JP3569872B2

JP3569872B2 - Method for detecting Candida albicans, DNA fragment for detecting Candida albicans, and probe for detecting Candida albicans

Info

Publication number: JP3569872B2
Application number: JP12079194A
Authority: JP
Inventors: 義村深澤; 洋三宮川; けい子加賀谷
Original assignee: 株式会社三菱化学ヤトロン
Priority date: 1994-05-11
Filing date: 1994-05-11
Publication date: 2004-09-29
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: JPH07298898A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）の検出方法、カンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片、及びカンジダアルビカンス検出用プローブに関し、更に詳しくは、生体試料中に含まれる極めて微量のカンジダアルビカンスでも特異的に検出することができる検出方法、検出用ＤＮＡ断片、及び検出用プローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンジダアルビカンスは、免疫不全の患者にとって重要な病原菌である。このカンジダ症の診断には、抗原又は抗体を検出する血清学的な方法が従来から使われていた。しかし、抗体検出法では、免疫機能の低下した患者に抗体産生能の低下が観察されることや、逆に健康人にも高い抗体価を示す場合があるので、診断法としては問題があった。一方、抗原検出法では、検体内に病原菌が少なくとも１０^５個存在しないと検出できないという感度上の問題があるので、菌の培養等の操作を必要とした。以上のように、従来、カンジダ症の良い診断法は存在しなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、カンジダアルビカンスを迅速かつ確実に検出するために、カンジダアルビカンスのＤＮＡを制限酵素を用いて分解し、得られたカンジダアルビカンスに特異的なＤＮＡ断片を得ていた。このＤＮＡ断片の塩基配列の中から、塩基配列を選択し、相補的なＤＮＡを合成したところ、ＰＣＲ法（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）のプライマーとして良好に用いることが出来ることを見い出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は以上の見地からなされたもので、下記の（１）〜（６）の請求項に記載するカンジダアルビカンスの検出方法、カンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片、及びカンジダアルビカンス検出用プローブから構成されている。
（１）▲１▼下記プライマー１の塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を有する第一のＤＮＡプライマーと
▲２▼下記プライマー２の塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの組み合わせと、
▲３▼ＤＮＡポリメラーゼと、
▲４▼被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液
とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮＡ検査工程にかけることを特徴とするカンジダアルビカンスの検出方法。
プライマー１：５’ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣ−３’
プライマー２：５’ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴ−３’
（２）被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を調製するに際し、被検試料に、カンジダアルビカンスの抗原因子５を共通して保有するカンジダトロピカリスをキャリヤーとして加え、抗因子５抗体ＭＡｂ−５共存下に凝集塊（カンジダアルビカンスとカンジダトロピカリスの凝集塊）を形成させ、この凝集塊からカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を調製する前記（１）に記載するカンジダアルビカンスの検出方法。
（３）下記の２２５塩基から構成されることを特徴とするカンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片。
ＡＴＡＣＧＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＡＡ
ＴＡＴＡＡＴＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣ
ＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣＣ
ＡＧＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＡ
ＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴ
ＴＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴ
ＡＴＡＴＡＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＡＴＡＴＡＧＡＣＣＡ
ＣＣＣＧＡＣＣＴＡＣＣＧＣＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＴＧ
ＡＧＧＧＡＴＡＡＡＣＣＣＣＡＣＡＴＴＧＴＧＧＧＴＴ
（４）カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＯ１０９１で分解して得られる約２ｋｂのＤＮＡ断片（ＥＯ３）に、更にＡｃｃＩ及びＨｉｎｃＩＩの２種類の制限酵素を作用させて得られる請求項３に記載するカンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片。
（５）前記（３）または（４）に記載するＤＮＡ断片を標識したカンジダアルビカンス検出用プローブ。
（６）前記（５）に記載するプローブを被検試料（被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液）と接触させ、プローブからの信号を検出することを特徴とするカンジダアルビカンスの検出方法。
【０００５】
本明細書の塩基配列において、Ａはアデニン残基、Ｃはシトシン残基、Ｇはグアニン残基、そしてＴはチミン残基の意味である。
【０００６】
本発明方法で用いる被検試料とは、カンジダアルビカンスを含有している疑いのある試料であれば特に制限されない。例えば、血液、唾液、咽頭拭い液、組織切片等を用いることが出来る。
【０００７】
本発明による前記のカンジダアルビカンスを検出する第１の方法は、（ａ）ＤＮＡ増幅工程と、（ｂ）ＤＮＡ検査工程とからなる。
このＤＮＡ増幅工程（ａ）では、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法を用いることが出来る。ＰＣＲ法を利用すると、微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域のみを自動的に約百万倍にまで増幅することが出来る（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１参照）。ＰＣＲ法では、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対するプライマー（以下、第１プライマーと称する）及び−鎖に対するプライマー（以下、第２プライマーと称する）の２種類のＤＮＡプライマーを用いる。
【０００８】
本発明のＤＮＡ増幅工程（ａ）では、第１プライマーと第２プライマーの組み合わせを用いることにより、カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡに由来する下記の１２５塩基の領域のみを特異的に増幅することが出来る。
ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴ
ＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＣ
ＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴ
ＡＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＡＴＡＴＡＧＡＣＣＡＣＣＣＧ
【０００９】
前記の第１プライマー及び第２プライマーは、それぞれ１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができるが、一般的には２０ｍｅｒから２５ｍｅｒであることが好ましい。第１プライマー及び第２プライマーは、各々［５’ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣ−３’］又は［５’ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴ−３’］で表される塩基のうちの、少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチドを含有していればよい。第１プライマー及び第２プライマーが１５ｍｅｒ未満であるとアニーリングの際の特異性が減少し、非特異的結合が増加する。又３０ｍｅｒを越えるとプライマー分子間あるいは分子内での二重鎖を取り易くなるので好ましくない。
本発明方法で用いる第１プライマー及び第２プライマーの、それぞれを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。
【００１０】
本発明による前記のそれぞれの第１プライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によって調製することが出来る。
【００１１】
本発明のＤＮＡ増幅工程（ａ）では、第１プライマー及び第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することのできるポリメラーゼを用いることができる。
【００１２】
本発明のＤＮＡ増幅工程（ａ）では、前記の第１プライマーと第２プライマーとの特定の組み合わせ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実行することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は、場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム）を含有することができる。
【００１３】
本発明方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、
（ｉ）ＤＮＡの変性工程（９０℃〜９５℃で、約１０秒〜約２分間）
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡの第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約３０秒〜約３分間）、及び
（ｉｉｉ）ＤＮＡボリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃で、約３０秒〜約５分間）とからなる。１サイクル毎にＤＮＡ量は約２倍に増幅され、ｎサイクル後には２^ｎ倍に増幅される。本発明においては、前記の増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２０〜４０回繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程（ｉｉｉ）での加熱時間を約５〜１０分間延長してＤＮＡ合成が完全に行われるようにするのが好ましい。
【００１４】
被検試料中にカンジダアルビカンスが存在する場合には、前記の増幅サイクル終了後には、１２５塩基対のＤＮＡ断片が大量に合成されている。このＤＮＡ断片を次のＤＮＡ検査工程によって検出する。
【００１５】
（ｂ）のＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動法及びエチジウムブロマイド染色を利用する方法、サザンブロットハイブリッド法、又はジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用することができる。
【００１６】
サザンブロットハイブリッド法、又はｉｎｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合には、非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は化学発光物質、蛍光物質でラベルしたプローブ）を用いることができる。更に、ジデオキシ法による塩基配列決定法を利用する場合には、蛍光ラベルを使用したＤＮＡオートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）等を用いることができる。
【００１７】
本発明は、更に、カンジダアルビカンス−ＤＮＡの特異的な検出に用いることのできるＤＮＡ断片、及びＤＮＡプローブを提供するものでもある。
カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡをＥｃｏＯ１０９１で分解して得られる、約２ｋｂのＤＮＡ断片であるＥＯ３を、制限酵素ＡｃｃＩ及びＨｉｎｃＩＩで処理すると、前記プライマー１及び２を用いてＰＣＲ法により増幅された１２５塩基対の塩基配列を含む約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られる。これを標識してプローブとして用いることもできる。
【００１８】
本発明による前記のカンジダアルビカンスの検出する第２の方法は、このＤＮＡプローブ（前記約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片）を使用するものである。このＤＮＡプローブは、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであっても、あるいはｉｎｓｉｔｕハイブリッド法であっても、カンジダアルビカンスＤＮＡを特異的に認識することができる。プローブの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば^３２Ｐなどの放射性物質、好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることが出来る。この標識物質から信号を発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の任意の方法を用いる。
【００１９】
本発明方法においては、被件試料中にカンジダアルビカンスが存在する場合にのみ、前記の第１プライマーと第２プライマーとの組み合わせにより、ＰＣＲ法によりそれぞれ下記の１２５塩基のＤＮＡ断片が短時間のうちに特異的に大量に増幅合成される。
ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴ
ＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＣ
ＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴ
ＡＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＡＴＡＴＡＧＡＣＣＡＣＣＣＧ
従って、被検試料中におけるカンジダアルビカンスの存在を極めて特異的に検出することが出来る。更に、被検試料中のカンジダアルビカンス量が微量であっても１２５塩基のＤＮＡ断片が増幅合成されるので高感度である。
又、本発明方法においては、カンジダアルビカンス−ＤＮＡに特異的な標識ＤＮＡプローブを用いるので、極めて正確にカンジダアルビカンスを検出することができる。
【００２０】
更に、前記の第１プライマー及び第２プライマーを用いる増幅工程と前記のプローブを用いる検査工程を併用すると、検査の所用時間はエチジウム染色の場合は４〜５時間程度ですみ、サザンブロットハイブリッド法で行う場合でも４８〜５０時間程度でよく、迅速に結果を得ることが出来る。
