JP3571362B2 - 骨組織の処理方法及び関連の移植可能なバイオ材料 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は骨組織を処理するための方法及び関連の移植可能なバイオ材料に関連する。
【０００２】
特に、かかる方法はヒトに移植すべき観点で骨組織を処理する方法を可能とする。かかる組織は拒絶反応を起こさせず（又は少なくともできるだけ小さく起こさせる）、そして良好な骨伝導（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）能力を有すべき、即ち受容者により新たに形成される骨組織の形成及び移動を可能とすべきである。
【０００３】
【従来の技術】
骨組織の移植は世界中のほとんどの整形外科部門で日常利用されている技術である。その移植は３種のタイプ、即ち、
−同種移植、
−自己移植、
−異種移植、
でありうる。
【０００４】
骨の同種移植は供与体から、この供与体と同種であるが別個の受容体への骨組織の移植より成る。骨の自己移植は骨組織を取り出し、そして同一の個体に移植することより成る。骨の異種移植は動物（通常はブタ又はウシ）由来の骨組織をヒト個体に移植することより成る。
【０００５】
このような移植を行うため、出発点は骨組織にあり、それを機械的に処理し、そしてその移植に有害な作用を及ぼすであろう物質全てを除去する。これを行ううえで、骨組織の機械的性質が損われることが従来技術において用いられている処理に見い出されている。これは抽出された有機物質が骨の機械的性質に影響することを理由とする。しかしながら、骨移植片の移植は一般に骨格の再構成の目的のために一般に行われるものであり、それはある程度、機械的性質が最も重要である強度の問題に付される。従って、天然の骨と同等、又は優れてさえもいる機械的性質を有する有用な骨移植片を獲得することが有利であろう。
【０００６】
例えば、かかる移植片は整形外科の用途において指定され、そして特に移植片に負荷がかけられるとき、即ち、特に背柱の手術（頸部の融合、腰椎板の交換、他）、寛骨臼の土台の再構成、関節形成手術、骨切り術、偽関節、関節固定術に指定されるであろう。
【０００７】
従って、移植された人工補てつ（接続補てつ、歯科補てつ、等）を補強する移植片を骨格の一部を修復するために用いるとき、もとの劣化した骨よりも特に加圧のもとでの機械的強度が高いであろう移植片の利用は補てつの寿命及び機能の観点から明らかに有利であろう。更に、補てつと天然の骨との間に挿入された移植片は機械的性質における変化をより累進的なものとし、従って強度における極端な急変化を回避することにより応力の伝達の性質を向上せしめるであろう。更に、もし移植片がそれが移植されたときから骨と同じ強度を有するなら、新たに形成された骨組織によるこの移植片の再吸収の際の劣化の危険性の全てがなくなる。
【０００８】
従って、本発明の狙いは、機械的性質、特に加圧のもとでの強度が少なくとも天然の骨と同程度である移植可能なバイオ材料を提供することにある。詳しくは、本発明は加圧のもとでの強度が天然の骨の１〜２倍でありうる移植可能なバイオ材料を提供することを狙っている。
【０００９】
更に、本発明は機械的及び生物学的観点の両面での骨移植片の有効性を高めるバイオ材料を提供することを目的とする。
【００１０】
実際、同種移植はかなりの欠点を有する。まず第１に、１個体から別の個体への骨組織の伝達に関連する感染症の危険が多々ある。これは特にＡＩＤＳ ＨＩＶウィルスの伝播が考えられる場合である。この病気の多大な流行により、かかる感染の危険性はここ数年関心が高まっている。これらの感染の危険性とは別に、その他のウィルスも考慮されるが、同種移植の利用に関連する主たる問題は同種移植片の破損、移植された骨組織（移植片）の不適切な再転移増殖（ｒｅｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ）及び移植の拒絶反応である。不適切な再転移増殖は今日重大な問題を起こしている。なぜなら、移植片の組織は再吸収し、侵入し、従って新たに形成される骨組織に置き代わることを目的としているからである。しかしながら今日まで、そのリハビリテーションは幾分弱い。
【００１１】
本発明の狙いの一つは従って、感染及び免疫系の観点から安全な移植可能な骨組織を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の狙いは、この種の骨組織が良好な骨伝達能力を有するであることにある（即ち、移植片の有効な再転移増殖を助長するもの）。
