JP3580822B2 - Non-A non-B non-C non-D non-E hepatitis reagents and methods of using them - Google Patents

Description

これに対して本発明者らは、より切断頻度の高い制限エンドヌクレアーゼを使用してRDA被験DNAを分画するならば、小さいウイルスのクローニングにRDAが有用であることを知見した。表１に示す通り、4bp認識部位酵素をベースとするアンプリコンは、約250bp毎に4bp認識部位フラグメントDNAを有する制限エンドヌクレアーゼのように、如何なる小さいウイルスからも数個のフラグメントをほぼ確実に含む。他方、DNA種のほぼ全部は4bp認識制限エンドヌクレアーゼによる消化後に≦1500bpで即ちPCR増幅されるので、アンプリコンはその生成起源である核酸源と同程度の複合度であると思われる。相対ウイルス配列コピー数は任意の特定又は内在配列コピー数よりも多いと予想されるので、テスターアンプリコン中に存在する固有ウイルス配列はハイブリダイゼーション段階（上記段階３）中に２本鎖分子を形成できるはずである。従って、これらの配列は上記のように指数的に増幅される。相対ウイルス配列コピー数がバックグラウンド又は内在核酸配列コピー数に近づくので、重複6bp配列を認識し（例えばBstY I又はHinc II）且つ約1000bp毎に開裂する制限エンドヌクレアーゼを使用するか、又は6bp配列を認識する数個の制限エンドヌクレアーゼを同時に使用して、PCRによる増幅前にDNAを分画することができると推論される。こうして、テスターアンプリコンからウイルス配列を排除する危険を最小限にしながら、RDAを受けるアンプリコンの複合度を適度に低下させることができる。この方法の有用性は、本明細書中に記載する感染性タマリン血漿からのHGBV配列のクローニングにより立証される。
HGBV免疫反応性エピトープを同定するための免疫スクリ ーニング
以下に記載するような免疫スクリーニングも、HGBV配列を同定する付加的手段であった。急性又は慢性HGBV感染を有する下記パラメーター内で基準に合致する個体からの個々の血清、血漿又は肝臓ホモジネート又はそのプールを使用してウイルス粒子を単離する。これらの粒子から単離した核酸をゲノムライブラリー及び／又はウイルスゲノムに対するcDNAライブラリーの構築で鋳型として使用する。推定HGBV粒子を単離し、当業者に公知のλ−gt11又は類似のシステムでゲノム及び／又はcDNAライブラリーを構築するために使用する手順を以下に説明する。λ−gt11はβ−ガラクトシダーゼとの融合ポリペプチドとして挿入cDNAを特異的に発現させ、規定抗原に対する特異抗血清で以って多数の組換えファージをスクリーニングするために開発されたベクターである。cDNAを含むcDNAプールから生成されるλ−gt11 cDNAライブラリーを、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎既往個体からの血清と特異的に結合することが可能なコード化エピトープについてスクリーニングする。V.Hunyhら,D.Glover編，DNA Cloning Techniques;A Practical App roach,IRL Press,Oxford,England,pp.49−78（1985）を参照されたい。約10⁶〜10⁷個のファージをスクリーニングして陽性ファージを同定、精製後、HGBV物質に先に感染した各個体からの血清と結合する特異性を試験する。下記基準に合致する患者に由来し且つこれらの基準に合致しない患者には存在しない血清又は血漿と選択的に結合するファージがその後の試験に好適である。オーバーラップする核酸配列を単離する方法を使用することにより、付加的な上流及び下流HGBV配列を含むクローンが得られる。単離クローン内でコードされるHGBV核酸配列のヌクレオチド配列を分析し、複合配列が１つの長い連続ORFを含むか否かを決定する。
本明細書に記載するようなHGBV配列から回収される配列（及びその相補体）及びその配列又は任意部分は、合成法を使用して調製してもよいし、本明細書に記載すると同様の方法を使用して合成法を部分配列の回収と組み合わせることにより調製してもよい。この記載は、完全HGBVゲノムに対応するゲノム又はcDNA配列を単離することが可能な方法に関する。しかしながら、これらの配列を単離するための他の方法も当業者に自明であり、本発明の範囲内であるとみなされる。
菌株寄託
HGBV核酸配列ライブラリーからの複製株（クローン２、４、10、16、18、23及び50）はブダペスト条約に基づき1994年２月10日付けで12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852に所在のAmerican Type Culture Collectionに寄託し、寄託日から30年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。全寄託材料中のHGBV cDNA配列は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以下のA.T.C.C.寄託番号を付託された。クローン２はA.T.C.C.寄託番号69556、クローン４はA.T.C.C.寄託番号69557、クローン10はA.T.C.C.寄託番号69558、クローン16はA.T.C.C.寄託番号69559、クローン18はA.T.C.C.寄託番号69560、クローン23はA.T.C.C.寄託番号69561、クローン50はA.T.C.C.寄託番号69562を付与された。
HGBV核酸配列ライブラリーからの複製株（クローン11、13、48及び119）はブダペスト条約に基づき1994年４月29日付けで12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852に所在のAmerican Type Culture Collectionに寄託し、寄託日から30年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料が便宜の目的で呈示するに過ぎず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。全寄託材料中のHGBV cDNA配列は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以下のA.T.C.C.寄託番号を付託された。クローン11はA.T.C.C.寄託番号69613、クローン13はA.T.C.C.寄託番号69611、クローン48はA.T.C.C.寄託番号69610、クローン119はA.T.C.C.寄託番号69612を付与された。
HGBV核酸配列ライブラリーからの付加的株（クローン４−B1.1、66−3A1.49、70−3A1.37及び78−1C1.17）はブダペスト条約に基づき1994年７月28日付けで12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852に所在のAmerican Type Culture Collectionに寄託し、寄託日から30年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎず、明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。全寄託材料中のHGBV cDNA配列は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以下のA.T.C.C.寄託番号を付与された。クローン４−B1.1はA.T.C.C.寄託番号69666、クローン66−3A1.49はA.T.C.C.寄託番号69665、クローン70−3A1.37はA.T.C.C.寄託番号69664、クローン78−1C1.17はA.T.C.C.寄託番号69663を付与された。
クローンpHGBV−Ｃクローン＃１はブダペスト条約に基づき1994年11月８日付けで12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852に所在のAmerican Type Culture Collectionに寄託し、寄託日から30年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎず、本明細書上の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。pHGBV−Ｃクローン＃１はA.T.C.C.寄託番号69711を付与された。全寄託材料中のHGBV cDNA配列は参考資料として本明細書の一部とする。
ウイルスポリペプチド及びフラグメントの調製
核酸配列を入手できることにより、いずれかの鎖でコードされるポリペプチドの抗原活性領域をコードする発現ベクターを構築することができる。これらの抗原活性領域は、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、及びウイルス粒子の複製及び／又はアセンブリに必要な他のウイルスタンパク質を含むウイルスの非構造領域以外に、例えばエンベロープ（コート）又はコア抗原を含むウイルスの構造領域から誘導され得る。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは慣用制限消化又は合成法によりゲノム又はcDNAクローンから得られ、例えばβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）又はCMP−KDOシンテターゼ（CKS）等の融合配列の部分を含み得るベクターに連結される。SODの融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な方法及びベクターは1986年10月１日付け公開EPO第0196056号に記載されており、CKSの融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な方法及びベクターは1989年９月13日付け公開EPO第0331961号に記載されている。いずれかの方向の鎖においてオープンリーディングフレームを含む核酸配列の任意の所望部分は成熟又は融合タンパク質等の組換えタンパクとして得られ、あるいはHGBVゲノム又はcDNAでコードされるポリペプチドを化学的合成により提供することもできる。
融合又は成熟形態のいずれかに関係なく、また分泌を可能にするシグナル配列を含むか否かに関係なく、所望のポリペプチドをコードする核酸配列を任意の適当な宿主に適切な発現ベクターに連結することができる。当該技術分野では真核及び原核両者の宿主系を使用して組換えタンパク質を形成することができ、本明細書にはこれらの宿主のいくつかを挙げる。次に溶解細胞又は培地からポリペプチドを単離し、所期用途に必要な程度まで精製する。精製は当業者に公知の方法により実施することができ、特に塩析、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離等を使用することができる。このようなポリペプチドは診断薬として又は受動的免疫療法に使用することができる。更に、これらのポリペプチドに対する抗体は、HGBV粒子を単離及び同定するために有用である。HGBV抗原はHGBV粒子からも単離することができる。これらウイルス粒子は組織培養物又は感染個体中のHGBV感染細胞中で増殖させることができる。
抗原性ポリペプチドの調製及び固相との結合
ポリペプチドの抗原性領域又はフラグメントは比較的小さく、通常約８〜10アミノ酸長又はそれ以下である。５アミノ酸程度のフラグメントでも抗原性領域を特徴付けることができる。これらのセグメントはHGBV抗原の領域に対応し得る。HGBVゲノム又はcDNA配列を基本として使用することにより、HGBVポリペプチドの短いセグメントをコードする核酸配列を融合タンパク質又は単離ポリペプチドとして組換えにより発現させることができる。これらの短いアミノ酸配列は、化学的合成によっても得られる。化学的に合成された小さいポリペプチドは、得られた合成ポリペプチドが適正なエピトープを提供するように適正に配置されており且つ抗原性となるには小さ過ぎる場合に適切なキャリヤー分子に結合され得る。結合方法は当業者に公知であり、非限定的な例としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）及びスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）を使用する。システイン残基を加えることにより、スルフヒドリル基をもたないポリペプチド修飾することができる。これらの物質は、該物質と一方のタンパク質上のペプチドシステイン残基の間にジスルフィド結合を生成し、他方のタンパク質中のリジン上のε−アミノ又は他の遊離アミノ基を介してアミド結合を生成する。このような種々のジスルフィド／アミド形成物質は公知である。他の２官能カップリング剤はジスルフィド結合でなくチオエステルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販されており、当業者に公知である。そのカルボキシ基は、スクシンイミド又は１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と結合させることにより活性化することができる。宿主に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しないものであれば、任意のキャリヤーを使用することができる。適切なキャリヤーとしては、特にタンパク質、多糖類（例えばラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズ）、ポリマーアミノ酸（例えばポリグルタミン酸、ポリリシン、アミノ酸コポリマー）及び不活性ウイルス粒子を挙げることができる。タンパク質基質の例としては、血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、イムノグロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風毒素及び当業者に公知の他のタンパク質を挙げることができる。
HGBVエピトープを含むハイブリッド粒子免疫原の調製
HGBVエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質（例えばHBV表面抗原にあるような）融合又は結合した哺乳動物又は酵母系で調製することにより強化することもできる。粒子形成タンパク質をコードする配列にHGBVエピトープを直接結合した構築物は、HGBVエピトープに対して免疫原性のハイブリッドを生成する。更に、調製されるHGBVに対して特異的なエピトープを含む全てのベクターは、異なる程度の免疫原性を有する。HGBV配列を含む粒子形成タンパク質から構築される粒子はHGBV及びHBVに対して免疫原性がある。
Ｂ型肝炎表面抗原はS.cerevisiae及び哺乳動物細胞中で形成されて粒子に結合することが確認され、これらの粒子の形成はモノマーサブユニットの免疫原性を強化することが報告されている。P.Valenzuelaら，Nature 298:334（1982）;P.Valenzuelaら,I.Millmanら編，Hepati tis Ｂ,Plenum Press,pp.225−236（1984）。構築物はHBsAgの免疫優性エピトープを含み得る。このような構築物は酵母で発現可能であることが報告されており、酵母発現のための異種ウイルス配列を含むハイブリッドが開示されている。例えばEPO第174,444号及びEPO第174,261号を参照されたい。これらの構築物はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞等の哺乳動物細胞で発現され得ることも報告されている。Michelleら，Internat ional Symposium on Viral Hepatitis,1984を参照されたい。HGBVにおいては粒子形成タンパク質をコードする配列の部分を、HGBVエピトープをコードするコドンで置換することができる。この置換では、酵母又は哺乳動物中で免疫原性粒子を形成するための単位の凝集を媒介するために不要な領域を削除し、こうしてHGBVエピトープとの競合から付加的なHGBV抗原部位を削除することができる。
ワクチン製造
ワクチンは、HGBV核酸配列又は該核酸配列に対応するHGBVゲノムに由来する１種以上の免疫原性ポリペプチド又は核酸から製造することができる。ワクチンはHGBVのエピトープを含む組換えポリペプチドを含み得る。これらのポリペプチドは細菌、酵母又は哺乳動物細胞中で発現させてもよいし、あるいはウイルス調製物から単離してもよい。種々の構造タンパク質が防御抗HGBV抗体を誘導するHGBVのエピトープを含み得ることも予想される。こうして、これらのワクチンの製造時には合成ペプチドも使用することができる。従って、HGBVの少なくとも１個のエピトープを含むポリペプチドをHGBVワクチン中で単独又は組み合わせて使用することができる。更に、非構造タンパク質及び構造タンパク質は、中和抗体を産生しないとしても、ウイルス病原性に対する防御を提供し得ると予想される。
上記に鑑み、HGBVに対する多価抗体は１種以上の構造タンパク質及び／又は１種以上の非構造タンパク質を含み得る。これらのワクチンは例えば組換えHGBVポリペプチド及び／又はウイルス粒子から単離されたポリペプチド及び／又は合成ペプチドから構成され得る。これらの免疫原エピトープは組み合わせて使用することができ、即ち組換えタンパク質、合成ペプチド及び／又はウイルス粒子から単離されたポリペプチドの混合物として使用することができ、これらのワクチンは同一又は異なる時刻に投与することができる。更に、ワクチンに不活化HGBVを使用することも可能であり得る。このような不活化はウイルス溶解物を調製してもよいし、肝炎様ウイルスの不活化を生じることが当業者に知られている他の手段、例えば有機溶媒もしくは界面活性剤による処理、又はホルマリン処理により実施してもよい。本発明では弱毒HGBV株調製物も開示する。HGBVにおけるタンパク質には他の公知ウイルスと交差反応できるものもあり、従って、HGBVと他のウイルスとの間に共有エピトープが存在し、これらの病原物質により生じる疾患の１種以上に対する防御抗体をもたらすと予想される。この確信に基づいて多重目的ワクチンを設計できることが予想される。
少なくとも１種の免疫原性ペプチドを活性成分として含むワクチンの調製は当業者に公知である。典型的には、このようなワクチンは溶液又は懸濁液としての注射剤として調製される。注射前に液体に溶解又は懸濁するのに適切な固体形態も製造可能である。調製物を乳化してもよいし、タンパク質をリポソームに封入してもよい。活性免疫原性成分は多くの場合には活性成分と適合可能な医薬的に許容可能な賦形剤と混合する。適切な賦形剤の非限定的な例としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等が挙げられ、種々の量のこれらの賦形剤を組み合わせて使用してもよい。ワクチンは更に、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤及び／又はワクチンの効力を強化するアジュバント等の少量の補助物質も含有し得る。例えば、このようなアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（thr−DMP）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（CGP 11687、別称nor−MDP）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（1',2'−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（CGP 19835A、別称MTP−PE）及びRIBI（MPL＋TDM＋CWS）の２％スクアレン/Tween−80（登録商標）エマルジョンが挙げられる。アジュバントの効力は、同様に種々のアジュバントから構成されるワクチン中のポリペプチドを投与した結果生じたHGBV抗原配列を含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することにより決定することができる。
ワクチンは通常、静脈内又は筋肉内注射により投与される。他の投与方法に適切な別の製剤には座薬があり、場合によっては経口製剤でもよい。座薬の場合、慣用バインダー及びキャリヤーの非限定的な例としてはポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙げられる。このような座薬は約0.5％〜約10％、好ましくは約１％〜約２％の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような一般に使用される賦形剤を含有する。これらの組成物は溶液、懸濁液、タブレット、ピル、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態をとることでがき、約10％〜約95％、好ましくは約25％〜約70％の活性成分を含有し得る。
ワクチン中で使用するタンパク質は中性又は塩形態としてワクチンに配合され得る。医薬的に許容可能な塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成され且つ）無機酸（例えば塩酸又はリン酸）又は有機酸（酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸）と共に形成される酸付加塩や、当業者に公知の他の塩を使用することができる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化鉄（III）等）及び有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン）及び当業者に公知の他の塩基から誘導され得る。
ワクチンは剤形に適合可能な方法で且つ予防及び／又は治療上有効な量を投与される。投与量は一般に１回に抗原約５μｇ〜約250μｇであり、被投与患者、患者の免疫系の抗体合成能力及び所望の防御度に依存する。投与するために必要な活性成分の厳密な量は処方医の判断にも依存し、患者毎に異なる。ワクチンは単一投与スケジュールで投与してもよいし、多重投与スケジュールで投与してもよい。多重投与では、１〜10回に分けて一次ワクチン接種過程を実施した後、免疫応答を維持及び／又は強化するために必要な期間後、例えば１〜４カ月後に二次投与を実施し、個体が必要とする場合には更に数カ月後にも投与する。投与計画は少なくとも一部には個体の必要により決定され、処方医の判断による。免疫原性HGBV抗原を含有するワクチンは他の免疫調節剤、例えば免疫グロブリンと併用投与し得ることが予想される。
HGBVエピトープに対する抗体の製造
本明細書中に記載するように調製した免疫原性ペプチドを使用してポリクローナル又はモノクローナル抗体を製造する。ポリクローナル抗体を製造する際には、選択した哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を少なくとも１種のHGBVエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫感作する。免疫感作した動物からの血清を適当なインキュベーション時間後に収集し、公知手順に従って処理する。HGBVエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合には、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィーによりポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗体を製造及び処理するための方法は当業者に公知であり、特にMayerとWalker編，Imm unochemical Methods In Cell and Molecular Bi ology,Academic Press,London（1987）に記載されている。ポリクローナル抗体は先にHGBVに感染した哺乳動物からも得られる。アフィニティークロマトグラフィーを使用してHGBVに感染した個体の血清からHGBVエピトープに対する抗体を精製するための方法の１例をここに記載する。
HGBVエピトープに対するモノクローナル抗体も当業者により製造することができる。このような抗体を製造するための一般方法は周知であり、例えばKohlerとMilstein,Nature 256:494（1975）に記載されており、J.G.R.Hurrel編，Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techni ques and Applications,CRC Press Inc.,Boco Raton,FL（1982）に考察されており、L.T.Mimmsら，Virolo gy 176:604−619（1990）により教示されている。不死化抗体産生細胞系は細胞融合により作成することができ、オンコジーンDNAによるＢリンパ球の直接形質転換又はエプスタイン−バールウイルスによるトランスフェクション等の他の方法により作成することもできる。同様にM.Schreierら,Hybridoma Techniques,Scopes（1980）Protein Purification,Principles and Practice,第２版,Springer−Verlag,New York（1984）;Hammerlingら,Monoclonal Antibodies and Ｔ−Cell Hybridomas（1981）;Kennetら,Monoclonal Abtibodies（1980）を参照されたい。モノクローナル抗体の使用及び技術の例は米国特許出願第748,292号、748,563号、610,175号、648,473号、648,477号及び648,475号に開示されている。
こうして開発されたHGBVエピトープに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は診断及び予後用途に有用であり、更に中和抗体は受動的免疫療法で有用である。モノクローナル抗体は特に抗イディオタイプ抗体を製造するために使用することができる。これらの抗イディオタイプ抗体は防御が所望される感染物質の抗原の「内部像」を有するイムノグロブリンである。例えば、A.Nisonoffら，Clin.Immunol.Immunopath.21:397−406（1981）及びDreesmanら，J.Infect.Dis.151:761（1985）を参照されたい。このようなイディオタイプ抗体を誘導するための方法は当業者に公知であり、例えばGrychら，Nature 316:74（1985）;MacNamaraら，Science 226:1325（1984）；及びUytdehaagら，J.Immunol.134:1225（1985）に例示されている。これらの抗イディオタイプ抗体はHGBV感染の治療及びHGBV抗原の免疫原性領域の解明にも有用であり得る。
診断オリゴヌクレオチドブローブ及びキット
単離したHGBV核酸配列の所定部分を基材として用いて、HGBVゲノムとハイブリダイズし、ウイルス剤の同定、ウイルスゲノムの更なる特性分析、及び罹患した個体でのウイルス検出に有用である約８ヌクレオチド以上のオリゴマーを切り出し又は合成により産生することができる。HGBVポリヌクレオチド用の天然又は誘導プローブは、ハイブリダイゼーションによる単一ウイルス配列の検出を可能とする長さである。６〜８ヌクレオチドが処理可能な長さであり得るが、10〜12ヌクレオチドの配列が好ましく、約20ヌクレオチドの配列が最も好ましいものであり得る。これらの配列が異質性に欠けた領域から誘導されることが好ましい。これらのプローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成方法を含む常用の標準的な方法を用いて製造することができる。HGBVゲノムの任意の単一部分の相補体は満足すべきものであろう。完全相補性は、断片長さが増せば不要であり得るが、プローブとして使用するには望ましい。
診断試薬として使用するときには、血液又は血清のような分析すべき試験試料を処理してもよく、例えば試料内に含まれる核酸を抽出する。試料から得られた核酸をゲル電気泳動又は他のサイズ分離技術に付してもよいし、核酸試料をサイズ分離せずにドットブロットしてもよい。次いで、プローブを標識する。ラベルをプローブに付着させるための適切なラベル及び方法は当業界では公知であり、ニックトランスレーション又はキナーゼ反応（kinasing）により取り込まれる放射性ラベル、ビオチン、蛍光及び化学発光プローブが含まれるが、これらに限定はされない。これらのラベルの例は多数本明細書に開示されている。次いで、試料から抽出した核酸を、適切な厳密度のハイブリダイゼーション条件下にて標識プローブで処理する。
プローブをHGBVゲノムに対して完全に相補的にすることができる。従って、通常は偽陽性を回避するために厳密度の高い条件が望ましい。しかしながら、厳密度の高い条件は、プローブが異質性に欠けたHGBVゲノムの領域に相補的である場合にのみ使用すべきである。ハイブリダイゼーションの厳密度は、洗浄手順中の幾つかの要素（例えば温度、イオン強度、時間及びホルムアミド濃度）により決定される。例えばJ.Sambrook（上掲）を参照されたい。ハイブリダイゼーションは幾つかの様々な技術により実施することができる。増幅は、例えばリガーゼ連鎖反応（LCR）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、Ｑ−βレプリカーゼ、NASBA等により実施することができる。
HGBVゲノム配列は、例えば約10²〜10³個の配列/mlの比較的低レベルで、感染した個体の血清中に存在し得ると考えられる。このレベルでは、ハイブリダイゼーションアッセイで、リガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応のような増幅技術を使用する必要があり得る。このような技術は当業界では公知である。例えば、“バイオブリッジ”系は末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、非改変3'−ポリ−dT−テールを核酸プローブに付加する（Enzo Biochem.Corp.）。ポリ−dT−テールを有するプローブを標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、次いでビオチン改変ポリ−Ａにハイブリダイズする。更には、被分析物質を、酵素標識オリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖DNAプローブにアニーリングし、得られたテール付き二本鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするDNAハイブリダイゼーションアッセイがヨーロッパ特許第124221号に記載されている。ヨーロッパ特許第204510号は、被分析物質DNAを、テール（例えばポリ−dT−テール）を有するプローブ、及びプローブのテールにハイブリダイズする配列（例えばポリ−Ａ配列）を有し、複数の標識鎖と結合し得るアンプリファイア鎖と接触させるDNAハイブリダイゼーションアッセイを記載している。この技術はまず、血清中の標的HGBV配列を約10⁶個の配列/mlに増幅することからなり得る。これは、Saiki等、Nature 324:163（1986）に記載の方法に従って実施され得る。次いで、増幅した配列を、当業界では公知のようなハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる。標識され得るプローブ核酸配列を含む診断キットにプローブをパッケージすることができる。あるいは、プローブを標識せずに、標識用成分をキットに含ませてもよい。キットは更に、特定のハイブリダイゼーションプロトコルに必要な又は望ましい他の適切にパッケージされた試薬や材料、例えばアッセイ実施のための標準物や指示書を含み得る。
本発明で使用できる他の公知の増幅方法には、PNAS USA 87:1874−1878（1990）に教示され、Nature:350（No.6313）:91−92（1991）でも議論されているいわゆる“NASBA"又は“3SR"技術や、Ｑ−βレプリカーゼが含まれるが、これらに限定はされない。
本明細書に記載する試薬を用いて、蛍光インシトウハイブリダイゼーション（“FISH"）を実施することもできる。インシトウハイブリダイゼーションは、核酸ハイブリダイゼーション法により形態の損なわれていない組織、細胞又は染色体を採取して、特殊な遺伝情報の存在や、個体細胞内での前記情報の特定位置を実証することからなる。これは細胞の均質化及び標的配列の抽出を必要としないので、細胞集団中での配列の正確な位置や分布が判明する。インシトウハイブリダイゼーションは、細胞中に集中して含まれる問題の配列を同定し得、更には該配列を含む異質細胞集団中の細胞のタイプやフラクションを同定し得る。DNA及びRNAを同一のアッセイ試薬で検出することができる。PNAをFISH法で使用して、増幅せずに標的を検出することができる。シグナルの増加が望ましければ、多数の発蛍光団を使用してシグナルを増し、方法の感度を高めることができる。多数のオリゴヌクレオチドを用いる一工程法又は従来の多工程法を含む様々なFISH法が知られている。これらのタイプの方法を様々な手段（例えばフローサイトメトリー及び画像分析）により自動化できることは本発明の範囲内である。
イムノアッセイ及び診断キット
HGBV抗体及びその複合体を含む血清と免疫反応するポリペプチド、及びこれらのポリペプチド中のHGBV特異エピトープに対する抗体は共に、生物試験試料中でのHGBV抗体の存在又はウイルス及び／もしくはウイルス抗体の存在を検出するイムノアッセイで有用である。これらのイムノアッセイの設計は変形を受けることが多く、これらの変形は当業界では公知である。これらの変形は本明細書に記載する。イムノアッセイは、１個のウイルス抗原（例えばHGBV核酸配列を含むクローン、又はこれらのクローン中のHGBV核酸配列に由来する複合核酸配列、又はこれらのクローン中の核酸配列のソースであるHGBVゲノムから誘導されるポリペプチド）を使用し得る。あるいは、このイムノアッセイは、これらのソースから誘導されるウイルス抗原を組み合わせて使用してもよい。イムノアッセイは例えば、同一ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体、又は異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を使用し得る。アッセイには、競合アッセイ、直接反応アッセイ又はサンドイッチ型アッセイに基づくものが含まれるが、これらに限定されない。アッセイは、固相を使用してもよいし、免疫沈殿又は固相を使用しない他の任意の方法で実施してもよい。ラベルをシグナル生成化合物として使用するアッセイや、これらのラベルの例は本明細書に記載する。シグナルは更に、係属中の米国特許出願第608,849号、第070,647号、第418,981号、及び第687,785号に記載のビオチン及びアビジン、酵素ラベル又はビオチン抗ビオチン系を使用して増幅してもよい。HGBVの免疫優性領域に由来するエピトープを含む組換えポリペプチドは、感染個体の生物試験試料でウイルス抗体を検出するのに有用であり得る。抗体は、急性感染と非急性感染とを識別するのに有用であり得るとも考えられる。適切な材料（例えばHGBVエピトープ又はHGBVエピトープに対する抗体を含む本発明のポリペプチド）を、アッセイの実施に必要な他の試薬や材料、及び適切なアッセイ指示書と一緒に適切な容器にパッケージングすることにより、適切な試薬を含んだ免疫診断に適したキットを製造する。
本明細書に詳述する組換えタンパク質を使用するアッセイ方式を設計することができる。本発明者らはCKSタンパク質を記載しているが、本発明でスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）等のような他の発現系を使用して、様々な方法で使用できる融合タンパク質、例えばイムノアッセイの抗原、抗体産生用免疫原等を産生できるとも考えられる。ヒト試験試料中の特異被分析物質（例えばウイルスのような感染物質）に対する抗体の存在を検出するためのアッセイ方式では、ヒト試験試料を、少なくとも１種の組換えタンパク質（ポリペプチド）でコーティングした固相と接触させてインキュベートする。試験試料中に抗体が存在すれば、この抗体は抗原ポリペプチドと複合体を形成して、固相に固定化する。複合体の形成後、固相を洗浄して未結合の物質や試薬を除去する。複合体を指示試薬と反応させて、第２の複合体形成のための時間及び条件下でインキュベートする。生成したシグナルを検出して、試験試料中でのCKS組換えポリペプチドに対する抗体の存在を調べる。カットオフ値より高いシグナル生成は、試験試料中に被分析物質に対する抗体が存在することを示す。酵素のような多数の指示試薬を用いると、存在する抗体の量は生成するシグナルに比例する。試験試料の種類によっては、試験試料を適切な緩衝試薬で希釈してもよいし、濃縮してもよいし、操作せずに（“ニート”）固相と接触させてもよい。例えば通常は、予め希釈した血清もしくは血漿試料を試験するか又は尿のような試料を濃縮して、抗体の存在及び／又は存在する抗体の量を調べることが好ましい。
更には、研究中の感染物質のウイルスゲノムの様々な抗原エピトープに対するCKS融合タンパク質を使用して特異感染物質に対する抗体の存在を試験する前述のアッセイ方式では、２種以上の組換えタンパク質を使用することができる。従って、特異ウイルス抗原領域内のエピトープと、ウイルスゲノム由来の他の抗原領域に由来するエピトープとを含んでいる組換えポリペプチドを使用して、１種のエピトープに由来するポリペプチドを用いるよりも感度が増し、恐らくは特異性高いアッセイを提供することが好ましえであろう。このようなアッセイは、確認（confirmatory）アッセイとして使用することができる。この特定のアッセイ方式では、既知量の試験試料を、組換えタンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１種の組換えタンパク質でコーティングされた既知量の少なくとも１種の固相と接触させる。反応を生起するための時間、適切な条件下で、複合体を既知量の適切な指示試薬と接触させる。生成したシグナルを陰性試験試料と比較して、試験試料中での被分析物質に対する抗体の存在を調べる。微粒子のようなある種の固相を使用するときには、アッセイで使用される各組換えタンパク質が、個々の微粒子や、種々の被覆微粒子を合わせて製造される前記微粒子の混合物に付着して、各アッセイのために最適化され得る。
前述のアッセイ方式の変形には、各被分析物質に対する抗体の存在を検出するための同一又は異なる固相に付着した種々の被分析物質のCKS組換えタンパク質（例えば同一又は異なる固相上にコーティングされた１種の感染物質のある抗原領域に特異的なCKS組換えタンパク質）を、異なる感染物質のある抗原領域に特異的なCKS組換えタンパク質と共に取り込んで、一方（又は両方）の感染物質の存在を検出することが挙げられる。
他のアッセイ方式としては、抗原エピトープを含むCKS組換えタンパク質が、中和アッセイのような競合アッセイで有用である。中和アッセイを実施するには、ウイルスのような感染物質の抗原領域のエピトープを示す組換えポリペプチドを可溶化し、試料希釈液と混合して、0.5〜50.0μg/mlの最終濃度にする。所要により希釈した既知量の試験試料（好ましくは10μｌ）を反応ウェルに添加し、次いで組換えポリペプチドを含む試験希釈液400μｌを添加する。所望とあれば、混合物を約15分〜２時間プレインキュベートしてもよい。次いで、本明細書に記載のCKS組換えタンパク質でコーティングした固相を反応ウェルに加え、約40℃で１時間インキュベートする。洗浄後、既知量の指示試薬、例えば結合希釈液中のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG 200μｌを添加し、40℃で１時間インキュベートする。洗浄後、前述のような酵素結合体を使用するときには、酵素基質（例えばOPD基質）を添加して、室温で30分間インキュベートする。1N硫酸のような停止剤を反応ウェルに添加して、反応を停止させる。492nmで吸光度を読み取る。特異ポリペプチドに対する抗体を含む試験試料では、溶液中でのペプチドと前記抗体との競合結合によるシグナル生成は減少する。競合結合のパーセンテージは、組換えポリペプチドの存在下での試料の吸光度値を、同一希釈度の組換えポリペプチドの不在下でアッセイした試料の吸光度値と比較して計算することができる。従って、組換えタンパク質の存在下の試料と、組換えタンパク質の不在下の試料との間で生じるシグナルの差は、抗体の存在又は不在を調べるために使用する尺度となる。
他のアッセイ方式としは、イムノドットブロットアッセイ系で組換えタンパク質を使用することができる。イムノドットプロットアッセイ系は、ニトロセルロース固相担体上に並置された精製組換えポリペプチドのパネルを使用する。製造した固相担体を試料と接触させ、組換えタンパク質（他の特異結合要素）に対する特異抗体（特異結合要素）を捕捉して、特異結合要素対を形成する。捕捉した抗体は、指示試薬と反応させて検出する。1988年８月２日出願の米国特許出願第07/227,408号に記載されている機器内でレフレクタンスオプチックスアセンブリーを用いて、結合体特異反応を定量することが好ましい。関連米国特許出願第07/227,586号及び第07/227,590号（共に1988年８月２日出願）は更に、本出願人によるものであり、参考として本明細書に組み入れる米国特許第5,075,077号（1988年８月２日出願）の米国特許出願第07/227,272号）と同様に、イムノドットアッセイを実施するのに有用な特定方法や装置を記載している。簡潔に言えば、ニトロセルロースベースの試験カートリッジを多数の抗原ポリペプチドで処理する。各ポリペプチドは、試験カートリッジ上の特異反応ゾーン内に含まれている。全ての抗原ポリペプチドがニトロセルロース上に置かれた後に、ニトロセルロース上の過剰結合部位を阻止する。次いで、試験カートリッジを試験試料と接触させて、試験試料が適切な抗体を含めば各反応ゾーンの各抗原ポリペプチドが反応するようにする。反応後、試験カートリッジを洗浄し、よく知られた適切な試薬を用いて、任意の抗原抗体反応を同定する。本明細書に引用した特許及び特許出願に記載されているように、全プロセスは自動化可能である。イムノドットブロットアッセイを実施するための方法及び装置に関連する前記出願明細書は参考として本明細書に組み入れる。
試験試料中に被分析物質の特異抗原に対する抗体を検出するために後述する第１及び第２の固相担体を使用するアッセイでCKS融合タンパク質を使用することができる。このアッセイ方式では、試験試料の第１のアリコートを、組換えタンパク質／被分析物質抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、被分析物質に特異的なCKS組換えタンパク質でコーティングされた第１の固相担体と接触させる。次いで、複合体を、組換え抗原に特異的な指示試薬と接触させる。指示試薬を検出して、試験試料中での組換えタンパク質に対する抗体の存在を調べる。その後、試験試料の第２のアリコートを、組換えタンパク質／第２の抗体の複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、第２の抗体に特異的なCKS組換えタンパク質でコーティングされた第２の固相担体と接触させて、同一被分析物質の異なる抗原決定基の存在を調べる。複合体を、複合体の抗体に特異的な第２の指示試薬と接触させる。シグナルを検出して、試験試料中での抗体の存在を調べる。一方又は両方の被分析物質組換えタンパク質に対する抗体の存在は、試験試料中に抗被分析物質が存在することを示している。固相担体を同時に試験できるとも考えられる。
ハプテンの使用は当業界では公知である。CKS融合タンパク質を用いるアッセイでハプテンを使用して、アッセイの性能を高めることもできると考えられる。
プローブを用いたHGBVゲノム、ビリオン及びウイルス抗 原の更なる特性分析
HGBV核酸配列を使用して、HGBVゲノムの配列、並びにHGBV剤の同定及び単離について更なる情報を得ることができる。従って、この知識は、HGBVの特性（例えばHGBVゲノムの種類、ウイルス粒子の構造、及びHGBVを構成する抗原の種類）の分析に役立つと考えられる。この情報により、付加的なポリヌクレオチドプローブ、HGBVゲノムに由来するポリペプチド、及びHGBVエピトープに対する抗体を得ることができる。これらは、HGBVにより発病する非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の診断及び／又は治療に有益である。
核酸配列情報は、HGBVゲノムの非確定領域に由来する更なる核酸配列を単離するためのプローブ又はPCRプライマーの設計に有用である。例えば、８個以上、好ましくは20個以上のヌクレオチドの配列を含み、HGBV核酸配列ファミリーの5'末端又は3'末端に近い領域に由来するPCRプライマー又は標識プローブを使用して、重複核酸配列をHGBVゲノム又はcDNAライブラリーから単離してもよいし、ウイルス核酸から直接単離してもよい。次いで、HGBV核酸配列と重複するが、該HGBV核酸配列のソースではないゲノムの領域に由来する配列を更に含んでいる前記配列を使用して、必ずしもクローン中の核酸配列とは重複しない他の重複断片を同定するためのプローブを合成してもよい。HGBVゲノムがセグメント化されていても共通配列が欠けていれば、ウイルスゲノムに由来する重複核酸配列の単離技術を使用して、全ウイルスゲノムの配列を決定することが可能である。あるいは、精製したHGBV粒子から単離したウイルスゲノムから、ゲノムセグメントの特性分析を行うことができる。HGBV粒子を精製し、精製手順中に該粒子を検出する方法は本明細書に記載する。ウイルス粒子からポリヌクレオチドゲノムを単離する手順は当業界ではよく知られている。次いで、単離したゲノムセグメントをクローニングして配列決定することができる。従って、HGBVゲノムをその種類とは関係なくクローニングして配列決定することが可能である。HGBVゲノム又はcDNAライブラリーの構築方法は当業界では公知であり、このために有用なベクターも当業界では公知である。これらのベクターには、λ−gt11、λ−gt10等が含まれる。単離したポリヌクレオチドを適切な制限酵素で消化して、HGBVゲノム又はcDNA由来のプローブにより検出されるHGBV由来の核酸配列をクローンから単離し、配列決定してもよい。
これらの重複HGBV核酸配列に由来する配列情報は、ウイルスゲノム内の相同性エリア及び異質性エリアを決定するのに有用である。これは、種々のゲノム株及び／又は欠陥粒子集団の存在を示し得る。これは、本明細書に記載の技術を使用して、HGBVの単離中に、生物試料中のHGBV又はHGBV抗原又はHGBV核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブの設計にとっても有用である。重複核酸配列を使用して、HGBVゲノム由来のポリペプチドに対する発現ベクターを産生してもよい。HGBVに対してユニークであると考えられるエピトープを含む抗原が核酸配列ファミリー内にコードされている。即ち、これらの抗原に対する抗体は、HAV、HBV、HCV及びHEVに感染した個体には存在せず、GenBankのゲノム配列と、これらの核酸配列及び前記ソースのポリヌクレオチド配列との間の相同性は小さいと考えられる。従って、HGBV核酸配列でコードされた抗原に対する抗体を使用して、感染個体から単離した非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型粒子を同定してもよい。更には、これらはHGBV物質の単離にも有用である。
HGBV粒子は、例えばサイズ識別をベースとする技術（例えば沈降もしくは排除法）、又は密度をベースとする技術（例えば密度勾配超遠心分離、もしくはポリエチレングリコール（PEG）のような物質による沈殿、もしくはアニオンもしくはカチオン交換材料や、疎水性相互反応により結合する材料、及び親和性カラムのような様々な材料でのクロマトグラフィー）を含む当業界で公知の任意の方法により、感染個体の血清又は細胞培養物から単離することができる。単離手順中に、HGBV核酸配列に由来するプローブを用いて抽出ゲノムのハイブリダイゼーション分析を行って、又はHGBV核酸配列ファミリー内にコードされたHGBV抗原に対する抗体をプローブとして使用するイムノアッセイによりHGBVの存在を検出することができる。抗体はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよく、抗体をイムノアッセイで使用する前に精製することが所望され得る。固相に固定化したHGBV抗原に対する前記抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるHGBVの単離に有用である。イムノアフィニティークロマトグラフィー法は当業界では公知であり、免疫選択活性を保持するように抗体を固相に固定化する方法を含んでいる。これらの方法には、吸着及び共有結合が含まれる。抗体の抗原結合部位が接近可能なままであるように、二官能価カップリング剤にスペーサー基を含ませてもよい。
精製手順中に、HGBVゲノム又はcDNA配列ファミリー、及び重複HGBV核酸配列に由来するポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして使用して、HGBVの存在を核酸ハイブリダイゼーション又はPCRにより検出及び／又は検証してもよい。ウイルス粒子の破壊を引き起こす条件下で、例えばキレート化剤の存在下で洗剤を使用して画分を処理し、ウイルス核酸の存在をハイブリダイゼーション技術又はPCRにより調べる。個体（好ましくはタマリン）に単離したウイルス粒子を感染させ、次いで本明細書に記載の非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の症状が感染によるものかどうかを調べることにより、単離した粒子がHGBV感染誘発物質である別の確証が得られ得る。
次いで、精製した調製物から得た前述のウイルス粒子の特性を更に分析することができる。ゲノム核酸を精製すれば、これを試験して、RNAse又はDNAse Iに対する感度を調べることができる。これらの試験に基づいて、HGBVをRNAゲノム又はDNAゲノムとして調べてもよい。当業界で公知の方法により、例えば電子鏡検法による可視化、密度勾配による移動及び沈降特性により、鎖の数及び環状性又は非環状性を調べることができる。HGBVゲノムのハイブリダイゼーションから、精製核酸の陰性又は陽性鎖数（strandedness）を調べることができる。更には、ゲノム材料がRNAならば、公知の技術（例えば逆転写酵素）により精製核酸をクローニングして配列決定することができる。次いで、ウイルス粒子に由来する核酸を用いて、全ゲノムをセグメント化の如何を問わず配列決定することが可能である。
保存された配列を含むポリペプチドの決定は、HGBVゲノムと結合するプローブ選択に有用であり、それはプローブを単離することにつながる。更には、保存された配列を、HGBV核酸配列に由来する配列と一緒に使用して、ゲノム配列を増幅する系で使用するプライマーを設計してもよい。更には、HGBVの構造を調べて、その成分を単離してもよい。例えば電子鏡検法により形態及び寸法を調べることができる。抗原が主要ウイルス成分中に存在するのか、少量ウイルス成分中に存在するのかを確かめ、単離した核酸配列内にコードされた特異抗原に対する抗体をプローブとして使用して、特異ウイルスポリペプチド抗原［例えばエンベロープ（コート）抗原又は内部抗原（例えば核酸結合タンパク質もしくはコア抗原）］や、ポリヌクレオチドポリメラーゼを同定して位置を調べることもできる。この情報は、診断及び治療用途に有用であり得る。例えば、ワクチン調製物中に外部抗原を含めることが好ましく、又は恐らく多価ワクチンは、構造タンパク質をコードするゲノムに由来するポリペプチド、及びゲノムの他の部分に由来するポリペプチド（例えば非構造ポリペプチド）からなり得る。
HGBV複製用の細胞培養系及び動物モデル系
一般に、HGBVの培養に適した細胞又は細胞系は、サル腎臓細胞（例えばMK2及びVERO）、ブタ腎臓細胞系（例えばPS）、ハムスター乳児腎臓細胞系（例えばBHK）、マウスマクロファージ細胞系（例えばP388D1、MK1及びMm1）、ヒトマクロファージ細胞系（例えばＵ−937）、ヒト末梢血白血球、ヒト付着単球、肝細胞又は肝細胞系（例えばHUH7及びHepG2）、胚もしくは胚細胞（例えばニワトリ胚線維芽細胞）、又は無脊椎動物、好ましくは昆虫に由来する細胞系（例えばショウジョウバエ細胞系）、更に好ましくは節足動物に由来する細胞系（例えば蚊細胞系もしくはマダニ細胞系）を含み得る。一次肝細胞を培養し、次いでこれにHGBVを感染させることも可能である。あるいは、肝細胞培養物を、感染個体（ヒト又はタマリン）の肝臓から誘導することができる。後者の場合は、in vivo感染させてin vitro継代させた細胞系の例である。更には、種々の不死化方法を使用して、肝細胞培養物に由来する細胞系を得ることができる。例えば、（肝細胞集団の増菌前後の）一次肝臓培養物を種々の細胞と融合して、安定性を維持することができる。更には、培養物に形質転換ウイルスを感染させるか、形質転換遺伝子をトランスフェクトして、永続的な又は半永続的な細胞系を生成してもよい。更には、肝臓培養物中の細胞を融合して、PehG2のような確定した細胞系にしてもよい。細胞融合方法は当業者にはよく知られており、とりわけPEG及びセンダイウイルスのような融合剤の使用を含んでいる。
細胞系のHGBV感染は、細胞内へのウイルス侵入を可能とする条件下で、細胞をウイルス調製物と共にインキュベートするような技術により達成され得ると考えられる。細胞に、単離したウイルスポリヌクレオチドをトランスフェクトさせてウイルス調製物を得ることも可能であり得る。組織培養細胞をトランスフェクトする方法は当業界では公知であり、エレクトロポレーション及びDEAE−デキストラン又はリン酸カルシウムによる沈殿を使用する技術が含まれるが、これに限定はされない。クローニングしたHGBVゲノム又はcDNAによるトラスフェクションでウイルスが複製され、in vitro増殖する。培養した細胞の他に、ウイルス複製に動物モデル系を使用してもよい。従って、HGBV複製はチンパンジー、更には例えばマーモセット及び乳児マウスで生起し得る。
HGBV抗ウイルス剤のスクリーニング
HGBV用の細胞培養系及び動物モデル系が利用できることから、HGBV複製を阻害する抗ウイルス剤、特に好ましくはウイルス複製を阻害しつつ細胞増殖を可能とする物質のスクリーニングも可能となる。これらのスクリーニング方法は当業界では公知である。一般に、ウイルス複製を支える細胞培養系で抗ウイルス剤がウイルス複製の阻止に及ぼす作用、次いで感染性又はウイルス病原性の阻害、また低レベルの毒性について、抗ウイルス剤を様々な濃度で動物モデル系にて検査する。本明細書に記載するHGBV抗原及びHGBVポリヌクレオチドの検出のための方法及び組成物は、抗ウイルス剤のスクリーニングに有用である。何故ならば、これらは、抗ウイルス剤のウイルス複製への作用の検出については、細胞プラークアッセイ又はID₅₀アッセイよりも恐らく高感度の代替手段となるからである。例えば、本明細書に記載するHGBVポリヌクレオチドプローブを使用して、細胞培養物中に産生されるウイルス核酸の量を定量してもよい。これは、感染細胞核酸を標識したHGBVポリヌクレオチドプローブでハイブリダイズ又は競合ハイブリダイズすることにより実施され得る。更には、抗HGBV抗体を使用して、本明細書に記載するイムノアッセイにより、細胞培養物中のHGBV抗原を同定、定量してもよい。更には、競合アッセイにより感染細胞培養物中のHGBV抗原を定量することが所望され得るので、本明細書に記載するHGBV核酸配列内にコードされるポリペプチドはこれらのアッセイで有用である。一般に、HGBVゲノム又はcDNAに由来する組換えHGBVポリペプチドを標識し、細胞培養系で産生された抗原による、前記標識ポリペプチドとHGBVポリペプチドとの結合の阻害を監視する。これらの方法は、HGBVが細胞死を起こさずに細胞系で複製し得る場合に特に有用である。
HGBV弱毒化株の調製
本明細書に記載する組織培養系及び／又は動物モデル系を用いて、HGBV弱毒化株を単離することが可能であり得る。これらの弱毒化株は、ワクチンとして又はウイルス抗原の単離に有用である。弱毒化株は、細胞培養物及び／又は動物モデルに何度も継代させた後に単離することができる。感染した細胞又は個体での弱毒化株の検出は、当業界で公知の以下の方法に従って達成可能であり、検出には、HGBVにコードされた１種以上のエピトープに対する抗体のプローブとしての使用、又は長さが少なくとも約８ヌクレオチドのHGBV配列を含むポリヌクレオチドのプローブとしての使用が含まれ得る。これに加え又はこれに代わって、本明細書に記載するHGBVのゲノム情報を使用し、また組換え技術を使用して弱毒化株を構築してもよい。通常、ウイルス複製ではなく、病原性に関連するポリペプチドをコードするゲノムの領域を欠失させる。ゲノムを構築すれば、HGBVに対する中和抗体を産生するエピトープを発現させることができる。次いで、変性ゲノムを使用して、HGBV複製を可能とする細胞を形質転換して、細胞をウイルス複製を可能とする条件下で増殖させることができる。弱毒化HGBV株はワクチン用としてだけでなく、ウイルス抗原の商業的産生のソースとしても有用である。何故ならば、これらのウイルスの処理は、ウイルス産生及び／又はウイルス製品の製造に係わる従業員に対してそれほど厳密な保護措置を必要としないからである。
宿主及び発現制御配列
ゲノムをウイルスから抽出し、ゲノムライブラリーを作成、プロービングし、クローンの配列を決定し、発現ベクターを構築し、細胞を形質転換し、免疫アッセイを実施し、培養物中で細胞を増殖させるために使用する一般的な技術は当業界では公知であり、本発明に包含する。
指定の宿主と適合する適切な制御配列を使用するときには、原核宿主細胞及び真核宿主細胞の両方を、所望のコード化配列の発現のために使用することができる。原核宿主としては、E.coliが最も頻繁に使用される。原核生物の発現制御配列には、場合によってオペレーター部分を含むプロモーターや、リボソーム結合部位が含まれる。原核宿主と適合するトランスファーベクターは通常、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミドpBR322や、更に抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含む種々のpUCベクターから誘導される。これらのマーカーを使用して、選択により良好な形質転換細胞を得ることができる。通常使用される原核生物制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Chang等，N ature 198:1056［1977］）、（Goeddel等，Nucleic A cid Res 8:4057［1980］により報告されている）トリプトファンプロモーター系、λ誘導P1プロモーター及びＮ遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake等，Nature 292:128［1981］）、並びにtrp及びlacUV5プロモーターの配列に由来するハイブリッドTacプロモーター（De Boer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 292:128［1983］）が含まれる。前述の系は、特にE.coliに適合し得るが、所望とあれば、Bacillus株又はPseudomonas株のような他の原核宿主を対応する制御配列と共に使用してもよい。
真核宿主は、培養系の酵母及び哺乳動物細胞を含んでいる。Saccharomyces cerevisiae及びSaccharomyces carlsbergensisが最も一般的に使用されている酵母宿主であり、好都合な真菌宿主である。酵母適合性ベクターは、栄養要求突然変異株を原栄養性とするか又は野生型株に重金属耐性を付与して良好な形質転換細胞の選択を可能とするマーカーを保有する。酵母適合性ベクターは、２ミクロン複製オリジン（Broach等，Meth.Enz.101;307［1983］）、CEN3とARS1の組み合わせ、又は複製を行うための他の手段（例えば宿主細胞ゲノム内への適切な断片の取り込みをもたらす配列）を使用し得る。酵母ベクターの制御配列は当業界では公知であり、３−ホスホフィセレートキナーゼ（phosphophycerate kinase）用プロモーターを含む解糖酵素合成用プロモーターを含んでいる。例えば、Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7:149（1968）、Holland等，Biochemistry 17:4900（1978）及びHitzeman J.Biol.Chem.255:2073（1980）を参照されたい。Holland,J.Biol.Chem.256:1385（1981）に報告されているエノラーゼ遺伝子に由来するようなターミネーターも含まれ得る。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）プロモーター又はアルコールデヒドロゲネーゼ（ADH）調節可能プロモーター、更にGAPDHから誘導されるターミネーター、また分泌が望ましければ、酵母αファクターに由来するリーダー配列を含む系であると考えられる。更には、操作可能に連結した転写調節領域及び転写開始領域は、野生型生物で先天的に関連しないようなものであり得る。
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当業界では公知であり、American Type Culture Collectionから入手可能な多数の不滅化細胞系が含まれる。これらには、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ハムスター乳児腎臓（BHK）細胞等が含まれる。哺乳動物細胞に適したプロモーターも当業界では公知であり、Simianウイルス40（SV40）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイルス（ADV）、ウシ乳頭腫ウイルス（BPV）、サイトメガロウイルス（CMV）に由来するようなウイルスプロモーターが含まれる。哺乳動物細胞は更に、ターミネーター配列及びポリＡ付加配列を必要とし得る。発現を増加させるエンハンサー配列を含めてもよいし、遺伝子の増幅を誘発する配列も所望され得る。これらの配列は当業界では公知である。哺乳動物細胞の複製に適したベクターは、ウイルスレプリコン、又は非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型エピトープをコードする適切な配列の宿主ゲノム内への取り込みを確実にする配列を含み得る。HCVの哺乳動物発現系の一例は、1992年１月31日出願の米国特許出願第07/830,024号に記載されている。
形質転換
形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための公知の方法によって可能であり、ポリヌクレオチドをウイルス内に組み込んだウイルスによる宿主細胞の形質導入、及びポリヌクレオチドの直接取り込みを含む。選択する形質転換手順は、形質転換すべき宿主に依存する。直接の取り込みによる細菌の形質転換は一般に、塩化カルシウム又は塩化ルビジウムによる処理を使用する。Cohen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110（1972）。Graham等，Virology 52:526（1978）のリン酸カルシウム沈殿法又はその変形を用いて、直接の取り込みによる酵母形質転換を実施してもよい。
ベクター構築
ベクター構築は当業界で公知の方法を使用する。一般には、市販酵素の製造業者により一般に規定されている条件下にて、適切な制限酵素で処理して、部位特異的DNA開裂を実施する。通常、約20μｌの緩衝溶液中の１〜10単位の酵素を用いて37℃で１〜２時間インキュベートすることにより、約１マイクログラム（μｇ）のプラスミド又はDNA配列を開裂する。制限酵素と共にインキュベートした後に、フェノール／クロロホルム抽出によりタンパク質を除去し、エタノールと共に沈殿させてDNAを回収する。開裂断片は、当業者に公知の方法により、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気泳動法を用いて分離してもよい。
混合物中に存在する適切なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（dNTP）の存在下で，E.coli DNAポリメラーゼ１（クレノウ）を用いて付着端開裂断片をブラント末端にしてもよい。S1ヌクレアーゼによる処理を使用して、一本鎖DNA部分を加水分解してもよい。
T4 DNAリガーゼ及びATPを用い、標準的な緩衝液及び温度条件下で結合する。付着端結合は、ブラント末端結合ほどATPやリガーゼを必要としない。ベクター断片を結合混合物の一部として使用するときは、ベクター断片をしばしば細菌アルカリ性ホスファターゼ（BAP）又は仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理して、5'−ホスフェートを除去し、ベクターの再結合を妨げる。あるいは、所望しない断片の制限酵素消化を使用して、結合を妨げることができる。結合混合物を、E.coliや、抗生物質耐性を含む方法により選択された良好な形質転換細胞のような適切なクローニング宿主内に形質転換し、次いで正しい構築についてスクリーニングする。
望ましいDNA配列の構築
Warner,DNA 3:401（1984）が記載するような自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドを産生してもよい。所望とあれば、標準的な反応条件を用いて、³²P−ATPの存在下にてポリヌクレオチドキナーゼで処理して、合成鎖を³²Pで標識することができる。DNA配列（例えばゲノム又はcDNAライブラリーから単離したDNA配列）を、公知の方法［例えばZoller,Nu cleic Acid Res.10:6487（1982）に記載の特定部位の突然変異誘発］により改変してもよい。簡潔に言えば、改変すべきDNAを一本鎖配列としてファージ内にパッケージングし、改変すべきDNA部分に相補的であり、自身の配列に所望の改変を含む合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてDNAポリメラーゼで二本鎖DNAに変換する。ファージの各鎖の複製域を含む形質転換細菌の培養物を寒天平板培養して、プラークを得る。理論的には新しいプラークの50％が、突然変異配列を有するファージを含み、残りの50％は元の配列を有する。非改変配列ではなく、正しい鎖とのハイブリダイゼーションに適した温度及び条件下で、プラーク複製物を標識した合成プローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションにより同定された配列を回収して、クローニングする。
プローブとのハイブリダイゼーション
Grunstein及びHogness,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:3961（1975）に記載の手順を用いて、HGBVゲノム又はDNAライブラリーをプロービングしてもよい。簡潔に言えば、プロービングすべきDNAをニトロセルロースフィルター上に固定化し、変性し、０〜50％ホルムアミド、0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、それぞれ0.02％（w/v）のウシ血清アルブミン（BSA）、ポリビニルピロリドン及びFicoll、50mMリン酸ナトリウム（pH6.5）、0.1％SDS並びに100μg/mlキャリヤー変性DNAを含む緩衝液でプレハイブリダイズする。緩衝液中のホルムアミドのパーセンテージ、及びプレハイブリダイゼーションやその後のハイブリダイゼーション工程の時間／温度条件は、必要とされる厳密度に依存する。厳密度条件が低くてもよいオリゴマープローブは一般に、ホルムアイドを低率に、温度をより低く、ハイブリダイゼーション時間をより長くして使用する。cDNA又はゲノム配列から誘導されるような30又は40個以上のヌクレオチドを含むプローブは一般に、例えば約40〜42℃のより高温と、例えば50％と高率のホルムアミドを使用する。プレハイブリダイゼーションの後に、³²P標識オリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し、ハイブリダイゼーション条件下でフィルターをこの混合物中でインキュベートする。洗浄後、被処理フィルターをオートラジオグラフィーにかけて、ハイブリダイズしたプローブの位置を示す。元の寒天プレート上の対応位置にあるDNAを所望のDNAのソースとして使用する。
構築の検証及び配列決定
標準的なベクター構築では、結合混合物をE.coli株XL−１ Blue又は他の適切な宿主内に形質転換し、良好な形質転換細胞を抗生物質耐性又は他のマーカーにより選択する。次いで、通常はClewell等，J.Bacteriol.110:667（1972）に記載のようなクロラムフェニコール増幅の後に、Clewell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62:1159（1969）の方法で、形質転換細胞由来のプラスミドを産生する。DNAを単離し、通常は制限酵素分析及び／又は配列決定により分析する。Messing等，Nucleic Acid Res.9:309（1981）にも記載されているSanger等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 74:5463（1977）のよく知られたジデオキシ法により、又はMaxam等，Methods in Enzymo logy 65:499（1980）に記載の方法により、配列決定してもよい。GCに富む領域で時々観察されるバンド圧縮の問題は、Barr等，Biotechniques 4:428（1986）に記載の方法により、Ｔ−デアゾグアノシンを用いて克服される。
エンザイムリンクドイムノソーベントアッセイ
エンザイムリンクドイムノソーベントアッセイ（ELISA）を使用して、抗原濃度又は抗体濃度を測定することができる。この方法は、酵素ラベルと抗原又は抗体との結合に依存し、結合酵素活性（生成シグナル）を定量ラベル（測定可能な生成シグナル）として使用している。酵素をラベルとして使用する方法、及びこのような酵素ラベルの例は本明細書に記載する。
HGBV核酸配列の作成
非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型物質のソースは、本明細書に記載する臨床的及び実験的基準に合致するHGBVウイルスに感染したヒト又はタマリンからの個々の血漿、血清もしくは肝臓ホモジネート又はそのプールである。あるいは、以下に記載する基準に合致する非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型肝炎に罹患した他の個体の血液をタマリンに実験的に感染させることができる。高レベルのアラニントランスフェラーゼ活性を含む個々の血漿、血清又は肝臓ホモジネート試料を多数合わせてプールを調製することができる。この活性は、HGBV感染による肝炎性損傷によるものである。本発明者らの実験のひとつで計算したウイルスのTID（タマリン感染価）は４×10⁵個/ml以上であった（以下の実施例２を参照）。
例えば、高力価であることが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい血漿、血清又は肝臓ホモジネートに由来する核酸ライブラリーを以下の方法で作成する。まず血漿、血清又は肝臓ホモジネートからウイルス粒子を単離する。次いで、アリコートを緩衝溶液（例えば50mMトリス−HCl（pH8.0）、1mM EDTA、100mM NaClを含む緩衝溶液）中に希釈する。例えば15,000×ｇ、20℃で20分間の遠心分離により破片を除去する。次いで、当業者により慣用的に決定され得る適切な条件下で遠心分離を行って、得られた上清中のウイルス粒子をペレット化する。ウイルスゲノムを放出するために、ペレットをSDS懸濁液［例えば１％SDS、120mM EDTA、10mMトリス−HCl（pH7.5）を含み、更に2mg/mlのプロテイナーゼＫを含んでいる懸濁液］のアリコート中に懸濁させ、次いで適切な条件下で、例えば45℃で90分間インキュベートして粒子を破壊する。例えば0.8μｇ MS2バクテリオファージRNAをキャリヤーとして添加し、この混合物をフェノール：クロロホルム［0.5Mトリス−HCl（pH7.5）、0.1％（v/v）β−メルカプトエタノール、0.1％（w/v）ヒドロキシキノロンで飽和させたフェノール］の1:1混合物で４回抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出して核酸を単離する。水性相を例えば１−ブタノールで濃縮した後に、2.5容量の無水エタノールと共に−20℃で一晩沈殿させる。例えばBeckman SW41ローターにて、40,000rpm、４℃で90分間遠心分離にかけて核酸を回収し、これを水に溶解し、0.05％（v/v）ジエチルピロカーボネートで処理して、オートクレーブ処理する。
前記手順により得られた核酸を、例えば17.5mM CH₃HgOHで変性し、次いでこの変性核酸を鋳型として用いてcDNAを合成し、例えばHuynh（1985、上掲）に記載の方法を用いてファージλ−gt11のEcoR I部位内にクローニングする。但し、逆転写酵素により第１核酸鎖の合成中にランダムプライマーをオリゴ（dT）12−18に代える（Taylor等，［1976］参照）。得られた二本鎖核酸配列を、例えばセファロースCL−4Bカラム上でのサイジングにより分別する。平均寸法が約400、300、200及び100塩基対の溶離材料をゲノムプール内にプールする。少なくとも１つのプール内のcDNAから、λ−gt11 cDNAライブラリーを作成する。あるいは、病因物質がDNAウイルスの場合、ゲノムDNAのクローニング方法が有用であり、これは当業者には公知である。
このようにして作成されたλ−gt11ゲノムライブラリーを、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型肝炎既往個体（以下で説明する基準に合致する）からの血清、血漿又は肝臓ホモジネートと特異結合し得るエピトープについてスクリーニングする。Huyng等（上掲）の方法を用いて、約10⁴〜10⁷個のファージを血清、血漿又は肝臓ホモジネートを用いてスクリーニングする。¹²⁵I又は他の適切なリポーター分子（例えばHRPO、アルカリ性ホスファターゼ等）で放射性標識したヒツジ抗ヒトIg抗血清で結合ヒト抗体を検出することができる。陽性ファージを同定して、精製する。次いで、同一方法を用い、先にHGBV物質に感染した所定人数の各ヒトの血清との結合の特異性について、前記ファージを試験する。理想的には、ファージは、試験する血清、血漿又は肝臓ホモジネートの全て又は大半と反応するポリペプチドをコードし、HGBV物質やＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎について本明細書に記載した基準により“陰性”であることが確定した個体からの血清、血漿又は肝臓ホモジネートとは反応しない。これらの手順に従って、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型であると同定された患者からの血清、血漿又は肝臓ホモジネートにより免疫学的に特異認識されるポリペプチドをコードするクローンを単離することができる。
以下で本発明を実施例により説明する。これらの実施例は例示的であって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
本明細書に記載されている実施例は、HGBV群のウイルスの発見方法を詳細に記載するものである。該実施例は、HGBV群のHGBV−Ａ、HGBV−Ｂ及びHGBV−Ｃウイルスの発見をたどり得るように年代順に記載されている。一般的には、先ず伝播性及び感染性の研究が行われた。本明細書に記載されているこれらの研究及びその後の研究により、HGBVとしてGB−Ａ及びGB−Ｂの２種のHCV様ウイルスの存在が実証された。さらに、これも本明細書に詳細に記載されている退化性（degenerative）プライマーを用いたその後の実験によりHGBV−Ｃが発見された。血清研究により実証された該ウイルス群のヒトにおける罹患率、該ウイルス群のウイルス特性分析、その特定の属における他のウイルスとの関連性及びHGBV−Ａ、HGBV−Ｂ及びHGBV−Ｃの相互関連性も教示する。
実施例1. HGBVの伝播性
A. 実験プロトコル。伝播性及び感染性研究用に、LEMSIP（Laboratory for Experimental Medicine and Surgery in Primates,Tuxedo,New York）から16匹のタマリン（Saguinus labiatsu）を入手した。動物全てをLEMSIPにより承認されたプロトコルに従ってLEMSIPで維持且つ監視した（注：動物１匹が自然死し、もう１匹の病弱な動物は感染力実験の開始前に安楽死させた）。血清肝酵素アラニントランスアミナーゼ（ALT）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ICD）について、２〜３週間の間、１週間に一度又は２週間に一度得た血清試料に基づいて基準血清肝酵素値を決定した。接種に先立って各動物につき最低８つの血清肝酵素値を得た。平均肝酵素値＋標準偏差の3.75倍に基づき、各動物についてカットオフ値（CO）を決定した。カットオフ値を超える肝臓酵素値は異常であり、肝臓が損傷を受けているとみなした。数匹のタマリンに以下に記載のように接種し、ALT、GGT及びICD血清レベルにおける変化を監視した。その後、監視過程の間の特定時期に、その後の実験用の血清及び組織を得るべく動物数匹を殺した。
B. 動物の接種（初期実験）。HGBVを接種した９匹のタマリンから肝炎の初期急性期（接種後19〜24日）の間に採取した血清から、既知の感染性タマリンGB血清プール（H205 GBパス11として示される11回継代）を調製した。該プールは、既に記載（J.L.Dienstagら，Nature 264,前出;E.Taborら,J.Med.virol.5,前出）されており、関連病因物質を決定するために研究された。該プールのアリコートは、この実験研究に用いられるまでAbbott Laboratories（North Chicago,IL60064）において液体窒素貯蔵条件下に維持されていた。HGBVの他のアリコートはAmerican Type Culture Collection（A.T.C.C.）,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD20852から、A.T.C.C.受託番号第VR−806号の下に入手し得る。
第１日目に、初期群の残りの14匹中４匹ののタマリン、認識番号Ｔ−1053、Ｔ−1048、Ｔ−1057及びＴ−1061に、前以て1:50に希釈しておいたプールH205、11回継代0.25mlを静脈内接種した。これらの動物を肝酵素ALT、GGT及びICDの変化について毎週監視した。表２は、これら４匹のタマリン（Ｔ−1053、Ｔ−1048、Ｔ−1057及びＴ−1061）に関する接種前及び接種後の肝酵素データを示す。図１〜４は、接種前及び接種後のこれら４匹のタマリンのALTレベル及びICDレベルを示している。該データが示しているように、プールH205の1:50の希釈物を接種した４匹のタマリンのALT、GGT及びICDにCOを超える有意な上昇が得られた。
同日（第１日目）、１匹のタマリン（Ｔ−1047）に、プールされた正常タマリン血清0.25mlを静脈内接種して陰性対照として用い、もう１匹のタマリン（Ｔ−1042）には、プールされた正常ヒト血清を静脈内接種して追加の陰性対照とした。図５及び図６並びに表３は、２匹の対照タマリン（Ｔ−1047及びＴ−1042）の接種前及び接種後のALT及びICDレベルを示す。データが示しているように、該２匹の対照タマリンにおいては８週の間にALT又はICDに全く上昇が見られなかった。
同日（第１日目）、１匹のタマリン（Ｔ−1044）に、急性肝炎の発生から約３週間後の前記外科医（GB起源）から得た回復期血清0.2mlを静脈内接種した。この標本は−20℃で貯蔵されていた〔F.Deinhardtら，J.Exper.M ed.125:673−688（1967）〕。もう１匹のタマリン（Ｔ−1034）に、該回復期血清0.1mlを接種した。図７及び図８並びに表４に示されているように、接種後11週の間には、これらのタマリンの血清肝酵素に上昇が全く見られなかった。従って、これらのデータは、元の患者から採取し、−20℃で貯蔵されていた回復期血清には感染性HGBVが検出されなかったことを示しており、それは、患者が感染から回復しており、且つ、ウイルスが患者の血清から除去されているか、又はウイルスタイターが−20℃での貯蔵により検出不能なレベルにまで減少していたことを示し得る。
C. その後の実験。タマリンＴ−1053は、接種後１週間で血清肝酵素に有意な上昇を示し、接種後11日目に肝酵素に関して再テストを行った。12日目に、血清肝酵素に有意な上昇が存在することが測定され、該動物をその日に殺した。その後の実験用に、血漿、肝臓及び脾臓の組織試料を得た。Ｔ−1053由来の血漿を以下の実施例３に記載のRDA手順用の出発物質とし、肝組織を以下の実施例８に用いた。
タマリンＴ−1048、Ｔ−1057及びＴ−1061を血清肝臓酵素について監視した。該動物は全て、接種後２週間以内に肝臓酵素レベルが上昇したことが認められた。これらの上昇値は接種後６週間以降に見られた。３匹のタマリンは全て、接種後84日目までに血清肝酵素レベルがCOを下回るレベルに減少したことが認められた。接種後97日目に、これら３匹のタマリン（Ｔ−1048、Ｔ−1057及びＴ−1061）を、タマリンＴ−1053由来のニート血漿0.10ml（感染性であると判明した、実施例２参照）を用いて再チャレンジし、血清肝酵素の上昇として示される肝炎が再誘発され得たかどうかを測定した。そのデータを表２、図１、図３及び図４に示す。データが示しているように、２匹のタマリン（Ｔ−1057及びＴ−1061）の血清肝酵素レベルは、接種後３週間ではCOを下回るレベルに留まった。１匹のタマリン（Ｔ−1048）は、再接種直後の２週間に血清肝酵素レベルに緩やかな上昇を示した。Ｔ−1048における緩やかな上昇は、HGBVよる肝臓組織の再感染によるものか又はH205の初期接種から完全に回復していないことによるものと推定された。
実施例2. 感染性実験
A. 実験プロトコル。実施例１（Ａ）に記載のようにして４匹のタマリンに関する基準読み取り値を得た。接種前に各動物について簡単に基準血清肝臓酵素（ALT、GGT及びICD）の値を決定した。平均肝酵素値＋標準偏差の3.75倍に基づいて各動物についてカットオフ値（CO）を決定した。カットオフ値を超える肝酵素は異常であり、肝臓に損傷があるとみなされた。
B. タマリンの接種。接種後12日目に殺したタマリンＴ−1053由来の血漿（実施例１〔Ｃ〕参照）をその後の実験用の接種材料として用いた。１日目に、１匹のタマリン（Ｔ−1055）に、Ｔ−1053のニート血漿0.25mlを静脈内接種した。同日、２匹のタマリン（Ｔ−1038及びＴ−1051）に、プールされた正常タマリン血漿中に10^-4（Ｔ−1038）又は10^-5（Ｔ−1051）に順次希釈しておいたＴ−1053血漿0.25mlを静脈内接種した。同日、タマリンＴ−1049に、減少孔径（0.8μｍ、0.45μｍ、0.22μｍ及び0.10μｍ）の一連のフィルターを介して濾過し、プールされた正常タマリン血漿に10^-4に希釈しておいたＴ−1053血漿0.25mlを静脈内接種した。
血清肝酵素ALT、GGT及びICDの変化について実施例１に記載のようにして毎週全タマリン（Ｔ−1055、Ｔ−1038、Ｔ−1051及びＴ−1049）を監視した。表５は、これら４匹のタマリンに関する接種前及び接種後の血清肝酵素データを示す。図９は、Ｔ−1055の接種前及び接種後のALT及びICD値を示す。図９を参照すると、血清肝酵素ALT及びICDにCDを超える上昇が生じたことがわかる。該タマリンを接種後12日目に殺した。図10及び図11は、それぞれタマリンＴ−1051及びＴ−1038のALT及びICDにおける接種前及び接種後の血清レベルを示す。図10及び図11を参照すると、接種後11日目まで両動物の血清肝酵素ALT及びICDに上昇が生じたことをわかる。Ｔ−1038を接種後14日目に殺した。表５及び図12は、Ｔ−1049に関して得られたデータを示す。表５及び図12からわかるように、接種後11日以内にＴ−1049にCOを超える血清肝酵素の上昇が認められた。
Ｔ−1049に関して行われた濾過実験は、HGBVが0.10μｍのフィルターを通過し得ることを示し、それは、HGBVからウイルス性であり且つ直径が0.1μｍ未満であり得ることを示唆している。さらに、Ｔ−1038に関して行われた感染性滴定実験は、Ｔ−1053血清が1ml当たり少なくとも４×10⁵のタマリン感染量を含んでいることを示している。
単一のHGBV病原体の伝播性を示すために、タマリンＴ−1044に、H205接種７日後に採取し、正常なタマリン血清に1:500希釈しておいたＴ−1057血清からなる接種材料0.25mlを接種した。接種後14〜63日からALTレベルにカットオフを超える緩やかな上昇（即ち、82〜106の範囲の上昇）が認められた。
接種後14日目に採取し、正常なタマリン血清に1:2希釈しておいたＴ−1044の血清0.25mlをタマリンＴ−1047及びＴ−1056に順次接種した。先ず、接種後42日目にＴ−1047及びＴ−1056にカットオフを超えるALTレベルの上昇が認められたが、それぞれ接種後64日目及び91日目に正常レベルに戻った。タマリンＴ−1058に、Ｔ−1053血清を用いてチャレンジ後22日目に採取したＴ−1057のニート血清0.25mlを接種した。接種後112日の間にはALTレベルに上昇は認められなかった。
実施例3. 代表相違分析（控除ハイブリダイゼーショ ン）
A. アンプリコン用二本鎖DNAの産生
本明細書の上記材料及び方法に記載され、図13に参照されている手順を用い、H205血清（実施例1C及び2B参照）の接種後12日目に採取したタマリンＴ−1053感染性血漿（実施例1A参照）由来の総核酸からテスターアンプリコンを合成した。接種前17〜30日の間にプールされたタマリンＴ−1053の接種前血漿からドライバーアンプリコンを合成した。簡単に言えば、両血漿を実施例2Bに記載のように0.1μｍのフィルターを介して濾過した。次いで、市販のキット〔United States Biochemecal（USB）,Cleveland,OH,cat.＃73750〕及び担体として10μｇの酵母tRNAを用い、50μｌの濾過血漿を抽出した。この核酸をランダムに開始して逆転写し、次いで市販のキットを用いランダム開始してDNA合成した。簡単に言えば、ランダムヘキサマーを用いて、製造業者に指示されたPerkin Elmer's（Norwalk,CT）RNA PCRキット（cat.＃N808−0017）を用いて80μｌの逆転写反応を行い、20℃で10分間インキュベートし、次いで42℃で２時間インキュベートした。次いで反応を停止し、cDNA/RNA重複部（duplexes）を99℃で２分間インキュベートして変性させた。反応材料に、総量20μｌの10μｌの10×RP緩衝液〔100mMのNaCl、420mMのTris（pH8.0）、50mMのDTT、100μg/mlのBSA〕、250pmolのランダムヘキサマー及び13単位のSequenase（登録商標）バージョン2.0ポリメラーゼ（USB,cat.＃70775）を補った。反応材料を20℃で10分間、次いで37℃で２時間インキュベートした。フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた後、製造業者により指示されたように、これらの反応の二本鎖DNA産物を30μｌの反応材料容量中４単位の制限エンドヌクレアーゼSau3A I（New England Biolabs〔NEB〕,cat.＃169L）で30分間消化した。
B. アンプリコンの合成
Sau3A I消化DNAを上記のように抽出、沈殿させた。反応材料を50〜55℃の乾燥加熱ブロックに入れ、４℃で１時間インキュベートすることにより、Sau3A I消化産物全体を、１×T4 DNAリガーゼ緩衝液（NEB）中で緩衝した30μｌの反応材料容量中465pmolのR Bgl24（配列番号１）及び465pmolのR Bgl 12（配列番号２）にアニーリングした。400単位のT4 DNAリガーゼ（NEB,cat.＃202S）を添加してアニーリングされた産物を連結した。16℃で14時間インキュベートした後、小規模のPCRを行った。10μｌの連結反応材料を、60μｌのH₂O、20μｌの５×PCR緩衝液（335mMのTris（pH8.8）、80mMの〔NH₄〕₂SO₄、20mMのMgCl₂、0.5μg/mlのウシ血清アルブミン及び50mMの２−メルカプトエタノール）、８μｌの4mMdNTP株、２μｌ（124pmol）R Bgl 24（配列番号３）及び3.75単位のAmpli Taq（登録商標）DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer,cat.＃N808−1012）に加えた。GeneAmp（登録商標）9600サーモサイクラー（Perkin Elmer）中でPCR増幅を行った。試料を72℃で５分間インキュベートし、連結されたアダプターの５′突出末端を充填した。試料を25〜30サイクル（95℃で１分及び72℃で３分）で増幅し、次いで72℃で10分間延長増幅した。アガロースゲルにより首尾よくアンプリコンが合成されたこと（即ち、約100bp〜1500bpを超える範囲のPCR産物の塗抹標本）が確認された後で、テスター及びドライバーアンプリコンの大規模な増幅を行った。それぞれドライバー及びテスターの合成について先に記載されたようにして、40の100μlPCR及び８つの100μlPCRを設定した。100μｌの反応材料当たり２μｌの小規模PCR産物は、大規模アンプリコン産生用の鋳型としての役割を果たした。追加の15〜20サイクルの増幅を行うために、上記のようなサーモサイクリングを行った。次いでドライバー及びテスターDNA用のPCR反応材料をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、70％エタノールで洗浄、Sau3A Iで消化してアダプターを開裂した。テスターアンプリコンを低融点アガロースゲル上でさらに精製した。簡単に言えば、テスターアンプリコンDNA10μｇを２％SeaPlaque（登録商標）ゲル（FMC Bioproducts,Rockland,ME）上で移動させた。150〜1500塩基対のフラグメントをゲルから切り出し、ゲルのスライスを、3mlのH2O、400μＬの0.5M MOPS及び400μｌのNaClを用い、72℃で20分間融解させた。製造業者により指示されたように、Qiagen−tip20（Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA）を用いて融解したゲルスライスからDNAを回収した。
C. アンプリコンのハイブリッド形成及び選択的増幅
精製されたテスターDNAアンプリコン約２μｌを上記のようにN Bgl 24（配列番号３）及びN Bgl 12（配列番号４）に連結した。最初の控除ハイブリッド形成のために、N Bglプライマーセットに連結されたテスターアンプリコン（0.5μｇ）とドライバーアンプリコン（20μｇ）とを混合し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。４μｌのEE×３緩衝液（30mMのEPPS、20℃におけるpH8.0〔Sigma,St.Louis,MO〕、3mMのEDTA）にDNAを再懸濁し、35μｌの鉱油を重層した。加熱変性（99℃で３分）させた後、変性したDNAに5MのNaCl1μｌを加え、DNAを67℃で20時間ハイブリダイズした。水相を新しい管に移し、該試料に８μｌのtRNA（5mg/ml）、次いで390μｌのTE〔10mMのTris（pH8.0）及び1mMのEDTA〕を加えた。ハイブリダイズしたDNA溶液80μｌを、H₂O480μｌ、５×PCR緩衝液（上記）160μｌ、4mMのdNTP64μｌ及びAmpliTaq（登録商標）ポリメラーゼ６μｌ（30単位）に加えた。該溶液を72℃で５分間インキュベートして、連結されたN Bgl 24プライマーによって形成された５′オーバーハングを充填した。N Bgl 24（配列番号３、20μｌのH₂O中1.24nmol）を加え、反応材料をアリコート（100μl/管）に分け、上記のように10サイクルの増幅を行った。反応材料をプールし、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、70％エタノールで洗浄して、40μｌのH₂Oに再懸濁した。一本鎖DNAをヤエナリヌクレアーゼ（MBN）により除去した。簡単に言えば、増幅されたDNA20μｌを、販売業者により記載のように、40μｌの反応材料中20単位のMBN（NEB）で消化した。MBN消化物に50mMのTris（pH8.8）160μｌを加えた。酵素を99℃で５分間熱不活化した。80μｌのMBN消化DNAを上記のようにしてさらに15サイクルPCR増幅した。再び反応材料をプールし、フェノール／クロロホルムで２回抽出、イソプロパノールで沈殿させ、70％エタノールで洗浄、H₂Oに再懸濁した。次いで、増幅されたDNA（３〜５μｌ）をSau3A Iで消化し、上記のように抽出、沈殿させた。最終DNAペレットを100μｌのTEに再懸濁した。
D. 引き続いてのハイブリッド形成／増幅段階
上記のようにして、先のハイブリッド形成／選択的増幅材料由来のDNA100ngをJ Bglプライマーセット（配列番号５及び配列番号６）に連結した。このDNA（50ng）を20μｇのドライバーアンプリコンと混合し、上記のようにしてハイブリッド形成及び増幅手順を繰り返したが、但し、サーモサイクリングの間の延長温度は70℃であって、N Bglプライマーセット（配列番号３及び配列番号４）の場合の72℃ではなく、最終増幅段階（NBN消化後の）は25サイクルであった。次いで２回目のハイブリッド形成−増幅産物100ngをN Bglプライマーセット（配列番号３及び配列番号４）に連結し、この材料200pgと20μｇのドライバーアンプリコンとを混合し、上記のようにして３回目のハイブリッド形成／増幅を行ったが、最終増幅は25サイクルであった。
HGBV接種前及び急性期Ｔ−1053血漿に体して行われた代表相違分析（RDA）から得られた産物の２％アガロースゲルを図14に示す。図14を参照すると、レーン１は、適切なサイズ（bp）のDNAフラグメントを有する150ngのHae III消化Phi−X174DNAマーカー（NEB）を含んでいる。ドライバーアンプリコン（レーン２）及びテスターアンプリコン（レーン３）の複合性は、試料中に見られるDNA産物の塗抹標本によって実証されている。この複合性は、テスター配列が１回目（レーン４）、２回目（レーン５）又は３回目（レーン６）のハイブリッド形成／選択的増幅を受けると劇的に低下する。
E. 相違産物のクローニング
相違産物を、以下のようにpBluescript II KS＋（Stratagene,La Jolla,CA,cat.＃212207）のBamH I部位にクローニングした。0.5μｇのpBluescript IIをBamH I（10単位、NEB）で消化し、販売業者により指示されたように子牛腸管ホスファターゼ（10単位、NEB）を用いて５′脱リン酸化した。プラスミドをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、70％エタノールで洗浄、10μｌのH₂Oに再懸濁した（最終濃度:1μｌ当たり約50ngのpBluescript II）。２回目のハイブリッド形成／増幅産物由来の４つの最大バンドを上記のようにして２％低融点アガロースゲルから切り出した。TakaraDNA連結反応キット（Takara Biochemical,Berkeley,CA）を用い、融解した（72℃、５分）ゲルスライス４μｌを、50μｌの反応材料中50ngのBamH I−カット、脱リン酸化pBluescript IIに連結した。16℃で3.5時間インキュベートした後、８μｌの連結反応材料を用いて、販売業者に指示されたように、E.coliコンピテントXL−1Blue細胞（Stratagene）を形質転換した。アンピシリン（150μg/ml）を補ったLBプレート上に形質転換混合物をのせ、37℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーを液体培養中で増殖させ、ミニプレプ（miniprep）プラスミドDNAを当該分野に記載のようにして分析し、クローニング産物の存在を確認した。
２回目のハイブリッド形成／増殖段階から得られた４つの最大産物のクローニングに加えて、３回目のハイブリッド形成／増殖段階から得られた産物の全集団をpBluescript IIにクローニングした。50ngのpBluescript IIベクター（上記のように合成した）を、上記のようにして、50μｌの反応材料中10ngの３回目のハイブリッド形成／増殖産物に連結した。16℃で２時間インキュベートした後、10μｌの連結反応産物を用いて、E.coliコンピテントXL−1Blue細胞を形質転換した。得られた形質転換産物由来の60のコロニーを増殖させ、ミニプレプDNAを合成し、上記のような当該分野において公知の方法で分析した。制限エンドヌクレアーゼ消化及びドットブロットハイブリッド形成法をユニーククローンを特定するために用いた。
実施例4. HGBVゲノムの抗原領域をコードするcDNAクロ ーンの免疫分離
A. クローニング材料源としての濃縮ウイルスの調製
実施例３に示されている方法に加えて、以下の分離手順を用いて、HGBBVゲノムを分離した。３匹のタマリン（Ｔ−1055、Ｔ−1038及びＴ−1049）に、実施例２に記載のタマリンＴ−1053から調製した血清を接種した。表５を参照すると、接種後11日目までに３匹全てのタマリンに肝酵素値の上昇が見られた。タマリンＴ−1055を接種後12日目に殺し、タマリンＴ−1038及びＴ−1049を接種後14日目に殺した。これら３匹のタマリンそれぞれから由来の血清約３〜4mlをプールし、全量約11.3mlを得た。プールされた血清を15℃で15分間10,000×ｇで遠心して清澄化した。次いでこれを連続的に0.8、0.45、0.2及び0.1μｍの注射器フィルターに通した。次いで該濾過された材料を、SW41−Tiローター中、４℃で68分間、41,000rpmで、0.3mlのCsClクッション〔密度:10mMのTris、150mMのNaCl、1mMのEDTA（pH8.0）中1.6g/ml〕を介して遠心して濃縮した。約0.6mlのCsCl層を遠心後に取り出し、３つの0.2mlアリコートに分け、−70℃で貯蔵した。
次いで、タマリンＴ−1034にこのペレット化材料（正常なタマリン血清中で調製した）の10^-6希釈物0.25mlを接種した。先ず、接種後２週間でＴ−1034にALT肝酵素値の上昇が認められ、該値はその後７週間上昇を継続し、最終的に接種後10週までに正常化した（図30、実施例14を参照されたい）。この実験は、プールされたタマリン血清から濃縮した材料の感染性を示した。該材料は比較的高いタイターを有することが示されたので、このウイルス濃縮源を、以下に記載のような、cDNAライブラリー構築用の核酸源として用いた。
B. cDNAライブラリーの構築
販売業者の指示により市販のRNA抽出キット（Stratagene,La Jolla,CA）を用いて、濃縮ウイルス（上記）のアリコート（0.2ml）からRNAを抽出した。最終沈殿段階の前に、試料を４つの等量のアリコートに分け、次いで５μg/mlの酵母tRNAの存在下に沈殿させた。これらのアリコートの中一つだけをcDNA合成用に用いた。他のものは−80℃で貯蔵した。製造業者に指示されたように、市販のキット（Stratagene,La Jolla,CA）を用いて、RNAから、リン酸化され、ブラント末端化二本鎖cDNAを合成した。次いで、製造業者に指示されたように、T4DNAリガーゼキット（Stratagene,La,Jolla,CA）を用いて、10μｌの反応材料容量中で二本鎖リンカー／プライマーをcDNA末端（センスストランド、配列番号7;アンチセンスストランド、配列番号８）に連結した。これによって、全てのcDNAを、Not I及びEcoR I制限酵素認識部位を含む同一の５′及び３′末端を有する混合物として得た〔G.Reyes及びJ.Kim,Mol.Cell.Probes 5:473−481（1991）;A.Akowitz及びL.Manuelidis,Gene 81:295−306（1989）；並びにG.Inchauspeら，Viral Hepatitis and Liv er Disease,F.B.Hollingerら,Eds.,382−387ページ（1991）〕。次いで、全cDNAがそれらの配列とは無関係に増幅されるように、リンカー／プライマーのセンスストランドオリゴヌクレオチドをPCR反応におけるプライマーとして用いた。この手順により、全cDNA集団内に存在する微量cDNAが、効率的にクローニングされるレベルにまで増幅され、それによって出発材料内の配列を表すcDNAライブラリーが形成された。
製造業者により指示されたGeneAmp PCRキット（Perkin−Elmer）を用いて、PE−9600サーモサイクラー中で、センスストランドオリゴヌクレオチドプライマーの存在下に上記連結材料の１μｌアリコートに対してPCRを行った（最終濃度:1μM;反応材料容量:50μｌ）。以下のようにして30サイクルのPCRを行った:94℃で0.5分間の変性、55℃で0.5分間のアニーリング及び72℃で1.5分間の延長。次いで、得られた産物の１μｌアリコートを上記のようにして再増幅した。次いで、最終PCR反応産物を等量のフェノール−クロロホルム（1:1、v/v）で１回、等量のクロロホルムで１回抽出し、次いで、酢酸ナトリウム（最終濃度、0.3M）及び2.5容量の無水エタノールを加えて、ドライアイス上で10分間沈殿させた。得られたDNAペレットを水に再懸濁し、製造業者に指示されたように、制限酵素EcoR I（New England Biolabs）で消化した。次いで、製造業者に指示されたようにDNA結合樹脂（Prep−ａ−Gene,BioRad Laboratories）を用いて、消化されたcDNAを反応混合物から精製し、20μｌの蒸留水中で溶離した。
cDNA（８μｌ）を、30μｌの反応材料容量中３μｇのラムダgt11ベクターDNAアーム（Stratagen,La Jolla,CA）に４℃で１〜５日の間に連結した。製造業者に指示されたようにGigaPack III Goldパッケージ抽出物（Stratagene,前出）を用いて、連結材料11μｌをファージヘッドにパッケージした。得られたライブラリーは、組換え頻度が89.3％で、平均インサートサイズが約350塩基対の合計約173万メンバー（PFU）を含んでいた。
C. 組換えGB cDNAライブラリーの免疫スクリーニング
cDNAライブラリーの免疫スクリーニングに用いた抗血清は、接種後に血清肝酵素レベルに上昇を示したタマリンから採取した。免疫スクリーニングには、２つの別個の抗血清プールを用いた。第１のプールは、２匹の動物（Ｔ−1048及びＴ−1051;それぞれ実施例１、表２と、実施例２、表５を参照されたい）由来の血清を含み、第２のプールは、１匹の動物（Ｔ−1034;図30、実施例14を参照されたい）由来の血清を含むものであった。用いられた特定の血清を表６に示す。
cDNAライブラリーの免疫スクリーニングに用いるためにこれらの試料を選択した時点では、これらの試料は、1.4又は1.7組換えCKSタンパク質（実施例13）とのそれらの免疫反応性について試験されていなかった。従って、本明細書に示されている結果は、用いられた抗血清中のこれらの組換えタンパク質に対するHGBV抗体の有無に関するいずれの情報とも関係なく得られたものである。