【００２１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例において使用した標準株（１４株）は、以下の通りである。
カンジダアルビカンスＭ１０１２Ａ血清型
カンジダアルビカンスＭ１４４５血清型
カンジダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｍ１０１７
カンジダギラモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｍ１０２３
カンジダクルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）Ｍ１００５
カンジダパラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）Ｍ１０１５
カンジダケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）Ｍ１００４
カンジダグラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）Ｍ４００２
サッカロミセスセレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＬ２０
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３
クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）ＮＩＨ−６８
ヒト口腔扁平上皮癌ＨＳＣ−２細胞株
【００２２】
又、以下の実施例において用いた各種の供試カンジダ菌株は、明治薬科大学、株式会社ヤトロン、及び財団法人理化学研究所（ＪＣＭ：ＪａｐａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の保存株である。カンジダ菌株の同定は、通常の生物学的方法、及びポリクローナル因子血清（カンジダチェツク：ヤトロン）によって行った。酵母の培養はサブロー培地（Ｄｉｆｃｏ社）中で２７℃にて行い、細菌の培養は普通栄養液体培地（栄研）中で３７℃にて行った。
【００２３】
【実施例】
＜実施例１＞
前記１４株を培養した菌体からのＤＮＡの調製は、下記のように行なった。カンジダアルビカンスＡ血清型Ｍ１０１２株（明治薬科大学から入手）をザイモリエース（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）によりスフェロプラストとした後（Ｔｏｒｒｅｓ−Ｂａｕｚａ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔａｌ，１９８０，ＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｆｒｏｍｙｅａｓｔａｎｄｍｙｃｅｌｉａｌｆｏｒｍｓｏｆＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１９：３４１−３４９参照）、Ｃｒｙｅｒらの方法（Ｃｒｙｅｒ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔａｌ，１９７５，ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔＤＮＡ，ＩＮＤ．Ｍ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ参照）に従い、全ＤＮＡを調製した。
すなわち、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）の存在下でスフェロプラストを１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで溶解し、その溶解物をクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）で処理してタンパク質を除去した後、膵ＲＮａｓｅ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．：５０μｇ／ｍｌ）処理し、エタノールで沈澱させ、得られた粗ＤＮＡをＰＣＲ法に用いた。
他の前記カンジダ菌株については、前記と同様のスフェロプラスト溶解物をクロロホルム−フェノール（１：１）で抽出処理してタンパク質を除いた後、膵ＲＮａｓｅで処理し、エタノール沈澱により粗ＤＮＡを調製し、これらを後述のハイブリダイゼーション及びＰＣＲ法に用いた。
又、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒト由来細胞株、及び各種細菌の粗ＤＮＡは、Ｒｅｓｔｒｅｐｏらの方法（Ｒｅｓｔｒｅｐｏ，Ｂ．Ｉ．，ｅｔａｌ，１９８９，Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ１８ＳｒＤＮＡｓｆｒｏｍｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｕｓＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：５５９６−５６００）、及びＭａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）により調製した。
【００２４】
＜実施例２＞
血液検体中の菌体からのＤＮＡの調製
血液検体からのカンジダアルビカンスのＤＮＡの調製は、人の血液０．１ｍｌに０．４５％−ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０と６０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅを含むトリトン−トリス緩衝液［１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］０．９ｍｌを加え、５５℃で１０分間保持した後、カンジダトロピカリスの生菌又は加熱死菌１０^５細胞をキャリヤーとして加え、１２，５００×ｇ、７秒間遠心し、得られた沈澱をカンジダアルビカンスの因子５に対する抗体ＭＡｂ−５を含有している無菌のマウス腹水（抗体価１：３２０）１２５μｌに懸濁する。
５分間氷冷後、生じたカンジダアルビカンスとカンジダトロピカリスの凝集塊を、トリトン−トリス緩衝液１ｍｌに懸濁し、遠心する。得られた沈澱を、同じ緩衝液を用いて更に２回、洗浄し、最後に、蒸留水で洗浄する。菌体に、ザイモリエース６００００（生化学工業、０．５ｍｇ／ｍｌ）と２％メルカプトエタノールを含んでいるＳＥ緩衝液［１Ｍソルビトール−０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）］０．１ｍｌを加え、３７℃、１５分の処理により、スフェロプラストを得る。ＳＥ緩衝液で２回洗浄後、０．４５％−ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０と６０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを含有するＰＣＲ緩衝液［８０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）］に懸濁して５５℃、２０分保持した後、９５℃、１０分の熱処理を行い、遠心して、その上清をＤＮＡ抽出液として用いた。
【００２５】
＜実施例３＞
ＤＮＡプローブの調製（カンジダアルビカンス−ＤＮＡの特異的な検出に用いることのできるＤＮＡ断片の調製）
プラスミドベクターｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位で連結した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９に移入して作製したカンジダアルビカンスの遺伝子ライブラリー（Ｍｉｙａｋａｗａｅｔａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：８９４−９００）から、カンジダアルビカンスの特異的ＤＮＡ断片ＥＯ３（約２ｋｂ）を得た（図１参照）。
次に、ＥＯ３を制限酵素ＡｃｃＩとＨｉｎｃＩＩで処理した後、反応産物をアガロースゲル電気泳動して２２５ｂｐのバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（フナコシ）を用いて抽出した。得られた２２５塩基のＤＮＡ断片（ＡｃｃＩ−ＨｉｎｃＩＩ）をプローブとして用いた。このＤＮＡ断片（以下、ＡＨ２２と称する）は、前記プライマー１及びプライマー２を使用してＰＣＲ法により増幅される１２５塩基の領域をカバーしている。
