JP3580453B2

JP3580453B2 - Cell activating cosmetic

Info

Publication number: JP3580453B2
Application number: JP27370995A
Authority: JP
Inventors: 近藤昇一郎; 小尾由美子; 岩見潤子; 岡部敬一郎
Original assignee: Advance KK
Current assignee: Advance KK
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1995-09-28
Publication date: 2004-10-20
Anticipated expiration: 2015-09-28
Also published as: JPH0987134A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は細胞賦活組成物を含有する保湿性を高め若々しい皮膚を保つ化粧料及び該細胞賦活成分を生産する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化粧品に使用されている細胞賦活剤としては単一成分原料（感光素、ビタミン、コラーゲンなど）及び抽出成分原料（プラセンタエキス（特願昭５９−１９０９０９）、ラクトバチルス・アシドフィルス（特願平３−１５６０３３）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（特願昭５７−８１２８７）からなる乳酸菌エキス、霊芝エキスなど）である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は安全性の高い細胞賦活作用を有し、かつ、保湿性が高く、皮膚を滑らかにし、若々しい皮膚を保つ性質の化粧料を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
皮膚には色々な皮膚常在菌が棲息しマイクロフローラを形成している。面白いことに健康な人の肌は一様に嫌気性菌のプロピオニバクテリウム・アクネス菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ）、好気性菌のスタフィロコッカス・エピデルミデイス菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｅｓ）がそれぞれ１０^４−１０^５個／ｃｍ^２、１０^３−１０^４個／ｃｍ^２という高密度な棲息を示し、皮膚常在菌の上位優勢菌種を成している。健康な肌に、実験的に外来菌を塗布したとしても外来菌は速やかに排除され元の菌叢が自然と回復するということがしばしば観察される。このことはあたかも常在菌が皮膚の感染防御機構の一端を担っているように見える。健康な皮膚が持つ常在菌叢のこれら生態系が構築されるためには、皮膚から供給される優勢常在菌の生産に必要な栄養因子と常在菌が分泌する抗菌様物質などの存在が考えられている。そこで本発明は、まず健康な人の正常皮膚に存在する細菌を採取し、分離培地プレート上で単コロニーを得、その単離皮膚常在菌純粋液培養を行い、その培養菌体及び培養液中にヒト線維芽細胞増殖作用物質があるかの否かの検索を試みた。その結果、プロピオニバクテリウムに属する菌の培養液中に細胞増殖作用を示す成分があること、さらにこれを含有する化粧料として有用であることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明はプロピオニバクテリウム・アクネスに属し、線維芽細胞に対して細胞賦活作用を示す成分を産生する菌を培養して得られる培養液あるいはその該菌体に由来する物質で線維芽細胞の増殖能を高める成分を含有する化粧料並びに微生物を提供するものである。
【０００５】
本発明に用いられる培養液を生産する菌株はプロピオニバクテリウム・アクネスに属し、線維芽細胞に対して特異的に増殖作用を示す成分を生産する菌としては、例えばＡＤ３０００２株（以下本菌株と言う）が挙げられる。
本菌株の菌学的性質は以下の通りである。
（ａ）菌の性状：桿菌
（ｂ）運動性：無
（ｃ）胞子形成：観察されず
（ｄ）グラム染色性：陽性
（ｅ）ゼラチン：液化能あり
（ｆ）インドール生成：あり
（ｇ）硝酸還元反応：陽性
（ｈ）カタラーゼ反応：陽性
（ｉ）リパーゼ活性：あり
（ｊ）ガス生成：なし
（ｋ）ウレアーゼ反応：陽性
（ｌ）ヒアルロニダーゼ反応：陰性
（ｍ）生育範囲：ｐＨ５−９，温度２０−４０℃（最適生育温度３２−４０℃）（ｎ）酸素要求性：偏性嫌気性。但し菌数の多い場合，酸素耐性が認められる。
（ｏ）嫌気条件下での酸の産生能：マルトース（−）
（ｐ）エスクリン加水分解：なし
以上の性質をもとにＢｅｒｇｅｙ’ｓｍａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８版，（１９７４年）の記載から、本菌株をプロピオニバクテリウム・アクネスＡＤ３０００２と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。（受託番号ＦＥＲＭＰ−１５１８６）
【０００６】
本発明に用いる線維芽細胞に対して特異的に賦活作用を示す成分は、上記菌株を栄養源含有培地に接種し嫌気的に培養すれば培養中に生産される。かかる菌株としては、上記ＡＤ３０００２株はもとより、人工変異株あるいは自然変異株であっても上記成分を生産する能力を有するものであれば、全て本発明に使用することができる。
【０００７】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、これにより限定するものではない。
実施例１
プロピオニバクテリウム・アクネスＡＤ３０００２株を下記のＧＡＭ液体培地に接種し、３７℃で嫌気培養を行い、得られた培養液を１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離に付し、菌体上清を０．２２ミクロンのフィルターを用いて無菌ろ過し培養上清液を得た。一方、菌体は生理的食塩水でよく洗い洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を８０％アセトンで抽出し、次いで酢酸エチルで抽出したものをエバポレーターで蒸発乾固し菌体抽出物を得た。
ＧＡＭ液体培地の組成（１リットル当たり）
ペプトン１０．０ｇ
ダイズペプトン３．０ｇ
プロテオーゼペプトン１０．０ｇ
消化血清末１３．５ｇ
酵母エキス５．０ｇ
肉エキス２．２ｇ
肝臓エキス末１．２ｇ
ブドウ糖３．０ｇ
リン酸二水素カリウム２．５ｇ
塩化ナトリウム３．０ｇ
溶性デンプン５．０ｇ
Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ
チオグリコール酸０．３ｇ
ｐＨ７．３±０．１
【０００８】
実験例１（細胞賦活作用）
ヒト繊維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ、理化学研究所より購入）を予め、１０％ＦＣＳ加ＲＩＴＣ−８０培地にて５％ＣＯ_２，３７℃の条件下で４日間培養した。その培養細胞は、その後、ＰＢＳ緩衝液で２度洗浄し、０．２５％トリプシン処理にて細胞をはがし、同培地で８ × １０^３細胞／ｍｌ細胞浮遊液に調製した。これを９６穴マイクロプレートに０．１ｍｌずつ分注し同培養条件下で前培養（４時間）を行った。サンプルは同培地（無血清）で１．０％，０．３％，０．０３％（濃度は実施例１の容量％、但し菌体抽出液は培養液１ｍｌ相当量の容量％）に希釈したものを各々０．０１１ｍｌずつ９６穴に添加して培養した。判定はニュ−トラルレッドで生細胞を染色（３７℃，１時間）し、０．１ＭＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ：エタノール（１：１）で溶出後、分光光度計を用いて波長５４０ｎｍでの吸光度を測定し、細胞増殖能を算出した。その結果を表１に示した。
【表１】