組換えファージの免疫分離に用いた手順は、Young及びDavisにより記載された方法〔R.A.Young及びR.W.Davis,PNAS 80:1194−1198（1983）〕に基づき、以下のように変更を加えたものであった。一方は、Ｔ−1048及びＴ−1051からプールした抗血清を用い、他方はＴ−1034由来の抗血清を用いた２回の免疫スクリーニング実験を行った。いずれに場合にも、抗体とE.coliタンパク質との非特異的相互作用を低減させるために、使用前に一次抗血清をE.coli抽出物に予備吸着させた。最初の実験では、Ｔ−1048/T−1051抗血清プールを用いて129万個の組換えファージを免疫スクリーニングした。２回目の実験では、Ｔ−1034抗血清を用いて30万個の組換えファージを免疫スクリーニングした。組換えファージライブラリーをE.coliストランドY1090_r-のローン上に置き、37℃で3.5時間増殖させた。次いで、プレートをIPTG（10mM）で飽和したナイロンフィルターで覆い、42℃で3.5時間インキュベートした。次いでフィルターを、１％のBSA、１％のゼラチン及び３％のTween−20（「ブロッキング緩衝液」）を含むTris−塩水緩衝液中、22℃で１時間ブロックした。次いでフィルターを一次抗血清（ブロッキング緩衝液中の1:100希釈物）中、４℃で16時間インキュベートした。次いで一次抗血清を取り出して次回のプラーク精製用に取って置き、0.1％Tween−20を含むTris−塩水中でフィルターを４回洗浄した。次いで、フィルターを125−Ｉ−標識（又はアルカリ−ホスファターゼ結合）ヤギ抗ヒトIgG（Jackson ImmunoResearch,West Grove,PAから入手可能）を含むブロッキング緩衝液中22℃で60分間インキュベートし、上記のように洗浄し、次いでＸ線フィルムに暴露（又はJ.Sambrookら，Molecu lar Cloning:A Laboratory Manual，第２版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989におけるような確定した手順に従って発色）した。このライブラリーから５種の免疫陽性ファージ（４−3BI、48−1A1、66−3A1、70−3A1、78−1C1）を分離し、次いで、上記の方法を用いて３匹の感染タマリン（Ｔ−1048、Ｔ−1051、Ｔ−1034）由来の抗血清に対する結合特異性についてテストした。これらの組換え体は、３匹の感染タマリンそれぞれに由来する回復期血清と反応したが予備接種した血清とは反応しなかったポリペプチドをコードした（データは示さず）。
組換えファージによりコードされたポリペプチドの免疫学的反応性の特異性を証明するために、EcoR Iクローニング部位に対して５′位に位置するプライマー（配列番号９）及び３′位に位置するプライマー（配列番号10）を用いて、PCRにより、各cDNAをラムダファージゲノムから回収した。次いで、PCR産物をEcoR Iで消化し、実施例13に記載のようにして、E.coli発現プラスミドpJO201に次いで連結した。該cDNAをpJO201のEcoR I部位に挿入することにより、このcDNAの翻訳読み取り枠をラムダファージクローン中にあるがままに維持した。pJO201発現ベクター中のサブクローンを、４−3B1.1、48−1A1.1、66−3A1.49、70−3A1.37及び78−1C1.17とした。タマリンＴ−1034、Ｔ−1048及びＴ−1051由来の回復期血清（1:100希釈物）を含むこれらのcDNAを発現する培養物から調製されたE.coli溶解物の免疫ブロット分析（実施例13におけるような）により、各CKS融合タンパク質について予測されたサイズのタンパク質との特異的免疫学的反応性が示された（データは示していない）。該cDNAそれぞれのDNA配列を決定したが、これらのクローンはHGBV−Ｂウイルス（配列番号11）の配列とほぼ100％の配列同一性を有していることが見いだされた。４−3B1.1インサート（配列番号12及び13）の配列は、その全体は決定されなかったが、配列決定部分は、塩基対6834−7458由来のHGBV−Ｂ（配列番号11）中の配列部分との99.5％の配列同一性を示す。クローン４−3B1.1から得られた配列との同一性を示すHGBV−Ｂ（配列番号11）配列のこの領域は、＋１読み取り枠に翻訳され、配列番号14として配列リストに示されている。48−1A1.1インサート（配列番号15）の配列は、塩基対4523−4752由来のHGBV−Ｂ（配列番号11、実施例９を参照されたい）の配列の部分との100％配列同一性を示す。配列番号15に対応するDNA配列は＋１読み取り枠に翻訳され、配列番号16として配列リストに示されている。66−3A1.49インサート（配列番号17）の配列は、クローン48−1A1.1の配列と実質的に100％の配列同一性を示し、従って、配列リストにはタンパク質翻訳は示さない。70−3A1.37インサート（配列番号18）の配列は、塩基対6450−6732由来のHGBV−Ｂ（配列番号11）の配列の部分と100％の配列同一性を示すが、但し、HGBV−Ｂ配列（配列番号11）の塩基6630−6632に対応する３つの塩基対がかけている。配列番号18に対応するDNA配列は＋２読み取り枠に翻訳され、配列番号19として配列リストに示されている。78−1C1.17インサート（配列番号20）の配列は、クローン70−3A1.37の配列と100％の配列同一性を示し、従って、配列リストにはタンパク質の翻訳は示さない。これらのデータは、ラムダgt11cDNAライブラリーから分離されたcDNAクローンがHGBV病原体のゲノムから誘導され、該ライブラリーがGB感染タマリン由来の血清によって免疫学的に特異的に認識されたポリペプチドをコードすることを示している。クローン48−1A1.1（「クローン48」）４−3B1.1、66−3A1.49、70−3A1.37及び78−1C1.17は、前記のAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。
実施例5. HGBVクローンのDNA配列分析
実施例３で得られたユニーククローンをキット形態〔Sequenase（登録商標）バージョン2.0,USB〕のジデオキシヌクレオチド鎖停止法（Sangerら，前出）を用いて配列形態した。これらの配列はオーバーラップしておらず、クローン４（配列番号21）、クローン２（配列番号22）、クローン10（配列番号23）、クローン11（配列番号24）、クローン13（配列番号25）、クローン16（配列番号26）、クローン18（配列番号27）、クローン23（配列番号28）、クローン50（配列番号29）及びクローン119（配列番号30）として配列リストに示されている。クローン４、２、10、11、13、16、18、23、50及び119はA.T.C.C.に寄託されている。クローン２はA.T.C.C.受託番号69556、クローン４はA.T.C.C.受託番号69557、クローン10はA.T.C.C.受託番号69558、クローン16はA.T.C.C.受託番号69559、クローン18はA.T.C.C.受託番号69560、クローン23はA.T.C.C.受託番号69561、クローン50はA.T.C.C.受託番号69562、クローン11はA.T.C.C.受託番号69613、クローン13はA.T.C.C.受託番号69611、及びクローン119はA.T.C.C.受託番号69612が付与された。
配列は、BLASTNアルゴリズム（Altschulら，J.Mol.Bi ol.215:403−410〔1990〕）を用いて、GenBankデータベースで検索した。これらの配列はいずれもGenBankでは見つからなかったが、これは、これらの配列がまだ文献において特性分析されていないことを示している。該DNA配列は６つの可能な読み取り枠に翻訳され、配列リスト（配列番号21は配列番号31〜36に、配列番号22は配列番号37〜42に、配列番号23は配列番号43〜48に、配列番号26は配列番号49〜54に、配列番号27は配列番号55〜60に、配列番号28は配列番号61〜66に、配列番号29は配列番号67〜72に翻訳する）に示されている。配列番号24は配列番号73（実施例９に記載）に含まれ、配列番号74〜79に翻訳されている。配列番号25〜30は配列番号80（実施例９に記載）に含まれ、配列番号81〜86に翻訳されている。BLASTXアルゴリズム（Gishら，Nature Genetics 3:266−272〔1993〕）を用い、翻訳された配列をSWISS−PROTデータベースの検索に用いた。ここでも、これらの配列はSWISS−PROTでは見つからず、それは、これらの配列がまだ文献において特性分析されていないことを示している。
BLASTN、BLASTX及びFASTdbアルゴリズムを用いて相同体を検索すると、肝炎のＣウイルスと低くはあっても幾分かの配列類似性が示される（以下の表７）。特に、クローン４（配列番号35）、10（配列番号44）、11（GB−４の残基１〜166、枠３〔配列番号76〕）、16（配列番号50）、23（配列番号65）、50（配列番号70及び72）並びに119（GB−Ａの残基912〜988、枠３〔配列番号83〕）の翻訳は、アミノ酸レベルでの種々のHCV分離体に対する24.1〜45.1％の範囲の相同性がある。特に重要なのは、クローン10（配列番号44）の翻訳体が、HCVの推定RNA依存性RNAポリメラーゼに対してわずかな相同性を示したことである。他の正鎖ウイルスの推定RNA依存性RNAポリメラーゼ中に存在する保存アミノ酸（Jiangら，P NAS 90:10539−10543〔1993〕）とクローン10（配列番号44）の推定アミノ酸翻訳体との比較により、他のRNA依存性RNAポリメラーゼの保存アミノ酸残基もクローン10（配列番号44）中に保存されていることが明らかになった。これには、RNA依存性RNAポリメラーゼの正準（canonical）GDD（Gly−Asp−Asp）シグネチャー配列が含まれている。従って、クローン10（配列番号44）は、ウイルス性RNA依存性RNAポリメラーゼをコードするものと思われる。驚くべきことには、BLASTNアルゴリズムを用いた場合、クローン10（配列番号44）のみが、ヌクレオチドレベルでHCVとの配列相同性を示した。アミノ酸レベルで低いHCV相同性を有するクローン４（配列番号21）、16（配列番号26）、23（配列番号28）及び50（配列番号29）並びに119（配列番号30）は、GenBankの検索において、BLASTNでは検出されなかった。さらに、クローン２（配列番号37〜42）、13（配列番号25及び37〜42）並びに18（配列番号27及び55〜60）は、上記のGenBank又はSWISS−PROTOで検索した場合に、HCVに対する有意なヌクレオチド又はアミノ酸相同性は、下記のように示さなかった。

実施例6. HGBVクローンの外因性
HGBVクローンは、正常又はHGBV感染タマリン肝臓DNA、正常なヒトリンパ球DNA、酵母DNA又はE.coliDNAには検出されなかった。これは、サザン法によりHGBVクローン２（配列番号22）及び16（配列番号26）について示された。さらに、全HGBVクローンをゲノムPCRで分析して、タマリン、ヒト、酵母及びE.coliゲノムに関するHGBV配列の外因性起源を確認した。これらのデータは実施例５に記載のHGBV配列のウイルス性性質と一致している。
A. サザンブロット法分析
HGBV感染タマリン及び正常なタマリンの肝臓ホモジネートを低速ペレット化してタマリンの肝臓の核を得た（以下に記載）。販売業者に指示されたように市販のキット（USB cat.＃73750）を用いて核からDNAを抽出した。タマリンDNAを抽出過程の間にRNaseで処理した。ヒト胎盤DNA（Clontech,Palo Alto,CA）、酵母DNA（Sacch aromyces cerevisiae,Clontech）及びE.coliDNA（Sigma）を市販源から得た。
販売業者の指示に従って各DNA試料をBamH I（NEB）で消化した。消化されたDNA（10μｇ）及びRNA産物（実施例3Bからそれぞれ0.5μｇずつ）を１％アガロースゲル上で電気泳動させ、Sambrookらにより記載（pp・9.34ff）のようにHybond−Ｎ＋ナイロンメンブラン（Amersham,Arlington Heights,IL）にキャピラリーでブロットした。DNAをメンブラン販売業者により指示されたようにアルカリ処理してメンブランに固定した。メンブランをRapid Hyb溶液（Amersham）中、65℃で30分間プレハイブリダイズした。
HGBV配列の放射線標識プローブをPCRにより調製した。１×PCR緩衝液II（Perkin Elmer）、2mMのMgCl₂、20μＭのdNTP、それぞれ１μＭのクローン特異性センス及びアンチセンスプライマー（クローン２については、配列番号87及び88;クローン４については、配列番号89及び90;クローン10については、配列番号91及び92;クローン16については、配列番号93及び94;クローン18については、配列番号95及び96;クローン23については、配列番号97及び98;クローン50については、配列番号99及び100）、1ngのHGBVクローンプラスミド（実施例３〔Ｅ〕に記載）、60μCiα−³²p−dATP（3000Ci/mmol）及び1.25単位のAmpliTaq（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いて50μｌのPCRを形成した。反応材料を、94℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で30秒インキュベートして、合計30サイクルの増幅を行い、次いで72℃で３分間最終延長した。組み込まれなかった標識を、販売業者に指示されたようにQuick−Spin（登録商標）Ｇ−50スピンカラム（Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN）により除去した。プレハイブリダイズしたメンブランに添加する前にプローブを変性させた（99℃、２分）。
プレハイブリダイズしたメンブラン（２×10⁶dpm/ml）に、放射線標識したプローブを加え、Rapid Hyb（登録商標）販売業者に指示されたように、フィルターを65℃で2.5時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズしたメンブランを、緩やかな厳格さ（１×SSC、65℃で0.1％SDS）で洗浄し、次いで増感板を用い、−80℃で72時間オートラジオグラフフィルムに暴露した。これらの条件は、類似の放射線標識プローブを用いて単一コピーの遺伝子を検出するために考案された。結果は、クローン２（配列番号22）及びクローン16（配列番号26）配列が、正常又はHGBV感染タマリンの肝臓由来のDNA（それぞれ図15及び図16、レーン1B及び3B）、ヒトDNA（図15及び図16、レーン1A）、酵母DNA（図15及び図16、レーン2A）又はE.coliDNA（図15及び図16、レーン3A）にハイブリダイズしなかったことを示している。さらに、ドライバーアンプリコンDNA（図15及び図16、レーン4A、実施例2.B.に記載の予備HGBV接種されたタマリン血漿から誘導された）の場合にもハイブリッド形成は全く検出されなかった。対比的に、テスターアンプリコン（図15及び図16、レーン6A、実施例2.Bに記載の総核酸抽出及び逆転写ステップを用いた感染HGBVタマリン血漿から誘導された）及び３回の控除／選択的増幅の産物（それぞれ１回目、２回目及び３回目の控除／選択的増幅からの産物に関する図15及び図16、レーン7A、8A及び4B）の場合には強力なハイブリッド形成シグナルが認められた。これらのデータは、HGBVクローン２（配列番号22）及び16（配列番号26が感染源から増幅された核酸配列中に検出され、HGBVクローン２（配列番号22）及び16（配列番号26）が、タマリン、ヒト、酵母又はE.coliゲノムDNA配列からは誘導されないことを示している。
B. ゲノムのPCR分析
さらにHGBV配列の外因性を示し且つそれらのウイルス起源を支持するために、タマリン、ヒト、酵母及びE.co li由来のゲノムDNAに対してPCRを行った。前出のJ.Sambrookらによる記載のようにして、正常なタマリンの腎臓及び肝臓組織由来のDNAを合成した。酵母、アカゲザルの腎臓及びヒト胎盤DNAをClonotechから得た。E.coliDNAはSigmaから得た。
販売業者に指示されたように主としてPerkin−Elmer−Cetus製のGeneAmp（登録商標）試薬を用いてPCRを行った。各100μｌの反応材料に対して300ngのゲノムDNAを用いた。HGBVクローン化配列（クローン２については、配列番号87及び88;クローン４については、配列番号89及び90;クローン10については、配列番号91及び92;クローン16については、配列番号93及び94;クローン18については、配列番号95及び96;クローン23については、配列番号97及び98;クローン50については、配列番号99及び100）由来のPCRプライマーを0.5μＭの最終濃度で用いた。PCRを35サイクル（94℃で１分;55℃で１分;72℃で１分）行い、次いで、72℃で７分の伸長サイクルを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムを用いて核酸を直接染色した後で紫外線照射するか及び／又はサザン法によりニトロセルロースフィルターへトランスファーした後で放射線標識プローブにハイブリダイズして視覚化した。実施例6Aに記載のようにしてプローブを形成した。Digene（Belstville,MD）製のFast−Pair Hybridization Solution中でフィルターを３〜５時間プレハイブリダイズし、次いで100−200cpm/cm²を用い、42℃で15〜25時間Fast−Pair Hybridization Solution中でハイブリダイズした。G.G.Schlauderら，J.Virol.Methods 37:189−200（1992）に記載のようにしてフィルターを洗浄し、増感板を用い、−70℃で15〜72時間、Kodak X−Omat−ARフィルムに暴露した。
図17は、臭化エチジウム染色した1.5％アガロースゲルを示している。図18は、クローン16（配列番号26）由来の放射線標識プローブにハイブリダイズした後の同一ゲルからのサザンブロット法によるオートラジオグラムを示す。正常なタマリン肝臓及び腎臓DNAに0.05ゲノム当量（レーン17及び18）でスパイクされたクローン16（配列番号26）配列を検出することは可能であるにも拘わらず、クローン16（配列番号26）配列は、その外因性と一致して、ゲノムPCR分析により、タマリン（図17及び図18、レーン９及び10）、アカゲザル（レーン11）又はヒトゲノムDNA（レーン12）中にも、酵母又はE.coliDNA（データは示さず）中にも検出されなかった。さらに、ヒトドーパミンD1レセプター遺伝子由来のプライマー、1000−1019塩基対（センスプライマー）及び1533−1552塩基対（アンチセンスプライマー）（GenBankアクセス番号:X55760、R.K.Sunaharaら，Nature 347:80−83〔1990〕）は、霊長類ゲノムDNA（タマリン腎臓、タマリン肝臓、アカゲザル及びヒトのDNAに対応する図17、レーン２、３、４及び５、）由来のドーパミンD1レセプターDNAを首尾よく増幅し、それは、低コピー数（即ち、単一コピー）配列を検出するこの方法の有用性を示している。レーン１及び８は、それぞれドーパミンD1レセプター及びクローンの16プライマー（配列番号93及び94）に対するH₂O対照である。レーン６は、ドーパミンレセプタープライマーで増幅した100fgのクローン16（配列番号26）プラスミドDNAを含む。レーン14、15、16及び20は、それぞれ１、３、10及び100fgのクローン16（配列番号26）プラスミドDNAを含む。レーン７及び19はマーカーである。上記のクローン２、４、10、18、23及び50に特異的なPCRプライマーを用いて類似の結果を得た（データは示さず）。クローン２（配列番号22）、４（配列番号21）、10（配列番号23）、18（配列番号27）、23（配列番号28）及び50（配列番号29）はこの時点では結果が出ていない。しかし、クローン４（配列番号21）、10（配列番号23）、18（配列番号27）及び50（配列番号29）配列は、タマリン、ヒト、酵母及びE.co liDNA（アカゲザルは試験しなかった）には検出されず、これは、これらの配列が試験したゲノムDNA源に対して外因性であり、これらの配列のウイルス起源を支持するものであることを示している。
実施例7. タマリン血清におけるHGBV配列の存在
接種前及び急性期Ｔ−1053血漿のHGBVクローン配列の存在をPCRにより調べた。HGBVゲノムはDNA又はRNAであり得るので、PCR及びRT−PCRを行った。特に、全核酸を実施例３（Ａ）に記載のようにして血漿から抽出した。実施例６（Ｂ）に記載のようにして当量の５μｌの血漿核酸に対してPCRを行い、主として製造者の指示に従いPerkin−Elmer−Cetus製のGeneAmp（登録商標）RNA PCRキットを用いて、PCR中１μＭ濃度のプライマー（クローン２については、配列番号87及び88;クローン４については、配列番号89及び90;クローン10については、配列番号91及び92;クローン16については、配列番号93及び94;クローン18については、配列番号95及び96;クローン23については、配列番号97及び98;クローン50については、配列番号99及び100）を用いてRT−PCRを行った。ランダムヘキサマーを用いてcDNA合成を開始した。
PCR産物の臭化エチジウムによる染色及びハイブリッド形成により、急性期Ｔ−1053血漿には、HGBVクローン配列２（配列番号22）、４（配列番号２）、10（配列番号23）、16（配列番号26）、18（配列番号27）、23（配列番号28）及び50（配列番号29）が存在したが、予備接種Ｔ−1053血漿には存在しないことが示された（データは示さず）。さらに、HGBVクローン２（配列番号22）、４（配列番号21）、10（配列番号23）、18（配列番号27）、23（配列番号28）及び50（配列番号29）配列は、タマリンＴ−1053に注入されたHGBV接種材料であるH205中に検出することができた（実施例I B参照）。これらの結果を表８に要約する。HGBVクローン配列は急性期血漿においてRT−PCRによってのみ検出されたことに留意されたい。HGBVクローン配列が、RNAをcDNAに変換するための逆転写段階後に初めてPCRにより急性期血漿中に検出されたという事実は、これらのクローンのあるものとHCV分離体との低い相同性、及びHGBVクローン10（配列番号23;実施例５）のRNA依存性RNAポリメラーゼ中に認められた保存アミノ酸をコードする配列の存在と共に、HGBVがRNAウイルスであることを示唆している。
HGBVクローン16配列（配列番号26）を有するタマリン血漿パネルのRT−PCR分析を行って、実験的にHGBVに感染させた他の個体中のHGBVクローン16（配列番号26）の存在を確認した。先に記載（G.G.Schlauderら，J.Virol ogical Methods 37:189−200〔1992〕）のようにして、H205の接種材料で実験的に感染させる前と感染させた後で得られたタマリン由来の血漿25μｌから核酸を分離した。エタノールで沈殿させた核酸を３μｌのDEPC処理H₂Oに再懸濁した。主として製造業者の指示に従って、Perkin−Elmer−Cetus製のGeneAmpRNA PCRキットを用いて、cDNA合成及びPCRを行った。ランダムヘキサマーを用いてcDNA合成を開始した。得られたcDNAをクローン16プライマー（配列番号93及び94）を用い、0.5μＭの最終濃度でPCRにかけた。PCRを35サイクル（94℃で１分;55℃で１分;72℃で１分）行い、次いで72℃で７分間延長サイクルを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、核酸を臭化エチジウムで直接染色した後で紫外線照射するか、及び／又は実施例6Bに記載のようにサザンブロット法によりニトロセルロースフィルターにトランスファーした後で放射線標識したプローブにハイブリダイズして視覚化した。
図19は、臭化エチジウム染色した1.5％アガロースゲルを示す。図20は、クローン16（配列番号26）由来の放射線標識プローブにハイブリダイズした後の同一ゲルからのサザンブロット法によるオートラジオグラムを示す。H₂O及びヒトの正常血清がレーン１及び２に示されている。レーン３、19及び20はマーカーである。レーン４、８、12及び16は非感染タマリン血清由来であり、レーン６、10、14及び18は感染タマリン血清由来である。これらの結果は、HGBVクローン16配列（配列番号26）が、タマリンＴ−1053の外に、HGBVに感染した他の個体にも検出されたが、非感染個体には検出されなかったことを示している。５匹のH205感染動物由来の急性期血清をテストした。クローン16配列（配列番号26）は、これらの動物の中の３匹〔レーン10、Ｔ−1049、接種後14日目（dpi）；レーン14、Ｔ−1051,28dpi;レーン18、Ｔ−1055、16dpi〕由来の血清中に検出された。クローン16配列（配列番号26）は、５匹の動物（レーン４、Ｔ−1048;レーン８、Ｔ−1049;レーン12、Ｔ−1051;レーン16、Ｔ−1055;T−1057は示さず）のいずれの接種前血清からも検出されなかった。これらの結果は、クローン16配列（配列番号26）が感染性HGBV病原体由来であり得ることを示唆している。５種の急性期血漿中の２種（レーン６、Ｔ−1048、28dpi;T−1057、14dpi、図示せず）に、クローン16配列（配列番号26）が不在であることは、タマリンにおけるHGBV感染の急性分解性質とあいまったクローン16RT−PCRの比較的低い感受性（クローン16配列（配列番号26）の約≧1000コピーを検出し得ると想定される）から説明し得る。従って、２匹の陰性動物由来の急性期血漿は、用いられたRT−PCRアッセイの検出レベルを下回るHGBVのタイターを含み得る。これら２匹の動物がクローン４（配列番号21）に対して陽性であったというRT−PCRによる観察結果（実施例14）は、１つのウイルス（クローン４を含む）のRNA配列の存在及び第２のウイルス（クローン16を含む）由来の検出可能なRNA配列の不在を反映している可能性がある。
実施例8. 感染タマリンの肝臓におけるHGBV配列のノー ザンブロット分析
HGBVクローン配列が、急性期タマリン血漿中でのRT−PCRとH205接種とにおいて検出できたことにより、これらの配列がHGBVゲノムを起源とする可能性が高まった。さらに別のRT−PCR検査によって、H205感染タマリンＴ−1053から抽出した肝臓RNAにHGBV配列が存在することが実証された（データは示されていない）。従って、HGBVゲノムのサイズを知るために、H205感染及び非感染タマリンの肝臓RNAとのノーザンブロット分析を行った。RNA単離キット（Stratagene,La Jolla,CA）をその推奨使用法に従って用い、H205感染タマリンＴ−1053の肝臓1.25gと対照非感染タマリンＴ−1040の肝臓1.0gとから全細胞RNAを抽出した。全RNA（30μｇ）を、0.6Mホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルを通して電気泳動し（R.M.FourneyらFocus 10:5−7,［1988］）、更に、上記の通りに20×SCC（pH7.0）中で毛管作用によってHybond−Ｎナイロン膜（Amersham）に移した。J.Sambrookら,Molecular Cloning−A Laboratory Manual，第２版（1989）。そのRNAを上記ナイロン膜に対してUV架橋し、上記ナイロン膜を真空炉内で80℃で60分間焼き付けた。PIPES 0.05Mとリン酸ナトリウム50mMとNaCl 100mMとEDTA 1mMとSDS 5％とを含む溶液25ml中で、60℃で２時間、このブロットに前ハイブリッド形成させた。G.D.Vircaら,Biotechniques 8:370−371（1990）。放射能標識化DNAプローブとのハイブリッド形成の前に、上記溶液を取り除き、新鮮な溶液10mlを加えた。ハイブリッド形成に使用したプローブは、クローン４（配列番号21;221bp）とクローン50（配列番号29;337bp）とヒトβ−アクチンに対応する2000bp cDNAだった。P.Gunning,らMo l.and Cell.Biol.3:787−795（1983）。ランダムプライマー標識化キット（Stratagene,La Jolla,CA）を推奨使用法に従って用い、［α−³²P］dATPの存在下でプローブ（50ng）を放射能標識化した。各プローブの比放射能は約10⁹cpm/μｇだった。ブロットを60℃で16時間ハイブリッド形成させ、上記の通り洗浄し（G.D.Vircaら、前出）、−80℃でKodak X−Omat−ARフィルムに対して露出した。得られたオートラジオグラフの写真を図21Aに示した。レーン１とレーン３とレーン５は、Ｔ−1040からの肝臓RNAを含み、レーン２とレーン４とレーン６は、Ｔ−1053からの肝臓RNAを含む。レーン１とレーン２は、ヒトβ−アクチンcDNAプローブとハイブリッド形成し、レーン３とレーン４はクローン４プローブ（配列番号21）とハイブリッド形成し、レーン５とレーン６はクローン50プローブ（配列番号29）とハイブリッド形成した。露出時間は、レーン１とレーン２とが−80℃で５時間であり、レーン３からレーン６までが−80℃で56時間であった。28SリボゾームRNAの位置と18SリボゾームRNAの位置では矢印で示されている。これらのリボゾームRNAの相対サイズは、各々6333ヌクレオチドと2366ヌクレオチドである。J.Sambrookら、前出。
クローン４プローブ（配列番号21）とクローン50プローブ（配列番号29）は、感染タマリン（Ｔ−1053）の肝臓から抽出したRNA中に含まれるRNA種とハイブリッド形成した（図21A、レーン４とレーン６）。このハイブリッド形成可能なRNA種のサイズは、28SリボゾームRNAと18SリボゾームRNAと比べての相対移動度に基づいて約8300ヌクレオチドと計算された。上記両プローブは同一のRNA種とハイブリッド形成したと考えられる。上記両プローブは非感染タマリン（Ｔ−1040）の肝臓から抽出したRNAとはハイブリッド形成しなかった（図21A、レーン３とレーン５）。これらの結果は、クローン４（配列番号21）配列とクローン50（配列番号29）配列とが同じ8.3Kb転写物内に存在していることを示している。
HGBV RNAゲノムの鎖形成度（strandedness）を知るために、鎖特異性（Strand−specific）放射能標識化DNAプローブを、Perkin−ElmerからのGeneAmp^▲Ｒ▼PCRキットを推奨使用法に従って用い、非対称PCRによって調製した。精製クローン50 DNA（配列番号29）を、クローン50に陰性な鎖特異性プライマー（配列番号99）又はクローン50に陽性な鎖特異性プライマー（配列番号100）のどちらかを含む別々の反応の中で、１μＭの最終濃度となるよう鋳型として使用した。この反応混合物は、こうした反応混合物中に通常含まれるdATPの代わりに、｛α³²P−dATP］（Amersham;3000Ci/mmol）を含んでいた。上記鋳型を30回線形増幅した後に、非取込み［α³²P−dATP］をQuick−Spin^▲Ｒ▼Sephadex G50スピンカラム（Boehringer−Mannheim,Indianapolis,IN）を推奨使用法に従って用い、取り除いた。二重鎖クローン50 DNA（配列番号29）の10倍ずつ希釈した液を含むDNAドットブロットに放射能標識化プローブをハイブリッド形成させ、上記両プローブが概ね同等の感度を有することを認めた（データは示していない）。上記の通りに非感染タマリンＴ−1040から抽出した肝臓RNAと感染タマリンＴ−1053から抽出した肝臓RNAとを合計で30μｇ含むRNAブロットと共に、放射能標識化プローブをハイブリッド形成させた。得られたオートラジオグラフの写真を図21Bに示す。レーン１とレーン３はＴ−1040からの肝臓RNAを含み、レーン２とレーン４はＴ−1053からの肝臓RNAを含む。レーン１とレーン２はクローン50に陽性な鎖プローブと共にハイブリッド形成し（即ち、陽性鎖が放射能標識化され、陰性鎖を検出した：配列番号100）、レーン３とレーン４はクローン50に陰性な鎖プローブと共にハイブリッド形成した（即ち、陰性鎖が放射能標識化され、陽性鎖を検出した：配列番号99）。プロットを−80℃で18時間露出した。28SリボゾームRNAの位置と18SリボゾームRNAの位置とが矢印で示されている。
図21Bに示すように、クローン50に陽性及び陰性な鎖プローブ（各々配列番号100と99）は、感染タマリンＴ−1053の肝臓から抽出した約8.3キロベースのRNA種とはハイブリッド形成した（図21B、レーン２とレーン４）が、非感染タマリンＴ−1040の肝臓から抽出したRNAとはハイブリッド形成しなかった（図21B、レーン１とレーン３）。これは、上記で示したクローン４（配列番号21）及びクローン50（配列番号29）二重鎖プローブを使用して得られたノーザンブロット結果と一致していた。より強いシグナルがクローン50に陰性な鎖プローブ（配列番号99）を用いて得られた（図21B、レーン４対レーン２）ことは、感染タマリンの肝臓中に存在する優勢なRNA種が陽性（即ち、コード化）鎖であることを示唆していた。
実施例9. HGBVクローン配列の伸長
A. HGBV配列の生成
既述の実施例３の通りに得られ且つ実施例５の通りに配列決定されたクローンの各々は、HGBVゲノムの別々の領域から得られたと考えられた。従って、既に同定したクローンの間に残るHGBVゲノムの別の領域から配列を得るために、及び、そのRNAクローンの配列を確認するために、幾つかのPCR移動実験（PCR walking experiment）を行った。
全核酸を実施例３（Ａ）で説明した通りに感染Ｔ−1053血漿の50μｌアリコートから抽出した。簡単に言えば、沈殿した核酸をDEPC処理したH₂O 10μｌ中に再懸濁させた。GeneAmp^▲Ｒ▼RNA PCRキット（Perkin−Elmer）で推奨使用法に従って標準RT−PCRを行った。簡潔に言えば、2mM MgCl₂と１μＭプライマーによる抽出核酸のランダム感作逆転写反応のcDNA生成物に対して、PCRを行った。反応物に対して35サイクルの変性−アニーリング−伸長（94℃、30秒;55℃、30秒;72℃、２分）を行い、その後で72℃で３分間の伸長を行った。アガロースゲル分析の前に反応物を４℃に維持した。これらの生成物を慣用手法によりpT7 Blue T−ベクタープラスミド（Novagen）の中にクローン化した。表９は、上記反応を行った時に得られた結果を表している。

Sorensenら（J.Virol,67:7118−7124［1993］）によって説明されているPCR移動手法を変形した方法を、追加HGBV配列を得るために使用した。簡単に述べると、全核酸を感染タマリンＴ−1053血漿から抽出し、逆転写した。得られたcDNAを、MgCl₂ 2mMを使用したことを除いてはSorensenら（前出）の手順と同様に、50μl PCR反応物（PCR 1）中で増幅した。これらの反応物に対して35回の変性−アニーリング−伸長（94℃、30秒;55℃、30秒;72℃、２分）を行い、その後72℃で３分間の伸長を行った。Sorensenら（前出）が説明している通りに、ストレプタビジンで被覆した常磁性ビーズ（Promega）を使用してビオチニル化生成物を単離した。Sorensenらが説明している通りに、合計で20〜35回の変性−アニーリング−伸長し、ストレプタビジンで精製した生成物に対して「入れ子（nested）」PCR（PCR 2）を行った。得られた生成物と、それらを生成するために使用したPCRプライマーとを表10に示す。

これらの生成物を、慣用手法により低融点アガロースゲルから単離し、pT7 Blue T−ベクタープラスミド（Novagen）の中にクローン化した。
上記の通りに、ウイルスゲノムRNAから５′末端配列を得るために、RNAリガーゼ仲介５′RACE（cDNA末端の高速増幅：Ｒapid Ａmplification of ｃDNA Ｅnds）を使用した。簡単に述べると、５′AmpliFINDER^▲Ｒ▼RACEキット（Clontech,Palo Alto,CA）を推奨使用法に従って使用した。ウイルスRNAの供給源は、上記の通りに抽出した急性期Ｔ−1053血漿であった。逆転写（RT）のために使用した個々のウイルス種に固有のオリゴヌクレオチドと、第１のPCR増幅（PCR 1）と第２のPCR増幅（PCR 2）とを、表11に示す。結合アンカープライマーとその相補的PCRプライマーは上記製造者から提供を受けた。GeneAmp RNA PCRキット（Perkin Elmer）を使用して推奨使用法に従ってPCRを行った。

RNAリガーゼ仲介５′RACEによって生成された生成物を、上記の通りに低融点アガロースゲルから単離し、pT7 Blue T−ベクタープラスミド（Novagen）の中にクローン化した。
HGBV−Ｂ配列の５′末端と３′末端とにおける別の配列を得るために（下記の「HGBV内の２種類のHCV様フラビウイルスの存在の証拠」を参照されたい）、RNA環化実験（RNA circularization experiment）を行った。（この方法は、C.W.Mandlら（1991）Biotechniques,Vol 10（４）:485−486に説明されている方法に基づいている。）（沈殿中にtRNAをグリコーゲン１μｇで置き換えたことを除いてH205接種後14日目の）Ｔ−1057血漿50μｌから全核酸を精製した。核酸ペレットをDEPC処理した水16.3μｌの中に再溶解し、２×TAP緩衝液（１×＝50mM NaOAc、pH5.0、1mM EDTA、10mM 2−メルカプトエタノール、2mM ATP）25μｌと、タバコ酸ピロホスファターゼ（20単位;Sigma）8.7μｌとを加えた。混合物を37℃で60分間温置した。（水で飽和させた）フェノールを使用し更にクロロホルムを使用して試料を抽出し、グリコーゲン（１μｇ）の存在下でNaOAc/EtOHを用いて沈殿させた。そのペレットをDEPC水83μｌ中に溶解し、10×RNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs,NEB）10μｌとRNaseインヒビター（Perkin Elmer）２μｌとT4 RNAリガーゼ（NEB）５μｌとを加えた。混合物を４℃で16時間温置した。上記と同様にフェノールを使用し更にクロロホルムを使用して試料を抽出し、NaOAc/EtOHを用いて沈殿させた。
Superscript RT（GIBCO/BRL）をその推奨使用法に従って使用し且つ配列番号146をプライマーとして用いる逆転写酵素（RT）反応で、結合RNAの1/10を使用した。RT反応混合物の半分を、ビオチニル化オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号146）と第２のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号133）との存在下でPCR1のために上記の通り使用した。Sorensenら（前出）の通りにストレプタビジン被覆磁性ビーズを使用して、PCR1生成物を反応混合物から精製した。精製したPCR1生成物（30μｌの中から２μｌ）をPCR2のための鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号147,154）を使用するPCR2によって、1200bp生成物を得、この生成物をpT7 Blue T−ベクタープラスミドの中にクローン化し、下記の通りに配列決定した。この実験からの２つの独立したクローンの配列分析によって、（一方のクローンが18個のＴ残基の配列を有し、他方のクローンが27個のＴ残基の配列を有したが）既知の配列と重複する領域では100％の同一性を示し、さらに追加の塩基270個の新たな配列とが明らかになった。
上記環化実験は、標準的な３′−RACE手法又は５′−RACE手法では得られなかったHGBV−Ｂウイルスゲノムの５′末端と３′末端の両方からの配列を与えた。しかし、新たに得られた配列から設計したプライマーを使用して行った別のPCR実験の後でさえ、正確な５′−３′結合部を発見することは困難だった。従って、HGBV−B RNAゲノムの５′末端をより適切に定性するために、Ｔ−1053の肝臓から単離したRNAを使用してプライマー伸長実験を行った。
実施例７で説明した通り、Ｔ−1053の肝臓と対照（即ち、非感染）動物（Ｔ−1040）の肝臓とから全細胞RNAを単離した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号155）を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）を使用して約9.39×10⁷CPM/μｇの比放射能にγ−³²P−ATPで末端標識化した（Sambrookら）。プライマーを別々の反応においてＴ−1053肝臓RNAとＴ−1040肝臓RNAとの30μｌにアニーリングし、上記（Sambrookら）の通りにMMLV逆転写酵素（Perkin−Elmer）を使用して伸長した。生成物を６％シークエンシングゲル上で分析した。プライマー伸長のために使用したプライマーと同一のプライマーを使用したHGBV−Ｂ環化クローンの１つから生成したシーケンスラダー（sequence ladder）が、サイズ標準としての役割を果たした。
176bpのプライマー伸長生成物をＴ−1053から得た。非感染動物（Ｔ−1040）から抽出した肝臓RNAを使用したプライマー伸長では、こうした生成物は得られず、従って、HGBV−Ｂゲノムから得られた生成物を示した。得られたこれらの生成物の長さは、感染動物の肝臓内に存在するそれのような上記ゲノムの５′末端が、AUG開始コドンから442ヌクレオチド長だけ上流に位置することを示した。
上記環化実験で得られた配列の３′位置を確認するために、予測される３′末端に対応するプライマーを使用してRT−PCRを行った（表２の反応1.25を参照されたい）。配列番号156と配列番号157とを使用した（上記の通りの）感染Ｔ−1053血漿のRT−PCRでは450bpの生成物が得られた。これとは対照的に、配列番号157の相補と配列番号147とを使用するRT−PCRでは、検出可能なPCR生成物が得られなかった（データは示していない）。これらのデータは上記ゲノムの３′末端がポリＴ系の50ヌクレオチド長下流に位置することを示唆している。
表９、表10、表11と上記RNA環化実験とからのクローン化生成物を、実施例５で既に説明した通りに配列決定した。興味深いことに、反応1.4、1.6、1.9、1.10、1.11のクローン化生成物がその末端において上記２つのプライマー配列の一方だけしか含まないことが発見され、このことは、これらの生成物が、誤ったランダムな合成開始事業（priming event）の結果として生じたことを示唆していた。PCR/配列決定実験によって、生成物1.4、1.6、1.9、1.10、1.11中で検出した配列が、クローン４（配列番号21）及び／又はクローン50（配列番号29）とに関連付けられた。加えて、反応の各々から得られた配列は、HCVとの同一性が限定されていた。従って、これらの生成物は、PCR生成物の一方の末端における誤った合成開始（priming）の結果ではあっても、真正のHGBV配列を含むと考えられた。反応1.14から得られた生成物も誤った合成開始の結果であると考えられた。この場合に、配列番号160の相補が、反応1.14から得た生成物の５′末端に発見された（図22、GB−Ｂ）。GB−Ａ内にある配列番号161から配列番号160が得られているので、このことは予想外であった。しかし、反応1.14から得た生成物と反応2.8から得た生成物との間の配列の同一性が、別のPCR/配列決定実験（データは示していない）と共に、反応1.14が真正HGBV配列を含むことを実証した。配列番号160の相補が配列番号162の上流にあって、GB−Ｂ配列に対してPCRプライマーとして働くのに十分な同一性を有することが明らかである。
上記の表９と表10と表11とに示した生成物から得られた配列と、上記RNA環化実験から得られた配列とを、GCG Package（Version 7）プログラムを使用してコンティグ（contig）の形にアセンブルした。このアセンブルしたコンティグの概要を図22に示す。GBコンティグＡ（GB−Ａ）は長さ9493bpであり、その全てが配列決定されており、配列番号163に示す。GB−Ａは、クローン２（配列番号22）とクローン16（配列番号26）とクローン23（配列番号28）とクローン18（配列番号27）とクローン11（配列番号24）とクローン10（配列番号23）とを含む。配列番号163は３つの読み可能枠に翻訳され、配列番号164−392としての配列表の形で示されている。GBコンティグＢ（GB−Ｂ）は9143bpであり、配列番号393に示す。GB−Ｂ（配列番号393）は、クローン４（配列番号21）とクローン50（配列番号29）とクローン119（配列番号30）とクローン13（配列番号25）とを含んでいる。配列番号393は１つの開放読み枠に翻訳され、配列番号396、397として配列表の形で示されている。５′末端と３′末端とからのUTRの各々を６つの読み枠に翻訳することが可能である。
B. HGBV内の２種類のHCV様ウイルスの存在に関する証 拠
1. ２つの互いに異なったRNA種を表すGB−ＡとGB−Ｂ との証拠
GB−Ａ（配列番号163）及びGB−Ｂ（配列番号393）とHCV−１（GenBank accession＃M67643）との比較によって、GB−Ａ（配列番号163）及びGB−Ｂ（配列番号393）とHCV−１とが全て異なった配列であることを示す。GB−Ａ（配列番号163）及びGB−Ｂ（配列番号393）とHCV−１との核酸配列のドットプロット分析を、GCGPackage（Version 7）を使用して行った。21のウィンドウサイズと14のストリンジェンシー（stringency）とを使用して、GB−Ａ（配列番号163）及びGB−Ｂ（配列番号393）とHCV−１とが互いに明らかに異なったヌクレオチド配列を含むことが発見された（図23）。従って、GB−Ａ（配列番号163）及びGB−Ｂ（配列番号393）は、HCVの異なる株又は遺伝子型を表すものではなく、互いに異なる株又は遺伝子型を表すものでもない。この分析によって、限定されたヌクレオチド同一性を有する短い領域が、GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）のNS3様配列とNS5b様配列との中に、並びにHCVのNS3配列とNS5b配列の中に発見された。しかし、推定上のNTP結合ヘリカーゼとRNA依存性RNAポリメラーゼの各々がNS3とNS5bとに対応し、これが全てのフラビウイルス中に保存されているので、上記領域内のヌクレオチド同一性は驚くには値しない（下記参照）。GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）が別々のRNA分子を表し、これらが同じRNA分子の別々の領域でもないということが、５′RACE実験（上記）によって実証され、（実施例８で説明した）ノーザンブロットデータによって立証された。最初に、５′RACE実験によって、GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）との５′末端がそれぞれ異なることが示された。RNA分子の５′末端は１種だけだから、GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）とは別々のRNA分子を表す。第２に、クローン４とクローン50（両方ともGB−Ｂ［配列番号393］から得られた配列番号21、29、実施例８を参照されたい）を用いてノーザンブロット法によって感染タマリンの肝臓RNA中に検出された8300塩基のRNA分子は、GB−Ｂ（配列番号393、9143bp）のサイズに概ね一致した。GB−ＡとGB−Ｂとが同一のRNA分子のそれぞれ一部であるとすれば、少なくとも17,000個の塩基を有するノーザンブロット生成物がなければならない。これらのデータは、GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）とが、HCVの変形でもなく又は互いの変形でもない、２つの互いに異なったRNA分子のヌクレオチド配列であることを示す。
Ｔ−1053のノーザンブロット分析とPCR調査によれば、GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）とにそれぞれ対応する２つのRNA種は、Ｔ−1053の肝臓中に相等しい含量で存在するわけではないことが判明した。上記のように、いずれもGB−Ｂ（配列番号393）から得られたクローン４とクローン50（各々配列番号21、29）が、（実施例８で説明した通り）Ｔ−1053の感染肝臓中に存在する8.3kb RNA種とハイブリッド形成した。これとは対照的に、いずれもGB−Ａ（配列番号163）から得られたクローン２（配列番号22）とクローン10（配列番号23）とクローン16（配列番号26）とクローン23（配列番号28）は、同一の実験においてＴ−1053肝臓RNAとのハイブリッド形成を全く示さなかった（データは示していない）。加えて、クローン4 PCRとクローン16 PCRとが同等の感度を有することがプラズミド鋳型を使用して実証された（データは示していない）にもかかわらず、クローン16 PCRは、エチジウム染色によってＴ−1053肝臓RNAから生成されたcDNA上において、クローン4 PCRに比べて著しく少ない生成物しか生成しなかった。これは、動物を犠牲にした時点でＴ−1053血漿中において発見された状況とは対照的だった。Ｔ−1053血漿RNAから生成されたcDNA上におけるクローン４（GB−Ｂ（配列番号393）に特異的）PCRとクローン６（GB−Ａ（配列番号163）に特異的）PCRに関するPCR滴定実験は、相等しい量のGB−Ａ（配列番号163）RNAとGB−Ｂ（配列番号393）RNAとがＴ−1053血漿中に存在することを示唆した（実施例４、E.2）。従って、GB−Ａ（配列番号163）RNAとGB−Ｂ（配列番号393）RNAとがＴ−1053血漿中に相等しい含量で存在していたにもかかわらず、動物を犠牲にした時点のＴ−1053肝臓中には、GB−Ａ（配列番号163）RNAよりも多い量のGB−Ｂ（配列番号393）RNAが存在すると考えられた。これらの結果はさらに、Ｔ−1053血漿中にGB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）とに対応する２つの互いに異なったRNA分子が存在することの更に別の証拠であり、これらのRNAが必ずしも感染タマリン肝臓RNA中に相等しい含量で存在するわけではないということを示唆した。従って、GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）とが単一のウイルスゲノムの別々のセグメントを形成するとは考え難い。
2. GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）と が２つの互いに異なるウイルスのゲノムを表すというこ との証拠
感染力（infectivity）とPCRの検討により、GB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）のウイルス性質に対する証拠が得られる。具体的には、濾過（0.1μｍ）されて10^-4に希釈された又は濾過されずに10^-5に希釈されたＴ−1053血漿を接種されたタマリンＴ−1049とタマリンＴ−1051は、いずれもクローン４（GB−Ｂ［配列番号393］）配列とクローン16（GB−Ａ［配列番号163］）配列の両方に関して陽性だった。接種の前は、これらの動物は二匹ともクローン４とクローン16とに対して陰性だった（実施例４、E.4、E.5）。従って、GB−ＡとGB−Ｂとに対応する急性相Ｔ−1053血漿中に含まれる２つのRNA種を、濾過し、希釈して、他の動物に当該のGB−Ａ（配列番号163）とGB−Ｂ（配列番号393）とのウイルスに予期される性質を維持するよう継代接種することが可能だった。GB−ＡとGB−Ｂとが別個のウイルス粒子からのRNA分子を表すことは、H205接種タマリンのPCR調査によって明らかになった。具体的には、H205接種後にRT−PCRによって４匹のタマリンが全てクローン４（GB−Ｂ［配列番号393］）に対して陽性になった。これとは対照的に、４匹のH205接種タマリンの内の一匹（Ｔ−1053）だけがクローン16（GB−Ｂ［配列番号163］）に対して陽性になったにすぎなかった（実施例４、E.2）。従って、GB−Ａ（配列番号163）配列はＴ−1048とＴ−1057とＴ−1061には本当に存在しないと仮定し、且つ、クローン16 PCRの結果が陰性であることが感染力の低さに起因するわけではないと仮定すると、GB−Ｂ（配列番号393）配列に対応するウイルス（即ち、肝炎GBウイルスＢ［HGBV−Ｂ］）が、GB−Ａ（配列番号163）配列とは無関係に単独で継代接種されうると考えられた。Ｔ−1057からのHGBV−Ｂのみの試料を、更に２回継代接種した（実施例４）。これらの動物では、GB−Ａ（配列番号163）配列はRT−PCRによって検出されなかった。加えて、これらの動物において肝臓酵素のレベルが有意に上昇するとされており（実施例４）、このことは、HGBV−Ｂだけでもタマリンに肝炎を発症せしめることを示した。GB−Ｂ（配列番号393）配列が検出限界未満のタマリンにおいて、GB−Ａ（配列番号163）配列が確認された。具体的には、GB−Ｂのみの動物（Ｔ−1048、Ｔ−1057、Ｔ−1061）にＴ−1053血漿で誘導すると、クローン16に特異的なRT−PCRによって検出されるような、GB−Ａ（配列番号163）のみのウイルス血症が発症した。Ｔ−1057からのGB−Ａのみの血漿を更に１回継代接種した（実施例４）。従って、GB−Ａ（配列番号163）配列に対応するウイルス（肝炎GBウイルスＡ［HGBV−Ａ］）はHGBV−Ｂとは無関係に単独で複製するものと考えられた。HGBV−Ｂの不在下でHGBV−Ａの継代接種を更に続けている。現在までのところ、HGBV−Ａがタマリンの肝炎を引き起こすか否かは判明していない。しかし、Ｔ−1053誘導タマリンにHGBV−Ａウイルス血症を伴う肝臓酵素レベルの上昇がないことや、Ｔ−1057からのHGBV−Ａのみの血清を継代接種しても肝臓酵素のレベル上昇のないことは、タマリンにおけるHGBV−Ｂの肝好性とは対照的である。
急性相Ｔ−1053血漿中の２種類のウイルスの存在は、H205接種物に基づくと考えられる。具体的には、実施例７のデータは、クローン16（配列番号26、GB−Ａ［配列番号163］からのもの）が７匹の検査対象タマリンからの接種前の血漿中にはいずれにも存在しなかったことを示した。加えて、クローン２、10、18、23（各々配列番号22、23、27、28、全てGB−Ａ［配列番号163］からのもの）も、検査したHGBV接種タマリン血漿の何れにおいても検出されなかった（実施例７）。接種前のタマリンの血漿をクローン４とクローン50（各々配列番号21、29、全てGB−Ｂ［配列番号393］からのもの）に関して検査した時にも、同様の陰性の結果が得られた。従って、HGBV−ＡとHGBV−Ｂはいずれも接種前のタマリンの血漿中に存在しなかった。これに対し、上記クローンの全て（即ち、GB−Ａ［配列番号163］からのクローン２、10、16、18、23と、GB−Ｂ［配列番号393］からのクローン４、50）が、H205接種物中に検出された（表７）。興味深いことに、Ｔ−1053肝臓から作られたcDNA（上記）に見られるように、H205からランダムに合成開始された同一のcDNAを使用した場合に、GB−Ａ（配列番号163）中の幾つかの別々のPCR標的は全て、GB−Ｂ（配列番号393）中の同様のPCR標的の場合よりも生成物が少なかった（データは示していない）。従って、当初のGB接種物であるH205中には、HGBV−Ａ及びHGBV−Ｂが存在すると結論付けられた。しかし、H205中にはHGBV−Ａよりも多くのHGBV−Ｂが含まれると考えられる。H205接種物中のHGBV−Ａが相対的に少ないことが、H205接種後に４匹のタマリンの中の１匹だけがHGBV−Ａに対して陽性であったこと（実施例４、E.2）の理由と考えられる。
3. HGBV−ＡとHGBV−Ｂとがフラビウイルス科（Flaviv iridae）に属することの証拠
実施例５で説明したGB−Ａ（配列番号165−268、270−384,386−392）の３つの枠翻訳生成物とGB−Ｂ（配列番号397）とをSWISS−PROTデータベースで検索すると、HCVの様々な菌株との、限定されてはいるが顕著なアミノ酸配列の相同性を示した。GB−Ａ（配列番号164）とGB−Ｂ（配列番号393）とからの翻訳生成物は、様々なHCV単離物（即ち、NS2、NS3、NS4、NS5）の非構造タンパク領域に対して最も近いホモロジーを示した。例えば、図24に示されるように、フラビウイルスの推定上のNTP結合ヘリカーゼドメインにおける保存残基（＊で表す）（図24A）と、全てのウイルス性RNA依存性RNAポリメラーゼのRNA依存性RNAポリメラーゼドメインにおける保存残基（＊で表す）（図24B）は、同様にHCV−1 NS3及びNS5b（SWISS−PROT accession number p26664）と、GB−Ａ（配列番号390）及びGB−Ｂ（配列番号397）の予期される翻訳生成物のいずれにも保持されていた。（Chooら，PNAS 88:2451−2455［1991］とDomierら，Virology 158:20−27［1987］を参照されたい。）従って、GB−ＡウイルスとGB−Ｂウイルスとはいずれも機能NTP結合ヘリカーゼ（functional NTP−binding helicase）とRNA依存性RNAポリメラーゼとをコードすると考えられた。しかし、GB−Ａ（配列番号390）とGB−Ｂ（配列番号397）は、その間に完全なアミノ酸同一性があるわけではなく、及び／又は、HCV NS3及びNS5bの他の領域内においてHCVとも完全なアミノ酸同一性がない。具体的には、図24Aに示されるNS3の残基200個に亙って、GB−Ａ（配列番号390、残基1252−1449）ウイルスとHCV−１（配列番号398）は47％同一であり、GB−Ｂ（配列番号397、残基1212−1408）ウイルスとHCV−１（配列番号398）は55％同一であり、GB−Ａ（配列番号390、残基1252−1449）ウイルスとGB−Ｂ（配列番号397、残基1212−1408）ウイルスは43.5％同一だった。加えて、図24Bに示されるNS3の残基100個に亙って、GB−Ａ（配列番号390、残基2644−2739）ウイルスとHCV−１（配列番号398）は36％同一であり、GB−Ｂ（配列番号397、残基2513−2612）ウイルスとHCV−１（配列番号398）は41％同一であり、GB−Ａ（配列番号390、残基2644−2739）ウイルスとGB−Ｂ（配列番号397、残基2599−2698）ウイルスは44％同一だった。HCVと比較した場合に、GB−Ａ（配列番号390）とGB−Ｂ（配列番号397）との他の推定上の非構造遺伝子にも、ホモロジーは比較的低かった。Genbankに登録された種々のHCV配列と比較しても、GB−ＡウイルスとGB−Ｂウイルスとの推定上の非構造タンパク質のホモロジーの全体的レベルは、GB−Ａ（配列番号164）とGB−Ｂ（配列番号393）の両方はフラビウイルス科の２つの互いに異なったメンバーから得られることを示唆している。フラビウイルス類は、１つのNTP結合ヘリカーゼドメインと１つのRNA依存性RNAポリメラーゼドメインとに対応する単一のゲノムRNA分子を含む。推定上のRNAヘリカーゼドメインと推定上のRNA依存性RNAポリメラーゼドメインとを各々に含む２つのコンティグの存在は、急性相Ｔ−1053血漿中の２つのHCV様フラビウイルスの存在と一致するものである。
実施例10. PCR
HGBVとＣ型肝炎ウイルスとの配列相関性を検出するために、PCRに基づく実験を次のように行った。様々な位置的起源からのHCV単離体（Cha,T.−A.ら，J.Clin.Micr obiol.29:2528−2534［1991］）において高度に保存されている、HCVゲノムの５′−非翻訳領域（UTR）配列に基づくPCRプライマー（J.H.Han,PNAS 88:1711−1715［1991］）を、H205感染タマリンＴ−1053肝臓RNAにおける類似の配列を検出するために使用した。実施例8Aで説明した通りに、全細胞RNAを感染タマリンＴ−1053の肝臓と非感染タマリン（Ｔ−1040）の肝臓とから抽出した。Perkin−Elmerから入手可能なキットを使用し、その推奨使用法に概ね従って、各RNAの試料30μｇを逆転写しPCR増幅した。HCV 5′−UTRの塩基249−268を含むアンチセンスプライマー（プライマー１）を上記逆転写酵素反応に使用した。プライマー１と、HCV 5′−UTRの塩基13−46を含むプライマー（プライマー２）とを、介在配列のPCR増幅のために使用した。サーモサイクリング（thermocycling）の条件はChaら（前出）による。
H205感染タマリンＴ−1053のHCV 5′−UTR配列の検出感度を増大させるために、上記PCR反応に対して、「入れ子」PCRプライマーを使用した第２の増幅反応を生じさせた。そのためのプライマーは、HCV 5′−UTR内における上記プライマー１の配列と上記プライマー２の配列との間にある配列から得た。プライマー３はHCV 5′−UTRの塩基47−69からの配列を含み、アンチセンスプライマーであるプライマー４はHCV 5′−UTRの塩基188−210を含んでいた。この「入れ子」PCR反応では、第１のPCR反応からのPCR生成物（反応体積合計100μｌから２μｌ）をDNA鋳型源として使用した。アニーリング温度が60℃でなく55℃であったことを除いてサーモサイクリング条件は上記と概ね同一だった。第２のPCR反応で得られたPCR生成物を、アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色とを使用して所期のDNA生成物に関して分析した。HCV 5′−UTR配列に基づくこの所期のDNAフラグメントのサイズ（Hanら、前出）は、第１のPCR反応の生成物に関しては253bpであり、入れ子PCR反応の生成物に関しては163bpであった。所期サイズのPCR生成物が、実施例8Aで説明したHCV感染チンパンジーの肝臓から抽出した全細胞RNA 30μｇを使用して行った対照実験において得られ（データは示していない）、これは、この実験手順でHCVの５′−UTRを検出できることを示す。しかし、Ｔ−1053肝臓RNA又はＴ−1040肝臓RNAの一方を使用した場合には、どちらの所期生成物も、生じた臭化エチジウム染色アガロースゲル上に発見できなかった（データは示していない）。このように所期の結果が得られなかったのは、（ｉ）上記試薬の５′−UTRの配列がHCVのそれと大きく異なっていたために、使用したオリゴヌクレオチドプライマーが効率的にアニールされず、従って、PCR増幅が不可能になったということ、又は、（ii）上記試薬に５′−UTRが欠如していたということを示唆する。どちらの場合にも、上記試薬のヌクレオチド配列がHCVのそれと大きく異なっていることが、この結果から推定される。
HCVの実験的感染の急性相中に得られたチンパンジー血漿プールから核酸を実施例７で説明した通り単離した（G.Schlauderら,J.Clin.Microbiology 29:2175−2179［1991］）。クローン16プライマー（配列番号93、94）を使用してRT−PCRを実施例７の通り行った。これらのプライマーに関する所期サイズのバンドは、臭化エチジウム染色によっても検出されず、クローン16に特異的なプローブに対するハイブリッド形成後にも検出されなかった（データは示していない）。こうした結果は、HCVに対するクローン16配列（配列番号26）の無関係性を立証する。
実施例11. 他の肝炎ウイルスに対するHGBV感染血清の 反応性
H205接種物（Ｔ−1048、Ｔ−1057、Ｔ−1061）又はＴ−1053接種物（Ｔ−1051）を使用したHGBV接種の前と後に血清標本を得、既知の肝炎ウイルスに接触した後に検出されることが多い抗体に関する検査を行った。Ａ型肝炎ウイルスに対する抗体（本出願人から入手可能なHAVAB検定を使用）と、Ｂ型肝炎コアの核タンパク質（本出願人から入手可能なCorzyme^▲Ｒ▼検査を使用）と、Ｅ型肝炎ウイルス（HEV）（本出願人から入手可能なHEVEIAを使用）と、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）（本出願人から入手可能なHCV第２世代検査を使用）とに関して、上記標本を検査した。これらの検査は、各検査キットのパッケージに同封された説明書に従って行った。
HGBV接種の前と後のどちらにおいても、検査したタマリンは何れも、HCV又はHEVに対する抗体に関して陽性ではなかった（表12を参照）。従って、HGBV感染は、HCV又はHEVに対する検出可能な抗血清をもたらさなかった。
上記タマリンの中の１匹（Ｔ−1061）は、HGBV接種の前と後のどちらにおいてもHAV抗体に対して陽性であり、このことは、HAVに事前に罹患していたことを示唆した（表９、Ｔ−1061）。しかし、他の３匹のタマリン（Ｔ−1048、Ｔ−1057、Ｔ−1051）は、HGBV接種後において、HAVに特異的な抗体を全く示さなかった。従って、HGBV感染は抗HAV反応を生じさせない。上記タマリンの中の１匹（Ｔ−1048）は、HGBV接種の前と後のどちらにおいてもHBV抗体に対して陰性だった。上記タマリンの中の２匹（Ｔ−1061、Ｔ−1057）は、HGBV接種の前に陽性だった。上記タマリンの中の１匹（Ｔ−1051）は、HGBV接種の前にはHBV抗体に対して境界近くの陽性であったが、接種後には陰性だった。こうしたデータに基づく限り、HGBV試薬による感染がHBV核に対する免疫反応を誘導するという証明は得られない。総論的に言えば、これらのデータは、HGBV試薬が独特（unique）なウイルス剤であり、ヒト肝炎に関連した一般のウイルス性試薬の何れにも関係しないことを実証した。
実施例12. HGBV感染肝臓のウェスタンブロット分析
上記の実施例１と実施例２とに示したように、HGBVを接種したタマリンには肝臓酵素値の上昇が認められた。HGBVが実際に肝臓向性ウイルスである場合には、ウイルスタンパク質が感染肝臓細胞内で生成され、こうしたタンパク質に対する免疫反応が生じることが推測される。この実施例では、HGBV感染タマリンから得られた肝臓に特有（unique）のタンパク質が現れ、このタンパク質がHGBV感染後の回復期段階に得られたタマリン血清を使用するウェスタンブロットによって特異的に認識されるとすべき根拠を示す。
HGBV感染タマリン肝臓と様々な対照用のタマリン肝臓とチンパンジー肝臓とを賽の目に切り、Omni−mixerホモジナイザーを使用してPBS中にホモジナイズした（5mlに対して肝臓約1g）。得られた懸濁液を、遠心分離（10,000×ｇ、１時間、４℃）と、５μｍフィルタと0.8μｍフィルタと0.45μｍフィルタとを通す限界濾過とによって清澄化した。この清澄化したホモジネートを、100S以上の全成分のペレット化を生じさせる条件下で遠心分離した。ペレット（100S肝臓フラフション）を少量の緩衝液中に溶解し、−70℃で貯蔵した。
標準的な方法と試薬（Laemmli不連続ゲル）を使用してSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を行った。100S肝臓フラクションを、SDSと２−メルカプトエタノールとを含む試料緩衝液中に1:20に希釈し、５分間95℃に加熱した。30〜45分間200ボルトで12％アクリルアミド又は４→15％アクリルアミド線形勾配ゲル（7cm×8cm）のいずれかによって上記タンパク質を電気泳動した。標準の方法と試薬を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に電気転写（electro−transfer）した。
標準的な方法を使用してウェスタンブロットを生じさせた。概略的に言えば、ニトロセルロース膜をTBS/Tween中で簡単にすすぎ、４℃のTBS/CS（100mM Tris、150mM NaCl、10mM EDTA、0.18％ Tween−20、4.0％仔ウシ血清、pH8.0）中で一晩封鎖した。上記ニトロセルロース膜をMulti−screen装置の中に入れ、600μｇの血清を上記装置の溝の中に入れ、その後２時間室温に維持し、一晩４℃で温置した。Multi−screen装置から上記ニトロセルロース膜を取り除き、TBS/Twee（50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ Tween−20、pH8.0）中で５分間ずつ３回上記ニトロセルロース膜を洗浄した。そのニトロセルロース膜をヤギ抗ヒト:HRPO抱合体（0.2μg/ml TBS/CS）15ml中で室温で１時間温置した。上記の通りに洗浄した後に、ニトロセルロース膜をTMB酵素基質溶液中に温置し、水ですすぎ、乾燥した。
犠牲時（GB接種12日後）にＴ−1053肝臓から単離して上記の通りに吸収転写したタンパク質は、GB接種後５週目、６週目、７週目、９週目、又は11週目から、Ｔ−1057血清との反応時に約50〜80kDaの見掛け分子量を有する独特な抗原性タンパク質を示した。GB接種前又は接種３週後のＴ−1057血清と反応させた時には、上記バンドは存在しなかった。上記Ｔ−1057血清の何れかと反応させた時に、上記バンドは、非接種タマリン（Ｔ−1040）から得られた肝臓タンパク質を含むレーン中には現れなかった。加えて、他のGB接種後の血清（GB接種後11週目のＴ−1048と、GB接種後８週目のＴ−1051）にＴ−1053肝臓タンパク質を反応させた時には、同一サイズ（50〜80kDa）のタンパク質が現れたが、同じ上記動物から得た接種前血清とＴ−1053肝臓タンパク質を反応させた時には、この同一サイズのタンパク質は現れなかった。
他のGB接種タマリンからの肝臓組織中で、又は、HCVもしくはHBVのいずれかに感染させたチンパンジーの肝臓組織の中で、上記免疫反応性バンドが検出されるかを調べるために、更に別のウェスタンブロット実験を行った。各々の場合、肝臓タンパク質を含むニトロセルロースストリップをＴ−1048（GB接種後５、８、16週目）とＴ−1051（GB接種後８、12週目）とから得た血清プールと反応させた。上記プール中では、５つの血清を同等の割合で混合した。50〜80kDaの反応性タンパク質バンドを、GB接種タマリン（GB接種後14日目に得たＴ−1038、Ｔ−1049、Ｔ−1055と、GB接種後12日目に得たＴ−1053）から得た全てのタマリン肝臓標本において検出した。この免疫反応性バンドは、Ｔ−1040（非接種）から得た肝臓標本と、チンパンジー肝臓標本（CHAS−457（HCV接種前）、CHAS−457（HCV＋）、CRAIG−454（HCV＋）、MUNA−376（HBV＋））とにおいては検出できなかった。
以上総合して、これらのデータは、HGBV感染タマリン肝臓に特異的に結合する、約50〜80kDaの見掛け分子量を有する免疫原性及び抗原性タンパク質の存在を実証するものだった。このHGBV関連タンパク質の性質（即ち、ウイルスをコードするか又は宿主起源か）は現在調査中である。HGBV関連タンパク質の起源に関係なく、これらの結果は、HGBV感染がHGBV感染タマリン肝臓中に存在する抗原に対する抗体反応を誘導する事実と整合している。
実施例13. CKSに基づく免疫原性HGBV−Ａ及びHGBV−Ｂ ポリペプチドの発現と検出
A. HGBV−Ａ及びHGBV−Ｂ配列のクローン化
クローン化ベクターpJO200、pJO201、pJO202により、組換えタンパク質をCMP−KDOシンセターゼ（CKS）タンパク質に融合させた。これらのプラスミドの各々はプラスミドpBR322由来であるが、（E.coli CKSタンパク質を構成する全体で248個のアミノ酸の中の最初の239個をコードする）kdsB遺伝子フラグメントに融合した修飾ラックプロモーターと、kdsB遺伝子フラグメントの末端に融合した合成リンカーとを有する。この合成リンカーは、遺伝子挿入に要する複数の制限部位と、翻訳停止シグナルと、trpA rho依存性転写ターミネーターとを含んでいた。このリンカー領域内の特有の制限部位は、５′から３′方向に、EcoR I、Sac I、Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、Pst I、Sph I、Hind IIIを含んでいた。各々のプラスミドは、上記複数のクローン化部位内のいずれの読み枠の中へも挿入を可能にする。タンパク質合成のCKS方法とCKSベクターは、本明細書に引例として組み入れられている本出願人の米国特許第5,124,255号に開示されており、一方、検定フォーマットと検査キットとにおけるCKS融合タンパク質の使用は、本明細書に引例として組み入れられている本出願人の米国出願番号No.07/903,043に開示されている。
表９と表10（実施例９）で説明した移動実験（walking experiment）から得られたHGBV−Ａ配列とHGBV−Ｂ配列を、表13と表14に示した制限酵素（10単位、NEB）を使用して適切なpT7Blue T−ベクタークローンから切り離し、実施例3Bで説明した通りに１％低融点アガロースゲルから精製した。プラスミドpJO200、pJO201、pJO202を同一の制限酵素（10単位、NEB）によって消化し、細菌性アルカリフォスフォターゼ（GIBCO BRL,Grand Island,NY）で脱リン酸した。精製したHGBVフラグメントの各々を、消化し脱リン酸したpJO200、pJO201、pJO202の中に結合させ、実施例3Bで説明した通りにE.coli XL1 Blueに形質転換した。標準的なミニプレプ（miniprep）分析によって、CKS/HGBV発現ベクターの形成の成功を確認した。
別の２つのPCR生成物を、特に発現のために準備した。これら２つの生成物は、4.1、4.2と表され、各々にHGBV−Ｂコア領域とHGBV−Ａコア領域とをコードすると予想された（図22参照）。実施例９で説明したように、PCR生成物4.1を、プライマーコアＢ−ｓとプライマーコアＢ−a1（配列番号708、709）を使用して作成し、PCR生成物4.2を、プライマーコアＡ−ｓとプライマーコア2.2.1′（配列番号710、138）を使用して生成した。この4.1センス及びアンチセンスプライマーは、末端となるように意図したEcoR I及びBamH I制限部位を各々に有した。上記のように、4.1PCR生成物を消化し、ゲル単離し、pJO200、pJO201、pJO202に結合させた。4.2PCR生成物に関するセンスプライマーは、末端となるように意図したEcoR I制限部位を有するが、そのアンチセンスプライマーは制限部位を持たなかった。従って、この生成物を、EcoR Iによって切断し、ゲル単離し、既にBamH Iで消化したpJO200、pJO201、pJO202に結合させ、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントとdNTPとで末端修飾し、EcoR Iで消化し、当業界で公知のように細菌性アルカリフォスファターゼで脱リン酸した。
B. HGBV−Ａ及びHGBV−Ｂ配列の発現
トリプトン32gm/L、酵母抽出物20gm/L、MaCl 5gm/L、pH7.4、アンピシリン100mg/L、グルコース3mMを含む媒質中で振とうしながら、CKS/HGBV発現ベクターを含むE.coli XL1 Blue培養物を37℃で生長させた。この培養物が1.0〜2.0のOD600に達した時に、修飾ラックプロモーターからの発現を誘導するためIPTGを最終濃度1mMになるように加えた。更に３時間振とうしながら37℃で培養物を生長させ、集菌した。細胞ペレットをSDS/PAGE充填緩衝液（Tris pH6.8 62.5mM、SDS 2％、グリセロール 10％、２−メルカプトエタノール５％、ブロモフェノールブルー0.1mg/ml）中に10のOD600となるよう再懸濁させ、５分間沸騰させた。調製した全細胞ライゼートのアリコートを10％SDS−ポリアクリルアミドゲル上に施し、40％メタノール/10％酢酸中にクーマシーブルー染料0.2％を含む溶液で着色し、更に、バックグラウンドが透明になるまで16.5％メタノール/5％酢酸で脱色した。
全細胞ライゼートを第２の10％ SDS−ポリアクリルアミドゲル上に施し、イムノブロット検定のために電気永動によってニトロセルロースに転写した。転写されたタンパク質を含むニトロセルロースのシートを室温で30分間封鎖溶液（Tris緩衝塩類液中の５％Carnation無脂肪ドライミルク）中に温置し、E.coli細胞ライゼートに対して予め封鎖されたヤギ抗CKS血清中で室温で１時間温置し、封鎖溶液中に1:1000に希釈した。このニトロセルロースシートをTris緩衝塩類液（TBS）で２回洗浄し、その後アルカリホスファターゼ抱合ウサギ抗ヤギIgGと共に室温で１時間温置し、封鎖溶液中で1:1000に希釈した。このニトロセルロースシートをTBSで２回洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム（nitroblue tetrazolium）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートとを含むTBS中で発色させた。各フラグメントに対する適切な読み枠を、適正な予想サイズの免疫反応性CKS融合タンパク質の発現に基づいて定め、ベクター挿入結合部分についてはDNA配列決定によって確認した。
上記フラグメント各々の適切な読み枠を決定した後に、適切な構成要素を含む培養物からの試料を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気永動とウェスタンブロットとによって分析した。図25Aは、上記CKS融合タンパク質全細胞ライゼートを含む２つのクーマシー染色10％SDS−ポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１とレーン16は、左に示されるキロダルトン単位の分子量標準を含む。ゲル１（HGBV−Ａ試料）上の展開順序は次の通りだった：レーン２、クローン1.17誘導前：レーン３−15、クローン4.2、クローン1.17、クローン1.8、クローン1.2、クローン1.18（配列番号390）、クローン1.19、クローン1.20、クローン1.21、クローン1.22（配列番号390）、クローン2.12、クローン1.5、クローン1.23、クローン2.18、各々全て誘導３時間後。ゲル２（HGBV−Ｂ試料）上の展開順序は次の通りだった：レーン17、クローン4.1誘導前：レーン18−29、クローン4.1、クローン1.15、クローン1.14、クローン2.8、クローン1.13、クローン1.12、クローン2.1、クローン1.7、クローン1.3、クローン1.4、クローン1.16、クローン2.12、各々全て誘導３時間後。これらのタンパク質を上記と同じ順序で２つの別の10％ゲル上に施し、上記の通りにニトロセルロースに転写した。試料を、２匹の回復期のＴ−1048、Ｔ−1051からの血清のプールを使用したウェスタンブロットで次のように分析した。上記試料を含むニトロセルロースシートを封鎖溶液中に30分間温置し、E.coliライゼート10％と、XL1−Blue/CKSライゼート6mg/mlと、表６（実施例４）で説明した回復期タマリン血清プールの1:100希釈液とを含む封鎖溶液に移した。室温で一晩温置した後、上記ニトロセルロースシートをTBS中で２回洗浄し、HRPO−抱合ヤギ抗ヒトIgG中に室温で１時間温置し、封鎖溶液中に1:500に希釈した。ニトロセルロースシートをTBS中で２回洗浄し、４−クロロ−１−ナフトール2mg/mlと過酸化水素0.02％とメタノール17％とを含むTBS中で発色させた。図25Bに示されているように、３つのHGBV−Ｂタンパク質、クローン1.4、1.7、4.1のCKS融合が、タマリン血清プールとの免疫反応を示した。クローン1.7は、HGBV−Ｂ免疫原性領域をコードする配列（配列番号610）を含み、クローン1.4は、同じ回復期タマリン血清プールを使用したcDNAライブラリー（実施例４）のイムノスクリーニングによって発見された、２つのHGBV−Ｂ免疫原性領域をコードする配列（配列番号12、13、18）を含んでいた。
上記のパラグラフで説明した試料も、軍医GB（the surgeon GB）からの急性肝炎の発病後約３週目に得られた回復期血清の1:100希釈液を使用して、上記の通りにウェスタンブロットによって分析した。HGBV−ＡとHGBV−Ｂとからの融合タンパク質の上記血清に対する反応性を表13、14に示す。HGBV−Ｂタンパク質では１つ（2.1）だけがこの血清に対する反応性を示したが、この反応性は非常に低く、一方、２つのHGBV−Ａタンパク質（1.22［配列番号390］、2.17）はこの血清に対する高い反応性を示した。これら２つのHGBV−Ａタンパク質は40個のアミノ酸について共通であり、このことは、１個以上のエピトープに対する反応性を反映している可能性がある。これら２つのHGBV−Ａタンパク質を、実施例16で説明した通りのELISA検定で使用するために選択した。第11代継代接種GB材料（H205 GB pass 11）に感染したタマリンは、幾つかのHGBV−Ｂエピトープに対して免疫反応を示し、HGBV−Ａエピトープに対しては免役反応を示さなかったが、最初のGB源からの血清は、少なくとも１つのGBV−Ａエピトープに対して著しい反応性を示したということは興味深い。このことは、HGBV−Ａが軍医GBにおける肝炎の原因であった可能性を示唆した。
1.4、1.7、又は2.17 ELISAS（実施例15、16を参照されたい）によってCKS/HGBV−Ａ又はCKS/HGBV−Ｂ融合タンパク質の１つ以上に対する抗体の存在を示した４つの別のヒト血清を、ウェスタンブロット分析のために選択した。これらの血清の３つ（G1−41、G1−14、G1−31）は西アフリカ「危険」集団からのものであり、４番目（341C）は、非Ａ−Ｅ肝炎（エジプト）標本（これらの集団の詳細な説明については実施例15を参照されたい）からのものだった。上記のCKS融合タンパク質の中の幾つかからの全細胞ライゼートを別の10％ SDS−ポリアクリルアミドゲルに施し、上記の通りニトロセルロースに転写した。これらのブロットの各々を上記の通りに予め封鎖し、E.coliライゼート10％とXL1−Blue/CKSライゼート6mg/mlとを含む封鎖緩衝液中に1:100に希釈したヒト血清標本の１つと共に一晩温置した。ブロットをTBS中で２回洗浄し、HRPO抱合ヤギ抗ヒトIgGと反応させ、上記の通りに発色させた。
CKS/HGBV−Ｂタンパク質を上記血清の２つ（G1−41、G1−14）を使用して分析し、その反応性を表13に示した。タマリン血清に対して反応性を示した上記３つのタンパク質に加えて、更に別の２つのタンパク質（1.16、2.1）が２つのヒト血清のどちらか一方に対して反応性を示した。CKS/HGBV−Ａタンパク質を、上記４つのヒト血清全てと分析し、これらの反応性を表14に示す。GB血清に対して反応性を示した上記２つのタンパク質に加えて、更に別の３つのタンパク質（1.5、1.18、1.19）がヒト血清の１つ以上に対して反応性を示した。これらのタンパク質の内の２つ（1.5、1.18）を、実施例16で説明する通りのELISA検定に使用するために選択した。ウェスタンブロットによって及び／又は２つのHGBV−Ａタンパク質（1.18、2.17）と１つのHGBV−Ｂタンパク質（1.7）とに対するELISA（実施例15、16）によって反応性を示すG1−31血清が、GB−Ｃ配列（配列番号673、残基2274−2640）がそれから単離された血清である（実施例17）ということが特に興味深い。