【００２６】
＜実施例４＞
ＤＮＡプローブの標識
カンジダアルビカンス由来のＥＯ３から調製したＡＨ２２をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ：３，０００Ｃｉ／ミリモル）で標識し、ニックカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ）で精製した。
【００２７】
＜実施例５＞
プライマーの合成
プローブに用いるＡＨ２２の部分塩基配列に基づき、ＰＣＲに用いる一対のプライマー（２０ｍｅｒ）をＤＮＡ合成装置で作製した。３８１Ａ型自動ＤＮＡ合成装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に、シトシンＣＰＧカラムを装着してプライマー１［５’−ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣ−３’］、及びチミンＣＰＧカラムを装着してプライマー２［５’−ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴ−３’］を合成した。
【００２８】
アンモニア水（約３０％）２．５ｍｌを入れたディスポシリンジ（２．５ｍｌ）を、合成工程が完了したＣＰＧカラムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出して、合成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収したＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、５５℃で６時間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ７．４）に溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型高速液体クロマトグラフィー装置（日立製作所）（以下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％アセトニトリルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニトリルとによる濃度勾配を用いて精製し、メインピークを集めた。得られた沈渣に８０％酢酸（アセトニトリルで調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してから減圧乾燥した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解し、ジエチルエーテルで抽出してから、２回目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピークを集めた。こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを減圧乾燥して保存し、後記の実施例で用いた。
【００２９】
＜実施例６＞
プライマーペアーの特異性
Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが産生する耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）１．２５Ｕを反応液２５μｌ［８０ｍＭ−ＫＣｌ、１．５ｍＭ−ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．９）、０．０５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、０．１％コール酸ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００（東洋紡）、５０μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、特に記載しない限り標的ＤＮＡ２５０μｇ及び各プライマー０．１μＭを含む］に加えた。ＤＮＡをＰＣＲプロセッサー（Ｚｙｍｏｒｅａｃｔｏｒ：ＡｔｔｏＣｏｒｐ．）中で、
熱変性：９４℃で１分間
アニーリング（二重鎖形成反応）：５６℃で２．５分間
プライマー延伸反応：７２℃で３分間
のサイクルを３５回繰り返し行って増幅させた。最終サイクルでは、ＰＣＲの残存産物を完全な二重鎖とするため更に７２℃で７分間反応させた。
【００３０】
実施例１で得た粗ＤＮＡを用い、３５サイクルのＰＣＲ処理の後、そのＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により分析した。結果を図２及び表１に示す。
なお、図２中（Ａ）はエチジウムブロマイド染色、（Ｂ）はプローブＡｃｃＩ−ＨｉｎｃＩＩによるサザンブロットハイブリダイゼイションの結果を示す。
ブロッティングしたＤＮＡは以下の通りである。
カンジダアルビカンスＭ１０１２Ａ血清型
カンジダアルビカンスＭ１４４５Ｂ血清型
カンジダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｍ１０１７
カンジダギラモンディー（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｍ１０２３
カンジダクルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）Ｍ１００５
カンジダパラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）Ｍ１０１５
カンジダケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）Ｍ１００４
カンジダグラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）Ｍ４００２
サッカロミセスセレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＬ２０
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３
カンジダアルビカンスＡ血清型５株
カンジダアルビカンスＢ血清型５株
【００３１】
図２から明かな通り、カンジダ属の７菌種を初めとする１２標準菌株のうち、カンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型のＤＮＡにのみ１２５塩基断片が検出され、その他の株では増幅されたバンドは認められなかった。
又、下記表１には、標準株以外に多数の株についてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析した結果を示す。カンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型の３５株全てにおいて１２５塩基断片が観察された。一方、カンジダアルビカンスに属していない菌株及びヒト細胞株においては、増幅されたＤＮＡ断片は全く検出されなかった。
なお、現在分類学上カンジダアルビカンスに帰属しているカンジダステライトイデア１３株についてもテストした１３株すべてについてＰＣＲ陽性であった（表１参照）。
【００３２】

前記表中のａ，ｂ，ｃはの表す内容は次の通りである。
ａ：エチジウムブロマイド染色
ｂ：プローブＡＨ２２とのサザンブロットハイブリダイゼーション
ｃ：現在Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓに属すると考えられている（Ｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄ．Ｇ．Ａｈｅａｒｎ，ａｎｄＤ．Ｙａｒｒｏｗ．１９８４．Ｇｅｎｕｓ４．ＣａｎｄｉｄａＢｅｒｋｈｏｕｔ，ｐ．５８５−８４４．ＩｎＮ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎＲｉｊ（ｅｄ．），ＴｈｅＹｅａｓｔ：ａｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ，３ｒｄｅｄ．ＥｒｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＢ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｒｄａｍ．）