上記のごとく、培養上清液（Ｐ＜０．０５）及び菌体抽出液（Ｐ＜０．０１）には明らかに線維芽細胞に対して有意に増殖効果が認められた。一方、皮膚常在菌であるスタフィロコッカス・エピデルミデス菌や皮膚有害菌であるスタフィロコッカス・アウレウス菌及びマイクロコッカス菌属には増殖効果が認められず、本菌株の細胞賦活作用の有用性が示された。
【０００９】
安全性
実施例１で得られた菌体培養液をソニケーション処理（氷冷で２０分間）し、その上清液を０．２２ミクロンのフィルターを用いて無菌ろ過したものにグリセリンを加えて試験液とした。これを成人男子（ｎ＝１）前腕曲内側皮膚に貼付し、２４時間後の皮膚刺激性について観察を行い表２に示す結果を得た。
【表２】

上記のように、安全性になんら問題はない。
【００１０】
実施例２（ローション）
上記実施例１で得られた培養菌体（１０^９細胞／ｍｌ相当量）を８０％アセトンで抽出後、アセトンを除去する。この溶液を０．２２ミクロンのフィルターでろ過し精製水で１０倍に希釈したもの９４．９ｇにグリセリン５．０ｇ、パラオキシ安息香酸０．１ｇを攪拌添加してローションを得た。（配合量は重量％）
【００１１】
実施例３（クリーム）
上記実施例２で得られた培養菌体抽出液５ｇ、グリセリン５ｇ、ポリエチレングリコール（４００）２ｇ及び精製水７０ｇを７０℃加熱混合溶解した中へ、予めセタノール４ｇ，スクワラン５ｇ，ステアリン酸１ｇ，ミツロウ１ｇ，ワセリン２ｇ、グリセリンモノステアレート２ｇ、パラオキシ安息香酸エチルエステル０．１ｇと少量の香料を加熱混合溶解させたものを攪拌混合して、ホモジナイザーで乳化し室温まで冷却してクリームを得た。（配合量は重量％）
【００１２】
【発明の効果】
本発明のプロピオニバクテリウム・アクネスの培養上清あるいは菌体抽出液を含む化粧料は線維芽細胞の増殖効果を有する。従ってこれを含有する化粧料は皮膚の保湿性を高め、皮膚を滑らかにし、若々しい皮膚を保つ効果が期待され、かつ安全性についても問題はない。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a cosmetic containing a cell activation composition to enhance moisture retention and maintain a youthful skin, and a microorganism that produces the cell activation component.
[0002]
[Prior art]
Cell activators used in cosmetics include single-component raw materials (photosensitive elements, vitamins, collagen, etc.) and extractive raw materials (placenta extract (Japanese Patent Application No. 59-190909)), Lactobacillus acidophilus (Japanese Patent Application No. 3- Lactic acid bacteria extract, reishi extract and the like) consisting of Streptococcus thermophilus (Japanese Patent Application No. 57-81287).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a cosmetic having a highly safe cell activation effect, high moisturizing property, smooth skin and keeping youthful skin.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Various skin resident bacteria inhabit the skin and form microflora. Interestingly, the healthy skin is uniformly composed of 10 ⁴ -10 ⁵ anaerobic bacteria, Propionibacterium acnes, and aerobic bacteria, Staphylococcus epidermidides. / ^cm ^2, 10 3 -10 ⁴ cells / cm ² showed a high density habitat that forms a upper predominant species of indigenous dermal bacteria. Even when exogenous bacteria are experimentally applied to healthy skin, it is often observed that the exogenous bacteria are quickly eliminated and the original flora naturally recovers. This seems as if resident bacteria play a part in the defense mechanism of skin infection. In order for these ecosystems of the normal flora of healthy skin to be built, the presence of nutritional factors necessary for the production of dominant normal bacteria supplied from the skin and antimicrobial-like substances secreted by the normal bacteria Is considered. Therefore, the present invention first collects bacteria present in normal healthy human skin, obtains a single colony on a separation medium plate, conducts pure liquid culture of the isolated skin resident bacteria, and culture cells and culture solution thereof. Attempts were made to determine whether there are any human fibroblast proliferating agents. As a result, it has been found that a component exhibiting cell proliferation activity is present in the culture solution of bacteria belonging to Propionibacterium, and that the composition is useful as a cosmetic containing the component, and the present invention has been completed. That is, the present invention belongs to Propionibacterium acnes, and a fibroblast is obtained from a culture solution obtained by culturing a bacterium that produces a component that exhibits a cell activation effect on fibroblasts or a substance derived from the microbial cell. The present invention provides a cosmetic and a microorganism containing a component that enhances cell growth ability.
[0005]
