a fragment comprising a partial amino acid sequence required for its biological or immunological activity. Examples of the above fragments include fragments lacking five amino acid residues from the amino terminus of polypeptide (I) (EP-A-499,993) and fragments lacking several amino acid residues at the carboxyl terminus. Can be Further, muteins of the polypeptide (I) having the amino acid sequence shown in FIG. 22 can also be used in the present invention.
[0006]
Such muteins of NGF-2 / NT-3 are mainly obtained by modifying the amino acid sequence of the original peptide or protein. Such modifications include addition of one or more amino acids, deletion of one or more constituent amino acids, and substitution of one or more constituent amino acids with other amino acids. Furthermore, NGF-2 / NT-3 muteins introduced at glycosylation sites are also included in this modification.
The addition of the above amino acid includes at least one methionine derived from the initiation codon used for peptide expression or as a signal peptide as long as the activity of NGF-2 / NT-3 is not lost. Refers to the addition of amino acids. Some or all of the amino acid sequences of proteins having similar activity to NGF or BDNF exhibiting the same activity as NGF-2 / NT-3 are mentioned as preferred amino acids for addition.
The amino acid to be deleted is a deletion of at least one amino acid of the NGF-2 / NT-3 constituent amino acids within a range not losing the activity of NGF-2 / NT-3 and excluding cysteine. No. Mutein in which 1 to 7, preferably 1 to 5 amino acids have been deleted from the amino terminus of polypeptide (I), or 41 to 48, 57 to 61 and 91 to 94 of polypeptide (I) Muteins in which one or more amino acids have been deleted from the amino acid region are examples.
[0007]
Substituting the constituent amino acids with the above other amino acids includes at least one NGF-2 / NT-3 constituent amino acid excluding cysteine as long as the activity of NGF-2 / NT-3 is not lost. Substitutions with at least one different amino acid are included. These substituted constituent amino acids include isoleucine, lysine, threonine, alanine, serine, proline, valine, glutamic acid, arginine, glycine, and asparagine. The substitution position is the amino acid residue in the amino acid sequence of FIG. Substitution in the region of base numbers 41 to 48, 57 to 61 and 91 to 94 is mentioned as a preferable example.
For example, when the constituent amino acid is isoleucine, the substituted amino acids include asparagine, threonine, valine, lysine, glycine, serine and proline.
When the constituent amino acid is arginine, the substituted amino acids include glutamic acid, lysine and alanine.
When the constituent amino acid is glycine, the substituted amino acids include threonine, isoleucine, lysine, glycine, serine, asparagine, proline and valine.
When the constituent amino acid is serine, the substituted amino acids include isoleucine, glutamic acid, threonine, glycine, asparagine, proline, valine and lysine.
[0008]
When the constituent amino acid is valine, the substituted amino acids include serine, isoleucine, proline, glycine, threonine, lysine and asparagine.
When the constituent amino acid is lysine, the substituted amino acids include isoleucine, threonine, glycine, asparagine, serine, proline, glutamic acid, alanine, arginine and valine.
When the constituent amino acid is threonine, the substituted amino acids include isoleucine, lysine, glycine, asparagine, serine, proline and valine.
When the constituent amino acid is asparagine, the substituted amino acids include isoleucine, threonine, glycine, lysine, serine, proline, glutamic acid and valine.
When the constituent amino acid is proline, the substituted amino acids include isoleucine, lysine, glycine, asparagine, serine, threonine and valine.
When the constituent amino acid is alanine, the substituted amino acids include glutamic acid, lysine and arginine.
When the constituent amino acid is glutamic acid, the substituted amino acids include alanine, lysine, serine, asparagine and arginine.
[0009]
In the above substitution, substitution of at least two constituent amino acids can be performed simultaneously, and substitution of two or three constituent amino acids is particularly preferable.
Muteins can also be obtained by a combination of two or three of the above additions, deletions and substitutions.
To obtain these muteins, site-directed mutations can be used. This technique is described in R. F. Lather and J.M. P. It is well known as described in Lecoq's Genetic Engineering, pages 31-50, Academic Press (1983). Mutations to the oligonucleotide are described in Smith and S.M. See Gillam's Genetic Engineering: Principles and Methods, 3, 1-32, Plenum Press (1981).
[0010]
The NGF-2 / NT-3 may be chemically modified, such as a polyethylene glycol derivative.
Particularly, in the present invention, it is preferable to use human NGF-2 / NT-3 having the amino acid sequence shown in FIG. 22. In this case, it is preferable that human NGF-2 / NT-3 has a methionine residue (Met) at the amino terminal. It may be a mixture with a compound having no Met at the amino terminus and starting with tyrosine (Tyr) (EP-A-499,993).
[0011]
Since NGF-2 / NT-3 in the present invention has low toxicity, it can be used safely.
The NGF-2 / NT-3 of the present invention increases blood cells in peripheral blood, for example, basophils, eosinophils, monocytes, neutrophils, etc., and enhances their functions. Therefore, the NGF-2 / NT-3 of the present invention can be used as a therapeutic agent for neutropenia in animals, and further can be used as a therapeutic agent for infectious diseases and tumors.
Examples of the animals include warm-blooded mammals, and examples include mice, cats, cows, sheep, goats, pigs, rabbits, and humans.
[0012]
When the therapeutic agent of the present invention is administered to an animal, it improves neutropenia and symptoms associated with infectious diseases, and promotes healing. The therapeutic agent of the present invention exhibits an antitumor effect when administered to an animal.