【００３３】
＜実施例７＞
ＰＣＲの感度
カンジダアルビカンスを検出する感度を調べるために、実施例２に記載した方法で、１０^４、１０^３、１０^２、１０及び３個のカンジダアルビカンスの細胞を含んだ検体から調製したＤＮＡを、ＰＣＲ反応液２５μｌに加え、各増幅産物をアガロース電気泳動及び実施例４で調製したプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼイションで解析した（実施例６参照）。その結果を図３に示す。
図３によれば、エチジウムブロマイド染色による検出限界はカンジダアルビカンス１０細胞であるのに対し、サザンブロットハイブリダイゼイションでは３細胞まで可能である。血液検体中の菌体からＤＮＡを調製する際にカンジダトロピカリスだけを加えた場合には、エチジウムブロマイド染色においては、カンジダアルビカンス１００細胞が検出限界であったが、カンジダトロピカリスと因子抗体ＭＡｂ−５の両方を加えてＤＮＡを調製した場合には、感度がほぼ１０倍上昇した。
【００３４】
【発明の効果】
（１）本発明によるプライマー１とプライマー２との組み合わせを用いるＰＣＲ法により、カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）由来の約２ｋｂのＤＮＡ領域（ＥＯ３）の内の１２５塩基の領域を特異的に増幅することが出来る。このＤＮＡ領域はカンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型のいずれにおいても特異的に存在するのに対し、他のカンジダ属に属する菌には存在しない。従って、本発明のプライマーによって其の領域の塩基配列を増幅し、ＤＮＡ検査工程として好ましくは本発明のプローブを使用すると、試料中に少量のＤＮＡしか存在しなくても、カンジダアルビカンスを特異的に検出することができる。
【００３５】
（２）カンジダアルビカンスｍｔＤＮＡ由来の約２ｋｂのＤＮＡ断片ＥＯ３を制限酵素ＡｃｃＩ及びＨｉｎｃＩＩで処理して得られる２２５塩基のＡＨ２２をプローブとすることにより、カンジダアルビカンスを特異的に検出することができる。
【００３６】
（３）カンジダアルビカンスを少量しか含んでいない検体からのカンジダアルビカンスのＤＮＡの調製法として、検体にカンジダトロピカリスをキャリヤーとして加え、遠心して得られる沈渣にカンジダアルビカンスとカンジダトロピカリスに共通のマンナンの抗原因子５に対する抗体ＭＡｂ−５を加えて懸濁することにより検体中のカンジダアルビカンスの細胞を失わないように注意することによりＰＣＲ法による検出感度を上げることができる。
【００３７】
（４）上記の方法で実検体から調製したカンジダアルビカンスのＤＮＡ標品を用いて、ＰＣＲ法とＡＨ２２基を組み合わせると、検体中にカンジダアルビカンスが３細胞あれば検出できる。以上のように、本発明は特異性と感度の優れた新しいカンジダアルビカンスの迅速検出及びカンジダ症の迅速診断手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カンジダアルビカンスＤＮＡ由来のＤＮＡ断片ＥＯ３の中でのプローブ設定位置、プライマーで増幅される部分を示した図である。
【図２】（Ａ）プライマーの特異性を、エチジウムブロマイド染色によって分析した結果を示す図（写真）である。
（Ｂ）プライマーの特異性を、サザンブロットハイブリダイゼイションによって分析した結果を示す図（写真）である。
【図３】（Ａ）カンジダアルビカンスを検出する感度を、エチジウムブロマイド染色によって分析し、その結果を示す図（写真）である。
（Ｂ）カンジダアルビカンスを検出する感度を、サザンブロットハイブリダイゼイションによって分析し、その結果を示す図（写真）である。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a method for detecting Candida albicans, a DNA fragment for detecting Candida albicans, and a probe for detecting Candida albicans. More specifically, the present invention specifically detects even a very small amount of Candida albicans contained in a biological sample. The present invention relates to a detection method, a DNA fragment for detection, and a probe for detection.
[0002]
[Prior art]
Candida albicans is an important pathogen for immunocompromised patients. For the diagnosis of candidiasis, a serological method for detecting an antigen or an antibody has been conventionally used. However, in the antibody detection method, there is a problem as a diagnostic method because a decrease in antibody production ability is observed in patients with reduced immune function, and conversely, healthy people also show a high antibody titer. . On the other hand, in the antigen detection method, the specimen contains at least 10 pathogenic bacteria. ⁵ Since there is a problem in sensitivity that detection is not possible if there is no individual, an operation such as culture of bacteria was required. As described above, conventionally, there has been no good diagnostic method for candidiasis.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have degraded the DNA of Candida albicans using a restriction enzyme in order to rapidly and surely detect Candida albicans, and obtained a DNA fragment specific to the obtained Candida albicans. From the base sequence of this DNA fragment, a base sequence was selected and a complementary DNA was synthesized. As a result, it was found that it could be used favorably as a primer for PCR (Polymerase Chain Reaction). The present invention is based on these findings.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made in view of the above, and comprises a method for detecting Candida albicans, a DNA fragment for detecting Candida albicans, and a probe for detecting Candida albicans according to the following claims (1) to (6). I have.