【００１３】
自己移植は通常同種移植よりも好ましく、なぜならこれらはより有効に再転移増殖し、そして移植部位において骨細胞に貢献しがちであるからである。その効果は、感染及び免疫系に至る危険性がかなり低いことであるが、このタイプの実施は安全に満足たるものではない。なぜならこれは痛みを伴い、患者からの望ましくない応答によく遭遇し、そして提供部位での併発症の危険性を含むからである。更に、数多くの手術は自己移植に相容れない大量の骨組織を必要とする。
【００１４】
骨異種移植も数多くの欠点を有する。一般に、これらの移植片は強い免疫反応（拒絶反応）を引き起こす。この欠点を和らげるため、これらの反応を減らす又はなくす様々な試みがなされてきた。これらは一般に移植前に骨組織からタンパク質を抽出する原理に基づいている。その理由は、骨組織に含まれているタンパク質が拒絶反応の一部の原因であるからである。これらの拒絶反応は骨髄組織中の細胞塊の存在及びこの組織のその他の要素にも関連している。
【００１５】
骨組織からタンパク質を抽出するための有機溶媒の利用が知られている。最も一般的に利用されている溶媒は：エチレンジアミン、過酸化水素、様々な塩素化溶媒、例えばクロロホルム又はジクロロメタン、そして更にはエタノール及びアセトンである。タンパク質をこのように抽出することにより、たいていの骨組織は免疫反応をわずかにしか、又は全く示さない。これらは一般に血管再生に有効であり、そして受容者由来の骨形成細胞の侵入を受ける。しかしながら、それら自体は骨誘発特性を有さない。その機械的強度は一般に天然の骨より弱いか又は類似である。
【００１６】
しかしながら、タンパク質抽出のために利用される溶媒は通常毒性が高いことが認識されている。そのため、受容部位のわずかな汚染を回避するために骨組織はていねいにすすがなければならない（その多孔性により、それは容易ではない）。
【００１７】
仏国特許出願ＦＲ−Ａ−２，６５４，６２５は、特定の尿素ベース抽出剤と組合さったかかる毒性溶媒を利用するタンパク質抽出工程を述べている。しかしながら、かかる工程は非常に様々な脂質の抽出物をもたらし、なぜならこの特許に従うと、０．５〜５％の脂質が残りうるからである。
【００１８】
動物の組織又は器官から脂質、タンパク質、ヌクレオチド及び多糖類のような様々な物質を抽出するための超臨界状態における流体が既に知られている。しかしながら、これらの既知の方法は利用するにはめんどう、且つ、費用がかかり、その他の方法に比べて何らかの決定的な利点はない。
【００１９】
従って、従来技術は、骨組織を処理する際の有機物質の抽出の結果として、骨組織の機械的強度が高まることの可能性を開示していない。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の狙いは従来技術の欠点の全てを緩和すること、そして詳しくは、天然の骨に比べて向上した強度を有し、感染及び免疫系に関して安全であり、良好な骨伝達能力を有し、そして毒性製品を利用しない移植可能な骨組織を提供することにある。本発明はかかる骨組織を処理することを可能とする方法を提供することを特に狙っている。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
この目的のため、本発明はヒトの中に移植することができ、且つ、機械的応力に耐えるのに適切であるバイオ材料を獲得するために動物又はヒトの骨組織を処理するための方法に関し、ここでは、骨組織を、そのまわりの有機物質を全て機械的に洗い出し、そして有機物質をこの骨組織から抽出しており、この方法は少なくとも一段階において、骨組織全体にわたって浸透する超臨界状態にある流体を含むことを特徴とする。
【００２２】
従って、本発明者は驚くべきことに、骨組織の機械的強度を高めると同時に有機物質を抽出するのに、処理の最中において骨組織を超臨界流体と接触せしめることで簡単になし得ることを見い出した。
【００２３】
本発明に従うと、超臨界状態における流体を、組織の中に存在し、そして超臨界状態における流体の中に可溶化されている必須の脂質系有機物質を抽出する段階において、骨組織の中に浸透させるようにする。従って、この抽出は骨組織に特に適切である特性を有する超臨界流体により行われる。
【００２４】
本発明に従うと、この方法は：
ａ）骨組織のまわりの全ての有機物質を機械的に除去する、
ｂ）予め決定された形態へとこの骨組織を切る、