実施例14. 免疫反応性HGBV−Ａ及びHGBV−Ｂタンパク 質のエピトープマッピング
A. HGBV−Ｂタンパク質1.7のエピトープマッピング
免疫原性領域の位置を確認するために、HGBV−Ｂ免疫原性タンパク質1.7内の重複サブクローンを、実施例７で説明した通りＴ−1053血清からのRT−PCRによって実施した。各PCRプライマーは、制限酵素消化を容易にするために５′末端側に余分の６つの塩基を有しており、その後にEcoR I部位（センスプライマー）又はHind III部位（アンチセンスプライマー）のいずれかが続いた。加えて、各アンチセンスプライマーはコーディング領域の直後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施例13で説明したように、各フラグメントをEcoR I/Hind III−消化pJO201の中にクローン化した。実施例13で説明した通り、CKS融合タンパク質を発現させ、タマリンＴ−1048/T−1051血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。1.7−１から1.7−５と称する５つの重複クローンを生成した。これらのクローンは、サイズがアミノ酸104〜110個分の範囲にある1.7タンパク質の領域をコードしている。各クローンを生成するために使用したPCRプライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.7配列内の位置と、タマリンＴ−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表15に示す。cDNAライブラリー（実施例４）のイムノスクリーニングによって発見された免疫原性領域（配列番号678）にまたがる、更に別の２つの重複クローンを生成した。1.7−６と1.7−７と称されるこれらのクローンの各々は、アミノ酸75個のポリペプチドをコードする。使用したPCRプライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.7配列内の位置と、タマリンＴ−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表15に示す。アミノ酸507個分の長さの1.7タンパク質の中に、２つの免疫原性領域を確認した。即ち、Ｎ末端付近の免疫原性領域は残基１−105の範囲内であり、上記タンパク質の中央付近の免疫原性領域は残基185−410の範囲内であった。これらの領域の各々の中に単一のエピトープ又は複数のエピトープがあるかどうかは、更に検討を要する。
B. HGBV−Ｂタンパク質1.4のエピトープマッピング
免疫原性領域の位置を確認するために、HGBV−Ｂ免疫原性タンパク質1.4内の重複サブクローンを、Ｔ−1053血清からのRT−PCRによって実施した。各PCRプライマーは、制限酵素消化を容易にするために５′末端側に余分の６つの塩基を有しており、その後にEcoR I部位（センスプライマー）又はBamH I部位（アンチセンスプライマー）のいずれかが続いた。加えて、各アンチセンスプライマーはコーディング領域の直後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施例13で説明したように、各フラグメントをEcoR I/BamH I−消化pJO201の中にクローン化した。実施例13で説明した通り、CKS融合タンパク質を発現させ、タマリンＴ−1048/T−1051血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。1.4−１から1.4−４と称する４つの重複クローンを生成した。これらのクローンは、サイズがアミノ酸137〜138個の範囲にある1.4タンパク質の領域をコードしている。各クローンを生成するために使用したPCRプライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.4配列内の位置と、タマリンＴ−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表15に示す。cDNAライブラリー（実施例４）のイムノスクリーニングによって発見された免疫原性領域にまたがる、更に別の２つの重複クローンを生成した。1.4−５と1.4−６とで称されるこれらのクローンの各々は、アミノ酸75個の長さのポリペプチドをコードする。使用したPCRプライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.4配列内の位置と、タマリンＴ−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表15に示す。残基129−393を含むアミノ酸265個から構成される配列が、アミノ酸522個分の長さの1.4タンパク質の中の免疫原性領域であると確認した。ライブラリーのイムノスクリーニング（実施例４）によって上記配列内に２つの非隣接免疫原性クローンを確認したので、少なくとも２つのエピトープが上記領域内に存在する可能性がある。
C. HGBV−Ａタンパク質1.22（配列番号390）及び2.17 のエピトープマッピング
HGBV−Ａタンパク質1.22（配列番号390）と2.17（配列番号613）は、いずれもウェスタンブロットによってGB血清との免役反応を示した（実施例13）。これらの２つのタンパク質はアミノ酸40個分だけ重なっているので、観察された免疫反応は、１つのエピトープによるか、又は２つ以上のエピトープの存在の結果として生じた可能性がある。完全な1.22/2.17配列はアミノ酸641個分の長さだった。免疫原性領域を発見するために、この領域内の重複サブクローンをＴ−1053からRT−PCRによって実施した。各PCRプライマーは、制限酵素消化を容易にするために５′末端側に余分の６つの塩基を有しており、その後に、EcoR I部位（センスプライマー）、又は、1.22/2.17−２から1.22/2.17−６に関してBamH I部位（アンチセンスプライマー）のいずれかが続いた。しかし、クローン1.22/2.17−１は内部EcoR I部位を有するので、BamH I部位がセンスプライマーとして使用され、Hind III部位がアンチセンスプライマーとして使用された。加えて、各アンチセンスプライマーはコーディング領域の直後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施例13で説明したように、各フラグメントをEcoR I/BamH I−消化（又は、1.22/2.17−１に関してはBamH I/Hind III−消化）pJO201の中にクローン化した。実施例13で説明した通り、CKS融合タンパク質を発現させ、GB血清を使用してウェスタンブロットによって分析した。このクローンはアミノ酸115−116個分のサイズ範囲の1.22/2.17の領域をコードした。各クローンを生成するために使用したPCRプライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、HGBV−Ａポリペプチド配列内の位置と、GB血清に対する反応性とを、表15に示す。1.22/2.17タンパク質の中央では、免疫原性領域はアミノ酸220個分の長さの領域に狭まっていた。これは、1.22と2.17の間のアミノ酸40個分の長さの重複領域を含み、従って、２つのタンパク質に共通する免疫反応は、共有している１つのエピトープによるか、又は複数のエピトープに起因していた可能性がある。

実施例15. HGBV−Ｂの血清学的研究
A.組換えタンパク精製手順
CKS融合タンパクを発現する細菌細胞培養物を凍結し、−70℃で保存した。三つの構築物それぞれからの細菌細胞を解凍し、リゾチームとDNアーゼを用いて粉砕処理し、次いでフッ化フェニルメタンスルホニルおよびその他のプロテアーゼ阻害剤の存在下、超音波処理して個々の組換え抗原と大腸菌タンパクの混合物を得た。三つの培養物それぞれについて、不溶性の組換え抗原を遠心分離により濃縮し、一連の洗浄工程に付して非組換え大腸菌タンパクの大部分を除去した。本プロトコールで使用した洗浄液の構成は、蒸留水、５％TritonX−100、および50mMのTris（8.5）であった。得られた沈殿物をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下、溶解した。タンパク濃度を測定したあと、２−メルカプトエタノールを加え、混合物をセファクリルS300樹脂を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付し、種々のタンパクをそのサイズによって分別、分離した。各分画を集め、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気永動（SDS−PAGE）で分析した。この電気永動で分離されたタンパクは、次いでクーマシーブリリアントブルーR250で染色し、分子量が約75kD（CKS−1.7/配列番号610）、80kD（CKS−1.4/配列番号611）、42kD（CKS−4.1/配列番号612）に相当するタンパクの有無を調べた。該当するタンパクを含有する分画をプールし、SDS−PAGEによって再度調査した。
精製抗原を含有するプール分画の免疫原性および構造の完全性を、実施例13に記載の方法に従ってニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロット法によって決定した。適当な陽性コントロールがなかったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのCKS部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって同定した。CKS−1.7タンパク（配列番号610）について、組換え抗原を検出すべく抗−CKSモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、約75kDのところにシングルバンドが認められた。この結果はCKS−1.7タンパク（配列番号610）の予想サイズに一致している。CKS−1.4タンパク（配列番号611）については、抗−CKSモノクローナル抗体によって60kDと70kDの間に四重のバンドパターンが検出された。観察されたこれらのバンドは完全長タンパクについて予想された長さより短く、恐らく欠失されたものであろうと思われる。CKS−4.1タンパク（配列番号52）をウェスタンブロット法で調べると、抗−CKSモノクローナル抗体によって組換え抗体が約42kDにおいてシングルバンドとして検出された。この結果はCKS−4.1タンパク（配列番号612）について予想されたサイズと一致している。
B.ポリスチレンビーズの被覆手順
上記タンパクを透析し、以下に記載のように、これらのタンパクのポリスチレンビーズ上での抗原性を評価した。これとは別に、三種の精製HGBV組換えタンパク（CKS−1.7/配列番号610、CKS−1.4/配列番号611、およびCKS−4.1/配列番号612）のそれぞれを用いてHGBVに対する抗体を検出すべく、酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）を行った。これらのタンパクで行ったELISAをそれぞれ、1.7ELISA（CKS−1.7（配列番号610）組換えタンパク使用）、1.4ELISA（CKS−1.4（配列番号611）組換えタンパク使用）、および4.1ELISA（CKS−4.1（配列番号612）組換えタンパク使用）とする。最初の研究においては、1/4インチのポリスチレンビーズを種々の濃度の精製タンパクで被覆（約60ビーズ／ロット）し、無接種のタマリンからの血清を陰性コントロール、接種したタマリンからの回復期血清を陽性コントロールとして用いたELISA試験（下記）により評価した。その他のコントールとして、種々の肝炎ウイルスに対して陰性と判定された個体から得たヒト血清のプールを含めた。追加の陽性コントロールは、ビーズの被覆効率をモニターするためのCKSタンパクに対するモノクローナル抗体であった。陰性コントロールシグナルに対する陽性コントロールシグナルの比が最も高くなるようにビーズの被覆条件を選択し、ビーズ被覆プロセスのスケールアッセイに用いた。四つのELISA試験のそれぞれについて、1000ビーズからなるロットを少なくとも２ロット作成し、血清学的研究に用いた。
簡単に述べると、ポリスチレンビーズを精製タンパクで被覆するにあたり、洗浄したビーズをシンチレーションバイアルに加え、ビーズを組換え抗原含有緩衝液に浸漬した（約0.233ml/ビーズ）。各組換え抗原につき種々の異なる濃度を用意し、これらをpH5.0〜9.5の範囲に調整した種々の異なる緩衝液とともに用いて評価した。次いでバイアルを40℃のインキュベーター中の回転装置上に２時間載置し、その後液体を吸引し、ビーズをpH6.8のリン酸緩衝食塩水（PBS）で３回洗浄した。次いでビーズを0.1％TritonX−100を用いて１時間、40℃で処理し、PBSで３回洗浄した。次に、ビーズを５％ウシ血清アルブミンでオーバーコートし、攪拌しながら40℃、１時間でインキュベートした。PBSでさらに洗浄を繰り返した後、ビーズを５％ショ糖で20分間室温でオーバーコートし、液体は吸引除去した。最後にビーズを空気乾燥し、HGBVに対する抗体を検出するためのELISA試験に使用した。
C.HGBVに対する抗体を検出するためのELISA手順
ELISAは間接アッセイ法で行った。即ち、血清または血漿を検体希釈剤で希釈し、固相に被覆した抗原と反応させた。洗浄工程の後、固相と結合したタマリンまたはヒト抗体を検出するために、ビーズをヒト免疫グロブリンを指向する西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）標識抗体と反応させた。切捨て値を越えるシグナルを生じた検体は反応性ありとした。ELISAに関する付加的な詳細を以下に記す。
ELISAの様式は、抗原で被覆した固相を予め検体希釈剤（動物血清と非イオン活性剤を含有する緩衝溶液）で希釈したタマリン血清と接触させるものである。この検体希釈剤の調合に当たっては、特異的抗体が抗原で被覆された固相と結合する割合を高める一方、固相に対する非特異的な免疫グロブリンの結合に起因するバックグラウンドシグナルを減少させるように調合した。具体的には、10μｌのタマリン血清を150μｌの検体希釈剤で希釈し、回転攪拌した。この予備希釈された検体10μｌを反応トレイ中のウェルに添加した後、200μｌの検体希釈剤と抗原被覆ポリスチレンビーズを加えた。この反応トレイをダイナミックインキュベーター（アボットラボラトリーズ製）中でインキュベートした。インキュベーターは、室温で常に攪拌し続けた。１時間のインキュベーションの後、液体を吸引除去し、ビーズを含有するウェルを蒸留水で３回洗浄した（各回5ml）。次にコンジュゲート希釈剤（動物血清と非イオン活性剤を含有する緩衝溶液）で希釈したHRPO標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを200μｌ各ウェルに添加し、反応トレイを上記のようにして再び１時間インキュベートした。液体を吸引除去し、ビーズを含有するウェルを蒸留水で上記のようにして３回洗浄した。抗原及び結合免疫グロブリンを有するビーズをウェルから除去し、各ビーズを試験管に入れ、0.3％ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩の0.02％H₂O₂含有0.1Mクエン酸塩緩衝液（pH5.5）溶液300μｌと反応させた。室温で30分保持後、1NのH₂SO₄を加えて反応を停止させた。492nmでの吸収を分光光度計で読み取った。生じた色は、試験サンプル中に存在する抗体の量と正比例する関係にあった。
HGBVエピトープに対する抗体を含まないと思われる検体とHGBVエピトープに対する抗体を含むと思われる検体とを分別するために、検体の各グループに対して予備的な切捨て値を設定した。
D.感染個体の血清におけるHGBV由来RNAの検出
タマリン血清またはヒト血清／血漿中における、HGBV−RNA存在下の1.7ELISAおよび1.4ELISAの血清反応データを相互に関連付けるために、RT−PCRを既に参照して本明細書に包含した米国特許出願第08/283,314号の実施例７と同様に実施した。実施にあたってはHGBVのクローン化された配列に由来するオリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドのHGBV−Ｂゲノムに由来するクローン４（実施例７参照）およびHGBV−Ａゲノムに由来するクローン16に対する最終濃度は0.5μＭであった。
E.タマリンの血清像
IEMSIPに収容されたタマリンから週単位で採血して血清を得、肝臓の酵素レベルを検査した。検体血清の残量はさらなる調査のためにアボットラボラトリーズに送った。
1.タマリンについてのELISAの結果（初期感染性の研究）
４匹のタマリン（Ｔ−1053、Ｔ−1048、Ｔ−1057、およびＴ−1061）にGB血清（H205GB継代数11と称する）を接種した。接種後（PI）の最初１週間の間、タマリンＴ−1053では肝酵素の上昇が認められた。このタマリンは、PI12日で安楽死させた。タマリンＴ−1048、Ｔ−1057、およびＴ−1061は、接種後２週間までの間に肝酵素の上昇を示した。この上昇はPI8〜９週まで続いた（図２〜４）後、接種前のレベルに戻った。PI14週において、これら３匹のタマリンに対し、タマリンＴ−1053（この個体は感染力を有することが判明している−実施例２）から得た希釈していない血清0.10mlでの再接種を行った。
この３匹のタマリン（タマリンＴ−1048、Ｔ−1057、およびＴ−1061）の回復期の血清がCKS−1.7（配列番号610）組換えタンパク、CKS−1.4（配列番号611）組換えタンパク、CKS−4.1（配列番号612）組換えタンパクに対する抗体を有するか否かについて、ELISA（図３、４、５）を個々に行って検討した。1.7（配列番号610）、1.4（配列番号611）、4.1（配列番号612）、あるいは1.5（配列番号614）の各組換えタンパクに対する特異抗体は、どの接種前の検体からも検出されなかった。
図26に示すように、Ｔ−1048の血清においては、1.7および1.4ELISAの試験によってPI56〜84日で特異抗体が検出されたが、PI97および137日では検出されなかった。また、Ｔ−1048の血清は、4.1ELISAの試験では特異抗体を検出しなかった。図27に示すように1.7タンパク（配列番号610）に対する抗体がＴ−1057の血清においてPI56および63日に検出されたが、PI63日よりも後は検出されなかった。4.1タンパク（配列番号612）に対する抗体がPI28〜63日に検出されたが、PI84〜97では検出されなかった。上記のように、各タマリンに対し、PI97日に接種剤H205で再接種を行った。4.1タンパク（配列番号612）に対する特異抗体がPI112日およびPI126日に検出されたが、これは接種に対する既往反応を示唆するものである。1.4組換えタンパク（配列番号611）については抗体反応は認められなかった。
組換え1.4タンパク（配列番号611）に対する特異抗体がタマリンＴ−1061の血清においてPI84日からPI112日の間で検出されたが、PI126日以降では検出されなかった。図28に示すように、タマリンＴ−1061の血清は1.7タンパク（配列番号610）および4.1タンパク（配列番号612）に対する抗体に関してPI350日で陰性であった。
2.タマリンについてのPCRの結果（初期感染性の研究）
タマリンＴ−1048およびＴ−1057の血清を選択し、実施例７に記載のクローン４から得たプライマーと実施例７に記載のクローン16から得たプライマーを用い、RT−PCRによってHGBV−RNAを調べた。
HGBV−RNAは、RT−PCRによっては接種前10日および接種前17日の血清中のプライマーのいずれにおいても（Ｔ−1048）（図26）、あるいは接種前17、37、59日の血清中のプライマーのいずれにおいても（Ｔ−1057）（図27）検出されなかった。Ｔ−1048については、HGBV−RNAが、PI7〜137日の間に得た17の異なった血清のうちの15に関してクローン４からのプライマーを用いて検出された。HGBV−RNAは、PI7〜97日の期間に得た10種血清のいずれかにあっても、クローン16から得たプライマーを用いるRT−PCRによっては検出されなかった。Ｔ−1053の血漿を接種すると、接種後８日および40日の期間に採取した血清５検体のうち４検体がクローン16に対して陽性であった。Ｔ−1057については、RT−PCRの結果が陽性であったのは、図27に示すようにPI7日から28日に採取した４検体で、クローン４からのプライマーを用いたものであった。各検体に対して行ったRT−PCRの結果は、PI28日後においては弱いハイブリダイゼーションシグナルを示した287日目を除いては、クローン４に対して陰性であった。PI7日〜97日に得たＴ−1057の６つの検体のいずれもが、クローン16からのプライマーを用いたRT−PCRが陽性であった。しかしながら、Ｔ−1053の接種後８日〜85日の間の血清は、クローン16からのプライマーの使用で陽性であった。
3.タマリンについてのELISAの結果（力価検定／伝播性の研究）
実施例２に記載のように、タマリンＴ−1053の血清を４匹のタマリンに接種した。これら４匹のタマリンのうち３匹を疾病の急性期（PI12日から14日の間）に安楽死させた。これら３匹のタマリンについて得たRT−PCRの結果を以下に記す。生き残ったタマリン（Ｔ−1051）は最初PI14日までに肝酵素値が上昇し、この上昇値は少なくともPI8週まで持続した。タマリンＴ−1051の検体を1.7ELISAおよび1.4ELISAで試験した。結果を図29に示す。特異抗体は接種後の最初の41日間に採取された血清においても接種前の血清においても検出されなかった。しかしながら、1.4タンパク（配列番号611）および1.7タンパク（配列番号610）に対する抗体反応がPI49日とPI113日の間に、また4.1タンパク（配列番号612）に対する抗体反応がPI28日とPI105日の間に認められた。タマリンはPI113日目に安楽死させた。
タマリン（Ｔ−1034）は、実施例１および表４に記載のように最近罹患した肝炎感染から回復しつつある患者（最初のGB源）の潜在的感染性血清0.1mlで前に接種したものである。肝酵素値の上昇はＴ−1034において接種後の約10週間認められなかった。この理由からタマリンＴ−1034は付加的研究において使用できるであろうと決定した。タマリンＴ−1034はHGBV調製物で接種した。このHGBV調製物は、タマリンＴ−1053の血清を予め接種した３匹のタマリン（Ｔ−1055、Ｔ−1038、Ｔ−1049）の血清プールから実施例4??の記載に従って調製したものである。
これらの３匹のタマリン（Ｔ−1055、Ｔ−1038、Ｔ−1049）に、実施例２の記載に従ってタマリンＴ−1053から調製した血清を接種した。PI11日までには３匹のタマリン全てで肝酵素の上昇が認められた。PI12日目にタマリンＴ−1055を殺した。タマリンＴ−1038とタマリンＴ−1049はPI14日目に殺した。これらのタマリンの血清をプールして、清澄化し、濾過した。この濾過したものの10^-6希釈物（健常タマリン血清中に調製）0.25mlをタマリンＴ−1034に接種した。
Ｔ−1034に接種後２週間で肝酵素ALT値の上昇が最初に認められ、続く７週間の間上昇値を保ち、最後に接種後10週までに正常化した。図30に示したように1.4（配列番号22）組換えタンパクに対する特異抗体応答がPI49日に最初に検出され、PI56日〜118日の間検出され続けた。4.1（配列番号52）組換えタンパクに対する抗体応答はPI49日に最初に検出され、PI56日〜77日の間検出され続けた。但しPI84日から118日の間は検出されなかった。1.7（配列番号610）組換えタンパクに対する抗体応答はPI56日に最初に検出され、PI63日〜118日の間検出され続けた。タマリンはPI118日目に殺した。
実施例２に記載のように、タマリンＴ−1044は、H205で接種した７日後にＴ−1057からの血清で接種した。この接種物はクローン４プライマーで検出された配列に対してのみ陽性であった。クローン16プライマーを用いたRT−PCRでPI14日から63日の間、切捨て値を越えるゆるやかなALT値の上昇が見られた。前述のように、1.7（配列番号610）組換えタンパクに対する特異抗体応答は、PI63日〜84日の間、検出された。4.1（配列番号612）組換えタンパクに対する抗体応答や、1.4（配列番号611）組換えタンパクに対する抗体応答は検出されなかった。タマリンは、PI161日目に殺した。
4.タマリンについてのPCRの結果（力価検定／伝播性の研究）
接種に先立つ８週目の週にＴ−1049とＴ−1055から採取した血清および接種の日にＴ−1038から得た血清は、クローン16（配列番号26）およびクローン４（配列番号21）に対し、RT−PCR陰性であった。タマリンＴ−1049とタマリンＴ−1055はクローン４の配列（配列番号21）に対して接種の１週間後、RT−PCR陽性であった（クローン16のPCRは実施しなかった）。殺す日に先立つ、Ｔ−1049（PI14日）並びにＴ−1055（PI11日）は、クローン４（配列番号21）およびクローン16の配列（配列番号26）のいずれに対しても、RT−PCR陽性であった。タマリンＴ−1038は、殺す日（PI14日）には、両プライマーのいずれでも陽性であった。
図30から判るように、Ｔ−1034は、接種後に採取した（PI7日）最初の血清サンプルについてクローン４プライマーで検出された配列に対しRT−PCR陽性で、PI70日まで陽性でありつづけた。PI112日に採取したサンプルは陰性であった。これらのサンプル全てはクローン16プライマーによるRT−PCRで陰性であった。接種前の70日目および101日目に採取したサンプルは両プライマーのいずれでも陰性であった。
タマリンＴ−1051に関する図29から判るように、HGBV−RNAは、接種の８週間前に採取した血清サンプルにおいては、両プライマー（上記のクローン４とクローン16からのもの）のいずれによっても検出されなかった。HGBV−RNAは、PI7日〜69日の間に採取した６種の血清において、クローン４からのプライマーを用いたRT−PCRで検出されたが、PI77、84、91、あるいは105日に採取した血清では検出されなかった。接種後に採取した９つのサンプルにおいて、クローン16からのプライマーを用いたRT−PCRでHGBV−RNAが検出された。
図７に示すように、Ｔ−1044は、接種後（PI7日）に採取した最初の血清サンプルにおいては、クローン４プライマーで検出された配列に対し、RT−PCR陽性であり、PI63日まで陽性でありつづけた。PI77日〜119日の間に採取したサンプルは陰性であった。これらのすべてのサンプルは、クローン16プライマーに対してRT−PCR陰性であった。接種の42日前に採取したサンプルは、両プライマーのいずれに対しても陰性であった。
タマリンＴ−1047とＴ−1056に対し、PI14日に採取したＴ−1044血清を接種した。これらの両動物からPI7日〜64日の間に採取した９種のサンプルは、クローン４プライマー（配列番号８と９）によるRT−PCRは陽性であったが、クローン16プライマーでは陰性であった。
タマリンＴ−1058に、Ｔ−1053血清による誘発の22日後に採取した無希釈のＴ−1057血清を接種した。この接種物は、クローン16プライマーで検出された配列に対して陽性であったが、クローン４プライマーでのものには陰性であった。この動物から採取した血清サンプルを、GBV−配列［クローン16、クローン２、クローン10、クローン18］およびGB−Ｂ配列［クローン４およびクローン50］に由来するプライマーを用いて試験した。接種の９日前に採取したサンプルは、全てのプライマーでいずれも陰性であった。PI14日に採取したサンプルはクローン10と18のプライマーのみで陽性であった。PI21日に採取したサンプルはクローン16、10、および18のプライマーのみで陽性であった。PI28日に採取したサンプルはクローン18のプライマーのみで陽性であった。PI35日に採取したサンプルはクローン２、16、および18のプライマーのみで陽性であった。PI41日に採取したサンプルはクローン16および18のプライマーのみで陽性であった。クローン４およびクローン50からのプライマーでは、試験した全サンプルが陰性であった。
5.タマリンによる血清学的研究のまとめ
５匹のタマリンに対し、HGBVの種々の調製物を接種すると、接種後２週間までに肝酵素が上昇を始めた。この上昇値は続く６〜８週間の間持続した。一以上のHGBV組換え抗原、1.7、1.4、および4.1に対する特異抗体の応答が５匹全部のタマリンで観察された。いずれの場合も抗体はまず、PI6から10週で検出され、さらに２週間から７週間の間持続した。一般に、抗体レベルはピークに達し、次いで引き続く数週間の内に急速に下降した。抗体は、肝酵素の値が正常値に戻った後しばらくして検出可能となることがわかる。このことは、抗体の産生がウイルス感染の消散において何らかの作用をしていることを示唆するものである。
6.タマリンでのPCR研究のまとめ
ゲノムウォーキング実験の結果は、クローン４（配列番号21）とクローン16（配列番号26）が別々のRNA分子上にあることを示唆している。我々は従前、ウイルスゲノムには異なる２種類が存在し、その一つは一部にクローン４（配列番号21）を含有しもう一つは一部にクローン16（配列番号26）を含有する、という仮説を提起した。ある動物がクローン４からのプライマーで陽性でクローン16からのプライマーでは陰性であるという事実が観察されたことは、ウイルスゲノムに異なる２種類が存在することを支持するものである。しかしながら、クローン16（配列番号26）の配列が感染タマリンの内にあるものでは検出できなかったことは、クローン16のプライマーセットとクローン４のプライマーセットとの感度の下限の違いを反映している、という議論もできるかもしれない。もしこの後者の可能性が正しいとするならば、両方のプライマーともに陽性のタマリンは、これら二つのプライマーセットに関し、感度の差を示すはずである。上記の結果は二つのウイルス種の存在によって説明されるのであって二つのプライマーセットの感度の差によるものではない、という立場を補強するため、タマリンＴ−1057とＴ−1053のcDNAの一連の希釈列を用いてPCRを実施した。Ｔ−1057血清はクローン４プライマーの血清当量５×10^-3μｌで陽性、５×10^-4μｌで陰性であった。Ｔ−1057血清を20μｌという多量で用いてRT−PCRをクローン16プライマーで行ったが、結果は陰性であった。もしこの差が二つのプライマーセット（クローン４対クローン16）の相対感度に帰するのであれば、他の検体もPCR試験を行ったとき4000倍もの高い終点希釈を示すであろうと予測される。しかしながら、Ｔ−1053血清に由来するcDNAは、クローン４（配列番号21）およびクローン16（配列番号26）の両クローンの配列に対し、いずれも血清当量2.5×10^-4μｌで陽性で、2.5×10^-5μｌで陰性であることが判った。よってこの結果はプライマーセットの感度の差では説明できず、contigB−クローン４（配列番号21）およびcontigA−クローン16（配列番号26）配列が、Ｔ−1057においては少なくとも4000倍異なる力価であるがＴ−1053では略等しい力価であるような別個のウイルスゲノムの上に存在する、という仮定と整合する。すなわちこのデータは、異なる検体において異なる相対終点力価を有する別個の二つのウイルスの存在と整合するものである。
HGBV−Ｂによるウイルス血症のみで肝酵素レベルの上昇を引き起こすのに十分であって、GBV−Ａのみのウイルス血症段階では肝酵素レベル上昇は認められない、という観察結果から、HGBV−Ｂが恐らくこれらのタマリンにおける肝炎の原因物質であったことがわかった。HGBV−Ｂ抗原に対する免疫応答は、精々接種後150日という短期間出現した。これに対する説明としては、これらのELISAアッセイにおいて選定されたエピトープが、免疫応答が生成する主エピトープからのものではなかったということが考えられる。他の説明として、タマリンにおいては肝炎誘発は長期間の応答を必要とする重症ではない、ということも考えられる。これは、急性期に殺した、あるいは急性期の少し後で自然死した動物において、肝臓の炎症が軽症ないし非重症に止まった（結果は示さない）という組織学的証拠と整合する。
この研究で記載した６匹の動物の内の５匹において、PI112日までにHGBV−Ｂによるウイルス血症が散退した。一方、タマリンＴ−1048は136日間ウイルス血症から回復せず、死亡時（PI137日）にウイルス血症が認められた。GBV−Ａ配列に陽性であった４匹の動物中で、３匹は、GBV−Ａ配列が最初に出現してから77日後までにウイルス血症の解消をみた。これに対し、タマリンＴ−1061は、犠牲に供されるまでの245日間、ウイルス血症が認められた。加えて、タマリンＴ−1051は、犠牲に供されるまで（PI113日）ウイルス血症であったが、この持続するウイルス血症が最初にＴ−1053血漿で接種したことによるものか、あるいはその69日後にＴ−1053血漿で追加接種した結果によるものかは不明である。
HGBV−ＡおよびHGBV−Ｂの両方に陽性であった６匹の動物のピークALTの平均値は、HGBV−Ｂのみに陽性の４匹の動物の平均値より高かった。加えてピーク値に達するのは、平均してGBV−Ｂのみに陽性の動物よりもGBV−ＡおよびGBV−Ｂの両方に陽性の動物における方が早かった。これらの結果は、肝炎の強さは両剤が相当量で存在することに関係するかもしれないことを示唆している。タマリンＴ−1047とＴ−1056へのGBV−Ｂの追加継代接種において肝酵素値の上昇がGBV−Ｂウイルス血症でほとんどなかったことが観察されたが、この結果は、タマリンにおいては両剤がALTレベルの主たる上昇をもたらすのに必須ではないかという仮説を支持する。HGBV−Ｂ単独を用いた継代接種に加え、Ｔ−1058に接種物HGBV−Ａを接種した時の初期の結果は、クローン４とクローン50のプライマーで検出可能なGB−Ｂ配列の不在によって示されるように、HGBV−Ａは検出可能なHGBV−Ｂがなくとも独立に伝染しうることを示唆している。
F.ヒト集団でのHGBVへの暴露を示すための実験手順
種々のヒト集団から検体を得て、HGBV−Ｂに由来する組換えタンパクを用いた三種の別個のELISAによってHGBVに対する抗体の有無を調べた。実施例15Bのようにして1.7ELISAにおいてはCKS−1.7組換えタンパク（配列番号610）で固相を被覆し、1.4ELISAにおいてはCKS−1.4組換えタンパク（配列番号611）で固相を被覆し、また4.1ELISAでは4.1組換えタンパク（配列番号612）で固相を被覆して用いた。実施例15Eでも記したように、HGBVで接種したタマリンでは、これらのタンパクに対して特異的ではあるが短い抗体応答が認められた。この検出可能な免疫応答の短期的な性質からすると、結果が陰性のヒト集団においてHGBVに対して従前暴露された可能性がないとはいえない。
ヒトの検体で行った血清学的研究は二重の目的を有するものであった。第一の目的は、種々のヒト集団における本発明のHGBV組換え抗原に対する抗体の血清学的存在を決定することであった。これらの研究は次の（１）〜（３）のテストを含む：（１）HGBVへの暴露に関し「低リスク」と考えられる集団（例えば合衆国における健康なボランティアの血液ドナーの人々）；（２）HGBVへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる集団（例えば経静脈麻薬使用者や血友病患者の検体は、非経口的に伝播した肝炎ウイルス（HBVおよびHCV）に対して血清反応がしばしば陽性となる；発展途上国に居住する個体からの検体は、経腸的に伝播したウイルス（HAVおよびHEV）に対して血清反応がしばしば陽性となる；（３）既知の肝炎ウイルス（HAV、HBV、HCV、HDV、またはHEV）への暴露や、サイトメガロウイルス（CMV）やエプスタイン−バーウイルス（EBV）などの肝炎関連のその他のウイルスへの暴露には関連のない、「非Ａ−Ｅ−肝炎」を有する個体から得た検体グループ。非Ａ−Ｅ−肝炎という一般的呼称に属するグループのメンバーの一部はHEVに対する抗体に関してはテストされていない場合がある。よって、1.7、1.4、あるいは4.1ELISAで反応性を有した非Ａ−Ｅ群のすべての検体について、HEV−ELISAアッセイ（本出願人から入手可能）を行った。抗HEVは、三つの地域（パキスタン、アメリカ合衆国、およびニュージーランド）からのサンプルで以下に記載するように陽性の結果となった。
HGBVに対する暴露に関し「低リスク」と考えられる集団よりも、HGBVに対する暴露の「リスクあり」の集団や非Ａ−Ｅ肝炎を有する個体における方が、より高い血清学的存在率がみられることが予想される。
本血清学的研究の第二の目的は、一以上のHGBVエピトープに対する抗体について陽性であることが判った検体RT−PCRで調べ、ウイルスが血清中に存在するかどうかを決定することであった。HBVおよびHCVは数ヵ月あるいは数年も持続するウイルス血症の疾病状態を、また、一般にHAVやHEVは一般に数週間持続する短期間のウイルス血症をもたらすことはよく知られている。急性で消退しつつある肝炎である、HBVやHCV感染の場合には、ウイルス血症の段階は数週間という短期間の持続の場合もあろう。このようにRT−PCRは、感染個体にウイルスが存在するという証拠を得るために用いることができる。しかしながら、ウイルス血症の状態は短期間でありうるので、ある剤に感染した個体でもその剤に関してRT−PCR陰性となることもある。
G.切捨て値の決定
間接方式を利用するその他のELISAアッセイにおける従前の経験から、予備的な切捨て値を、研究対象のタンパクに対する抗体に関して恐らく陰性であると思われる集団から得た吸収に基づいて算出すればよいことが判明している。予備的切捨て値は、集団の平均吸収値と、集団の平均値からの10の標準偏差との合計として計算した。切捨て値は一検査群の検査が行われるたびに用いられるものなので、切捨てを表現するより簡便な方法は、各アッセイのたびに５個重複して走らせる陰性コントロール（正常ヒト血漿プール−NFP）から決める方法であった。1.7、1.4、および4.1ELISAについては、陰性コントロールは、典型的には0.030と0.060の間の吸収を有していた。以下に記載のように、切捨て値は約0.300から0.600であると吸収であると計算されたが、これは陰性コントロールの値の10倍の吸収シグナルに匹敵するものであった。よって、検体が反応性であると考えられるのは、陰性対照（Ｎ）吸収値に対するサンプル（Ｓ）の吸収値（＝S/N比）が10.0以上であることを要する。
H.追補的試験
最初の試験で反応性であるとされた検体は、原則として２個重複で再試験した。もし再試験時の吸収の一あるいは二者も切捨て値より高ければ、その検体は繰り返し反応性であると考えられた。繰り返し反応性であると考えられた検体については、さらにELISAのデータを補充すべく追補的アッセイを行った。十分量がある場合、繰り返し反応性検体はウェスタンブロットによって、抗体応答がCKS1.7（配列番号610）CKS1.4（配列番号611）またはCKS4.1（配列番号612）抗原を指向するものであって、問題とする主タンパクとともに固相に共に被覆されていたかもしれない大腸菌タンパクを指向するものではないことを確認した。ウェスタンブロットが陽性と考えられるためには、可視的なバンドが1.7タンパク（配列番号610）に対して80kD、1.4タンパク（配列番号611）に対して60から70kD、または4.1タンパク（配列番号612）に対して42kDにおいて検出される必要がある。ウェスタンブロットはELISAの感度に匹敵ないしそれを凌駕するほど最適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちにELISAのデータを捨てることはしなかった。しかしながら、陽性の結果が出れば、それはELISAによって検出された反応性を補強するものである。
繰り返し反応性のある検体で十分量あるものの対しては、クローン４プライマーを使用するRT−PCR（実施例15Dに記載に従って実施）を実施し、血清中のHGBV特異性ヌクレオチド配列を同定してもよい。結果が陽性であれば、その検体はウイルス血症であることがわかり、究極的にはヒト肝炎におけるHGBVの役割を確立する一助になるであろう。しかしながら、結果が陰性であってもそれはELISAの結果が誤りだったと解釈してはならない。タマリンによる研究において実施例15Eに記載したように、RT−PCRの結果は感染後の最初の数週間は陽性で、その後本発明のELISAで抗体がまさに検出されはじめた頃には陰性になっていた。この後の段階における検体はRT−PCR反応陰性であっても一方または両方のELISAにおいて陽性であるかもしれない。
I.低リスク検体における血清反応データ
ウィスコンシン州南東部の健康なボランティア血液供与者から100血清と100血漿から成る集団を得て、上記のELISAによって1.7（配列番号610）、1.4（配列番号611）、4.1（配列番号612）の各組換えタンパクに対する抗体を検査した。血清および血漿について、1.7、1.4、および4.1ELISAで得られた吸収の値を別々にプロットした（図９−14）。
1.7ELISAでは、血清検体と血漿検体に対する平均吸収値はそれぞれ0.072［標準偏差（SD）は0.061］および0.083（SD＝0.055）であった。よって1.7ELISAでは血清と血漿に対する仮の切捨て値はそれぞれ0.499および0.468であった。上述のように陰性コントロールの吸収値をもとにして切捨て値を表すこともできる。S/N比が10.0を越える検体を反応性ありとした。この切捨て値を用いると、1.7（配列番号610）に対する抗体に対して試験した200検体の内の０検体が反応性であった。
1.4ELISAでは幾つかの検体（血清集団から３種、血漿集団から６種）が0.300を越える吸収値を示した（S/N比が６から12、予想される切捨て値に近いかそれ以上）。再試験すると、これらの検体の９種全部が10.0より低いS/N比を示した。血清検体と血漿検体に対する平均吸収値はそれぞれ0.072（SD＝0.052）および0.108（SD＝0.062）であった。1.4ELISAにおける切捨て値は、上記の式によって計算した。即ち、血清と血漿それぞれの集団に対する切捨て値はそれぞれ0.436および0.542であった。血清集団の中の一検体は、最初の試験で反応性とされたが、二重にして再試験したときには陰性であった。血漿集団の中の２検体も最初は試験で反応性とされたが、再試験では陰性であった。血漿100検体と血清100検体からなる第二の正常検体200の集団を試験した。先に提案した切捨てに基づき試験すると、血漿２検体および血清２検体が繰り返し反応性であった。
4.1ELISAでは血清検体と血漿検体に対する平均吸収値はそれぞれ0.070［標準偏差（SD）は0.037］および0.063（SD＝0.040）であった。よって4.1ELISAにおいて、血清および血漿に対する仮の切捨て値はそれぞれ0.329および0.511であった。上述のように陰性コントロールの吸収値に基づいて切捨て値を決めることもできる:S/N比が10.0を越える検体を反応性ありとした。この切捨て値を用いると、4.1（配列番号612）に対する抗体について試験した100血漿検体の内の０検体、および100血清検体の内の０検体が最初の試験で反応性を有しているとされた。
インターステート血液銀行（オハイオ州）から追加の760の血漿供与者の提供を受け、1.7ELISAおよび1.4ELISAの試験を行った。合計９検体が繰り返し反応性であった。両方のELISAで同時に反応性を有する検体はなく、全９検体が1.4ELISAで繰り返し反応性であった。
アメリカ合衆国に居住している血漿或いは血液提供者からの合計960検体について、1.7タンパクおよび1.4タンパクに対する抗体の有無を調査した。合計13検体が1.4ELISAにおいて繰り返し反応性であった。1.7ELISAで繰り返し反応性を有する検体はなかった。
以上まとめると、これらのデータは次のことを示している。すなわち、HGBV−Ｂからの組換え抗原を用いる一種以上のELISAアッセイにおいて、これまでのELISA結果によると、アメリカ合衆国の血液提供者から採取された960検体のうち13検体が抗体反応性であった。この結果からHGBVはアメリカ合衆国に固有のいわゆる風土病である可能性があると思われる。
これらのデータを表16に示す。
J.肝炎に関し「リスクあり」と考えられる検体
この研究でのデータを表16に示す。
（ｉ）西アフリカからの検体
西アフリカから入手した1300検体の内、合計181検体が一以上のELISAで繰り返し反応性であった。３種のELISA全部で繰り返し反応性の検体が１検体あった。合計43検体が1.7ELISAで繰り返し反応性を有し、91検体が1.4ELISAで繰り返し反応性を有し、51検体が4.1ELISAで繰り返し反応性を有した。
1.7ELISAで繰り返し反応性であった６検体のうちの一つは、1.7タンパク（配列番号610）についてのウェスタンブロットで反応性であった。1.4ELISAで繰り返し反応性であった９検体のうちの９検体（100％）は、1.4タンパク（配列番号611）に対する抗体についてのウェスタンブロットで陽性であった。一検体が両方のタンパクについてのウェスタンブロットで陽性であった。4.1ELISAで繰り返し反応性であった12検体のうちの12検体（100％）は、4.1タンパク（配列番号612）に関するウェスタンブロットで陽性であった。
繰り返し反応性であった３つの検体（1.4ELISAで陽性であった一検体と、両ELISAおよびウェスタンブロットで陽性であった一検体を含む）について、クローン４からのプライマーを用いるRT−PCRによって上記のようにしてHGBV−RNAの有無を調べた。
得られたデータはHGBVが西アフリカの風土病である可能性を示唆するものであった。
（ii）経静脈麻薬使用者（IVDU）からの検体
セット1:112検体のうち３検体が1.4ELISAで陽性であった。５検体が4.1ELISAで、３検体が1.7ELISAで反応性であった。２サンプルが、２以上のELISAで陽性であった。
セット2:経静脈麻薬使用者の集団から計99検体を採取した。この試験はイリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病院（Hines Veteran′s Administration Hospital）で実施されたものの一部である。検体のいずれも1.7あるいは4.1ELISAで反応性を有しなかった。一検体は1.4ELISAで繰り返し反応性が認められた。この繰り返し反応性の検体について、クローン４からのプライマーを用いるRT−PCRによって上記のようにしてHGBV−RNAの有無を調べた。この検体はRT−PCR陰性であった。
K.非Ａ−Ｅ肝炎の個体から採取した検体
得られたデータを表16にまとめて示す。
非Ａ−Ｅ肝炎と診断された個体群から種々の検体集団を得て、実施例15Cに従って1.7、1.4、および4.1ELISAを実施した。使用した検体は次のものを含む：日本のクリニックからの180検体；ニュージーランドのクリニックからの56検体；ギリシャのクリニックからの73検体；エジプトのクリニックからの132検体；アメリカ合衆国テキサス州のクリニックからの64検体（セットＴ）；ミネソタの研究センターからの72検体（セットＭ）；米国からの62検体（セット＃１）；パキスタンのクリニックからの82検体；イタリーのクリニックからの10検体（幾つかの検体は血清量の不足のため実行可能なELISAアッセイすべては実施しなかった）。
（ｉ）日本の検体
これらの180検体は85人の異なる患者からのものであった。全180検体のうち二つが1.7ELISAで繰り返し反応性であった。この二つの反応性を示す検体は２人の異なる患者からのものであった。上記２検体について、クローン４からのプライマーを用いるRT−PCRによって前記のように検査した。陽性の検体はなかった。
1.4ELISAで陽性の検体はなかった。
4.1ELISAについては、89検体中７検体が4.1アッセイで繰り返し反応性を示した（注：これら89検体は29人の異なる患者から得たものであった）。反応性の検体のうち５検体は一人の患者からのものであった。残る２検体は別の一人の患者からのものであった。
（ii）ニュージーランドの検体
56検体のうち計４検体が1.7、1.4、および4.1ELISAの一以上において繰り返し反応性であった。これらの内、二以上のELISAで反応性を示した検体はなかった。１検体が1.7ELISAで繰り返し反応性であり、２検体が1.4ELISAで繰り返し反応性であった。１検体が4.1ELISAで繰り返し反応性であった。二つの繰り返し反応性の検体についてPCRを実施した。その結果、両検体とも陰性であった。1.4ELISAで繰り返し反応性を示した１検体はHEVに対する抗体とも反応性を有した。
（iii）ギリシャの検体
73検体中の計５検体が1.7および／または1.4ELISAで抗体反応性であった。これら73検体は計11人の患者から採取したものであった。繰り返し反応性の５検体中２検体は、両ELISAで繰り返し反応性を示したが、これらは別々の日に同一の患者から採取したものであった。二つの繰り返し反応性を示した検体をRT−PCRで調べたところ陰性であった。これらの検体のいずれも4.1ELISAでは抗体反応性を有しなかった。
（iv）エジプトの検体
132検体中の計11検体が1.7、1.4、あるいは4.1ELISAで反応性を示した。８検体が1.7および1.4ELISAの両方で陽性であった。９検体が1.7ELISAで抗体反応性であり、９検体が1.4ELISAで反応性であった。１検体は4.1ELISAでは繰り返し反応性を示したが、1.7および1.4ELISAでは陰性であった。1.7ELISAで繰り返し反応性を示した１検体は、ウェスタンブロットで調べると1.7組換えタンパク（配列番号610）に対する抗体に関し陰性であった。1.4ELISAで繰り返し反応性を示した９検体中６検体は、ウェスタンブロットでは1.4組換えタンパク（配列番号611）に対する抗体に関し陽性であった。繰り返し反応性であったもののうち７検体についてRT−PCRで試験した。どの検体も反応性を示さなかった。これら全132検体は25人の異なる個体から別々の日に採取したものであった。繰り返し反応性を示した11検体は、異なる５個体からのものであった。これらの個体中の一個体（患者＃101）においては、免疫応答は明白にタマリン（図31）で観察されたそれと相似であった。図31においてALTレベルが医者が症状を認めた時には上昇していたことに注意されたい。その後の検体ではALTレベルは低下し、1.4および1.7ELISAによって抗体が検出された。抗体応答は、タマリンで観察された血清反応状況と同じく、その後数週間にわたって低下した。追加の３人の患者（257、260、および340）は患者＃101と同様の血清パターンを示した（図32−34参照）。これらのデータはHGBVがこれらの肝炎の症例において原因剤であるかもしれないという仮説を支持するものである。
上の４人の患者からの７検体中、いずれの検体もRT−PCRではHGBV−RNA陽性ではなかった。この結果には幾つかの理由が考えられる。第一にウイルス血症の段階は非常に短期間であるかもしれず、その場合ウイルスは最初の採血の日までに血清から除去されてしまっていた可能性がある。第二にこれらの検体が船でエジプトから輸送されてきたことから、恐らく保存・輸送の過程で凍結、解凍を経るかその他の変化を受けたことが考えられ、その結果HGBV−RNAの検出能力が低下した可能性がある。
（ｖ）アメリカ合衆国の検体（セットＴ）
アメリカ合衆国の64検体（セットＴ）で、1.7、1.4、4.1ELISAにおいて繰り返し反応性を有するものはなかった。
（vi）アメリカ合衆国の検体（セットＭ）
アメリカ合衆国の72検体（セットＭ）のうち、計４検体が一以上のELISAで繰り返し反応性を示した。２検体は1.7および4.1ELISAで反応性を示した。1.7ELISAのみで反応性のものが１検体、4.1ELISAのみで反応性のものが１検体存在した。
（vii）アメリカ合衆国の検体（セット１）
非Ａ−Ｅ肝炎のアメリカ合衆国検体（セット１）51検体中、３検体が一つまたは両ELISAで繰り返し反応性を示した。１検体は両ELISAで繰り返し反応性を示した。１検体は1.7ELISAで反応性を示し、３検体は1.4ELISAで繰り返し反応性を示した。両ELISAで陽性の検体は、1.4組換えタンパク（配列番号22）に対するウェスタンブロットで陽性であったが、1.7組換えタンパク（配列番号23）では陰性であった。追加の１検体は1.4ELISAで陽性、1.4組換えタンパク（配列番号611）に対してウェスタンブロット陽性であった。1.4ELISAで繰り返し反応性を示した１検体はHEVに対する抗体に反応性であった。
（viii）パキスタンの検体
82検体中の計４検体が、1.4および／または1.7ELISAで繰り返し抗体反応性であった。両ELISAで反応性を示した検体はなかった。２検体が1.7ELISAで繰り返し反応性を示し、２検体が1.4ELISAで繰り返し反応性を示した。1.4ELISAで繰り返し反応性の２検体は、HEVに対する抗体にも反応性であった。82検体いずれも4.1ELISAでは陽性でなかった。
（ix）イタリーの検体
10検体いずれも、1.7、1.4、および4.1ELISAで繰り返し反応性を示さなかった。
L.血清反応の結果の統計的意義
これらのデータは、HGBVタンパクに対する特異抗体（即ち1.7、1.4、または4.1ELISAで抗体に繰り返し反応性を示す検体）を、調査した集団の三つのカテゴリー全部で検出できることを示している。種々の検体カテゴリー（「低リスク」、「リスクあり」、および非Ａ−Ｅ肝炎患者）から得た血清学上の結果を合わせ、χ二乗検定で統計的意義について分析した。データは、HGBVへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる個体、あるいは分類未知の肝炎と診断された個体を含むボランティア血液提供者において、抗−HGBVの血清学的有病率を比較すると有意の差異が存在することを示した。
西アフリカ検体においては血清学的有病率は13.9％であって、これはベースライン上のグループ（表17）と比べ、ｐ値0.000の下で有意に高かった。同様にIVDUにおいても、結果をボランティア提供者のデータと比較した時、統計的に有意の差が存在した（ｐ値＝0.000）。日本、ニュージーランド、アメリカ合衆国、エジプト、およびパキスタンを含む国々については、アメリカ合衆国のボランティア血液提供者に比べ、非Ａ−Ｅ肝炎患者において抗体の存在に有意の差が存在した。
H.まとめ
これらのデータは、本明細書に記載の種々のELISAが、日本、ニュージーランド、アメリカ合衆国、エジプト、およびパキスタンを含む様々な地域におけるヒトの肝炎診断に有用である可能性を示唆している。これらのデータは、試験した検体の全カテゴリーにおいてHGBVに対する抗体の血清学的存在を過小に評価しているように思われる。さらなるHGBVエピトープが発見され、評価されるにつれ、現在は診断を下すことができない患者において肝炎を診断するにあたり、HGBVゲノム（群）に基づく試験の有用性がより重要なものとなることが期待される。注：これらの最初の研究ではRT−PCRの結果は陰性であったが、その後のデータから血清反応陽性の個体の血清でフラヴィ様ウイルス配列が見いだされた。
上に記載したように、２種以上のHGBV株が存在する。これらは本発明の範囲内のものと考えられ、これを「肝炎GBウイルス（HGBV）」と呼ぶ。
実施例16. HGBV−Ａの血清学的研究
A.組換えタンパク精製手順
CKS融合タンパクを発現する細菌細胞を凍結し、−70℃で保存した。各GBV−Ａ構築物からの細菌細胞を解凍し、実施例15でGBV−Ｂ構築物について記載したようにして粉砕処理した。さらに、組換えタンパクを、実施例15でGBV−Ｂ組換えタンパクについて記載したようにして精製した。
この精製手順で収集した分画を電気永動で分離し、クーマシーブリリアントブルーR250で染色して、分子量が約60kD（CKS−1.5/配列番号614）、65kD（CKS−2.17/配列番号613）、55kD（CKS−1.18/配列番号390）、および66kD（CKS−1.22/配列番号390）に相当するタンパクの有無を調べた。該当するタンパクを含有する分画をプールし、SDS−PAGEによって再度調査した。
精製抗原を含有するプール分画の免疫原性および構造の完全性を、実施例13に記載の方法に従ってニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロット法によって決定した。適当な陽性コントロールがなかったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのCKS部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって同定した。CKS−1.5タンパク（配列番号614）について、組換え抗原を検出すべく抗−CKSモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、約60kDのところにシングルバンドが認められた。この結果はCKS−1.5タンパク（配列番号614）の予想サイズに対応している。同様にCKS−2.17タンパク（配列番号613）、CKS−1.18タンパク（配列番号390）およびCKS−1.22タンパク（配列番号390）も、イムノブロット法で調べた結果予想されたサイズを有していた。
B.ポリスチレンビーズの被覆手順
上記タンパクを透析し、実施例15の記載に従って、これらのタンパクのポリスチレンビーズ上での抗原性を評価した。
C.HGBVに対する抗体を検出するためのELISAの手順
各種ELISAは実施例15の記載に従って実施した。
D.感染個体の血清におけるHGBV−RNAの検出
各ELISAで繰り返し反応性を示した検体について、実施例15のセクションＤの記載に従ってHGBV−RNAの有無を調べた。
E.タマリンの血清像
すべてHGBV−Ａゲノム由来のCKS1.5タンパク、CKS2.17タンパク、CKS1.18タンパク、あるいはCKS1.22タンパクを用いたELISAアッセイにおいて、タマリンからの血清はいずれも特異免疫反応を示さなかった。しかしながら、先の実施例に記載のように、感染タマリンの内のあるものではHGBV−ＡのRNAが検出された（実施例15中タマリンの血清像についてのまとめ参照）。
F.ヒト集団についての血清学的研究のための実験手順
実施例15では、HGBV−Ｂに由来する組換え抗原を用いたELISAによって種々のヒトの集団におけるHGBV−Ｂに対する抗体の存在を評価した。その後、同じ検体の多くについて、CKS1.5組換えタンパク（配列番号614）を用いた1.5ELISA、CKS2.17組換えタンパク（配列番号613）を用いた2.17ELISA、CKS1.18組換えタンパク（配列番号390）を用いた1.18ELISA、およびCKS1.22組換えタンパク（配列番号390）をそれぞれ用いたELISAによって、HGBV−Ａに対する抗体の有無を調べた。各タンパクは実施例15のように固相に被覆して用いた。実施例15に記載のように、HGBVを接種された回復期のタマリン５匹全部が、HGBV−Ｂ組換えタンパクに対して特異的抗体反応を示したが、短期間しか持続しなかった（1.7、1.4、および4.1ELISAで検出）。1.5、2.17、1.18、あるいは1.22ELISAにおいては、どのタマリンも検出可能な抗体反応を示さなかったが、西アフリカからのヒト検体の幾つかは、ウェスタンブロットでこれらの組換えタンパクの一以上のものについて特異的抗体反応を示し、ある外科医（GB剤の供給者）の提供になる肝炎発症22日目に採取した検体の一つは、ウェスタンブロットで試験したとき2.17組換えタンパクに対する特異的抗体反応を示した（実施例３参照）。本実施例では、様々なヒトの集団において抗体を検出するに際しての、1.5、2.17、1.18、および1.22ELISAの有用性を評価した。
G.切捨て値の決定
1.5、2.17、1.18、および1.22ELISAにおける切捨て値を、実施例15に記載のようにして決定した。
H.追補的試験
実施例15に記載したように、最初反応性を示した検体については、原則として再試験を行った。ある検体が２回目も反応性を示した場合、ELISAによるデータをさらに補充すべく追加の試験（例えばウェスタンブロット）を実施した。ウェスタンブロットの結果が陽性と考えられるためには、観察可能なバンドが1.5タンパク（配列番号614）に対して60kD、2.17タンパク（配列番号613）に対して65kD、1.18タンパク（配列番号390）に対して55kD、および1.22タンパク（配列番号390）に対して66kDにおいて検出される必要がある。ウェスタンブロットはELISAの感度に匹敵ないしはそれを凌駕するほど最適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちにELISAのデータを捨てることはしなかった。しかしながら、陽性の結果が出れば、それはELISAによって検出された反応性を補強するものである。
実施例15で記載したように、繰り返し反応性のある検体で十分量あるものの対しては、プライマーを使用するRT−PCR（実施例15の記載に従って実施）を実施し、血清中のHGBV特異性ヌクレオチド配列を同定してもよい。
I.低リスク検体における血清学的データ
計252本の血漿検体をオハイオ州のインターステート血液銀行から入手し、1.5組換えタンパク（配列番号614）を用いた1.5ELISAで抗体の有無を検査した。この集団での平均吸収値は0.036（SD＝0.022）であった。切捨て値は0.168と計算された。これはS/N比＝10.0に対応する。760本の血漿検体（切捨て値決定のために用いた252検体を含む）について、1.5ELISAで抗体の有無を検査した。繰り返し反応性を示す検体はなかった。加えて、100本の血漿検体をウィスコンシン州南東部から入手し、1.5ELISAで抗体の有無を検査した。繰り返し反応性を示す検体はなかった。
このように、1.5タンパクに対する抗体の存在を示す証拠はアメリカ合衆国の血液提供者においては見いだされなかった。
200本の検体をウィスコンシンの血液提供者から入手し、2.17組換えタンパク（配列番号60）を用いる2.17ELISAによって抗体の有無を検査した。この集団での平均吸収値は0.058（SD＝0.025）であった。切捨て値は0.208と計算された。これはS/N比＝10.0にほぼ対応する。検体の一つは繰り返し反応性を示した。このように、アメリカ合衆国の血液提供者（Ｎ＝200）における血清学的有病率（seroprevalence）は比較的低かった。
上のパラグラフに記載のものと同じ200検体について、1.18および1.22ELISAで抗体の有無を検査した。どの検体も繰り返し反応性を示さなかった。このように、ボランティアの血液提供者からの検体については、1.5、2.17、1.18、および1.22ELISAから判断するかぎり、HGBV−Ａタンパクに関して抗体陽性であるという証拠はなかった。
J.肝炎に関し「リスクあり」と考えられる検体
この研究でのデータを表18にまとめて示す。
（ｉ）西アフリカからの検体
1300検体の内、58検体が1.5ELISAで反応性を示した。繰り返し反応性であった18検体のうちの12検体は、1.5タンパク（配列番号614）に対する抗体についてのウェスタンブロットで陽性であった。817検体中43検体が2.17ELISAで反応性であった。これらの繰り返し反応性の検体については、2.17タンパク（配列番号613）に対する抗体に関するウェスタンブロットは行わなかった。
817検体中６検体が1.22ELISAで反応性であった。353検体中９検体が1.18ELISAで反応性であった。2.17ELISAで反応性の21検体をウェスタンブロットで試験したところ、13検体が反応性であった。1.18ELISAで繰り返し反応性の８検体がウェスタンブロットで陽性であった。
これらのデータはHGBVが西アフリカの風土病である可能性を示唆するものである。
（ii）経静脈麻薬使用者からの検体
経静脈麻薬使用者の集団から全112検体を採取した。この試験はイリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病院で実施されたものの一部である。１検体は2.17ELISAで繰り返し反応性が認められた。追加の１検体は1.18ELISAで反応性を示した。これらの検体のいずれも1.5あるいは1.22ELISAでは陽性ではなかった。
K.非Ａ−Ｅ肝炎の個体から採取した検体
得られたデータを表18にまとめて示す。
非Ａ−Ｅ肝炎の個体群から種々の検体集団（実施例15Kに記載）を得て、1.5、2.17、1.18、および1.22ELISA（実施例15Cに記載）を実施した。幾つかの検体は血清量の不足のため全部のELISAアッセイは実施しなかった。
（ｉ）日本の検体
89検体中の計４検体は、1.5ELISAで繰り返し反応性を示した。そのうちの３検体は１個人から、１検体は別の個人からのものであった。1.5ELISA、1.18ELISA、および1.22ELISAで陰性であった１検体は、2.17ELISAでは反応性を示した。1.18ELISAで反応性を示した検体はなかった。これらの検体は、1.22ELISAでは検査しなかった。
（ii）ニュージーランドの検体
56検体のうち1.5ELISAで反応性を示したものはなかった。これらの検体は2.17ELISA、1.18ELISA、あるいは1.22ELISAでは検査しなかった。
（iii）ギリシャの検体
67検体（10人の患者からのもの）のいずれもが1.5、2.17、あるいは1.22ELISAでは反応性を示さなかった。
（iv）エジプトの検体
132検体中に1.5ELISAに反応性の検体はなかった。検査可能であった132検体中、計７検体が2.17ELISAで反応性を有した。これらの検体は急性の非Ａ−Ｅ肝炎患者25名からのものであった。25名の患者のうち３名が2.17ELISAで肝炎の発症のあと１日以上たったとき血清反応陽性であった。1.18、あるいは1.22ELISAで反応性の検体は存在しなかった。
（ｖ）アメリカ合衆国の検体（セットＭ）
72検体のいずれも1.5ELISAで反応性を示さなかった。72検体中３検体は1.18ELISAで反応性を示した。２検体が2.17ELISAで、また４検体が1.22ELISAで反応性を示した。２サンプルは一以上のELISAで反応性を示した。
（vi）アメリカ合衆国の検体（セットＴ）
64検体のいずれも1.5、1.22、あるいは2.17ELISAで反応性を示さなかった。１検体は1.18で反応性を有した。
（vii）アメリカ合衆国の検体（セット１）
62検体中の計３検体が一以上のGBV−ＡのELISAで反応性を示した。2.17および1.22ELISAの両者で繰り返し反応性を示したものが１検体存在した。2.17ELISAのみに反応性の検体が１検体あり、別の１検体は1.22ELISAのみに反応性を示した。1.5あるいは1.18ELISAに反応性の検体は存在しなかった。
上に述べたように、２以上のHGBV株があり、あるいは、２以上の別種のウイルスを本明細書に記載の配列によって表すことができる。それらは本発明の範囲内のものと考えられ、これを「肝炎GBウイルス（HGBV）」と呼ぶ。
L.血清反応の結果の統計的意義
これらのデータによって、HGBV−Ａタンパクに対する特異抗体（即ち1.5、2.17、1.18および1.22ELISAで抗体に繰り返し反応性を示す検体）は、HGBVへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる個体および非Ａ−Ｅ肝炎と診断された個体において検出されたが、アメリカ合衆国のボランティアからも売血者からもそれほど高頻度には検出されることがなかったことが示された。表19において、種々のカテゴリーの検体（表18の「低リスク」、「リスクあり」、および非Ａ−Ｅ肝炎患者）からの血清反応の結果を合わせ、χ二乗検定で統計的意義について分析した。表18は検査した検体の総数におけるHGBVタンパクに対する抗体の血清学的存在をまとめたものであるが、これと異なり、表19のデータは、異なる個体（人）からの結果を示している。GBV−ＡのELISAについては、抗−HGBVの血清学的存在をボランティア血液提供者とHGBVへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる個体（西アフリカ、但しIVDUではないもの）との間で比較すると、有意の差（ｐ値＝0.000）が存在することを示している。加えて、ボランティアの血液提供者と比較した場合、エジプトとアメリカ合衆国における非Ａ−Ｅ肝炎患者におけるHGBV−Ａに対する抗体の血清学的存在には、統計的に有意の差があった。このデータは、HGBV−Ａに対する暴露と非Ａ−Ｅ肝炎とに関連があることを示唆している。注：これらの最初の研究ではRT−PCRの結果は陰性であったが、その後のデータによって血清反応陽性の個体の血清においてフラヴィ様ウイルス配列が見いだされた（実施例19参照）。
M.まとめ
これらのデータは、本発明に記載のELISAが西アフリカに居住している個体および非Ａ−Ｅ肝炎の個体において抗体を検出するのに有用であることを示唆するものである。西アフリカの個体群においては肝炎に罹患するリスクは比較的高い。人々のほぼ85％近くが肝炎Ｂウイルスに対する抗体に血清反応陽性であり、約５％が肝炎Ｃウイルスに対する抗体に陽性である。これらのデータは、試験した検体の全カテゴリーにおいてHGBVに対する抗体の血清学的存在を過小に評価しているように思われる。さらなるHGBVエピトープが発見され、評価されるにつれて、現在は診断を下すことができない患者において肝炎を診断するにあたり、HGBVゲノム（群）に基づく試験の有用性がより重要なものとなることが期待される。
実施例18. ヒトにおけるGB関連ウイルスの同定
A.理論
HGBV−ＡおよびHGBV−Ｂの両者のエピトープが同定された（実施例３）。これらを血清学的マーカーとして用いてヒトの血清および血漿サンプルをスクリーニングした（実施例５および６）。これらのマーカーのうちの幾つかについての血清学的活性と非Ａ−Ｅ肝炎の発症頻度との間に顕著な相関があったが、これはHGBV−Ｂがヒトにおける非Ａ−Ｅ肝炎の病因物質であることを示唆している（実施例5G）。しかしながら、GBヒト血清をウェスタンブロットで分析してみるとHGBV−Ｂエピトープに対する反応性は示されなかった（実施例３）。そのかわり、GBヒト血清に少なくとも一つのHGBV−Ａエピトープが同定された。これはHGBV−ＡがGBにおける肝炎の病因物質であったことを示唆するものである。HGBV−Ａ配列もHGBV−Ｂ配列も、RT−PCRでは非Ａ−Ｅ肝炎の患者では同定されなかった（実施例5E）。そこで非Ａ−Ｅ肝炎に罹患しているヒトにおけるHGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂ感染の証拠を定める必要がいまだ残っている。
ヒト血清あるいは血漿源におけるHGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂ配列の同定が失敗に終わったことには幾つかの要因が考えられる。第一に、我々がRT−PCRによって検査したのは限られた数のHGBV−Ａ血清陽性および／またはHGBV−Ｂ血清陽性サンプルであって、これらのサンプルの多くは保存歴が不明である。よってこれらのサンプル中に存在したウイルス性のRNAが不適当な保存の影響を受けた可能性がある。第二に、GB感染は自然に快癒するように見受けられる。そのため、GB配列が感染した個体の血清中に存在する期間幅は非常に狭い可能性がある。即ちGB配列を含有する血清サンプルを得る機会は極端に低いものとなろう。最後に、HGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂ配列を探すにあたって、限られた数のPCRプライマーセットを用いたことが挙げられる。HGBV−Ａおよび／またはHGBV−ＢはRNAウイルスであるため、突然変異の率が高い傾向がある（ホランドら（1982年）サイエンス215:1577−1585）。即ち、検査したヒト血清中のHGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂ配列が我々のPCRプライマーの配列とは異なっていて、そのためHGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂが検出されない可能性がある。
HGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂのゲノムの変異性のために我々のPCR研究においてこれらのウイルスが妨害された可能性を示すため、HGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂの高度に保存されたNS3様の領域（図17参照）に合わせ、変性PCRプライマーを設計配置した。これらの高度に保存された領域がウイルスの複製サイクルにおいて必要な機能を果たしているからである。よってこれらの配列はHGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂ変異体においても保存されているはずである。この領域内に設計配置されたPCRプライマーは、RT−PCRによってHGBV−Ａおよび／またはHGBV−ＢのゲノムRNAを検出できるはずである。加えて、HGBV−Ａ、HGBV−ＢおよびHCV配列を特異的に増幅することのできる変性PCRプライマーを設計すれば、HGBV−Ａ、HGBV−ＢおよびHCVに関連するウイルスから得た配列を増幅することができるかもしれないと我々は判断した。よって、もし別のHGBV−Ａ関連ウイルスまたはHGBV−Ｂ関連ウイルスの抗原と交差反応する抗体が存在するために、ヒトの血清および血漿サンプル（実施例５および６）で血清反応があまり検出されなかったのであるならば、我々はこれらのGB関連ウイルスから配列を得ることができるであろう。［これはニコルと彼の同僚が最近米国南西部における急性呼吸器疾患の大流行に関連する特殊なハンタウイルスを同定するために採用した実験手法に類似のものである。ニコルら、サイエンス262:914−917（1993）］
B.肝炎GBウイルスＣ（HGBV−Ｃ）のNS3様領域のクローニング
ウイルス感染のモデルでは、感染の初期段階でウイルス血症が起こり、これがウイルスタンパクに対するIgM抗体の検出と相関していることが多い。実施例５、６で記載したように、HGBV−Ａ及びHGBV−Ｂに由来する組換えタンパクに対するIgG抗体が検出された検体は、ELISAにおいて免疫反応性を有していた。更に追加のELISAを実施し、IgM抗体がこれらのタンパクについて検出されるかどうかを調べた。西アフリカの個体（実施例5E−ｉ）の血清反応陽性の検体の内のあるものは、組換えタンパクに対するIgM抗体に関して反応性であった（データ省略）。これらの検体はウイルスを含有する可能性が高いと考えられた。加えて、急性肝炎に罹患しているHGBV−Ａ陽性およびHGBV−Ｂ陽性のエジプトの個体（実施例5F−vii）で、HGBV−ＡまたはHGBV−Ｂ組換えタンパクに対するIgM抗体が検出されない検体についても、急性肝臓疾患はウイルスの存在と関連している可能性があることから検査を実施した。これらのサンプルの核酸について、HGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、及びHCV−１の各配列を増幅する変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて“半入れ子”（hemi−nested）RT−PCRを実施した。使用機器はGeneAmp（登録商標）RNAPCRキット（パーキンエルマー製）を用い、製造業者の使用説明書に従って実施した。簡単に言えば、増幅の第一セットは、2mMのMgCl₂および１μＭのプライマーns3.1−ｓとns3.1−ａ（配列番号はそれぞれ671および672）で抽出した核酸のランダム−プライムド逆転写反応によるcDNA産物について行った。反応物に対し、変性−アニーリング−伸展［（94℃、30秒;37℃、30秒;2分かけて72℃;72℃、30秒）を３サイクル行い、次いで（94℃、30秒;55℃、30秒;72℃、30秒）を37サイクル行う］を40回行い、最後に72℃で10分間伸展させた。反応が終了したものは、４℃で保存した。増幅の第二セットは、最初のPCR産物の４％を鋳型として使用し、ns3.1−ｓおよびns3−ａ（配列番号はそれぞれ671および673）を“ヘミネスティッド”プライマーセットとして用いた他は上記と同様であった。PCRの第一及び第二のセットの産物をゲル濾過で分析した。
西アフリカの１サンプルは、約386bp（HGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、またはHCV産物の予想されるサイズ）にぼやけた半入れ子反応に由来するPCR産物を有していた。この産物を、本技術分野の書物に記載されているpT7ブルーＴ−ベクタープラスミド（ノヴァゲン製）にクローニングした。このクローンから得た配列（GBcontigC［GB−Ｃ］、配列番号673、残基2274−2640）をGBcontigA（GB−Ａ、配列番号163、残基4438−4804）、GBcontigB（GB−Ｂ、配列番号393、残基4218−4587）、およびHCV−１（配列番号398）と比較した。図36は、これらの配列のヌクレオチド配列を示し、一方、表20はこれらの配列間の％相同性を示す。