(1) (1) a first DNA primer having an oligonucleotide portion of at least 15 bases of the base sequence of the following primer 1
(2) a combination of a second DNA primer containing an oligonucleotide portion of at least 15 bases in the base sequence of the following primer 2,
(3) DNA polymerase,
(4) DNA extract from Candida albicans in the test sample
A method for detecting Candida albicans, comprising subjecting a mixture comprising the following to a DNA amplification step, and subsequently subjecting the resulting reaction solution to a DNA inspection step.
Primer 1: 5 'CACCACTCGACCAGTAGGC-3'
Primer 2: 5'CGGGTGGTCTATAATTGAGAT-3 '
(2) In preparing a DNA extract derived from Candida albicans in a test sample, Candida tropicalis, which has Candida albicans antigen factor 5 in common, is added to the test sample as a carrier, and the anti-factor 5 antibody MAb (5) The method for detecting Candida albicans according to (1), wherein an aggregate (Candida albicans and Candida tropicalis) is formed in the coexistence, and a DNA extract derived from Candida albicans is prepared from the aggregate.
(3) A DNA fragment for detecting Candida albicans, comprising the following 225 bases:
ATACG CTACC TGACC CCACC TGAAA
TATAA TACCC CAGGT GGGCC TGCCC
CACCC ACCAA CTCGA CCAGT AGGCC
AGCTG CTTCC GCCCT TTATT TAATA
TTTAT TTATT AGGAA TTATT TTCCT
TACCT ATAAA AATAA TATTT TATAT
ATAGA AGATA TCTCA ATAGA GACCA
CCCGA CCTAC CGCAT AAATG TGGTG
AGGGA TAAAC CCCAC ATTGT GGGTT
(4) The method according to claim 3, wherein the mitochondrial DNA of Candida albicans is digested with a restriction enzyme EcoO1091 to obtain a DNA fragment (EO3) of about 2 kb, which is further reacted with two types of restriction enzymes AccI and HincII. DNA fragment for detection of Candida albicans.
(5) A probe for detecting Candida albicans labeled with the DNA fragment according to (3) or (4).
(6) A method for detecting Candida albicans, which comprises contacting the probe according to (5) with a test sample (a DNA extract derived from Candida albicans in the test sample) and detecting a signal from the probe. .
[0005]
In the base sequence herein, A is an adenine residue, C is a cytosine residue, G is a guanine residue, and T is a thymine residue.
[0006]
The test sample used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample suspected of containing Candida albicans. For example, blood, saliva, pharyngeal swabs, tissue sections and the like can be used.
[0007]
The first method for detecting Candida albicans according to the present invention comprises (a) a DNA amplification step and (b) a DNA test step.
In the DNA amplification step (a), a PCR (Polymerase Chain Reaction) method can be used. When the PCR method is used, only a target DNA region can be automatically amplified to about one million times from a small amount of DNA (see Science, 239: 487-492). In the PCR method, two types of DNA primers are used: a primer for the + strand (hereinafter, referred to as a first primer) and a primer for the − strand (hereinafter, referred to as a second primer) across the DNA region to be amplified.
[0008]
In the DNA amplification step (a) of the present invention, by using a combination of the first primer and the second primer, only the following 125 base region derived from mitochondrial DNA of Candida albicans can be specifically amplified.
ACCCA ACTCG ACCAG TAGGC CAGCT
GCTTC CGCCC TTTAT TTAAT ATTTA
TTTAT TAGGA ATTAT TTTCC TTACC
TATAA AAATA ATATT TTATA TATAT
AAGAT ATCTC AATAT AGACC ACCCG
[0009]
The first primer and the second primer may each have a length of 15 mer to 30 mer, but are generally preferably 20 mer to 25 mer. The first primer and the second primer only need to contain an oligonucleotide of at least 15 bases among the bases represented by [5′CACCAACTCGACCAGTAGGC-3 ′] or [5′CGGGTGGTCTATATTGAGAT-3 ′]. If the first and second primers are less than 15 mer, the specificity during annealing will decrease and non-specific binding will increase. On the other hand, if it exceeds 30 mer, it is not preferable because a double strand is easily formed between primer molecules or within the molecule.
Each base constituting each of the first primer and the second primer used in the method of the present invention may be modified (for example, labeled with biotin or a luminescent substance) in any known manner.
[0010]
Each of the first and second primers according to the present invention can be prepared by a known DNA synthesis method (for example, a phosphoramidite method) using an ordinary DNA synthesizer (for example, manufactured by Applied Biosystems). I can do it.
[0011]
In the DNA amplification step (a) of the present invention, the amplification cycle is repeated using a DNA polymerase, for example, a thermostable DNA polymerase, together with the first primer and the second primer. As the thermostable polymerase, a polymerase capable of maintaining its activity at a temperature of particularly up to 95 ° C. can be used.