The administration is generally performed parenterally, and can be preferably performed, for example, by injecting the therapeutic agent of the present invention into the animal.
The amount of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the method of use, the purpose of use, and the like. When used as an NGF-2 / NT-3 protein by injection, for example, a daily dose of about 0.02 μg / Kg to 0.02 mg / kg is preferred.
[0013]
When the therapeutic agent of the present invention is prepared as an aqueous solution, NGF-2 / NT-3 may be prepared from an aqueous solvent (eg, distilled water), a water-soluble solvent (eg, physiological saline, Ringer's solution), an oily solvent (eg, sesame oil). , Olive oil) or solubilizers (eg, sodium salicylate, sodium acetate), buffers (eg, sodium citrate, glycerin), tonicity agents (eg, glucose, invert sugar), stabilizers if desired (Eg, human serum albumin, polyethylene glycol), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol), and soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride), and are manufactured by conventional means. .
The pH of the aqueous solution is adjusted to about 3 to 8, more preferably about 5 to 7. The pH is adjusted to the above range by adding, for example, a dilute acid (eg, dilute hydrochloric acid) or a dilute alkali (eg, dilute sodium hydroxide, dilute sodium hydrogen carbonate).
When the therapeutic agent of the present invention is prepared as a solid form, for example, NGF-2 / NT-3 is freeze-dried or solid form (eg, powder form) of NGF-2 / NT- 3, diluents (eg, distilled water, physiological saline, glucose), excipients (eg, carboxymethyl cellulose (CMC), sodium alginate), preservatives (eg, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, phenol), A soothing agent (glucose, calcium gluconate, procaine hydrochloride) or the like can be mixed, and the mixture can be manufactured into a solid intramuscular injection preparation by conventional means.
[0014]
When formulating the therapeutic agent of the present invention, human serum albumin (HSA) is further added to an aqueous solvent containing NGF-2 / NT-3 and adjusted to show a pH of 3 to 8 in a solution state. This is advantageous because the decrease in NGF-2 / NT-3 activity during freezing and freeze-drying operations is small, and the freeze-dried product has a clear dissolved state upon redissolution.
As the HSA, any HSA can be used. However, in order to apply the present composition to clinical applications, it is preferable that the HSA has a quality sufficient for parenteral administration.
For example, a product obtained by fractionating and purifying healthy human plasma as a raw material by Cohn's sixth method for ethanol fractionation is used.
Further, those containing sodium acetyltryptophan or sodium caprylate as a stabilizer may be used.
When each component is used as an aqueous solution, HSA is preferably contained in an amount of about 0.1 mg to 50 mg, particularly about 0.5 mg to 20 mg, per 1 ml of the aqueous solution.
[0015]
In formulating the therapeutic agent of the present invention, in addition to the above-mentioned HSA, amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid, alanine, and proline, especially monoamino aliphatic amino acids, or cyclic amino acids, monosaccharides such as glucose and mannose, sorbit, One or more sugar alcohols such as mannitol and physiologically acceptable salts or derivatives thereof may be blended.
When NGF-2 / NT-3 is used as an aqueous solution, it is preferable to mix about 10 to 100 mg of monosaccharide or sugar alcohol and about 5 to 50 mg of amino acid per 1 ml of the aqueous solution.
In the above formulation, when an acidic amino acid such as glutamic acid is added in order to adjust the aqueous solution to a pH of about 3 to 8, preferably about 5 to 7 in a solution state, the substance is added to the above-mentioned predetermined amount. The pH can be adjusted to a predetermined pH by addition, or if desired, or if the above-mentioned acidic amino acid is not added, to a predetermined pH with a mineral acid such as hydrochloric acid or phosphoric acid, or a buffer such as succinic acid, tartaric acid, or citric acid. adjust.
[0016]
The therapeutic agent of the present invention is preferably in the form of an aqueous solution, a frozen product or a lyophilized product, particularly preferably a lyophilized product.
The therapeutic agent of the present invention can be more preferably produced by, for example, the following method in order to prevent the attenuation of the NGF-2 / NT-3 active substance.
If necessary, HSA is added to the aqueous solution containing the NGF-2 / NT-3 active substance to the above-mentioned predetermined concentration, and the pH is adjusted by the above-mentioned method.
If desired, monosaccharides, sugar alcohols, amino acids and the like can also be added at the concentrations described therein. If desired, a tonicity agent, a surfactant and the like can be added. When a substance other than HSA is added, the pH is adjusted by the method described above so that the pH of the final aqueous solution indicates the above pH. The therapeutic agent of the present invention as an aqueous solution thus obtained can also be used as a raw material for the following frozen and lyophilized products.
[0017]
The therapeutic agent of the present invention as a frozen product can be produced, for example, by freezing the above aqueous solution usually at about -80 to -20 ° C. Preferably, the frozen composition is stored at about -80 to -10C.
The therapeutic agent of the present invention as a lyophilized product may be obtained by, for example, drying the above-mentioned frozen composition under reduced pressure by an ordinary method or subdividing the above-mentioned aqueous solution or an aqueous solution obtained by thawing the above-mentioned frozen composition, if desired, and freezing as described above. It can be manufactured by drying under reduced pressure by a conventional method.
The lyophilized product produced by the above-mentioned method is reconstituted with a dissolving solution containing, for example, the above-mentioned monosaccharides, isoalcohols, amino acids, etc., and optionally adjusted to pH with hydrochloric acid or the like to obtain a solution state. The therapeutic agent of the present invention can be manufactured.