The strain that produces the culture solution used in the present invention belongs to Propionibacterium acnes, and as a bacterium that produces a component that specifically exhibits a proliferative action on fibroblasts, for example, the AD30002 strain (hereinafter referred to as this strain) Say).
The mycological properties of this strain are as follows.
(A) Fungus properties: Neisseria gonorrhoeae (b) Motility: No (c) Spore formation: Not observed (d) Gram stainability: Positive (e) Gelatin: Capable of liquefaction (f) Indole formation: Yes (g) Nitrate reduction reaction: positive (h) catalase reaction: positive (i) lipase activity: yes (j) gas generation: no (k) urease reaction: positive (l) hyaluronidase reaction: negative (m) growth range: pH 5-9, Temperature 20-40 ° C. (optimum growth temperature 32-40 ° C.) (n) Oxygen requirement: obligate anaerobic. However, oxygen tolerance is observed when the number of bacteria is large.
(O) Acid production ability under anaerobic conditions: maltose (-)
(P) Esculin hydrolysis: Based on the above properties, the strain was named Propionibacterium acnes AD30002 from the description of Bergey's manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, (1974). Deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Technology. (Accession number FERM P-15186)
[0006]
Ingredients that specifically activate the fibroblasts used in the present invention are produced during culture if the strain is inoculated into a nutrient-containing medium and cultured anaerobically. Such strains can be used in the present invention as long as they have the ability to produce the above components, including the above-mentioned AD30002 strain, as well as artificial mutants or natural mutants.
[0007]
【Example】
EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1
Propionibacterium acnes AD30002 strain is inoculated into the following GAM liquid medium, anaerobic culture is performed at 37 ° C., the obtained culture solution is subjected to continuous centrifugation at 15,000 rpm, and the cell supernatant is treated with 0. Aseptic filtration was performed using a 22 micron filter to obtain a culture supernatant. On the other hand, the cells were washed thoroughly with physiological saline to obtain washed cells. The washed cells were extracted with 80% acetone and then extracted with ethyl acetate, and evaporated to dryness with an evaporator to obtain a cell extract.
Composition of GAM liquid medium (per liter)
Peptone 10.0g
Soybean peptone 3.0g
Proteose peptone 10.0g
Digested serum powder 13.5g
Yeast extract 5.0g
Meat extract 2.2g
Liver extract powder 1.2g
Glucose 3.0g
Potassium dihydrogen phosphate 2.5g
Sodium chloride 3.0g
Soluble starch 5.0g
L-cysteine hydrochloride 0.3g
Thioglycolic acid 0.3g
pH 7.3 ± 0.1
[0008]
Experimental example 1 (cell activation)
Human fibroblasts (NBIRGB, purchased from RIKEN) were cultured beforehand in a RITC-80 medium supplemented with 10% FCS for 4 days under conditions of 5% CO ₂ and 37 ° C. The cultured cells were then washed twice with PBS buffer, peeled off by 0.25% trypsin treatment, and prepared to 8 × 10 ³ cells / ml cell suspension with the same medium. This was dispensed in 0.1 ml portions into a 96-well microplate and pre-cultured (4 hours) under the same culture conditions. Samples were diluted to 1.0%, 0.3%, 0.03% in the same medium (serum-free) (concentrations were volume% of Example 1, but the cell extract was volume% corresponding to 1 ml of culture solution) 0.011 ml of each was added to 96 wells and cultured. Judgment was performed by staining live cells with neutral red (37 ° C., 1 hour), eluting with 0.1 M NaH ₂ PO ₄ .2H ₂ O: ethanol (1: 1), and then using a spectrophotometer at a wavelength of 540 nm. Absorbance was measured and cell proliferation ability was calculated. The results are shown in Table 1.
[Table 1]