[0012]
In the DNA amplification step (a) of the present invention, a mixture containing the specific combination of the first primer and the second primer, a DNA polymerase, and a DNA extract derived from Candida albicans in a test sample is used. The amounts of the first primer, the second primer, and the DNA polymerase vary depending on the type of the test sample, but can be easily determined within a range where the DNA amplification step by the PCR method can be performed. The mixture can optionally contain a buffer (eg, Tris-HCl buffer), a stabilizer (eg, gelatin), or salts (eg, sodium chloride).
[0013]
In the method of the present invention, an amplification cycle of the PCR method is performed using the above-mentioned mixture. The amplification cycle is
(I) DNA denaturation step (at 90 ° C. to 95 ° C. for about 10 seconds to about 2 minutes)
(Ii) an annealing step of the single-stranded DNA with the first primer and the second primer (at about 37 ° C. to 70 ° C. for about 30 seconds to about 3 minutes), and
(Iii) a DNA synthesis step using DNA volimerase (at about 65 ° C. to 80 ° C. for about 30 seconds to about 5 minutes). Every cycle, the amount of DNA is amplified about twice, and after n cycles, 2 times. ⁿ It is amplified twice. In the present invention, the above amplification cycle is repeated 10 to 60 times, preferably 20 to 40 times. In the last cycle, the heating time in step (iii) is preferably extended for about 5 to 10 minutes so that the DNA synthesis is completely performed.
[0014]
When Candida albicans is present in the test sample, a large amount of a 125 base pair DNA fragment is synthesized after the completion of the amplification cycle. This DNA fragment is detected in the next DNA test step.
[0015]
As the DNA test step (b), a method using gel electrophoresis and ethidium bromide staining, a Southern blot hybrid method, a nucleotide sequence determination method using the dideoxy method, and the like can be used. When performing gel electrophoresis, for example, submarine electrophoresis using an agarose gel as a carrier or slab electrophoresis using acrylamide can be used.
[0016]
When performing the Southern blot hybrid method or the in situ hybrid method, a non-radioactive probe (for example, an enzyme-labeled probe, a biotinylated probe, a digoxigeninated probe, or a probe labeled with a chemiluminescent substance or a fluorescent substance) may be used. it can. Further, when a base sequence determination method by the dideoxy method is used, a DNA autosequencer using a fluorescent label (Applied Biosystems) or the like can be used.
[0017]
The present invention further provides a DNA fragment and a DNA probe that can be used for specific detection of Candida albicans-DNA.
When EO3, which is a DNA fragment of about 2 kb, obtained by digesting Candida albicans mitochondrial DNA with EcoO1091, is treated with restriction enzymes AccI and HincII, 125 base pairs amplified by PCR using the primers 1 and 2 described above. A DNA fragment of about 0.2 kbp containing the nucleotide sequence of This can be labeled and used as a probe.
[0018]
The second method for detecting Candida albicans according to the present invention uses this DNA probe (the above-described DNA fragment of about 0.2 kbp). This DNA probe can specifically recognize Candida albicans DNA whether the test sample has undergone a DNA amplification step by the PCR method or the in situ hybrid method. As the labeling substance of the probe, any conventionally known substance, for example, ³² A radioactive substance such as P, preferably a non-radioactive substance (enzyme, fluorescent dye, luminescent substance, biotin, etc.) can be used. As a method for generating a signal from the labeling substance and further measuring the signal, any conventionally known method is used.
[0019]
In the method of the present invention, only in the case where Candida albicans is present in the subject sample, the following 125 bases DNA fragment can be produced in a short time by the PCR method using the combination of the first primer and the second primer. Is amplified and synthesized specifically in large quantities.
ACCCA ACTCG ACCAG TAGGC CAGCT
GCTTC CGCCC TTTAT TTAAT ATTTA
TTTAT TAGGA ATTAT TTTCC TTACC
TATAA AAATA ATATT TTATA TATAT
AAGAT ATCTC AATAT AGACC ACCCG
Therefore, the presence of Candida albicans in the test sample can be detected very specifically. Further, even if the amount of Candida albicans in the test sample is very small, a DNA fragment of 125 bases is amplified and synthesized, so that the sensitivity is high.
In the method of the present invention, a labeled DNA probe specific to Candida albicans-DNA is used, so that Candida albicans can be detected extremely accurately.
[0020]
Furthermore, when the amplification step using the first primer and the second primer and the test step using the probe are used together, the time required for the test is about 4 to 5 hours in the case of ethidium staining, and the Southern blot hybrid method is used. Even if it is performed, it may be about 48 to 50 hours, and the result can be obtained quickly.
[0021]
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention. The standard strains (14 strains) used in the following examples are as follows.
Candida albicans M1012A serotype
Candida albicans M1445 serotype
C. tropicalis M1017
C. guilliermondii M1023
C. krusei M1005
C. parapsilosis M1015
C. kefir M1004
C. glabrata M4002
Saccharomyces cerevisiae LL20
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Escherichia coli JM109
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Cryptococcus neoformans NIH-68
Human oral squamous cell carcinoma HSC-2 cell line
[0022]
Various test Candida strains used in the following examples are stocks of Meiji Pharmaceutical University, Yatron Co., Ltd., and RIKEN (JCM: Japan Collection of Microorganisms). The identification of Candida strains was carried out by conventional biological methods and by polyclonal factor serum (Candida Check: Jatron). The yeast was cultured at 27 ° C. in a Sabouraud medium (Difco), and the bacteria were cultured at 37 ° C. in a normal nutrient liquid medium (Eiken).