図36と表20に示すように、GB−Ａ、GB−Ｂ、およびHCV−１のヌクレオチドの比較の結果、これらの配列は47.99〜61.66％互いに類似している。このことは、これらのウイルスのNTP結合性ヘリカーゼに存在する保存されたアミノ酸残基を考えると特に驚くべきことではない（実施例2B3、図17A）。西アフリカのサンプル（GB−Ｃ、配列番号673、残基2274−2640）から得たNS3PCR産物のヌクレオチドと他のウイルスのヌクレオチドを比較すると、GB−Ａ（配列番号163、残基4438−4804）、GB−Ｂ（配列番号393、残基4218−4587）、およびHCV−１（配列番号398）からのNS3配列に関連しているが、明確に異なっていることが示唆されている。ウィスコンシン配列分析パッケージ（バージョン８）中の核酸およびタンパクデータベースとGB−Ｃ（配列番号673、残基2274−2640）とのBLASTINおよびBLASTX解析の結果、HCVの株の幾つかは配列の同一性に限界があることが判明した。ヌクレオチドおよびアミノ酸に関するもっとも高いＰ値（すなわち偶然に配列が整合した確率）はそれぞれ1.9×10^-20と5.3×10^-31であった（データ省略）。以上を合わせると、これらのデータは、GB−Ｃ（配列番号673、残基2274−2640）がHGBV−Ａ、HGBV−Ｂおよび我々がここでHGBV−Ｃと標記するHCVに関連するユニークなGB様のウイルスに由来するものであるかもしれないことを示唆している。
C. GB−Ｃは外因性である
GB−Ｃ配列に対するPCRプライマーを用い、上記のように、即ち例えば実施例6Bに記載の手順によって、この配列がヒト、アカゲザル、S.cerevisiaeおよびE.coliのゲノム中に検出されるかどうかを決定した。PCRはパーキン−エルマー−シータスのGeneAmp（登録商標）を使用し、基本的に製造者の指示書に従って実施した。即ち、300ngのゲノムDNAを各100μｌの反応物に対して使用した。PCRプライマー（配列番号675および676）を最終濃度1.0μＭで使用した。PCRは40サイクル行い（94℃、30秒;55℃、30秒;72℃、30秒）、次いで72℃で10分間伸展させた。PCR産物をアガロースゲル電気永動で分離し、臭化エチジウムで核酸を直接染色したのちUV照射で可視化し、さらにサザントランスファーでHybond−Ｎ＋ナイロンフィルターに移してから放射標識プローブとハイブリダイズした。図37は、GB−Ｃ（配列番号673、残基2274−2640）から調製した放射線標識プローブとハイブリダイズした後、PCR産物をサザンブロットして得たPhosphoImage（モレキュラー・ダイナミクス社、カリフォルニア州サニーヴェイル）である。GB−Ｃ（配列番号673）は、300ngのヒトゲノムDNA中にGB−Ｃプラスミド鋳型の〜350fg（１ゲノムコピー当量、レーン５）および〜35fg（0.1ゲノムコピー当量、レーン６）が検出された以外、ヒト（図19、レーン１）、アカゲザル（レーン２）、S.cerevisiae（レーン３）、E.coli（レーン４）の各ゲノムDNAには検出されなかった。（レーン７は〜3.5fg［0.01ゲノムコピー当量］のGB−Ｃプラスミド鋳型からのPCR産物を300ngのヒトゲノムDNA中に含有する。）このように、0.1ゲノムコピー当量を検出できるゲノムPCRを使用してもGB−Ｃ（配列番号673）はヒト、アカゲザル、S.cerevisiaeおよびE.coliのゲノム中に検出できない。この結果は、GB−Ｃ（配列番号673）が外因性（即ちウイルス性）起源であるという予想と一致している。
D. GB−Ｃは追加のヒト血清サンプル中に検出できる
追加のHGBV−ＡおよびHGBV−Ｂ免疫反応性ヒト血清サンプルにRT−PCRを適用し、GB−Ｃ配列の存在について調べた。実施例７に記載のように、血清サンプルから抽出した核酸をランダムヘキサマーで逆転写し、cDNAに対して35−40サイクルの増幅を行い（94℃、30秒;55℃、30秒;72℃、30−90秒）、次いで72℃で10分間伸展させた。GB−Ｃに特異的なPCRプライマー（g131−slとg131−al、配列番号675と676）を濃度1.0μＭで使用した。PCR産物をアガロースゲル電気永動で分離し、臭化エチジウムで核酸を直接染色したのちUV照射で可視化し、サザンブロットでHybond−Ｎ＋ナイロンフィルターに移してから放射標識プローブとハイブリダイズした。西アフリカからの計48本のHGBV−免疫陽性サンプルを試験した。GB−Ｃが同定された最初のサンプルを含む西アフリカからの８サンプルは、GB−Ｃ配列に陽性であることがRT−PCRで判った。GB血清反応陰性の西アフリカ血清サンプルを計10本試験したが、いずれも検出可能なGB−Ｃ配列は有していなかった。陽性サンプル４本からのPCR産物をクローニングし、前記のように配列決定した。156にわたるヌクレオチドを調べた所、試験した４クローンの内の２つがGB−Ｃ配列（配列番号673、残基2274−2640）と同一であり、２クローン（配列番号677および678）がGB−Ｃ（配列番号673、残基2274−2640）と88.4％および83.6％相同の配列を含有していた（図38）。しかしながら、ヌクレオチドレベルにおけるダイバージェンスにもかかわらず、各クローンは非常に類似しており、配列番号678の予想された翻訳中にはただ一つのアミノ酸の相違が見られただけであることが、予想された翻訳で示された。
ギリシャ、エジプトおよびアメリカ合衆国の非Ａ−Ｅ肝炎の個体から追加の血清サンプルを得て、前記のようにしてGB−Ｃ配列について検査した。これらのサンプルはいずれもGB−Ｃ配列は含有していなかった。サンプル中にGB−Ｃ配列が検出されなかったことには幾つかの理由が考えられる（上記、理論の項参照）。しかしながら、GB−Ｃ（配列番号673、残基2274−2640）と二つのGB−Ｃ変異体（配列番号678と677）との間における上述の配列変化は、もし密接に関連している西アフリカからのHGBV−Ｃがヌクレオチドレベルで15.1％異なることがあるならば、GB−Ｃに特異的なPCRプライマー（g131−sl、g131−al、配列番号675と676）が地理的に別個の隔離体であるGB−Ｃウイルスと、検出可能なPCR産物を産生するほどには十分ハイブリダイズしないかもしれないことを示唆している。この場合、ゲノムのより高度に保存された領域（5'UTR）に設計されたPCRプライマーによって、GB−Ｃ配列を西アフリカ血清サンプル中に検出できるかもしれない。
E. HGBV−Ｃ配列の伸展
実施例2Aに記載のPCRウォーキング法によって追加のGB−Ｃ配列を得た。即ち、当初GB−Ｃ（配列番号673、残基2274−2640）を同定するために用いた西アフリカのヒト血清から全核酸を抽出した。この核酸を前記のようにして逆転写した。その結果得られたcDNAを、2mMのMgCl₂を用いたこと以外はソレンセンらによって記載された方法に従って50μｌのPCR反応物（PCR1）中で増幅した。反応物を35サイクルの変性−アニーリング−伸展工程（94℃、30秒;55℃、30秒;72℃、90秒）に付し、次いで72℃で10分間伸展させた。ソレンセンらによって記載された方法に従ってストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（プロメガ社）によってビオチン化産物を単離した。次いでソレンセンらの記載する方法に従ってこのストレプトアビジンで精製した産物に上記と同じ全35サイクルの変性−アニーリング−伸展によってネスティッドPCR（PCR2）を行った。得られた産物およびこれを精製するために用いたPCRプライマーを表21に示す。

さらに、上記のPCR1の条件下でオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号669および670）を用いて1.3kb産物（C.16）を生成した。この産物を表21に記載のものと共にアガロースゲルから単離し、本技術分野で周知の方法によってpT7ブルーＴ−ベクタープラスミド（ノヴァゲン社）中にクローニングした。
クローニングした産物は、実施例５に記載のようにして配列決定した。GCGパッケージ（バージョン７）のプログラムによって配列を組み立てた。構築されたcontigの概略を図39に示す。GB−Ｃは長さが9034bpで、その全長が配列決定された。これを配列番号400−606に示す。これらの配列番号は三つの前進翻訳フレームと対応している。
実施例19. CKSに基づいた発現と免疫原性HGBV−Ｃポリ ペプチドの検出
実施例17（表13）に記載のウォーキング試験で得たHGBV−Ｃ配列を、実施例13の記載にしたがって表22（10ユニット、NEB）に掲載の制限酵素を用いてCKS発現ベクターpJO200、pJO201およびpJO202にクローニングした。追加のPCRクローン２種、C3/2およびC8/12、も発現した（図39）。配列番号681のプライマーによってPCR産物C3/2を生成し、PCR産物C8/12と配列番号685の補体を、実施例９の記載に従ってプライマー（配列番号693とその補体）を用いて生成した。このPCR産物を前記のようにしてpT7ブルー中にクローニングし、次いで表22に掲載した制限酵素で遊離させ、上記のpJO200、pJO201およびpJO202中にクローニングした。
一以上のCKS/HGBV−ＡあるいはCKS/HGBV−Ｂ融合タンパクに対する抗体の存在が1.7、4.1、または2.17ELISA（実施例15、16参照）によって示唆された二つのヒト血清を選択し、ウェスタンブロットによって分析した。これらの血清のうちの一つ（240D）は非Ａ−Ｅ肝炎（エジプト）の個体からのものであり、他方（G8−81）は西アフリカの個体のものでHGBVへの暴露について「リスクあり」（実施例15参照）のものであった。CKS/HGBV−Ｃ融合タンパクを発現し、これを前記のようにしてニトロセルロースシートに移した。記載されたようにブロットをプレブロックし、10％のE.coli溶解物と6mg/mlのXL1−ブルー/CKS溶解物を含有するブロッキングバッファーで1:100に希釈されたヒト血清サンプルの一つで一夜インキュベートした。ブロットはTBSで２回洗浄し、HRPO−接合ヤギ抗−ヒトIgGと反応させ、上記のように展開させた。結果を表22に示す。
HGBV−Ｃタンパクの内この二つの血清の一方あるいは他方と反応性を示したものがいくつかあり、その三つ（C.1、C.6、C.7）を選んでELISAアッセイ（実施例20参照）に付した。このようにして、HGBV−Ａおよび／またはHGBV−Ｂタンパクと反応性を示すことが既に判っているサンプルは、HGBV−Ｃタンパクとも反応することが判明した。三つのHGBVウイルスからの複数のタンパクとの反応性は、ウイルス間でエピトープが共有された結果の交差反応によるものであるかもしれない。あるいは、これは複数種のウイルスの感染によるものかもしれず、さらにはその他の同定されていない要因によるものである可能性もある。

実施例20. GBV−Ｃの血清学的研究
A. 組換えタンパク精製手順
CKS融合タンパクを発現する細菌細胞を凍結し、−70℃で保存した。各GBV−Ｃ構築物からの細菌細胞を解凍し、実施例15でGBV−Ｂ構築物について記載したようにして破砕処理した。さらに、組換えタンパクを、実施例15でGBV−Ｂ組換えタンパクについて記載したようにして精製した。
この精製手順で収集した分画を電気永動で分離し、クーマシーブリリアントブルーR250で染色して、分子量が約75kD（CKS−C.1/配列番号404）、71kD（CKS−C.6/配列番号404）、および49kD（CKS−C.7/配列番号404）であるタンパクの存否を調べた。予想された分子量のタンパクを示すバンドが、CKS−C.6およびCKSC.7組換えタンパクについて観察された。CKS−C.1タンパクについては、予想された分子量75kDの所ではなく、分子量62kDに対応する箇所にバンドが認められた。なぜ予想されたバンドと観察されたバンドが異なるのかは不明である。興味の対象のタンパクを含有する分画をプールし、SDS−PAGEによって再度調査した。
精製抗原を含有するプール分画の免疫原性および構造の完全性を、実施例13に記載の方法に従ってニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロット法によって決定した。適切な陽性対照がなかったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのCKS部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって同定した。CKS−C.1タンパク（配列番号404）の組換え抗原を検出すべく抗−CKSモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、約65kDのところにシングルバンドが認められた。この結果はCKS−C.1タンパク（配列番号404）の予想サイズの75kDとは異なっている。なお、CKS−C.6タンパク（配列番号404）およびCKS−C.7タンパク（配列番号404）については、イムノブロット法で調べた結果予想されたサイズを有していた。
B. ポリスチレンビーズの被覆手続き
上記タンパクを透析し、実施例15の記載に従って、これらのタンパクのポリスチレンビーズ上での免疫原性を評価した。
C. HGBVに対する抗体を検出するためのELISAの手順各種ELISAは実施例15の記載に従って実施した。
D. 感染個体の血清におけるHGBV−RNAの検出
各ELISAで繰り返し反応性を示した検体について、実施例15のセクションＤの記載に従ってHGBV−RNAを調べた。
E. タマリンの血清像
HGBV−Ｃゲノム由来のCKSC.1タンパク、CKSC.6タンパク、あるいはCKSC.7タンパクを用いたELISAアッセイにおいて、タマリンからの血清はいずれも特異的免疫反応を示さなかった。実施例15中のタマリンの血清像についての記載参照。
F. 追補的試験
実施例15に記載したように、最初反応性を示した検体については、典型的には再試験を行った。ある検体が繰り返し反応性を示した場合、ELISAによるデータをさらに補充すべく追加の試験（例えばウェスタンブロット）を実施することができる。ウェスタンブロットの結果が陽性と考えられるためには、観察可能なバンドがC.1タンパク（配列番号404）に対して65kD、C.6タンパク（配列番号404）に対して71kD、またはC.7タンパク（配列番号404）に対して49kDにおいて検出される必要がある。ウェスタンブロットはELISAの感度に匹敵しあるいはそれを越えるほど最適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちにELISAのデータを捨てることはしなかった。しかしながら、陽性の結果が出ればそれはELISAによって検出された反応性を補強するものである。
実施例15で記載したように、繰り返し反応性のある検体で十分量あるものに対しては、RT−PCR（配列番号８と９に対応するプライマーを用い、実施例10の記載に従って実施）によって血清中のHGBV−Ｃ特異性ヌクレオチド配列を同定することができる。
G. 実験手順
実施例15では、種々のヒト個体群におけるHGBV−ＢとHGBV−Ａに対する抗体の存在を評価するために、HGBV−Ｂからの組換え抗原を使用したELISAを利用した。実施例14に記載したように、固相の上に被覆したCKS−C.1組換えタンパク（配列番号404）を用いたC.1ELISA、CKS−C.6組換えタンパク（配列番号404）を用いたC.6ELISA、およびCKS−C.7組換えタンパク（配列番号404）を用いたC.7ELISAを利用し、HGBV−Ｃに対する抗体についての試験を同じ検体の多くについて行なった。実施例15に述べたように、HGBVを接種した回復期にあるタマリンの５匹全てが、（1.7、1.4および4.1ELISAを用いて検出されたように）HGBV−Ｂ組換えタンパクに応答する特異的ではあるが短命の抗体を産生した。C.1、C.6およびC.7ELISAに応答する検出可能な抗体を産生したタマリンはなかったが、ヒトの検体の幾つかは、ウエスタンブロット法（実施例13参照）によって試験したとき、C.1、C.6およびC.7組換えタンパクに反応する特異的な抗体を産生した。本実施例では、種々のヒト個体群における抗体を検出する上でのC.1、C.6およびC.7ELISAの有用性を評価した。
H. 切捨て値の決定
C.1、C.6およびC.7ELISAの切捨て値を実施例15に記載したようにして決定した。
I. 低リスク検体を用いて得た血清学的データ
ウイスコンシン州南西部に住む健康なボランティアのドナーから100本の血清と100本の血漿を含む集団を得るとともに、C.1ELISAにおけるCKS−C.1（配列番号404）タンパク、C.6ELISAにおけるCKS−C.6（配列番号404）タンパク、およびC.7ELISAにおけるCKS−C.7（配列番号404）タンパクを含むHGBV−Ｃからの三種の組換えタンパクに対する抗体について試験を行なった。
C.1ELISAについては、血清および血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ0.049（標準偏差（SD）＝0.040）と0.038（SD＝0.029）であった。血清と血漿についての切捨て値はそれぞれ0.214と0.286と計算された。上記のように、切捨て値は、陰性対照の吸収値の関数として表すこともでき、10.0を越えるS/N値を有する検体は反応性であると考えられた。この切捨て値を用いたところ、100の血漿検体にはC.1タンパク（配列番号404）に対する抗体に初期反応性および繰り返し反応性がみとめられたものはなく、100の血清検体の内の一つでは、C.1タンパク（配列番号404）に対する抗体に初期反応性および繰り返し反応性が認められた。
C.6ELISAについては、血清および血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ0.102（標準偏差（SD）＝0.046）と0.105（SD＝0.047）であった。10以上のS/N値を有する検体が反応性であると判断されるように切捨て値を設定した。この切捨て値を用いたところ、３個の検体（２個は血清の集団からで、１個は血漿の集団から）ではC.6タンパク（配列番号404）に対する抗体に対して繰り返し反応性がみとめられた。
C.7ELISAについては、血清および血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ0.061（標準偏差（SD）＝0.040）と0.050（SD＝0.055）であった。10以上のS/N値を有する検体が反応性であると判断されるように切捨て値を設定した。この切捨て値を用いたところ、C.7タンパク（配列番号404）に対する抗体に対して繰り返し反応性であると考えられる検体は無かった。
したがって、米国人の血液提供者（Ｎ＝200）の約１％にC1、C6またはC.7タンパクに対する抗体が存在することが証明された。
J. 肝炎に対し「リスクあり」と考えられる検体
この研究のデータを表23にまとめて示す。
（ｉ）西アフリカからの検体
137個の検体の内の計20個が、GBV−Ｃタンパクを用いたELISAの一種またはそれ以上において反応性であった。97個の内の合計12個がC.1ELISAにおいて繰り返し反応性であることが認められ、52個の内の３個がC.6ELISAにおいて繰り返し反応性であることが認められ、137個の検体の内の５個がC.7ELISAにおいて繰り返し反応性であることが認められた。C.1において反応性であった検体の内の３個をウエスタンブロット法で試験し、反応性であることが分かった。
これらのデータは、HGBVが西アフリカの風土病であることを示唆している。
（ii）経静脈麻薬使用者の検体
イリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病院において行なわれた研究の一環として、経静脈麻薬使用者の集団から合計112個の検体を得た。112個の検体の内の計２個が一種またはそれ以上のタンパクに対して繰り返し反応性を有していた。１個の検体がC.1ELISAにおいて繰り返し反応性であることがみとめられ、１個の検体がC.7ELISAにおいて繰り返し反応性であることがみとめられた.C.6ELISAにおいて陽性であった検体は無かった。
K. 非Ａ−Ｅ肝炎の個体から得た検体
この研究のデータを表23にまとめて示す。
非Ａ−Ｅ肝炎を有する個体から種々の検体の集団（実施例15.Kに記載）を得、1.5、2.17、1.18、および1.22ELISA（実施例15.Cに記載）によって試験した。検体の量が不十分であったため、検体の全てを全てのELISAにおいて試験できなかった。
（ｉ）日本の検体
合計89個の検体の内、C.1ELISAにおいて繰り返し反応性であるとみとめられたものは無かった。検体の量が少なかったため、C6またはC.7ELISAでの抗体についての試験は行なわなかった。
（ii）ギリシャの検体
合計67個の検体をC.1およびC.7ELISAを用いて試験した。反応性のみとめられた検体は無かった。
（iii）エジプトの検体
132個の検体の内の計18個が一つ以上のELISAにおいて反応性であるとみとめられた。C.1ELISAにおいて反応性であるとみとめられたものは無かった。計15個の検体がC.6ELISAにおいて反応性であるとみとめられ、３個の検体がC.7ELISAにおいて反応性であるとみとめられた。
（iv）米国の検体（Ｍセット）
合計６個の検体が一以上のELISAにおいて反応性であると認められた。２個の検体がC.1ELISAにおいて繰り返し反応性であると認められた。４個の検体がC.6ELISAにおいて繰り返し反応性であると認められた。C.7ELISAにおいて繰り返し反応性の検体は無かった。
（ｖ）米国からの検体（Ｔセット）
64個の検体の内で、C.1ELISAまたはC.6ELISAにおいて反応性であると認められたものは無かった。１個の検体がC.7ELISAにおいて繰り返し反応性であった。
（vi）米国の種々の臨床現場からの検体（セット１）
総計すると、62個の検体の内の３個が一以上のELISAで反応性であると認められた。１個の検体がC.1ELISAおよびC.6ELISAの両方において繰り返し反応性であると認められた。２個の検体がC.7ELISAにおいて繰り返し反応性であると認められた。
上記のように、HGBVには二以上の株が存在する可能性があり、即ち二以上の別個のウイルスを本明細書に開示した配列によって表すことができる。これらは本発明の範囲内であると考えられ“肝炎GBウイルス（“HGBV"）”と称す。
L. 血清反応の結果の統計的意義
これらのデータは、HGBVに晒されるリスクがあると考えられる個人、および非Ａ−Ｅ肝炎であると診断された個人からは、HGBV−Ｃタンパク（即ち、C.1、C.6およびC.7ELISAの抗体に対して繰り返し反応性である検体）に特異的な抗体が検出され、米国からのボランティアまたは売血血液提供者からはこれらの抗体が低い割合で検出された。表24に、種々のカテゴリーの検体（表23に示す“低リスク”、“リスク有り”、および非Ａ−Ｅ肝炎患者）について得られた血清反応の結果をグループ分けして示し、χ二乗検定によって統計的意義を分析した。試験した検体の総数におけるHGBVタンパクに対する抗体の血清学的にみた存在をまとめた表23のデータと異なり、表24のデータは、異なる個体（人）について得られた結果を反映している。GBV−ＣのELISAについては、そのデータは、ボランティアの血液提供者における抗HGBVの血清学的にみた存在と、IVDUではなくHGBVに晒される“リスクあり”と考えられる個体（西アフリカ）との比較においては有意差（ｐ値＝0.000）があることを示している。また、エジプトと米国の非Ａ−Ｅ肝炎に罹患している個体におけるHGBV−Ｃに対する血清学的にみた抗体の存在は、ボランティアの血液提供者と比較した場合、統計的有意差があった。これらのデータによれば、HGBV−Ｃに晒されることは非Ａ−Ｅ肝炎と関連していることが示唆される。注：これらの初期の研究ではRT−PCRの結果は陰性であったが、その後に得られたデータによって、血清学的に陽性の個体（実施例19参照）の血清におけるフラヴィ様ウイルス配列が判明した。
実施例21. 非Ａ−Ｅ肝炎のヒトにおけるHGBV−Ｃの存 在
HGBV−Ｃに特異的なELISAの生成により、非Ａ−Ｅ肝炎に罹患している患者の免疫的に陽性の血清（HGBV−Ｃ血清学の実施例）を同定できるようになった。この血清を、非Ａ−Ｅ肝炎であると立証された個体（表25）から得た幾つかの免疫的に陽性のHGBV−ＡとHGBV−Ｂと共に、HGBV−Ｃ配列についてRT−PCRによって試験した。HGBV−Ｃの異型もなるべく検出できるよう、第１回目の増幅において変性NS3オリゴヌクレオチドプライマーを使用してRT−PCRを行ない、これに続き、ネスト化されたGB−Ｃ特異性プライマーを用いて第２回目の増幅を行なった。具体的には、第１回目の増幅は、2mMのMgCl₂、および１μＭのプライマーns3.2−s1、ns3.2−a1（配列番号はそれぞれ711と712）を使用し、実施例６で述べたようにして調製された血清cDNA製品を用いて行なった。反応物に対して変性−アニーリング−伸展を40回繰り返し〔（94℃で30秒、37℃で30秒、２分間かけて72℃に温度上昇、72℃で30秒）というサイクルを３回繰り返し、その後（94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で30秒）のサイクルを37回〕、これに続き72℃で10分間伸展を行なった。得られた反応物は４℃に維持した。第２回目の増幅は、2mMのMgCl₂、１μＭのGB−Ｃ特異性のプライマー（配列番号675と676）、および鋳型として４％の第１のPCR製品を使用して行なった。第２回目の増幅では、増幅すべき鋳型との塩基対の不適合を含んでいるようなオリゴヌクレオチドプライマーを有する特定の生成物をも増幅するために設計された温度循環計画を採用した〔Roux、Bio/Techniques、16:812〜814（1994年）〕。即ち、反応は、温度循環（94℃で20秒、55℃（各サイクル毎に0.3℃低下）で30秒、72℃で１分）を43回行なった後、（94℃で20秒、40℃で30秒、72℃で１分）で10回行い、最終伸展を72℃で10分行なった。PCR産物をアガロースゲル電気永動法により単離し、臭化エチジウムを用いて核酸を直接染色した後、紫外線照射によって可視化し、サザントランスファーでHybond−Ｎ＋ナイロンフィルターに移した後、GB−Ｃに対する放射線標識化プローブにハイブリダイゼーションを行なった。PCR産物を、当分野において述べられたようにクローン化するとともに配列決定した。
上記の方法を用い、GB−C.4、GB−C.5、GB−C.6、およびGB−C.7を得た。これらの配列は、82.1〜86.6％の割合でGB−Ｃ（配列番号400、塩基4167〜4365）と相同である。図40は、予期されたコドントリプレットにおける、GB−Ｃと相同な領域に整合したGB−C.4、GB−C.5、GB−C.6、およびGB−C.7の配列の相違を示す。この図に示すように、ヌクレオチドの相違の殆どは、GB−Ｃからのアミノ酸の変化を引き起こさない。このアミノ酸レベルでの全体的な配列の維持は、GB−C.4、GB−C.5、GB−C.6、およびGB−C.7が同じウイルスの異なった株であるHGBV−Ｃから得られたものであることを示唆している。さらに、ヌクレオチドレベルでの配列の相違の程度は、これらのPCR産物が以前に同定されたGB−Ｃ配列の何れかによる汚染の結果生じたものではないことを示している。
これらの個体の内の三つ（GB−C.4、GB−C.5、GB−C.6、およびGB−C.7源）については、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎に感染している証拠はなかった。病因が未知の肝炎に罹患している個体におけるGB−Ｃ配列の存在は、ヒト肝炎の原因物質の一つがHGBV−Ｃであることを示唆している。個体の内の２つ（GB−C.4とGB−C.5を含んでいる）については経時的試料が利用可能であった。これらの試料中のHGBV−Ｃの配列を追跡するために、クローン特異性のRT−PCRを開発した。即ち、血清から抽出した核酸を、実施例７において行なったようにランダムヘキサマーによって逆転写した。得られたcDNAを、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒の条件での増幅を40回行い、その後、伸展を72℃で10分行なった。GB−C.4とGB−C.5に特異的なPCRプライマー（GB−C.4−s1とGB−C.4−a1、またはGB−C.5−s1とGB−C.5−a1）を1.0μＭの濃度で使用した。PCR産物をアガロースゲル電気永動法により単離し、臭化エチジウムを用いて核酸を直接染色した後、紫外線照射によって可視化し、サザントランスファーでHybond−Ｎ＋ナイロンフィルターに移した後、放射線標識プローブにハイブリダイズした。
急性非Ａ−Ｅ肝炎に罹患しているエジプト人の患者の血清においてGB−C.4が見いだされた。この患者はHGBV−Ａタンパクについて血清反応陽性であった（HGBV−Ａ ELISAの実施例参照）。このエジプト人の患者から得た５個の一連の試料のRT−PCRはウイルス血症を示し、これは血清ALT値が正常になった後少なくとも20日の間持続した（表26）。血清ALTが正常になった後におけるGB−Ｃ配列の存在は、人によっては慢性の感染につながることを示唆した。しかし、この患者の試料はそれ以上は得られなかったため、HGBV−Ｃの慢性化について結論を出すことはできない。この問題を解決するため追加の試料を求めている段階である。
GB−C.5は、肝炎に関連する再生不良貧血に罹患していたカナダ人の患者から得た。この患者の各試料は、C.7ELISAにおいて血清学的に陽性であった（実施例20）。カナダ人の患者から再生不良貧血の間（症状の顕出後13日目）および死亡時（14日目、図41）において得た試料から、GB−C.5特異性のプライマー（GB−C.5−s1とGB−C.5−a1）を用いてGB−C.5を検出した。しかし、GB−C.5特異性のPCRは、症状の発生時（０日目、急性肝炎）および３日目（肝不全）においてGB−C.5配列を検出できなかった。したがって、最初の試料中にGB−C.5が検出限界以下のレベルで存在していたか否かは不明である。もし、存在していたとしたら、HGBV−Ｃは、その患者の再生不良貧血の原因物質であったであろう。しかし、GB−C.5は、再生不良の危期においてのみRT−PCRによって検出されたため、GB−C.5は、貧血の対処のために投与された血液製品から混入したものかもしれない。この場合、再生不良貧血へのHGBV−Ｃの関連はHCVと類似したものであろう〔ヒブス（Hibbs）ら、JAMA、267、2051〜2054（1992年）〕。
HGBV−ＣとHCVとの関係が遠いことに鑑み、HCV感染を検出するための現在の方法により、HGBV−Ｃを含むヒトの試料を認識できるか否かは興味の対象であった。HCVに暴露または感染した個体の通常の検査法は、HCV−１の３つまたはそれ以上の領域から得た抗原を利用する抗体試験によるものである。この試験により、殆どの個体におけるHCVの既知の遺伝子型の全てに対する抗体を検出できる〔サカモトら、J.Gen.Virol.75、1761〜1768（1994年）、スチュイバー（Stuyver）ら、J.Gen.Virol.74、1093〜1102（1993年）〕。HCVのための第２世代のELISAを、実施例10（表25）に記載されたHGBV−Ｃを含む試料に対して実施した。HGBV−Ｃを含む４つの試料の内の一つがHCV抗原に対して血清反応陽性であった。HCVに対して血清反応陰性のヒト血清中の限られたものだけが、非常に感度の高いRT−PCRアッセイにより、HCVゲノムRNAに対して陽性であることが示された〔スギタニ、1992年、＃65〕。類似のRT−PCRアッセイ（実施例９に記載されたような）は、血清反応陽性の試料中のHCVウイルス血症の存在を確認した。しかし、血清反応HCV陰性の試料にはHCVウイルス血症であるものは存在しなかった。したがって、HGBV−Ｃ配列を含む４つの個体の内の一つはHCV感染の証拠を有しているものの、HCVの存在に関する本アッセイは、HGBV−Ｃの存在を正確に予測できなかった。この一人のHCV陽性の患者はHGBV−Ｃにも感染していたようである。この患者の肝炎がHCV、HGBV−Ｃ、または両方のウイルスの存在によるものであったかは不明確である。同じ患者においてHCVとHGBV−Ｃが発見されることは、これらの感染を受ける共通のリスクが存在することを示唆するものであろう。
上記のPCR手順を使用し、1994年に２人のボランティアの米国人提供者から得た血液の“正常（normal）”ユニット中に、GB−Ｃ配列（図41に示した先のGB−Ｃ分離株と〜85％相同、データは示していない）を同定した。これらのユニットは、試験の結果HBV、HCVについて陰性であるとされ、正常な血清ALT値を有していた。しかし、これらのユニットは1.4ELISAでの試験の結果、陽性とされた。免疫的にスクリーニングされた〜1000ユニットの内の少なくとも２つの“正常”血液ユニットにHGBV−Ｃが発見されたことは、このウイルスが現在、米国の血液供給に存在していることを示唆している。しかし、我々はHGBVタンパクから開発されたELISAおよびHGBV配列からのヌクレオチドプローブを使用して、これらの血液ユニットを同定できることを示す。
種々のHGBV配列（図41）には、多数の配列のバリエーションがあることに留意しなければならない。ウイルス性の核酸に対するPCRに基づくアッセイは、非常に敏感ではあるものの、オリゴヌクレオチドプライマーとウイルス鋳型との間の配列の一致に依存する。したがって、本研究で利用したPCRプライマーは、種々の分離物において十分保存されていないHGBV−Ｃゲノムの領域に位置していたため、試験したHGBV−Ｃウイルス血症の試料の全てを、ここで採用したRT−PCRによって検出できなかったのであろう。HCV5'の翻訳されていない領域中に発見されたように〔チャ（Cha）ら、J.Clin.Microbiol.、29、2528〜2534（1991年）〕、HGBV−Ｃゲノムの良く保存された領域からのPCRプライマーを利用することにより、HGBV−Ｃウイルス血症の試料をより正確に検出できるようになろう。

実施例22. 配列の比較と系統的分析
ヌクレオチドと予測したアミノ酸配列の比較、即ちアライメントを行なうことによってウイルスの近親性の程度についての情報を得ることができる。HGBV配列と他のウイルスの配列とのアライメントを行なうことにより、配列間の類似性と相同性の程度を量的に評価することができる。この情報は、HGBVウイルスの分類のための原理を開発するのに使用できる。一般に、二つのアミノ酸配列の間の類似性の計算は、アライメント中のアミノ酸対の側鎖の間の類似度程度に基づいて行なわれる。類似度は、アミノ酸の側鎖の物理化学的特徴、即ち、寸法、形状、電荷、水素結合の能力、および化学的反応性に基づいている。即ち類似したアミノ酸は類似の物理化学的特徴を備えた側鎖を有している。例えば、フェニルアラニンとチロシンは共に芳香性の側鎖を含んでおり、したがって化学的に類似であると見做すことができる。アミノ酸の化学についての議論は基礎的な生化学の教科書、例えば、Biochemistry、第３版、ルバート・スタイヤー（Lubert Stier）編、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク、1988年に見ることができる。整列した２つのアミノ酸配列の間の相同性の計算は、一般的にアライメント中の同一のアミノ酸対の数を計数し、この数をアライメント中の配列の長さで割るという算術計算である。アミノ酸配列のアライメントに使用する方法と同様に、アライメントした２つのヌクレオチド配列の間の相同性の程度の決定は、アライメント中の同一のヌクレオチド塩基対の数を計数し、この数をアライメント中の配列の長さで割るという算術計算である。アラインした２つのヌクレオチド配列の間の類似性の計算は、アライメント中の種々の位置における対になった（即ち、整合した）対の間における遷移および転換に対して時として異なる値を用いる。しかし、一対のヌクレオチド配列間の類似性と相同性の点数は通常非常に接近しており、即ち１〜２％以内である。
前に述べたように、HGBV作用物質とＣ型肝炎遺伝子型のアミノ酸配列の間の相同性は限られたものである。HGBV作用物質とHCVとの間の近親性の程度をより精度良く決定するために、HGBV−Ａ、ＢおよびＣの全体的な大きな開放読み枠（ORF）の配列、および幾つかの代表的なHCV分離物の大きなORFのアミノ酸配列を用いてアミノ酸配列アライメントを行った。さらに、ヌクレオチドレベルにおけるHGBV作用物質とHCVの間の近親性の程度は、HGBV−Ａ、ＢおよびＣの全体的なゲノムヌクレオチド配列、および幾つかの代表的なHCV分離物の全体的なゲノムヌクレオチド配列を用いて決定した。アミノ酸配列とヌクレオチド配列の間のアライメントは、53711、ウイスコンシン州マジゾン、サイエンスドライブ575にあるジェネティック・コンピュータ・グループ社から入手可能なウイスコンシン配列分析パッケージ（バージョン８）のプログラムGAPを用いて行なった。ギャップ作成とギャップ延長のペナルティーは、核酸配列のアライメントに対してはそれぞれ5.0と0.3であり、アミノ酸配列の比較に対してはそれぞれ3.0と0.1であった。GAPプログラムは、アラインされている２つの配列の間の百分率で表した類似性と相同性の程度を計算するために、ニードルマン（Needleman）とワンシュ（Wunsch）のアルゴリズム（J.Mol.Biol.48、443〜453、1970年）を使用している。
選択された数の主要なＣ型肝炎のウイルス（HCV）遺伝子型のヌクレオチド配列とアミノ酸配列をGenBankから入手した。これをそれらの登録番号とともに下記に示す。

大きな開放読み枠（即ち推定の前駆体ポリタンパク）の予想されるアミノ酸配列と、上記HCV遺伝子型の各々とHGBV分離物との間のヌクレオチド配列との間の対毎の比較結果を表28と29にそれぞれ示す。各HCV分離物の遺伝子型の指定を一番上の行に示す。この遺伝子型の指定は、シモンズ・ピー（Simmonds,P）ら（1994年）Hepatology、19、1321〜1324に記載されたHCV分離物のための命名法に基づく。
表28に示すデータは、HCV遺伝子型の間におけるアミノ酸配列の相同性の下限が69％であることを示している。この値は、シモンズら〔シモンズ・ピー（Simmonds,P）ら、Hepatology、19、1321〜1324（1994年）〕が示した値に非常に近い。シモンズらは、２つの主要な群からの８個の完全なHCVゲノムのコード化領域を比較して、67.1％〜68.6％のアミノ酸配列の類似度を示した。しかし、この著者は、類似度を計算した方法を記載しなかった。この値（69％）は、HCV−J8と他の主要なHCV分離物との比較についてオコモト（Okomoto）ら〔Virology、188、331〜341、1992〕が報告した値にも非常に近い。しかし、これらの研究者も、相同性を計算した方法を述べなかった。HGBVポリタンパク配列とHCV遺伝子型との比較は、HGBVによってコードされたポリタンパクの配列は、HCVポリタンパク（表28）の何れのものに対しても33％以下の相同性しか示さないことを明らかにしている。ヌクレオチド配列（表29）の比較により、任意のHGBVと任意のHCV分離物との間では最大で44.2％の相同性があり、これに対し、HCVの分離物の間では最小でもヌクレオチド配列の相同性が64.9％である。したがって、HGBV−Ａ、ＢおよびＣとHCVとの間では、そのヌクレオチドと予想されるアミノ酸配列の相同性が、既知のHCV遺伝子型について確立された相同性の範囲から大きく外れたものであるため、HGBVウイルスはＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型であると考えることはできない。
Ｃ型肝炎ウイルスとGB型肝炎のウイルスとの間の関係は、それらのアラインされたヌクレオチド、推定されたアミノ酸配列（即ち、大きな開放読み枠）、またはこれらの配列の一部について系統的分析を行なうことによって調べることができる。この方法をＣ型肝炎ウイルスに適用したところ、HCV分離物の可変性により配列の６つの均等に発散した主グループを描写することが示された〔シモンズ・ピー（Simmonds,P）ら、J.Gen.Virol.（1993年）74、2391〜2399およびシモンズ・ピー（Simmonds,P）ら、J.Gen.Virol.（1994年）75、1053〜1061〕。この分析の結果、Ｃ型肝炎ウイルスのための命名法が確立された〔シモンズ・ピー（Simmonds,P）ら、Hepatology、19、1321〜1324（1994年）〕、この命名法では、分離物を配列間の進化論的隔たりに基づいて遺伝子型に分類している。
GB型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスとの間の系統的関係を決定するために、NS3の推定ヘリカーゼ遺伝子およびNS5Bの推定RNA−依存RNA−ポリメラーゼ（RdRp）内のアミノ酸配列のアライメントを行なった。また、Flaviviridae内の他のウイルスからの関連する配列、およびヘリカーゼ遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子内においてFlaviviridaeのメンバーに対する進化論的近親性を有することが示されているウイルスもアライメントに含めた〔クーニン・イー・ヴイ（Koonin,E.V.）およびドルジャ・ブイ・ヴイ（Dolja,V.V）（1993年）、Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28、375〜430、およびクーニン・イー・ヴイ（Koonin,E.V.）（1991年）、J.Gen.Virol.72、2179〜2206〕。
アミノ酸配列のアライメントは、ウイスコンシン配列分析パッケージ（バージョン８）のプログラムPILEUPを用いて行なった。アラインされた一対の配列の間の系統的な距離は、ジェイ・フェルセンスタイン（J.Felsenstein）〔フェルセンスタイン・ジェイ（1989年）、Cladistics ５、164〜166〕のご好意により提供を受けたPHYLIPパッケージ（バージョン3.5c、1993年）のPROTDISTプログラムを用いて決定した。この計算した距離は、プログラムNEIGHBOR（隣接結合設定）を使用して系統図（phylogenetic trees）を組み立てるのに使用した。プログラムDRAWTREEを用いて系統図をプロットした。使用したウイルスの配列とそれらに対応するゲンバンク登録番号を表30に示す。ヘリカーゼ、RdRp、または完全な大きな開放読み枠内で行なったアライメントのための各HCV遺伝子型と各HGBVウイルスとの間の旋回距離を、表31、32および33にそれぞれ示す。HCV遺伝子型と、HGBVウイルスおよび表30に列挙した他のウイルスとの間で計算した距離は示していない。ヘリカーゼ、RdRp、または完全な大きな開放読み枠配列のアミノ酸アライメントについて作られた系統図を図42、43および44にそれぞれ示す。
HGBV−Ａ、ＢおよびＣの、NS5B領域内でコードされた、推定RdRpと、幾つかのHCV遺伝子型のRdRp、伝染性ウイルス二種、幾つかの代表的なフラヴィウイルス、および幾つかのポジティプストランドのRNA植物ウイルスとの間でのアミノ酸配列のアライメントは、それらがポジティプストランドRNAウイルスのRdRpに関連する保存された配列の特色を有することを示した（データは示していない）。類似の分析に基づき、HGBV−ＡとHGBV−Ｂでコードされたヘリカーゼは、これらのポジティプストランドのRNAウイルスのヘイカーゼと著しい相同性を示す（データは示していない）。例外は、ヘリカーゼ遺伝子を保有していないと推定されるCARMV、TCV、およびMNSVである〔グイレー・エッチ（Guilley,H）ら、（1985年）Nucleic Acids Res.13、6663〜6677〕。これらの結果は、以前の系統的分析によって示された、これらのウイルスのヘリカーゼとRdRp遺伝子のスーパーグループへの関連に鑑みると予期できない結果ではなかった〔クーニン・イー・ヴイ（Koonin,E.V.）およびドルジャ・ブイ・ヴイ（Dolja,V.V）（1993年）、Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28、375〜430〕。しかし、ヘリカーゼまたはRdRp配列（表31および33）の配列に基づくHGBV分離物とHCV分離物の間の系統的距離の調査は、これら２群の間には相当な隔たりがあることを示している。計算された隔たりは、HCV遺伝子型の間における近い関係を示し、２つの遺伝子型の間での最大距離は0.3696（RdRp距離）である。しかし、HGBV−Ａ、−Ｂ、または−ＣとHCV群の任意のメンバーとの間のRdRpから計算された距離は、0.96042〜1.46261である。同様に、任意の２つのHCV遺伝子型についてのヘリカーゼアライメントから計算された値は0.044555〜0.19706の範囲であるのに対し、HCV群の任意のメンバーとHGBV−Ａ、−Ｂ、または−Ｃとの間の距離は0.69130〜0.87120の範囲である。また、HCV遺伝子型とGBウイルスの完全な大きな開放読み枠の予想されるアミノ酸配列のアライメントは、HCV分離物の進化論的隔たりの範囲は狭く（0.17918〜0.39646）、一方、任意のGBウイルスと任意のHCV分離物の間の距離は最小でも1.68650であることを示す。したがって、GB肝炎ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型が示す範囲から外れた進化論的隔たりを示す。
HGBVおよびHCVの配列の系統的分析は、“HCV配列からのHGBV配列のダイバージェンスをHCV配列の間でのダイバージェンスとどの様にして比較できるか？特に、HCV配列相互のダイバージェンスよりもHCV配列からのHGBV配列のダイバージェンスの方が少ないのであろうか?"という疑問に答えようとするものである。もしHCV配列相互のダイバージェンスよりもHGBV配列のHCV配列からのダイバージェンスが小さいとしたら、満足しなければならない条件は、HGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、および／またはHGBV−Ｃの配列が、HCV配列の最も距離的に関連する対と同じ程度に、HCV配列の少なくとも一つと接近していることである（即ち、任意のHGBV配列から任意にHCV配列までの最小距離は、HCV配列の間で観察される最大値と等しいか小さい）。現在の配列データはこの条件を満たしていない。表31（RbRpアライメント）においては、最小HCV−HGBV距離は、最大HCV−HCVの距離の2.83倍であり、表32においては、最小HCV−HGBV距離は、最大HCV−HCVの距離の3.51倍である。したがって、データは、HGBV配列は、前に特徴づけしたHCV群のメンバーによってダイバージェンスが制限された群のメンバーであるとする着想を支持するものではない。
これらの相対距離は、ブートストラップに基づく試験を用いて調べることができる〔エフロン・ビー（Efron,B.）（1982年）、“ジャックナイフ、ブートストラップ、および他の再サンプリング計画”、Society Industrial and Applied Mathematics、フィラデルフィヤ、エルトン・ビー（Elton,B.）およびゴング・ジー（Gong,G.）、1983年）“ジャックナイフ、ブートストラップ、およびクロスバリデーションの楽しい研究"Am.Stat.37、36〜48〕。ブートストラップサンプリングから得られた結果を表32に示す。この表は、HCV−HGBVのダイバージェンス（全てのHCV−HGBV距離の内の最小値）のHCVダイバージェンス（全てのHCV−HCV距離の内の最大値）に対する比較を示すもので、PROTDISTプログラムを用いて計算したPAM距離に基づいている。配列アライメントにおけるカラムの1000のブートストラップ再サンプリングにおいて、HCV間の最大のダイバージェンスは、HCV配列からのHGBV配列のダイバージェンスの最小値を越えることは無かった（表34）。したがって、２つの分離した遺伝子からのコード領域のアライメントに基づく個々の測定においては、HCV遺伝子型の遺伝子配列のダイバージェンスの範囲内にHGBVの配列が入るという例は一つもない。慎重気味に推測するとしても、HGBVのためのデータを、HCV配列と同じ配列プールから引き出せる可能性は100,000に一つ未満である。

本研究で利用したHCV配列が、HCV遺伝子型の最も大きくダイバージェンスしたものを代表していると仮定すると、これらの結果は、HGBV−Ａ、Ｂ、およびＣがHCVの遺伝子型でないことを示している。また、HGBV−ＡとHGBV−Ｃの間の関係は、それらのHGBV−Ｂに対する関係に比べより近いようであり、これは、HGBV−ＡとHGBV−Ｃが異なったウイルスの系列を代表するものであることを示唆している。同様にHGBV−Ｂは、その独自のウイルス系列を代表する唯一のものである。分析されたウイルス配列の間の相対旋回距離は、図45および46に示した根のない系統図を調べることによって容易に明らかになる。系統図において枝の長さは進化論的距離に比例している。HCVウイルスが近い進化論的関係を持つことは明らかであり、分析を行なうにあたりコード化されたゲノム配列の一部を使用するか、ゲノムの全体を使用するかを選択することと一致している（図44）。HGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、およびHGBV−Ｃと、Flaviviridaeの他のメンバーとの間のダイバージェンスの程度が大きいことは、Ｃ型肝炎ウイルスに最も緊密に関係しているものの、GB作用物質はHCVの遺伝子型とは考えることはできず、実際にはフラヴィウイルス科内の新しいグループを代表するものであろうことを示している。
本発明は、試験試料中におけるHGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、およびHGBV−Ｃの存在を決定するための試薬と方法を提供するものである。本明細書に記載したHGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、およびHGBV−Ｃに特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチド（またはその断片）、またはこれらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドから産生される抗体は、一般に使用されているアッセイ用試薬と組み合わせることができ、また上記のウイルスに対する抗体を検出するための本アッセイ手順に組み込むことができ、これは本発明の範囲内と考えられるものである。あるいは、本明細書に記載したHGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、およびHGBV−Ｃに特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチド（またはその断片）、またはこれらのポリペプチドおよびポリヌクレオチド（またはその断片）から産生される抗体は、HGBV−Ａ、HGBV−Ｂ、およびHGBV−Ｃウイルスを検出するためにそれぞれ別個に使用できる。
本発明の他の用途または変種は、本明細書の開示を検討すれば当業者にとって明らかなもである。したがって、本発明は添付の請求の範囲のみによって限定されることを意図するものである。

【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:2
配列の長さ:12
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:3
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:4
配列の長さ:12
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:5
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:6
配列の長さ:12
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:7
配列の長さ:18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:8
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:9
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:10
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:11
配列の長さ:8912
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:12
配列の長さ:197
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:13
配列の長さ:207
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:14
配列の長さ:208
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:15
配列の長さ:230
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:16
配列の長さ:76
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:17
配列の長さ:291
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:18
配列の長さ:281
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:19
配列の長さ:93
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:20
配列の長さ:281
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:21
配列の長さ:221
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:22
配列の長さ:737
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:23
配列の長さ:307
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:24
配列の長さ:500
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:25
配列の長さ:479
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:26
配列の長さ:532
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:27
配列の長さ:306
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:28
配列の長さ:369
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:29
配列の長さ:337
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:30
配列の長さ:234
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:31
配列の長さ:73
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:32
配列の長さ:73
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:33
配列の長さ:73
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:34
配列の長さ:73
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:35
配列の長さ:73
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:36
配列の長さ:73
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:37
配列の長さ:245
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:38
配列の長さ:245
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:39
配列の長さ:245
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:40
配列の長さ:245
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:41
配列の長さ:245
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:42
配列の長さ:245
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:43
配列の長さ:102
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:44
配列の長さ:102
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:45
配列の長さ:101
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:46
配列の長さ:102
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:47
配列の長さ:102
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:48
配列の長さ:101
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:49
配列の長さ:177
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:50
配列の長さ:177
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:51
配列の長さ:176
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:52
配列の長さ:177
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:53
配列の長さ:177
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:54
配列の長さ:176
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:55
配列の長さ:102
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:56
配列の長さ:101
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:57
配列の長さ:101
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:58
配列の長さ:102
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:59
配列の長さ:101
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:60
配列の長さ:101
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:61
配列の長さ:123
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:62
配列の長さ:122
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:63
配列の長さ:122
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:64
配列の長さ:123
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:65
配列の長さ:122
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:66
配列の長さ:122
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:67
配列の長さ:112
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:68
配列の長さ:112
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:69
配列の長さ:111
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:70
配列の長さ:112
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:71
配列の長さ:112
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:72
配列の長さ:111
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:73
配列の長さ:795
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomoic DNA
配列

配列番号:74
配列の長さ:265
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:75
配列の長さ:264
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:76
配列の長さ:264
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:77
配列の長さ:265
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:78
配列の長さ:264
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:79
配列の長さ:264
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:80
配列の長さ:4268
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:81
配列の長さ:1422
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:82
配列の長さ:1422
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:83
配列の長さ:1422
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:84
配列の長さ:1422
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:85
配列の長さ:1422
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:86
配列の長さ:1422
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:87
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:88
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:89
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:90
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:91
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:92
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:93
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:94
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:95
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:96
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:97
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:98
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:99
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:100
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:101
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:102
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:103
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:104
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:105
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:106
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:107
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:108
配列の長さ:19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:109
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:110
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:111
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:112
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:113
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:114
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:115
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:116
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:117
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:118
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:119
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:120
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:121
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:122
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:123
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:124
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:125
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:126
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:127
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:128
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:129
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:130
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:131
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:132
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:133
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:134
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:135
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:136
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:137
配列の長さ:20
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:138
配列の長さ:21
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:139
配列の長さ:24
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:140
配列の長さ:23
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:141
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:142
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:143
配列の長さ:24
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:144
配列の長さ:23
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:145
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:146
配列の長さ:20
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:147
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:148
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:149
配列の長さ:21
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:150
配列の長さ:21
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:151
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:152
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:153
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:154
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:155
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:156
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配列の型：核酸
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:157
配列の長さ:21
配列の型：核酸
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:158
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配列の型：核酸
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:159
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配列の型：核酸
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:160
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配列の型：核酸
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:161
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:162
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:163
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:164
配列の長さ:9493
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..9493
配列

配列番号:165
配列の長さ:51
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:166
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:167
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:168
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:169
配列の長さ:47
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:170
配列の長さ:40
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:171
配列の長さ:94
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:172
配列の長さ:41
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:173
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:174
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:175
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:176
配列の長さ:6
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配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:177
配列の長さ:24
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:178
配列の長さ:54
配列の型：アミノ酸
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配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:179
配列の長さ:46
配列の型：アミノ酸
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配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:180
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:181
配列の長さ:25
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:182
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:183
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:184
配列の長さ:19
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:185
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:186
配列の長さ:19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:187
配列の長さ:3
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:188
配列の長さ:81
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:189
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:190
配列の長さ:134
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:191
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:192
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:193
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:194
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:195
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:196
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:197
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:198
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:199
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:200
配列の長さ:45
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:201
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:202
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:203
配列の長さ:28
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:204
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:205
配列の長さ:54
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:206
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:207
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:208
配列の長さ:71
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:209
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:210
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:211
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:212
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:213
配列の長さ:68
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:214
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:215
配列の長さ:50
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:216
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:217
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:218
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:219
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:220
配列の長さ:19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:221
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:222
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:223
配列の長さ:112
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:224
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:225
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:226
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:227
配列の長さ:106
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:228
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:229
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:230
配列の長さ:65
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:231
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:232
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:233
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:234
配列の長さ:72
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:235
配列の長さ:78
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:236
配列の長さ:35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:237
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:238
配列の長さ:52
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:239
配列の長さ:38
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:240
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:241
配列の長さ:50
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:242
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:243
配列の長さ:25
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:244
配列の長さ:31
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:245
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:246
配列の長さ:36
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:247
配列の長さ:42
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:248
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:249
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:250
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:251
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:252
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:253
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:254
配列の長さ:111
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:255
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:256
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:257
配列の長さ:46
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:258
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:259
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:260
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:261
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:262
配列の長さ:61
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:263
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:264
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:265
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:266
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:267
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:268
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:269
配列の長さ:9493
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:2..9493
配列

配列番号:270
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:271
配列の長さ:24
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:272
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:273
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:274
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:275
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:276
配列の長さ:74
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:277
配列の長さ:88
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:278
配列の長さ:25
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:279
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:280
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:281
配列の長さ:83
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:282
配列の長さ:20
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:283
配列の長さ:65
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:284
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:285
配列の長さ:22
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:286
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:287
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:288
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:289
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:290
配列の長さ:25
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:291
配列の長さ:50
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質

配列
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

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配列の種類：タンパク質

配列：
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配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
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配列番号:313
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:314
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配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
配列：

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配列の種類：タンパク質
配列：

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配列の種類：タンパク質
配列：

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配列の種類：タンパク質
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配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:321
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:323
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:324
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:325
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

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配列の長さ:7
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配列の種類：タンパク質
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配列番号:328
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:329
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:330
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:331
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配列の種類：タンパク質
配列：

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配列の種類：タンパク質
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:334
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:335
配列の長さ:70
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:336
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:337
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配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:338
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トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:339
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:340
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:341
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:342
配列の長さ:32
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:343
配列の長さ:20
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:344
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:345
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:346
配列の長さ:47
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:347
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:348
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:349
配列の長さ:51
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:350
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:351
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:352
配列の長さ:30
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:353
配列の長さ:30
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:354
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:355
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:356
配列の長さ:22
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:357
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:358
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:359
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:360
配列の長さ:35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:361
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:362
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:363
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:364
配列の長さ:53
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:365
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:366
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:367
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:368
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:369
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:370
配列の長さ:13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:371
配列の長さ:30
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:372
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:373
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:374
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:375
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:376
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:377
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:378
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:379
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:380
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:381
配列の長さ:66
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:382
配列の長さ:39
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:383
配列の長さ:61
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:384
配列の長さ:41
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:385
配列の長さ:9493
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:3..9493
配列

配列番号:386
配列の長さ:67
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:387
配列の長さ:2972
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:388
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:389
配列の長さ:25
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:390
配列の長さ:2973
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:391
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:392
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:393
配列の長さ:9143
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:394
配列の長さ:234
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:395
配列の長さ:479
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:396
配列の長さ:9143
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:5′UTR
存在位置:1..445
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:446..9037
配列の特徴
特徴を表す記号:3′UTR
存在位置:9038..9143
配列

配列番号:397
配列の長さ:2864
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:398
配列の長さ:200
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:399
配列の長さ:100
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:400
配列の長さ:9034
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..9034
配列：

配列番号:401
配列の長さ:19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:402
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:403
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:404
配列の長さ:2905
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:405
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:406
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:407
配列の長さ:9034
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:2..9034

配列番号:408
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:409
配列の長さ:39
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:410
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:411
配列の長さ:75
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:412
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:413
配列の長さ:76
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:414
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:415
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:416
配列の長さ:125
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:417
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:418
配列の長さ:36
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:419
配列の長さ:22
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:420
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:421
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:422
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:423
配列の長さ:56
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:424
配列の長さ:54
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:425
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列：

配列番号:426
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:427
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:428
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:429
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:430
配列の長さ:41
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:431
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:432
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:433
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:434
配列の長さ:41
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:435
配列の長さ:63
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:436
配列の長さ:19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:437
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:438
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:439
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:440
配列の長さ:68
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:441
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:442
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:443
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:444
配列の長さ:59
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:445
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:446
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:447
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:448
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:449
配列の長さ:13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:450
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:451
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:452
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:453
配列の長さ:77
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:454
配列の長さ:60
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:455
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:456
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:457
配列の長さ:72
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:458
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:459
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:460
配列の長さ:28
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:461
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:462
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:463
配列の長さ:24
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:464
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:465
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:466
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:467
配列の長さ:200
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:468
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:469
配列の長さ:30
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:470
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:471
配列の長さ:40
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:472
配列の長さ:61
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:473
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:474
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:475
配列の長さ:69
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:476
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:477
配列の長さ:59
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:478
配列の長さ:35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:479
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:480
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:481
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:482
配列の長さ:75
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:483
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:484
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:485
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:486
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:487
配列の長さ:45
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:488
配列の長さ:28
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:489
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:490
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:491
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:492
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:493
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:494
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:495
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:496
配列の長さ:13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:497
配列の長さ:55
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:498
配列の長さ:43
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:499
配列の長さ:43
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:500
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:501
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:502
配列の長さ:74
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:503
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:504
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:505
配列の長さ:9034
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列の特徴
特徴を示す記号:CDS
存在位置:3..9034
配列

配列番号:506
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:507
配列の長さ:12
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:508
配列の長さ:65
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:509
配列の長さ:37
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:510
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:511
配列の長さ:33
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:512
配列の長さ:61
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:513
配列の長さ:47
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:514
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:514
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:515
配列の長さ:73
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:516
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:517
配列の長さ:66
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:518
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:519
配列の長さ:51
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:520
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:521
配列の長さ:47
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:522
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:523
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:524
配列の長さ:44
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:525
配列の長さ:147
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:526
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:527
配列の長さ:24
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:528
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:529
配列の長さ:91
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:530
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:531
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:532
配列の長さ:35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:533
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:534
配列の長さ:44
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:535
配列の長さ:7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:536
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:537
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:538
配列の長さ:30
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:539
配列の長さ:50
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:540
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:541
配列の長さ:56
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:542
配列の長さ:42
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:543
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:544
配列の長さ:41
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:545
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:546
配列の長さ:40
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:547
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:548
配列の長さ:40
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:549
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:550
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:551
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:552
配列の長さ:20
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:553
配列の長さ:17
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:554
配列の長さ:51
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:555
配列の長さ:11
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:556
配列の長さ:15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:557
配列の長さ:40
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:558
配列の長さ:58
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:559
配列の長さ:28
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:560
配列の長さ:131
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:561
配列の長さ:47
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:562
配列の長さ:26
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:563
配列の長さ:22
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:564
配列の長さ:21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:565
配列の長さ:60
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:566
配列の長さ:13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:567
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:568
配列の長さ:4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:569
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:570
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:571
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:572
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:573
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:574
配列の長さ:38
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:575
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:576
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:577
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:578
配列の長さ:28
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:579
配列の長さ:5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:580
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:581
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:582
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:583
配列の長さ:55
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:584
配列の長さ:36
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:585
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:586
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:587
配列の長さ:16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:588
配列の長さ:6
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:589
配列の長さ:19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:590
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:591
配列の長さ:29
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:592
配列の長さ:24
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:593
配列の長さ:45
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:594
配列の長さ:9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:595
配列の長さ:13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:596
配列の長さ:14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:597
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:598
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:599
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:600
配列の長さ:39
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:601
配列の長さ:8
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:602
配列の長さ:10
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:603
配列の長さ:60
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:604
配列の長さ:13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:605
配列の長さ:47
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:606
配列の長さ:18
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:607
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:608
配列の長さ:33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:609
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:610
配列の長さ:507
配列の型：アミノ酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:611
配列の長さ:522
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:612
配列の長さ:118
配列の型：アミノ酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:613
配列の長さ:118
配列の型：アミノ酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:614
配列の長さ:222
配列の型：アミノ酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号:615
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:616
配列の長さ:38
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:617
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:618
配列の長さ:38
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の長さ:34
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:622
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配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:623
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:632
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:633
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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:648
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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:661
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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:663
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:664
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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:666
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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:668
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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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配列の種類:Genomic DNA
配列

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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:674
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配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:675
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配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:676
配列の長さ:19
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:677
配列の長さ:156
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:678
配列の長さ:156
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:679
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:680
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:681
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:682
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:683
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:684
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:685
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:686
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:687
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:688
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:689
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:690
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:691
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:692
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:693
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:694
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:695
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:696
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:697
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:698
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:699
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:700
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:701
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:702
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:703
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:704
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:705
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:706
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:707
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:708
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:709
配列の長さ:33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:710
配列の長さ:34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:711
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:712
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:713
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:714
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:714
配列の長さ:19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:715
配列の長さ:18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:716
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:717
配列の長さ:199
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:718
配列の長さ:199
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:719
配列の長さ:199
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

配列番号:720
配列の長さ:199
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列の種類:Genomic DNA
配列