As described above, the culture supernatant (P <0.05) and the bacterial cell extract (P <0.01) clearly showed a significant proliferation effect on fibroblasts. On the other hand, Staphylococcus epidermides bacteria that are skin resident bacteria and Staphylococcus aureus bacteria and Micrococcus genus bacteria that are harmful to skin have no growth effect, and the cell activation effect of this strain is not useful. Indicated.
[0009]
Safety The microbial cell culture solution obtained in Example 1 was subjected to sonication treatment (ice-cooling for 20 minutes), and the supernatant was sterilized using a 0.22 micron filter to obtain glycerin. To obtain a test solution. This was affixed to the inner skin of an adult male (n = 1) forearm curve, and the skin irritation after 24 hours was observed to obtain the results shown in Table 2.
[Table 2]

As mentioned above, there is no problem with safety.
[0010]
Example 2 (lotion)
After extraction the resulting cultured cells in Example 1 (10 ⁹ cells / ml equivalent) in 80% acetone to remove the acetone. This solution was filtered through a 0.22 micron filter and diluted 10-fold with purified water. To 94.9 g, 5.0 g of glycerin and 0.1 g of paraoxybenzoic acid were added with stirring to obtain a lotion. (Mixed amount is% by weight)
[0011]
Example 3 (cream)
5 g of cultured cell extract obtained in Example 2 above, 5 g of glycerin, 2 g of polyethylene glycol (400) and 70 g of purified water were mixed by heating at 70 ° C. and dissolved in advance, 4 g of cetanol, 5 g of squalane, 1 g of stearic acid, beeswax 1 g, petrolatum 2 g, glycerin monostearate 2 g, paraoxybenzoic acid ethyl ester 0.1 g and a small amount of fragrance were mixed by heating, mixed and stirred, emulsified with a homogenizer, and cooled to room temperature to obtain a cream. (Mixed amount is% by weight)
[0012]
【The invention's effect】
The cosmetic comprising the culture supernatant or cell extract of Propionibacterium acnes of the present invention has a fibroblast proliferation effect. Therefore, the cosmetics containing this are expected to have an effect of improving the moisture retention of the skin, smoothing the skin and keeping the youthful skin, and there is no problem with respect to safety.

Claims

For skin containing one or both of extracts of fungi belonging to Propionibacterium acnes AD30002 (Seiko Kenkyusho , No. FERM P-15186) or extracts obtained from their cultures of cell stimulatory cosmetic.