[0018]
When producing the lyophilized therapeutic agent of the present invention as an injectable preparation, an aqueous solution of NGF-2 / NT-3 and an aqueous solution containing a compounding agent are respectively sterilized and mixed, or these mixed solutions are subdivided. It is preferable to purify by sterilization filtration or the like before performing the above, dispense and divide into vials and the like by aseptic operation, and then subject to the freeze-drying treatment. In this case, the stability of the composition can be enhanced by evacuating the space of the container or replacing the container with nitrogen gas.
When the lyophilized product is dissolved in an aqueous solution containing amino acids, monosaccharides or sugar alcohols, the aqueous solution is sterilized and filtered, dispensed into ampoules or the like by aseptic operation, and then steamed in a usual manner. It is preferable to use a sterilized one.
[0019]
To administer the therapeutic agent of the present invention, when the composition is an aqueous solution, it is used as a solution for injection as it is.
When the composition is in a solid form by freeze-drying, it is dissolved in distilled water or physiological saline and used as a solution for injection. If desired, the same monosaccharides, sugar alcohols, amino acids, and the like as described above may be contained, and the mixture may be used after dissolving in a dissolution solution whose pH has been adjusted as described above.
The therapeutic agent comprising NGF-2 / NT-3 of the present invention significantly increases peripheral blood cells and enhances function.
Therefore, the therapeutic agent of the present invention is effective for treating neutropenia and can be used for treating infectious diseases and tumors.
[0020]
In the specification and drawings of the present invention, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are as follows. When amino acids may have optical isomers, L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA deoxyribonucleic acid
A Adenine
C Cytonin
G guanine
T thymine
Ala: Alanine
Arg: Arginine
Asn: Asparagine
Asp: Aspartic acid
Cys: cysteine
Gln: Glutamine
Glu: glutamic acid
Gly: glycine
His: histidine
Ile: Isoleucine
Leu: Leucine
Lys: lysine
Met: methionine
Phe: phenyl alanine
Pro: Proline
Ser: Serine
Thr: Threonine
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosine
Val: Valine
The transformant CHO-N2-1 obtained in Reference Example 9 described later has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the accession number IFO 50307 since January 22, 1991, and the transformant The body has been deposited on January 29, 1991 with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (FRI) of the Ministry of International Trade and Industry under the deposit number FERM BP-3255.
[0021]
Reference Example 1 Construction of human NGF expression vector (1)
After infecting E. coli NM538 with a λEMBL3 genomic library (Clontech) prepared from human leukocyte DNA, about 3 × 10 ⁴ Each clone was sown. The plaque was transferred onto a nylon membrane (Amersham, Hibond-N), immersed in a 0.5 N NaOH-1.5 M NaCl solution for 6 minutes to denature the phage DNA, and then 0.5 M Tris-HCl (pH 8). .0) -1.5 M NaCl solution for 6 minutes. This membrane was immersed in a 2 × SSC solution, air-dried, and then treated at 80 ° C. for 2 hours to fix DNA to the membrane.
On the other hand, known [Ullrich, A., et al., Nature. 303 , 821 (1983)], a DNA (0.38 kb) encoding human βNGF was chemically synthesized with reference to the human NGF gene, and this was synthesized using a DNA labeling kit (Nippon Gene). ³² Those labeled with P were used as probes.
The DNA-immobilized filter was washed with a 6 × SSC (1 × SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate), 5 × Denhardt's, 0.5% SDS, 20 μg / ml denatured salmon containing a labeled probe. The solution was kept at 65 ° C. for 16 hours in 10 ml of sperm DNA solution. After the reaction, the filter was washed three times for 5 minutes each at room temperature in a 2 × SSC, 0.1% SDS solution at 60 ° C. for 60 minutes in a 1 × SSC, 0.1% SDS solution. After drying the washed filter, a radioautogram was taken to search for a clone that reacted with the probe. Phage DNA was extracted from the clone λβLN2113 obtained by this method by the method of Davis et al. (Davis et al., [Advanced Bacterial Genetics], Cold Spring Harbor Laboratory 1980).
Next, λβLN2113 was cut with SmaI and ApaI to cut out a DNA (about 1 kb) containing the human NGF gene, and inserted into the SmaI and ApaI sites of plasmid pBluescript II SK + (+ is superscript) (Stratagene, USA). pNGF107G was obtained.
In addition, pNGFP108G was obtained by inserting the same DNA fragment into the SmaI and ApaI sites of pBluescript II SK￣ (Stratagene). The nucleotide sequence of the part inserted into pNGFP107G and pNGFP108G was determined using Sequenase (United States Biochemical Corporation). The determined nucleotide sequence completely coincided with the sequence described in Nature, 303, 821 (1983) in the protein coding region.
The phage λβLN2113 DNA was digested with the restriction enzyme Bgl II, and a DNA fragment (1.8 kb) containing human NGF was isolated. On the other hand, the expression vector pKSV-10 (Pharmacia) for animal cells was digested with the restriction enzyme BglII, and ligated to the above DNA fragment (1.8 kb) containing the human NGF gene with T4 DNA ligase. Using this reaction solution, Escherichia coli DH1 was transformed, and a plasmid isolated from one of the ampicillin-resistant transformants [Escherichia coli DH1 / pMNGF101] was named pMNGF101.
[0022]
Reference Example 2 Construction of human NGF expression vector (2)
The plasmid pNGFP107G obtained in Reference Example 1 was digested with restriction enzymes BclI and ApaI, and a DNA fragment (0.8 kb) containing the human NGF gene was isolated. This 0.8 kb BclI-ApaI fragment and the chemical synthesis adapters SN1, SN2 and SN3 are mixed, ligated with T4 DNA ligase, and then cut with Bgl II to obtain a 0.8 kb Hind III-Bgl II DNA fragment. Was done.
[0023]