Background of the Invention
The present invention provides a group of infectious viral agents that cause hepatitis in humans, particularly polynucleotides derived from such viruses, polypeptides encoded by them, antibodies that specifically bind to such polypeptides, and The present invention relates to diagnostic agents and vaccines using such materials.
Hepatitis is one of the most important diseases transmitted from donor to recipient by blood product transfusion, organ transplantation and hemodialysis. Hepatitis can also be transmitted by ingesting contaminated food and water or by contact between people. Viral hepatitis comprises a group of viral substances with unique viral genes and modes of replication, and is known to cause hepatitis, although the degree of liver damage varies by various routes of infection. Acute viral hepatitis is clinically diagnosed by jaundice, hepatic tenderness, and certain patient conditions including elevated levels of hepatic transaminases such as aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), and isocitrate dehydrogenase (ISD) However, it may not be clinically apparent. Examples of the viral hepatitis substance include hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis δ virus (HDV), hepatitis E virus (HEV), and Epstein-Barr. Virus (EBV), and cytomegalovirus (CMV).
A specific serum assay, available in the late 1960s, that screens donated blood for the presence of HBV surface antigen (HBsAg), has shown good results in reducing the incidence of post-transfusion hepatitis (PTH) in blood recipients Although given, PTH continues to occur at a significant rate. H.J.Alter et al.Ann.Int.Med.77: 691-699 (1972); H.J.Alter et al.,Lancet  ii: 838-841 (1975). Researchers have reported that "non-A non-B hepatitis," which causes viral hepatitis independently of exposure to viruses known to cause hepatitis in humans (HAV, HBV, CMV and EBV). I started looking for a new substance named (NANBH). For example, S.M.Feinstone et al.New Engl.J.Med.292: 767-770 (1975); editor anonymous,Lancet  ii: 64-65 (1975); F.B.Hollinger and D.M.Knipe of B.N.Fields et al.Virology, Raven Press, New York, pp. 2239-2273 (1990).
Multiple occurrences of acute NANBH in intravenous drug users; intrinsic post-infection latency of patients who acquired NANBH after transfusion; results of cross-challenge experiments; ultrastructural hepatopathological analysis of infected chimpanzees; Some epidemiological and experimental evidence indicates the presence of one or more parenterally-infected NANB substances, including differences in resistance to chloroform in sham patients. J.L.Dienstag,Gastroe nterology  85: 439-462 (1983); J.L.Dienstag,Gastro enterology  85,743-768 (1983); F.B.Hollinger et al.,J.Infect.Dis.142: 400-407 (1980); F. Chisari, edited by D.W. Bradley,Advances in Hepatitis Research, Masson, New York, pp. 268-280 (1984); and D.W. Bradley et al.J.Infect.Dis.148: 254-265 (1983).
Serum samples obtained from surgeons who developed acute hepatitis have been shown to induce hepatitis when inoculated into tamarin (Saguinus species). All four of the four tamarins developed elevated liver enzymes within weeks after inoculation, indicating that substances in the surgeon's serum may have induced hepatitis in the tamarins. By successive passage in various non-human primates, this hepatitis was found to be caused by an infectious agent, and filtration experiments indicated that the agent was viral. The infectious agent that caused hepatitis in the above surgeons and tamarins was named "GB Agent (GBagent)". F. Deinhardt et al.J.Expe r.Med.125: 673-688 (1967); F. Dienhardt et al.J.Exper. Med., Supra; E. Tabor et al.J.Med.Virol.5: 103-108 (1980); R.O. Whittington et al.Viral and Immunological Diseases in Nonhuman Primates, Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 221-224 (1983).
It has been shown that the GB substance can be a substance that causes NANBH in humans, and that the GB substance is not related to known NANBH substances that have been studied in various laboratories, but that the critical No final work is known, no viral material has been discovered, and no molecular characterization has been performed. F. Deinhardt et al.Am.J.Med.Sc i.270: 73-80 (1975); and J.L. Dienstag et al.Nature  264: 260-261 (1976). E. Tabor et al.J.Med.Virol., Supra; E. Tabor et al.J.Infect.Dis.140: 794-797 (1979); R.O. Whittington et al., Supra; and P.Karayiannis et al.Hepa tology  9: 186-192 (1989).
Earlier studies found that the GB substance was unrelated to any known human hepatitis virus. S.M.Feinstone et al.Science  182: 1026-1028 (1973); P.J.Provost et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.148; 532-539 (1975); J.L.Melnick,Intervirology  18: 105-106 (1982); A.W. Holmes et al.,Nature  243: 419-420 (1973); and F. Deinhardt et al.Am.J.Med.Sci., Supra. However, whether the GB substance is a virus that induces hepatitis infection in humans, or is activated by GB serum, and once activated, potential tamarins that readily pass to other tamarins and induce hepatitis in them The question was whether it was a virus. Also, a very small proportion of marmosets inoculated with GB-positive sera did not clinically develop hepatitis (4 of 52, 7.6%), and such animals may have had innate immunity, It has also been shown that the GB material can be a marmoset virus. W.P.Parks et al.J.Infect.Dis.120: 539-547 (1969); W.P.Parks et al.,J.Infect.Dis.120: 548-559 (1969). Morphological studies are ambiguous, and an immunoelectron microscopy study in one report shows that the GB material forms an immune complex with a size distribution of 20-22 nm, similar to the parvovirus sphere structure In other studies, however, immunoelectron microscopy data obtained from liver homogenates of GB-positive tamarins detected icosahedral symmetrical 34-36 nm aggregates, indicating that the GB substance was a calici-like virus. Is reported. For example, J.D.Almeida et al.Nature  261: 608-609 (1976); J.L.Dienstag et al.NatureSee above.
Two types of hepatitis-causing viruses have recently been discovered and reported, mainly HCV caused by parenteral infection and HEV that infects the gut. For example, Q.L.Choo et al.Science  244: 359-362 (1989), G. Kuo et al.Science  244: 362-364 (1989), EP 0 318 216 (published March 31, 1989), G.R.Reyes et al.,Science  247: 1335-1339 (1990). HCV is responsible for the majority of PTH that is attributed to NANBH substances and for many non-transfusion-related acute NANBH. Editor secretary,Lancet  335: 1431-1432 (1990); J.L.Dienstag,Gastroenterology  99: 1177-1180 (1990); and M. J. Alter et al.,JAMA  264: 2232-1235 (1990).
Detection of HCV antibodies in donor samples excludes 70-80% of NANBH-infected blood in the blood supply system, but the discovery and detection of HCV does not completely prevent hepatitis infection. H. Alter et al.New Eng.J.Med.321: 1494-1500 (1989). Recent literature has questioned whether other hepatitis substances may be responsible for PTH, and for population-acquired acute and / or chronic hepatitis unrelated to PTH. For example, of the 181 patients monitored in a prospective clinical specimen survey conducted in France between 1988 and 1990, the investigators described a total of 18 PTH cases. Thirteen of these 18 patients were negative for anti-HCV antibodies, HBsAg, HBV and HCV nucleic acids. The authors speculated the potential importance of non-A, non-B, non-C substances that cause PTH. V. Thiers et al.J.Hepatology  18: 34-39 (1993). Of the 1,476 patients monitored in another survey in Germany between 1985 and 1988, 22 recorded PTH cases were not associated with HBV or HCV infection. T. Peters et al.J. Med.Virol.39: 139-145 (1993).
Use of substances derived from a new and unique group of viruses that cause hepatitis, such as polynucleotides, recombinant and synthetic polypeptides encoded therein, antibodies that specifically bind to such polypeptides, and use of such substances It would be advantageous to identify and provide diagnostics and vaccines. Such substances significantly improve the ability of medical institutions to more accurately diagnose acute and / or chronic viral hepatitis and to detect non-A, non-B and non-C hepatitis in donated blood and organs. Would provide safer blood and organs.
Summary of the Invention
The present invention relates to a purified polynucleotide or a fragment thereof derived from HGBV capable of selectively hybridizing to the genome of hepatitis GB virus (HGBV) or its complement, comprising HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. An amino acid sequence having at least 35% identity, more preferably 40% identity, even more preferably 60% identity, and most preferably 80% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of: A purified polynucleotide or a fragment thereof characterized by a positive-sense RNA genome comprising an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein comprising: Also provided is a recombinant polynucleotide or fragment thereof derived from HGBV that is capable of selectively hybridizing to the genome of the Hepatitis GB virus (HGBV) or its complement, wherein said nucleotide comprises at least one of HGBV. The recombinant nucleotide comprises an amino acid sequence having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. It features a positive-stranded RNA genome that includes an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein. Such a recombinant polynucleotide is contained in a recombinant vector, and further constitutes a host cell transformed with the vector.
The present invention relates to a recombinant HGBV polynucleotide or a fragment thereof comprising a nucleotide sequence derived from the Hepatitis GB virus (HGBV) genome, which is contained in a recombinant vector and further transformed with the vector. A HGBV recombinant polynucleotide or a fragment thereof comprising a cell, wherein said sequence encodes an epitope of HGBV. The HGBV recombinant polynucleotide is an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein comprising an amino acid sequence having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. And characterized by a positive-stranded RNA genome containing The present invention relates to a recombinant expression system comprising a DNA or RNA open reading frame derived from the hepatitis GB virus (HGBV), wherein the open reading frame contains a HGBV genomic or cDNA sequence, and the open reading frame is Provided is a recombinant expression system operably linked to a control sequence compatible with the desired host, and further comprising cells transformed with the recombinant expression system and lengths produced by the cells. Provides a polypeptide of at least about 8 amino acids.
The present invention further provides a preparation of a hepatitis GB virus (HGBV) polypeptide or fragment thereof, ie, at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C; More preferably comprises an amino acid sequence characterized by a positive stranded RNA genome comprising an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein comprising an amino acid sequence having a 40% identity, even more preferably a 60% identity, or a fragment thereof. A purified HGBV comprising a recombinant polypeptide is provided. Polyclonal and monoclonal antibodies, and fusion polypeptides comprising at least one hepatitis GB virus (HGBV) polypeptide or fragment thereof, amino acid sequences capable of forming particles when produced in a eukaryotic or prokaryotic host A particle that is immunogenic against hepatitis GB (HGBV) infection, comprising a non-HGBV polypeptide having at least one HGBV epitope, and HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C. A polynucleotide probe for the hepatitis GB virus (HGBV), characterized by a positive RNA genome comprising an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein comprising an amino acid sequence having at least 35% identity to the selected amino acid sequence. Provided.
An assay kit and method for producing a polypeptide comprising at least one hepatitis GB virus (HGBV) epitope, comprising at least 35 amino acid sequences selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. %. A host cell transformed with an expression vector comprising a sequence encoding a polypeptide characterized by a positive RNA genome comprising an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein comprising an amino acid sequence having a percent identity Assay kits and methods comprising incubating are also provided. Further, there are provided methods for detecting HGBV nucleic acids, antigens and antibodies in a test sample, including methods using solid phases, recombinant or synthetic peptides, or probes. In addition, the individual is administered a vaccine, a tissue culture grown cell infected with the hepatitis GB virus (HGBV), an isolated immunogenic polypeptide or fragment thereof containing at least one HGBV epitope sufficient to generate an immune response. A method for producing an antibody against the hepatitis GB virus (HGBV), comprising: Further provided is a diagnostic reagent comprising a polynucleotide or polypeptide or a fragment thereof.
[Brief description of the drawings]
Figures 1 to 12 are graphs plotting the amount (mU / ml) of individual tamarin liver enzymes (ALT or ICD) against time (weeks after inoculation). In the graph, ALT CO indicates an ALT cutoff value, and ICD OD indicates an ICD cutoff value. here,
FIG. 1 shows a graph of Tamarin T-1053,
FIG. 2 shows a graph of Tamarin T-1048,
FIG. 3 shows a graph of Tamarin T-1057,
FIG. 4 shows a graph of Tamarin T-1061,
FIG. 5 shows a graph of Tamarin T-1047,
FIG. 6 shows a graph of Tamarin T-1042,
FIG. 7 shows a graph of Tamarin T-1044,
FIG. 8 shows a graph of Tamarin T-1034,
FIG. 9 shows a graph of Tamarin T-1055,
FIG. 10 shows a graph of Tamarin T-1051,
FIG. 11 shows a graph of Tamarin T-1038,
FIG. 12 shows a graph of Tamarin T-1049.
FIG. 13 shows a flowchart of the steps involved in a representational difference analysis (RDA) used to identify clones.
FIG. 14 shows a ethidium bromide stained 2.0% agarose gel of the product obtained by representative difference analysis (RDA) performed on pre-inoculation and acute HGBV infected tamarin plasma.
FIG. 15 shows a Southern blot autoradiogram of genomic DNA, amplicon DNA, and product from the first three subtraction / hybridization runs.
FIG. 16 is the same autoradiogram as shown in FIG. 15, except that another radiolabeled probe was used.
FIG. 17 shows a ethidium bromide stained 1.5% agarose gel of a polymerase chain reaction (PCR) amplification product derived from genomic DNA.
FIG. 18 shows an autoradiogram obtained by Southern blot of the 1.5% agarose gel of FIG.
FIG. 19 shows a ethidium bromide stained 1.5% agarose gel of RT-PCR products obtained from normal human serum and pre-inoculation and acute tamarin plasma.
FIG. 20 shows an autoradiogram obtained from a Southern blot of the same gel as shown in FIG.
FIGS. 21A and 21B show autoradiograms of Northern blots of total cellular RNA extracted from uninfected and HGBV-infected tamarin livers.
FIG. 22 shows that each recombinant polynucleotide isolate is present in a continuous RNA species.
Figures 23A-C show dot plot analysis of nucleic acid sequences. here,
FIG. 23A shows a dot blot comparison of HGBV-A;
FIG. 23B shows a dot blot comparison of HGBV-B;
FIG. 23C shows a dot blot comparison of HGBV-A versus HGBV-B.
Figures 24A-B show conserved residues as follows.
FIG. 24A shows the conserved residues in the putative NTP-binding helicase domain of the putative translation products of HGBV-A, HGBV-B and HCV-1 NS3;
FIG. 24B shows the conserved residues of the RNA-dependent RNA polymerase domain of the putative translation products of HGBV-A, HGBV-B and HCV-1 NS5b.
Figures 25A-B show Coomassie stained 10% SDS-polyacrylamide gels of CKS fusion protein whole cell lysates. Three CKS fusion proteins are immunoreactive with HGBV infected tamarin serum.
Figures 26-30 show individual tamarins: 1) Amount of liver enzyme (ALT) (mU / ml) versus time (weeks after inoculation) (indicated by solid line); 2) ELISA for CKS-1.7 recombinant protein Absorption value (indicated by a black circle connected by a dotted line); 3) ELISA absorption value of CKS-1.4 recombinant protein (indicated by an open circle connected by a dotted line); 4) ELISA absorption value of CKS-4.1 recombinant protein (dotted line) 5) Negative PCR results using primers of SEQ ID NO: 21 (shown by solid squares); 6) Positive PCR results using primers of SEQ ID NO: 21 (shown by black squares) 7) Negative PCR results using primers of SEQ ID NO: 26 (shown as open diamonds); 8) Positive PCR results using primers of SEQ ID NO: 26 (shown as open diamonds); 9) Inoculation It is the graph which plotted the data (indicated by the arrowhead). here,
FIG. 26 shows a graph of Tamarin T-1048;
Figure 27 shows a graph of Tamarin T-1057;
FIG. 28 shows a graph of Tamarin T-1061;
FIG. 29 shows a graph of Tamarin T-1051;
FIG. 30 shows a graph of Tamarin T-1034.
Figures 31-34 show 1) the amount of liver enzyme (ALT) (mU / ml) versus time (weeks after inoculation) (shown by the solid line) for human test samples; 2) ELISA for CKS-1.7 recombinant protein. It is a graph plotting absorption values (indicated by black circles connected by dotted lines); 3) ELISA absorption values of CKS-1.4 recombinant protein (indicated by open circles connected by dotted lines). here,
FIG. 31 shows a graph of patient 101;
FIG. 32 shows a graph of patient 257;
FIG. 33 shows a graph of patient 260;
FIG. 34 shows a graph of patient 340.
FIG. 35 shows the conserved residues. here,
FIG. 35A shows the conserved residues of the putative NTP-binding helicase domain of the putative translation products of Contig.A, Contig.B and HCV-1 NS3;
FIG. 35B shows the conserved residues of the RNA-dependent RNA polymerase domain of the putative translation products of Contig.A, Contig.B and HCV-1 NS5b.
FIG. 36 shows the nucleotide alignment of HGBV-A, HGBV-B, HGBV-C and HCV-1.
FIG. 37 shows a PhosphoImage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.) Obtained from a Southern blot of PCT products after hybridization using a radiolabeled probe derived from GB-C.
FIG. 38 shows the nucleotide alignment of HGBV-C with the two variant clones.
FIG. 39 shows a schematic of Contig after assembly of HGBV-C.
FIG. 40 shows the nucleotide alignment of HGBV-C with the four variant clones.
FIG. 41 shows a PhosphoImage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.) Of a Southern blot of a PCT product generated from a Canadian hepatitis patient after hybridization using a radiolabeled probe from a Canadian patient GB-C.5. Show.
FIG. 42 shows the phylogenetic tree generated from the alignment of the helicase domains of the described viruses.
FIG. 43 shows SCOTT, a phylogenetic tree generated from an alignment of the RNA-dependent RNA polymerase domains of the described viruses.
FIG. 44 shows the phylogenetic tree generated from the alignment of the large open reading frame (putative precursor polyprotein) of the described viruses.
Details of the Invention
The present invention relates to the characterization of newly identified pathogenic substances that induce non-A, non-B, non-C, non-D, and non-E hepatitis, collectively referred to as "hepatitis GB virus" or "HGBV". Provide the law. The present invention provides a method for determining the presence of an HGBV etiological agent, an infectious serum from a human or tamarin individual infected with HGBV, a nucleic acid of an etiological agent produced from plasma or liver homogenate, which has been isolated so far. The present invention provides a method for detecting a newly synthesized antigen from the genome of a non-infected viral substance and selecting a clone that has produced a product found only in infected individuals as compared to uninfected individuals.
Portions of the nucleic acid sequence derived from HGBV are useful as probes for determining the presence of HGBV in a test sample and for isolating natural variants. Such a sequence can provide the polypeptide sequence of the HGBV antigen encoded in the HGBV genome, and can also produce a polypeptide useful as a diagnostic test standard or reagent and / or as a component of a vaccine. Monoclonal and polyclonal antibodies against at least one epitope contained within such a polypeptide sequence are also useful in diagnostic tests and therapeutics, in screening for antiviral substances, in isolating the HGBV substance from which such nucleic acid sequences are derived. It is. Isolation and sequencing of other portions of the HGBV genome can also be performed by using probes or PCR primers derived from such nucleic acid sequences, and thus preventive and therapeutic agents in the diagnosis and / or treatment of HGBV. Other probes and polypeptides of HGBV that will be useful as can be produced.
According to one embodiment of the present invention, a purified HGBV polynucleotide, a recombinant HGBV polynucleotide, a recombinant polynucleotide comprising a sequence derived from the HGBV genome, a recombinant polypeptide encoding an epitope of HGBV, an epitope of HGBV, Provided are an encoded synthetic peptide, a recombinant vector containing any of the above recombinant polypeptides, and host cells transformed with such a vector. These recombinant polypeptides and synthetic peptides can be used alone or in combination, or can be used together with other substances that provide an epitope of HGBV.
In another aspect of the present invention, there is provided purified HGBV, a preparation of a polypeptide derived from purified HGBV, a purified HGBV polypeptide, a purified polypeptide comprising an epitope immunologically identical to an epitope contained in HGBV. .
In yet another embodiment of the present invention, a recombinant expression comprising an open reading frame (ORF) of DNA derived from the HGBV genome or HGBV cDNA, operably linked to control sequences compatible with the desired host. Provided are systems, cells transformed with the recombinant expression system, and polypeptides produced by the transformed cells.
Another embodiment of the present invention provides a method for preparing at least one recombinant HGBV polypeptide, at least one recombinant polypeptide comprising a sequence derived from an HGBV genome or HGBV cDNA, at least one recombinant polypeptide comprising an HGBV epitope, At least one fusion polypeptide comprising the polypeptide.
The invention further provides a method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to at least one epitope of HGBV, a purified preparation of a polyclonal antibody that specifically binds to at least one HGBV epitope, and diagnostic, prophylactic and therapeutic uses. A method of using such an antibody is provided.
In yet another embodiment of the present invention, comprising a non-HGBV polypeptide having an amino acid sequence capable of forming particles when produced in a eukaryotic host, and an HGBV epitope, the immunogenicity against HGBV infection. Are provided.
In addition, polynucleotide probes for HGBV are provided.
The present invention relates to a reagent, which can be used to detect the presence and / or amount of a polynucleotide derived from HGBV in a suitable container, wherein the reagent is derived from HGBV consisting of about 8 or more nucleotides. A reagent containing a polynucleotide probe containing a nucleotide sequence; a reagent for detecting the presence and / or amount of an HGBV antigen, contained in a suitable container, containing an antibody against the HGBV antigen to be detected; A kit for detecting the presence and / or amount of an antibody against an HGBV antigen, which is contained in a container, comprising a reagent containing a polypeptide containing an HGBV epitope present in the HGBV antigen. Other kits for various assay formats are also provided by the invention described herein.
Other embodiments of the present invention include a polypeptide comprising at least one HGBV epitope attached to a solid phase and an antibody against the HGBV epitope attached to a solid phase. Further, the method comprises incubating a host cell transformed with an expression vector containing a sequence encoding a polypeptide containing an HGBV epitope under conditions that allow expression of the polypeptide, comprising the steps of: The present invention also includes a method for producing a peptide and a polypeptide containing an HGBV epitope produced by the method.
The invention further provides assays that use the recombinant or synthetic polypeptides of the invention and the antibodies of the invention in a variety of formats, both of which can use signal producing compounds. Assays that do not use a signal producing compound to provide a means of detection are also provided. All assays described usually detect either antigen or antibody or both, and contact a test sample with at least one reagent of the invention to form at least one antigen / antibody complex. And detecting the presence of the complex. Such an assay will be described in detail.
Use of an immunogenic peptide comprising an HGBV epitope, or a vaccine for treating HGBV infection comprising an inactivated preparation of HGBV, or an attenuated preparation of HGBV, or a recombinant vaccine expressing an HGBV epitope, and / or a synthetic peptide Is also included in the present invention. Combinations of these immunogenic peptides may be used in an effective vaccine (eg, a cocktail of recombinant antigen, synthetic peptide and natural viral antigen may be administered simultaneously or at different times). Some of these can be used alone, while others can be supplemented later with a separate immunogenic epitope. Further, the present invention provides a method of producing antibodies to HGBV, comprising administering to an individual an isolated immunogenic polypeptide comprising an HGBV epitope in an amount sufficient to generate an immune response in the inoculated individual. Method is also included.
Furthermore, tissue culture proliferating cells infected with HGBV are also provided by the present invention.
In yet another aspect of the present invention, there is provided a method of isolating DNA or cDNA derived from the genome of an unidentified infectious agent, the method comprising representingal difference analysis (RDA). This is a unique improvement method, which will be described later.
Definition
As used herein, the term "hepatitis GB virus" or "HGBV" refers to a virus species that causes non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis in humans, and derived therefrom. Genetically indicates attenuated strains or defective interfering particles. This may further include acute viral hepatitis transmitted by contaminated food, drinking water, etc .; HGBV transmitted by human contact (including sexual activity, respiratory and parenteral transmission) or intravenous drug use. Hepatitis to be included. According to the method of the present invention, an individual who has acquired HGBV can be identified. Individually, the HGBV isolates are specifically referred to as "HGBV-A", "HGBV-B" and "HGBV-C". As used herein, the HGBV genome consists of RNA. Analysis of the nucleotide and deduced amino acid sequences of HGBV reveal that this group of viruses has a similar genomic organization to the Flaviridae family. Basically, but not absolutely, based on similarities in genomic organization, the International Committee on the Taxonomy of Viruses recommends that this family consist of three genera: Flavivirus, Pestivirus, and Hepatitis C group. . Searching for similarities at the amino acid level, it can be seen that the sequence of the hepatitis GB virus subclone is similar, albeit slightly, to that of the hepatitis C virus. The information provided here is sufficient to classify other strains of HGBV.
There is some evidence that HGBV-C is not a genotype of HCV. First, serum containing the HGB-C sequence was tested for the presence of HCV antibodies. Conventional methods of detecting individuals exposed or infected with HCV rely on antibody tests using antigens derived from three or more regions from HCV-1. Such tests can detect antibodies to known HCV genotypes (eg, Sakamoto et al.,J. Gen.Virol.75: 1761-1768 (1994) and Stuyver et al.J.Ge n.Virol.74: 1093-1102 (1993)). HCV-specific ELISA failed to detect serum containing the GB-C sequence in six of eight cases. Second, some human sera that are seronegative for HCV antibodies were found to be positive for HCV genomic RNA by a sensitive RT-PCR assay (Sugitani,Lancet  339: 1018-1019 (1992)). This assay failed to detect HCV RNA in 7 out of 8 sera containing the HGB-C sequence (Table A). That is, HGBV-C is not a genotype of HCV by either serological or molecular assays.
A portion of the putative translation product of HGB-C in the helicase region was aligned with the homologous regions of HGBV-A, HGBV-B, HCV-1, and another member of Flaviviridae, and the matched sequences were phylogenetically analyzed. HGBV-C is found to be more closely related to HGBV-A than other members of the HCV group. The sequences of HGBV-C and HGBV-A exhibiting an evolutionary distance of 0.42 are not as far apart as HGBV-C and HGBV-B exhibiting an evolutionary distance of 0.92 (Table 33, infra). That is, HGBV-A and HGBV-C are considered to be members of one subgroup of GB virus, and HGBV-B is itself a member of one subgroup. Phylogenetic analysis of helicase sequences from various HCV isolates shows that they form a small group of branches with a maximum evolutionary distance of 0.20 (Table 32, infra). Comparison of the HCV and HGBV groups shows that the minimum evolution distance of any two sequences from each group is 0.69. Using the above distance values, a phylogenetic tree shown in FIG. 42 was created. The relatively high degree of divergence of these viruses indicates that GB viruses constitute a unique phylogenetic group rather than merely forming a type or subtype within the hepatitis C group. Phylogenetic analysis using sequence information derived from a small portion of the HCV virus genome has been shown to be an acceptable method of assigning new isolates to genotype groups (Simmonds et al.,Hepatology  19: 1321-1324 (1994)). In a recent analysis, using the 110 amino acid sequence in the helicase gene from a representative HCV isolate, they were appropriately classified into their respective genotypes (Simmonds et al.,J.Gen.Virol.75: 1053-1061 (1994)). Thus, the indicated evolutionary distance probably reflects the high degree of divergence between GB virus and hepatitis C virus.
In the prior patent application, "HGBV strains are identifiable at the polypeptide level, and HGBV strains are 40% or more homologous, preferably about 60% or more homologous, more preferably about 80% or more homologous at the polypeptide level. There is. " The term "homologous", although used, is ambiguous when indicating the degree of relatedness of two polynucleotide or polypeptide sequences, and indeed suggests an evolutionary relatedness. According to recent practice in the art, the term "homology" is no longer used, and instead two terms are used using the terms "similarity" and / or "identity". Indicates the degree of relevance of the polynucleotide or polypeptide sequence. Methods for determining the "similarity" and / or "identity" of an amino acid sequence are known in the art, for example, by directly determining the amino acid sequence and comparing it to the sequences provided herein. Determining the nucleotide sequence of the genomic material of the putative HGBV (usually via a cDNA intermediate), determining the amino acid sequence encoded therein, and comparing the corresponding regions. Generally, `` identity '' means that the nucleotide sequence of HGBV and the nucleotide sequence of another strain, or the amino acid sequence of HGBV and the amino acid sequence of another strain exactly match at an appropriate place on each genome. . Usually, “similarity” means that the amino acid sequence of HGBV and the amino acid sequence of another strain exactly match at the appropriate place, in which case the amino acids are identical or similar chemical and / or physical. Properties such as charge or hydrophobicity. According to the programs available in the Wisconsin Sequence Analysis Package, version 8 (available from the Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, 53711), such as the GAP program, the percent identity between the sequences of two polynucleotides or two polypeptides and A similarity ratio can be calculated. Other programs for calculating percent identity and similarity between two sequences are also known in the art.
In addition, the following parameters may be used alone or in combination in identifying strains of HGBV-A, HGBV-B or HGBV-C. Since it is believed that the HGBV strain may be preferably about 60% or more, and more preferably about 80% or more genetically related, HGBV-A, HGBV-B or HGBV-C and one of these hepatitis GB viruses The overall nucleotide sequence identity between the two strains is estimated to be about 45% or greater.
Furthermore, since it is thought that the HGBV strain may have a genetic association of preferably about 40% or more, more preferably about 60% or more, and still more preferably about 80% or more, the HGBV-A genome and the HGBV-A It is estimated that the identity of the entire sequence at the amino acid level to the genome of one strain will be about 35% or more. In addition, there are corresponding contiguous sequences of at least about 13 nucleotides, which may be given in a combination of two or more contiguous sequences. Further, since it is considered that the HGBV strain may have a genetic association of preferably about 40% or more, more preferably about 60% or more, and still more preferably about 80% or more, the HGBV-B genome and the HGBV-B The identity of the entire sequence at the amino acid level to the genome of a strain is estimated to be about 35% or greater. In addition, there are corresponding contiguous sequences of at least 13 nucleotides that would be given in a combination of two or more contiguous sequences. Further, since it is considered that the HGBV strain may have a genetic association of preferably about 40% or more, more preferably about 60% or more, and still more preferably about 80% or more, the HGBV-C genome and the HGBV-C It is estimated that the identity of the entire sequence at the amino acid level to the genome of one strain will be about 35% or more. In addition, there are corresponding contiguous sequences of at least about 13 nucleotides, which may be given in a combination of two or more contiguous sequences.
The compositions and methods of the present invention allow for the growth, identification, detection and isolation of HGBV and its possible strains. Further, the composition and the method of the present invention enable the production of a diagnostic agent and a vaccine for various strains in which HGBV can be present, which is useful for antiviral substance screening treatment. The information will be sufficient for the virus taxonomy to identify other strains belonging to the species. We believe that HGBV encodes the sequences contained herein. Methods for assaying for the presence of such sequences are known in the art and include, for example, amplification methods such as ligase chain reaction (LCR), polymerase chain reaction (PCR), and hybridization. Further, such sequences include an open reading frame in which immunogenic viral epitopes can be found. This epitope is unique to HGBV compared to other known hepatitis-inducing viruses. Epitope identity can be determined by immunological reactivity to HGBV and lack of immunological reactivity to hepatitis A, B, C, D and E viruses. Methods for determining immunological reactivity are known in the art and include, for example, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), hemagglutination (HA), and fluorescence polarization immunoassay (FPIA). Some examples of suitable methods are described herein.
A particular sequence, for example, a polynucleotide `` derived from '' an HGBV cDNA or HGBV genome is approximately at least about 6 nucleotides corresponding to a region of the particular nucleotide sequence, i.e., similar or complementary, Preferably, it refers to a polynucleotide sequence consisting of a sequence of at least about 8 nucleotides, more preferably at least about 10-12 nucleotides, even more preferably at least about 15-20 nucleotides. Preferably, the sequence of the region from which the polynucleotide is derived is similar or complementary to a sequence unique to the HGBV genome. Whether a sequence is complementary or similar to a sequence unique to the HGBV genome can be determined by methods known to those skilled in the art. As a method of determining the uniqueness of a specific sequence, for example, a comparison with a sequence in a data bank can be performed. Regions from which sequences can be derived include, but are not limited to, regions encoding specific epitopes, and untranslated and / or non-transcribed regions.
Derived polynucleotides need not be physically derived from the nucleotide sequence of HGBV and are not limited to, but are chemically synthesized, replicated, or inverted based on, for example, information provided by the nucleotide sequence of the region from which the polynucleotide is derived. It can be produced by any method, including transcription or transcription. Further, the combination of regions corresponding to a particular sequence can be varied according to the intended use in a manner known in the art.
A "polypeptide" or "amino acid sequence" derived from a particular nucleic acid sequence or HGBV genome is a polypeptide having the same amino acid sequence as the polypeptide encoded in the sequence, or at least three to five polypeptides. Refers to a portion of said polypeptide which consists of amino acids, more preferably at least 8-10 amino acids, even more preferably 15-20 amino acids, and which may be immunologically consistent with the polypeptide encoded in the sequence .
As used herein, a "recombinant polypeptide" is at least not related, by origin or manipulation, to all or a portion of the related polypeptides, either naturally or in library form, and / or A genomic, semi-synthetic or synthetic polypeptide is attached to a polynucleotide other than the one to which it is attached. A recombinant or derived polypeptide need not necessarily be translated from the specific nucleic acid sequence of HGBV or the HGBV genome. Recombinant or derived polypeptides can also be produced by any method, including chemical synthesis or expression in a recombinant expression system, or isolation from mutated HGBV.
As used herein, the term "synthetic peptide" refers to a polymeric form of amino acids of any length that can be chemically synthesized by methods known to those skilled in the art. Such synthetic peptides are useful for various applications.
The term "polynucleotide" as used herein refers to a polymeric form of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of the molecule. Thus, the term includes double- and single-stranded DNA and double- and single-stranded RNA. Furthermore, a polynucleotide in a modified form by methylation and / or capping, and a polynucleotide in an unmodified form are also included.
“HGBV containing a sequence corresponding to cDNA” means that HGBV contains a polynucleotide sequence similar or complementary to a sequence in a specific DNA. The degree of similarity or complementarity to the cDNA is about 50% or more, preferably at least about 70%, more preferably at least about 90%. The length of the corresponding sequence is at least about 70 nucleotides, preferably at least about 80 nucleotides, more preferably at least about 90 nucleotides. The correspondence between HGBV and cDNA can be determined by methods known in the art.For example, the sequenced material can be directly compared to the described cDNA, or hybridized and digested with single-stranded nuclease, and the digested fragment Determining the size, and the like.
A “purified viral polynucleotide” is one in which the viral polynucleotide is substantially free of the polypeptide with which it is naturally associated, ie, less than about 50%, preferably less than about 70%, more preferably less than about 90% thereof. Refers to the HGBV genome or a fragment thereof. Methods for purifying viral polynucleotides are known in the art, for example, disrupting particles using a chaotropic agent and separating polynucleotides and polypeptides by ion exchange chromatography, affinity chromatography, density sedimentation It is mentioned. A “purified viral polypeptide” is substantially free of the cellular components with which the viral polypeptide is naturally associated, ie, less than about 50%, preferably less than about 70%, more preferably less than about 90%. HGBV polypeptide or fragment thereof is meant. Purification methods are known to those skilled in the art.
As used herein, "polypeptide" refers to a molecular chain of amino acids, and does not refer to a specific length product. Thus, peptides, oligopeptides and proteins are included in the definition of polypeptide. However, the term is not intended to include post-expression modifications of the polypeptide, such as glycosylation, acetylation, phosphorylation, and the like.
`` Recombinant host cells, '' `` host cells, '' `` cells, '' `` cell lines, '' `` cell cultures, '' and other similar terms referring to microorganisms or higher eukaryotic cell lines cultured as unicellular material include: Refers to a cell that can be or has been used as a recipient of a recombinant vector or other transferred DNA, including the natural progeny of the original cell that was transfected.
As used herein, "replicon" means any genetic element, such as a plasmid, chromosome or virus, that behaves as a self-sustaining unit of polynucleotide replication in a cell. That is, the replicon can replicate under its own control.
A “vector” is a replicon that has been added so that another polynucleotide segment can replicate and / or express.
The term "control sequences" refers to the polynucleotide sequences necessary to effect expression of the coding sequence to which they are attached. The characteristics of the control sequences will vary depending on the host organism. In prokaryotic cells, the control sequences generally include a promoter, a ribosome binding site and a terminator, and in eukaryotic cells, the control sequences generally include a promoter, a terminator, and optionally an enhancer. Thus, the term "control sequences" is intended to include at least all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components which, if present, are advantageous, for example, leader sequences.
"Operably linked" refers to a situation in which the components are in a relationship permitting them to function as expected. Thus, for example, a control sequence "operably linked" to a coding sequence is ligated in such a way that expression of the coding sequence occurs under conditions compatible with the control sequences.
The term "open reading frame" or "ORF" refers to a region of a polynucleotide sequence that encodes a polypeptide. This region may provide part or all of the coding sequence.
A "coding sequence" is a polynucleotide sequence that is transcribed into mRNA and / or translated into a polypeptide when placed under the control of appropriate regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by a translation start codon at the 5 'end and a translation stop codon at the 3' end. Coding sequences include, but are not limited to, mRNA, cDNA, and recombinant polynucleotide sequences.
The term "immunologically identifiable using / as" refers to the presence of epitopes and polypeptides that are present in and specific to a particular polypeptide, usually the HGBV protein. Immunological identity can be determined by antibody binding and / or binding competition. Such methods are known to those skilled in the art and are also described herein. The uniqueness of an epitope can be determined by computer search of polynucleotide sequences encoding the epitope in known databanks, such as GenBank, or by comparing the amino acid sequence with other known proteins.
“Epitope” as used herein refers to an antigenic determinant of a polypeptide. Possibly, an epitope may include three amino acids in a spatial arrangement unique to that epitope. Usually, an epitope consists of at least 5 such amino acids, and more usually, consists of at least 8-10 amino acids. Methods for investigating spatial configuration are known in the art and include, for example, X-ray crystallography and two-dimensional nuclear magnetic resonance.
A polypeptide is "immunologically reactive" with an antibody when the antibody recognizes a particular epitope contained within the polypeptide and binds to the antibody. Immunological reactivity may be determined by antibody binding, particularly the rate of antibody binding, and / or competition for binding using a known polypeptide comprising an epitope for the antibody as a competitor. Methods for determining whether a polypeptide is immunologically reactive with an antibody are known in the art.
As used herein, the term "immunogenic polypeptide comprising an HGBV epitope" refers to a naturally occurring HGBV polypeptide or a fragment thereof, as well as other means, e.g., chemical synthesis or of the polypeptide in a recombinant microorganism. A polypeptide produced by expression is meant.
The term "transformation" refers to the insertion of a foreign polynucleotide into a host cell, regardless of the method of insertion. For example, direct uptake, transduction or f-mating. The exogenous polynucleotide can be maintained as a non-integrated vector, eg, a plasmid, or can be integrated into the host genome.
“Treatment” refers to prevention and / or treatment.
As used herein, the term "individual" refers to animals, particularly those of mammalian species, including but not limited to domestic animals, sport animals, primates and humans, particularly the term tamarin. And humans.
As used herein, “positive chain” (or “+”) refers to a nucleic acid that includes a sequence encoding a polypeptide.
"Negative strand" (or "-") indicates a nucleic acid that contains a sequence that is complementary to the sequence of the "positive" strand.
The "positive strand genome" of a virus, whether RNA or DNA, indicates that the genome is single-stranded and encodes a viral polypeptide.
"Test sample" refers to a component of an individual that is a source of an analyte (eg, an antibody of interest or an antigen of interest). Such components are known in the art. Test samples include biological samples that can be tested according to the methods of the present invention, including human and animal body fluids, such as whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine, lymph, and respiratory, gastrointestinal, and urine fluids. Various exocrine secretions of the genital tract, tears, saliva, milk, leukocytes, myeloma, and the like, as well as biological fluids such as cell culture supernatants, fixed tissue samples, fixed cell samples.
"Purified HGBV" refers to a preparation of HGBV isolated from the cellular components with which the virus is normally associated, and from other types of viruses that may be present in infected tissues. Methods for isolating viruses are known to those skilled in the art and include, for example, centrifugation and affinity chromatography.
“PNA” refers to “peptide nucleic acid analogs” that can be used in certain processes, such as assays to determine the presence of a target. PNAs are electrically neutral substances for RNA targets or DNA. For example, PNA probes used in assays instead of DNA probes offer advantages not available when using DNA probes. Such advantages include manufacturability, large-scale labeling, reproducibility, stability, low sensitivity to changes in ionic strength, and resistance to enzymatic degradation present in methods using DNA or RNA. PNAs can be labeled with a signal-generating compound, such as fluorescein, a radionuclide, a chemiluminescent compound. Thus, PNA may be used in the method instead of DNA or RNA. Although an assay using DNA is described herein, it is within the ordinary skill in the art to use PNA instead of RNA or DNA, if necessary, by appropriately changing the assay reagents.
General use
Once a particular recombinant protein, synthetic peptide, or purified viral polypeptide of the invention has been produced, the recombinant or synthetic peptide is used to detect the presence of an antigen or antibody against HGBV, as described herein. Unique assays can be developed. Such compositions can also be used to develop monoclonal and / or polyclonal antibodies using specific recombinant proteins or synthetic peptides that specifically bind to the desired immunological epitope of HGBV. It is also conceivable to develop a vaccine using at least one polynucleotide of the invention according to methods known in the art.
The reagents used in the assay may be one or more containers, eg, vials or bottles, each containing a reagent such as a monoclonal antibody or a mixture of monoclonal antibodies or a (recombinant or synthetic) polypeptide used in the assay. It can be provided in the form of: Other components known to those of skill in the art, such as buffers, controls, etc., may be included in such test kits.
"Solid phase" ("solid support") is well known to those skilled in the art, and includes reaction tray well walls, test tubes, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips, membranes, microparticles (eg, latex particles), sheep (Or other animal) erythrocytes, Duracytes / -E (derivatized erythrocytes available from Abbott Laboratories, Abbott Park. IL) and the like. "Solid phase" is not limiting and can be selected by one skilled in the art. That is, latex particles, microparticles, magnetic or non-magnetic beads, membranes, plastic tubes, microtiter well walls, glass or silicon chips, sheep (or other suitable animal) erythrocytes, and Duracytes / -E are all suitable. This is a simple example. Suitable methods for immobilizing peptides on a solid phase include ionic, hydrophobic, covalent interactions, and the like. As used herein, "solid phase" refers to any material that is insoluble or can be made insoluble by a subsequent reaction. The solid phase may be selected for its inherent ability to attract and immobilize the capture agent. Alternatively, the solid phase may carry an auxiliary receptor capable of attracting and immobilizing the capture agent. The auxiliary receptor can include a charged material having a charge opposite to that of the capture agent itself or a charged material bound to the capture agent. Alternatively, the receptor molecule can be any specific binding member that is immobilized (attached) on a solid phase and has the ability to immobilize a capture agent by a specific binding reaction. The capture agent can be indirectly bound to the solid phase material by the receptor molecule during or in the assay example. The solid phase can be plastic, derivatized plastic, magnetic or non-magnetic metal, test tubes with glass or silicon surfaces, microtiter wells, sheets, beads, microparticles, chips, sheep (or other suitable animal) red blood cells, Duracytes / -E, as well as other configurations known to those skilled in the art.
It is also contemplated that the solid phase may comprise any suitable porous material having sufficient porosity to allow access to the detection antibody and suitable surface affinity to bind the antigen, and is within the scope of the invention. . Generally, a microporous structure is preferable, but a material having a gel structure in a hydrated state can also be used. Such useful solid supports include natural polymeric carbohydrates and their synthetically modified, crosslinked or substituted derivatives such as agar, agarose, crosslinked alginic acid, substituted crosslinked guar gum, especially cellulose esters with nitric acid and carboxylic acids, mixed cellulose esters, cellulose. Ethers; natural polymers containing nitrogen, such as proteins and derivatives, including cross-linked or modified gelatin; natural hydrocarbon polymers, such as latex and rubber; synthetic polymers, such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, which can be manufactured to have suitable porous structures; Polyvinyl chloride, vinyl polymers including polyvinyl acetate and partially hydrolyzed derivatives thereof, polyacrylamide, polymethacrylate, copolymers and terpolymers of the above polycondensates, for example, polyesters, polyamides And other polymers such as polyurethanes or polyepoxides; porous inorganic materials such as alkaline earth metal and magnesium sulfates or carbonates (eg barium sulfate, calcium sulfate, calcium carbonate), alkali and alkaline earth metals, aluminum and Magnesium silicates; and aluminum or silicon oxides or hydrates, such as clay, alumina, talc, kaolin, zeolite, silica gel or glass (these materials may be used as fillers with the above polymeric materials) And mixtures or copolymers thereof, for example, graft copolymers obtained by initiating the polymerization of a synthetic polymer on an existing natural polymer. All of these materials can be used in any suitable form, such as a film, sheet, or plate, or can be coated, adhered, or laminated to a suitable inert carrier, such as paper, glass, plastic film, or fiber. .
The porous structure of nitrocellulose shows excellent absorption and adsorption properties for a wide range of reagents, including monoclonal antibodies. Nylon has similar properties and is also suitable. The porous solid support as described above is considered to be in the form of a sheet having a thickness of about 0.01-0.05 mm, preferably about 0.1 mm. The pore size can vary over a wide range, but is preferably about 0.025 to 15μ, especially about 0.15 to 15μ. The surface of such a support may be activated by a chemical treatment that causes a covalent bond between the antigen or antibody and the support. Generally, antigens or antibodies are irreversibly bound by adsorption onto the porous material by poorly understood hydrophobic forces. Suitable solid supports are also described in U.S. Patent Application No. 227,272.
An "indicator" includes a "signal generating compound" (label) attached to (attached to) a specific binding member of HGBV that is capable of producing or producing a measurable signal detectable by external means. As used herein, a "specific binding member" is a specific binding pair, i.e., a member of two molecules where one molecule specifically binds to a second molecule via chemical or physical means. means. In addition to being an antibody member of a specific binding pair to HGBV, the indicator may be a hapten-anti-hapten system, such as biotin or anti-biotin, avidin or biotin, carbohydrate or lectin, a complementary nucleotide sequence, an effector or receptor molecule, an enzyme cofactor. And enzymes, enzyme inhibitors or enzymes. The immunoreactive specific binding member is an antibody, antigen, or antibody / antigen complex that can bind to HGBV in a sandwich assay, a capture agent in a competition assay, or any specific binding member in an indirect assay. Can be
Various possible "signal-generating compounds" (labels) include chromogens, catalysts such as enzymes, luminescent compounds such as fluorescein and rhodamine, chemiluminescent compounds such as dioxetane, acridinium, phenanthridinium and luminol, radioactive elements , Direct visible labels. Examples of enzymes include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β-galactosidase and the like. The choice of a particular label is not limiting, and the label can generate a signal by itself or together with one or more other substances.
The invention provides assays that use specific binding members. As used herein, a “specific binding member” is a specific binding pair, ie, a member of two different molecules in which one molecule specifically binds to a second molecule via chemical or physical means. It is. Thus, in addition to antigen and antibody specific binding pairs for common immunoassays, other specific binding pairs include biotin and avidin, carbohydrates and lectins, complementary nucleotide sequences, effector molecules and reporter molecules, cofactors and enzymes, Mention may be made of enzyme inhibitors and enzymes. Specific binding pairs can also include analogs of the original specific binding pair, eg, members that are analyte analogs. Immunoreactive specific binding members include those formed by recombinant DNA molecules and include antigens, antigen fragments, monoclonal and polyclonal antibodies and antibody fragments, and complexes thereof. As used herein, the term "hapten" refers to a partial antigen or non-protein binding member that can bind to an antibody but is unable to induce antibody formation unless bound to a carrier protein.
As used herein, "analyte" is a substance to be detected that may be present in a test sample. The analyte can be a substance against which a natural specific binding member (eg, an antibody) is present or for which a specific binding member can be prepared. That is, an analyte is a substance that can bind to one or more specific binding members in an assay. "Analyte" includes any antigenic substance, hapten, antibody, and combinations thereof. As a member of a specific binding pair, the analyte can be detected by a natural specific binding partner (pair); for example, measurement of vitamin B12 uses an intrinsic factor protein as a member of the specific binding pair and folate The folate binding protein is used to measure, and the lectin is used as a member of a specific binding pair to measure carbohydrates. Analytes include proteins, peptides, amino acids, nucleotide targets and the like.
Other embodiments using various other solid phases are also contemplated and are within the scope of the present invention. For example, the negative charge described in co-pending U.S. Patent Application No. 150,278 and U.S. Patent Application No. 375,029 (EP-A-0464773) corresponding to EP-A-0326100. A fast solution-phase immunochemical reaction can be performed using the ion capture method of immobilizing a reaction complex that can be immobilized using a polymer having the following formula: The immobilizable immune complex is separated from the rest of the reaction mixture by ionic interaction between the negatively charged polyanion / immune complex and the pretreated, positively charged porous matrix, and the EPO patent application is published. Detection may be accomplished using a variety of signal generation systems described in the literature, including those described in Chemiluminescent Signal Measurements, such as described in co-pending U.S. Patent Application No. 921,979, which corresponds to U.S. Patent No. 0,273,115.
The method of the present invention may also be adapted for use in systems using particulate technology, including automated and semi-automated systems in which the solid phase consists of (magnetic or non-magnetic) particulates. Such systems include those described in pending U.S. Patent Application Nos. 425,651 and 425,643, corresponding to EPO Patent Application Publication Nos. 0 425 633 and 0 424 634, respectively. Is mentioned.
The use of a scanning probe microscope (SPM) for immunoassays allows the monoclonal antibodies of the invention to be readily adapted. In a scanning probe microscope, especially an atomic force microscope, a capture phase, for example, at least one monoclonal antibody of the present invention, is attached to a solid phase, and a scanning probe microscope is used to detect the presence on the surface of the solid phase. The resulting antigen / antibody complex is detected. The use of a scanning tunneling microscope eliminates the need for labels that must normally be used in many immunoassay systems to detect antigen / antibody complexes. Such a system is described in pending US patent application Ser. No. 662,147. SPM can be used in many ways to monitor a specific binding reaction. In one embodiment, one member of a specific binding partner (analyte-specific substance that is a monoclonal antibody of the invention) is attached to a surface suitable for scanning. The attachment of the analyte-specific substance can be performed by adsorbing a test piece consisting of a solid phase on a plastic or metal surface according to a method known to those skilled in the art. Alternatively, a specific binding partner (analyte-specific substance) can be covalently bound to a test piece comprising a solid phase of derivatized plastic, metal, silicon, or glass. Covalent attachment methods are known to those skilled in the art and include various means of irreversibly binding a specific binding partner to a test strip. If the test strip is silicon or glass, the surface must be activated before the specific binding partner can be attached. Triethoxyaminopropylsilane (available from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), triethoxyvinylsilane (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) and (3-mercapto-propyl) -trimethoxysilane (Sigma Chemical Co.) Activated silane compounds (., St. Louis, MO) can be used to introduce reactive groups such as amino, vinyl and thiol, respectively. Such activated surfaces can be used to directly bind the binding partner (in the case of amino or thiol), or the activated surface can be further modified with glutaraldehyde, bis (succinimidyl) suberate, SPPD9 (succinimidyl 3 -[2-pyridyldithio] propionate), SMCC (succinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate), SIAB (succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate) and SMPB (succinimidyl 4- [1 -Maleimidophenyl] butyrate) to separate the binding partner from the surface. Vinyl groups can be oxidized to provide a covalent means of attachment, or used as anchors for polymerizing various polymers, such as polyacrylic acid, which can provide multiple points of attachment to specific binding partners. it can. The amino surface can also be reacted with oxidized dextran of various molecular weights to provide hydrophilic linkers of various sizes and binding capacities. Examples of oxidizable dextrans include Dextran T-40 (molecular weight 40,000 daltons), Dextran T-110 (molecular weight 110,000 daltons), Dextran T-500 (molecular weight 500,000 daltons), and Dextran T-2M (molecular weight 2,000,000 daltons) (all of these). Available from Pharmacia), or Ficoll (molecular weight 70,000 daltons) (available from Sigma Chemical Co., St Louis, MO). In addition, the method and chemical substance described in U.S. Patent Application No. 150,278, filed on Jan. 29, 1988 and U.S. Patent No. 375,029, filed on July 7, 1989, using polyelectrolyte interaction are used. Thus, a specific binding partner can be immobilized on the surface of the test strip. The preferred method of attachment is by covalent bonding. After the specific binding members have been attached, the surface may be further treated with serum, proteins, or other blocking agents to minimize non-specific binding. It may be scanned at the manufacturing location or at the point of use to verify that the surface is suitable for the assay. The scanning method shall not alter the specific binding properties of the test strip.
A variety of other assay formats can be used, including "sandwich" immunoassays and probe assays. For example, the monoclonal antibodies of the invention can be used in various assay systems to determine the presence, if any, of the HGBV protein in a test sample. Fragments of such monoclonal antibodies provided may be used. For example, in a fast assay format, a solid phase coated polyclonal or monoclonal anti-HGBV antibody or fragment thereof, or a combination of these antibodies, is contacted with a test sample that may include HGBV protein to form a mixture. The mixture is incubated for a time and under conditions sufficient to form an antigen / antibody complex. An indicator comprising a monoclonal or polyclonal antibody or a fragment thereof or a combination of these antibodies, which specifically binds to the HGBV region, having a signal generating compound attached thereto, is contacted with the antigen / antibody complex to form a second mixture. . The second mixture is incubated for a time and under conditions sufficient to form an antibody / antigen / antibody complex. The presence, if any, of the HGBV antigen present in the test sample and captured on the solid phase is determined by detecting a measurable signal generated by the signal generating compound. The amount of HGBV antigen present in the test sample is proportional to the signal generated.
Alternatively, a monoclonal or polyclonal antibody that specifically binds to the HGBV antigen, having a polyclonal or monoclonal anti-HGBV antibody or a fragment thereof or a combination of these antibodies attached to a solid support, a test sample, and a signal generating compound attached thereto. Alternatively, the mixture is contacted with an indicator comprising a fragment thereof or a combination of these antibodies to form a mixture. The mixture is incubated for a time and under conditions sufficient to form an antibody / antigen / antibody complex. The presence, if any, of the HGBV protein present in the test sample and captured on the solid phase is determined by detecting a measurable signal produced by the signal producing compound. The amount of HGBV protein present in the test sample is proportional to the signal generated.
In yet another assay format, one or a combination of two or more of the monoclonal antibodies of the present invention may be used as a competitive probe for detecting antibodies against the HGBV protein. For example, the HGBV protein can be coated on a solid phase alone or in combination. Then, a test sample suspected of containing an antibody against the HGBV antigen is combined with a test sample and an indicator and a solid phase, or an indicator and a solid phase, together with an indicator containing a signal-generating compound and at least one monoclonal antibody of the present invention. Incubate for a time and under conditions sufficient to form an antigen / antibody complex. The decrease in binding of the monoclonal antibody to the solid phase can be quantitatively measured. If the signal decrease can be measured as compared to the signal generated from a test sample in which non-A, non-B, non-C, non-D, non-hepatitis negative is confirmed, the anti-HGBV antibody in the test sample It turns out that it exists.
In yet another detection method, each of the monoclonal or polyclonal antibodies of the present invention can be used to detect HGBV antigen in fixed tissue sections and cells by immunohistochemical analysis. Such antibodies can be directly labeled (fluorescein, colloidal gold, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) or labeled using a second labeled anti-species antibody (using various labels exemplified herein). Cytochemical analysis to track the history of the disease is also within the scope of the present invention.
In addition, monoclonal antibodies can be bound to a matrix similar to CNBr-activated Sepharose and used for the affinity purification of specific HGBV proteins from cell cultures or biological tissues such as blood and liver, using recombinant or native viral HGBV antigens and proteins. Can also be purified.
The monoclonal antibodies of the present invention can also be used for the production of chimeric antibodies for therapeutic purposes and other similar uses.
Monoclonal antibodies or fragments thereof can be provided individually for detecting the HGBV antigen. Combinations of the monoclonal antibodies (and fragments thereof) provided herein may each have a different binding specificity in a mixture or "cocktail" of at least one anti-HGBV antibody of the invention and antibodies to other HGBV regions. It can be used together as an active ingredient. That is, the cocktail may include a monoclonal antibody of the invention against the HGBV protein and other monoclonal antibodies against other antigenic determinants of the HGBV genome.
Polyclonal antibodies or fragments thereof that can be used in such an assay format should specifically bind to the specific HGBV region or other HGBV protein used in the assay. The polyclonal antibodies used are preferably of mammalian origin, and human, goat, rabbit or sheep anti-HGBV polyclonal antibodies may be used. Most preferably, the polyclonal antibody is a rabbit polyclonal anti-HGBV antibody. The polyclonal antibodies used in the assay can be used alone or as a cocktail of polyclonal antibodies. Since the cocktails used in the assay format consist of either monoclonal or polyclonal antibodies with different HGBV specificities, they are useful for diagnosing, assessing and preventing HGBV infection and for studying HGBV protein differentiation and specificity Let's be.
It is contemplated that the use of synthetic, recombinant or natural peptides common to all HGBV viruses may make the HGBV family of viruses detectable in the assay and is within the scope of the present invention. It is also within the scope of the present invention that various synthetic, recombinant or natural peptides identifying various epitopes from HGBV-A, HGBV-B, HGBV-C, and even other HGBV viruses may be used in the assay format. is there. In the latter case, they may be coated on one solid phase, or each peptide may be coated on a separate solid phase, eg, microparticles, and combined to form a mixture of peptides that can be used later in an assay. It may be formed. Such assay format variations are known to those skilled in the art and are described below.
In another assay format, the presence of antibodies and / or antigens to HGBV may be detected in a simultaneous assay as follows. A test sample is prepared by combining a first analyte capture agent containing a first binding member specific to a first analyte attached to a solid phase with a second analyte for a second analyte attached to a second solid phase. Simultaneous contact with a second analyte capture agent comprising one binding member, thereby forming a mixture. The mixture is incubated for a time and under conditions sufficient to form a capture agent / first analyte complex and a capture agent / second analyte complex. The complex thus formed is combined with an indicator containing a member of a binding pair specific for the first analyte labeled with the signal-generating compound, and with an indicator specific for the second analyte labeled with the signal-generating compound. Contact with an indicator comprising a member of a suitable binding pair to form a second mixture. The second mixture is incubated for a time and under conditions sufficient to form a capture agent / first analyte / indicator complex and a capture agent / second analyte / indicator complex. The presence of one or more analytes was produced in association with a complex formed on one or both solid phases as an indicator of the presence of one or more analytes in the test sample. It is determined by detecting a signal. In this assay format, proteins derived from human expression systems can be used as well as monoclonal antibodies produced from proteins derived from mammalian expression systems as described herein. Such an assay system is described in detail in pending US patent application Ser. No. 07 / 574,821, corresponding to EP-A-0473065, entitled “Simultaneous Assay for Detecting One Or More Analytes”.
In yet another assay format, recombinant proteins and / or synthetic peptides may be used to detect the presence of anti-HGBV in a test sample. For example, a test sample is incubated with a solid phase to which at least one recombinant protein or synthetic peptide has been attached. These are reacted for a time and under conditions sufficient to form an antigen / antibody complex. After incubation, the antigen / antibody complex is detected. Depending on the assay system chosen, indicators may be used to facilitate detection. In another assay format, a test sample is contacted with a solid phase to which a recombinant protein or synthetic peptide prepared as described herein has been attached, and the protein is further labeled, preferably with an indicator. Contact with specific monoclonal or polyclonal antibodies. After incubation for a time and under conditions sufficient for the formation of the antibody / antigen complex, the solid phase is separated from the free phase and a label is detected in the solid phase or free phase as an indicator of the presence of the HGBV antibody. Other assay formats using the proteins of the invention are also contemplated. They include contacting a test sample with a solid phase to which at least one antigen from a first source has been attached, and allowing the solid phase and the test sample to have sufficient time to form an antigen / antibody complex. Incubating under conditions and then contacting the solid phase with a labeled antigen derived from a second source different from the first source. For example,E.coliUsing a recombinant protein derived from a first source, such as, as a capture antigen on a solid phase, a test sample is added to the solid phase thus prepared, and a different source (ie,E.coli) Is used as part of the indicator. Similarly, one can combine the recombinant antigen on the solid phase with the synthetic peptide in the indicator phase. Assay formats using HGBV-specific antigens from a first source as capture antigens and using HGBV-specific antigens from a different second source are also contemplated. Various combinations of recombinant antigens, as well as the use of synthetic peptides, purified viral proteins, etc., are within the scope of the invention. Such assays and the like are described in US Pat. No. 5,254,458 in the name of the present applicant, the contents of which are incorporated herein by reference.
In other assay systems, antibodies (polyclonal, monoclonal or natural) that specifically bind to HGBV virions or subviral particles containing the viral genome (or fragments thereof) by contact of the specific antibodies with viral proteins (such as peptides) Is used. The captured particles can then be analyzed by methods such as LCR or PCR to determine if the viral genome is present in the test sample. Test samples that can be analyzed according to the method include blood, liver, sputum, urine, stool, saliva, and the like. An advantage of using such an antigen capture amplification method is that a specific antibody can be used to separate the viral genome in a test sample from other molecules. Such a method is described in pending US patent application Ser. No. 08 / 141,429.
Although the invention has been described using a solid phase, it is contemplated that reagents such as antibodies, proteins and peptides of the invention may be used in non-solid phase assay systems. Such assay systems are known to those skilled in the art and are intended to be included in the scope of the present invention.
Materials and methods
General method
Unless otherwise indicated, the practice of the present invention will employ conventional and known techniques and methods in the fields of molecular biology, microbiology, recombinant DNA and immunology. Such techniques are explained fully in the literature. For example, J. Sambrook et al.Mo lecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); D.N.DNA Cloning, Volumes Ia nd II(1985); edited by M.J.Gait,Oligonucleotide Synthe sis, (1984); B.D.Hames et al.,Nucleic Acid Hybrid ization, (1984); B.D.Hames et al.,Transcription an d Translation, (1984); edited by R.I.Freshney,Animal C ell Culture, (1986);Immobilized Cells and E nzymes, IRL Press (1986); B. Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning, (1984); series,Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Orlando, Florida; J.H. Miller et al.Gene Transfer Vec tors For Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987); Ed. Wu et al., Methods in Enzymology, Vol. 154 and 155; Ed.Immunological Methods In Cell and Molecul ar Biology, Academic Press, London (1987); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition, Springer-Verlag, N.Y .; and D. Weir et al.Han dbook Of Experimental Immunology, Vol. I-IV (1986); N. Lisitisyn et al.Science  259: 946-951 (1993).
The reagents and methods of the present invention are highly relevant for the presence of tamarins or human HGBV-infected individuals in plasma, serum or liver homogenates, as isolated by improved representative difference analysis as described herein. This can be realized by providing a certain nucleotide sequence group. This nucleotide sequence should not hybridize to human or tamarin genomic DNA from uninfected individuals, should only be present in the liver (or liver homogenate), plasma or serum of HGBV infected individuals, and should not be present in GenBank Therefore, it is not derived from humans or tamarins. Furthermore, the sequence group does not show significant matches at the nucleic acid level with sequences contained in the HAV, HBV, HCV, HDV and HEV genomes, and the level of match in the translation products is too low to be considered significant. Infectious serum, plasma or liver homogenate from an HGBV infected human contains such a polynucleotide sequence, whereas serum, plasma or liver homogenate from an uninfected human does not. Northern blot analysis of infected livers containing some of these polynucleotide sequences shows that they are derived from large RNA transcripts similar in size to the viral genome. Serum, plasma or liver homogenate from HGBV infected humans contains antibodies that bind to this polypeptide, whereas serum, plasma or liver homogenate from uninfected humans does not contain antibodies to this polypeptide and such antibodies are It has been induced in individuals after A, non-B, non-C, non-D and non-E infections. Based on these, the sequence is considered to be the sequence of a virus that causes or is associated with non-A, non-B, non-C, non-D and non-E hepatitis.
By using this nucleic acid sequence group, non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis caused by HGBV infection can be diagnosed, and blood donors, blood donated blood, blood products and individuals can be infected. DNA probes and polypeptides useful in screening can be constructed. For example, the sequences are useful as hybridization probes or PCR primers, for example, to detect the presence of the viral genome in the serum of a subject suspected of carrying the virus, or screen for the presence of the virus in donated blood. DNA oligomers of about 8 to 10 or more nucleotides, useful for DNA synthesis, can be synthesized. With the nucleic acid sequence group, an HGBV-specific polypeptide useful as a diagnostic reagent for the presence of an antibody generated upon infection with HGBV can be designed and manufactured. Antibodies to purified polypeptides derived from the nucleic acid sequences can also be used to detect viral antigens in infected individuals and blood. Such a nucleic acid sequence allows one to design and produce a polypeptide that can be used as a vaccine against HGBV and for producing antibodies, so that it can be used to prevent disease and / or treat HGBV infected individuals. I can do it.
Such nucleic acid sequences also allow for further characterization of the HGBV genome. Using a polynucleotide probe derived from such a sequence, a genomic or cDNA library can be screened for another overlapping nucleic acid sequence and further used to obtain a duplicated sequence. If the genome is segmented but the segments do not lack consensus sequences, this method can be used to obtain the sequence of the entire genome. However, if the genome is segmented, the RDA cloning process as described is repeated to modify as described below, or the λ-gt11 serological screening process is repeated as described below to isolate the clone described below, Alternatively, other segments of the genome can be obtained by isolating the genome from purified HGBV particles.
CDNA sequences and polypeptides derived from the above sequences, as well as antibodies against such polypeptides, are also useful for isolating and identifying HGBV causative agents. For example, antibodies to HGBV epitopes contained in polypeptides derived from such nucleic acid sequences can be used in affinity chromatography-based methods to isolate viruses. Alternatively, antibodies can be used to identify virus particles that have been otherwise isolated. The viral antigens and genomic material in the isolated virus particles can be further characterized.
By further sequencing the HGBV genome, further characterizing the HGBV antigen, and the information obtained by characterizing the genome, HGBV-induced non-A, non-B, non-C, non-D, non-E Additional probes and polypeptides and antibodies can be designed and synthesized that can be used for diagnosis, prevention and treatment of hepatitis B, and for screening of infected blood and blood-related products.
If a probe for HGBV is obtained, including antigens, antibodies and polynucleotides derived from the genome from which such nucleic acid sequences are derived, a tissue culture system particularly used to characterize the biological characteristics of HGBV Development becomes possible. Once this is known, it is conceivable that new therapeutic strategies could be developed based on antiviral compounds that preferentially inhibit HGBV replication or its infection.
One method used to identify and isolate the etiological agent of HGBV is described in N. Lisitsyn et al.Science.259: 946-951 (1993). Cloning / isolation of GB material was performed by a modification of a known method known as Reproducibility Difference Analysis (RDA). This method clones DNA differences between two complex mammalian genomes based on the principle of subtractive hybridization. In summary, this method generically distinguishes two test genomes from a "tester" (containing the relevant target sequence) and a "driver" (corresponding to normal DNA). Lisitsyn et al.'S description of the RDA is limited to the identification and cloning of DNA differences between similar composite DNA backgrounds. These differences include any large DNA virus (eg, ≧ 25,000 DNA base pairs) that is present in a particular cell line, blood, plasma or tissue sample and is absent in an uninfected cell line, blood, plasma or tissue sample. obtain. Since HGBV was previously shown to be a small virus containing DNA or RNA genomes of ≤10,000 bases, the RDA protocol was modified to detect small viruses. The main steps of the method are described below and are shown in FIG.
Briefly, in step 1, total nucleic acids (DNA and RNA) are isolated using a commercial kit. RDA requires that samples be highly consistent. Ideally, tester and driver nucleic acid samples should be obtained from the same source (animal, human, etc.). Highly relevant non-identical materials may be used for the tester and driver nucleic acid sources. Double-stranded DNA is generated from total nucleic acid by randomly initiated reverse transcription of RNA followed by randomly initiated DNA synthesis. This treatment converts single-stranded RNA virus and single-stranded DNA virus into double-stranded DNA molecules that can be used for RDA. Assuming that the unknown virus has one of the DNA or RNA genomes, double-stranded DNA can be produced using DNA-only or RNA-only extraction procedures as described in the literature.
Stage 2 amplifies the tester and driver nucleic acids to produce large amounts of material (ie, tester and driver amplicons) corresponding to the total nucleic acids extracted from the pre-inoculation and infectious plasma sources. This is achieved by cleaving the double-stranded DNA prepared as described above with a restriction endonuclease having a 4 bp recognition site (eg, Sau3AI). The DNA fragment is ligated to an oligonucleotide adapter (set # 1). The DNA fragment is end-filled and PCR amplified. After PCR amplification, the oligonucleotide adapter (Set # 1) is removed by restriction endonuclease digestion (eg, Sau3A I) to release large amounts of tester and driver nucleic acids used in subsequent subtractive hybridization methods.
The purpose of the stage 3 experiment is to integrate DNA specific to the tester genome. This is achieved by combining subtractive hybridization and dynamic integration as a single step. Briefly, an oligonucleotide adapter set (# 2 or # 3) is ligated to the 5 'end of a tester amplicon. The tester amplicon and excess driver amplicon are mixed, denatured and hybridized for 20 hours. Large amounts of sequences that are commonly conserved between tester and driver DNA anneal during this time. In addition, sequences specific to the tester apricon reanneal. However, due to the limited hybridization time, some single-stranded tester and driver DNA remain.
In step 4, the 3 ′ ends of the reannealed tester and driver DNA are filled with a thermostable DNA polymerase at an elevated temperature as described in the literature. The reannealed sequence unique to the tester contains adapters ligated on both strands of the annealed sequence. Thus, the 3 'end-filling of these molecules generates sequences complementary to the PCR primers on the two DNA strands. Thus, these DNA species are exponentially amplified when subjected to PCR. In contrast, relatively large amounts of hybrid molecules containing sequences that are commonly conserved between the tester and the driver amplicon (ie, one strand is derived from the tester amplicon and one strand is derived from the driver amplicon) ) Is linearly amplified by PCR. This is because it contains an adapter sequence to which only the strand (derived from the tester amplicon) is ligated, and the 3 ′ end filling creates only a sequence complementary to the PCR primer on the strand derived from the driver adapter.
In step 5, the corresponding double-stranded DNA is quantitatively increased using 10 amplification cycles of PCR. As described in step 4, the reannealed tester sequences are amplified exponentially, and the sequences conserved in common between the tester and driver anneals are amplified linearly.
In step 6, the remaining single-stranded DNA is removed by single-stranded DNA nuclease digestion using house nuclease as described in the literature.
In step 7, the remaining double-stranded DNA after nuclease digestion is further amplified by PCR for 15 to 25 cycles.
Finally, in step 8, these DNA products are cleaved with restriction endonucleases to remove the oligonucleotide adapter. These DNA products are then either subjected to the next amplification (starting from step # 3 using an oligonucleotide adapter not used in the previous cycle RDA) or cloned into an appropriate plasmid vector for further analysis .
The RDA method described above is a modification of the replay difference analysis known to those skilled in the art. The method was modified to isolate virus clones from pre-inoculation and infectious serum sources. These variations are described below with respect to the preparation of tester and driver DNA amplicons. First, the starting material was total nucleic acids extracted from infectious pre-inoculated biological blood samples obtained from tamarin, rather than double-stranded DNA obtained from genomic DNA of mammalian cells as previously reported. . Other biological samples (eg, organs, tissues, bile, feces, or urine) may be used as a source of nucleic acids to produce testers and driver amplicons. Second, the amount of starting nucleic acid is substantially less than described in the literature. Third, a restriction endonuclease with a 4bp but not 6bp recognition site was used. This is substantially different from the prior art. According to the teachings of Lisitsyn et al., RDA is effective because the formation of amplicons (ie, reproductions) reduces the complexity of the hybridized (ie, subtracted) DNA.
In the prior art, the genome was fractionated using a restriction enzyme having a 6 bp recognition site. These restriction endonucleases cleave about every 4000 bp. On the other hand, under the PCR conditions described in the prior art, the amplification size of the sequence is ≦ 1500 bp. Thus, subsequent PCR amplification of complex species (eg, genomes) of DNA fractionated with a viral restriction enzyme that recognizes a 6 bp sequence will result in the production of amplicons containing a fraction of DNA of size ≦ 1500 bp after restriction endonuclease digestion. You. It has been reported that this reduction in DNA complexity (estimated by a factor of 10 to 50) is required for the RDA hybridization step to be performed effectively. If the degree of complexity does not decrease, the unique sequences in the tester will not be able to hybridize effectively during the subtraction stage, and thus these unique sequences will not be amplified exponentially during the subsequent PCR stage of the RDA.
The reduced complexity of the nucleic acid sequence undergoing RDA makes it difficult to use RDA to isolate relatively small viruses. The probability of the presence of two 6 bp recognition sites within 1.5 kb of each other is so low that small (≦ 10 kb) viruses may not be isolated (Table 1).