ｃ）有効な再移植にとって有害な成分をこの骨組織から抽出するために、この組織の中に存在している必須の脂質系有機物質を溶解及び抽出せしめるのに適切な超臨界状態における流体をこの骨組織全体にわたって浸透するようにしてこの骨組織を清浄する、
ｄ）このようにして清浄した骨組織を洗浄、脱水及び滅菌に付すること、
より成る。清浄段階ｃ）は更に、その中に残っている特定のタンパク質を抽出するための化学的及び／又は酵素的な骨組織の処理より成る。
【００２５】
超臨界状態における流体、即ち、低い動的粘度（気体のそれに近い）、高い拡散係数、非常に低い界面張力及び高い密度（液体のそれに近い）を有するものは、吸収性の問題を全く伴わずに多孔性材料にわたって容易に拡散する。更に、かかる流体の溶解力は高く（液体のそれに近く、そして時折り気体の１０^８ 倍までに至る）、そして圧力を変えることによって変わりうる。その結果、かかる超臨界状態における流体は骨組織の中に存在している必須の脂質系有機物質を容易に、且つ、事実上完全に溶かす。免疫系に対する及び感染の危険性はこれによりかなり低下する。
【００２６】
本発明の利点の一つは超臨界状態における流体としての二酸化炭素（ＣＯ_２ ）の利用にあり、なぜならこの成分は数多くの下記の有利な性質を有するからである。
−その臨界温度が低い（３１℃）。従って、約３１℃の温度及び約７．３８ＭＰａ の圧力にて作業しながら超臨界状態にある二酸化炭素を伴うことが可能である。適用する圧力に応じて、３１℃〜６０℃の温度で作業することが可能であり、その温度では、骨組織の唯一の考えられる損傷の形態はコラーゲンの変性であり、これによりその抗原特性は取り払われてしまう、
−その溶解力、特に脂質に対する溶解力が優れている。例えば、数多くの脂肪酸及びトリグリセリドは、超臨界状態における二酸化炭素の中で１０％までの溶解度を有しうることが知られている。ところで、これらの脂質は骨髄組織の中に大量に存在し、海綿状の骨組織の中に含浸し、それらは抗原性が強く、そして削除するのに常に非常に困難である；更に、それらは吸着性でないため、それらは物理的なバリヤーを形成し、移植の再転移増殖を妨害する、
−それは骨の生体メカニズム的な性質を補強し、そして移植された骨組織の骨統合に役立つ、
−それは天然で、全体的に無毒な物質である、
−それは獲得するのが容易であり、そして処理すべき物体又は実験者のいづれにとっても危険性を示さない。
【００２７】
有利には、該骨組織の処理は、骨組織に存在するタンパク質物質を抽出するのに特に適する化学的又は酵素的処理で補強されている。
【００２８】
本発明はまた、上述の方法に従って獲得でき、そして超臨界状態における流体と接触した精製骨組織より成る移植可能なバイオ材料に関し、この組織は、ヒトの損傷を受けた骨組織がある箇所にて移植するのに適切なものである。
【００２９】
本発明に従うと、この骨組織は超臨界状態における流体を用いる抽出により必須の脂質系有機物質が除去されている。
【００３０】
かかる材料は天然の骨と同等又はそれより優れた強度を有し、感染及び免疫系の観点から安全であり、無毒であり、そして本来含まれている脂質のほぼ完全な抽出のため、良好な骨伝導能力を有する。
【００３１】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、本発明にかかわる方法の実施のための設備を示す添付図面を参照しながら、限定でない実施例として供する下記の詳細により明らかとなるであろう。
【００３２】
図面に示す設備は、骨組織２を入れ、そして超臨界状態における二酸化炭素ＣＯ_２ のストリームが通過する反応槽１を含んでいる。
【００３３】
二酸化炭素はシリンダー３の中で液状で保存され、フィルター４に通され、冷却ユニット５によってそれが明らかに液体となる約０℃の温度へと冷やされ、次いでバッファータンク６へと供給される。この液状二酸化炭素を、それが超臨界状態へと変化することができる圧力へと圧縮されるために、タンク６の下流に計量ポンプ７が設置されている。ポンプ７の下流にバルブ８が設置され、反応槽１はそれが装填又は排出に付されるように独立となっている。反応槽１に供給される前に、この二酸化炭素はヒーター９により熱せられ、従ってこのヒーター９を離れるとき、この二酸化炭素は超臨界状態となっている。二酸化炭素は反応槽１を通過し、そしてそれが侵入したのと反対側から出ていく。反応槽１の下流にバルブ１０が設置され、それがこの回路から取り出されることが可能となっている。バルブ１０は二酸化炭素が第１セパレーター１１の中に供給される前にその圧力を低下させることも可能とする。二酸化炭素の中に溶解した物質はセパレーター１１の出口１２で回収される。この設備はまた、圧力を更に下げるバルブ１３と、有機物質の回収のための出口１８を有している第２セパレーター１４を含んで成る第２分離ステージとを含んで成る。必要ならば、２以上の分離ステージを設けることができる。分離ステージの出口１２，１８での二酸化炭素はバルブ１５によってこの回路にフィードバックされる。シリンダー３は逆止めバルブ１６及びバルブ１７によってこの閉鎖回路に接続されている。