1. Plasmid pSV2-gpt [Science, 209, 1422 (1980)] is cut with restriction enzymes EcoRI and Hind III, and contains the SV40 promoter. A 6 kb EcoRI-Hind III DNA fragment was isolated. Next, a 1.6 kb Bgl II-EcoRI fragment containing a polyA addition region was isolated from the plasmid pMTVdhfr [Nature, 294, 228 (1981)].
The 2.6 kb EcoRI-HindIII DNA fragment containing the SV40 promoter, the 0.8 kb HindIII-BglII DNA fragment containing the human NGF gene, and the 1.6 kb BglII-EcoRI fragment containing the polyA addition region were ligated with T4 DNA ligase. did. Using this reaction solution, Escherichia coli DH1 was transformed, and a plasmid isolated from an ampicillin-resistant transformant [Escherichia coli DH1 / pMNGF201] was named pMNGF201.
[0024]
Reference Example 3 Construction of human NGF expression vector (3)
Plasmid pMNGF201 obtained in Reference Example 2 was digested with Hind III, blunted by DNA polymerase Klenow fragment reaction, and then digested with Bgl II to isolate a DNA fragment of about 0.8 kb. On the other hand, plasmid pTB399 (described in JP-A-61-63282) was digested with EcoRI, blunted by Klenow fragment reaction, and then digested with BglII to obtain an approximately 3.9 kb DNA fragment. These two DNA fragments were circularized by a T4 DNA ligase reaction to obtain a plasmid pTB1054.
[0025]
Reference Example 4 Construction of Human NGF-2 / NT-3 Expression Vector
(1) Plasmid pHNT2 containing human NGF-2 / NT-3 cDNA (see European Patent Application Publication No. 386,752) was cut with a restriction enzyme StuI, and a Bgl II linker was ligated with T4 DNA ligase. This DNA was cleaved with restriction enzymes EcoRI and BglII to obtain a 1.0 kb DNA fragment containing human NGF-2 / NT-3 cDNA. On the other hand, an expression plasmid pTB399 for animal cells (Cell Structure and Function.) 12 , 205 (1987)) with the restriction enzymes EcoRI and Bgl II to obtain a DNA fragment of about 3.8 kb. Both DNA fragments were ligated with T4 DNA ligase to obtain plasmid pTB1055.
Next, plasmid pTB348 (described in JP-A-61-63282) having hamster dihydrofolate reductase (DHFR) cDNA was digested with restriction enzymes SalI and HindIII, and plasmid pTB1055 was digested with restriction enzymes SalI and HindIII. By ligating the approximately 2.6 kb DNA fragment obtained by the cleavage, plasmid pTB1059 was obtained (see FIG. 1).
[0026]
(2) The human NGF-2 / NT-3 gene contained in the plasmid pHNT2 described in the above item (1) has an inframe ATG sequence 5 ′ upstream (see EP-A-386,752). 2). In order to remove the ATG sequence, the following two DNA oligomers were synthesized.
[0027]
Primer 1: 5'TAC AGG TGA ATT CGG CCA TGT CCA TCT TG 3 '(SEQ ID NO: 4)
Primer2: 5'AGA GAT GCG AAT TCA TGT TCT TC 3 '(SEQ ID NO: 5)
Using