In contrast, the present inventors have found that RDA is useful for cloning small viruses if the RDA test DNA is fractionated using a restriction endonuclease having a higher cleavage frequency. As shown in Table 1, amplicons based on the 4 bp recognition site enzyme almost certainly contain several fragments from any small virus, such as a restriction endonuclease with a 4 bp recognition site fragment DNA about every 250 bp. . On the other hand, amplicons appear to be as complex as the nucleic acid source from which they were produced, since almost all of the DNA species are ≦ 1500 bp, ie, PCR amplified, after digestion with the 4 bp recognition restriction endonuclease. Since the relative viral sequence copy number is expected to be greater than any specific or endogenous sequence copy number, the unique viral sequences present in the tester amplicon will form double-stranded molecules during the hybridization step (step 3 above). It should be possible. Therefore, these sequences are exponentially amplified as described above. Use a restriction endonuclease that recognizes overlapping 6 bp sequences (eg, BstY I or Hinc II) and cleaves about every 1000 bp as the relative viral sequence copy numbers approach background or endogenous nucleic acid sequence copy numbers, or It is inferred that several restriction endonucleases recognizing can be used simultaneously to fractionate DNA before amplification by PCR. In this way, the complexity of the amplicon undergoing RDA can be moderately reduced, while minimizing the risk of eliminating viral sequences from the tester amplicon. The utility of this method is demonstrated by the cloning of HGBV sequences from infectious tamarin plasma as described herein.
Immune screen to identify HGBV immunoreactive epitopes Learning
Immunoscreening, as described below, was also an additional means of identifying HGBV sequences. Virus particles are isolated using individual sera, plasma or liver homogenates or pools from individuals meeting criteria within the following parameters with acute or chronic HGBV infection. Nucleic acids isolated from these particles are used as templates in the construction of genomic libraries and / or cDNA libraries for viral genomes. The procedure used to isolate putative HGBV particles and construct a genomic and / or cDNA library on a λ-gt11 or similar system known to those skilled in the art is described below. λ-gt11 is a vector developed to specifically express an inserted cDNA as a fusion polypeptide with β-galactosidase and to screen a large number of recombinant phages with a specific antiserum against a defined antigen. An encoded epitope capable of specifically binding a λ-gt11 cDNA library generated from a cDNA pool containing cDNA to serum from a non-A, non-B, non-C, non-D, and non-E hepatitis-existing individual Screen for V. Hunyh et al., D. Glover,DNA Cloning Techniques; A Practical App roach, IRL Press, Oxford, England, pp. 49-78 (1985). About 10⁶~Ten⁷Individual phages are screened to identify and purify positive phages, and then tested for specificity of binding to serum from each individual previously infected with the HGBV substance. Phage that selectively bind to serum or plasma derived from patients meeting the following criteria and not present in patients not meeting these criteria are suitable for further testing. By using the method of isolating overlapping nucleic acid sequences, clones containing additional upstream and downstream HGBV sequences are obtained. The nucleotide sequence of the HGBV nucleic acid sequence encoded in the isolated clone is analyzed to determine whether the composite sequence contains one long contiguous ORF.
The sequence recovered from the HGBV sequence as described herein (and its complement) and the sequence or any portion thereof may be prepared using synthetic methods, or may be similar to those described herein. The method may be used to prepare by combining a synthetic method with the recovery of a partial sequence. The description relates to a method by which the genomic or cDNA sequence corresponding to the complete HGBV genome can be isolated. However, other methods for isolating these sequences will be apparent to those skilled in the art and are considered to be within the scope of the present invention.
Deposit of strain
Replicates from the HGBV nucleic acid sequence library (clone 2, 4, 10, 16, 18, 23 and 50) were based on the Budapest Treaty on February 10, 1994 at 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, American. Deposited at the Type Culture Collection and stored for 30 years from the date of deposit, 5 years from the latest request for sample order, or the longest of the US patents, whichever is longer. The above deposited strains and all other deposited materials described herein are provided for convenience only and are not required to practice the present invention in light of the teachings herein. The HGBV cDNA sequence in all deposited materials is incorporated herein by reference. The plasmid was assigned the following A.T.C.C. accession number. Clone 2 has ATCC deposit number 69556, clone 4 has ATCC deposit number 69557, clone 10 has ATCC deposit number 69558, clone 16 has ATCC deposit number 69559, clone 18 has ATCC deposit number 69560, clone 23 has ATCC deposit number 69561, and clone 50. Was assigned ATCC deposit number 69562.
Replicas from the HGBV nucleic acid sequence library (clone 11, 13, 48 and 119) have been deposited with the American Type Culture Collection at 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 on April 29, 1994 based on the Budapest Treaty. 30 years from the date of deposit, 5 years from the most recent sample submission request, or the life of the US patent, whichever is the longer. The above deposited strains and all other deposited materials described herein are provided for convenience only and are not required to practice the present invention in light of the teachings herein. The HGBV cDNA sequence in all deposited materials is incorporated herein by reference. The plasmid was assigned the following A.T.C.C. accession number. Clone 11 was assigned A.T.C.C. accession number 69613, clone 13 was given A.T.C.C. accession number 69611, clone 48 was given A.T.C.C. accession number 69610, and clone 119 was given A.T.C.C. accession number 69612.
Additional strains from the HGBV nucleic acid sequence library (clone 4-B1.1, 66-3A1.49, 70-3A1.37 and 78-1C1.17) were 12301 as of July 28, 1994 based on the Budapest Treaty. Deposited at the American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, which is stored for 30 years from the date of deposit, 5 years from the latest sample order request, or the life of a U.S. patent, whichever is longer . The above deposited strains and all other deposited materials described herein are provided for convenience only and are not required to practice the present invention in light of the teachings herein. The HGBV cDNA sequence in all deposited materials is incorporated herein by reference. The plasmids were assigned the following A.T.C.C. accession numbers. Clone 4-B1.1 has ATCC deposit number 69666, clone 66-3A1.49 has ATCC deposit number 69665, clone 70-3A1.37 has ATCC deposit number 69664, and clone 78-1C1.17 has ATCC deposit number 69663. Was.
Clone pHGBV-C clone # 1 was deposited with the American Type Culture Collection located at 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 on November 8, 1994, based on the Budapest Treaty, requesting the latest sample transfer for 30 years from the date of deposit. For a maximum of five years, or the life of a U.S. patent, whichever is longer. The above deposited strains and all other deposited materials described herein are provided for convenience only and are not required to practice the present invention in light of the teachings herein. pHGBV-C clone # 1 has been assigned A.T.C.C. accession number 69711. The HGBV cDNA sequence in all deposited materials is incorporated herein by reference.
Preparation of viral polypeptides and fragments
The availability of the nucleic acid sequence allows the construction of an expression vector encoding the antigen-active region of the polypeptide encoded by either chain. These antigenically active regions include, for example, the envelope (coat) or core, in addition to the non-structural regions of the virus, including, for example, polynucleotide binding proteins, polynucleotide polymerases, and other viral proteins necessary for viral particle replication and / or assembly. It can be derived from the structural region of the virus, including the antigen. Fragments encoding the desired polypeptides can be obtained from genomic or cDNA clones by conventional restriction digestion or synthetic methods, such as, for example, β-galactosidase (β-gal), superoxide dismutase (SOD), or CMP-KDO synthetase (CKS). It is ligated into a vector that may contain a portion of the fusion sequence. Methods and vectors useful for the production of polypeptides containing SOD fusion sequences are described in EPO 0196056, published October 1, 1986, and are useful for the production of polypeptides containing CKS fusion sequences. The vector is described in EPO 0331961 published September 13, 1989. Any desired portion of the nucleic acid sequence containing the open reading frame in either direction of the strand can be obtained as a recombinant protein, such as a mature or fusion protein, or the polypeptide encoded by the HGBV genome or cDNA can be provided by chemical synthesis. You can also.
The nucleic acid sequence encoding the desired polypeptide is linked to an appropriate expression vector in any suitable host, regardless of whether it is in a fused or mature form and whether or not it contains a signal sequence that allows for secretion. can do. Recombinant proteins can be formed in the art using both eukaryotic and prokaryotic host systems, and several of these hosts are listed herein. The polypeptide is then isolated from the lysed cells or medium and purified to the extent required for the intended use. Purification can be performed by a method known to those skilled in the art, and in particular, salting out, ion exchange resin chromatography, affinity chromatography, centrifugation and the like can be used. Such polypeptides can be used as diagnostics or for passive immunotherapy. In addition, antibodies to these polypeptides are useful for isolating and identifying HGBV particles. HGBV antigens can also be isolated from HGBV particles. These virus particles can be grown in HGBV-infected cells in tissue culture or infected individuals.
Preparation of antigenic polypeptide and binding to solid phase
The antigenic region or fragment of a polypeptide is relatively small, usually about 8 to 10 amino acids in length or less. Fragments as small as 5 amino acids can characterize the antigenic region. These segments may correspond to regions of the HGBV antigen. By using HGBV genomic or cDNA sequences as a basis, nucleic acid sequences encoding short segments of HGBV polypeptides can be expressed recombinantly as fusion proteins or isolated polypeptides. These short amino acid sequences can also be obtained by chemical synthesis. Small chemically synthesized polypeptides can be conjugated to a suitable carrier molecule if the resulting synthetic polypeptide is properly positioned to provide the correct epitope and is too small to be antigenic. Coupling methods are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) and succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC). By adding a cysteine residue, a polypeptide having no sulfhydryl group can be modified. These substances form a disulfide bond between the substance and a peptide cysteine residue on one protein, and an amide bond via the ε-amino or other free amino group on lysine in the other protein. I do. Various such disulfide / amide-forming substances are known. Other bifunctional coupling agents form thioesters rather than disulfide bonds. Many of these thioether forming agents are commercially available and known to those skilled in the art. The carboxy group can be activated by conjugation with succinimide or 1-hydroxy-2-nitro-4-sulfonic acid sodium salt. Any carrier that does not itself induce the production of antibodies harmful to the host can be used. Suitable carriers can include, inter alia, proteins, polysaccharides (eg, latex functionalized sepharose, agarose, cellulose, cellulose beads), polymeric amino acids (eg, polyglutamic acid, polylysine, amino acid copolymer) and inactive virus particles. Examples of protein substrates include serum albumin, mussel hemocyanin, immunoglobulin molecules, thyroglobulin, ovalbumin, tetanus toxin, and other proteins known to those of skill in the art.
Preparation of hybrid particle immunogen containing HGBV epitope
The immunogenicity of an HGBV epitope can also be enhanced by preparing it in a mammalian or yeast system fused or conjugated to a particle forming protein (eg, as in the HBV surface antigen). Constructs in which the HGBV epitope is directly linked to the sequence encoding the particle-forming protein generate an immunogenic hybrid against the HGBV epitope. Moreover, all vectors containing epitopes specific for HGBV prepared have different degrees of immunogenicity. Particles constructed from particle forming proteins containing HGBV sequences are immunogenic for HGBV and HBV.
Hepatitis B surface antigenS.cerevisiaeAnd binding to particles formed in mammalian cells, and formation of these particles has been reported to enhance the immunogenicity of monomeric subunits. P. Valenzuela et al.Nature  298: 334 (1982); P. Valenzuela et al., I. Millman et al.Hepati tis B, Plenum Press, pp. 225-236 (1984). The construct may include an immunodominant epitope of HBsAg. Such constructs have been reported to be expressible in yeast, and hybrids containing heterologous viral sequences for yeast expression have been disclosed. See, for example, EPO 174,444 and EPO 174,261. It has also been reported that these constructs can be expressed in mammalian cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) cells. Michelle et al.Internat ional Symposium on Viral Hepatitis, 1984. In HGBV, the portion of the sequence encoding the particle forming protein can be replaced with a codon encoding an HGBV epitope. This substitution deletes unnecessary regions to mediate aggregation of units to form immunogenic particles in yeast or mammals, thus eliminating additional HGBV antigen sites from competition with HGBV epitopes be able to.
Vaccine production
A vaccine can be made from an HGBV nucleic acid sequence or one or more immunogenic polypeptides or nucleic acids from the HGBV genome corresponding to the nucleic acid sequence. The vaccine may include a recombinant polypeptide comprising an epitope of HGBV. These polypeptides may be expressed in bacterial, yeast or mammalian cells, or may be isolated from viral preparations. It is also anticipated that various structural proteins may include HGBV epitopes that induce protective anti-HGBV antibodies. Thus, synthetic peptides can also be used in the production of these vaccines. Thus, a polypeptide comprising at least one epitope of HGBV can be used alone or in combination in an HGBV vaccine. Further, it is expected that non-structural and structural proteins may provide protection against viral pathogenicity, even though they do not produce neutralizing antibodies.
In view of the above, multivalent antibodies to HGBV may include one or more structural proteins and / or one or more non-structural proteins. These vaccines can be composed of, for example, recombinant HGBV polypeptides and / or polypeptides isolated from virus particles and / or synthetic peptides. These immunogenic epitopes can be used in combination, i.e. as a mixture of recombinant proteins, synthetic peptides and / or polypeptides isolated from viral particles, and these vaccines can be used at the same or different times. Can be administered. Furthermore, it may be possible to use inactivated HGBV in vaccines. Such inactivation may prepare a virus lysate, or other means known to those skilled in the art to cause inactivation of the hepatitis-like virus, such as treatment with organic solvents or detergents, or formalin. The processing may be performed. The present invention also discloses attenuated HGBV strain preparations. Some proteins in HGBV can cross-react with other known viruses, so there is a shared epitope between HGBV and other viruses, leading to protective antibodies against one or more of the diseases caused by these pathogens It is expected to be. It is anticipated that multi-purpose vaccines can be designed based on this belief.
The preparation of a vaccine containing at least one immunogenic peptide as an active ingredient is known to those skilled in the art. Typically, such vaccines are prepared as injectables as solutions or suspensions. Solid forms suitable for solution or suspension in liquid prior to injection can also be prepared. The preparation may be emulsified, or the protein may be encapsulated in liposomes. The active immunogenic ingredient is often mixed with a pharmaceutically acceptable excipient that is compatible with the active ingredient. Non-limiting examples of suitable excipients include water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, and various amounts of these excipients may be used in combination. The vaccine may also contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting agents, emulsifying agents, pH buffering agents and / or adjuvants which enhance the efficacy of the vaccine. For example, such adjuvants include aluminum hydroxide, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-DMP), N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11687). N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1 ′, 2′-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) ethylamine (CGP) 19835A, also known as MTP-PE) and 2% squalene / Tween-80® emulsion of RIBI (MPL + TDM + CWS). The efficacy of an adjuvant can be determined by measuring the amount of antibody to an immunogenic polypeptide containing an HGBV antigen sequence resulting from administration of the polypeptide in a vaccine also composed of various adjuvants.
Vaccines are usually administered by intravenous or intramuscular injection. Another formulation suitable for other modes of administration includes suppositories and, in some cases, oral formulations. In the case of suppositories, non-limiting examples of conventional binders and carriers include polyalkylene glycols or triglycerides. Such suppositories may be formed from mixtures containing from about 0.5% to about 10%, preferably from about 1% to about 2%, of the active ingredient. Oral formulations include such normally employed excipients as, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, and the like. These compositions may take the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release formulations or powders and contain from about 10% to about 95%, preferably from about 25% to about 70%, of the active ingredient. May be contained.
The proteins used in the vaccine can be incorporated into the vaccine as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with the free amino groups of the peptide) and formed with inorganic acids (eg, hydrochloric or phosphoric acid) or organic acids (acetic, oxalic, tartaric, maleic). Alternatively, other salts known to those skilled in the art can be used. Salts formed with free carboxyl groups include inorganic bases (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium hydroxide, iron (III) hydroxide, etc.) and organic bases (eg, isopropylamine, trimethylamine, 2-ethyl Aminoethanol, histidine, procaine) and other bases known to those skilled in the art.
The vaccine is administered in a manner compatible with the dosage formulation, and in such amount as will be prophylactically and / or therapeutically effective. The dosage will generally be from about 5 μg to about 250 μg of antigen at a time, depending on the recipient patient, the ability of the patient's immune system to synthesize antibodies and the degree of protection desired. The exact amount of active ingredient required for administration will also depend on the judgment of the prescribing physician, and will vary from patient to patient. The vaccine may be administered on a single dose schedule or on a multiple dose schedule. In the multiple administration, the primary vaccination process is performed in 1 to 10 times, and the secondary administration is performed after a period necessary to maintain and / or enhance the immune response, for example, 1 to 4 months later, If needed, administer several months later. The dosage regimen will be determined, at least in part, by the needs of the individual and will be at the discretion of the prescribing physician. It is anticipated that vaccines containing immunogenic HGBV antigens may be co-administered with other immunomodulators, such as immunoglobulins.
Production of antibodies against HGBV epitope
Polyclonal or monoclonal antibodies are produced using the immunogenic peptides prepared as described herein. In preparing a polyclonal antibody, a selected mammal (eg, mouse, rabbit, goat, horse, etc.) is immunized with an immunogenic polypeptide having at least one HGBV epitope. Serum from the immunized animals is collected after an appropriate incubation time and processed according to known procedures. When the serum containing a polyclonal antibody against the HGBV epitope contains an antibody against another antigen, the polyclonal antibody can be purified by, for example, immunoaffinity chromatography. Methods for producing and processing polyclonal antibodies are known to those of skill in the art and are described, inter alia, in Mayer and Walker, eds.Imm unochemical Methods In Cell and Molecular Bi ology, Academic Press, London (1987). Polyclonal antibodies can also be obtained from mammals previously infected with HGBV. Described herein is one example of a method for purifying antibodies to an HGBV epitope from the serum of an individual infected with HGBV using affinity chromatography.
Monoclonal antibodies to the HGBV epitope can also be produced by one of skill in the art. General methods for producing such antibodies are well known and are described, for example, by Kohler and Milstein,Nature  256: 494 (1975), edited by J.G.R.Hurrel,Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techni ques and Applications, CRC Press Inc., Boco Raton, FL (1982); L. T. Mimms et al.Virolo gy  176: 604-619 (1990). Immortalized antibody producing cell lines can be produced by cell fusion, or by other methods, such as direct transformation of B lymphocytes with oncogene DNA or transfection with Epstein-Barr virus. Similarly, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques, Scopes (1980) Protein Purification, Principles and Practice, 2nd edition, Springer-Verlag, New York (1984); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennet See Monoclonal Abtibodies (1980). Examples of the use and techniques of monoclonal antibodies are disclosed in U.S. Patent Applications Nos. 748,292, 748,563, 610,175, 648,473, 648,477 and 648,475.
Monoclonal and polyclonal antibodies against the HGBV epitope thus developed are useful for diagnostic and prognostic applications, and neutralizing antibodies are useful for passive immunotherapy. Monoclonal antibodies can be used in particular for producing anti-idiotype antibodies. These anti-idiotype antibodies are immunoglobulins that have an "internal view" of the antigen of the infectious agent for which protection is desired. For example, A. Nisonoff et al.Clin.Immunol.Immunopath.21: 397-406 (1981) and Dreesman et al.J.Infect.Dis.151: 761 (1985). Methods for deriving such idiotypic antibodies are known to those of skill in the art, for example, Grych et al.,Nature  316: 74 (1985); MacNamara et al.Science  226: 1325 (1984); and Uytdehaag et al.J.Immunol.134: 1225 (1985). These anti-idiotype antibodies may also be useful in treating HGBV infection and elucidating the immunogenic region of the HGBV antigen.
Diagnostic oligonucleotide probes and kits
Using a predetermined portion of the isolated HGBV nucleic acid sequence as a substrate, it hybridizes with the HGBV genome and is useful for identifying viral agents, further characterizing the viral genome, and detecting the virus in affected individuals. Oligomers of nucleotides or more can be cut out or produced by synthesis. Natural or derived probes for HGBV polynucleotides are of a length that allows detection of a single viral sequence by hybridization. While 6-8 nucleotides may be of manageable length, a sequence of 10-12 nucleotides is preferred, and a sequence of about 20 nucleotides may be most preferred. It is preferred that these sequences are derived from regions lacking heterogeneity. These probes can be manufactured using standard standard methods, including automated oligonucleotide synthesis methods. The complement of any single part of the HGBV genome will be satisfactory. Perfect complementarity may be unnecessary as fragment length increases, but is desirable for use as a probe.
When used as a diagnostic reagent, a test sample to be analyzed, such as blood or serum, may be processed, for example, to extract nucleic acids contained in the sample. The nucleic acids obtained from the sample may be subjected to gel electrophoresis or other size separation techniques, or the nucleic acid sample may be dot blotted without size separation. The probe is then labeled. Suitable labels and methods for attaching labels to probes are known in the art and include, but are not limited to, radioactive labels incorporated by nick translation or kinase reaction, biotin, fluorescent and chemiluminescent probes. There is no limitation. Many examples of these labels are disclosed herein. The nucleic acid extracted from the sample is then treated with a labeled probe under hybridization conditions of appropriate stringency.
The probe can be perfectly complementary to the HGBV genome. Therefore, conditions with high strictness are usually desirable to avoid false positives. However, stringent conditions should only be used if the probe is complementary to a region of the HGBV genome that lacks heterogeneity. The stringency of hybridization is determined by several factors during the washing procedure (eg, temperature, ionic strength, time, and formamide concentration). See, for example, J. Sambrook (supra). Hybridization can be performed by several different techniques. Amplification can be performed by, for example, ligase chain reaction (LCR), polymerase chain reaction (PCR), Q-β replicase, NASBA, or the like.
The HGBV genome sequence is, for example, about 10^Two~Ten^ThreeIt is believed that relatively low levels of individual sequences / ml may be present in the serum of infected individuals. At this level, hybridization assays may require the use of amplification techniques such as the ligase chain reaction or the polymerase chain reaction. Such techniques are well-known in the art. For example, the "biobridge" system uses a terminal deoxynucleotide transferase to add an unmodified 3'-poly-dT-tail to a nucleic acid probe (Enzo Biochem. Corp.). A probe with a poly-dT-tail is hybridized to the target nucleotide sequence and then to biotin-modified poly-A. Furthermore, a DNA hybridization assay in which an analyte is annealed to a single-stranded DNA probe complementary to an enzyme-labeled oligonucleotide and the resulting tailed duplex is hybridized to the enzyme-labeled oligonucleotide is disclosed in European Patent No. No. 124221. EP 204510 discloses a probe having a tail (e.g., poly-dT-tail) and a sequence (e.g., poly-A sequence) that hybridizes the analyte DNA to the tail of the probe, and comprises a plurality of labeled strands. A DNA hybridization assay is described that contacts an amplifier strand capable of binding to. This technique first targets the target HGBV sequence in serum by about 10⁶Amplifying to 3 sequences / ml. This is Saiki etc.Nature  324: 163 (1986). The amplified sequence can then be detected using a hybridization assay as known in the art. The probe can be packaged in a diagnostic kit containing a probe nucleic acid sequence that can be labeled. Alternatively, the labeling component may be included in the kit without labeling the probe. The kit may further include other suitably packaged reagents and materials necessary or desirable for the particular hybridization protocol, such as standards and instructions for performing the assay.
Other known amplification methods that can be used in the present invention include:PNAS USA  87: 1874-1878 (1990),Nature: 350 (No. 6313): 91-92 (1991), including, but not limited to, the so-called "NASBA" or "3SR" technology, and Q-β replicase.
Fluorescent in situ hybridization ("FISH") can also be performed using the reagents described herein. In situ hybridization is based on the collection of tissues, cells or chromosomes that have not lost their morphology by nucleic acid hybridization to demonstrate the presence of special genetic information or the specific location of said information within individual cells. Become. This does not require cell homogenization and extraction of the target sequence, so the exact location and distribution of the sequence in the cell population is known. In situ hybridization can identify the sequence of interest that is concentrated in the cell, and can also identify the type and fraction of cells in a heterogeneous cell population that contains the sequence. DNA and RNA can be detected with the same assay reagent. PNA can be used in the FISH method to detect targets without amplification. If an increase in signal is desired, multiple fluorophores can be used to increase the signal and increase the sensitivity of the method. Various FISH methods are known, including one-step methods using multiple oligonucleotides or conventional multi-step methods. It is within the scope of the present invention that these types of methods can be automated by various means (eg, flow cytometry and image analysis).
Immunoassay and diagnostic kit
Polypeptides immunoreactive with serum containing HGBV antibodies and their complexes, and antibodies to HGBV-specific epitopes in these polypeptides, are both present in the biological test sample in the presence of HGBV antibodies or in the presence of virus and / or virus antibodies. Useful in immunoassays that detect The design of these immunoassays is often subject to variations, and these variations are known in the art. These variations are described herein. Immunoassays are derived from one viral antigen (eg, clones containing HGBV nucleic acid sequences, or composite nucleic acid sequences derived from HGBV nucleic acid sequences in these clones, or the HGBV genome that is the source of nucleic acid sequences in these clones). Polypeptide). Alternatively, the immunoassay may use a combination of viral antigens derived from these sources. Immunoassays can use, for example, monoclonal antibodies to the same viral antigen, or polyclonal antibodies to different viral antigens. Assays include, but are not limited to, those based on competition assays, direct reaction assays or sandwich-type assays. The assay may use a solid phase or may be performed by immunoprecipitation or any other method that does not use a solid phase. Assays using labels as signal-generating compounds and examples of these labels are described herein. The signal may be further amplified using biotin and avidin, an enzyme label or a biotin anti-biotin system as described in pending U.S. Patent Applications Nos. 608,849, 070,647, 418,981, and 687,785. Recombinant polypeptides containing epitopes from the immunodominant region of HGBV may be useful for detecting viral antibodies in biological test samples of infected individuals. It is also believed that antibodies may be useful in distinguishing between acute and non-acute infections. Package the appropriate material (eg, an HGBV epitope or a polypeptide of the invention including an antibody against the HGBV epitope) in a suitable container along with other reagents and materials necessary to perform the assay, and appropriate assay instructions. Thus, a kit containing an appropriate reagent and suitable for immunodiagnosis is manufactured.
Assay formats using the recombinant proteins detailed herein can be designed. Although we describe the CKS protein, other expression systems such as superoxide dismutase (SOD) and the like can be used in the present invention to use fusion proteins, such as antigens for immunoassays, in a variety of ways. It is also considered that an immunogen for producing antibodies can be produced. In an assay format for detecting the presence of antibodies to a specific analyte (eg, an infectious agent such as a virus) in a human test sample, the human test sample is coated with at least one recombinant protein (polypeptide). Incubate in contact with the solid phase. If an antibody is present in the test sample, the antibody forms a complex with the antigen polypeptide and is immobilized on a solid phase. After formation of the complex, the solid phase is washed to remove unbound substances and reagents. The complex is reacted with the indicator reagent and incubated for a time and under conditions for the formation of the second complex. The signal generated is detected to determine the presence of an antibody against the CKS recombinant polypeptide in the test sample. Signal generation above the cut-off value indicates the presence of antibodies to the analyte in the test sample. With multiple indicator reagents, such as enzymes, the amount of antibody present is proportional to the signal generated. Depending on the type of test sample, the test sample may be diluted with a suitable buffer reagent, concentrated, or contacted without manipulation ("neat") with the solid phase. For example, it is usually preferable to test a pre-diluted serum or plasma sample or concentrate a sample such as urine to determine the presence and / or amount of antibody present.
Furthermore, the aforementioned assay format, which tests for the presence of antibodies to specific infectious agents using CKS fusion proteins against various antigenic epitopes of the viral genome of the infectious agent under study, uses two or more recombinant proteins. be able to. Thus, using a recombinant polypeptide containing an epitope within a specific viral antigenic region and an epitope from another antigenic region from the viral genome is more advantageous than using a polypeptide derived from one type of epitope. It would be desirable to provide an assay with increased sensitivity and possibly higher specificity. Such an assay can be used as a confirmatory assay. In this particular assay format, a known amount of test sample is coated with at least one known amount of at least one recombinant protein coated with at least one recombinant protein for a time and under conditions sufficient to form a recombinant protein / antibody complex. Contact with the solid phase. The conjugate is contacted with a known amount of the appropriate indicator reagent under appropriate conditions for a time to effect the reaction. The signal generated is compared to a negative test sample to determine the presence of antibodies to the analyte in the test sample. When using certain solid phases, such as microparticles, each recombinant protein used in the assay adheres to individual microparticles, or a mixture of the microparticles produced by combining the various coated microparticles, resulting in each Can be optimized for the assay.
Variations of the above assay format include CKS recombinant proteins of various analytes attached to the same or different solid phases (eg, coated on the same or different solid phases) to detect the presence of antibodies to each analyte. The CKS recombinant protein specific to one antigenic region of one infectious agent thus obtained is taken together with a CKS recombinant protein specific to an antigenic region of a different infectious agent, and one (or both) of the infectious agents is Detecting its presence.
In another assay format, CKS recombinant proteins containing antigenic epitopes are useful in competition assays, such as neutralization assays. To perform a neutralization assay, a recombinant polypeptide that represents an epitope in the antigenic region of an infectious agent, such as a virus, is solubilized and mixed with sample diluent to a final concentration of 0.5-50.0 μg / ml. . A known amount of test sample, preferably diluted (preferably 10 μl), is added to the reaction wells, followed by 400 μl of test dilution containing the recombinant polypeptide. If desired, the mixture may be pre-incubated for about 15 minutes to 2 hours. The solid phase coated with the CKS recombinant protein described herein is then added to the reaction well and incubated at about 40 ° C. for 1 hour. After washing, a known amount of an indicator reagent, for example 200 μl of peroxidase-labeled goat anti-human IgG in binding diluent, is added and incubated at 40 ° C. for 1 hour. After washing, when using an enzyme conjugate as described above, an enzyme substrate (eg, OPD substrate) is added and incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction is stopped by adding a terminator such as 1N sulfuric acid to the reaction wells. Read the absorbance at 492 nm. In a test sample containing an antibody to a specific polypeptide, signal generation due to competitive binding between the peptide and the antibody in solution is reduced. The percentage of competitive binding can be calculated by comparing the absorbance value of the sample in the presence of the recombinant polypeptide to the absorbance value of the sample assayed in the absence of the same dilution of the recombinant polypeptide. Thus, the difference in signal that occurs between a sample in the presence of the recombinant protein and a sample in the absence of the recombinant protein is a measure used to determine the presence or absence of the antibody.
In another assay format, the recombinant protein can be used in an immunodot blot assay system. The immunodot plot assay system uses a panel of purified recombinant polypeptides juxtaposed on a nitrocellulose solid support. The manufactured solid phase carrier is brought into contact with a sample, and a specific antibody (specific binding member) against the recombinant protein (other specific binding member) is captured to form a specific binding member pair. The captured antibody is detected by reacting with the indicator reagent. Preferably, the conjugate specific reaction is quantified using a reflectivity optics assembly in the instrument described in U.S. patent application Ser. No. 07 / 227,408, filed Aug. 2, 1988. Related U.S. Patent Application Nos. 07 / 227,586 and 07 / 227,590 (both filed August 2, 1988) are further assigned by the present applicant and are incorporated by reference herein into US Patent No. 5,075,077 (1988). No. 07 / 227,272, filed Aug. 2, 1998), describes specific methods and devices useful for performing immunodot assays. Briefly, a nitrocellulose-based test cartridge is treated with a number of antigenic polypeptides. Each polypeptide is contained within a specific reaction zone on a test cartridge. After all antigen polypeptides have been deposited on the nitrocellulose, excess binding sites on the nitrocellulose are blocked. The test cartridge is then contacted with the test sample such that each antigenic polypeptide in each reaction zone reacts if the test sample contains the appropriate antibody. After the reaction, the test cartridge is washed and any antigen-antibody reaction is identified using suitable reagents well known in the art. The entire process is automatable, as described in the patents and patent applications cited herein. The aforementioned application relating to the method and apparatus for performing an immunodot blot assay is incorporated herein by reference.
The CKS fusion protein can be used in an assay that uses first and second solid carriers described below to detect an antibody against a specific antigen of an analyte in a test sample. In this assay format, a first aliquot of a test sample is coated with an analyte-specific CKS recombinant protein for a time and under conditions sufficient to form a recombinant protein / analyte antibody complex. With the first solid phase carrier. The complex is then contacted with an indicator reagent specific for the recombinant antigen. The indicator reagent is detected to determine the presence of antibodies to the recombinant protein in the test sample. A second aliquot of the test sample is then coated with a CKS recombinant protein specific for the second antibody for a time and under conditions sufficient to form a recombinant protein / second antibody complex. The second analyte is then contacted with a second solid phase carrier to examine the presence of different antigenic determinants of the same analyte. The conjugate is contacted with a second indicator reagent specific for the antibody of the conjugate. The signal is detected to determine the presence of the antibody in the test sample. The presence of antibodies to one or both analyte recombinant proteins indicates the presence of anti-analyte in the test sample. It is also contemplated that solid supports can be tested simultaneously.
The use of haptens is known in the art. Haptens could also be used in assays using CKS fusion proteins to enhance the performance of the assay.
HGBV genome, virions and viral anti-probes using probes Hara's further characterization
The HGBV nucleic acid sequence can be used to obtain additional information about the sequence of the HGBV genome and the identification and isolation of HGBV agents. Thus, this knowledge may be useful for analyzing the properties of HGBV, such as the type of HGBV genome, the structure of virus particles, and the type of antigens that make up HGBV. With this information, additional polynucleotide probes, polypeptides derived from the HGBV genome, and antibodies to HGBV epitopes can be obtained. They are useful for the diagnosis and / or treatment of non-A, non-B, non-C, non-D and non-E hepatitis caused by HGBV.
The nucleic acid sequence information is useful in designing probes or PCR primers to isolate additional nucleic acid sequences from undefined regions of the HGBV genome. For example, using a PCR primer or labeled probe comprising a sequence of 8 or more, preferably 20 or more nucleotides, and derived from a region near the 5 'or 3' end of the HGBV nucleic acid sequence family, It may be isolated from HGBV genomic or cDNA libraries or directly from viral nucleic acids. Then, using the sequence that further includes a sequence from a region of the genome that overlaps with the HGBV nucleic acid sequence but is not the source of the HGBV nucleic acid sequence, other overlaps that do not necessarily overlap with the nucleic acid sequence in the clone are used. Probes for identifying fragments may be synthesized. If the HGBV genome is segmented but lacks consensus sequences, it is possible to determine the sequence of the entire viral genome using techniques for isolating overlapping nucleic acid sequences derived from the viral genome. Alternatively, genomic segment characterization can be performed from the viral genome isolated from purified HGBV particles. Methods for purifying HGBV particles and detecting the particles during the purification procedure are described herein. Procedures for isolating polynucleotide genomes from viral particles are well known in the art. The isolated genomic segment can then be cloned and sequenced. Thus, it is possible to clone and sequence the HGBV genome independent of its type. Methods for constructing HGBV genomic or cDNA libraries are known in the art, and useful vectors for this are also known in the art. These vectors include λ-gt11, λ-gt10, and the like. The isolated polynucleotide may be digested with appropriate restriction enzymes, and the HGBV-derived nucleic acid sequence detected by a HGBV genomic or cDNA-derived probe isolated from the clone and sequenced.
Sequence information derived from these overlapping HGBV nucleic acid sequences is useful for determining areas of homology and heterogeneity within the viral genome. This may indicate the presence of various genomic strains and / or defective particle populations. This is also useful for designing hybridization probes to detect HGBV or HGBV antigens or HGBV nucleic acids in biological samples during the isolation of HGBV using the techniques described herein. The overlapping nucleic acid sequence may be used to produce an expression vector for a polypeptide from the HGBV genome. Antigens containing epitopes that are considered unique to HGBV are encoded within the nucleic acid sequence family. That is, antibodies against these antigens are not present in individuals infected with HAV, HBV, HCV and HEV, and the homology between the GenBank genomic sequence, these nucleic acid sequences and the source polynucleotide sequences is Considered small. Thus, antibodies to the antigen encoded by the HGBV nucleic acid sequence may be used to identify non-A, non-B, non-C, non-D and non-E particles isolated from an infected individual. Furthermore, they are also useful for isolating HGBV substances.
HGBV particles can be obtained, for example, by size-based techniques (eg, sedimentation or exclusion), or density-based techniques (eg, density gradient ultracentrifugation, or precipitation with substances such as polyethylene glycol (PEG), or anions. Alternatively, serum or cell cultures of infected individuals can be obtained by any method known in the art, including cation exchange materials, materials that bind by hydrophobic interactions, and chromatography on various materials such as affinity columns. Can be isolated from During the isolation procedure, the presence of HGBV is determined by performing a hybridization analysis of the extracted genome using a probe derived from the HGBV nucleic acid sequence, or by immunoassay using an antibody against the HGBV antigen encoded within the HGBV nucleic acid sequence family as a probe. Can be detected. Antibodies can be polyclonal or monoclonal, and it may be desirable to purify the antibody before use in an immunoassay. The antibody against the HGBV antigen immobilized on a solid phase is useful for isolating HGBV by immunoaffinity chromatography. Immunoaffinity chromatography methods are known in the art and include methods for immobilizing antibodies on a solid phase so as to retain immunoselective activity. These methods include adsorption and covalent bonding. The bifunctional coupling agent may include a spacer group so that the antigen-binding site of the antibody remains accessible.
During the purification procedure, the presence of HGBV may be detected and / or verified by nucleic acid hybridization or PCR, using polynucleotides from the HGBV genomic or cDNA sequence family, and overlapping HGBV nucleic acid sequences as probes or primers. . The fractions are treated using detergents under conditions that cause disruption of the viral particles, for example, in the presence of a chelating agent, and the presence of viral nucleic acids is determined by hybridization techniques or PCR. Infecting an individual (preferably tamarin) with the isolated viral particles and then determining whether the non-A, non-B, non-C, non-D and non-E hepatitis symptoms described herein are due to infection. Examination of whether may provide another confirmation that the isolated particles are HGBV infection inducers.
The properties of the aforementioned virus particles obtained from the purified preparation can then be further analyzed. Once the genomic nucleic acid has been purified, it can be tested to determine its sensitivity to RNAse or DNAse I. Based on these tests, HGBV may be examined as an RNA genome or a DNA genome. The number and cyclicity or acyclicity of the chains can be determined by methods known in the art, for example, visualization by electron microscopy, migration and sedimentation by density gradients. From the hybridization of the HGBV genome, the number of negative or positive strands (strandedness) of the purified nucleic acid can be determined. Furthermore, if the genomic material is RNA, the purified nucleic acid can be cloned and sequenced by known techniques (eg, reverse transcriptase). The whole genome can then be sequenced with the nucleic acid from the virus particle, whether segmented or not.
Determination of polypeptides containing conserved sequences is useful for selecting probes that bind to the HGBV genome, which will lead to isolation of the probes. Furthermore, the conserved sequences may be used together with sequences derived from HGBV nucleic acid sequences to design primers for use in systems that amplify genomic sequences. Furthermore, the structure of HGBV may be examined and its components may be isolated. For example, morphology and dimensions can be examined by electron microscopy. Determine whether the antigen is present in the major or minor viral components, and use the antibodies against the specific antigen encoded in the isolated nucleic acid sequence as a probe to probe the specific viral polypeptide antigen [eg, Envelope (coat) antigens or internal antigens (eg, nucleic acid binding proteins or core antigens)] and polynucleotide polymerases can be identified and located. This information can be useful for diagnostic and therapeutic applications. For example, it is preferred to include an external antigen in the vaccine preparation, or perhaps a multivalent vaccine will contain polypeptides derived from the genome encoding structural proteins, and polypeptides derived from other parts of the genome (eg, non-structural polypeptides). Peptide).
Cell culture and animal model systems for HGBV replication
In general, cells or cell lines suitable for culturing HGBV include monkey kidney cells (eg, MK2 and VERO), pig kidney cell lines (eg, PS), hamster infant kidney cell lines (eg, BHK), mouse macrophage cell lines (eg, P388D1). , MK1 and Mm1), human macrophage cell lines (eg, U-937), human peripheral blood leukocytes, human adherent monocytes, hepatocytes or hepatocyte cell lines (eg, HUH7 and HepG2), embryos or embryonic cells (eg, chicken embryo fibroblasts) Cells), or a cell line derived from an invertebrate, preferably an insect (eg, a Drosophila cell line), more preferably a cell line derived from an arthropod (eg, a mosquito cell line or a tick cell line). It is also possible to culture primary hepatocytes and then infect them with HGBV. Alternatively, hepatocyte cultures can be derived from the liver of an infected individual (human or tamarin). In the latter case,in vivoInfectin vitroIt is an example of a passaged cell line. In addition, various immortalization methods can be used to obtain cell lines derived from hepatocyte cultures. For example, primary liver cultures (before and after enrichment of the hepatocyte population) can be fused with various cells to maintain stability. In addition, cultures may be infected with the transforming virus or transfected with the transforming gene to produce permanent or semi-permanent cell lines. Furthermore, cells in liver culture may be fused into a defined cell line such as PehG2. Cell fusion methods are well known to those of skill in the art and include, inter alia, the use of fusion agents such as PEG and Sendai virus.
It is contemplated that HGBV infection of a cell line may be achieved by such techniques as incubating the cell with a virus preparation under conditions that allow the virus to enter the cell. It may also be possible to transfect cells with the isolated viral polynucleotide to obtain a viral preparation. Methods for transfecting tissue culture cells are known in the art and include, but are not limited to, techniques using electroporation and precipitation with DEAE-dextran or calcium phosphate. Virus is replicated by transfection with cloned HGBV genome or cDNA,in vitroMultiply. In addition to cultured cells, animal model systems may be used for virus replication. Thus, HGBV replication can occur in chimpanzees, as well as, for example, marmosets and infant mice.
Screening for HGBV antivirals
Since a cell culture system and an animal model system for HGBV can be used, it is possible to screen an antiviral agent that inhibits HGBV replication, particularly preferably a substance that inhibits virus replication and enables cell growth. These screening methods are known in the art. In general, antiviral agents can be used at various concentrations in animal model systems for the effects of antiviral agents on inhibiting viral replication in cell culture systems that support viral replication, followed by inhibition of infectivity or viral pathogenesis and low levels of toxicity. Inspect at. The methods and compositions for detecting HGBV antigens and HGBV polynucleotides described herein are useful for screening antiviral agents. Because, for the detection of the effect of antiviral agents on viral replication, these may be cell plaque assays or IDs.₅₀This is probably a more sensitive alternative to the assay. For example, the HGBV polynucleotide probes described herein may be used to quantify the amount of viral nucleic acid produced in a cell culture. This can be performed by hybridizing or competitively hybridizing the infected cell nucleic acid with a labeled HGBV polynucleotide probe. Furthermore, HGBV antigens in cell cultures may be identified and quantified by immunoassays described herein using anti-HGBV antibodies. Furthermore, the polypeptides encoded within the HGBV nucleic acid sequences described herein are useful in these assays, as it may be desirable to quantify HGBV antigens in infected cell cultures by competition assays. Generally, recombinant HGBV polypeptides derived from HGBV genomic or cDNA are labeled and the inhibition of binding of the labeled polypeptide to the HGBV polypeptide by antigens produced in cell culture is monitored. These methods are particularly useful where HGBV can replicate in a cell line without causing cell death.
Preparation of attenuated HGBV strain
Using the tissue culture and / or animal model systems described herein, it may be possible to isolate the attenuated HGBV strain. These attenuated strains are useful as vaccines or for isolating viral antigens. Attenuated strains can be isolated after multiple passages into cell culture and / or animal models. Detection of an attenuated strain in infected cells or individuals can be achieved according to the following methods known in the art, including using antibodies as a probe for one or more of the epitopes encoded by HGBV, Alternatively, use of a polynucleotide comprising an HGBV sequence of at least about 8 nucleotides in length as a probe may be included. Additionally or alternatively, attenuated strains may be constructed using the HGBV genomic information described herein and using recombinant techniques. Usually, a region of the genome that encodes a polypeptide involved in virulence, rather than viral replication, is deleted. By constructing a genome, an epitope that produces a neutralizing antibody against HGBV can be expressed. The denatured genome can then be used to transform cells that allow HGBV replication, and the cells can be grown under conditions that allow viral replication. Attenuated HGBV strains are useful not only for vaccines, but also as a source for commercial production of viral antigens. This is because treatment of these viruses does not require very strict protection for employees involved in virus production and / or production of virus products.
Host and expression control sequences
To extract genomes from viruses, create and probe genomic libraries, sequence clones, construct expression vectors, transform cells, perform immunoassays, and grow cells in culture The general techniques used for are well known in the art and are encompassed by the present invention.
When using the appropriate control sequences compatible with the designated host, both prokaryotic and eukaryotic host cells can be used for expression of the desired coding sequence. As a prokaryotic host,E.coliIs most often used. Prokaryotic expression control sequences include a promoter, optionally including an operator portion, and a ribosome binding site. Transfer vectors compatible with prokaryotic hosts are generally derived from plasmid pBR322, which contains an operon that confers ampicillin and tetracycline resistance, and various pUC vectors that also contain sequences that confer antibiotic resistance markers. Using these markers, good transformed cells can be obtained by selection. Commonly used prokaryotic control sequences include β-lactamase (penicillinase), the lactose promoter system (Chang et al.,N ature  198: 1056 [1977]), (Goeddel et al.,Nucleic A cid Res  8: 4057 [1980]), a tryptophan promoter system, a lambda inducible P1 promoter and an N gene ribosome binding site (Shimatake et al.Nature  292: 128 [1981]), andtrpas well aslacHybrid derived from UV5 promoter sequenceTacPromoters (De Boer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  292: 128 [1983]). The above system is particularlyE.coliBut if desired,BacillusShares orPseudomonasOther prokaryotic hosts, such as strains, may be used with the corresponding control sequences.
Eukaryotic hosts include yeast and mammalian cells in culture.Saccharomyces cerevisiaeas well asSaccharomyces carlsbergensisIs the most commonly used yeast host and a convenient fungal host. Yeast compatible vectors carry markers that render auxotrophic mutants prototrophic or confer heavy metal resistance on wild-type strains to allow for better selection of transformed cells. Yeast compatible vectors are 2 micron replication origins (Broach et al.,Meth.Enz.101; 307 [1983]), combinations of CEN3 and ARS1, or other means for effecting replication (eg, sequences that result in incorporation of the appropriate fragment into the host cell genome). The control sequences for yeast vectors are well known in the art and include promoters for glycolytic enzyme synthesis, including promoters for 3-phosphophycerate kinase. For example, Hess,J.Adv.Enzyme Reg.7: 149 (1968), Holland et al.,Biochemistry  17: 4900 (1978) and HitzemanJ. Biol. Chem.255: 2073 (1980). Holland, CA USJ. Biol. Chem. 256: 1385 (1981). Terminators such as those derived from the enolase gene may also be included. Particularly useful control systems include the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) promoter or alcohol dehydrogenase (ADH) regulatable promoter, as well as a terminator derived from GAPDH and, if secretion is desired, the yeast alpha factor. It is considered that the system contains a leader sequence from which it was derived. Further, the operably linked transcription regulatory region and transcription initiation region may be such that they are not innately associated in a wild-type organism.
Mammalian cell lines that can be used as expression hosts are known in the art and include many immortalized cell lines available from the American Type Culture Collection. These include HeLa cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, hamster infant kidney (BHK) cells, and the like. Suitable promoters for mammalian cells are also known in the art and include Simian virus 40 (SV40), Rous sarcoma virus (RSV), adenovirus (ADV), bovine papilloma virus (BPV), cytomegalovirus (CMV) Viral promoters as derived are included. Mammalian cells may further require a terminator sequence and a polyA addition sequence. Enhancer sequences that increase expression may be included, and sequences that induce gene amplification may be desirable. These sequences are known in the art. Vectors suitable for mammalian cell replication ensure the incorporation of the viral replicon or appropriate sequences encoding non-A, non-B, non-C, non-D, and non-E epitopes into the host genome May be included. One example of a mammalian expression system for HCV is described in US patent application Ser. No. 07 / 830,024, filed Jan. 31, 1992.
Transformation
Transformation is possible by known methods for introducing polynucleotides into host cells, and includes transduction of host cells with a virus that has incorporated the polynucleotide into a virus, and direct uptake of the polynucleotide. The transformation procedure selected depends on the host to be transformed. Transformation of bacteria by direct uptake generally uses treatment with calcium chloride or rubidium chloride. Cohen, ENG GBProc.Natl.Acad.Sci.USA  69: 2110 (1972). Graham et al.Virology  52: 526 (1978), or a variant thereof, may be used to perform yeast transformation by direct uptake.
Vector construction
Vector construction employs methods known in the art. Generally, site-specific DNA cleavage is performed by treatment with an appropriate restriction enzyme under conditions generally specified by the commercial enzyme manufacturer. Usually, about 1 microgram (μg) of the plasmid or DNA sequence is cleaved by incubation at 37 ° C. for 1-2 hours with 1-10 units of enzyme in about 20 μl of buffer solution. After incubation with restriction enzymes, proteins are removed by phenol / chloroform extraction and DNA is recovered by precipitation with ethanol. Cleavage fragments may be separated using polyacrylamide or agarose gel electrophoresis by methods known to those skilled in the art.
In the presence of the appropriate deoxynucleotide triphosphate (dNTP) present in the mixture,E.coli  The cohesive end cleaved fragment may be blunt-ended using DNA polymerase 1 (Klenow). Single-stranded DNA portions may be hydrolyzed using treatment with S1 nuclease.
Ligation using T4 DNA ligase and ATP under standard buffer and temperature conditions. Cohesive end ligation does not require ATP or ligase as much as blunt end ligation. When the vector fragment is used as part of a ligation mixture, the vector fragment is often treated with bacterial alkaline phosphatase (BAP) or calf intestinal alkaline phosphatase to remove the 5'-phosphate and prevent recombination of the vector. Alternatively, restriction enzyme digestion of unwanted fragments can be used to prevent ligation. The binding mixture,E.coliAlternatively, it is transformed into a suitable cloning host, such as a good transformed cell selected by a method involving antibiotic resistance, and then screened for the correct construction.
Construction of desired DNA sequence
Warner, ENG GBDNA  Synthetic oligonucleotides may be produced using an automated oligonucleotide synthesizer as described in 3: 401 (1984). If desired, using standard reaction conditions,³²Treating with polynucleotide kinase in the presence of P-ATP,³²Can be labeled with P. The DNA sequence (eg, a DNA sequence isolated from a genomic or cDNA library) can be obtained by known methods [eg, Zoller,Nu cleic Acid Res.10: 6487 (1982)]. Briefly, the DNA to be modified is packaged in a phage as a single-stranded sequence, and the primer is a synthetic oligonucleotide that is complementary to the DNA portion to be modified and contains the desired modification in its own sequence. Convert to double-stranded DNA with DNA polymerase. A culture of the transformed bacterium containing the replication zone of each chain of the phage is plated on agar to obtain plaques. Theoretically, 50% of the new plaques will contain phage with the mutated sequence and the remaining 50% will have the original sequence. The plaque replica is hybridized to the labeled synthetic probe at a temperature and under conditions suitable for hybridization with the correct strand, rather than the unmodified sequence. The sequence identified by the hybridization is recovered and cloned.
Hybridization with probe
Grunstein and Hogness,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  73: 3961 (1975), using the procedure described in HGBV genomic or DNA libraries. Briefly, DNA to be probed is immobilized on nitrocellulose filters, denatured, and 0-50% formamide, 0.75 M NaCl, 75 mM sodium citrate, 0.02% (w / v) bovine serum albumin (BSA) each. ), Polyvinylpyrrolidone and Ficoll, 50 mM sodium phosphate (pH 6.5), 0.1% SDS, and a buffer containing 100 μg / ml carrier-denatured DNA. The percentage of formamide in the buffer and the time / temperature conditions for the prehybridization and subsequent hybridization steps depend on the stringency required. Oligomeric probes, which may have lower stringency requirements, generally use lower formamide, lower temperature, and longer hybridization times. Probes containing 30 or more nucleotides, such as those derived from cDNA or genomic sequences, generally use higher temperatures, e.g., about 40-42 <0> C, and a high percentage of formamide, e.g. After prehybridization,³²A P-labeled oligonucleotide probe is added to the buffer and the filter is incubated in this mixture under hybridization conditions. After washing, the filter to be treated was subjected to autoradiography to indicate the position of the hybridized probe. Use the DNA at the corresponding position on the original agar plate as the source of the desired DNA.
Verification and sequencing of the construction
In standard vector construction, the ligation mixture isE.coliTransform into strain XL-1 Blue or other suitable host and select good transformed cells by antibiotic resistance or other markers. Then, usually Clewell et al.J. BacteriolAfter chloramphenicol amplification as described in .110: 667 (1972), Clewell et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA  A plasmid derived from a transformed cell is produced by the method of 62: 1159 (1969). DNA is isolated and analyzed, usually by restriction enzyme analysis and / or sequencing. Messing, etc.Nucleic Acid Res.9: 309 (1981).Proc. Natl.Acad.Sci.USA  74: 5463 (1977) by the well-known dideoxy method, or by Maxam et al.Methods in Enzymo logy  65: 499 (1980). The problem of band compression sometimes observed in GC-rich regions is described by Barr et al.Biotechniques  4: 428 (1986), with T-deazoguanosine.
Enzyme-linked immunosorbent assay
An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be used to measure antigen or antibody concentration. This method relies on the binding between an enzyme label and an antigen or antibody, and uses the bound enzyme activity (product signal) as a quantitative label (measurable product signal). Methods of using enzymes as labels, and examples of such enzyme labels, are described herein.
Creation of HGBV nucleic acid sequence
The source of the non-A, non-B, non-C, non-D, non-E material is an individual from human or tamarin infected with the HGBV virus that meets the clinical and experimental criteria described herein. Plasma, serum or liver homogenate or a pool thereof. Alternatively, the blood of another individual with non-A, non-B, non-C, non-E hepatitis that meets the criteria described below can be experimentally infected with tamarin. Pools can be prepared by combining multiple individual plasma, serum or liver homogenate samples containing high levels of alanine transferase activity. This activity is due to hepatitis damage due to HGBV infection. The TID of the virus calculated in one of our experiments was 4 × 10^Five/ Ml or more (see Example 2 below).
For example, a nucleic acid library derived from plasma, serum or liver homogenate, which is preferably, but not necessarily, high titer, is prepared by the following method. First, virus particles are isolated from plasma, serum or liver homogenate. The aliquot is then diluted in a buffer solution (eg, a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl). For example, debris is removed by centrifugation at 15,000 × g at 20 ° C. for 20 minutes. The virus particles in the resulting supernatant are then pelleted by centrifugation under appropriate conditions that can be routinely determined by those skilled in the art. To release the viral genome, the pellet is suspended in an SDS suspension [eg, a suspension containing 1% SDS, 120 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and further containing 2 mg / ml proteinase K]. And then incubated under appropriate conditions, eg, at 45 ° C. for 90 minutes, to break up the particles. For example, 0.8 μg MS2 bacteriophage RNA is added as a carrier and the mixture is phenol: chloroform [0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% (v / v) β-mercaptoethanol, 0.1% (w / v) Phenol saturated with hydroxyquinolone] is extracted four times and then extracted twice with chloroform to isolate the nucleic acid. After concentration of the aqueous phase, for example with 1-butanol, it is precipitated overnight at −20 ° C. with 2.5 volumes of absolute ethanol. For example, the nucleic acid is recovered by centrifugation at 40,000 rpm at 4 ° C. for 90 minutes using a Beckman SW41 rotor, and the nucleic acid is dissolved in water, treated with 0.05% (v / v) diethylpyrocarbonate, and autoclaved.
Nucleic acid obtained by the above procedure, for example, 17.5 mM CH_ThreeDenatured with HgOH, then cDNA is synthesized using this denatured nucleic acid as a template and cloned into the EcoRI site of phage λ-gt11 using, for example, the method described by Huynh (1985, supra). However, the random primer is replaced with oligo (dT) 12-18 during the synthesis of the first nucleic acid strand by reverse transcriptase (see Taylor et al., [1976]). The resulting double-stranded nucleic acid sequence is fractionated, for example, by sizing on a Sepharose CL-4B column. The eluted material having an average size of about 400, 300, 200 and 100 base pairs is pooled into the genomic pool. A λ-gt11 cDNA library is generated from the cDNA in at least one pool. Alternatively, where the etiological agent is a DNA virus, genomic DNA cloning methods are useful and are known to those skilled in the art.
The thus prepared λ-gt11 genomic library was used to obtain serum, plasma, or liver from a non-A, non-B, non-C, non-E hepatitis-existing individual (meeting the criteria described below). Screen for epitopes that can specifically bind to the homogenate. Using the method of Huyng et al.^Four~Ten⁷Individual phages are screened using serum, plasma or liver homogenate.¹²⁵Bound human antibodies can be detected with sheep anti-human Ig antiserum radiolabeled with I or another suitable reporter molecule (eg, HRPO, alkaline phosphatase, etc.). Positive phages are identified and purified. The phage is then tested using the same method for specificity of binding to the sera of a predetermined number of individuals previously infected with the HGBV substance. Ideally, the phage encodes a polypeptide that reacts with all or most of the serum, plasma or liver homogenate to be tested and is herein described for HGBV substances and hepatitis A, B, C, D, E. It does not react with serum, plasma or liver homogenates from individuals determined to be "negative" according to the criteria described in this document. In accordance with these procedures, a polypeptide immunologically specifically recognized by serum, plasma or liver homogenate from a patient identified as non-A, non-B, non-C, non-D, non-E Can be isolated.
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples. These examples are illustrative and do not limit the scope of the invention.
Example
The examples described herein describe in detail a method for detecting viruses of the HGBV group. The examples are listed in chronological order so that the discovery of the HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C viruses of the HGBV group can be traced. In general, transmission and infectivity studies were first performed. These and subsequent studies described herein have demonstrated the presence of two HCV-like viruses as HGBV, GB-A and GB-B. Furthermore, HGBV-C was discovered by subsequent experiments using degenerative primers, which are also described in detail herein. Prevalence of the virus group in humans as demonstrated by serum studies, virus characterization of the virus group, association with other viruses in that particular genus and correlation of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C The gender is also taught.
Example 1. Propagability of HGBV
A.Experimental protocol. Sixteen tamarins (Saguinus labiatsu) were obtained from the Laboratory for Experimental Medicine and Surgery in Primates, Tuxedo, New York (LEMSIP) for transmission and infectivity studies. All animals were maintained and monitored with LEMSIP according to the protocol approved by LEMSIP (Note: one animal died spontaneously and another diseased animal was euthanized before the start of the infectivity experiment). Reference serum for serum liver enzymes alanine transaminase (ALT), γ-glutamyltransferase (GGT) and isocitrate dehydrogenase (ICD) based on serum samples obtained once a week or once every two weeks for 2-3 weeks Liver enzyme levels were determined. A minimum of eight serum liver enzyme levels were obtained for each animal prior to inoculation. The cut-off value (CO) was determined for each animal based on the mean liver enzyme value plus 3.75 times the standard deviation. Liver enzyme levels above the cut-off value were abnormal and the liver was considered damaged. Several tamarins were inoculated as described below and monitored for changes in ALT, GGT and ICD serum levels. Thereafter, at certain times during the monitoring process, several animals were killed to obtain serum and tissue for subsequent experiments.
B.Inoculation of animals (initial experiment). A pool of known infectious tamarin GB serum (11 passages indicated as H205 GB pass 11) was obtained from sera collected during the early acute phase of hepatitis (19-24 days after inoculation) from 9 tamarins inoculated with HGBV. ) Was prepared. The pool was described previously (J.L.Dienstag et al.,Nature 264, supra; E. Tabor et al., J. Med. Virol. 5, supra) and were studied to determine related etiological agents. Aliquots of the pool were maintained under liquid nitrogen storage conditions at Abbott Laboratories (North Chicago, IL 60064) until used in this experimental study. Other aliquots of HGBV are available from the American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 under A.T.C.C.Accession No. VR-806.
On the first day, 4 out of the remaining 14 animals in the initial group were pre-diluted 1:50 in recognition numbers T-1053, T-1048, T-1057 and T-1061. Pool H205 was inoculated intravenously with 0.25 ml of 11 passages. These animals were monitored weekly for changes in liver enzymes ALT, GGT and ICD. Table 2 shows liver enzyme data before and after inoculation for these four tamarins (T-1053, T-1048, T-1057 and T-1061). Figures 1-4 show the ALT and ICD levels of tamarin in these four animals before and after inoculation. As the data show, four tamarins inoculated with a 1:50 dilution of pool H205 gave significant increases in ALT, GGT and ICD over CO over CO.
On the same day (Day 1), one tamarin (T-1047) was inoculated intravenously with 0.25 ml of pooled normal tamarin serum and used as a negative control, while another tamarin (T-1042) was used as a negative control. An additional negative control was given by intravenous inoculation of pooled normal human serum. FIGS. 5 and 6 and Table 3 show ALT and ICD levels before and after inoculation of two control tamarins (T-1047 and T-1042). As the data show, there was no increase in ALT or ICD in the two control tamarins during eight weeks.
On the same day (day 1), one tamarin (T-1044) was inoculated intravenously with 0.2 ml of convalescent serum obtained from the surgeon (of GB origin) approximately three weeks after the onset of acute hepatitis. This specimen was stored at −20 ° C. [F. Deinhardt et al.J.Exper.M ed.125: 673-688 (1967)]. Another tamarin (T-1034) was inoculated with 0.1 ml of the convalescent serum. As shown in FIGS. 7 and 8 and Table 4, there was no increase in the serum liver enzymes of these tamarins during the 11 weeks after inoculation. Thus, these data indicate that no infectious HGBV was detected in the convalescent serum collected from the original patient and stored at -20 ° C, indicating that the patient recovered from the infection. And may indicate that the virus has been removed from the patient's serum or that the virus titer has been reduced to undetectable levels by storage at -20 ° C.
C.Subsequent experiments. Tamarin T-1053 showed a significant increase in serum liver enzymes one week after inoculation and was retested for liver enzymes 11 days after inoculation. On day 12, it was determined that there was a significant increase in serum liver enzymes, and the animals were killed on that day. Plasma, liver and spleen tissue samples were obtained for subsequent experiments. Plasma from T-1053 was used as starting material for the RDA procedure described in Example 3 below, and liver tissue was used in Example 8 below.
Tamarin T-1048, T-1057 and T-1061 were monitored for serum liver enzymes. All of the animals were found to have elevated liver enzyme levels within two weeks after inoculation. These elevations were seen 6 weeks after inoculation. All three tamarins were found to have reduced serum liver enzyme levels to below CO by day 84 after inoculation. 97 days after inoculation, these three tamarins (T-1048, T-1057 and T-1061) were replaced with 0.10 ml of neat plasma from tamarin T-1053 (see Example 2). ) Was used to determine whether hepatitis, indicated as elevated serum liver enzymes, could be re-induced. The data is shown in Table 2, FIG. 1, FIG. 3, and FIG. The data show that the serum liver enzyme levels of the two tamarins (T-1057 and T-1061) remained below CO three weeks after inoculation. One tamarin (T-1048) showed a gradual increase in serum liver enzyme levels two weeks immediately after revaccination. The modest increase in T-1048 was presumed to be due to re-infection of liver tissue with HGBV or not fully recovering from the initial inoculation with H205.
Example 2. Infectivity experiment
A.Experimental protocol. Reference readings for four tamarins were obtained as described in Example 1 (A). Baseline serum liver enzyme (ALT, GGT and ICD) values were determined briefly for each animal prior to inoculation. The cut-off value (CO) was determined for each animal based on the mean liver enzyme value plus 3.75 times the standard deviation. Liver enzymes above the cutoff value were abnormal and considered to be liver damaged.
B.Tamarin inoculation. Plasma from Tamarin T-1053 killed 12 days after inoculation (see Example 1 [C]) was used as inoculum for subsequent experiments. On the first day, one tamarin (T-1055) was inoculated intravenously with 0.25 ml of neat T-1053 plasma. On the same day, two tamarins (T-1038 and T-1051) contained 10% in pooled normal tamarin plasma.^-Four(T-1038) or 10^-Five0.25 ml of T-1053 plasma which had been sequentially diluted in (T-1051) was inoculated intravenously. On the same day, Tamarin T-1049 was filtered through a series of filters of reduced pore size (0.8 μm, 0.45 μm, 0.22 μm, and 0.10 μm) to give 10% pooled normal tamarin plasma.^-FourWas intravenously inoculated with 0.25 ml of T-1053 plasma, which had been diluted to 1.
All tamarins (T-1055, T-1038, T-1051 and T-1049) were monitored weekly as described in Example 1 for changes in serum liver enzymes ALT, GGT and ICD. Table 5 shows pre- and post-inoculation serum liver enzyme data for these four tamarins. FIG. 9 shows ALT and ICD values before and after inoculation of T-1055. Referring to FIG. 9, it can be seen that serum liver enzymes ALT and ICD increased more than CD. The tamarin was killed 12 days after inoculation. FIGS. 10 and 11 show the pre- and post-inoculation serum levels of ALT and ICD of tamarin T-1051 and T-1038, respectively. Referring to FIG. 10 and FIG. 11, it can be seen that serum liver enzymes ALT and ICD of both animals increased until day 11 after inoculation. T-1038 was killed 14 days after inoculation. Table 5 and FIG. 12 show the data obtained for T-1049. As can be seen from Table 5 and FIG. 12, within 10 days after inoculation, T-1049 showed an increase in serum liver enzymes exceeding CO.
Filtration experiments performed on T-1049 showed that HGBV could pass through a 0.10 μm filter, suggesting that it was viral from HGBV and could be less than 0.1 μm in diameter. In addition, infectious titration experiments performed on T-1038 showed that T-1053 serum was at least 4 × 10^FiveOf tamarin infection.
To demonstrate the transmission of a single HGBV pathogen, 0.25 ml of inoculum consisting of T-1057 serum taken 7 days after inoculation of H205 in Tamarin T-1044 and diluted 1: 500 in normal Tamarin serum. Was inoculated. From 14 to 63 days after inoculation, there was a gradual increase in ALT levels above the cutoff (ie, an increase in the range of 82 to 106).
On day 14 after the inoculation, 0.25 ml of T-1044 serum diluted 1: 2 with normal tamarin serum was inoculated sequentially into tamarin T-1047 and T-1056. First, an increase in ALT level exceeding the cutoff was observed in T-1047 and T-1056 on day 42 after inoculation, but returned to normal levels on days 64 and 91 after inoculation, respectively. Tamarin T-1058 was inoculated with 0.25 ml of neat T-1057 serum collected 22 days after challenge with T-1053 serum. There was no increase in ALT levels during 112 days after inoculation.
Example 3. Representative difference analysis (deduction hybridization) N)
A.Production of double-stranded DNA for amplicon
Above in this specificationMaterials and methodsAnd from the tamarin T-1053 infectious plasma (see Example 1A) collected 12 days after inoculation with H205 serum (see Examples 1C and 2B) using the procedure described in FIG. A tester amplicon was synthesized from the nucleic acid. Driver amplicon was synthesized from tamarin T-1053 pre-inoculation plasma pooled between 17-30 days before inoculation. Briefly, both plasmas were filtered through a 0.1 μm filter as described in Example 2B. Next, 50 μl of the filtered plasma was extracted using a commercially available kit [United States Biochemecal (USB), Cleveland, OH, cat. # 73750] and 10 μg of yeast tRNA as a carrier. The nucleic acid was randomly initiated and reverse transcribed, and then DNA was synthesized using a commercially available kit with random initiation. Briefly, a random hexamer was used to perform an 80 μl reverse transcription reaction using the Perkin Elmer's (Norwalk, CT) RNA PCR kit (cat. # N808-0017) as directed by the manufacturer and at 20 ° C. Incubate for 10 minutes and then at 42 ° C for 2 hours. The reaction was then stopped and the cDNA / RNA duplexes were denatured by incubating at 99 ° C for 2 minutes. The reaction material was combined with a total of 20 μl of 10 μl of 10 × RP buffer [100 mM NaCl, 420 mM Tris (pH 8.0), 50 mM DTT, 100 μg / ml BSA], 250 pmol random hexamer and 13 units of Sequenase ( ® version 2.0 polymerase (USB, cat. # 70775). The reaction material was incubated at 20 ° C. for 10 minutes, then at 37 ° C. for 2 hours. After extraction with phenol: chloroform and ethanol precipitation, the double-stranded DNA products of these reactions were combined with 4 units of the restriction endonuclease Sau3A I (New England Biolabs) in a 30 μl reaction material volume as indicated by the manufacturer. [NEB], cat. # 169L) for 30 minutes.
B.Amplicon synthesis
Sau3A I digested DNA was extracted and precipitated as described above. The entire Sau3A I digestion product was buffered in 1 × T4 DNA ligase buffer (NEB) by placing the reaction material in a dry heating block at 50-55 ° C. and incubating at 4 ° C. for 1 hour. Annealed to 465 pmol of RBgl24 (SEQ ID NO: 1) and 465 pmol of RBgl12 (SEQ ID NO: 2). The annealed product was ligated by adding 400 units of T4 DNA ligase (NEB, cat. # 202S). After incubation at 16 ° C. for 14 hours, small scale PCR was performed. 10 μl of ligation reaction material was added to 60 μl of H_TwoO, 20 μl of 5 × PCR buffer (335 mM Tris (pH 8.8), 80 mM [NH_Four]_TwoSO_Four, 20 mM MgCl_Two0.5 μg / ml bovine serum albumin and 50 mM 2-mercaptoethanol), 8 μl of 4 mM dNTP strain, 2 μl (124 pmol) RBgl24 (SEQ ID NO: 3) and 3.75 units of Ampli Taq® DNA polymerase (Perkin Elmer) , cat. # N808-1012). PCR amplification was performed in a GeneAmp® 9600 thermocycler (Perkin Elmer). The sample was incubated at 72 ° C for 5 minutes to fill in the 5 'overhang of the ligated adapter. Samples were amplified for 25-30 cycles (1 min at 95 ° C. and 3 min at 72 ° C.), then extended amplified at 72 ° C. for 10 min. After agarose gel confirmed successful synthesis of the amplicon (i.e., a smear of the PCR product ranging from about 100 bp to over 1500 bp), large scale amplification of the tester and driver amplicon was performed. Forty 100 μl PCRs and eight 100 μl PCRs were set up as described above for driver and tester synthesis, respectively. 2 μl of the small PCR product per 100 μl reaction material served as a template for large-scale amplicon production. Thermocycling was performed as described above to perform an additional 15-20 cycles of amplification. The PCR reaction material for driver and tester DNA was then extracted twice with phenol / chloroform, precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol, digested with Sau3A I, and the adapter was cleaved. The tester amplicon was further purified on a low melting point agarose gel. Briefly, 10 μg of tester amplicon DNA was run on a 2% SeaPlaque® gel (FMC Bioproducts, Rockland, ME). Fragments of 150-1500 base pairs were excised from the gel and slices of the gel were thawed with 3 ml of H2O, 400 μL of 0.5 M MOPS and 400 μl of NaCl at 72 ° C. for 20 minutes. DNA was recovered from thawed gel slices using Qiagen-tip20 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) as directed by the manufacturer.
C.Amplicon hybridization and selective amplification
About 2 μl of the purified tester DNA amplicon was ligated to NBgl24 (SEQ ID NO: 3) and NBgl12 (SEQ ID NO: 4) as described above. For the first subtractive hybridization, the tester amplicon (0.5 μg) and the driver amplicon (20 μg) linked to the NBgl primer set were mixed, extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol. The DNA was resuspended in 4 μl of EE × 3 buffer (30 mM EPPS, pH 8.0 at 20 ° C. [Sigma, St. Louis, MO], 3 mM EDTA) and overlaid with 35 μl of mineral oil. After heat denaturation (99 ° C. for 3 minutes), 1 μl of 5M NaCl was added to the denatured DNA, and the DNA was hybridized at 67 ° C. for 20 hours. The aqueous phase was transferred to a new tube and 8 μl of tRNA (5 mg / ml) was added to the sample followed by 390 μl of TE [10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA]. 80 μl of the hybridized DNA solution was_TwoO480 μl, 160 μl of 5 × PCR buffer (above), 64 μl of 4 mM dNTP and 6 μl of AmpliTaq® polymerase (30 units). The solution was incubated at 72 ° C. for 5 minutes to load the 5 ′ overhang formed by the ligated NBgl24 primer. N Bgl 24 (SEQ ID NO: 3, 20 μl of H_Two1.24 nmol in O) was added, the reaction material was aliquoted (100 μl / tube) and 10 cycles of amplification were performed as described above. The reaction materials were pooled, extracted twice with phenol / chloroform, precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol, and_TwoResuspended in O. The single-stranded DNA was removed with a green nuclease (MBN). Briefly, 20 μl of amplified DNA was digested with 20 units of MBN (NEB) in 40 μl reaction material as described by the vendor. 160 μl of 50 mM Tris (pH 8.8) was added to the MBN digest. The enzyme was heat inactivated at 99 ° C. for 5 minutes. 80 μl of the MBN digested DNA was PCR amplified for an additional 15 cycles as described above. The reaction materials were pooled again, extracted twice with phenol / chloroform, precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol,_TwoResuspended in O. Next, the amplified DNA (3 to 5 μl) was digested with Sau3A I, and extracted and precipitated as described above. The final DNA pellet was resuspended in 100 μl of TE.
D.Subsequent hybridization / amplification steps
As described above, 100 ng of DNA from the previous hybridization / selective amplification material was ligated to the JBgl primer set (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6). This DNA (50 ng) was mixed with 20 μg of driver amplicon and the hybridization and amplification procedure was repeated as described above, except that the extension temperature during thermocycling was 70 ° C. and the NBgl primer set The final amplification step (after NBN digestion) was 25 cycles instead of 72 ° C. for (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4). Next, 100 ng of the second hybridization-amplification product was ligated to the NBgl primer set (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 200 pg of this material and 20 μg of the driver amplicon were mixed, and the third round was performed as described above. Hybridization / amplification was performed, with a final amplification of 25 cycles.
A 2% agarose gel of the product obtained from representative difference analysis (RDA) performed before HGBV inoculation and on acute phase T-1053 plasma is shown in FIG. Referring to FIG. 14, lane 1 contains 150 ng of Hae III digested Phi-X174 DNA marker (NEB) with the appropriate size (bp) DNA fragment. The complexity of the driver amplicon (lane 2) and the tester amplicon (lane 3) has been demonstrated by a smear of the DNA product found in the sample. This complexity is dramatically reduced when the tester sequence undergoes the first (lane 4), second (lane 5) or third (lane 6) hybridization / selective amplification.
E.Cloning of difference products
The difference product was cloned into the BamHI site of pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA, cat. # 212207) as follows. 0.5 μg of pBluescript II was digested with BamHI (10 units, NEB) and 5 ′ dephosphorylated with calf intestinal phosphatase (10 units, NEB) as indicated by the vendor. The plasmid was extracted with phenol: chloroform, precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol, 10 μl of H_TwoResuspended in O (final concentration: about 50 ng of pBluescript II per μl). The four largest bands from the second hybridization / amplification product were excised from a 2% low melting point agarose gel as described above. Using a Takara DNA ligation kit (Takara Biochemical, Berkeley, CA), 4 μl of the melted (72 ° C., 5 min) gel slice was ligated to 50 ng of BamHI-cut, dephosphorylated pBluescript II in 50 μl of reaction material. After incubation at 16 ° C. for 3.5 hours, use 8 μl of the ligation reaction material as directed by the vendor,E.coliCompetent XL-1 Blue cells (Stratagene) were transformed. The transformation mixture was placed on an LB plate supplemented with ampicillin (150 μg / ml) and incubated at 37 ° C. overnight. The resulting colonies were grown in liquid culture and miniprep plasmid DNA was analyzed as described in the art to confirm the presence of the cloning product.
In addition to the cloning of the four largest products from the second hybridization / expansion step, the entire population of products from the third hybridization / expansion step was cloned into pBluescript II. 50 ng of the pBluescript II vector (synthesized as described above) was ligated as described above to 10 ng of the third hybridization / growth product in 50 μl of reaction material. After incubation at 16 ° C. for 2 hours, 10 μl of the ligation productE.coliCompetent XL-1 Blue cells were transformed. Sixty colonies from the resulting transformants were grown, miniprep DNA was synthesized and analyzed by methods known in the art as described above. Restriction endonuclease digestion and dot blot hybridization were used to identify unique clones.
Example 4. cDNA clone encoding antigen region of HGBV genome Immune separation
A.Preparation of concentrated virus as a source of cloning material
The HGBBV genome was isolated using the following isolation procedure in addition to the method described in Example 3. Three tamarins (T-1055, T-1038 and T-1049) were inoculated with serum prepared from tamarin T-1053 as described in Example 2. Referring to Table 5, by day 11 after inoculation, all three tamarins had elevated liver enzyme levels. Tamarin T-1055 was killed 12 days after inoculation and tamarin T-1038 and T-1049 were killed 14 days after inoculation. Approximately 3-4 ml of serum from each of these three tamarins was pooled to give a total volume of approximately 11.3 ml. The pooled serum was clarified by centrifugation at 10,000 xg for 15 minutes at 15 ° C. It was then continuously passed through 0.8, 0.45, 0.2 and 0.1 μm syringe filters. The filtered material is then placed in a SW41-Ti rotor at 41,000 rpm for 68 minutes at 4 ° C. with a 0.3 ml CsCl cushion [density: 1.6 mM in 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0). g / ml] and concentrated. About 0.6 ml of the CsCl layer was removed after centrifugation, divided into three 0.2 ml aliquots and stored at -70 ° C.
Then, 10-10 of this pelleted material (prepared in normal tamarin serum) was added to Tamarin T-1034.^-60.25 ml of the dilution was inoculated. First, two weeks after inoculation, an increase in the ALT liver enzyme level was observed at T-1034, and the level continued to rise for seven weeks thereafter, and finally normalized by 10 weeks after inoculation (FIG. 30, Example See 14). This experiment demonstrated the infectivity of material concentrated from pooled tamarin serum. Since the material was shown to have a relatively high titer, this source of virus concentration was used as a source of nucleic acids for cDNA library construction, as described below.
B.Construction of cDNA library
RNA was extracted from an aliquot (0.2 ml) of the concentrated virus (above) using a commercially available RNA extraction kit (Stratagene, La Jolla, CA) according to the instructions of the vendor. Prior to the final precipitation step, the sample was divided into four equal aliquots and then precipitated in the presence of 5 μg / ml yeast tRNA. Only one of these aliquots was used for cDNA synthesis. Others were stored at -80 ° C. Phosphorylated, blunt-ended double-stranded cDNA was synthesized from the RNA using a commercially available kit (Stratagene, La Jolla, CA) as directed by the manufacturer. Then, using the T4 DNA ligase kit (Stratagene, La, Jolla, Calif.), Double-stranded linker / primer was added to the cDNA end (sense strand, SEQ ID NO: 7) in a 10 μl reaction material volume as directed by the manufacturer. Antisense strand, SEQ ID NO: 8). This gave all cDNAs as a mixture with identical 5 'and 3' ends containing NotI and EcoRI restriction sites [G. Reyes and J. Kim,Mol.Cell.Probes 5: 473-481 (1991); A. Akowitz and L. Manuelidis,Gene 81: 295-306 (1989); and G. Inchauspe et al.Viral Hepatitis and Liv er Disease, F.B. Hollinger et al., Eds., Pp. 382-387 (1991)]. The linker / primer sense strand oligonucleotide was then used as a primer in a PCR reaction so that all cDNAs were amplified independent of their sequence. This procedure amplified the traces of cDNA present in the entire cDNA population to levels that would be efficiently cloned, thereby forming a cDNA library representing the sequences in the starting material.
PCR was performed on a 1 μl aliquot of the ligation material in the PE-9600 thermocycler in the presence of a sense strand oligonucleotide primer using the GeneAmp PCR kit (Perkin-Elmer) as directed by the manufacturer (final). Concentration: 1 μM; reaction material volume: 50 μl). Thirty cycles of PCR were performed as follows: denaturation at 94 ° C. for 0.5 min, annealing at 55 ° C. for 0.5 min and extension at 72 ° C. for 1.5 min. A 1 μl aliquot of the resulting product was then reamplified as described above. The final PCR reaction product was then extracted once with an equal volume of phenol-chloroform (1: 1, v / v) and once with an equal volume of chloroform, followed by sodium acetate (final concentration, 0.3 M) and 2.5 volumes. Was added and precipitated on dry ice for 10 minutes. The resulting DNA pellet was resuspended in water and digested with the restriction enzyme EcoRI (New England Biolabs) as indicated by the manufacturer. The digested cDNA was then purified from the reaction mixture using a DNA binding resin (Prep-a-Gene, BioRad Laboratories) as directed by the manufacturer and eluted in 20 μl of distilled water.
The cDNA (8 μl) was ligated to 3 μg lambda gt11 vector DNA arm (Stratagen, La Jolla, Calif.) at 4 ° C. for 1-5 days in a 30 μl reaction material volume. Using a GigaPack III Gold package extract (Stratagene, supra) as directed by the manufacturer, 11 μl of the ligation material was packaged into a phage head. The resulting library had a recombination frequency of 89.3% and contained a total of about 1.73 million members (PFU) with an average insert size of about 350 base pairs.
C.Immunoscreening of recombinant GB cDNA library
The antiserum used for the immunoscreening of the cDNA library was collected from tamarins that showed elevated serum liver enzyme levels after inoculation. Two separate antisera pools were used for immunoscreening. The first pool contained sera from two animals (T-1048 and T-1051; see Example 1, Table 2 and Example 2, Table 5, respectively) and the second pool contained One containing serum from one animal (T-1034; see FIG. 30, Example 14). The specific sera used are shown in Table 6.
At the time these samples were selected for use in immunoscreening cDNA libraries, these samples had not been tested for their immunoreactivity with the 1.4 or 1.7 recombinant CKS protein (Example 13). Thus, the results presented herein were obtained without regard to any information regarding the presence or absence of HGBV antibodies to these recombinant proteins in the antisera used.

The procedure used for immunoseparation of the recombinant phage was based on the method described by Young and Davis [RA Young and RW Davis, PNAS 80: 1194-1198 (1983)], with the following modifications. there were. Two immunoscreening experiments were performed, one using antisera pooled from T-1048 and T-1051 and the other using antiserum from T-1034. In each case, the antibody andE.coliPrimary antisera prior to use to reduce non-specific interactions with proteinsE.coliThe extract was pre-adsorbed. In the first experiment, 1.29 million recombinant phages were immunoscreened using the T-1048 / T-1051 antiserum pool. In the second experiment, 300,000 recombinant phages were immunoscreened using the T-1034 antiserum. Recombinant phage libraryE.coliStrand Y1090_r-And grown at 37 ° C. for 3.5 hours. The plate was then covered with a nylon filter saturated with IPTG (10 mM) and incubated at 42 ° C. for 3.5 hours. The filters were then blocked in Tris-brine buffer containing 1% BSA, 1% gelatin and 3% Tween-20 ("blocking buffer") for 1 hour at 22C. Filters were then incubated in primary antiserum (1: 100 dilution in blocking buffer) at 4 ° C. for 16 hours. The primary antiserum was then removed and set aside for the next plaque purification, and the filters were washed four times in Tris-brine containing 0.1% Tween-20. The filters were then incubated in a blocking buffer containing 125-I-labeled (or alkaline-phosphatase conjugated) goat anti-human IgG (available from Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) at 22 ° C. for 60 minutes, as described above. Washed and then exposed to X-ray film (or J. Sambrook et al.,Molecu lar Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Five immunopositive phages (4-3BI, 48-1A1, 66-3A1, 70-3A1, 78-1C1) were isolated from this library, and then three infected tamarins (T -1048, T-1051, T-1034) were tested for binding specificity to antisera. These recombinants encoded polypeptides that reacted with convalescent sera from each of the three infected tamarins but did not react with the pre-inoculated sera (data not shown).
To demonstrate the specificity of the immunological reactivity of the polypeptide encoded by the recombinant phage, a primer (SEQ ID NO: 9) located 5 'to the EcoRI cloning site and a primer located 3' Each cDNA was recovered from the lambda phage genome by PCR using the primer (SEQ ID NO: 10). The PCR product was then digested with EcoR I and, as described in Example 13,E.coliThe expression plasmid pJO201 was then ligated. By inserting the cDNA into the EcoRI site of pJO201, the translational open reading frame of the cDNA was maintained in the lambda phage clone. The subclones in the pJO201 expression vector were designated as 4-3B1.1, 48-1A1.1, 66-3A1.49, 70-3A1.37 and 78-1C1.17. Prepared from cultures expressing these cDNAs, including convalescent sera from Tamarin T-1034, T-1048 and T-1051 (1: 100 dilution)E.coliImmunoblot analysis of lysates (as in Example 13) showed specific immunological reactivity with the expected size protein for each CKS fusion protein (data not shown). The DNA sequence of each of the cDNAs was determined and these clones were found to have almost 100% sequence identity with the sequence of the HGBV-B virus (SEQ ID NO: 11). The sequence of the 4-3B1.1 insert (SEQ ID NOs: 12 and 13) was not determined in its entirety, but the sequencing portion was the sequence portion in HGBV-B (SEQ ID NO: 11) from base pair 6834-7458. 99.5% sequence identity with This region of the HGBV-B (SEQ ID NO: 11) sequence, which shows identity to the sequence obtained from clone 4-3B1.1, was translated into the +1 open reading frame and is shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 14. The sequence of the 48-1A1.1 insert (SEQ ID NO: 15) has 100% sequence identity with a portion of the sequence of HGBV-B (SEQ ID NO: 11, see Example 9) derived from base pairs 4523-4752. Show. The DNA sequence corresponding to SEQ ID NO: 15 was translated into the +1 reading frame and is shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 16. The sequence of the 66-3A1.49 insert (SEQ ID NO: 17) shows substantially 100% sequence identity with the sequence of clone 48-1A1.1, and therefore does not show protein translation in the sequence listing. The sequence of the 70-3A1.37 insert (SEQ ID NO: 18) shows 100% sequence identity with the portion of the sequence of HGBV-B (SEQ ID NO: 11) derived from base pair 6450-6732, except that HGBV-B Three base pairs corresponding to bases 6630-6632 of the sequence (SEQ ID NO: 11) are crossed over. The DNA sequence corresponding to SEQ ID NO: 18 was translated into the +2 open reading frame and is shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 19. The sequence of the 78-1C1.17 insert (SEQ ID NO: 20) shows 100% sequence identity with the sequence of clone 70-3A1.37, and therefore does not show protein translation in the sequence listing. These data indicate that a cDNA clone isolated from the lambda gt11 cDNA library was derived from the genome of the HGBV pathogen, and that the library encodes a polypeptide that is immunologically specifically recognized by serum from GB-infected tamarins. It is shown that. Clone 48-1A1.1 ("clone 48") 4-3B1.1, 66-3A1.49, 70-3A1.37 and 78-1C1.17 have been deposited with the American Type Culture Collection described above.
Example 5. DNA sequence analysis of HGBV clone
The unique clones obtained in Example 3 were sequenced using the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al., Supra) in kit form (Sequenase® version 2.0, USB). These sequences do not overlap and are clone 4 (SEQ ID NO: 21), clone 2 (SEQ ID NO: 22), clone 10 (SEQ ID NO: 23), clone 11 (SEQ ID NO: 24), clone 13 (SEQ ID NO: 25) , Clone 16 (SEQ ID NO: 26), clone 18 (SEQ ID NO: 27), clone 23 (SEQ ID NO: 28), clone 50 (SEQ ID NO: 29) and clone 119 (SEQ ID NO: 30) in the sequence listing. Clones 4, 2, 10, 11, 13, 16, 18, 23, 50 and 119 have been deposited with A.T.C.C. Clone 2 is ATCC Accession No. 69556, Clone 4 is ATCC Accession No. 69557, Clone 10 is ATCC Accession No. 69558, Clone 16 is ATCC Accession No. 69559, Clone 18 is ATCC Accession No. 69560, Clone 23 is ATCC Accession No. 69561, Clone 50 Was given ATCC accession number 69613, clone 11 was given ATCC accession number 69613, clone 13 was given ATCC accession number 69611, and clone 119 was given ATCC accession number 69612.
The sequence was sequenced using the BLASTN algorithm (Altschul et al.,J.Mol.Bi ol.215: 403-410 [1990]). None of these sequences were found in GenBank, indicating that these sequences have not yet been characterized in the literature. The DNA sequence is translated into six possible open reading frames, and the sequence listing (SEQ ID NO: 21 into SEQ ID NOs: 31-36, SEQ ID NO: 22 into SEQ ID NOs: 37-42, SEQ ID NO: 23 into SEQ ID NOs: 43-48, SEQ ID NO: 26 translates into SEQ ID NOs: 49-54, SEQ ID NO: 27 translates into SEQ ID NOs: 55-60, SEQ ID NO: 28 translates into SEQ ID NOs: 61-66, and SEQ ID NO: 29 translates into SEQ ID NOs: 67-72) I have. SEQ ID NO: 24 is included in SEQ ID NO: 73 (described in Example 9) and is translated into SEQ ID NOs: 74-79. SEQ ID NOs: 25-30 are contained in SEQ ID NO: 80 (described in Example 9) and translated into SEQ ID NOs: 81-86. BLASTX algorithm (Gish et al.,Nature Genetics 3: 266-272 [1993]) and the translated sequence was used for searching the SWISS-PROT database. Again, these sequences were not found in SWISS-PROT, indicating that these sequences have not yet been characterized in the literature.
Searching for homologs using the BLASTN, BLASTX and FASTdb algorithms shows some, albeit low, sequence similarity with the Hepatitis C virus (Table 7 below). In particular, clones 4 (SEQ ID NO: 35), 10 (SEQ ID NO: 44), 11 (residues 1-166 of GB-4, frame 3 [SEQ ID NO: 76]), 16 (SEQ ID NO: 50), 23 (SEQ ID NO: 65) ), 50 (SEQ ID NOs: 70 and 72) and 119 (residues 912-988 of GB-A, frame 3 [SEQ ID NO: 83]) resulted in 24.1-45.1% of the various HCV isolates at the amino acid level. There is a range of homology. Of particular importance, the translator of clone 10 (SEQ ID NO: 44) showed little homology to the putative RNA-dependent RNA polymerase of HCV. Conserved amino acids present in the putative RNA-dependent RNA polymerase of other positive chain viruses (Jiang et al.,P NAS 90: 10539-10543 (1993)) and the conserved amino acid residues of other RNA-dependent RNA polymerases are also conserved in clone 10 (SEQ ID NO: 44) by comparison with the putative amino acid translation of clone 10 (SEQ ID NO: 44). It became clear that it was. It contains a canonical GDD (Gly-Asp-Asp) signature sequence for an RNA-dependent RNA polymerase. Thus, clone 10 (SEQ ID NO: 44) appears to encode a viral RNA-dependent RNA polymerase. Surprisingly, when using the BLASTN algorithm, only clone 10 (SEQ ID NO: 44) showed sequence homology with HCV at the nucleotide level. Clones 4 (SEQ ID NO: 21), 16 (SEQ ID NO: 26), 23 (SEQ ID NO: 28) and 50 (SEQ ID NO: 29) and 119 (SEQ ID NO: 30) having low HCV homology at the amino acid level were found in the GenBank search. , BLASTN. In addition, clones 2 (SEQ ID NOs: 37-42), 13 (SEQ ID NOs: 25 and 37-42) and 18 (SEQ ID NOs: 27 and 55-60), when searched in GenBank or SWISS-PROTO described above, No significant nucleotide or amino acid homology was indicated as described below.