【００３４】
本発明にかかわる骨組織のための処理工程を下記に説明する。
【００３５】
通常通り、骨をまず機械的に清浄化し、次いで所望の寸法及び予め決定された形態に切断する。骨組織の形態は例えば直角をなした平行方面体、円筒形又は任意のその他の適切な形態でありうる。この骨組織を次に抽出反応槽１に移す。最適な運転条件は、３１〜６０℃の温度、及び約１．５×１０^７ 〜４×１０^７ Ｐａの圧力で達成される。
【００３６】
二酸化炭素ＣＯ_２ を計量ポンプ７によって液状でポンプする。この液を、超臨界状態で抽出反応槽１に供給されるようにその上流で予備加熱する。
【００３７】
超臨界状態における流体は温度及び圧力の条件のもとで気体として定義されうることが、それらの特性が気体のそれと液体のそれとの間にあることで思い起こせるであろう。これらは「密な気体」又は「膨張した液体」としても知られる。一定の化学物質にとって、２つの相、液体と蒸気とが単相のみを形成するような温度圧力ダイアグラムの正確な点が臨界点として知られる。この臨界温度（Ｔｃ）及び臨界圧力（Ｐｃ）を超えると、この流体はいわゆる「超臨界」状態となる。
【００３８】
反応槽１を通過して、超臨界状態にある二酸化炭素は骨の中の大量の有機系、本質的に脂質系の物質を溶解せしめる。特に、これは骨組織の中に含まれている骨髄組織中の脂肪を溶解する。
【００３９】
超臨界流体の特性のため、この抽出物は非常に効率的である。特に、公知方法で用いる化学溶媒に通常接近することのない脂肪が、この超臨界状態における二酸化炭素によって抽出される。
【００４０】
二酸化炭素により実施される脂質抽出をコントロールするため、セパレーター１１及び１４は常に抽出物が空となっており、脂肪残渣を回収する。骨組織は、脂肪残渣の流れがセパレーター１１，１４の出口１２，１８で回収される最中に超臨界二酸化炭素と接触したままとなっている。処理時間は処理すべき骨組織の重量及び反応槽１の中に供給される超臨界二酸化炭素の流速に比例して変化する。従ってこの工程は、骨組織を通過する二酸化炭素の決定された質量をコントロールすることによって制御されうる。事実、抽出の質量収率は一定であることが知られている。従って、反応槽１の出口に連続して質量フローメーターを設置することにより、利用する二酸化炭素の質量が十分であるときにこの工程は制御されうる。
【００４１】
抽出された物質は９８％以上の脂肪より成ることが認められるであろう。この骨組織自体は処理の後に平均して２％以下の脂肪を含み、そしてこの量は均等に分布している。更に、その圧縮強度は約１０〜２０ＭＰａ である。
【００４２】
化学反応槽の中で通常起こなわれるのとは反対に、次に利用するのは、抽出物（本質的には脂質系の物質）ではなく、残渣（骨組織）である。
【００４３】
従って、超臨界状態における流体は、生物機械特性を向上せしめる骨物質を強化する機能と、骨物質を清浄化する機能の二重機能も有する。
【００４４】
このようにして処理した骨組織を、特定のタンパク質を抽出するための化学的又は酵素的処理を包括する追加の常用の工程に付する。この追加の化学的処理は過酸化水素を用いて実施してよく、一方、酵素的処理はプロテアーゼによって行ってよい。この追加の処理は骨組織からのタンパク質のより効果的な抽出を保障し、そしてそれに従ってこのようにして処理した骨組織の拒絶反応の危険性を低める。
【００４５】
次に、この骨組織を洗浄工程に付する。この洗浄は３０℃〜６０℃の温度の蒸留水の複数の連続湯浴の中で実施する。
【００４６】
骨組織の脱水及び消毒より成る段階を次に行う。この段階は、骨組織を濃度が高まっていくエタノール（例えば７０％、９５％、次いで１００％）の複数の連続湯浴に通すことによって行う。エタノールは優れた殺ウィルス剤であるため、これは組織の脱水及び感染に関係するこのバイオ材料の安全性を高めることを同時に可能とすることが明らかであろう。３０〜６０℃の温度の通風オーブンの中での乾燥がこの工程を終了させる。
【００４７】