Primers

1 and 2, polymerase chain reaction (PCR) was performed according to the following procedure. Plasmid pHNT2 was digested with the restriction enzyme BamHI to make it linear, extracted with phenol, extracted with ethanol, evaporated to dryness, and dissolved in distilled water. PCR was performed using GeneAmp ™ DNA amplification reagent kit (Perkin-Elmer Cetus USA) with 0.3 ng of the above-mentioned linear pHNT2 as a template DNA, and Primer1 and Primer1 as primers at 1.0 μM each. . The reaction was carried out using a DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) at 94 ° C., 1 minute, 55 ° C., 2 minutes, 72 ° C., 3 minutes 30 times. As a result, a DNA fragment of about 0.8 kb was obtained. Since

Primer

1 and 2 have a recognition site for the restriction enzyme EcoRI, the obtained fragment was cut with EcoRI and subcloned into the EcoRI site of pUC119. When the base sequence was confirmed from single-stranded DNA obtained by introducing this recombinant primer pTB1337 into Escherichia coli MV1184, it was found that the gene was amplified without any single base error. This pTB1337 was cut out with restriction enzymes EcoRI and ApaI to obtain a 0.23 kb DNA fragment. The 0.23 kb DNA was ligated to about 4.6 kb DNA obtained by cutting the plasmid pTB1055 described in the above item (1) with restriction enzymes EcoRI and ApaI, to obtain a plasmid pTB1338.
pTB1338 was digested with restriction enzymes SalI and HindIII, and the hamster DHFR gene was introduced in the same manner as in the above (1) to obtain an expression plasmid pTB1339 (see FIGS. 2 to 3).
The DNA encoding the pro-region of NGF-2 / NT-3, the DNA encoding NGF-2 / NT-3, and the DNA in the vicinity thereof present on the plasmid pTB1339 are shown in FIG. 2] (SEQ ID NO: 6).
[0028]
Reference Example 5 Measurement of biological activity of human NGF-2 / NT-3
Dorsal root ganglion (hereinafter referred to as DRG) was excised from a fetus in which embryos were generated by shaking chicken embryos at 37.5 ° C. for 8 to 10 days using an incubator. The DRG was treated with a 0.125% trypsin-PBS solution at 37 ° C. for 20 minutes, and the cells were dispersed by pipetting. This was suspended in 10% fetal bovine serum-Dulbecco's modified MEM medium-50 μg / ml kanamycin, and was suspended at 37 ° C. in 5% CO 2. ₂ By culturing for 2 to 4 hours in the presence, fibroblasts and the like were attached to a culture dish, and only non-adhered cells were collected. Non-adherent cells were collected by centrifugation (800 rpm, 5 minutes), 10% fetal calf serum-Dulbecco's modified MEM medium / Ham F-12 medium (mixing ratio 1: 1) -1 μM cytosine arabinoside (AraC, Sigma, USA) ) The cells were resuspended at 10,000 cells / ml in a medium containing -50 µg / ml kanamycin, and seeded at a rate of 0.5 ml / well on a poly-L-ornithine-coated 48-well plate. To this medium, 0.5 to 20 μl of a solution to be a sample is added. ₂ The cells were cultured in the presence for 3 days, and the number of viable cells was counted.
[0029]
Reference Example 6 Construction of Human NGF-2 / NT-3 Expression Vector
Plasmid pHNT5 (the direction of the EcoRI inserted fragment of pHNT2 was reversed) was introduced into E. coli MV1183 to prepare a (-) single-stranded DNA by a conventional method. On the other hand, human NGF (-) chain single-stranded DNA was prepared using the plasmid pNGFP108G (see Reference Example 1). In contrast,
oligo1; 5 'AGGAGCAAGCGCTCATCATCCCA 3' (SEQ ID NO: 7)
oligo2; 5'TCACGGCGGAAGCGCTACGCGGAGCAT 3 '(SEQ ID NO: 8)
Was synthesized, and a site-specific base mutation was introduced using this to introduce a recognition site (AGCGCT) for the restriction enzyme Eco47III in each of NGF and NGF-2 / NT-3. This reaction is described in in vitro Mutagenesis System, Ver. 2.0 (Amersham, UK) was used. As a result, a plasmid pTB1340 having an Eco47III site in the human NGF gene and a plasmid pTB1341 having an Eco47III site in the human NGF-2 / NT-3 gene were obtained. By cutting pTB1340 with restriction enzymes KpnI and Eco47III, a DNA fragment of about 3.0 kb was obtained. By cutting pTB1341 with restriction enzymes KpnI and Eco47III, a 0.67 kb DNA fragment was obtained. The two were ligated with T4 DNA ligase to obtain a plasmid pTB1342 having a gene coding for a hybrid protein having a prepro region of NGF and a nature region of NGF-2 / NT-3. After pTB1342 was cleaved with the restriction enzyme StuI, a synthetic Bal II linker was ligated, and this was cleaved with the restriction enzymes MluI and BglII to obtain a 0.8 kb DNA fragment. This was inserted into a DNA fragment of about 4.1 kb obtained by digesting pTB1054 (see Reference Example 3) with restriction enzymes MluI and BglII to obtain an expression plasmid pTB1343 (see FIGS. 4 to 6). ). Further, a DNA fragment of about 2.6 kb obtained by digesting this with SalI and HindIII was inserted into the SalI-HindIII site of pTB348 to obtain pTB1344 (see FIGS. 4 to 6).
The DNA encoding the NGF pro region, the DNA encoding NGF-2 / NT-3, and the DNA around the NGF pro region present on the plasmid pTB1344 are shown in FIGS. Number: 9).
[0030]
Reference Example 7 Transformation and Cloning of CHO Cells
Hamster CHO cells (DHFR-) were placed in a Falcon Petri dish (6 cm in diameter) in HamF-12 medium containing 5% fetal calf serum in a 4 × 10 5 ratio. ⁵ I scattered. 5% CO ₂ After overnight culture at 37 ° C. in the presence, the medium was exchanged, and the culture was further performed for 4 hours. The human NGF-2 / NT-3 expression plasmids pTB1059, pTB1339, and pTB1344 obtained in Reference Example 1 were each added to a Petri dish. 10 μg per sheet Calcium phosphate method (Graham et al. Virology) 52 , 456-467 (1973)). After 4 hours of culturing, the medium was exchanged, and after overnight culturing, the medium was replaced with a selective medium (5% fetal bovine serum-Dulbecco's modified MEM medium-50 μg / ml kanamycin-35 μg / ml proline) and the culture was continued. After 10 to 15 days, cells that became DHFR + (+ is superscript) formed a colony, and thus cloned by single colony isolation.
[0031]
Reference Example 8 Expression of human NGF-2 / NT-3 gene by transformant
The culture supernatant of the CHO transformant obtained in Reference Example 2 was collected, and the human NGF-2 / NT-3 activity in the culture supernatant was measured by the method described in Reference Example 5. As a result, biological activity was observed when transformed with any of pTB1059, pTB1339, and pTB1344.
[0032]
Reference Example 9 Establishment of Human NGF-2 / NT-3 High Producing CHO Cell Line
Each of the transformants shown in Reference Examples 7 and 8 was cultured in a selective medium containing 100 nM methotrexate (described in Reference Example 7). With respect to the clones that survived in this medium, the culture was continued while the methotrexate concentration in the selection medium was gradually increased to 1 μM and 10 μM. As a result, strain A1002 transformed with plasmid pTB1059, strains CHO-dN2-17 and CHO-dN2-19 transformed with plasmid pTB1339, and strain CHO-N2-1 (IFO) transformed with plasmid pTB1344. 50307, FERM BP-3255) and CHO-N2-37. The production amounts of these NGF-2 / NT-3) were as follows.