Example 6. Exogenous HGBV clone
HGBV clones are normal or HGBV infected tamarin liver DNA, normal human lymphocyte DNA, yeast DNA orE.coliIt was not detected in DNA. This was shown for HGBV clones 2 (SEQ ID NO: 22) and 16 (SEQ ID NO: 26) by Southern method. In addition, all HGBV clones were analyzed by genomic PCR to find tamarin, human, yeast andE.coliThe exogenous origin of the HGBV sequence on the genome was confirmed. These data are consistent with the viral nature of the HGBV sequence described in Example 5.
A.Southern blot analysis
HGBV infected tamarins and normal tamarin liver homogenates were pelleted at low speed to obtain tamarin liver nuclei (described below). DNA was extracted from the nuclei using a commercially available kit (USB cat. # 73750) as directed by the vendor. Tamarin DNA was treated with RNase during the extraction process. Human placenta DNA (Clontech, Palo Alto, CA), yeast DNA (Sacch aromyces cerevisiae, Clontech) andE.coliDNA (Sigma) was obtained from commercial sources.
Each DNA sample was digested with BamHI (NEB) according to the vendor's instructions. The digested DNA (10 μg) and RNA product (0.5 μg each from Example 3B) were electrophoresed on a 1% agarose gel and Hybond-N + nylon membrane (Hybond-N + nylon membrane) as described by Sambrook et al. (Pp. 9.34ff). (Amersham, Arlington Heights, IL). DNA was treated with alkali as instructed by the membrane vendor and immobilized on the membrane. The membrane was prehybridized in Rapid Hyb solution (Amersham) at 65 ° C. for 30 minutes.
Radiolabeled probes of the HGBV sequence were prepared by PCR. 1 × PCR Buffer II (Perkin Elmer), 2 mM MgCl_Two, 20 μM dNTPs, 1 μM each of clone specific sense and antisense primers (SEQ ID NOS: 87 and 88 for clone 2; SEQ ID NOs: 89 and 90 for clone 4; SEQ ID NOs: 91 and 92 for clone 10; SEQ ID NOs: 93 and 94 for clone 16; SEQ ID NOs: 95 and 96 for clone 18; SEQ ID NOs: 97 and 98 for clone 23; SEQ ID NOs: 99 and 100 for clone 50); 1 ng of HGBV clone plasmid (Described in Example 3 [E]), 60 μCiα-³²A 50 μl PCR was formed using p-dATP (3000 Ci / mmol) and 1.25 units of AmpliTaq® polymerase (Perkin Elmer). The reaction material was incubated at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds for a total of 30 cycles of amplification, followed by a final extension at 72 ° C. for 3 minutes. Unincorporated label was removed with a Quick-Spin® G-50 spin column (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) as directed by the vendor. The probe was denatured (99 ° C, 2 minutes) before being added to the prehybridized membrane.
Prehybridized membrane (2 × 10⁶dpm / ml), the radiolabeled probe was added, and the filters were hybridized at 65 ° C. for 2.5 hours as directed by the Rapid Hyb® vendor. The hybridized membrane was washed with mild stringency (1 × SSC, 0.1% SDS at 65 ° C.) and then exposed to autoradiographic film using a sensitizer at −80 ° C. for 72 hours. These conditions were devised to detect a single copy of the gene using a similar radiolabeled probe. The results show that the clone 2 (SEQ ID NO: 22) and clone 16 (SEQ ID NO: 26) sequences show normal or HGBV infected tamarin liver-derived DNA (FIGS. 15 and 16, lanes 1B and 3B, respectively) and human DNA (FIG. 15). And FIG. 16, lane 1A), yeast DNA (FIGS. 15 and 16, lane 2A) orE.coliIt shows that it did not hybridize to DNA (FIGS. 15 and 16, lane 3A). In addition, no hybridization was detected with the driver amplicon DNA (FIGS. 15 and 16, lane 4A, derived from pre-HGBV-inoculated tamarin plasma as described in Example 2.B.). In contrast, the tester amplicon (FIGS. 15 and 16, lane 6A, derived from infected HGBV tamarin plasma using the total nucleic acid extraction and reverse transcription steps described in Example 2.B) and three subtractions / In the case of the products of the selective amplification (FIGS. 15 and 16, lanes 7A, 8A and 4B for the products from the first / second and third subtraction / selective amplification, respectively), a strong hybridization signal is observed. Was. These data indicate that HGBV clones 2 (SEQ ID NO: 22) and 16 (SEQ ID NO: 26 were detected in the nucleic acid sequence amplified from the infectious source, and that HGBV clones 2 (SEQ ID NO: 22) and 16 (SEQ ID NO: 26) Tamarin, human, yeast orE.coliThis indicates that it is not derived from the genomic DNA sequence.
B.Genome PCR analysis
To further demonstrate the exogenous nature of the HGBV sequences and to support their viral origin, tamarins, humans, yeasts andE.co liPCR was performed on the derived genomic DNA. DNA from normal tamarin kidney and liver tissue was synthesized as described by J. Sambrook et al., Supra. Yeast, rhesus monkey kidney and human placental DNA were obtained from Clonotech.E.coliDNA was obtained from Sigma.
PCR was performed primarily using the GeneAmp® reagent from Perkin-Elmer-Cetus as directed by the vendor. 300 ng of genomic DNA was used for each 100 μl reaction material. HGBV cloned sequences (SEQ ID NOs: 87 and 88 for clone 2; SEQ ID NOs: 89 and 90 for clone 4; SEQ ID NOs: 91 and 92 for clone 10; SEQ ID NOs: 93 and 94 for clone 16; clones PCR primers from SEQ ID NOs: 95 and 96 for 18; SEQ ID NOs: 97 and 98 for clone 23; SEQ ID NOs: 99 and 100 for clone 50) were used at a final concentration of 0.5 μM. The PCR was performed for 35 cycles (94 ° C. for 1 minute; 55 ° C. for 1 minute; 72 ° C. for 1 minute) followed by an extension cycle at 72 ° C. for 7 minutes. The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis, and the nucleic acids were stained directly with ethidium bromide and then irradiated with ultraviolet light and / or transferred to a nitrocellulose filter by the Southern method and then hybridized to a radiolabeled probe. Visualized. Probes were formed as described in Example 6A. Filters are prehybridized for 3-5 hours in Fast-Pair Hybridization Solution from Digene (Belstville, MD), then 100-200 cpm / cm^TwoAnd hybridized in a Fast-Pair Hybridization Solution at 42 ° C. for 15 to 25 hours. G.G.Schlauder et al.J.Virol.Methods Filters were washed as described in 37: 189-200 (1992) and exposed to Kodak X-Omat-AR film using a sensitizer at -70 ° C for 15-72 hours.
FIG. 17 shows a 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide. FIG. 18 shows an autoradiogram by Southern blotting from the same gel after hybridization to a radiolabeled probe derived from clone 16 (SEQ ID NO: 26). Clone 16 (SEQ ID NO: 26) sequence despite being able to detect clone 16 (SEQ ID NO: 26) sequence spiked at 0.05 genomic equivalents (lanes 17 and 18) in normal tamarin liver and kidney DNA Consistent with its exogenous properties, genomic PCR analysis revealed that yeast or rhesus monkey (lane 11) or human genomic DNA (lane 12) were also found in tamarin (FIGS. 17 and 18, lanes 9 and 10).E.coliNo detectable in DNA (data not shown). In addition, primers derived from the human dopamine D1 receptor gene, 1000-1019 base pairs (sense primer) and 153-1552 base pairs (antisense primer) (GenBank accession number: X55760, R.K.Sunahara et al.Nature 347: 80-83 [1990]) incorporates dopamine D1 receptor DNA from primate genomic DNA (FIG. 17, lanes 2, 3, 4, and 5, corresponding to tamarin kidney, tamarin liver, rhesus monkey and human DNA). Amplification was successful, which demonstrates the utility of this method for detecting low copy number (ie, single copy) sequences. Lanes 1 and 8 show Hp for dopamine D1 receptor and clone 16 primers (SEQ ID NOs: 93 and 94), respectively._TwoO control. Lane 6 contains 100 fg of clone 16 (SEQ ID NO: 26) plasmid DNA amplified with the dopamine receptor primer. Lanes 14, 15, 16 and 20 contain 1, 3, 10, and 100 fg of clone 16 (SEQ ID NO: 26) plasmid DNA, respectively. Lanes 7 and 19 are markers. Similar results were obtained using PCR primers specific for clones 2, 4, 10, 18, 23 and 50 above (data not shown). Clones 2 (SEQ ID NO: 22), 4 (SEQ ID NO: 21), 10 (SEQ ID NO: 23), 18 (SEQ ID NO: 27), 23 (SEQ ID NO: 28), and 50 (SEQ ID NO: 29) have shown results at this time. Absent. However, the clones 4 (SEQ ID NO: 21), 10 (SEQ ID NO: 23), 18 (SEQ ID NO: 27) and 50 (SEQ ID NO: 29) sequences wereE.co liNo detectable in DNA (rhesus monkeys not tested), indicating that these sequences are exogenous to the genomic DNA source tested and support the viral origin of these sequences. ing.
Example 7. Presence of HGBV sequence in tamarin serum
Pre-inoculation and acute phase T-1053 plasma was examined for the presence of the HGBV clone sequence by PCR. Since the HGBV genome can be DNA or RNA, PCR and RT-PCR were performed. In particular, total nucleic acids were extracted from plasma as described in Example 3 (A). PCR was performed on an equivalent of 5 μl of plasma nucleic acid as described in Example 6 (B), using a GeneAmp® RNA PCR kit from Perkin-Elmer-Cetus, mainly according to the manufacturer's instructions. Primers at 1 μM concentration in the PCR (SEQ ID NOs: 87 and 88 for clone 2; SEQ ID NOs: 89 and 90 for clone 4; SEQ ID NOs: 91 and 92 for clone 10; SEQ ID NOs: 93 and 94 for clone 16) RT-PCR was performed using SEQ ID NOs: 95 and 96 for clone 18; SEQ ID NOs: 97 and 98 for clone 23; SEQ ID NOs: 99 and 100 for clone 50). CDNA synthesis was started using random hexamers.
HGBV clone sequences 2 (SEQ ID NO: 22), 4 (SEQ ID NO: 2), 10 (SEQ ID NO: 23), 16 (SEQ ID NO: 23) were obtained in the acute-phase T-1053 plasma by staining of the PCR product with ethidium bromide and hybridization. 26), 18 (SEQ ID NO: 27), 23 (SEQ ID NO: 28) and 50 (SEQ ID NO: 29) were shown to be absent in the pre-vaccinated T-1053 plasma (data not shown). Furthermore, the sequences of HGBV clones 2 (SEQ ID NO: 22), 4 (SEQ ID NO: 21), 10 (SEQ ID NO: 23), 18 (SEQ ID NO: 27), 23 (SEQ ID NO: 28) and 50 (SEQ ID NO: 29) correspond to Tamarin T HGBV inoculum injected at -1053 could be detected in H205 (see Example IB). These results are summarized in Table 8. Note that the HGBV clonal sequence was detected only by RT-PCR in acute phase plasma. The fact that HGBV clone sequences were detected in acute phase plasma by PCR only after the reverse transcription step to convert RNA to cDNA, indicates the low homology between some of these clones and the HCV isolate, and the HGBV The presence of a sequence encoding a conserved amino acid found in the RNA-dependent RNA polymerase of clone 10 (SEQ ID NO: 23; Example 5) suggests that HGBV is an RNA virus.
RT-PCR analysis of a tamarin plasma panel having the HGBV clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) was performed to confirm the presence of HGBV clone 16 (SEQ ID NO: 26) in other individuals experimentally infected with HGBV. As described earlier (G.G.Schlauder et al.,J.Virol ogical Methods 37: 189-200 [1992]), nucleic acids were isolated from 25 μl of tamarin-derived plasma obtained before and after experimental infection with the H205 inoculum. 3 µl of DEPC-treated H_TwoResuspended in O. CDNA synthesis and PCR were performed using the GeneAmpRNA PCR kit from Perkin-Elmer-Cetus, mainly according to the manufacturer's instructions. CDNA synthesis was started using random hexamers. The resulting cDNA was subjected to PCR using clone 16 primers (SEQ ID NOs: 93 and 94) at a final concentration of 0.5 μM. The PCR was performed for 35 cycles (94 ° C. for 1 minute; 55 ° C. for 1 minute; 72 ° C. for 1 minute) followed by an extension cycle at 72 ° C. for 7 minutes. The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and the nucleic acids were stained directly with ethidium bromide and then irradiated with UV light and / or transferred to nitrocellulose filters by Southern blotting as described in Example 6B. Hybridization to the radiolabeled probe was visualized.
FIG. 19 shows a ethidium bromide stained 1.5% agarose gel. FIG. 20 shows an autoradiogram by Southern blotting from the same gel after hybridizing to a radiolabeled probe derived from clone 16 (SEQ ID NO: 26). H_TwoO and human normal serum are shown in lanes 1 and 2. Lanes 3, 19 and 20 are markers. Lanes 4, 8, 12 and 16 are from uninfected tamarin serum, and lanes 6, 10, 14 and 18 are from infected tamarin serum. These results indicate that the HGBV clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) was detected in other individuals infected with HGBV in addition to tamarin T-1053, but not in uninfected individuals. ing. Acute sera from five H205 infected animals were tested. The clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) was obtained from three of these animals (lane 10, T-1049, 14 days post inoculation (dpi); lane 14, T-1051, 28 dpi; lane 18, T-1055 , 16dpi]. The clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) is composed of 5 animals (lane 4, T-1048; lane 8, T-1049; lane 12, T-1051; lane 16, T-1055; T-1057 not shown). Was not detected in any of the pre-inoculation sera. These results suggest that the clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) may be derived from an infectious HGBV pathogen. The absence of the clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) in two of the five acute phase plasmas (lane 6, T-1048, 28dpi; T-1057, 14dpi, not shown) was due to the HGBV in tamarin. This can be explained by the relatively low sensitivity of clone 16 RT-PCR (assumed to be able to detect about ≧ 1000 copies of clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26)) coupled with the acute degradation nature of the infection. Thus, acute phase plasma from two negative animals may contain titers of HGBV below the level of detection of the RT-PCR assay used. Observation by RT-PCR that these two animals were positive for clone 4 (SEQ ID NO: 21) (Example 14) showed the presence of RNA sequence of one virus (including clone 4) and It may reflect the absence of detectable RNA sequences from two viruses (including clone 16).
Example 8. No HGBV sequence in the liver of infected tamarins Zan blot analysis
The ability to detect HGBV clonal sequences in RT-PCR in acute phase tamarin plasma and H205 inoculation increased the likelihood that these sequences originated from the HGBV genome. Yet another RT-PCR test demonstrated the presence of HGBV sequences in liver RNA extracted from H205 infected tamarin T-1053 (data not shown). Therefore, Northern blot analysis of H205 infected and uninfected tamarins with liver RNA was performed to determine the size of the HGBV genome. Total cell RNA was extracted from 1.25 g of liver of H205 infected tamarin T-1053 and 1.0 g of liver of control uninfected tamarin T-1040 using an RNA isolation kit (Stratagene, La Jolla, CA) according to its recommended use. . Total RNA (30 μg) was electrophoresed through a 1% agarose gel containing 0.6 M formaldehyde (R.M. Fourney et al.).Focus10: 5-7, [1988]) and further transferred to a Hybond-N nylon membrane (Amersham) by capillary action in 20 x SCC (pH 7.0) as described above. J. Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd edition (1989). The RNA was UV cross-linked to the nylon membrane, and the nylon membrane was baked in a vacuum furnace at 80 ° C. for 60 minutes. The blot was prehybridized in a 25 ml solution containing 0.05 M PIPES, 50 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA and 5% SDS at 60 ° C. for 2 hours. G.D.Virca et al., Biotechniques 8: 370-371 (1990). Prior to hybridization with the radiolabeled DNA probe, the solution was removed and 10 ml of a fresh solution was added. The probes used for hybridization were clone 4 (SEQ ID NO: 21; 221 bp), clone 50 (SEQ ID NO: 29; 337 bp), and a 2000 bp cDNA corresponding to human β-actin. P. Gunning, et al.Mo l.and Cell.Biol.3: 787-795 (1983). Using a random primer labeling kit (Stratagene, La Jolla, CA) according to the recommended usage, [α-³²The probe (50 ng) was radiolabeled in the presence of [P] dATP. Specific activity of each probe is about 10⁹cpm / μg. Blots were hybridized at 60 ° C. for 16 hours, washed as described above (G.D. Virca et al., Supra) and exposed at −80 ° C. to Kodak X-Omat-AR film. The photograph of the obtained autoradiograph is shown in FIG. 21A. Lanes 1, 3, and 5 contain liver RNA from T-1040, and lanes 2, 4, and 6 contain liver RNA from T-1053. Lanes 1 and 2 hybridize with the human β-actin cDNA probe, lanes 3 and 4 hybridize with the clone 4 probe (SEQ ID NO: 21), and lanes 5 and 6 with the clone 50 probe (SEQ ID NO: 29). ) And hybridized. The exposure time was 5 hours at -80 ° C for lanes 1 and 2, and 56 hours at -80 ° C for lanes 3 to 6. The positions of the 28S ribosomal RNA and the position of the 18S ribosomal RNA are indicated by arrows. The relative sizes of these ribosomal RNAs are 6333 and 2366 nucleotides, respectively. J. Sambrook et al., Supra.
The clone 4 probe (SEQ ID NO: 21) and the clone 50 probe (SEQ ID NO: 29) hybridized with RNA species contained in RNA extracted from the liver of infected tamarin (T-1053) (FIG. 21A, lanes 4 and lanes). 6). The size of this hybridizable RNA species was calculated to be approximately 8300 nucleotides based on the relative mobility of the 28S and 18S ribosomal RNAs. It is considered that both probes hybridized with the same RNA species. Neither of the above probes hybridized with RNA extracted from the liver of uninfected tamarin (T-1040) (FIG. 21A, lanes 3 and 5). These results indicate that the clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 50 (SEQ ID NO: 29) sequences are present in the same 8.3 Kb transcript.
In order to know the strandedness of the HGBV RNA genome, a strand-specific radioactively labeled DNA probe was prepared using GeneAmp from Perkin-Elmer.^{▲ R ▼}Prepared by asymmetric PCR using a PCR kit according to recommended usage. Purified clone 50 DNA (SEQ ID NO: 29) was isolated in a separate reaction containing either the clone 50 negative strand specific primer (SEQ ID NO: 99) or the clone 50 positive strand specific primer (SEQ ID NO: 100). And used as a template to give a final concentration of 1 μM. This reaction mixture replaces dATP normally present in such reaction mixtures with Δα³²P-dATP] (Amersham; 3000 Ci / mmol). After amplifying the template for 30 lines, non-incorporation [α³²P-dATP] to Quick-Spin^{▲ R ▼}Sephadex G50 spin columns (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) were used and removed according to recommended usage. A radiolabeled probe was hybridized to a DNA dot blot containing a 10-fold dilution of the double-stranded clone 50 DNA (SEQ ID NO: 29), and it was confirmed that both probes had approximately the same sensitivity (data Is not shown). A radiolabeled probe was hybridized with an RNA blot containing a total of 30 μg of liver RNA extracted from uninfected tamarin T-1040 and liver RNA extracted from infected tamarin T-1053 as described above. A photograph of the obtained autoradiograph is shown in FIG. 21B. Lanes 1 and 3 contain liver RNA from T-1040, and lanes 2 and 4 contain liver RNA from T-1053. Lanes 1 and 2 hybridized with clone 50 positive strand probe (ie, the positive strand was radiolabeled and the negative strand was detected: SEQ ID NO: 100), and lanes 3 and 4 were negative for clone 50. (Ie, the negative strand was radiolabeled and the positive strand was detected: SEQ ID NO: 99). The plot was exposed at -80 C for 18 hours. The positions of the 28S ribosomal RNA and the position of the 18S ribosomal RNA are indicated by arrows.
As shown in FIG. 21B, the positive and negative strand probes for clone 50 (SEQ ID NOS: 100 and 99, respectively) hybridized to an approximately 8.3 kilobase RNA species extracted from the liver of infected tamarin T-1053 (see FIG. 21B). 21B, lanes 2 and 4) did not hybridize with RNA extracted from the liver of uninfected tamarin T-1040 (FIG. 21B, lanes 1 and 3). This was consistent with the Northern blot results obtained using the clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 50 (SEQ ID NO: 29) duplex probes shown above. The stronger signal was obtained using the negative strand probe (SEQ ID NO: 99) for clone 50 (FIG. 21B, lane 4 versus lane 2), indicating that the predominant RNA species present in the liver of infected tamarins was positive ( That is, the coding) chain.
Example 9. Extension of HGBV clone sequence
A.Generate HGBV array
Each of the clones obtained as described in Example 3 above and sequenced as in Example 5 was considered to have been obtained from a separate region of the HGBV genome. Therefore, several PCR walking experiments were performed to obtain sequences from other regions of the HGBV genome that remained between previously identified clones and to confirm the sequence of the RNA clone. .
Total nucleic acid was extracted from a 50 μl aliquot of infected T-1053 plasma as described in Example 3 (A). Simply put, H that was treated with DEPC_TwoResuspended in 10 μl O. GeneAmp^{▲ R ▼}Standard RT-PCR was performed with the RNA PCR kit (Perkin-Elmer) according to the recommended usage. Briefly, 2mM MgCl_TwoPCR was performed on the cDNA product of the random transcription reverse transcription reaction of the extracted nucleic acid with the primers and 1 μM primer. The reaction was subjected to 35 cycles of denaturation-annealing-extension (94 ° C, 30 seconds; 55 ° C, 30 seconds; 72 ° C, 2 minutes) followed by an extension at 72 ° C for 3 minutes. Reactions were maintained at 4 ° C. prior to agarose gel analysis. These products were cloned into pT7 Blue T-vector plasmid (Novagen) by conventional techniques. Table 9 shows the results obtained when performing the above reaction.

A variant of the PCR migration procedure described by Sorensen et al. (J. Virol, 67: 7118-7124 [1993]) was used to obtain additional HGBV sequences. Briefly, total nucleic acids were extracted from infected tamarin T-1053 plasma and reverse transcribed. The obtained cDNA was added to MgCl_Two Amplification was performed in a 50 μl PCR reaction (PCR 1) as in the procedure of Sorensen et al. (Supra) except that 2 mM was used. The reactions were denatured-annealed-extended 35 times (94 ° C., 30 seconds; 55 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 2 minutes), followed by an extension at 72 ° C. for 3 minutes. Biotinylated products were isolated using streptavidin-coated paramagnetic beads (Promega) as described by Sorensen et al. (Supra). A total of 20-35 denaturation-annealing-extended and streptavidin-purified products were subjected to "nested" PCR (PCR 2) as described by Sorensen et al. Table 10 shows the products obtained and the PCR primers used to generate them.

These products were isolated from low melting point agarose gels by conventional techniques and cloned into the pT7 Blue T-vector plasmid (Novagen).
As described above, RNA ligase-mediated 5'RACE (rapid amplification of cDNA ends:RapidAmplification ofcDNAEnds). Briefly, 5'AmpliFINDER^{▲ R ▼}RACE kit (Clontech, Palo Alto, CA) was used according to the recommended usage. The source of viral RNA was acute-phase T-1053 plasma extracted as described above. The oligonucleotides specific to the individual virus species used for reverse transcription (RT), the first PCR amplification (PCR 1) and the second PCR amplification (PCR 2) are shown in Table 11. The binding anchor primer and its complementary PCR primer were provided by the manufacturer. PCR was performed using the GeneAmp RNA PCR kit (Perkin Elmer) according to the recommended usage.

The product generated by RNA ligase mediated 5 'RACE was isolated from a low melting agarose gel as described above and cloned into the pT7 Blue T-vector plasmid (Novagen).
To obtain alternative sequences at the 5 'and 3' ends of the HGBV-B sequence (see "Evidence for the presence of two HCV-like flaviviruses in HGBV" below), RNA cyclization experiments (RNA circularization experiment) was performed. (This method is described in C.W. Mandl et al. (1991)Biotechniques,Vol 10 (4): 485-486. Total nucleic acid was purified from 50 μl of T-1057 plasma (14 days after H205 inoculation except that tRNA was replaced with 1 μg of glycogen during precipitation). The nucleic acid pellet was redissolved in 16.3 μl of DEPC-treated water, 25 μl of 2 × TAP buffer (1 × = 50 mM NaOAc, pH 5.0, 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM ATP) and pyrobacco tobacco 8.7 μl of phosphatase (20 units; Sigma) was added. The mixture was incubated at 37 ° C. for 60 minutes. The sample was extracted using phenol (saturated with water) and further using chloroform, and precipitated with NaOAc / EtOH in the presence of glycogen (1 μg). The pellet was dissolved in 83 μl of DEPC water, and 10 μl of 10 × RNA ligase buffer (New England Biolabs, NEB), 2 μl of RNase inhibitor (Perkin Elmer) and 5 μl of T4 RNA ligase (NEB) were added. The mixture was incubated at 4 ° C. for 16 hours. Samples were extracted using phenol and chloroform as before, and precipitated using NaOAc / EtOH.
1/10 of the bound RNA was used in a reverse transcriptase (RT) reaction using Superscript RT (GIBCO / BRL) according to its recommended use and using SEQ ID NO: 146 as a primer. Half of the RT reaction mixture was used as described above for PCR1 in the presence of a biotinylated oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 146) and a second oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 133). The PCR1 product was purified from the reaction mixture using streptavidin-coated magnetic beads as described by Sorensen et al. (Supra). The purified PCR1 product (2 μl out of 30 μl) was used as a template for PCR2. A 1200 bp product was obtained by PCR2 using oligonucleotide primers (SEQ ID NOs: 147,154), which was cloned into the pT7 Blue T-vector plasmid and sequenced as described below. Sequence analysis of two independent clones from this experiment showed that the known clones (although one clone had a sequence of 18 T residues and the other clone had a sequence of 27 T residues). A region overlapping with the sequence showed 100% identity, and revealed a new sequence with an additional 270 bases.
The cyclization experiments provided sequences from both the 5 'and 3' ends of the HGBV-B virus genome that were not obtained with the standard 3'-RACE or 5'-RACE procedures. However, it was difficult to find the correct 5'-3 'junction even after another PCR experiment using primers designed from the newly obtained sequence. Therefore, in order to better qualify the 5 'end of the HGBV-B RNA genome, a primer extension experiment was performed using RNA isolated from T-1053 liver.
As described in Example 7, total cellular RNA was isolated from the liver of T-1053 and the liver of a control (ie, uninfected) animal (T-1040). The antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 155) was prepared using T4 polynucleotide kinase (NEB) at approximately 9.39 × 10⁷Γ- to specific activity of CPM / μg³²End-labeled with P-ATP (Sambrook et al.). Primers were annealed to 30 μl of T-1053 and T-1040 liver RNA in separate reactions and extended using MMLV reverse transcriptase (Perkin-Elmer) as described above (Sambrook et al.). The products were analyzed on a 6% sequencing gel. A sequence ladder generated from one of the HGBV-B circularized clones using the same primers used for primer extension served as a size standard.
A 176 bp primer extension product was obtained from T-1053. Primer extension using liver RNA extracted from an uninfected animal (T-1040) did not yield such a product and therefore indicated a product obtained from the HGBV-B genome. The length of these products obtained indicated that the 5 'end of the genome, such as that present in the liver of infected animals, was located 442 nucleotides upstream from the AUG start codon.
To confirm the 3 'position of the sequence obtained in the cyclization experiment, RT-PCR was performed using primers corresponding to the predicted 3' end (see reaction 1.25 in Table 2). . RT-PCR of infected T-1053 plasma (as described above) using SEQ ID NO: 156 and SEQ ID NO: 157 yielded a 450 bp product. In contrast, RT-PCR using the complement of SEQ ID NO: 157 and SEQ ID NO: 147 did not yield a detectable PCR product (data not shown). These data suggest that the 3 'end of the genome is located 50 nucleotides downstream of the polyT system.
The cloned products from Tables 9, 10 and 11 and the RNA cyclization experiments described above were sequenced as previously described in Example 5. Interestingly, it was discovered that the cloned products of reactions 1.4, 1.6, 1.9, 1.10, 1.11 contained only one of the two primer sequences at their ends, indicating that these products were incorrect. Suggests that it occurred as a result of a random priming event. The sequences detected in the products 1.4, 1.6, 1.9, 1.10, 1.11 by PCR / sequencing experiments were related to clone 4 (SEQ ID NO: 21) and / or clone 50 (SEQ ID NO: 29). In addition, the sequences obtained from each of the reactions had limited identity with HCV. Therefore, these products were considered to contain genuine HGBV sequences, albeit as a result of incorrect priming at one end of the PCR product. The product obtained from reaction 1.14 was also considered to be the result of incorrect synthesis initiation. In this case, the complement of SEQ ID NO: 160 was found at the 5 'end of the product from reaction 1.14 (FIG. 22, GB-B). This was unexpected, as SEQ ID NO: 160 was obtained from SEQ ID NO: 161 in GB-A. However, the sequence identity between the product from reaction 1.14 and the product from reaction 2.8, together with another PCR / sequencing experiment (data not shown), shows that reaction 1.14 recreates the authentic HGBV sequence. Proven to include. It is clear that the complement of SEQ ID NO: 160 is upstream of SEQ ID NO: 162 and has sufficient identity to the GB-B sequence to serve as a PCR primer.
The sequences obtained from the products shown in Tables 9, 10 and 11 and the sequences obtained from the RNA cyclization experiments were contig using the GCG Package (Version 7) program. ). FIG. 22 shows an outline of the assembled contig. GB contig A (GB-A) is 9493 bp in length, all of which have been sequenced and are shown in SEQ ID NO: 163. GB-A was clone 2 (SEQ ID NO: 22), clone 16 (SEQ ID NO: 26), clone 23 (SEQ ID NO: 28), clone 18 (SEQ ID NO: 27), clone 11 (SEQ ID NO: 24), and clone 10 (SEQ ID NO: 24). 23). SEQ ID NO: 163 is translated into three readable frames and is set forth in the Sequence Listing as SEQ ID NOs: 164-392. GB contig B (GB-B) is 9143 bp and is shown in SEQ ID NO: 393. GB-B (SEQ ID NO: 393) includes clone 4 (SEQ ID NO: 21), clone 50 (SEQ ID NO: 29), clone 119 (SEQ ID NO: 30), and clone 13 (SEQ ID NO: 25). SEQ ID NO: 393 is translated into one open reading frame and is shown in the form of a sequence listing as SEQ ID NOs: 396, 397. It is possible to translate each of the UTRs from the 5 'and 3' ends into six reading frames.
B.Evidence for the presence of two HCV-like viruses in HGBV Support
1.GB-A and GB-B representing two different RNA species Evidence of
By comparing GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) with HCV-1 (GenBank accession # M67643), GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) This shows that all sequences are different from HCV-1. Dot plot analysis of the nucleic acid sequences of GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) and HCV-1 was performed using GCGPackage (Version 7). Using a window size of 21 and a stringency of 14, GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) and HCV-1 contain nucleotide sequences that are distinctly different from each other. Was discovered (Figure 23). Thus, GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) do not represent different strains or genotypes of HCV, nor do they represent different strains or genotypes. By this analysis, short regions with limited nucleotide identity were found in the NS3-like and NS5b-like sequences of GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393), as well as in the NS3 of HCV. Sequence and was found in the NS5b sequence. However, since the putative NTP-binding helicase and RNA-dependent RNA polymerase each correspond to NS3 and NS5b, which are conserved in all flaviviruses, the nucleotide identity within the region is surprising. No (see below). The 5 'RACE experiment (supra) demonstrated that GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) represent separate RNA molecules and that they are not separate regions of the same RNA molecule. , Demonstrated by Northern blot data (described in Example 8). First, 5 'RACE experiments showed that the 5' ends of GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) were different. GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) represent separate RNA molecules because there is only one 5 'end of the RNA molecule. Second, infected tamarin liver RNA by Northern blot using clone 4 and clone 50 (both obtained from GB-B [SEQ ID NO: 393], see SEQ ID NOs: 29 and 29, see Example 8). The RNA molecule of 8300 bases detected therein almost matched the size of GB-B (SEQ ID NO: 393, 9143 bp). Given that GB-A and GB-B are each part of the same RNA molecule, there must be a Northern blot product with at least 17,000 bases. These data indicate that GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are nucleotide sequences of two different RNA molecules that are neither variants of HCV nor variants of each other. Is shown.
According to Northern blot analysis and PCR investigation of T-1053, two RNA species corresponding to GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393), respectively, were found in the liver of T-1053. It was found that they were not present in equal content. As described above, clone 4 and clone 50 (SEQ ID NOs: 21 and 29, respectively), both obtained from GB-B (SEQ ID NO: 393), were isolated from T-1053 infected liver (as described in Example 8). Hybridized with the 8.3 kb RNA species present in E. coli. In contrast, clone 2 (SEQ ID NO: 22), clone 10 (SEQ ID NO: 23), clone 16 (SEQ ID NO: 26), and clone 23 (SEQ ID NO: 23) all obtained from GB-A (SEQ ID NO: 163) 28) did not show any hybridization with T-1053 liver RNA in the same experiment (data not shown). In addition, despite the demonstrated sensitivity of clone 4 PCR and clone 16 PCR using the plasmid template (data not shown), clone 16 PCR showed T- Significantly less product was produced on cDNA generated from 1053 liver RNA compared to clone 4 PCR. This was in contrast to the situation found in T-1053 plasma at the time the animals were sacrificed. PCR titration experiments on clone 4 (specific for GB-B (SEQ ID NO: 393)) and clone 6 (specific for GB-A (SEQ ID NO: 163)) PCR on cDNA generated from T-1053 plasma RNA Suggested that equal amounts of GB-A (SEQ ID NO: 163) RNA and GB-B (SEQ ID NO: 393) RNA were present in T-1053 plasma (Example 4, E.2). Thus, despite the equivalent content of GB-A (SEQ ID NO: 163) RNA and GB-B (SEQ ID NO: 393) RNA in T-1053 plasma, the T It was thought that GB-B (SEQ ID NO: 393) RNA was present in the liver in a larger amount than GB-A (SEQ ID NO: 163) RNA. These results further provide further evidence that two distinct RNA molecules corresponding to GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are present in T-1053 plasma. Yes, suggesting that these RNAs are not necessarily present in equal amounts in infected tamarin liver RNA. Therefore, it is unlikely that GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) form separate segments of a single viral genome.
2.GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) Represent the genomes of two different viruses. Evidence of
Examination of infectivity and PCR provides evidence for the viral properties of GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393). Specifically, it is filtered (0.1 μm) and^-Four10 diluted or unfiltered^-FiveT-1049 and Tamarin T-1051 inoculated with T-1053 plasma diluted in each of the above were clone 4 (GB-B [SEQ ID NO: 393]) sequence and clone 16 (GB-A [SEQ ID NO: 163]). ) Positive for both sequences. Prior to inoculation, both of these animals were negative for clone 4 and clone 16 (Examples 4, E.4, E.5). Therefore, the two RNA species contained in the plasma of acute phase T-1053 corresponding to GB-A and GB-B were filtered and diluted and the other animals were identified as GB-A (SEQ ID NO: 163). And GB-B (SEQ ID NO: 393) could be passaged to maintain the expected properties. PCR studies of H205 inoculated tamarins revealed that GB-A and GB-B represent RNA molecules from separate virus particles. Specifically, after H205 inoculation, all four tamarins became positive for clone 4 (GB-B [SEQ ID NO: 393]) by RT-PCR. In contrast, only one of the four H205-inoculated tamarins (T-1053) was positive for clone 16 (GB-B [SEQ ID NO: 163]) (run Example 4, E.2). Therefore, it is assumed that the GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence is not really present in T-1048, T-1057 and T-1061, and that the negative result of clone 16 PCR indicates low infectivity. As a result, the virus corresponding to the GB-B (SEQ ID NO: 393) sequence (ie, hepatitis GB virus B [HGBV-B]) is unrelated to the GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence. Could be passaged alone. A sample of only HGBV-B from T-1057 was passaged twice more (Example 4). In these animals, the GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence was not detected by RT-PCR. In addition, hepatic enzyme levels were found to be significantly elevated in these animals (Example 4), indicating that HGBV-B alone caused tamarin to develop hepatitis. In tamarins having a GB-B (SEQ ID NO: 393) sequence lower than the detection limit, a GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence was confirmed. Specifically, when induced with T-1053 plasma in GB-B only animals (T-1048, T-1057, T-1061), GB-B as detected by RT-PCR specific for clone 16 -A (SEQ ID NO: 163) only viremia developed. One additional passage of GB-A-only plasma from T-1057 was performed (Example 4). Therefore, it was considered that the virus (hepatitis GB virus A [HGBV-A]) corresponding to the GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence replicates independently of HGBV-B. Subcultures of HGBV-A continue in the absence of HGBV-B. To date, it is unclear whether HGBV-A causes tamarin hepatitis. However, there was no increase in liver enzyme levels associated with HGBV-A viremia in T-1053-induced tamarin, and even when the serum of HGBV-A alone from T-1057 was subcultured, the increase in liver enzyme levels was not observed. The absence is in contrast to the hepatophilicity of HGBV-B in tamarins.
The presence of the two viruses in the acute phase T-1053 plasma is believed to be based on the H205 inoculum. Specifically, the data of Example 7 shows that clone 16 (SEQ ID NO: 26, from GB-A [SEQ ID NO: 163]) contained no plasma in pre-inoculation plasma from seven test tamarins. Indicated that it did not exist. In addition, clones 2, 10, 18, 23 (SEQ ID NOS: 22, 23, 27, 28, respectively, all from GB-A [SEQ ID NO: 163]) were also detected in any of the tested HGBV-inoculated tamarin plasmas. None (Example 7). Similar negative results were obtained when pre-inoculation tamarin plasma was tested for clone 4 and clone 50 (SEQ ID NOs: 21 and 29, respectively, all from GB-B [SEQ ID NO: 393]). Therefore, neither HGBV-A nor HGBV-B was present in tamarin plasma before inoculation. In contrast, all of the above clones (ie, clones 2, 10, 16, 18, 23 from GB-A [SEQ ID NO: 163] and clones 4, 50 from GB-B [SEQ ID NO: 393]) Detected in H205 inoculum (Table 7). Interestingly, as can be seen in the cDNA made from T-1053 liver (above), when using the same cDNA randomly initiated from H205, some of the GB-A (SEQ ID NO: 163) All of these separate PCR targets had less product than similar PCR targets in GB-B (SEQ ID NO: 393) (data not shown). Therefore, it was concluded that HGBV-A and HGBV-B were present in the original GB inoculum, H205. However, it is considered that H205 contains more HGBV-B than HGBV-A. The relatively low amount of HGBV-A in the H205 inoculum was that only one in four tamarins was positive for HGBV-A after H205 inoculation (Example 4, E.2). The reason is considered.
3.HGBV-A and HGBV-B are Flaviviridae (Flaviv iridae)
When the three frame translation products of GB-A (SEQ ID NOs: 165-268, 270-384, 386-392) and GB-B (SEQ ID NO: 397) described in Example 5 were searched in the SWISS-PROT database, HCV It showed limited but significant amino acid sequence homology with various strains. The translation products from GB-A (SEQ ID NO: 164) and GB-B (SEQ ID NO: 393) bind to the non-structural protein regions of various HCV isolates (ie, NS2, NS3, NS4, NS5). It showed the closest homology. For example, as shown in FIG. 24, conserved residues (represented by *) in the putative NTP-binding helicase domain of the flavivirus (FIG. 24A) and the RNA-dependent RNA polymerase of all viral RNA-dependent RNA polymerases Conserved residues (represented by *) in the domain (FIG. 24B) are also HCV-1 NS3 and NS5b (SWISS-PROT accession number p26664), GB-A (SEQ ID NO: 390) and GB-B (SEQ ID NO: 397). ) Were retained in any of the expected translation products. (Choo et al.,PNAS 88: 2451-2455 [1991] and Domier et al.Virology 158: 20-27 [1987]. Therefore, it was considered that both the GB-A virus and the GB-B virus encode a functional NTP-binding helicase and an RNA-dependent RNA polymerase. However, GB-A (SEQ ID NO: 390) and GB-B (SEQ ID NO: 397) do not have complete amino acid identity between them and / or may be HCV in other regions of HCV NS3 and NS5b. No complete amino acid identity. Specifically, over 200 residues of NS3 shown in FIG. 24A, the GB-A (SEQ ID NO: 390, residues 1252-1449) virus and HCV-1 (SEQ ID NO: 398) are 47% identical. Yes, the GB-B (SEQ ID NO: 397, residues 1212-1408) virus and HCV-1 (SEQ ID NO: 398) are 55% identical and the GB-A (SEQ ID NO: 390, residues 1252-1449) virus and GB -B (SEQ ID NO: 397, residues 1212-1408) viruses were 43.5% identical. In addition, over 100 residues of NS3 shown in Figure 24B, the GB-A (SEQ ID NO: 390, residues 2644-2739) virus and HCV-1 (SEQ ID NO: 398) are 36% identical, HCV-1 (SEQ ID NO: 398) is 41% identical to GB-B (SEQ ID NO: 397, residues 2513-2612) virus, and GB-B is similar to GB-A (SEQ ID NO: 390, residues 2644-2739) virus. (SEQ ID NO: 397, residues 2599-2698) The viruses were 44% identical. Other putative nonstructural genes of GB-A (SEQ ID NO: 390) and GB-B (SEQ ID NO: 397) also had relatively low homology when compared to HCV. Compared to the various HCV sequences registered in Genbank, the overall level of homology of the putative non-structural proteins between GB-A and GB-B viruses is GB-A (SEQ ID NO: 164) and GB -B (SEQ ID NO: 393) both suggest that they are obtained from two distinct members of the Flaviviridae family. Flaviviruses contain a single genomic RNA molecule corresponding to one NTP-binding helicase domain and one RNA-dependent RNA polymerase domain. The presence of two contigs, each containing a putative RNA helicase domain and a putative RNA-dependent RNA polymerase domain, is consistent with the presence of two HCV-like flaviviruses in acute phase T-1053 plasma .
Example 10.PCR
To detect the sequence correlation between HGBV and hepatitis C virus, a PCR-based experiment was performed as follows. HCV isolates from various positional sources (Cha, T.-A. et al.J.Clin.Micr obiol.29: 2528-2534 [1991]), a highly conserved PCR primer based on the 5'-untranslated region (UTR) sequence of the HCV genome (J.H. Han,PNAS88: 1711-1715 [1991]) was used to detect similar sequences in H205 infected tamarin T-1053 liver RNA. Total cellular RNA was extracted from infected tamarin T-1053 liver and uninfected tamarin (T-1040) liver as described in Example 8A. A 30 μg sample of each RNA was reverse transcribed and PCR amplified using a kit available from Perkin-Elmer and generally following its recommended use. An antisense primer containing bases 249-268 of HCV 5'-UTR (primer 1) was used for the reverse transcriptase reaction. Primer 1 and a primer containing bases 13-46 of HCV 5'-UTR (primer 2) were used for PCR amplification of the intervening sequence. Thermocycling conditions are from Cha et al. (Supra).
To increase the sensitivity of detecting the HCV 5'-UTR sequence of H205 infected tamarin T-1053, a second amplification reaction using "nested" PCR primers was generated for the PCR reaction. Primers therefor were obtained from sequences in the HCV 5'-UTR that lie between the sequences of the above primer 1 and the above primer 2. Primer 3 contained the sequence from bases 47-69 of the HCV 5'-UTR, and primer 4, the antisense primer, contained bases 188-210 of the HCV 5'-UTR. In this “nested” PCR reaction, the PCR product from the first PCR reaction (100 μl to 2 μl total reaction volume) was used as a source of DNA template. Thermocycling conditions were generally the same except that the annealing temperature was 55 ° C instead of 60 ° C. The PCR products obtained in the second PCR reaction were analyzed for the desired DNA products using agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. The expected size of the DNA fragment based on the HCV 5'-UTR sequence (Han et al., Supra) is 253 bp for the product of the first PCR reaction and 163 bp for the product of the nested PCR reaction. Was. Expected size PCR products were obtained in control experiments performed using 30 μg of total cellular RNA extracted from HCV infected chimpanzee liver described in Example 8A (data not shown), This shows that the experimental procedure can detect 5'-UTR of HCV. However, when either T-1053 liver RNA or T-1040 liver RNA was used, neither desired product was found on the resulting ethidium bromide stained agarose gel (data not shown). ). Thus, the expected results were not obtained because (i) the oligonucleotide primers used were not efficiently annealed because the sequence of 5'-UTR of the above reagent was significantly different from that of HCV, Thus, PCR amplification is no longer possible, or (ii) the reagent lacks 5'-UTR. In both cases, it is deduced from this result that the nucleotide sequence of the reagent is significantly different from that of HCV.
Nucleic acids were isolated from chimpanzee plasma pools obtained during the acute phase of experimental infection with HCV as described in Example 7 (G. Schlauder et al., J. Clin. Microbiology 29: 2175-2179 [1991]). RT-PCR was performed as in Example 7 using clone 16 primers (SEQ ID NOs: 93 and 94). The expected size band for these primers was not detected by ethidium bromide staining nor after hybridization to a probe specific for clone 16 (data not shown). These results demonstrate the unrelatedity of the clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) to HCV.
Example 11. HGBV-infected sera against other hepatitis viruses Reactivity
Serum specimens were obtained before and after HGBV inoculation using H205 inoculum (T-1048, T-1057, T-1061) or T-1053 inoculum (T-1051) and detected after contact with known hepatitis virus Tests for frequently performed antibodies were performed. Antibodies to hepatitis A virus (using the HAVAB assay available from the applicant) and the nucleoprotein of the hepatitis B core (Corzyme available from the applicant)^{▲ R ▼}Test), hepatitis E virus (HEV) (using HEVEIA available from the applicant), and hepatitis C virus (HCV) (using the HCV second generation test available from the applicant) The specimens were examined for These tests were performed according to the instructions included in the package of each test kit.
None of the tamarins tested were positive for antibodies to HCV or HEV both before and after HGBV inoculation (see Table 12). Thus, HGBV infection did not result in detectable antisera to HCV or HEV.
One of the tamarins (T-1061) was positive for HAV antibodies both before and after HGBV inoculation, suggesting that they had been previously infected with HAV ( Table 9, T-1061). However, the other three tamarins (T-1048, T-1057, T-1051) did not show any HAV-specific antibodies after HGBV inoculation. Thus, HGBV infection does not produce an anti-HAV response. One of the tamarins (T-1048) was negative for HBV antibodies both before and after HGBV inoculation. Two of the tamarins (T-1061, T-1057) were positive prior to HGBV inoculation. One of the tamarins (T-1051) was near borderline positive for HBV antibodies before HGBV inoculation, but was negative after inoculation. Based on these data, there is no evidence that infection with HGBV reagents induces an immune response against HBV nuclei. Collectively, these data demonstrated that the HGBV reagent is a unique viral agent and is not related to any of the common viral reagents associated with human hepatitis.
Example 12. Western blot analysis of HGBV infected liver
As shown in Examples 1 and 2 above, tamarins inoculated with HGBV showed increased liver enzyme levels. If HGBV is indeed a hepatotrophic virus, it is speculated that viral proteins are produced in infected liver cells and an immune response to these proteins occurs. In this example, a unique liver protein from HGBV-infected tamarins appeared, which was specifically recognized by Western blot using tamarin serum obtained during the convalescent phase following HGBV infection. The rationale to be followed.
HGBV-infected tamarin liver and various control tamarin and chimpanzee livers were diced and homogenized in PBS using an Omni-mixer homogenizer (about 1 g of liver for 5 ml). The resulting suspension was clarified by centrifugation (10,000 × g, 1 hour, 4 ° C.) and ultrafiltration through 5 μm, 0.8 μm, and 0.45 μm filters. The clarified homogenate was centrifuged under conditions that caused pelleting of all components of 100S or more. The pellet (100S liver fraction) was dissolved in a small amount of buffer and stored at -70 ° C.
SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was performed using standard methods and reagents (Laemmli discontinuous gel). The 100S liver fraction was diluted 1:20 in sample buffer containing SDS and 2-mercaptoethanol and heated to 95 ° C. for 5 minutes. The proteins were electrophoresed on either 12% acrylamide or 4 → 15% acrylamide linear gradient gels (7 cm × 8 cm) at 200 volts for 30-45 minutes. Proteins were electro-transferred to nitrocellulose membranes using standard methods and reagents.
Western blots were generated using standard methods. Briefly, the nitrocellulose membrane was briefly rinsed in TBS / Tween, 4 ° C. TBS / CS (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.18% Tween-20, 4.0% calf serum, pH 8.0 ). The nitrocellulose membrane was placed in a Multi-screen device and 600 μg of serum was placed in the groove of the device, then kept at room temperature for 2 hours and incubated at 4 ° C. overnight. The nitrocellulose membrane was removed from the Multi-screen apparatus, and the nitrocellulose membrane was washed three times for 5 minutes each in TBS / Twee (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 8.0). The nitrocellulose membrane was incubated for 1 hour at room temperature in 15 ml of a goat anti-human: HRPO conjugate (0.2 μg / ml TBS / CS). After washing as described above, the nitrocellulose membrane was incubated in the TMB enzyme substrate solution, rinsed with water and dried.
Proteins isolated from T-1053 liver at the time of sacrifice (12 days after GB inoculation) and absorbed and transcribed as described above were obtained at weeks 5, 6, 7, 9, 9 or 11 after GB inoculation. Showed a unique antigenic protein with an apparent molecular weight of about 50-80 kDa upon reaction with T-1057 serum. The band was absent when reacted with T-1057 serum before or 3 weeks after GB inoculation. When reacted with any of the T-1057 sera, the band did not appear in lanes containing liver protein obtained from uninoculated tamarin (T-1040). In addition, when T-1053 liver protein was allowed to react with another serum after GB inoculation (T-1048 at 11 weeks after GB inoculation and T-1051 at 8 weeks after GB inoculation), the same size (50%) was obtained. 〜80 kDa) protein, but when the pre-inoculation serum from the same animal was reacted with T-1053 liver protein, this same size protein did not appear.
To determine if the immunoreactive band is detected in liver tissue from other GB inoculated tamarins or in liver tissue of chimpanzees infected with either HCV or HBV, Western blot experiments were performed. In each case, nitrocellulose strips containing liver protein were reacted with serum pools obtained from T-1048 (5, 8, 16 weeks after GB inoculation) and T-1051 (8, 12 weeks after GB inoculation). Was. In the pool, the five sera were mixed in equal proportions. Reactive protein bands of 50-80 kDa were obtained from GB inoculated tamarins (T-1038, T-1049, T-1055 obtained on day 14 after GB inoculation and T-1053 obtained on day 12 after GB inoculation). It was detected in all obtained tamarin liver specimens. This immunoreactive band was composed of liver specimens obtained from T-1040 (uninoculated) and chimpanzee liver specimens (CHAS-457 (before HCV inoculation), CHAS-457 (HCV +), CRAIG-454 (HCV +), MUNA- 376 (HBV +)).
Taken together, these data demonstrate the presence of immunogenic and antigenic proteins with an apparent molecular weight of approximately 50-80 kDa that specifically bind to HGBV-infected tamarin liver. The nature of this HGBV-related protein (ie, virally encoded or host-origin) is currently under investigation. Regardless of the origin of the HGBV-related proteins, these results are consistent with the fact that HGBV infection induces an antibody response to antigens present in HGBV-infected tamarin liver.
Example 13. Immunogenic HGBV-A and HGBV-B based on CKS Expression and detection of polypeptides
A.Cloning of HGBV-A and HGBV-B sequences
The recombinant protein was fused to the CMP-KDO synthetase (CKS) protein using the cloning vectors pJO200, pJO201, and pJO202. Each of these plasmids is derived from plasmid pBR322, but fused to a kdsB gene fragment (encoding the first 239 of the total 248 amino acids that make up the E. coli CKS protein); a synthetic linker fused to the end of the kdsB gene fragment. This synthetic linker contained multiple restriction sites required for gene insertion, a translation termination signal, and a trpA rho-dependent transcription terminator. Unique restriction sites within this linker region included, in the 5 'to 3' direction, EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Pst I, Sph I, Hind III. Each plasmid allows for insertion into any of the reading frames within the plurality of cloning sites. CKS methods and CKS vectors for protein synthesis are disclosed in Applicant's U.S. Pat.No. 5,124,255, incorporated herein by reference, while the use of CKS fusion proteins in assay formats and test kits is not disclosed. No. 07 / 903,043, of the present applicant, which is incorporated herein by reference.
The HGBV-A sequence and the HGBV-B sequence obtained from the walking experiment described in Tables 9 and 10 (Example 9) were used as the restriction enzymes (10 units, NEB) shown in Tables 13 and 14. Was isolated from the appropriate pT7Blue T-vector clone and purified from a 1% low melting point agarose gel as described in Example 3B. Plasmids pJO200, pJO201 and pJO202 were digested with the same restriction enzymes (10 units, NEB) and dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (GIBCO BRL, Grand Island, NY). Each of the purified HGBV fragments was ligated into digested and dephosphorylated pJO200, pJO201, pJO202 and transformed into E. coli XL1 Blue as described in Example 3B. Successful formation of the CKS / HGBV expression vector was confirmed by standard miniprep analysis.
Another two PCR products were specifically prepared for expression. These two products, designated 4.1 and 4.2, were predicted to encode the HGBV-B and HGBV-A core regions, respectively (see FIG. 22). As described in Example 9, PCR product 4.1 was made using primer core B-s and primer core B-a1 (SEQ ID NOs: 708, 709), and PCR product 4.2 was prepared using primer core A- and primer core 2.2.1 '(SEQ ID NOs: 710, 138). The 4.1 sense and antisense primers each had EcoR I and BamH I restriction sites intended to be terminal. The 4.1 PCR product was digested, gel isolated and ligated to pJO200, pJO201, pJO202 as described above. 4.2 The sense primer for the PCR product had an EcoR I restriction site intended to be terminal, whereas the antisense primer had no restriction site. Thus, the product was cut with EcoR I, gel isolated, ligated to pJO200, pJO201, pJO202 already digested with BamH I, end-modified with Klenow fragment of DNA polymerase and dNTP, and digested with EcoR I. And dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase as known in the art.
B.Expression of HGBV-A and HGBV-B sequences
E. coli XL1 Blue containing the CKS / HGBV expression vector while shaking in a medium containing tryptone 32 gm / L, yeast extract 20 gm / L, MaCl 5 gm / L, pH 7.4, ampicillin 100 mg / L, glucose 3 mM Cultures were grown at 37 ° C. When the culture reached an OD600 of 1.0-2.0, IPTG was added to a final concentration of 1 mM to induce expression from the modified rack promoter. The culture was grown at 37 ° C. with shaking for an additional 3 hours and harvested. Resuspend the cell pellet in SDS / PAGE loading buffer (Tris pH 6.8 62.5 mM, SDS 2%, glycerol 10%, 2-mercaptoethanol 5%, bromophenol blue 0.1 mg / ml) to an OD600 of 10 Turbid and boil for 5 minutes. An aliquot of the prepared whole cell lysate was applied on a 10% SDS-polyacrylamide gel, stained with a solution containing 0.2% Coomassie Blue dye in 40% methanol / 10% acetic acid, and further until the background became clear. Decolorized with 16.5% methanol / 5% acetic acid.
Whole cell lysates were run on a second 10% SDS-polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose by electrophoresis for immunoblot assays. A sheet of nitrocellulose containing the transferred protein was incubated in a blocking solution (5% Carnation non-fat dry milk in Tris buffered saline) for 30 minutes at room temperature and pre-blocked against E. coli cell lysate. Incubated for 1 hour at room temperature in goat anti-CKS serum and diluted 1: 1000 in blocking solution. The nitrocellulose sheet was washed twice with Tris-buffered saline (TBS), then incubated with alkaline phosphatase-conjugated rabbit anti-goat IgG for 1 hour at room temperature and diluted 1: 1000 in blocking solution. The nitrocellulose sheet was washed twice with TBS and developed in TBS containing nitroblue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate. The appropriate reading frame for each fragment was determined based on the expression of the immunoreactive CKS fusion protein of the correct expected size, and the vector insert binding site was confirmed by DNA sequencing.
After determining the appropriate reading frame for each of the above fragments, samples from cultures containing the appropriate components were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot. FIG. 25A shows two Coomassie stained 10% SDS-polyacrylamide gels containing the CKS fusion protein whole cell lysate. Lanes 1 and 16 contain molecular weight standards in kilodaltons shown on the left. The order of development on Gel 1 (HGBV-A sample) was as follows: Lane 2, before clone 1.17 induction: Lane 3-15, clone 4.2, clone 1.17, clone 1.8, clone 1.2, clone 1.18 (SEQ ID NO: 390) ), Clone 1.19, clone 1.20, clone 1.21, clone 1.22 (SEQ ID NO: 390), clone 2.12, clone 1.5, clone 1.23, clone 2.18, all 3 hours after induction. The development order on Gel 2 (HGBV-B sample) was as follows: lane 17, before clone 4.1 induction: lanes 18-29, clone 4.1, clone 1.15, clone 1.14, clone 2.8, clone 1.13, clone 1.12, Clone 2.1, clone 1.7, clone 1.3, clone 1.4, clone 1.16, clone 2.12, all 3 hours after induction. The proteins were run on two separate 10% gels in the same order as above and transferred to nitrocellulose as described above. Samples were analyzed by Western blot using pools of sera from two convalescent T-1048, T-1051 as follows. The nitrocellulose sheet containing the sample was incubated in the blocking solution for 30 minutes, and 10% of E. coli lysate, 6 mg / ml of XL1-Blue / CKS lysate, and a recovery tamarin described in Table 6 (Example 4). Transferred to a blocking solution containing a 1: 100 dilution of the serum pool. After overnight incubation at room temperature, the nitrocellulose sheet was washed twice in TBS, incubated for 1 hour at room temperature in HRPO-conjugated goat anti-human IgG, and diluted 1: 500 in blocking solution. The nitrocellulose sheet was washed twice in TBS and developed in TBS containing 2 mg / ml of 4-chloro-1-naphthol, 0.02% of hydrogen peroxide and 17% of methanol. As shown in FIG. 25B, CKS fusions of the three HGBV-B proteins, clones 1.4, 1.7, 4.1, showed an immunoreactivity with the tamarin serum pool. Clone 1.7 contains the sequence encoding the HGBV-B immunogenic region (SEQ ID NO: 610) and clone 1.4 was found by immunoscreening a cDNA library (Example 4) using the same convalescent tamarin serum pool. And contained sequences encoding two HGBV-B immunogenic regions (SEQ ID NOs: 12, 13, 18).
The sample described in the above paragraph was also prepared as described above using a 1: 100 dilution of convalescent serum obtained approximately three weeks after the onset of acute hepatitis from the surgeon GB. Analyzed by blot. Tables 13 and 14 show the reactivity of the fusion protein of HGBV-A and HGBV-B with the above serum. Only one (2.1) of the HGBV-B proteins showed reactivity to this serum, but this reactivity was very low, while two HGBV-A proteins (1.22 [SEQ ID NO: 390], 2.17) showed this reactivity. It showed high reactivity to serum. These two HGBV-A proteins are common for 40 amino acids, which may reflect reactivity to one or more epitopes. These two HGBV-A proteins were selected for use in an ELISA assay as described in Example 16. Tamarin infected with the passage 11 inoculated GB material (H205 GB pass 11) showed an immune response to some HGBV-B epitopes and no immune response to the HGBV-A epitope, Interestingly, serum from the original GB source showed significant reactivity to at least one GBV-A epitope. This suggested that HGBV-A may have been the cause of hepatitis in military physicians GB.
Four additional human sera that showed the presence of antibodies to one or more of the CKS / HGBV-A or CKS / HGBV-B fusion proteins by 1.4, 1.7, or 2.17 ELISAS (see Examples 15, 16) , Selected for Western blot analysis. Three of these sera (G1-41, G1-14, G1-31) are from the West African "dangerous" population and the fourth (341C) is a non-AE hepatitis (Egypt) specimen (these (See Example 15 for a detailed description of the population). Whole cell lysates from some of the above CKS fusion proteins were run on another 10% SDS-polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose as described above. One of each of these blots was pre-sealed as described above and one 1: 100 human serum specimen diluted 1: 100 in blocking buffer containing 10% E. coli lysate and 6 mg / ml XL1-Blue / CKS lysate. And overnight. The blot was washed twice in TBS, reacted with HRPO-conjugated goat anti-human IgG, and developed as described above.
CKS / HGBV-B protein was analyzed using two of the above sera (G1-41, G1-14) and the reactivity is shown in Table 13. In addition to the three proteins reactive to tamarin serum, two additional proteins (1.16, 2.1) were reactive to either of the two human sera. The CKS / HGBV-A protein was analyzed with all four human sera above and their reactivity is shown in Table 14. In addition to the two proteins reactive with GB serum, three additional proteins (1.5, 1.18, 1.19) were reactive with one or more of the human sera. Two of these proteins (1.5, 1.18) were selected for use in an ELISA assay as described in Example 16. The G1-31 sera reactive by Western blot and / or by ELISA against two HGBV-A proteins (1.18, 2.17) and one HGBV-B protein (1.7) (Examples 15, 16) showed GB-31 It is of particular interest that the C sequence (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) is the serum isolated therefrom (Example 17).

Example 14. Immunoreactive HGBV-A and HGBV-B proteins Quality epitope mapping
A.Epitope mapping of HGBV-B protein 1.7
To confirm the location of the immunogenic region, overlapping subclones within HGBV-B immunogenic protein 1.7 were performed by RT-PCR from T-1053 serum as described in Example 7. Each PCR primer has an extra 6 bases at the 5 'end to facilitate restriction enzyme digestion, followed by either an EcoRI site (sense primer) or a Hind III site (antisense primer). Followed. In addition, each antisense primer contained a stop codon immediately after the coding region. After digestion, each fragment was cloned into EcoR I / Hind III-digested pJO201 as described in Example 13. The CKS fusion protein was expressed and analyzed by Western blot using tamarin T-1048 / T-1051 serum as described in Example 13. Five overlapping clones, designated 1.7-1 to 1.7-5, were generated. These clones encode a region of 1.7 proteins ranging in size from 104 to 110 amino acids. Table 15 shows the PCR primers used to generate each clone, the size of the encoded polypeptide, the position within the 1.7 sequence, and reactivity with tamarin T-1048 / T-1051 serum. Two additional duplicate clones were generated spanning the immunogenic region (SEQ ID NO: 678) found by immunoscreening of the cDNA library (Example 4). Each of these clones, designated 1.7-6 and 1.7-7, encodes a 75 amino acid polypeptide. Table 15 shows the PCR primers used, the size of the encoded polypeptide, the position within the 1.7 sequence, and the reactivity to tamarin T-1048 / T-1051 serum. Two immunogenic regions were identified in the 1.7 protein, which is 507 amino acids long. That is, the immunogenic region near the N-terminus was within residues 1-105 and the immunogenic region near the center of the protein was within residues 185-410. Whether there is a single epitope or multiple epitopes in each of these regions requires further investigation.
B.Epitope mapping of HGBV-B protein 1.4
To confirm the location of the immunogenic region, overlapping subclones within HGBV-B immunogenic protein 1.4 were performed by RT-PCR from T-1053 serum. Each PCR primer has an extra 6 bases at the 5 'end to facilitate restriction enzyme digestion, followed by either an EcoRI site (sense primer) or a BamHI site (antisense primer). Followed. In addition, each antisense primer contained a stop codon immediately after the coding region. After digestion, each fragment was cloned into EcoR I / BamHI-digested pJO201 as described in Example 13. The CKS fusion protein was expressed and analyzed by Western blot using tamarin T-1048 / T-1051 serum as described in Example 13. Four overlapping clones, designated 1.4-1 to 1.4-4, were generated. These clones encode a region of the 1.4 protein that ranges in size from 137 to 138 amino acids. Table 15 shows the PCR primers used to generate each clone, the size of the encoded polypeptide, the position within the 1.4 sequence, and the reactivity with tamarin T-1048 / T-1051 serum. Two additional duplicate clones were generated spanning the immunogenic regions found by immunoscreening of the cDNA library (Example 4). Each of these clones, designated 1.4-5 and 1.4-6, encodes a polypeptide 75 amino acids in length. Table 15 shows the PCR primers used, the size of the encoded polypeptide, the position within the 1.4 sequence, and the reactivity with tamarin T-1048 / T-1051 serum. A sequence composed of 265 amino acids including residues 129 to 393 was identified as an immunogenic region in the 1.4 protein having a length of 522 amino acids. Since two non-contiguous immunogenic clones were identified in the sequence by immunoscreening the library (Example 4), at least two epitopes may be present in the region.
C.HGBV-A protein 1.22(SEQ ID NO: 390) and 2.17 Epitope mapping
Both HGBV-A proteins 1.22 (SEQ ID NO: 390) and 2.17 (SEQ ID NO: 613) showed immunoreaction with GB serum by Western blot (Example 13). Since these two proteins overlap by 40 amino acids, the immune response observed could be due to one epitope or as a result of the presence of more than one epitope. The complete 1.22 / 2.17 sequence was 641 amino acids long. To find an immunogenic region, overlapping subclones within this region were performed by RT-PCR from T-1053. Each PCR primer has an extra 6 bases at the 5 'end to facilitate restriction enzyme digestion, followed by an EcoRI site (sense primer) or 1.22 / 2.17-2 to 1.22. Any of the BamHI sites (antisense primers) followed for /2.17-6. However, since clone 1.22 / 2.17-1 has an internal EcoRI site, the BamHI site was used as the sense primer and the HindIII site was used as the antisense primer. In addition, each antisense primer contained a stop codon immediately after the coding region. After digestion, each fragment was cloned into EcoRI / BamHI-digested (or BamHI / HindIII-digested for 1.22 / 2.17-1) pJO201 as described in Example 13. The CKS fusion protein was expressed and analyzed by Western blot using GB serum as described in Example 13. This clone encoded a region of 1.22 / 2.17 in the size range of 115-116 amino acids. Table 15 shows the PCR primers used to generate each clone, the size of the encoded polypeptide, its position within the HGBV-A polypeptide sequence, and its reactivity with GB serum. At the center of the 1.22 / 2.17 protein, the immunogenic region narrowed to a region 220 amino acids long. It contains an overlapping region 40 amino acids in length between 1.22 and 2.17, so that the immune response common to the two proteins is due to a shared epitope or to multiple epitopes It may have been.