包装した後、次にこの骨組織を滅菌にかける。この滅菌は、ベーター粒子又はガンマー線（２５ｋＧｒａｙ ）のいづれかの照射によって実施されうる。骨組織を受容者の骨組織に合うように移植の前に再び切ることが可能である。その理由は、このようにして処理した骨組織は比較的硬質であり、従って粉々にならずに再び切ることができうるからである。
【００４８】
下記の表において、未処理の骨組織（実施例１）、超臨界状況におけるＣＯ_２ のみを用いて処理した骨組織（実施例２）、及び化学的（実施例３）又は酵素的（実施例４）のいづれかの追加の段階に付されたＣＯ_２ で処理した骨組織の分析結果を示す。
【００４９】
４通り実施例それぞれについての有機物質（ＯＭ）、有機炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）及び脂質系残渣（脂質）の比率についての対応の値を示している。示している値は平均値である。許容値をかっこ内に示す。
【００５０】
分析した骨組織はウシの大腿骨の末梢端に由来する。
【００５１】
【表１】

【００５２】
第２系列の同一の試験を別の起源のウシの骨を用いて実施した。下記の表において示している結果は、実施例１及び４について３８の測定値の平均、実施例２についての３９の測定値の平均、そして実施例３についての２８の測定値の平均である。
【００５３】
【表２】

【００５４】
超臨界状態における流体のみでの処理と比べ（実施例２）、炭素及び窒素含有量、そしてより一般的には有機物質の低下が実施例３及び４から認められうる。この低下は骨髄組織の非脂質画分の削減、及び骨組織中の可溶性タンパク質の溶解に対応する。この状況は、動物に実施した実験が示すように炎症性反応を大いに低下させることができ、そして更に骨伝導を高める。
【００５５】
これらの移植片の生体機械的特性は、それがもととなる骨（実施例１）よりも統計学的に優れていた。事実、処理した骨組織の圧縮強度は未処理のコントロールの骨組織より優れていた。
【００５６】
上述の方法の変異法として、骨組織の清浄及び切断を下記の方法で実施できうることが明らかであろう。
【００５７】
清浄段階は研磨工程を用いて実施でき、ここではコランダム（アルミナ）を骨に４×１０^５ 〜１０^６ Ｐａの圧力にて適用して、骨膜を含むそれに付着している全ての軟質組織を除去する。この技術は全てが手動での常用の方法よりも早く、且つ、効率的であり、その研磨は全て自動化ロボット装置で実施できうる。
【００５８】
他方、切断段階はウォータージェットカッティングでよい。かかる切断は１０μｍまで精度を可能とし、これは純水のジェットを用いて実施されるため、切断器具に由来する汚染の危険性を回避でき、そしてこれは大量生産の目的のために利用できうる。
【００５９】
むろん、本発明は特定の態様に限定されず、従って当業者の能力の範囲内のあらゆる態様を包括する。従って、超臨界状態における流体により実施される化学洗浄段階は、超臨界状態における流体の中に溶解した流体の追加、及び反応槽自体の中で行われうる骨組織に対する特定の作用によって補強されてよい。
【００６０】
また、タンパク質の抽出及び脱脂質反応の全てを同じ場所（反応槽）の中で、同時に実施することが可能である。更に、このような超臨界状態における流体の中に溶解されている流体はこのタイプの反応に好ましい高い温度及び圧力にある。
【００６１】
従って、骨髄組織から、もしくは細胞外骨マトリックスからタンパク質を除去すること、又は再度骨髄源の細胞塊から免疫応答の大いなる原因である強い抗原作用を除去することを所望するなら、超臨界状態におけるＣＯ_２ により溶解される以下のもの即ち、清浄剤、有機物質に対する酸化剤、いづれかの反応に特異的な酵素、そしてより一般的には、施される所望の処理に適切な任意の物質を反応回路に導入することが有利でありうる。
【００６２】
上述の方法及びバイオ材料はヒト又は動物の骨を利用して実施及び生産されることが明らかであろう。これらは移植、特に整形外科用途において、更には移植片が機械的応力に付される用途、例えば脊椎の手術（頸部の融合、腰椎板の交換、他）、寛骨臼の土台の再構成、関節形成手術、骨切り術、偽関節、関節固定術を実施するために利用できうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を実施するための設備。
【符号の説明】
１…反応槽
２…骨組織
３…シリンダー
４…フィルター
５…冷却ユニット
６…バッファータンク
７…ポンプ
８…バルブ
９…ヒーター
１０…バルブ
１１…第１セパレーター
１２…出口
１３…バルブ