In this table, the production amount was calculated as the mouse βNGF equivalent by the biological activity measurement method shown in Reference Example 5. In this example, the limiting dilution point was the 0.02 ng / ml βNGF equivalent point.
[0033]
Reference Example 10 Isolation of human NGF-2 / NT-3
The cell line CHO-N2-1 obtained in Reference Example 9 was transformed into a Dulbecco's modified medium containing 5% fetal bovine serum, 35 μg / ml proline, 50 μg / ml kanamycin and 2 μM methotrexate in a 2 × 10 5 ratio. ⁴ Cells / cm ² Seeded at a concentration of 5% CO ₂ The cells were cultured in the presence at 37 ° C. for 7 days. Activity measurement on chicken DRG showed that 10 μg NGF-1 equivalent or more of recombinant human NGF-2 / NT-3 was produced in this medium. This culture solution was stored frozen at -20 ° C until use.
One liter of the cryopreserved culture supernatant is centrifuged at 8000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. or filtered (Toyo Filter Paper No. 2) to remove cell debris, and the final concentration is adjusted to 1 mM EDTA, 0.05% CHAPS. Adjusted and corrected to pH 6.0 with 2N acetic acid. This was centrifuged or filtered again to remove the insoluble fraction and passed through a cation exchange resin. As a cation exchange resin, S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia LKB, Sweden) was equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.0-1 mM EDTA-0.05% CHAPS, and the diameter was increased by 2.6 cm. What was packed in a 10 cm long column was used. Adsorption was performed by passing the prepared culture supernatant through this column at 4 ° C. at a flow rate of 60 ml / hr. After the adsorption, the column was washed with 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.0-1 mM EDTA-0.05% CHAPS at a flow rate of 60 ml / hr for 4 hours, and then 0.5 M NaCl-0.1 M sodium phosphate (pH 6.0). 0) Elution was performed by flowing 1 mM EDTA-0.05% CHAPS at a flow rate of 50 ml / hr. The fraction containing human NGF-2 / NT-3 was determined by Western blotting using an anti-polypeptide (I) N-terminal peptide antibody described in Reference Example 1 of EP-A-386,752. Was collected and concentrated about 20 times by Ultrafree 20 (Millipore, USA). Sephacryl S-100HR (Pharmacia LKB, Sweden) column (diameter 1.6 cm) in which the obtained concentrate was equilibrated with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) -0.15 M NaCl-1 mM EDTA-0.05% CHAPS. X85 cm). As described above, a human NGF-2 / NT-3 fraction was identified by Western blotting, and this fraction was concentrated about 20-fold with Ultrafree 20. The obtained concentrate was subjected to reverse phase HPLC to purify human NGF-2. That is, this concentrated solution was passed through an Asahipak ODP-50 (Asahi Kasei, Japan, diameter 8 mm × 150 mm) column, and subjected to a concentration gradient of 0-90% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) to give purified human NGF- About 60 μg of 2 / NT-3 was obtained.
When the recombinant human NGF-2 / NT-3 thus obtained was analyzed by SDS-PAGE (15% (35.1: 1)), it was detected as a substantially single band near a molecular weight of 14,000 [FIG. 9]. It reacted with the antibody shown in Reference Example 1 of EP-386,752 (FIG. 10).
[FIG. 9] shows the result of this purification process analyzed by SDS-PAGE and silver staining, and FIG. 10 shows the result of Western blotting after SDS-PAGE. 9 and 10, lane 1 shows the polypeptide (I) obtained by the method described in European Patent Application Publication No. 386,752, and lane 2 shows the sample subjected to the above reverse phase chromatography. Lane 3 shows the fraction passed through reverse phase chromatography, and Lane 4 shows the fraction (NGF-2 / NT-3 fraction) eluted by applying a gradient of acetonitrile by reverse phase chromatography. Shown respectively.
[0034]
Reference Example 11 Expression of human NGF-2 / NT-3 gene in animal cells (II)
Expression of plasmids pTB1059 and pTB1339 obtained in Reference Example 4 and pTB1344 obtained in Reference Example 1 in monkey COS-7 cells was examined. Gene transfer was performed by the calcium phosphate method described in Reference Example 7. However, 10% fetal calf serum-Dulbecco's modified MEM medium was used as the medium, and 0.5% fetal calf serum-Dulbecco's modified MEM medium was used after gene transfer. The medium was collected 48 hours after gene transfer. 10 μl of 100% (w / v) trichloroacetic acid was added to 100 μl of the culture supernatant, and the mixture was cooled (0 ° C., 10 minutes) to precipitate a protein, which was subjected to SDS-PAGE. Western blotting was carried out by a conventional method, and the recombinant was detected using the anti-polypeptide (I) N-terminal peptide antibody shown in Reference Example 1 of EP-386,752 (FIG. 11). In this system, pTB1339 produced the recombinant best. In FIG. 11, lane 1 is the polypeptide (I) obtained by the method described in European Patent Application Publication No. 386,752, lane 2 is the COS supernatant by plasmid pTB1059, and lane 3 is plasmid pTB1344. , And Lane 4 shows the result of the COS supernatant with the plasmid pTB1339, respectively.
[0035]
Reference Example 12
Each of the CHO-N2-1 strains obtained in Reference Example 9 was prepared by mass culture. The preparation method was partially modified as follows based on Reference Example 10.
Culture was performed in Dulbecco's modified MEM medium containing 5% fetal calf serum, 35 μg / ml proline, 50 μg / ml kanamycin, and 2 μM methotrexate in a 2 × 10 5 ratio. ⁴ / Cm ² Seeded at a concentration of 5% CO ₂ The cells were cultured at 37 ° C. for 7 days in the presence. After collecting the culture supernatant, Dulbecco's modified MEM medium / Ham F-12 medium (1: 1 mixed medium) containing 1% fetal calf serum-35 μg / ml proline-50 μg / ml kanamycin-2 μM methotrexate (hereinafter referred to as a prepared medium (Abbreviated) and cultured for 3-4 days. After collecting the culture supernatant, the cells were further cultured in a prepared medium for 3 to 4 days, and the culture supernatant was collected. From this series of cultures, 5 liters of culture supernatant could be obtained from 120 10 cm dishes. This was repeated twice to obtain 10 liters of the culture supernatant. The culture supernatant was stored at -20C. The culture supernatant was treated according to the method described in Reference Example 10 and applied to an S-Sepharose column (5 × 20 cm in diameter). The active fraction was eluted by the method described in Reference Example 10 and fractionated by 12 ml / fraction (FIG. 12). Ammonium sulfate was added to this fraction so as to be 50% saturated, left at 0 ° C. for 2 hours, and the precipitate was collected by centrifugation (10000 rpm, 15 minutes, 4 ° C., Serval SS34 rotor (USA)). The precipitate was dissolved in 40 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) 1 mM EDTA-0.05% CHAPS. Before performing gel filtration, centrifugation (15000 rpm, 15 minutes, 4 ° C, Serval SS 34 rotor) was performed to remove insoluble substances. Gel filtration was performed by the method described in Reference Example 10. However, the column used had a diameter of 2.6 cm × 90 cm, the flow rate was 100 ml / h, and the sample volume was 10 ml (FIG. 13). The eluted fraction was concentrated with Ultrafree 20 (Millipore, USA). This was purified by reverse phase chromatography according to the method described in Reference Example 10 (1 ml / fraction) (FIG. 14). Table 1 shows the purification process in each of these steps.
The figure which analyzed these by SDS-PAGE was shown to [FIG. 15] and [FIG. 16]. The final preparation showed almost a single band. From the above, it was found that 210 μg of the recombinant sample was obtained from about 10 liters of the culture supernatant.
FIG. 15 shows the results of silver staining, and FIG. 16 shows the results of western blotting. In FIG. 15 and FIG. 16, lane 1 is for 0.01 μg of polypeptide (I) obtained by the method described in EP-A-386,752, and lane 2 is for CHO-N2- For 10 μg of 1 cell culture supernatant, lane 3 for 10 μg of S-Sepharose pass-through fraction, lane 4 for 1 μg of S-Sepharose elution fraction, lane 5 for 1 μg of ammonium sulfate precipitation fraction, lane 6 for gel Lane 7 shows the result of 0.1 μg of the filtrate eluted fraction, and the result of 0.1 μg of the reverse phase HPLC eluted fraction.
At the start of purification, the protein having a purity of about 0.001 to 0.01% of the total protein is finally purified to a purity of 95% or more (efficiency of 10 ⁴ Western blotting (FIG. 16) and silver staining (FIG. 15) were juxtaposed to show that they had been doubled.
[0036]
[Table 1]