Example 15. Serological study of HGBV-B
A. Recombinant protein purification procedure
Bacterial cell cultures expressing the CKS fusion protein were frozen and stored at -70 ° C. Bacterial cells from each of the three constructs were thawed, triturated with lysozyme and DNase, and then sonicated in the presence of phenylmethanesulfonyl fluoride and other protease inhibitors with individual recombinant antigens. A mixture of E. coli proteins was obtained. For each of the three cultures, the insoluble recombinant antigen was concentrated by centrifugation and subjected to a series of washing steps to remove most of the non-recombinant E. coli protein. The composition of the washing solution used in this protocol was distilled water, 5% Triton X-100, and 50 mM Tris (8.5). The obtained precipitate was dissolved in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). After measuring the protein concentration, 2-mercaptoethanol was added, the mixture was subjected to gel filtration column chromatography using Sephacryl S300 resin, and various proteins were separated and separated according to their sizes. Each fraction was collected and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The protein separated by electroconversion was then stained with Coomassie Brilliant Blue R250 and had a molecular weight of approximately 75 kD (CKS-1.7 / SEQ ID NO: 610), 80 kD (CKS-1.4 / SEQ ID NO: 611), 42 kD (CKS- 4.1 / SEQ ID NO: 612). Fractions containing the relevant protein were pooled and re-examined by SDS-PAGE.
The immunogenicity and structural integrity of the pooled fractions containing the purified antigen were determined by electron transfer to nitrocellulose and immunoblotting according to the method described in Example 13. In the absence of a suitable positive control, recombinant proteins were identified by reactivity with monoclonal antibodies to the CKS portion of each fusion protein. When the CKS-1.7 protein (SEQ ID NO: 610) was examined by Western blotting using an anti-CKS monoclonal antibody to detect the recombinant antigen, a single band was observed at about 75 kD. This result is consistent with the expected size of the CKS-1.7 protein (SEQ ID NO: 610). For the CKS-1.4 protein (SEQ ID NO: 611), a quadruple band pattern was detected between 60 kD and 70 kD by the anti-CKS monoclonal antibody. These bands observed were shorter than expected for the full length protein and were probably deleted. When the CKS-4.1 protein (SEQ ID NO: 52) was examined by Western blotting, the recombinant antibody was detected as a single band at about 42 kD by the anti-CKS monoclonal antibody. This result is consistent with the size expected for the CKS-4.1 protein (SEQ ID NO: 612).
B. Procedure for coating polystyrene beads
The proteins were dialyzed and the antigenicity of these proteins on polystyrene beads was evaluated as described below. Separately, to detect antibodies against HGBV using each of the three purified HGBV recombinant proteins (CKS-1.7 / SEQ ID NO: 610, CKS-1.4 / SEQ ID NO: 611, and CKS-4.1 / SEQ ID NO: 612) An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed. The ELISA performed with these proteins was 1.7 ELISA (using CKS-1.7 (SEQ ID NO: 610) recombinant protein), 1.4 ELISA (using CKS-1.4 (SEQ ID NO: 611) recombinant protein) and 4.1 ELISA (CKS- 4.1 (SEQ ID NO: 612) using recombinant protein). In the first study, 1/4 inch polystyrene beads were coated with various concentrations of purified protein (approximately 60 beads / lot) and serum from uninoculated tamarin was used as a negative control, convalescent serum from inoculated tamarin. Was evaluated by an ELISA test (described below) using as a positive control. Other controls included pools of human sera from individuals determined to be negative for various hepatitis viruses. An additional positive control was a monoclonal antibody to the CKS protein to monitor the efficiency of coating the beads. Bead coating conditions were selected so that the ratio of the positive control signal to the negative control signal was the highest, and was used in the scale assay of the bead coating process. For each of the four ELISA tests, at least two lots of 1000 beads were made and used for serological studies.
Briefly, upon coating the polystyrene beads with the purified protein, the washed beads were added to a scintillation vial and the beads were immersed in a buffer containing recombinant antigen (about 0.233 ml / bead). A variety of different concentrations for each recombinant antigen were prepared and evaluated with a variety of different buffers adjusted to a pH in the range of 5.0-9.5. The vial was then placed on a rotator in a 40 ° C. incubator for 2 hours, after which the liquid was aspirated and the beads were washed three times with phosphate buffered saline (PBS) at pH 6.8. The beads were then treated with 0.1% Triton X-100 for 1 hour at 40 ° C. and washed three times with PBS. The beads were then overcoated with 5% bovine serum albumin and incubated at 40 ° C. for 1 hour with stirring. After repeated washing with PBS, the beads were overcoated with 5% sucrose for 20 minutes at room temperature, and the liquid was aspirated off. Finally, the beads were air dried and used in an ELISA test to detect antibodies to HGBV.
C. ELISA procedure for detecting antibodies to HGBV
ELISA was performed in an indirect assay. That is, serum or plasma was diluted with a sample diluent and reacted with an antigen coated on a solid phase. After the washing step, the beads were reacted with horseradish peroxidase (HRPO) -labeled antibodies directed against human immunoglobulins to detect tamarin or human antibodies bound to the solid phase. A sample that produced a signal exceeding the truncated value was regarded as reactive. Additional details regarding the ELISA are provided below.
In the ELISA format, a solid phase coated with an antigen is brought into contact with tamarin serum which has been diluted with a sample diluent (a buffer solution containing an animal serum and a nonionic activator) in advance. In preparing the sample diluent, the ratio of the specific antibody to the solid phase coated with the antigen is increased while the background signal due to the nonspecific binding of the immunoglobulin to the solid phase is reduced. I mixed. Specifically, 10 μl of tamarin serum was diluted with 150 μl of a sample diluent, and the mixture was rotated and stirred. After adding 10 μl of this pre-diluted sample to the wells in the reaction tray, 200 μl of sample diluent and antigen-coated polystyrene beads were added. The reaction tray was incubated in a dynamic incubator (Abbott Laboratories). The incubator was constantly stirred at room temperature. After a one hour incubation, the liquid was aspirated off and the wells containing the beads were washed three times with distilled water (5 ml each time). Next, 200 μl of HRPO-labeled goat anti-human immunoglobulin diluted with a conjugate diluent (buffer solution containing animal serum and nonionic surfactant) is added to each well, and the reaction tray is again incubated for 1 hour as described above. did. The liquid was aspirated off and the wells containing the beads were washed three times with distilled water as described above. The beads with antigen and bound immunoglobulin are removed from the wells, and each bead is placed in a test tube and 0.3%o0.02% H of phenylenediamine dihydrochloride_TwoO_TwoThe reaction was carried out with 300 μl of a 0.1 M citrate buffer (pH 5.5) solution. After 30 minutes at room temperature, 1N H_TwoSO_FourWas added to stop the reaction. The absorption at 492 nm was read on a spectrophotometer. The resulting color was directly proportional to the amount of antibody present in the test sample.
Preliminary truncation values were set for each group of specimens in order to distinguish between specimens that would not contain antibodies to the HGBV epitope and those that would contain antibodies to the HGBV epitope.
D. Detection of HGBV-derived RNA in serum of infected individuals
To correlate the serum response data of 1.7 and 1.4 ELISAs in the presence of HGBV-RNA in tamarin serum or human serum / plasma, U.S. patent application Ser. It carried out similarly to Example 7 of 08 / 283,314. For the implementation, oligonucleotides derived from the cloned sequence of HGBV were used. The final concentration of the oligonucleotides for clone 4 from the HGBV-B genome (see Example 7) and clone 16 from the HGBV-A genome was 0.5 μM.
Serum image of E. tamarin
Serum was collected weekly from tamarins housed in IEMSIP to obtain serum and liver enzyme levels were tested. The remaining amount of sample serum was sent to Abbott Laboratories for further investigation.
1. ELISA results for tamarin (early infectivity study)
Four tamarins (T-1053, T-1048, T-1057, and T-1061) were inoculated with GB serum (designated H205GB passage number 11). During the first week after inoculation (PI), an increase in liver enzymes was observed in tamarin T-1053. The tamarin was euthanized on PI12. Tamarins T-1048, T-1057, and T-1061 showed elevated liver enzymes by 2 weeks after inoculation. This increase lasted until PI 8-9 weeks (Figures 2-4) and then returned to pre-inoculation levels. At week 14 PI, these three tamarins were re-inoculated with 0.10 ml of undiluted serum from Tamarin T-1053 (this individual was found to be infectious-Example 2). went.
The serum of the three tamarins (Tamarin T-1048, T-1057, and T-1061) during the recovery phase was CKS-1.7 (SEQ ID NO: 610) recombinant protein, CKS-1.4 (SEQ ID NO: 611) recombinant protein, ELISA (FIGS. 3, 4, and 5) was performed individually to determine whether or not the antibody has an antibody against the CKS-4.1 (SEQ ID NO: 612) recombinant protein. Specific antibodies against the 1.7 (SEQ ID NO: 610), 1.4 (SEQ ID NO: 611), 4.1 (SEQ ID NO: 612), or 1.5 (SEQ ID NO: 614) recombinant proteins were not detected in any of the samples before inoculation.
As shown in FIG. 26, in the serum of T-1048, specific antibodies were detected on PI56-84 days by the 1.7 and 1.4 ELISA tests, but not on PI97 and 137 days. In the T-1048 serum, no specific antibody was detected in the 4.1 ELISA test. As shown in FIG. 27, an antibody against the 1.7 protein (SEQ ID NO: 610) was detected in the serum of T-1057 at PI56 and 63 days, but not after PI63. 4.1 Antibodies to the protein (SEQ ID NO: 612) were detected on PI28-63, but not PI84-97. As described above, each tamarin was re-inoculated with PI 205 on PI97. 4.1 Specific antibodies to the protein (SEQ ID NO: 612) were detected on PI112 and PI126, suggesting a prior response to inoculation. 1.4 No antibody reaction was observed for the recombinant protein (SEQ ID NO: 611).
A specific antibody against the recombinant 1.4 protein (SEQ ID NO: 611) was detected in the serum of tamarin T-1061 between PI84 and PI112, but not after PI126. As shown in FIG. 28, the serum of tamarin T-1061 was negative at 350 days PI for antibodies to 1.7 protein (SEQ ID NO: 610) and 4.1 protein (SEQ ID NO: 612).
2. Results of PCR on tamarins (Study on initial infectivity)
Tamarin T-1048 and T-1057 sera were selected, and HGBV-RNA was purified by RT-PCR using primers obtained from clone 4 described in Example 7 and primers obtained from clone 16 described in Example 7. Examined.
Depending on RT-PCR, HGBV-RNA was detected in both the primers in the sera 10 days before inoculation and 17 days before inoculation (T-1048) (FIG. 26), or (T-1057) (FIG. 27) was not detected in any of the primers. For T-1048, HGBV-RNA was detected using primers from clone 4 on 15 of 17 different sera obtained between days PI7-137. HGBV-RNA was not detected by RT-PCR using primers from clone 16 in any of the ten sera obtained during the period PI7-97. When T-1053 plasma was inoculated, 4 out of 5 sera collected during the 8 and 40 days after inoculation were positive for clone 16. As for T-1057, the result of RT-PCR was positive, as shown in FIG. 27, from four samples collected from PI7 to PI28, using primers from clone 4. The result of RT-PCR performed on each sample was negative for clone 4 except for day 287, which showed a weak hybridization signal after 28 days of PI. All of the six samples of T-1057 obtained on days PI7 to PI97 were positive for RT-PCR using primers from clone 16. However, sera between days 8 and 85 after inoculation with T-1053 were positive with the use of primers from clone 16.
3. ELISA results for tamarin (titer test / transmissibility study)
As described in Example 2, four tamarins were inoculated with the serum of Tamarin T-1053. Three of these four tamarins were euthanized during the acute phase of the disease (between days 12 and 14 PI). The RT-PCR results obtained for these three tamarins are described below. The surviving tamarin (T-1051) initially had elevated liver enzyme levels by day PI14, which persisted at least until week PI8. Specimens of Tamarin T-1051 were tested in 1.7 and 1.4 ELISAs. The results are shown in FIG. No specific antibodies were detected in sera collected during the first 41 days after inoculation or in pre-inoculation serum. However, the antibody response to the 1.4 protein (SEQ ID NO: 611) and 1.7 protein (SEQ ID NO: 610) was between PI49 and PI113 days, and the antibody response to the 4.1 protein (SEQ ID NO: 612) was between PI28 and PI105 days. Admitted. Tamarin was euthanized on day 113 of PI.
Tamarin (T-1034) was previously inoculated with 0.1 ml of potentially infectious serum of a patient recovering from a recently affected hepatitis infection (first GB source) as described in Example 1 and Table 4. It is. No increase in liver enzyme levels was observed for T-1034 for about 10 weeks after inoculation. For this reason, it was determined that tamarin T-1034 could be used in additional studies. Tamarin T-1034 was inoculated with the HGBV preparation. This HGBV preparation was prepared from the serum pool of three tamarins (T-1055, T-1038, T-1049) previously inoculated with the serum of tamarin T-1053 as described in Example 4 ?. .
These three tamarins (T-1055, T-1038, T-1049) were inoculated with serum prepared from tamarin T-1053 as described in Example 2. By PI11, elevated liver enzymes were observed in all three tamarins. Tamarin T-1055 was killed on day 12 of PI. Tamarin T-1038 and Tamarin T-1049 were killed on day 14 of PI. These tamarin sera were pooled, clarified and filtered. 10 of this filtered one^-60.25 ml of the dilution (prepared in healthy tamarin serum) was inoculated into tamarin T-1034.
At 10 weeks after inoculation, T-1034 showed an increase in hepatic enzyme ALT level initially, maintained the elevated level for the next 7 weeks, and finally normalized by 10 weeks after inoculation. As shown in FIG. 30, a specific antibody response to the 1.4 (SEQ ID NO: 22) recombinant protein was first detected on PI49 and continued to be detected between PI56-118. The antibody response to the 4.1 (SEQ ID NO: 52) recombinant protein was first detected on PI49 and continued to be detected between PI56-77. However, it was not detected between PI84 and 118 days. The antibody response to the 1.7 (SEQ ID NO: 610) recombinant protein was first detected on PI56 and continued to be detected between PI63-118. Tamarin killed on day 118 of PI.
As described in Example 2, tamarin T-1044 was inoculated with serum from T-1057 7 days after inoculation with H205. This inoculum was only positive for the sequence detected with the clone 4 primer. RT-PCR using the clone 16 primer showed a gradual increase in the ALT value exceeding the truncated value between PI14 and PI63. As described above, a specific antibody response to the 1.7 (SEQ ID NO: 610) recombinant protein was detected between days 63-84 of the PI. No antibody response to the 4.1 (SEQ ID NO: 612) recombinant protein and no antibody response to the 1.4 (SEQ ID NO: 611) recombinant protein were detected. Tamarin killed on day 161 PI.
4. PCR results for tamarin (titer test / transmissibility study)
Serum collected from T-1049 and T-1055 in the eighth week prior to inoculation and serum from T-1038 on the day of inoculation were cloned 16 (SEQ ID NO: 26) and clone 4 (SEQ ID NO: 21). On the other hand, RT-PCR was negative. Tamarin T-1049 and tamarin T-1055 were RT-PCR positive one week after inoculation against the sequence of clone 4 (SEQ ID NO: 21) (PCR of clone 16 was not performed). Prior to the day of killing, T-1049 (PI14) and T-1055 (PI11) were RT-PCR positive for both clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 16 (SEQ ID NO: 26). Met. Tamarin T-1038 was positive with both primers on the day of killing (PI14).
As can be seen from FIG. 30, T-1034 was RT-PCR positive for the sequence detected with the clone 4 primer in the first serum sample taken after inoculation (PI 7 days) and remained positive until PI 70 days. The sample taken on PI112 was negative. All of these samples were negative by RT-PCR with clone 16 primer. Samples taken on days 70 and 101 before inoculation were negative for both primers.
As can be seen from FIG. 29 for Tamarin T-1051, HGBV-RNA was detected by both primers (from clones 4 and 16 above) in serum samples collected 8 weeks prior to inoculation. Did not. HGBV-RNA was detected by RT-PCR using primers from clone 4 in 6 sera collected between PI7 and PI69, but was collected on PI77, 84, 91 or 105. It was not detected in serum. In nine samples collected after the inoculation, HGBV-RNA was detected by RT-PCR using primers from clone 16.
As shown in FIG. 7, in the first serum sample collected after inoculation (day PI7), T-1044 was positive for RT-PCR against the sequence detected with the clone 4 primer, and was positive until day 63 for PI. It continued. Samples taken between PI 77 and 119 days were negative. All these samples were RT-PCR negative for clone 16 primer. Samples taken 42 days prior to inoculation were negative for both primers.
Tamarin T-1047 and T-1056 were inoculated with T-1044 serum collected on PI14. Nine samples from both of these animals, taken between PI7 and PI64, were positive for RT-PCR with clone 4 primers (SEQ ID NOs: 8 and 9) but negative for clone 16 primers. .
Tamarin T-1058 was inoculated with neat T-1057 serum collected 22 days after induction with T-1053 serum. This inoculum was positive for the sequence detected with the clone 16 primer but negative for the clone 4 primer. Serum samples taken from this animal were tested using primers from the GBV-sequence [clone 16, clone 2, clone 10, clone 18] and the GB-B sequence [clone 4 and clone 50]. Samples taken 9 days before inoculation were all negative with all primers. The sample taken on day 14 of PI was positive only with the primers of clones 10 and 18. Samples taken on PI21 were positive with only clones 16, 10, and 18 primers. The sample taken on PI28 was positive with only the clone 18 primer. Samples taken on PI 35 were positive with only clone 2, 16, and 18 primers. Samples taken on PI41 were positive with only clone 16 and 18 primers. With the primers from clone 4 and clone 50, all samples tested were negative.
5. Summary of serological studies with tamarins
When five tamarins were inoculated with various preparations of HGBV, liver enzymes began to rise by two weeks after inoculation. This increase persisted for the next 6-8 weeks. Responses of specific antibodies to one or more HGBV recombinant antigens, 1.7, 1.4, and 4.1 were observed in all five tamarins. In each case, the antibodies were first detected at 10 weeks from PI6 and persisted for another 2 to 7 weeks. In general, antibody levels peaked and then fell rapidly over the next few weeks. It can be seen that the antibody becomes detectable some time after the liver enzyme levels return to normal values. This suggests that antibody production has some effect in resolving viral infection.
6. Summary of PCR research at Tamarin
The results of the genomic walking experiments suggest that clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 16 (SEQ ID NO: 26) are on separate RNA molecules. We previously had two different types of viral genome, one containing clone 4 (SEQ ID NO: 21) in part and another containing clone 16 (SEQ ID NO: 26) in part, The hypothesis was raised. The observation that one animal was positive with primers from clone 4 and negative with primers from clone 16 supports the presence of two distinct variants in the viral genome. However, the fact that the sequence of clone 16 (SEQ ID NO: 26) could not be detected in the infected tamarins reflected the difference in the lower sensitivity limit between the primer set of clone 16 and the primer set of clone 4. It may be possible to argue. If this latter possibility is correct, a tamarin that is positive for both primers should show a difference in sensitivity for these two primer sets. To reinforce the position that the above results are explained by the presence of the two virus species and not by the difference in sensitivity between the two primer sets, a series of tamarin T-1057 and T-1053 cDNAs was PCR was performed using the dilution series. T-1057 serum had a serum equivalent of clone 4 primer of 5 × 10 5^-3μl positive, 5 × 10^-Fourμl was negative. RT-PCR was performed with the clone 16 primer using a large amount of T-1057 serum as 20 μl, and the result was negative. If this difference is attributable to the relative sensitivity of the two primer sets (clone 4 vs. clone 16), it is expected that other samples will also show a 4000-fold higher endpoint dilution when performing PCR tests. However, the cDNA derived from the T-1053 serum was found to have a serum equivalent of 2.5 x 10^-Fourμl positive, 2.5 × 10^-Fiveμl was found to be negative. Therefore, this result cannot be explained by the difference in sensitivity of the primer sets, and the sequences of contigB-clone 4 (SEQ ID NO: 21) and contigA-clone 16 (SEQ ID NO: 26) are at least 4000-fold different in T-1057. Are consistent on the assumption that they are on separate viral genomes with approximately equal titers in T-1053. That is, this data is consistent with the presence of two distinct viruses with different relative endpoint titers in different samples.
From the observation that HGBV-B alone is sufficient to cause an increase in hepatic enzyme levels by viremia, and that the hepatic enzyme level is not increased in the viremia stage of GBV-A alone, it was confirmed that HGBV-B Was probably the causative agent of hepatitis in these tamarins. An immune response to the HGBV-B antigen appeared for as short as 150 days after inoculation. The explanation for this may be that the epitope selected in these ELISA assays was not from the main epitope that the immune response generated. Another explanation may be that in tamarins, hepatitis induction is not severe requiring a long-term response. This is consistent with histological evidence that liver inflammation remained mild to non-severe in animals that were killed in the acute phase or died shortly after the acute phase (results not shown).
In 5 of the 6 animals described in this study, HGBV-B viremia resolved in day 112 of PI. On the other hand, tamarin T-1048 did not recover from viremia for 136 days, and viremia was observed at the time of death (PI137 day). Of the four animals that were positive for the GBV-A sequence, three had resolved viremia by 77 days after the first appearance of the GBV-A sequence. In contrast, tamarin T-1061 had viremia for 245 days before being sacrificed. In addition, tamarin T-1051 was viremia until sacrificed (PI113 day), but this persistent viremia was due to the initial inoculation with T-1053 plasma, or It is unclear whether this was due to a booster inoculation with T-1053 plasma 69 days later.
The mean peak ALT of the six animals positive for both HGBV-A and HGBV-B was higher than the mean of the four animals positive for HGBV-B only. In addition, peak values were reached on average earlier in animals positive for both GBV-A and GBV-B than animals positive for GBV-B alone. These results suggest that hepatitis intensity may be related to the presence of both agents in significant amounts. It was observed that in the additional passage of GBV-B to tamarin T-1047 and T-1056, there was almost no increase in hepatic enzyme levels in GBV-B viremia. Support the hypothesis that is essential to produce a major rise in ALT levels. In addition to passaging with HGBV-B alone, the initial results when T-1058 was inoculated with the inoculum HGBV-A were due to the absence of the GB-B sequence detectable with the primers of clone 4 and clone 50. As shown, HGBV-A suggests that it can be transmitted independently without detectable HGBV-B.
F. Experimental procedure to demonstrate exposure to HGBV in human populations
Specimens were obtained from various human populations and tested for the presence of antibodies to HGBV by three separate ELISAs using recombinant proteins derived from HGBV-B. As in Example 15B, the solid phase was coated with the CKS-1.7 recombinant protein (SEQ ID NO: 610) in the 1.7 ELISA, and the solid phase was coated with the CKS-1.4 recombinant protein (SEQ ID NO: 611) in the 1.4 ELISA. In the 4.1 ELISA, the solid phase was coated with a 4.1 recombinant protein (SEQ ID NO: 612) before use. As also noted in Example 15E, tamarins inoculated with HGBV showed specific but short antibody responses to these proteins. Given the short-term nature of this detectable immune response, it is not unlikely that there was a prior exposure to HGBV in a negative human population.
Serological studies performed on human specimens had a dual purpose. The primary objective was to determine the serological presence of antibodies against the HGBV recombinant antigen of the invention in various human populations. These studies include the following tests (1)-(3): (1) Populations considered "low risk" for exposure to HGBV (e.g., healthy volunteer blood donor people in the United States); (2) ) Populations considered "at risk" for exposure to HGBV (e.g., samples from intravenous drug users and hemophilia patients often have a serum response to parenterally transmitted hepatitis viruses (HBV and HCV). Positive; specimens from individuals residing in developing countries often have a positive serum response to enterally transmitted viruses (HAV and HEV); (3) known hepatitis viruses (HAV, HBV) , HCV, HDV, or HEV) or other non-AE-related viruses such as cytomegalovirus (CMV) and Epstein-Barr virus (EBV). Individuals with "hepatitis" The group of specimens obtained from the group, some members of the group belonging to the general designation non-AE-hepatitis, may not have been tested for antibodies to HEV, and are therefore reactive in the 1.7, 1.4, or 4.1 ELISA. The HEV-ELISA assay (available from the applicant) was performed on all specimens of the non-AE group with the following: Anti-HEV was determined in samples from three regions (Pakistan, United States, and New Zealand) as follows: The results were positive as described in.
Higher seroprevalence may be seen in populations at risk for exposure to HGBV and in individuals with non-AE hepatitis than in populations considered "low risk" for exposure to HGBV is expected.
The secondary objective of this serologic study was to determine whether the virus was present in the serum by examining samples that were found to be positive for antibodies to one or more HGBV epitopes by RT-PCR. . It is well known that HBV and HCV cause viremia disease states that last for months or years, and that HAV and HEV generally cause short-term viremia, which generally lasts for several weeks. In the case of HBV and HCV infection, acute healing hepatitis, the viremia stage may last as short as a few weeks. Thus, RT-PCR can be used to obtain evidence that the virus is present in infected individuals. However, the viremia condition can be short-lived, so that individuals infected with an agent may be negative for RT-PCR for that agent.
G. Determination of truncation value
Previous experience with other ELISA assays that utilize the indirect format suggests that preliminary truncation values should be calculated based on absorption from a population that is likely to be negative for antibodies to the protein under study. It is known. The preliminary truncation value was calculated as the sum of the population mean absorption value and 10 standard deviations from the population mean value. Since the truncation value is used each time a test group is tested, a simpler way to represent truncation is to run a negative control (normal human plasma pool-NFP) with 5 replicates for each assay. Was the way to decide. For 1.7, 1.4, and 4.1 ELISAs, the negative controls typically had an absorbance between 0.030 and 0.060. As described below, the truncation value was calculated to be an absorbance between about 0.300 and 0.600, which was comparable to an absorbance signal ten times that of the negative control. Therefore, in order for the specimen to be considered reactive, the absorption value (= S / N ratio) of the sample (S) relative to the absorption value of the negative control (N) needs to be 10.0 or more.
H. Supplementary testing
Specimens that were found to be reactive in the first test were retested in duplicate in principle. If one or both of the retest absorptions were higher than the truncated value, the specimen was considered to be repeatedly reactive. Supplemental assays were performed on samples deemed to be repeatedly reactive to supplement further ELISA data. If sufficient, the repeatedly reactive specimens were those by Western blot where the antibody response was directed against the CKS1.7 (SEQ ID NO: 610), CKS1.4 (SEQ ID NO: 611) or CKS4.1 (SEQ ID NO: 612) antigen. Thus, it was confirmed that it was not directed to Escherichia coli protein which might have been coated on the solid phase together with the main protein in question. For a western blot to be considered positive, the visible band was 80 kD for the 1.7 protein (SEQ ID NO: 610), 60-70 kD for the 1.4 protein (SEQ ID NO: 611), or 4.1 protein (SEQ ID NO: 612). Needs to be detected at 42 kD. Since the Western blot was not optimized to match or exceed the sensitivity of the ELISA, we did not immediately discard the ELISA data for a negative result. However, a positive result reinforces the reactivity detected by ELISA.
For a sufficient amount of the repeatedly reactive sample, RT-PCR using the clone 4 primer (performed as described in Example 15D) was performed to identify the HGBV-specific nucleotide sequence in the serum. Good. A positive result indicates that the specimen is viremia and will ultimately help establish the role of HGBV in human hepatitis. However, a negative result should not be interpreted as a false ELISA result. As described in Example 15E in the Tamarin study, the RT-PCR results were positive during the first few weeks after infection and then negative by the time the antibodies were just starting to be detected in the ELISA of the present invention. Was. Samples at this later stage may be negative in the RT-PCR reaction but positive in one or both ELISAs.
I. Serum response data in low-risk samples
A population of 100 sera and 100 plasma was obtained from healthy volunteer blood donors in southeastern Wisconsin, and each of the 1.7 (SEQ ID NO: 610), 1.4 (SEQ ID NO: 611), 4.1 (SEQ ID NO: 612) Antibodies to the recombinant protein were tested. For serum and plasma, the absorbance values obtained with the 1.7, 1.4, and 4.1 ELISAs were plotted separately (FIGS. 9-14).
In the 1.7 ELISA, the mean absorption values for serum and plasma samples were 0.072 [standard deviation (SD) 0.061] and 0.083 (SD = 0.055), respectively. Thus, in the 1.7 ELISA, the tentative truncation values for serum and plasma were 0.499 and 0.468, respectively. As described above, the truncated value can be represented based on the absorption value of the negative control. Specimens with an S / N ratio exceeding 10.0 were considered reactive. Using this truncated value, 0 out of 200 tested against the antibody to 1.7 (SEQ ID NO: 610) were reactive.
In the 1.4 ELISA several samples (3 from the serum population and 6 from the plasma population) showed absorption values above 0.300 (S / N ratios between 6 and 12, close to or higher than the expected truncation values) . When retested, all nine of these specimens showed S / N ratios lower than 10.0. The average absorption values for serum and plasma samples were 0.072 (SD = 0.052) and 0.108 (SD = 0.062), respectively. The truncated value in the 1.4 ELISA was calculated by the above formula. That is, the truncated values for the respective serum and plasma populations were 0.436 and 0.542, respectively. One specimen in the serum population was reactive in the first test, but was negative when retested in duplicate. Two specimens in the plasma population were also initially reactive in the test, but were negative in the retest. A second population of 200 normal samples consisting of 100 plasma and 100 serum was tested. When tested based on the previously proposed truncation, two samples of plasma and two samples of serum were repeatedly reactive.
In the 4.1 ELISA, the mean absorption values for serum and plasma samples were 0.070 [standard deviation (SD) 0.037] and 0.063 (SD = 0.040), respectively. Thus, in the 4.1 ELISA, the tentative truncation values for serum and plasma were 0.329 and 0.511, respectively. The truncation value can also be determined based on the absorption value of the negative control as described above: samples with an S / N ratio exceeding 10.0 were considered reactive. Using this truncated value, 0 of 100 plasma samples tested for antibody to 4.1 (SEQ ID NO: 612) and 0 of 100 serum samples were considered reactive in the first test. Was.
An additional 760 plasma donors were provided by the Interstate Blood Bank (Ohio) to test the 1.7 and 1.4 ELISAs. A total of 9 samples were repeatedly reactive. No samples were reactive at the same time in both ELISAs, and all 9 samples were repeatedly reactive in the 1.4 ELISA.
A total of 960 samples from plasma or blood donors residing in the United States were examined for the presence of antibodies to 1.7 and 1.4 proteins. A total of 13 samples were repeatedly reactive in the 1.4 ELISA. There were no samples with repeated reactivity in the 1.7 ELISA.
In summary, these data indicate the following. That is, in one or more ELISA assays using recombinant antigens from HGBV-B, according to the results of the ELISA thus far, 13 out of 960 samples collected from blood donors in the United States were antibody-reactive. These results suggest that HGBV may be a so-called endemic endemic to the United States.
Table 16 shows these data.
J. Samples considered "at risk" for hepatitis
The data from this study is shown in Table 16.
(I) Sample from West Africa
Of the 1,300 samples obtained from West Africa, a total of 181 were repeatedly reactive in one or more ELISAs. In all three ELISAs, one sample was repeatedly reactive. A total of 43 samples had repetitive reactivity with 1.7 ELISA, 91 samples had repetitive reactivity with 1.4 ELISA, and 51 samples had repetitive reactivity with 4.1 ELISA.
One of the six samples that was repeatedly reactive in the 1.7 ELISA was reactive on a Western blot for the 1.7 protein (SEQ ID NO: 610). Nine (100%) of the nine repeatedly reactive in the 1.4 ELISA were positive on a Western blot for an antibody to the 1.4 protein (SEQ ID NO: 611). One specimen was positive on Western blots for both proteins. Twelve (100%) of the 12 samples that were repeatedly reactive in the 4.1 ELISA were positive on the Western blot for the 4.1 protein (SEQ ID NO: 612).
Three samples that were repeatedly reactive (including one that was positive in the 1.4 ELISA and one that was positive in both ELISAs and Western blots) were described above by RT-PCR using primers from clone 4. The presence or absence of HGBV-RNA was examined as described above.
The data obtained suggested that HGBV may be endemic in West Africa.
(Ii) Specimens from intravenous drug users (IVDU)
Set 1: Three of the 112 samples were positive in the 1.4 ELISA. Five samples were reactive with 4.1 ELISA and three samples were reactive with 1.7 ELISA. Two samples were positive in more than one ELISA.
Set 2: A total of 99 samples were collected from the group of intravenous drug users. The trial was part of a study conducted at Hines Veteran's Administration Hospital in Chicago, Illinois. None of the samples had reactivity in the 1.7 or 4.1 ELISA. One sample was repeatedly reactive by 1.4 ELISA. The presence or absence of HGBV-RNA was examined for the repeatedly reactive specimen by RT-PCR using the primers from clone 4 as described above. This sample was negative for RT-PCR.
K. Specimens collected from individuals with non-AE hepatitis
The data obtained are summarized in Table 16.
Various sample populations were obtained from the population diagnosed with non-AE hepatitis and subjected to 1.7, 1.4 and 4.1 ELISA according to Example 15C. Samples used included: 180 from a clinic in Japan; 56 from a clinic in New Zealand; 73 from a clinic in Greece; 132 from a clinic in Egypt; 64 from a clinic in Texas, USA Specimens (Set T); 72 specimens from the Minnesota Research Center (Set M); 62 specimens from the United States (Set # 1); 82 specimens from the Pakistani clinic; 10 specimens from the Italy clinic (some specimens) Did not perform all possible ELISA assays due to lack of serum).
(I) Japanese specimen
These 180 samples were from 85 different patients. Two out of a total of 180 samples were repeatedly reactive in the 1.7 ELISA. The two reactive specimens were from two different patients. The two samples were tested as described above by RT-PCR using primers from clone 4. There were no positive samples.
No samples were positive in the 1.4 ELISA.
For the 4.1 ELISA, 7 out of 89 samples showed repeated reactivity in the 4.1 assay (note: these 89 samples were obtained from 29 different patients). Five of the reactive samples were from one patient. The remaining two samples were from another patient.
(Ii) New Zealand specimens
A total of 4 out of 56 samples were repeatedly reactive in one or more of the 1.7, 1.4, and 4.1 ELISAs. None of these showed reactivity in more than one ELISA. One sample was repeatedly reactive with the 1.7 ELISA and two samples were repeatedly reactive with the 1.4 ELISA. One sample was repeatedly reactive in the 4.1 ELISA. PCR was performed on two repeatedly reactive samples. As a result, both samples were negative. One specimen that repeatedly showed reactivity in the ELISA was also reactive with the antibody against HEV.
(Iii) Greek specimen
A total of 5 samples out of 73 samples were antibody-reactive by 1.7 and / or 1.4 ELISA. These 73 samples were obtained from a total of 11 patients. Two of the five repeatedly reactive samples showed repetitive reactivity in both ELISAs, but were obtained from the same patient on separate days. A sample showing two repetitive reactivities was negative when examined by RT-PCR. None of these samples had antibody reactivity in the 4.1 ELISA.
(Iv) Egyptian specimen
A total of 11 samples out of 132 samples showed reactivity by 1.7, 1.4, or 4.1 ELISA. Eight specimens were positive in both 1.7 and 1.4 ELISAs. Nine samples were antibody reactive in the 1.7 ELISA and nine were reactive in the 1.4 ELISA. One sample repeatedly showed reactivity in the 4.1 ELISA, but was negative in the 1.7 and 1.4 ELISAs. One specimen that repeatedly showed reactivity in the 1.7 ELISA was negative for an antibody against the 1.7 recombinant protein (SEQ ID NO: 610) by Western blot analysis. Six out of nine specimens that repeatedly showed reactivity in the 1.4 ELISA were positive for the antibody against the 1.4 recombinant protein (SEQ ID NO: 611) in the Western blot. Seven samples among those that were repeatedly reactive were tested by RT-PCR. None of the samples showed reactivity. All 132 of these samples were taken on different days from 25 different individuals. Eleven samples that showed repeated reactivity were from five different individuals. In one of these individuals (patient # 101), the immune response was clearly similar to that observed with tamarin (FIG. 31). Note in FIG. 31 that ALT levels were elevated when the physician noted the symptoms. Subsequent samples had reduced ALT levels and antibodies were detected by 1.4 and 1.7 ELISA. The antibody response declined over the following weeks, similar to the serum response observed with tamarin. An additional three patients (257, 260, and 340) showed a similar serum pattern as patient # 101 (see FIGS. 32-34). These data support the hypothesis that HGBV may be the causative agent in these cases of hepatitis.
Of the seven samples from the above four patients, none of the samples were HGBV-RNA positive by RT-PCR. There are several possible reasons for this result. First, the viremia stage may be very brief, in which case the virus may have been removed from the serum by the date of the first blood draw. Second, since these samples were transported by ship from Egypt, it is likely that they were frozen, thawed, or otherwise altered during storage and transport, resulting in the ability to detect HGBV-RNA. May have decreased.
(V) US sample (Set T)
None of the 64 samples (set T) in the United States had repetitive reactivity in the 1.7, 1.4, and 4.1 ELISAs.
(Vi) United States specimen (Set M)
Of the 72 samples (Set M) in the United States, a total of 4 samples showed repeated reactivity in one or more ELISAs. Two samples showed reactivity in the 1.7 and 4.1 ELISAs. One sample was reactive only with 1.7 ELISA, and one sample was reactive only with 4.1 ELISA.
(Vii) United States specimen (set 1)
Of the 51 non-AE hepatitis U.S.A. specimens (set 1), 3 specimens repeatedly showed reactivity in one or both ELISAs. One sample repeatedly showed reactivity in both ELISAs. One sample showed reactivity in 1.7 ELISA and three samples showed reactivity repeatedly in 1.4 ELISA. Specimens that were positive in both ELISAs were positive in the Western blot against the 1.4 recombinant protein (SEQ ID NO: 22), but negative in the 1.7 recombinant protein (SEQ ID NO: 23). One additional sample was positive in the 1.4 ELISA and western blot positive for the 1.4 recombinant protein (SEQ ID NO: 611). One specimen that repeatedly showed reactivity in the ELISA was reactive with the antibody against HEV.
(Viii) Pakistani specimen
A total of 4 out of 82 samples were repeatedly antibody reactive in the 1.4 and / or 1.7 ELISA. No sample showed reactivity in both ELISAs. Two samples showed repetitive reactivity with 1.7 ELISA and two samples showed repetitive reactivity with 1.4 ELISA. Two samples that were repeatedly reactive in the 1.4 ELISA were also reactive with antibodies to HEV. None of the 82 samples were positive in the 4.1 ELISA.
(Ix) Italy samples
None of the 10 samples showed repeated reactivity in the 1.7, 1.4, and 4.1 ELISAs.
L. Statistical significance of serum reaction results
These data indicate that specific antibodies to the HGBV protein (ie, specimens that repeatedly show antibody reactivity in the 1.7, 1.4, or 4.1 ELISA) can be detected in all three categories of the population studied. Serological results from different sample categories ("low risk", "at risk", and non-AE hepatitis patients) were combined and analyzed for statistical significance by chi-square test. The data show a significant comparison of the serologic prevalence of anti-HGBV in volunteer blood donors, including individuals who are considered `` at risk '' for exposure to HGBV or who have been diagnosed with hepatitis of unknown classification. It indicated that there was a difference.
For West African specimens, the serologic prevalence was 13.9%, which was significantly higher at p-value 0.000 compared to the baseline group (Table 17). Similarly, there was a statistically significant difference in IVDU when the results were compared to volunteer donor data (p-value = 0.000). For countries including Japan, New Zealand, the United States, Egypt, and Pakistan, there were significant differences in the presence of antibodies in non-AE hepatitis patients compared to United States volunteer blood donors.
H. Summary
These data suggest that the various ELISAs described herein may be useful in diagnosing hepatitis in humans in various regions, including Japan, New Zealand, the United States, Egypt, and Pakistan. These data appear to underestimate the serological presence of antibodies to HGBV in all categories of specimens tested. As additional HGBV epitopes are discovered and evaluated, the usefulness of HGBV genome (s) -based tests is expected to become more important in diagnosing hepatitis in patients who cannot currently be diagnosed. You. Note: In these first studies, RT-PCR results were negative, but subsequent data found flavi-like virus sequences in the sera of seropositive individuals.
As described above, there are more than one HGBV strain. These are considered within the scope of the present invention and are referred to as "hepatitis GB virus (HGBV)".
Example 16. Serological study of HGBV-A
A. Recombinant protein purification procedure
Bacterial cells expressing the CKS fusion protein were frozen and stored at -70 ° C. Bacterial cells from each GBV-A construct were thawed and milled as described in Example 15 for the GBV-B construct. In addition, the recombinant protein was purified as described for GBV-B recombinant protein in Example 15.
The fractions collected in this purification procedure were separated by electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue R250 to give a molecular weight of approximately 60 kD (CKS-1.5 / SEQ ID NO: 614), 65 kD (CKS-2.17 / SEQ ID NO: 613). , 55 kD (CKS-1.18 / SEQ ID NO: 390), and 66 kD (CKS-1.22 / SEQ ID NO: 390). Fractions containing the relevant protein were pooled and re-examined by SDS-PAGE.
The immunogenicity and structural integrity of the pooled fractions containing the purified antigen were determined by electron transfer to nitrocellulose and immunoblotting according to the method described in Example 13. In the absence of a suitable positive control, recombinant proteins were identified by reactivity with monoclonal antibodies to the CKS portion of each fusion protein. When the CKS-1.5 protein (SEQ ID NO: 614) was examined by Western blotting using an anti-CKS monoclonal antibody to detect the recombinant antigen, a single band was observed at about 60 kD. This result corresponds to the expected size of the CKS-1.5 protein (SEQ ID NO: 614). Similarly, the CKS-2.17 protein (SEQ ID NO: 613), the CKS-1.18 protein (SEQ ID NO: 390) and the CKS-1.22 protein (SEQ ID NO: 390) also had the expected sizes as determined by immunoblotting.
B. Procedure for coating polystyrene beads
The proteins were dialyzed and the antigenicity of these proteins on polystyrene beads was evaluated as described in Example 15.
C. ELISA procedure for detecting antibodies to HGBV
Various ELISAs were performed as described in Example 15.
D. Detection of HGBV-RNA in sera of infected individuals
The presence or absence of HGBV-RNA was examined in accordance with the description in section D of Example 15 for the sample that showed repeated reactivity in each ELISA.
Serum image of E. tamarin
In ELISA assays using CKS1.5 protein, CKS2.17 protein, CKS1.18 protein, or CKS1.22 protein, all derived from the HGBV-A genome, none of the sera from tamarin showed a specific immune response. However, as described in the previous example, RNA of HGBV-A was detected in some of the infected tamarins (see the summary of serum image of tamarin in Example 15).
F. Experimental procedures for serological studies on human populations
Example 15 evaluated the presence of antibodies to HGBV-B in various human populations by ELISA using recombinant antigens derived from HGBV-B. Thereafter, for many of the same samples, 1.5 ELISA using the CKS1.5 recombinant protein (SEQ ID NO: 614), 2.17 ELISA using the CKS2.17 recombinant protein (SEQ ID NO: 613), and CKS1.18 recombinant protein (SEQ ID NO: 613) No. 390) and ELISA using a CKS1.22 recombinant protein (SEQ ID NO: 390) were used to examine the presence or absence of antibodies against HGBV-A. Each protein was used by coating on a solid phase as in Example 15. As described in Example 15, all five HGBV-inoculated convalescent tamarins showed specific antibody responses to HGBV-B recombinant protein, but only for a short period (1.7 , 1.4, and 4.1 ELISA). None of the tamarins showed a detectable antibody response in the 1.5, 2.17, 1.18, or 1.22 ELISAs, but some human samples from West Africa were tested on Western blots for one or more of these recombinant proteins. One of the specimens that showed a specific antibody response and was provided by a surgeon (supplier of GB agent) on day 22 of hepatitis onset showed a specific antibody response to the 2.17 recombinant protein when tested by Western blot. (See Example 3). In this example, the utility of the 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISAs in detecting antibodies in various human populations was evaluated.
G. Determination of truncation value
The truncation values in the 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISA were determined as described in Example 15.
H. Supplementary testing
As described in Example 15, the specimens that initially showed reactivity were retested in principle. If a sample showed reactivity a second time, additional tests (eg, Western blot) were performed to further supplement the ELISA data. In order for the Western blot result to be considered positive, the observable bands were 60 kD for the 1.5 protein (SEQ ID NO: 614), 65 kD for the 2.17 protein (SEQ ID NO: 613), and 1.18 protein (SEQ ID NO: 390) It must be detected at 55 kD, and 66 kD for the 1.22 protein (SEQ ID NO: 390). Western blots were not optimized to match or exceed the sensitivity of the ELISA, so we did not immediately discard the ELISA data for negative results. However, a positive result reinforces the reactivity detected by ELISA.
As described in Example 15, for a sufficient amount of a repeatedly reactive sample, RT-PCR using a primer (performed as described in Example 15) was performed to determine the HGBV specificity in serum. The nucleotide sequence may be identified.
I. Serological data in low-risk samples
A total of 252 plasma samples were obtained from Interstate Blood Bank, Ohio and tested for antibody by 1.5 ELISA using 1.5 recombinant protein (SEQ ID NO: 614). The mean absorption value in this population was 0.036 (SD = 0.022). The truncated value was calculated to be 0.168. This corresponds to an S / N ratio of 10.0. 760 plasma samples (including 252 samples used to determine the truncation value) were tested for the presence of antibodies by 1.5 ELISA. There were no samples showing repetitive reactivity. In addition, 100 plasma samples were obtained from southeastern Wisconsin and tested for antibody by 1.5 ELISA. There were no samples showing repetitive reactivity.
Thus, no evidence for the presence of antibodies to the 1.5 protein was found in blood donors in the United States.
200 samples were obtained from a Wisconsin blood donor and tested for antibody by 2.17 ELISA using the 2.17 recombinant protein (SEQ ID NO: 60). The mean absorption value in this population was 0.058 (SD = 0.025). The truncation value was calculated to be 0.208. This approximately corresponds to an S / N ratio of 10.0. One of the samples showed repeated reactivity. Thus, seroprevalence in blood donors in the United States (N = 200) was relatively low.
The same 200 specimens as described in the above paragraph were tested for the presence of antibodies by 1.18 and 1.22 ELISA. None of the samples showed repeated reactivity. Thus, there was no evidence that samples from volunteer blood donors were antibody positive for the HGBV-A protein as judged by the 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISAs.
J. Samples considered "at risk" for hepatitis
The data from this study are summarized in Table 18.
(I) Sample from West Africa
Of 1300 samples, 58 showed reactivity by 1.5 ELISA. Twelve of the eighteen replicates were positive on a Western blot for an antibody to the 1.5 protein (SEQ ID NO: 614). 43 out of 817 samples were reactive in the 2.17 ELISA. Western blots for antibodies against the 2.17 protein (SEQ ID NO: 613) were not performed on these repeatedly reactive specimens.
Six out of 817 samples were reactive in the 1.22 ELISA. Nine of the 353 samples were reactive in the 1.18 ELISA. When 2.21 ELISA-reactive samples were tested by western blot, 13 were reactive. Eight specimens that were repeatedly reactive by 1.18 ELISA were positive by Western blot.
These data suggest that HGBV may be endemic in West Africa.
(Ii) Samples from intravenous drug users
A total of 112 samples were collected from a group of intravenous drug users. The trial was part of a study conducted at the Hynes Veterans Administration Hospital in Chicago, Illinois. One sample was repeatedly reactive by 2.17 ELISA. One additional sample showed reactivity in the 1.18 ELISA. None of these samples were positive in the 1.5 or 1.22 ELISA.
K. Specimens collected from individuals with non-AE hepatitis
The data obtained is summarized in Table 18.
Various sample populations (described in Example 15K) were obtained from non-AE hepatitis populations and 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISAs (described in Example 15C) were performed. Some of the samples were not subjected to all ELISA assays due to lack of serum.
(I) Japanese specimen
A total of 4 samples out of 89 samples showed repeated reactivity by 1.5 ELISA. Three of these were from one individual and one from another. One specimen that was negative in the 1.5, 1.18, and 1.22 ELISAs showed reactivity in the 2.17 ELISA. No sample showed reactivity in the 1.18 ELISA. These samples were not tested by the 1.22 ELISA.
(Ii) New Zealand specimens
None of the 56 samples showed reactivity in the 1.5 ELISA. These samples were not tested with the 2.17, 1.18, or 1.22 ELISA.
(Iii) Greek specimen
None of the 67 samples (from 10 patients) showed reactivity with the 1.5, 2.17, or 1.22 ELISA.
(Iv) Egyptian specimen
None of the 132 samples were reactive with the 1.5 ELISA. Of the 132 samples that could be tested, a total of 7 had reactivity with the 2.17 ELISA. These samples were from 25 patients with acute non-AE hepatitis. Three of the 25 patients were seropositive in the 2.17 ELISA one day or more after the onset of hepatitis. No reactive samples were present in the 1.18 or 1.22 ELISA.
(V) United States specimen (Set M)
None of the 72 samples showed reactivity in the 1.5 ELISA. Three out of 72 samples showed reactivity by 1.18 ELISA. Two samples showed reactivity with 2.17 ELISA and four samples showed reactivity with 1.22 ELISA. Two samples showed reactivity in one or more ELISAs.
(Vi) United States specimen (Set T)
None of the 64 samples showed reactivity in the 1.5, 1.22, or 2.17 ELISA. One specimen had reactivity at 1.18.
(Vii) United States specimen (set 1)
A total of 3 out of 62 samples showed reactivity in one or more GBV-A ELISAs. There was one specimen that repeatedly showed reactivity in both the 2.17 and 1.22 ELISAs. One sample was reactive only to the 2.17 ELISA, and another sample was reactive only to the 1.22 ELISA. There were no samples reactive to the 1.5 or 1.18 ELISA.
As mentioned above, there are two or more HGBV strains, or two or more different viruses can be represented by the sequences described herein. They are considered within the scope of the present invention and are referred to as "hepatitis GB virus (HGBV)".
L. Statistical significance of serum reaction results
These data indicate that specific antibodies to the HGBV-A protein (i.e., specimens that repeatedly react with the antibodies in the 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISAs) are identified as "at risk" for individuals exposed to HGBV and non-A -Detected in individuals diagnosed with hepatitis E, but not so frequently detected from volunteers in the United States or from blood sellers. In Table 19, the results of the serum responses from the various categories of samples ("Low Risk", "At Risk", and Non-AE Hepatitis Patients in Table 18) were combined and analyzed for statistical significance by Chi-square test. . Table 18 summarizes the serological presence of antibodies to the HGBV protein in the total number of specimens tested, but unlike this, the data in Table 19 shows results from different individuals (humans). For the GBV-A ELISA, comparing the serological presence of anti-HGBV between volunteer blood donors and individuals considered "at risk" for exposure to HGBV (West Africa, but not the IVDU) , Indicates that there is a significant difference (p-value = 0.000). In addition, there was a statistically significant difference in the serological presence of antibodies to HGBV-A in non-AE hepatitis patients in Egypt and the United States when compared to volunteer blood donors. This data suggests that exposure to HGBV-A is associated with non-AE hepatitis. Note: In these first studies, RT-PCR results were negative, but subsequent data found flavi-like virus sequences in the sera of seropositive individuals (see Example 19).
M. Summary
These data suggest that the ELISA described in the present invention is useful for detecting antibodies in individuals living in West Africa and non-AE hepatitis individuals. The risk of developing hepatitis is relatively high in West African populations. Nearly 85% of people are seropositive for antibodies to hepatitis B virus, and about 5% are positive for antibodies to hepatitis C virus. These data appear to underestimate the serological presence of antibodies to HGBV in all categories of specimens tested. As additional HGBV epitopes are discovered and evaluated, it is expected that the usefulness of HGBV genome (s) -based tests will be more important in diagnosing hepatitis in patients who cannot currently make a diagnosis You.
Example 18. Identification of GB-related virus in humans
A. Theory
Both HGBV-A and HGBV-B epitopes were identified (Example 3). These were used as serological markers to screen human serum and plasma samples (Examples 5 and 6). There was a significant correlation between serologic activity for some of these markers and the frequency of non-AE hepatitis, which indicates that HGBV-B is the etiology of non-AE hepatitis in humans. It is a substance (Example 5G). However, analysis of GB human serum by Western blot showed no reactivity to the HGBV-B epitope (Example 3). Instead, at least one HGBV-A epitope was identified in GB human serum. This suggests that HGBV-A was a causative agent of hepatitis in GB. Neither HGBV-A nor HGBV-B sequences were identified in non-AE hepatitis patients by RT-PCR (Example 5E). Thus, there remains a need to provide evidence of HGBV-A and / or HGBV-B infection in humans with non-AE hepatitis.
Several factors may be responsible for the failure to identify HGBV-A and / or HGBV-B sequences in human serum or plasma sources. First, we have tested a limited number of HGBV-A and / or HGBV-B seropositive samples by RT-PCR, many of which have an unknown storage history. Thus, the viral RNA present in these samples may have been affected by improper storage. Second, GB infection appears to heal naturally. Thus, the duration of the GB sequence in the serum of infected individuals may be very narrow. That is, the chance of obtaining a serum sample containing the GB sequence will be extremely low. Finally, the search for the HGBV-A and / or HGBV-B sequences involved the use of a limited number of PCR primer sets. Since HGBV-A and / or HGBV-B are RNA viruses, they tend to have a high mutation rate (Holland et al. (1982) Science 215: 1577-1585). That is, the HGBV-A and / or HGBV-B sequence in the tested human serum is different from the sequence of our PCR primer, so that HGBV-A and / or HGBV-B may not be detected.
The highly conserved levels of HGBV-A and / or HGBV-B were shown to indicate that these viruses might have been disturbed in our PCR studies due to genomic variability of HGBV-A and / or HGBV-B. Denatured PCR primers were designed and arranged in accordance with the NS3-like region (see FIG. 17). This is because these highly conserved regions perform necessary functions in the viral replication cycle. Thus, these sequences should be conserved in HGBV-A and / or HGBV-B mutants. PCR primers designed and placed in this region should be able to detect HGBV-A and / or HGBV-B genomic RNA by RT-PCR. In addition, by designing denatured PCR primers capable of specifically amplifying HGBV-A, HGBV-B and HCV sequences, amplify sequences obtained from viruses related to HGBV-A, HGBV-B and HCV. We have determined that it may be possible. Thus, less serum response was detected in human serum and plasma samples (Examples 5 and 6), due to the presence of antibodies that cross-react with antigens of another HGBV-A or HGBV-B related virus. If so, we would be able to obtain sequences from these GB-related viruses. [This is similar to the experimental technique recently used by Nicole and his colleagues to identify a specific hantavirus associated with an acute respiratory disease outbreak in the southwestern United States. Nicol et al., Science 262: 914-917 (1993)]
B. Cloning of NS3-like region of hepatitis GB virus C (HGBV-C)
In models of viral infection, viremia occurs early in the infection and is often correlated with the detection of IgM antibodies to viral proteins. As described in Examples 5 and 6, the samples in which IgG antibodies to recombinant proteins derived from HGBV-A and HGBV-B were detected had immunoreactivity in ELISA. Additional ELISAs were performed to determine if IgM antibodies were detected for these proteins. Certain of the seropositive specimens from West African individuals (Example 5E-i) were reactive for IgM antibodies to the recombinant protein (data not shown). These samples were considered likely to contain the virus. In addition, in HGBV-A-positive and HGBV-B-positive Egyptian individuals suffering from acute hepatitis (Example 5F-vii), samples in which IgM antibodies against HGBV-A or HGBV-B recombinant protein are not detected In addition, tests were performed because acute liver disease may be associated with the presence of the virus. "Hemi-nested" RT-PCR was performed on the nucleic acids of these samples using denatured oligonucleotide primers that amplify the HGBV-A, HGBV-B, and HCV-1 sequences. The instrument used was a GeneAmp® RNA PCR kit (manufactured by PerkinElmer) according to the manufacturer's instructions. Briefly, the first set of amplifications consisted of 2 mM MgCl_TwoAnd cDNA products obtained by random-primed reverse transcription of nucleic acids extracted with 1 μM primers ns3.1-s and ns3.1-a (SEQ ID NOs: 671 and 672, respectively). The reaction was subjected to three cycles of denaturation-annealing-extension [(94 ° C, 30 seconds; 37 ° C, 30 seconds; 72 ° C, 72 ° C, 30 seconds over 2 minutes), followed by (94 ° C, 30 seconds; 37 cycles of 55 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 30 seconds) were performed 40 times, and finally stretched at 72 ° C. for 10 minutes. After the reaction was completed, it was stored at 4 ° C. The second set of amplifications used 4% of the original PCR product as a template, except that ns3.1-s and ns3-a (SEQ ID NOs: 671 and 673, respectively) were used as the "heminested" primer set. Same as above. The products of the first and second sets of PCR were analyzed by gel filtration.
One West African sample had a PCR product from a blurred half-nested reaction at approximately 386 bp (the expected size of the HGBV-A, HGBV-B, or HCV product). This product was cloned into the pT7 blue T-vector plasmid (Novagen) as described in the art. The sequence (GBcontigC [GB-C], SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) obtained from this clone was replaced with GBcontigA (GB-A, SEQ ID NO: 163, residues 4438-4804) and GBcontigB (GB-B, SEQ ID NO: 393, residues 4218-4587) and HCV-1 (SEQ ID NO: 398). FIG. 36 shows the nucleotide sequences of these sequences, while Table 20 shows the% homology between these sequences.

As shown in FIG. 36 and Table 20, a comparison of the nucleotides of GB-A, GB-B, and HCV-1 shows that these sequences are 47.99-61.66% similar to each other. This is not particularly surprising given the conserved amino acid residues present in the NTP-binding helicase of these viruses (Example 2B3, FIG. 17A). Comparison of the nucleotides of the NS3 PCR product obtained from a West African sample (GB-C, SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) with nucleotides of other viruses shows that GB-A (SEQ ID NO: 163, residues 4438-4804), It is related to the NS3 sequence from GB-B (SEQ ID NO: 393, residues 4218-4587), and HCV-1 (SEQ ID NO: 398), but has been suggested to be distinctly different. BLASTIN and BLASTX analysis of the nucleic acid and protein databases in the Wisconsin Sequence Analysis Package (version 8) with GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) indicated that some of the HCV strains had sequence identity. Turns out there are limitations. The highest P values for nucleotides and amino acids (ie, the probability of accidental sequence alignment) are 1.9 × 10^-20And 5.3 × 10^-31(Data omitted). Taken together, these data indicate that GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) is a unique GB associated with HGBV-A, HGBV-B and HCV, which we now refer to as HGBV-C. May be derived from a similar virus.
C. GB-C is exogenous
Using PCR primers for the GB-C sequence, it was determined whether this sequence is detected in the genomes of human, rhesus monkey, S. cerevisiae and E. coli as described above, i.e., by the procedure described in Example 6B. Were determined. PCR was performed using Perkin-Elmer-Cetus GeneAmp® essentially according to the manufacturer's instructions. That is, 300 ng of genomic DNA was used for each 100 μl reaction. PCR primers (SEQ ID NOs: 675 and 676) were used at a final concentration of 1.0 μM. The PCR was performed for 40 cycles (94 ° C., 30 seconds; 55 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 30 seconds), and then extended at 72 ° C. for 10 minutes. The PCR product was separated by agarose gel electrophoresis, the nucleic acid was directly stained with ethidium bromide, visualized by UV irradiation, further transferred to a Hybond-N + nylon filter by Southern transfer, and then hybridized with a radiolabeled probe. FIG. 37 shows PhosphoImage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.) Obtained by hybridizing with a radiolabeled probe prepared from GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640), followed by Southern blotting of the PCR product. ). GB-C (SEQ ID NO: 673) was obtained by detecting 350350 fg (1 genomic copy equivalent, lane 5) and 3535 fg (0.1 genomic copy equivalent, lane 6) of the GB-C plasmid template in 300 ng of human genomic DNA. , Human (FIG. 19, lane 1), rhesus monkey (lane 2), S. cerevisiae (lane 3), and E. coli (lane 4). (Lane 7 contains ~ 3.5 fg [0.01 genomic copy equivalents] of the PCR product from the GB-C plasmid template in 300 ng of human genomic DNA.) Thus, using genomic PCR capable of detecting 0.1 genomic copy equivalents. However, GB-C (SEQ ID NO: 673) is not detectable in the genomes of human, rhesus monkey, S. cerevisiae and E. coli. This result is consistent with the expectation that GB-C (SEQ ID NO: 673) is of exogenous (ie, viral) origin.
D. GB-C can be detected in additional human serum samples
Additional HGBV-A and HGBV-B immunoreactive human serum samples were subjected to RT-PCR to check for the presence of GB-C sequences. As described in Example 7, nucleic acids extracted from serum samples were reverse transcribed with random hexamers and the cDNA was amplified for 35-40 cycles (94 ° C, 30 seconds; 55 ° C, 30 seconds; 72 ° C). , 30-90 seconds) and then stretched at 72 ° C. for 10 minutes. PCR primers specific for GB-C (g131-sl and g131-al, SEQ ID NOs: 675 and 676) were used at a concentration of 1.0 μM. The PCR product was separated by agarose gel electrophoresis, the nucleic acid was directly stained with ethidium bromide, visualized by UV irradiation, transferred to a Hybond-N + nylon filter by Southern blot, and then hybridized with a radiolabeled probe. A total of 48 HGBV-immunopositive samples from West Africa were tested. Eight samples from West Africa, including the first sample in which GB-C was identified, were found to be positive for GB-C sequences by RT-PCR. A total of 10 GB seronegative West African serum samples were tested, none of which had a detectable GB-C sequence. PCR products from four positive samples were cloned and sequenced as described above. When 156 nucleotides were examined, two of the four clones tested were identical to the GB-C sequence (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) and two clones (SEQ ID NOs: 677 and 678) were GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) and contained sequences that were 88.4% and 83.6% homologous (FIG. 38). However, despite the divergence at the nucleotide level, it is expected that each clone is very similar and that only one amino acid difference was found during the predicted translation of SEQ ID NO: 678. Was shown in translation.
Additional serum samples were obtained from non-AE hepatitis individuals in Greece, Egypt and the United States and tested for GB-C sequences as described above. None of these samples contained the GB-C sequence. There are several possible reasons why the GB-C sequence was not detected in the sample (see Theory section above). However, the above sequence changes between GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) and the two GB-C variants (SEQ ID NOs: 678 and 677) are likely to occur from closely related West Africa. Of HGBV-C may differ by 15.1% at the nucleotide level, the PCR primers specific for GB-C (g131-sl, g131-al, SEQ ID NOs: 675 and 676) may be separated by geographically distinct isolates. This suggests that certain GB-C viruses may not hybridize sufficiently to produce a detectable PCR product. In this case, a GB-C sequence might be detectable in a West African serum sample by PCR primers designed in a more highly conserved region of the genome (5'UTR).
E. Extension of HGBV-C array
Additional GB-C sequences were obtained by the PCR walking method described in Example 2A. That is, total nucleic acids were extracted from West African human serum that was initially used to identify GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640). This nucleic acid was reverse transcribed as described above. The resulting cDNA was treated with 2 mM MgCl_TwoWas amplified in a 50 μl PCR reaction (PCR1) according to the method described by Sorensen et al. The reaction was subjected to 35 cycles of denaturation-annealing-extension step (94 ° C., 30 seconds; 55 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 90 seconds), and then extended at 72 ° C. for 10 minutes. Biotinylated products were isolated by streptavidin-coated paramagnetic beads (Promega) according to the method described by Sorensen et al. The streptavidin purified product was then subjected to nested PCR (PCR2) by denaturation-annealing-extension for the same 35 cycles as described above, according to the method described by Sorensen et al. Table 21 shows the obtained products and the PCR primers used for purifying the products.

In addition, a 1.3 kb product (C.16) was generated using the oligonucleotide primers (SEQ ID NOs: 669 and 670) under the conditions of PCR1 described above. This product was isolated from an agarose gel along with those described in Table 21 and cloned into pT7 blue T-vector plasmid (Novagen) by methods well known in the art.
The cloned product was sequenced as described in Example 5. The sequence was assembled by the program of the GCG package (version 7). An outline of the constructed contig is shown in FIG. GB-C is 9034 bp in length and its full length has been sequenced. This is shown in SEQ ID NOs: 400-606. These SEQ ID NOs correspond to the three forward translation frames.
Example 19.CKS-based expression and immunogenic HGBV-C poly Peptide detection
The HGBV-C sequence obtained in the walking test described in Example 17 (Table 13) was combined with the CKS expression vectors pJO200 and pJO201 using the restriction enzymes listed in Table 22 (10 units, NEB) as described in Example 13. And cloned into pJO202. Two additional PCR clones, C3 / 2 and C8 / 12, were also expressed (FIG. 39). The PCR product C3 / 2 was generated by the primer of SEQ ID NO: 681, and the complement of PCR product C8 / 12 and SEQ ID NO: 685 was generated using the primer (SEQ ID NO: 693 and its complement) as described in Example 9. . This PCR product was cloned into pT7 blue as described above, then released with the restriction enzymes listed in Table 22, and cloned into pJO200, pJO201 and pJO202 described above.
Two human sera were selected for which one or more CKS / HGBV-A or CKS / HGBV-B fusion proteins were indicated by the 1.7, 4.1, or 2.17 ELISA (see Examples 15, 16) for the presence of antibodies to the fusion protein, and Western blots were selected. Was analyzed by One of these sera (240D) is from individuals with non-AE hepatitis (Egypt), while the other (G8-81) is from individuals in West Africa and is "at risk" for exposure to HGBV. (See Example 15). The CKS / HGBV-C fusion protein was expressed and transferred to a nitrocellulose sheet as described above. One of the human serum samples was pre-blocked as described and diluted 1: 100 in blocking buffer containing 10% E. coli lysate and 6 mg / ml XL1-Blue / CKS lysate. For overnight. Blots were washed twice with TBS, reacted with HRPO-conjugated goat anti-human IgG, and developed as described above. The results are shown in Table 22.
Some of the HGBV-C proteins showed reactivity with one or the other of these two sera, and three (C.1, C.6, C.7) were selected and ELISA assay (Example 20). In this way, it was found that a sample already known to exhibit reactivity with HGBV-A and / or HGBV-B protein also reacted with HGBV-C protein. Reactivity with multiple proteins from the three HGBV viruses may be due to cross-reaction resulting from epitope sharing between the viruses. Alternatively, this may be due to infection by more than one virus, and may also be due to other unidentified factors.

Example 20. Serological study of GBV-C
A. Recombinant protein purification procedure
Bacterial cells expressing the CKS fusion protein were frozen and stored at -70 ° C. Bacterial cells from each GBV-C construct were thawed and disrupted as described in Example 15 for the GBV-B construct. In addition, the recombinant protein was purified as described for GBV-B recombinant protein in Example 15.
The fractions collected in this purification procedure were separated by electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue R250 to give a molecular weight of approximately 75 kD (CKS-C.1 / SEQ ID NO.404), 71 kD (CKS-C.6 / SEQ ID NO: 404) and 49 kD (CKS-C.7 / SEQ ID NO: 404). Bands indicating proteins of the expected molecular weight were observed for the CKS-C.6 and CKSC.7 recombinant proteins. For the CKS-C.1 protein, a band was observed at a position corresponding to a molecular weight of 62 kD, not at the expected molecular weight of 75 kD. It is unclear why the expected and observed bands differ. Fractions containing the protein of interest were pooled and re-examined by SDS-PAGE.
The immunogenicity and structural integrity of the pooled fractions containing the purified antigen were determined by electron transfer to nitrocellulose and immunoblotting according to the method described in Example 13. In the absence of a suitable positive control, recombinant proteins were identified by reactivity with monoclonal antibodies against the CKS portion of each fusion protein. Western blot analysis using an anti-CKS monoclonal antibody to detect the recombinant antigen of the CKS-C.1 protein (SEQ ID NO: 404) revealed a single band at about 65 kD. This result differs from the expected size of the CKS-C.1 protein (SEQ ID NO: 404) of 75 kD. The CKS-C.6 protein (SEQ ID NO: 404) and the CKS-C.7 protein (SEQ ID NO: 404) had the expected sizes as determined by immunoblotting.
B. Procedure for coating polystyrene beads
The proteins were dialyzed and the immunogenicity of these proteins on polystyrene beads was evaluated as described in Example 15.
C. ELISA Procedure for Detecting Antibodies to HGBV Various ELISAs were performed as described in Example 15.
D. Detection of HGBV-RNA in sera of infected individuals
HGBV-RNA was examined in accordance with the description in section D of Example 15 for the sample which showed repeated reactivity in each ELISA.
E. Serum image of tamarin
In ELISA assays using the CKSC.1, CKSC.6, or CKSC.7 proteins from the HGBV-C genome, none of the sera from tamarin showed a specific immune response. See the description of the serum image of tamarin in Example 15.
F. Supplemental Testing
As described in Example 15, specimens that initially showed reactivity were typically retested. If a sample shows repeated reactivity, additional tests (eg, Western blot) can be performed to further supplement the data from the ELISA. For a western blot to be considered positive, the observable band was 65 kD for the C.1 protein (SEQ ID NO: 404), 71 kD for the C.6 protein (SEQ ID NO: 404), or C.7. It needs to be detected at 49 kD for the protein (SEQ ID NO: 404). Since the Western blot was not optimized to match or exceed the sensitivity of the ELISA, the ELISA data was not immediately discarded for a negative result. However, a positive result reinforces the reactivity detected by ELISA.
As described in Example 15, for a sufficient amount of a repeatedly reactive sample, RT-PCR (using primers corresponding to SEQ ID NOs: 8 and 9 and performed as described in Example 10) was performed. HGBV-C specific nucleotide sequences in serum can be identified.
G. Experimental procedure
In Example 15, ELISA using a recombinant antigen from HGBV-B was used to evaluate the presence of antibodies against HGBV-B and HGBV-A in various human populations. As described in Example 14, C.1 ELISA using CKS-C.1 recombinant protein (SEQ ID NO: 404) coated on solid phase, CKS-C.6 recombinant protein (SEQ ID NO: 404) Using the C.6 ELISA used and the C.7 ELISA using the CKS-C.7 recombinant protein (SEQ ID NO: 404), tests for antibodies to HGBV-C were performed on many of the same specimens. As described in Example 15, all five HGBV-inoculated convalescent tamarins responded to HGBV-B recombinant protein (as detected using 1.7, 1.4 and 4.1 ELISAs). Produced targeted but short-lived antibodies. None of the tamarins produced detectable antibodies in response to the C.1, C.6 and C.7 ELISAs, but some of the human specimens showed a lower C.I. when tested by Western blotting (see Example 13). Specific antibodies reactive with .1, C.6 and C.7 recombinant proteins were produced. In this example, the utility of C.1, C.6 and C.7 ELISAs in detecting antibodies in various human populations was evaluated.
H. Determining the truncation value
C.1, C.6 and C.7 ELISA truncation values were determined as described in Example 15.
I. Serological data obtained using low-risk samples
A population containing 100 serum and 100 plasma was obtained from healthy volunteer donors living in southwestern Wisconsin, and CKS-C.1 (SEQ ID NO: 404) protein in C.1 ELISA, CKS- in C.6 ELISA. Antibodies were tested against the C.6 (SEQ ID NO: 404) protein and three recombinant proteins from HGBV-C, including the CKS-C.7 (SEQ ID NO: 404) protein in the C.7 ELISA.
For the C.1 ELISA, the mean absorption values for serum and plasma samples were 0.049 (standard deviation (SD) = 0.040) and 0.038 (SD = 0.029), respectively. The truncation values for serum and plasma were calculated to be 0.214 and 0.286, respectively. As described above, the truncation value can also be expressed as a function of the absorption value of the negative control, and samples with S / N values above 10.0 were considered reactive. Using this truncated value, none of the 100 plasma samples showed any initial or repeated reactivity with antibodies to the C.1 protein (SEQ ID NO: 404), and one of the 100 serum samples In Table 1, an initial reactivity and a repeated reactivity were observed for the antibody against the C.1 protein (SEQ ID NO: 404).
For C.6 ELISA, the mean absorption values for serum and plasma samples were 0.102 (standard deviation (SD) = 0.046) and 0.105 (SD = 0.047), respectively. The truncation value was set so that a sample having an S / N value of 10 or more was determined to be reactive. Using this truncated value, three samples (two from the serum population and one from the plasma population) were repeatedly reactive against antibodies to the C.6 protein (SEQ ID NO: 404). Was done.
For the C.7 ELISA, the average absorption values for serum and plasma samples were 0.061 (standard deviation (SD) = 0.040) and 0.050 (SD = 0.055), respectively. The truncation value was set so that a sample having an S / N value of 10 or more was determined to be reactive. Using this truncated value, no sample was considered to be repeatedly reactive to the antibody to the C.7 protein (SEQ ID NO: 404).
Thus, it was demonstrated that approximately 1% of American blood donors (N = 200) had antibodies against C1, C6 or C.7 proteins.
J. Samples considered “at risk” for hepatitis
The data from this study is summarized in Table 23.
(I) Sample from West Africa
A total of 20 of the 137 samples were reactive in one or more of the ELISAs using the GBV-C protein. A total of 12 out of 97 were found to be repeatedly reactive in the C.1 ELISA, 3 out of 52 were found to be repeatedly reactive in the C.6 ELISA, and 137 samples 5 were found to be repeatedly reactive in the C.7 ELISA. Three of the specimens that were reactive in C.1 were tested by Western blot and found to be reactive.
These data suggest that HGBV is endemic in West Africa.
(Ii) Intravenous drug user samples
As part of a study conducted at the Hynes Veterans Affairs Hospital in Chicago, Illinois, a total of 112 specimens were obtained from a population of intravenous drug users. A total of two of the 112 specimens were repeatedly reactive with one or more proteins. One sample was found to be repeatedly reactive in the C.1 ELISA, and one sample was found to be repeatedly reactive in the C.7 ELISA.No sample was positive in the C.6 ELISA. Was.
K. Specimens obtained from non-AE hepatitis individuals
The data from this study is summarized in Table 23.
Various populations of specimens (described in Example 15.K) were obtained from individuals with non-AE hepatitis and tested by the 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISAs (described in Example 15.C). Not all samples could be tested in all ELISAs due to insufficient sample volume.
(I) Japanese specimen
Out of a total of 89 samples, none were found to be repeatedly reactive in the C.1 ELISA. Due to the small sample size, no antibodies were tested in the C6 or C.7 ELISA.
(Ii) Greek specimen
A total of 67 specimens were tested using C.1 and C.7 ELISA. None of the samples showed only reactivity.
(Iii) Egyptian specimens
A total of 18 out of 132 samples were found to be reactive in one or more ELISAs. None were found to be reactive in the C.1 ELISA. A total of 15 samples were found to be reactive in the C.6 ELISA and three samples were found to be reactive in the C.7 ELISA.
(Iv) US sample (M set)
A total of six specimens were found to be reactive in one or more ELISAs. Two specimens were found to be repeatedly reactive in the C.1 ELISA. Four samples were found to be repeatedly reactive in the C.6 ELISA. There were no repeatedly reactive samples in the C.7 ELISA.
(V) US specimen (T set)
None of the 64 specimens were found to be reactive in the C.1 or C.6 ELISAs. One specimen was repeatedly reactive in the C.7 ELISA.
(Vi) Samples from various clinical sites in the United States (set 1)
In total, 3 out of 62 samples were found to be reactive in one or more ELISAs. One specimen was found to be repeatedly reactive in both C.1 and C.6 ELISAs. Two specimens were found to be repeatedly reactive in the C.7 ELISA.
As noted above, there may be more than one strain of HGBV, ie, more than one distinct virus can be represented by the sequences disclosed herein. These are considered to be within the scope of the present invention and are referred to as "hepatitis GB virus (" HGBV ").
L. Statistical significance of serum reaction results
These data indicate that HGBV-C protein (i.e., C.1, C.6, and C.I.H.) may be obtained from individuals believed to be at risk of exposure to HGBV, and from individuals diagnosed with non-AE hepatitis. 7) Specific antibodies were detected in specimens that were repeatedly reactive to the antibodies in the ELISA, and a low percentage of these antibodies were detected in volunteers or blood donors from the United States. Table 24 shows the results of the serum reactions obtained for the various categories of samples (“low risk”, “at risk”, and non-AE hepatitis patients shown in Table 23) by grouping, and the chi-square test Was analyzed for statistical significance. Unlike the data in Table 23, which summarizes the serological presence of antibodies to the HGBV protein in the total number of specimens tested, the data in Table 24 reflects the results obtained for different individuals. For the GBV-C ELISA, the data compare the serological presence of anti-HGBV in volunteer blood donors with individuals considered "at risk" (West Africa) exposed to HGBV rather than IVDU. Indicates that there is a significant difference (p-value = 0.000). There was also a statistically significant difference in the serological presence of antibodies against HGBV-C in individuals with non-AE hepatitis in Egypt and the United States when compared to volunteer blood donors. These data suggest that exposure to HGBV-C is associated with non-AE hepatitis. Note: Although RT-PCR results were negative in these earlier studies, subsequent data revealed flavi-like virus sequences in the sera of serologically positive individuals (see Example 19). did.
Example 21. Presence of HGBV-C in non-AE hepatitis humans In
The generation of an ELISA specific for HGBV-C has enabled the identification of immunopositive sera from patients suffering from non-AE hepatitis (HGBV-C serology example). This serum was tested by RT-PCR for the HGBV-C sequence, along with several immunologically positive HGBV-A and HGBV-B obtained from individuals who were proven non-AE hepatitis (Table 25). did. In order to detect HGBV-C variants as well as possible, RT-PCR was performed using a denatured NS3 oligonucleotide primer in the first round of amplification, followed by nested GB-C specific primers. A second amplification was performed. Specifically, the first amplification was performed with 2 mM MgCl 2_Two, And 1 μM of primers ns3.2-s1 and ns3.2-a1 (SEQ ID NOs: 711 and 712, respectively) using serum cDNA products prepared as described in Example 6. The reaction product was subjected to denaturation-annealing-extension for 40 times [(94 ° C. for 30 seconds, 37 ° C. for 30 seconds, temperature rise to 72 ° C. for 2 minutes, 72 ° C. for 30 seconds), repeated 3 times. After that, 37 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 50 ° C, and 30 seconds at 72 ° C) were performed], followed by extension at 72 ° C for 10 minutes. The resulting reaction was maintained at 4 ° C. The second amplification consisted of 2 mM MgCl_Two1 μM GB-C specific primers (SEQ ID NOs: 675 and 676) and 4% of the first PCR product as template. The second round of amplification employed a temperature cycling scheme designed to also amplify specific products with oligonucleotide primers that contained base pair mismatches with the template to be amplified [Roux, Bio / Techniques, 16: 812-814 (1994)]. That is, the reaction was performed 43 times of temperature cycling (20 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 55 ° C. (0.3 ° C. decreased every cycle), 1 minute at 72 ° C.), and then (20 seconds at 94 ° C., 40 (30 seconds at 72 ° C., 1 minute at 72 ° C.) and a final extension was performed at 72 ° C. for 10 minutes. The PCR product was isolated by agarose gel electrophoresis, and the nucleic acid was directly stained with ethidium bromide, visualized by ultraviolet irradiation, transferred to a Hybond-N + nylon filter by Southern transfer, and then irradiated to GB-C. Hybridization was performed on the labeled probe. PCR products were cloned and sequenced as described in the art.
Using the above method, GB-C.4, GB-C.5, GB-C.6, and GB-C.7 were obtained. These sequences are homologous to GB-C (SEQ ID NO: 400, bases 4167-4365) at a rate of 82.1-86.6%. FIG. 40 shows the sequence differences in GB-C.4, GB-C.5, GB-C.6, and GB-C.7 in the expected codon triplet, aligned with regions homologous to GB-C. Show. As shown in this figure, most of the nucleotide differences do not cause amino acid changes from GB-C. Maintenance of this overall sequence at the amino acid level is due to the fact that GB-C.4, GB-C.5, GB-C.6, and GB-C.7 are different strains of the same virus, HGBV-C. It is suggested that it was obtained. In addition, the degree of sequence difference at the nucleotide level indicates that these PCR products were not the result of contamination with any of the previously identified GB-C sequences.
For three of these individuals (GB-C.4, GB-C.5, GB-C.6, and GB-C.7 sources), hepatitis A, hepatitis B, or hepatitis C There was no evidence of infection. The presence of the GB-C sequence in individuals suffering from hepatitis of unknown etiology suggests that one of the causative agents of human hepatitis is HGBV-C. Over time samples were available for two of the individuals, including GB-C.4 and GB-C.5. To track the sequence of HGBV-C in these samples, a clone-specific RT-PCR was developed. That is, nucleic acids extracted from serum were reverse transcribed with random hexamers as in Example 7. The obtained cDNA was amplified 40 times at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds, and then extended at 72 ° C. for 10 minutes. PCR primers specific to GB-C.4 and GB-C.5 (GB-C.4-s1 and GB-C.4-a1, or GB-C.5-s1 and GB-C.5-a1 ) Was used at a concentration of 1.0 μM. The PCR product was isolated by agarose gel electrophoresis, and the nucleic acid was directly stained with ethidium bromide, visualized by ultraviolet irradiation, transferred to a Hybond-N + nylon filter by Southern transfer, and then hybridized to a radiolabeled probe. Soy.
GB-C.4 was found in the sera of Egyptian patients suffering from acute non-AE hepatitis. This patient was seropositive for the HGBV-A protein (see example in HGBV-A ELISA). RT-PCR of a series of five samples from this Egyptian patient showed viremia, which persisted for at least 20 days after normal serum ALT levels (Table 26). The presence of the GB-C sequence after normalization of serum ALT has suggested that in some people, chronic infection may result. However, no further samples of this patient were obtained and no conclusions can be drawn about the chronicity of HGBV-C. It is in the stage of seeking an additional sample to solve this problem.
GB-C.5 was obtained from a Canadian patient suffering from aplastic anemia associated with hepatitis. Each sample from this patient was serologically positive in the C.7 ELISA (Example 20). GB-C.5 specific primers (GB-C) were obtained from samples obtained from Canadian patients during aplastic anemia (day 13 after onset of symptoms) and at death (day 14; FIG. 41). .5-s1 and GB-C.5-a1) were used to detect GB-C.5. However, GB-C.5 specific PCR failed to detect the GB-C.5 sequence at the onset of symptoms (day 0, acute hepatitis) and at day 3 (liver failure). Therefore, it is unknown whether GB-C.5 was present at levels below the detection limit in the first sample. If present, HGBV-C would have been the causative agent of the patient's aplastic anemia. However, GB-C.5 may have been contaminated from blood products administered to combat anemia, since GB-C.5 was detected by RT-PCR only at the time of aplastic regeneration. In this case, the association of HGBV-C with aplastic anemia would be similar to HCV (Hibbs et al., JAMA, 267, 2051-2054 (1992)).
Given the distant relationship between HGBV-C and HCV, it was of interest whether current methods for detecting HCV infection could recognize human samples containing HGBV-C. The usual test for individuals exposed or infected with HCV is by antibody testing utilizing antigens obtained from three or more regions of HCV-1. This test allows the detection of antibodies against all known HCV genotypes in most individuals [Sakamoto et al., J. Gen. Virol. 75, 1761-1768 (1994); Stuyver et al., J. Gen. .Virol. 74, 1093 to 1102 (1993)]. A second generation ELISA for HCV was performed on samples containing HGBV-C as described in Example 10 (Table 25). One of the four samples containing HGBV-C was seropositive for HCV antigen. Only a limited number of human sera that are seronegative for HCV were shown to be positive for HCV genomic RNA by a very sensitive RT-PCR assay (Sugitani, 1992, # 65]. A similar RT-PCR assay (as described in Example 9) confirmed the presence of HCV viremia in seropositive samples. However, none of the serum-reactive HCV negative samples had HCV viremia. Thus, although one of the four individuals containing the HGBV-C sequence had evidence of HCV infection, this assay for the presence of HCV did not accurately predict the presence of HGBV-C. This one HCV-positive patient also appeared to be infected with HGBV-C. It is unclear whether hepatitis in this patient was due to the presence of HCV, HGBV-C, or both viruses. The finding of HCV and HGBV-C in the same patient may indicate that there is a common risk of receiving these infections.
Using the PCR procedure described above, the GB-C sequence (previously GB-C shown in FIG. 41) was included in a "normal" unit of blood obtained from two volunteer American donors in 1994. Isolates ~ 85% homologous, data not shown). These units were determined to be negative for HBV and HCV as a result of the test, and had normal serum ALT levels. However, these units tested positive in the 1.4 ELISA. The finding of HGBV-C in at least two out of ~ 1000 units of immunologically screened "normal" blood units suggests that the virus is currently present in the United States blood supply. I have. However, we show that these blood units can be identified using an ELISA developed from the HGBV protein and nucleotide probes from the HGBV sequence.
It should be noted that the various HGBV sequences (FIG. 41) have numerous sequence variations. PCR-based assays for viral nucleic acids, while very sensitive, rely on sequence matches between the oligonucleotide primers and the viral template. Therefore, all of the tested HGBV-C viremia samples were taken here because the PCR primers used in this study were located in regions of the HGBV-C genome that were not well conserved in various isolates. It could not have been detected by RT-PCR. A well conserved region of the HGBV-C genome, as found in the untranslated region of HCV 5 '[Cha et al., J. Clin. Microbiol., 29, 2528-2534 (1991)]. Utilizing PCR primers from will allow more accurate detection of HGBV-C viremia samples.

Example 22. Sequence comparison and systematic analysis
Comparison of nucleotides with the predicted amino acid sequence, ie, alignment, can provide information on the degree of closeness of the virus. By aligning the HGBV sequence with the sequences of other viruses, it is possible to quantitatively evaluate the degree of similarity and homology between the sequences. This information can be used to develop principles for HGBV virus classification. In general, the calculation of similarity between two amino acid sequences is based on the degree of similarity between the side chains of the amino acid pairs in the alignment. Similarity is based on the physicochemical characteristics of the side chains of the amino acids: size, shape, charge, ability for hydrogen bonding, and chemical reactivity. That is, similar amino acids have side chains with similar physicochemical characteristics. For example, phenylalanine and tyrosine both contain aromatic side chains and can therefore be considered chemically similar. A discussion of amino acid chemistry can be found in basic biochemistry textbooks, for example, Biochemistry, 3rd Edition, edited by Lubert Stier, W.H. Freeman and Company, New York, 1988. Calculation of homology between two aligned amino acid sequences is generally an arithmetic calculation in which the number of identical amino acid pairs in the alignment is counted and this number is divided by the length of the sequence in the alignment. Similar to the method used for amino acid sequence alignment, determining the degree of homology between two aligned nucleotide sequences involves counting the number of identical nucleotide base pairs in the alignment and determining this number in the sequence under alignment. Is the arithmetic calculation of dividing by the length of. Calculations of similarity between two aligned nucleotide sequences use sometimes different values for transitions and inversions between paired (ie, matched) pairs at various positions in the alignment. However, the scores of similarity and homology between a pair of nucleotide sequences are usually very close, ie, within 1-2%.
As mentioned earlier, the homology between the HGBV agonist and the amino acid sequence of the hepatitis C genotype is limited. To more accurately determine the degree of intimacy between HGBV agents and HCV, the sequence of the overall large open reading frame (ORF) of HGBV-A, B and C, and some representative Amino acid sequence alignment was performed using the amino acid sequence of the large ORF of the HCV isolate. In addition, the degree of closeness between the HGBV agent and HCV at the nucleotide level depends on the overall genomic nucleotide sequence of HGBV-A, B and C, and the overall genomic nucleotides of some representative HCV isolates. It was determined using the sequence. Alignment between amino acid and nucleotide sequences was performed using the GAP program of the Wisconsin Sequence Analysis Package (version 8) available from Genetic Computer Group, Inc., Science Drive 575, Madison, Wis., 53711. The penalties for gap creation and gap extension were 5.0 and 0.3, respectively, for nucleic acid sequence alignments, and 3.0 and 0.1, respectively, for amino acid sequence comparisons. The GAP program calculates the degree of similarity and homology, expressed as a percentage, between two aligned sequences by the algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970).
The nucleotide and amino acid sequences of a selected number of the major hepatitis C virus (HCV) genotypes were obtained from GenBank. This is shown below along with their registration numbers.

Table 28 shows the pairwise comparison between the predicted amino acid sequence of the large open reading frame (ie, the putative precursor polyprotein) and the nucleotide sequence between each of the above HCV genotypes and the HGBV isolate. Shown in 29 respectively. The genotype designation for each HCV isolate is shown in the top row. This genotype designation is based on the nomenclature for HCV isolates described in Simmonds, P et al. (1994) Hepatology, 19, 1321-1324.
The data shown in Table 28 shows that the lower limit of amino acid sequence homology between HCV genotypes is 69%. This value is very close to the value given by Simmons et al. (Simmonds, P. et al., Hepatology, 19, 1321-1324 (1994)). Simmons et al. Compared the coding regions of the eight complete HCV genomes from the two major groups and showed 67.1% to 68.6% amino acid sequence similarity. However, the author did not describe how the similarity was calculated. This value (69%) is very close to the value reported by Okomoto et al. (Virology, 188, 331-341, 1992) for comparison of HCV-J8 with other major HCV isolates. However, these investigators also did not describe how the homology was calculated. Comparison of the HGBV polyprotein sequence with the HCV genotype shows that the sequence of the polyprotein encoded by HGBV shows no more than 33% homology to any of the HCV polyproteins (Table 28). Reveals. By comparison of the nucleotide sequences (Table 29), there is at most 44.2% homology between any HGBV and any HCV isolate, while at least the nucleotide sequence homology between HCV isolates Sex is 64.9%. Therefore, between HGBV-A, B and C and HCV, the homology of the nucleotide and the predicted amino acid sequence is largely outside the range of homology established for known HCV genotypes. HGBV virus cannot be considered to be the genotype of hepatitis C virus.
The relationship between the hepatitis C virus and the hepatitis GB virus was determined by systematic analysis of their aligned nucleotides, deduced amino acid sequence (ie, large open reading frame), or portions of these sequences. You can find out by doing. Application of this method to hepatitis C virus has been shown to depict six equally divergent major groups of sequences due to the variability of HCV isolates [Simmonds, P. et al., J. Am. Gen. Virol. (1993) 74, 2391-2399 and Simmonds, P. et al., J. Gen. Virol. (1994) 75, 1053-1061]. As a result of this analysis, a nomenclature for hepatitis C virus was established [Simmonds, P. et al., Hepatology, 19, 1321-1324 (1994)]. Genotypes are classified based on the evolutionary gap between sequences.
To determine the phylogenetic relationship between the hepatitis GB virus and hepatitis C virus, an alignment of the amino acid sequences within the putative helicase gene of NS3 and the putative RNA-dependent RNA-polymerase of NS5B (RdRp) was performed. Also included in the alignment were related sequences from other viruses in Flaviviridae, and viruses that have been shown to have evolutionary closeness to members of Flaviviridae within the helicase and polymerase genes (Kunin EV). (Koonin, EV) and Dolja, VV (1993), Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 375-430, and Koonin, EV (1991). Year), J. Gen. Virol. 72, 2179-2206].
Amino acid sequence alignment was performed using the program PILEUP of the Wisconsin sequence analysis package (version 8). The systematic distance between a pair of aligned sequences was determined by the courtesy of PHYLIP, courtesy of J. Felsenstein (Felsenstein Jay (1989), Cladistics 5, 164-166). Determined using the PROTDIST program in the package (version 3.5c, 1993). This calculated distance was used to construct a phylogenetic tree using the program NEIGHBOR (adjacent bond setting). The system diagram was plotted using the program DRAWTREE. Table 30 shows the sequences of the viruses used and their corresponding Genbank accession numbers. The swirl distance between each HCV genotype and each HGBV virus for alignment performed in helicase, RdRp, or the complete large open reading frame is shown in Tables 31, 32 and 33, respectively. Calculated distances between HCV genotype and HGBV virus and other viruses listed in Table 30 are not shown. The phylogenetic diagrams generated for the amino acid alignment of helicase, RdRp, or the complete large open reading frame sequence are shown in FIGS. 42, 43 and 44, respectively.
Putative RdRp, encoded in the NS5B region of HGBV-A, B and C, and RdRp of several HCV genotypes, two infectious viruses, some representative flaviviruses, and some Alignment of the amino acid sequence with the positive-strand RNA plant virus indicated that they had conserved sequence features associated with the RdRp of the positive-strand RNA virus (data not shown). Based on similar analyses, the helicases encoded by HGBV-A and HGBV-B show significant homology to the helicase of these positive-strand RNA viruses (data not shown). Exceptions are CARMV, TCV, and MNSV, which are presumed not to carry the helicase gene [Guilley, H. et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13, 6666-6677]. These results were not unexpected given the association of the helicase and RdRp genes of these viruses with the supergroups shown by previous systematic analyzes [Koonin, EV and Dolja, VV (1993), Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 375-430]. However, a survey of the systematic distance between HGBV and HCV isolates based on the sequences of the helicase or RdRp sequences (Tables 31 and 33) shows that there is a considerable separation between these two groups. . The calculated separation indicates a close relationship between the HCV genotypes, with a maximum distance between the two genotypes of 0.3696 (RdRp distance). However, the distance calculated from RdRp between HGBV-A, -B, or -C and any member of the HCV group is 0.96042 to 1.46261. Similarly, values calculated from helicase alignments for any two HCV genotypes range from 0.044555 to 0.19706, whereas the HGBV-A, -B, or -C The distance between them ranges from 0.69130 to 0.87120. Also, the alignment of the expected amino acid sequence of the HCV genotype and the complete large open reading frame of the GB virus indicates that the HCV isolates have a narrow range of evolutionary separations (0.17918-0.39646), while any GB virus has The minimum distance between the HCV isolates is 1.68650. Thus, the GB hepatitis virus exhibits an evolutionary gap outside the range indicated by the genotype of the hepatitis C virus.
A systematic analysis of HGBV and HCV sequences has shown that "How can the divergence of HGBV sequences from HCV sequences be compared to divergence between HCV sequences? Does the HGBV sequence have less divergence? " If the divergence of the HGBV sequence from the HCV sequence is less than the divergence of the HCV sequences, the condition that must be satisfied is that the HGBV-A, HGBV-B, and / or HGBV-C sequence is As close to at least one of the HCV sequences as the most distantly related pair (ie, the minimum distance from any HGBV sequence to any HCV sequence is observed between HCV sequences Equal to or less than the maximum value). The current sequence data does not meet this condition. In Table 31 (RbRp alignment), the minimum HCV-HGBV distance is 2.83 times the maximum HCV-HCV distance, and in Table 32, the minimum HCV-HGBV distance is 3.51 times the maximum HCV-HCV distance. is there. Thus, the data do not support the idea that the HGBV sequence is a member of a group whose divergence is restricted by members of the HCV group previously characterized.
These relative distances can be determined using a bootstrap-based test [Efron, B. (1982), "Jackknife, bootstrap, and other resampling schemes", Society Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, Elton, B. and Gong, G., 1983, "A Fun Study of Jackknife, Bootstrap, and Cross Validation," Am. Stat. 37 , 36-48]. Table 32 shows the results obtained from the bootstrap sampling. This table shows a comparison of HCV-HGBV divergence (minimum value of all HCV-HGBV distances) with HCV divergence (maximum value of all HCV-HCV distances) using the PROTDIST program. Based on the calculated PAM distance. At 1000 bootstrap resampling of the column in the sequence alignment, the maximum divergence between HCV did not exceed the minimum divergence of the HGBV sequence from the HCV sequence (Table 34). Thus, in individual measurements based on alignment of coding regions from two separate genes, there is no single example where the HGBV sequence falls within the divergence of the HCV genotype gene sequence. Even if conservatively guessed, the likelihood that data for HGBV can be drawn from the same sequence pool as the HCV sequence is less than one in 100,000.

Assuming that the HCV sequences utilized in this study were representative of the largest divergence of HCV genotypes, these results indicate that HGBV-A, B, and C are not HCV genotypes. I have. Also, the relationship between HGBV-A and HGBV-C appears to be closer than their relationship to HGBV-B, which indicates that HGBV-A and HGBV-C represent different virus lines. Implies that Similarly, HGBV-B is the only one that represents its own viral lineage. The relative swirl distance between the analyzed viral sequences is readily apparent by examining the rootless pedigrees shown in FIGS. 45 and 46. The length of the branches in the pedigree is proportional to the evolutionary distance. Clearly, the HCV virus has a close evolutionary relationship, consistent with choosing to use a portion of the encoded genomic sequence or the entire genome to perform the analysis ( (Figure 44). Although the degree of divergence between HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C and other members of Flaviviridae is most closely related to the hepatitis C virus, the GB agent is HCV It cannot be considered a genotype, indicating that it may in fact represent a new group within the Flaviviridae family.
The present invention provides reagents and methods for determining the presence of HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C in a test sample. The polynucleotides or polypeptides (or fragments thereof) specific for HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C described herein, or antibodies produced from these polypeptides and polynucleotides, are generally used. It can be combined with the described assay reagents and can be incorporated into the present assay procedure for detecting antibodies against the above viruses, which is considered to be within the scope of the present invention. Alternatively, produced from the polynucleotides or polypeptides (or fragments thereof) specific for HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C described herein, or from these polypeptides and polynucleotides (or fragments thereof) The antibodies obtained can be used separately to detect HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C viruses.
Other uses or variations of the present invention will be apparent to those of skill in the art upon reviewing the disclosure herein. Therefore, it is intended that this invention be limited only by the appended claims.

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Claims (14)

A hepatitis GB virus (HGBV) polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a positive strand RNA genome comprising an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 390. 2. The HGBV polypeptide according to claim 1, wherein the polypeptide is a purified polypeptide, a recombinant polypeptide or a synthetic polypeptide. A diagnostic reagent comprising a polypeptide of hepatitis GB virus encoded by a positive strand RNA genome comprising an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 390. A purified antibody that specifically binds to at least one epitope of a hepatitis GB virus (HGBV) antigen, wherein the HGBV antigen is encoded by a positive RNA virus genome encoding a polyprotein comprising SEQ ID NO: 390 The purified antibody described above. The antibody according to claim 4, wherein the antibody is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibody according to claim 4 or 5, which is bound to a signal generating compound. An assay kit for detecting the presence of an antibody to hepatitis GB virus (HGBV) in a test sample, the kit comprising a container of a polypeptide having at least one HGBV antigen, wherein the HGBV antigen comprises a polypeptide comprising SEQ ID NO: 390. The above-described assay kit, which is encoded by a positive-stranded RNA virus genome encoding a protein. A method for detecting an antibody in a test sample suspected of containing an antibody to the hepatitis GB virus (HGBV),
(A) preparing the test sample under the conditions and for a time and under conditions sufficient to form an antigen / antibody complex; Contact with the peptide,
(B) a method for detecting the antibody, comprising detecting the complex containing an antibody against HGBV; 9. The method of claim 8, wherein said polypeptide is produced by recombinant techniques or synthetic means. 9. The method of claim 8, wherein in step (b), prior to detecting the complex, contacting the complex with an indicator. 11. The method according to claim 10, wherein said indicator is a signal producing compound. A method for detecting an HGBV antigen in a test sample suspected of containing Hepatitis GB virus (HGBV),
(A) contacting the test sample with the antibody according to claim 4 for a time and under conditions sufficient to form an antigen / antibody complex;
(B) a method for detecting the antigen, which comprises detecting, in a test sample, the complex containing the HGBV antigen encoded by a positive-sense RNA virus genome encoding a polyprotein comprising SEQ ID NO: 390; 13. The method according to claim 12, wherein in step (b), before detecting the complex, the complex is contacted with an indicator and incubated. 14. The method according to claim 13, wherein said indicator is a signal producing compound.

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