１４…第２セパレーター
１５…バルブ
１６…逆止めバルブ
１７…バルブ
１８…出口

Claims (16)

1. ヒトに移植可能であり、且つ、機械的応力に耐久性である、機械的強度の強化されたバイオ材料を獲得するために動物又はヒトの骨組織を処理する方法であって、該骨組織のまわりの全ての有機物質を機械的に清浄し、そしてその骨組織から有機物質を抽出し、ここで少なくとも一段階において、この骨組織全体にわたって超臨界状態にある二酸化炭素ＣＯ ₂ 流体を浸透させることを特徴とする方法。
2. 前記骨組織を、それを通過する超臨界流体の流れの中に置くことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記段階が、前記組織の中に存在し、且つ、前記超臨界状態における流体の中に溶解している必須の脂質系有機物質を抽出する段階である、請求項１又は２に記載の方法。
4. （ａ）前記骨組織のまわりの全ての有機物質を機械的に清浄する；
   （ｂ）この骨組織を予め決定しておいた形態に従って切る；
   （ｃ）有効な再移植にとって有害な成分をこの骨組織から抽出するために、この組織の中に存在している必須の脂肪系有機物質を溶解及び抽出せしめるのに適切な超臨界状態における二酸化炭素ＣＯ ₂ 流体をこの骨組織全体にわたって浸透するようにしてこの骨組織を清浄する；
   （ｄ）このようにして清浄した骨組織を洗浄、脱水及び滅菌に付する；
   ことから成ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記清浄段階（ｃ）が更に、前記骨組織の中に残っている特定のタンパク質をそれから抽出するためにこの骨組織を化学的及び／又は酵素的に処理することから成ることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記超臨界流体状態における二酸化炭素ＣＯ₂が、約３１℃〜６０℃の温度を有し、そして約１．５×１０⁷〜４×１０⁷Paの圧力が付されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記超臨界状態における流体が特定の溶解流体を含み、これらの特定の流体が骨組織からタンパク質又はその他の特定の物質を抽出するのに適していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記骨組織から特定のタンパク質を抽出するのに適する適切な流体を、前記超臨界状態における流体を利用する段階の後に実施する洗浄段階において利用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記骨組織をアルミナを用いる研磨によって機械的に清浄することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記骨組織を高圧ウォータージェットにより切ることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記超臨界状態における流体による骨組織の処理の後、この骨組織を２０〜６０℃の温度の蒸留水の複数の連続湯浴を通すことによって洗浄することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 洗浄した後の骨組織を、濃度が徐々に上昇しているエタノールの複数の連続湯浴に通すことによって脱水及び消毒し、次いで通風オーブンの中で３０〜６０℃の温度で乾かすことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 脱水した後、骨組織を包装後、骨組織を照射によって滅菌することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法に従って獲得できた移植可能なバイオ材料であって、超臨界状態における二酸化炭素ＣＯ ₂ 流体と接触させた純化骨組織より成り、該組織が損傷を受けた骨組織のあるヒトの箇所の中に移植されるのに適しているバイオ材料。
15. 前記骨組織が、超臨界状態における二酸化炭素ＣＯ ₂ 流体を用いる抽出によって必須の脂質系有機物質が洗い出されていることを特徴とする、請求項１４に記載のバイオ材料。
16. ２％以下の脂質残渣を有し、そして約１０〜２０MPa の圧縮強度を有することを特徴とする、請求項１４又は１５に記載のバイオ材料。

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