[0037]
Reference Example 13 Biological activity of purified recombinant (I)
The biological activity of the final purified preparation obtained in Reference Example 12 was measured by the method described in Reference Example 5. Mouse βNGF (Wako Pure Chemical Industries) was used as a control. The results are shown in FIG. In FIG. 17, ■ shows the result of mouse βNGF, and ● shows the result of NGF-2 / NT-3. As shown in FIG. 17, NGF-2 / NT-3 was found to be less active in this system than βNGF.
[0038]
Reference Example 14 Biological activity of purified recombinant (II)
Biological activity on rat PC12 cells was measured. The activity was measured by the method described in Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 171, pp. 116-122 (1990). The result is shown in FIG. In FIG. 18, Δ indicates the result of mouse βNGF, and ● indicates the result of NGF-2 / NT-3. Recombinant NGF-2 has a very low activity to induce neurite outgrowth on PC12 cells, and is 1/10 that of mouse βNGF (Wako Pure Chemical). ³ Or less.
[0039]
Reference Example 15
The CHO-N2-1 strain obtained in Reference Example 9 was seeded and cultured in the same manner as in Reference Example 10. The medium was replaced with a serum-free medium (Cosmedium; Cosmo Bio), and the cells were further cultured for 2 days. One liter of culture supernatant was collected from 100 10-cm dishes. NGF-2 / NT-3 was purified in the same manner as in Reference Example 10 by adding 0.5 mM PMSF and 1 mM benzamidine to the collected culture supernatant and the buffer of the column. Reverse phase HPLC gave three peaks with retention times of 24 minutes (P1), 26 minutes (P2) and 28 minutes (P3) [FIG. 19].
P2 and P3 had biological activity on chicken fetal DRG neurons, whereas P1 did not. The P2 protein migrated simultaneously with the recombinant NGF-2 produced by E. coli on PAGE, while the P3 protein migrated slightly faster than them (FIG. 21). Only the P2 protein recognized the anti-polypeptide (I) N-terminal peptide antibody (obtained in Reference Example 2 of EP-A-386,752) by Western blotting (FIG. 20). In FIG. 20, lane (a) shows NGF-2 produced by the E. coli transformant, and lane (b) shows fraction 24 (P1) obtained by reverse phase HPLC chromatography (FIG. 19). (C) shows the fraction 26 (P2) obtained by the reverse phase HPLC chromatography (FIG. 19), and lane (d) shows the fraction 28 (P3) obtained by the reverse phase HPLC chromatography (FIG. 19). .
In FIG. 21, lane (e) shows NGF produced by E. coli transformant, lane (f) shows fraction 25 obtained by reverse phase HPLC chromatography (FIG. 19), and lane (g) shows reverse. The fraction 26 (P2) obtained by the phase HPLC chromatography [FIG. 19], the lane (h) the fraction 27 obtained by the reverse phase HPLC chromatography [FIG. 19], and the lane (i) the reverse phase HPLC chromatography. The fraction 28 (P3) obtained by the chromatography [FIG. 19] is shown, and the lane (j) shows the fraction 29 obtained by the reverse phase HPLC chromatography [FIG. 19].
Analysis of the N-terminal amino acids revealed that P2 was consistent with the N-terminal sequence of mature NGF-2 / NT-3, but P3 was equivalent to NGF-2 / NT-3 with a deletion of the N-terminal 5 residues. I understand [Table 2].
[0040]
[Table 2]

[0041]
Example 1 (Effect of NGF-2 / NT-3 on human peripheral blood lymphocytes)
Human peripheral blood collected from a human vein was layered on LSM (Lymphocyte Separating Medium, Organon Teknika Corp.) and centrifuged at 2000 rpm for 30 minutes at room temperature. The cloudy layer composed of lymphocytes at the interface was collected, suspended in RPMI 1640 medium, and washed twice by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes twice. This lymphocyte fraction was suspended in RPMI 1640 medium, coated in advance with fetal calf serum (FCS), and seeded on a plastic dish. After incubating at 37 ° C. for 1 hour in a 5% carbon dioxide incubator, non-adherent cells that did not adhere to the petri dish wall were collected and washed with RPMI 1640 medium. The thus prepared human peripheral blood-derived lymphocyte cells were prepared from human GM-CSF (recombinant, Genzyme) at 5, 50 and 500 U / ml or human NGF (recombinant, Biochem. Biophys. Res. Commun. 171 , 116 (1990)), agar containing 5, 50 and 500 ng / ml, or 5, 50 and 500 ng / ml of the N-terminal 5-residue-deleted human NGF-2 / NT-3 obtained in Reference Example 12 described above, respectively. The suspension was suspended in a medium (RPMI 1640 medium containing 0.3% Bacto agar and 20% FCS) (1 × 10 ⁶ Cells / ml) and 1 ml per 35 mm dish.
After the agar solidifies, a carbon dioxide incubator (5% CO ₂ ), The cells were cultured at 37 ° C. for 2 weeks, and the number of colonies where the number of cells reached 50 or more was counted. The results are shown in FIG. 23.
As is clear from FIG. 23, the addition of N-terminal 5 residue-deleted NGF-2 / NT-3 resulted in colony formation of human peripheral blood lymphocytes in the same manner as when GM-CSF or NGF was added. Clearly promoted.
[0042]
Example 2 Production of Injection
An aqueous solution (pH 7.4) containing 0.5 mg of the N-terminal 5-residue-deleted human NGF-2 / NT-3 obtained in Reference Example 12, 10 mg of sucrose, and 15 mg of sodium citrate per 1 ml was prepared. Obtain a stable injection solution.
[0043]
【The invention's effect】
The therapeutic agent containing NGF-2 / NT-3 of the present invention acts on blood cells in the peripheral blood of an animal and exhibits a growth promoting effect. Therefore, the therapeutic agent of the present invention can be used as an effective therapeutic agent for neutropenia due to various causes, and is also effective for treating infections and tumors.
[0044]
[0045]
[Sequence list]

[0046]

[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

[0055]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a construction diagram of a plasmid pTB1059 obtained in Reference Example 4.
FIG. 2 shows a construction diagram of plasmid pTB1339 obtained in Reference Example 4.
FIG. 3 shows a construction diagram of plasmid pTB1339 obtained in Reference Example 4.
FIG. 4 shows a construction diagram of a plasmid pTB1344 obtained in Reference Example 6.
FIG. 5 shows a construction diagram of plasmid pTB1344 obtained in Reference Example 6.
FIG. 6 shows a construction diagram of plasmid pTB1344 obtained in Reference Example 6.
FIG. 7-1. DNA encoding the pro-region of NGF-2 / NT-3 present on plasmid pTB1339, DNA encoding NGF-2 / NT-3, and the vicinity thereof obtained in Reference Example 4. 1 shows a DNA sequence.
FIG. 7-2 shows the DNA encoding the pro-region of NGF-2 / NT-3 present on plasmid pTB1339, the DNA encoding NGF-2 / NT-3, and the vicinity thereof obtained in Reference Example 4. 1 shows a DNA sequence.
FIG. 8-1 shows a DNA encoding the NGF pro region, a DNA encoding NGF-2 / NT-3, and a DNA sequence in the vicinity thereof, present on the plasmid pTB1344 obtained in Reference Example 6.
FIG. 8-2 shows a DNA encoding the NGF pro-region, a DNA encoding NGF-2 / NT-3, and a DNA sequence in the vicinity thereof, which are present on the plasmid pTB1344 obtained in Reference Example 6.
FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE obtained in Reference Example 10.
FIG. 10 shows the results of SDS-PAGE obtained in Reference Example 10.
FIG. 11 shows the results of SDS-PAGE obtained in Reference Example 11.
FIG. 12 shows the elution fraction of the culture supernatant of the CHO-N2-1 strain obtained in Reference Example 12 through an S-Sepharose column.
FIG. 13 shows the elution fraction obtained by gel filtration obtained in Reference Example 12.
FIG. 14 shows the results of reversed-phase chromatography obtained in Reference Example 12.
FIG. 15 shows the results of SDS-PAGE of the product obtained in each purification step obtained in Reference Example 12.
FIG. 16 shows the results of SDS-PAGE obtained in Reference Example 12.
17 shows the results of measuring biological activity obtained in Reference Example 13. FIG.
FIG. 18 shows the measurement results of biological activity obtained in Reference Example 14.
FIG. 19 shows the results of reversed-phase HPLC chromatography obtained in Reference Example 15.
FIG. 20 shows the results of Western blotting obtained in Reference Example 15.
FIG. 21 shows the results of PAGE obtained in Reference Example 15.
FIG. 22 shows the amino acid sequence of human NGF-2.
FIG. 23 shows the effect of N-terminal 5-residue-deleted NGF-2 / NT-3 on human peripheral blood lymphocytes obtained in Example 1.

Claims

Human nerve growth factor 2 and / or
(1) addition of at least one amino acid;
(2) deletion of at least one constituent amino acid except cysteine;
(3) substitution of at least one constituent amino acid except cysteine;
(4) a combination of two or three of the above additions, deletions and substitutions;
(5) chemical modification with a polyethylene glycol derivative; and
(6) Introduction of glycosylation position
A therapeutic agent for neutropenia, comprising a mutein of human nerve growth factor 2, which comprises a modification selected from the group consisting of and has an activity of promoting the proliferation of peripheral blood cells .

The therapeutic agent for neutropenia according to claim 1, wherein the human nerve growth factor 2 is a natural extract or a recombinant polypeptide.

The therapeutic agent for neutropenia according to claim 1 or 2, wherein the human nerve growth factor 2 is a polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

The therapeutic agent for neutropenia according to claim 1, wherein the mutein is a polypeptide represented by the amino acid sequence of amino acid residues 1 to 118 of SEQ ID NO: 12.

The neutropenia according to claim 1, wherein the mutein is a polypeptide represented by SEQ ID NO: 12 or a sequence having a methionine at the N-terminal of the amino acid residue of amino acid residues 1 to 118 of SEQ ID NO: 12. Therapeutic agent.

The polypeptide represented by SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence of amino acid residues 1 to 118 of SEQ ID NO: 12 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence of amino acid residues 1 to 118 of SEQ ID NO: 12 The therapeutic agent for neutropenia according to claim 1, which comprises a polypeptide represented by a sequence having methionine at the N-terminus.

2. The mutein according to claim 1, wherein 1 to 7 amino acids are deleted from the amino terminus of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence of amino acid residues 1 to 118 of SEQ ID NO: 12. For the treatment of neutropenia.

The mutein according to claim 7 , wherein the polypeptide represented by SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence of amino acid residues 1 to 118 of SEQ ID NO: 12 has 5 amino acids deleted from the amino terminus. A therapeutic agent for neutropenia.