[0023]
【Example】
<Example 1>
Preparation of DNA from the cells obtained by culturing the 14 strains was performed as follows. Candida albicans A serotype M1012 strain (obtained from Meiji Pharmaceutical University) was converted into spheroplasts by Zymoliase (Torres-Bauza, LJ, et al, 1980, Protoplasts from marine medicines and marine medicines). J. Gen. Microbiol. 119: 341-349), and the method of Cryer et al. (Cryer, DR, et al, 1975, Isolation of yeast DNA, IND M. Prescott (ed.), Methods in biol. , Vol. 12, Academic Press, New York).
That is, spheroplasts were dissolved in 1% (w / v) SDS in the presence of proteinase K (Merck & Co.), and the lysate was treated with chloroform-isoamyl alcohol (24: 1) to remove proteins. After that, the cells were treated with pancreatic RNase (Sigma Chem. Co .: 50 μg / ml), precipitated with ethanol, and the obtained crude DNA was used for PCR.
For other Candida strains, the same spheroplast lysate as above was extracted with chloroform-phenol (1: 1) to remove proteins, then treated with pancreatic RNase, and crude DNA was prepared by ethanol precipitation. These were used in the hybridization and PCR described below.
Cryptococcus neoformans, C. neoformans, human-derived cell lines, and crude DNAs of various bacteria can be obtained by the method of Restrepo et al. (Restrepo, BI, et al, 1989, Cloning of 18S rDNAs from the functional fungus). J. Bacteriol., 171: 5596-5600) and the method of Maniatis et al. (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular cloning: a laboratory in the state of Colorado, Canada). .).
[0024]
<Example 2>
Preparation of DNA from cells in blood samples
Preparation of DNA of Candida albicans from a blood sample was performed using a Triton-Tris buffer [1% Triton X-100, 10 mM, containing 0.45% Nonidet P-40 and 60 μg / ml Proteinase in 0.1 ml of human blood. Tris-HCl (pH 7.5)], and the mixture was kept at 55 ° C. for 10 minutes. ⁵ The cells are added as a carrier, centrifuged at 12,500 × g for 7 seconds, and the resulting precipitate is reconstituted in 125 μl of sterile mouse ascites (antibody titer 1: 320) containing MAb-5, an antibody against Candida albicans factor 5 Suspend.
After cooling on ice for 5 minutes, the resulting aggregates of Candida albicans and Candida tropicalis are suspended in 1 ml of Triton-Tris buffer and centrifuged. The precipitate obtained is washed twice more with the same buffer and finally with distilled water. To the cells, 0.1 ml of SE buffer [1 M sorbitol-0.1 M EDTA (pH 7.5)] containing Zymolyase 60000 (Seikagaku Corporation, 0.5 mg / ml) and 2% mercaptoethanol were added, and 37 Spheroplasts are obtained by treatment at 15 ° C. for 15 minutes. After washing twice with the SE buffer, a PCR buffer containing 0.45% -Nonidet P-40 and 60 μg / ml Proteinase K [80 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 ₂ , 10 mM Tris-HCl (pH 8.9)], kept at 55 ° C for 20 minutes, heat-treated at 95 ° C for 10 minutes, centrifuged, and used the supernatant as a DNA extract.
[0025]
<Example 3>
Preparation of DNA probe (Preparation of DNA fragment that can be used for specific detection of Candida albicans-DNA)
After ligation at the SmaI site of the plasmid vector pUC118, the gene library of Candida albicans prepared by transfer into Escherichia coli (E. coli) JM109 (Miyakawa et al., Isolation and characterization of the specific-specific DNA characterization DNA fragment) was prepared. albicans by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 30: 894-900), a specific DNA fragment EO3 (about 2 kb) of Candida albicans was obtained (see FIG. 1).
Next, after treating EO3 with the restriction enzymes AccI and HincII, the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis to cut out a 225 bp band, and extracted using Geneclean (Funakoshi). The obtained 225-base DNA fragment (AccI-HincII) was used as a probe. This DNA fragment (hereinafter referred to as AH22) covers a region of 125 bases amplified by the PCR method using the primers 1 and 2.
[0026]
<Example 4>
Labeling of DNA probe
AH22 prepared from EO3 derived from Candida albicans was purified using a random primer DNA labeling kit (Takara Shuzo) [α- ³² [P] dCTP (Amersham International plc: 3,000 Ci / mmol) and purified with a nick column (Pharmacia LKB).
[0027]
<Example 5>
Primer synthesis
Based on the partial base sequence of AH22 used for the probe, a pair of primers (20mer) used for PCR was prepared using a DNA synthesizer. A type 381A automatic DNA synthesizer (Applied Biosystems, Inc.) was equipped with a cytosine CPG column and a primer 1 [5′-CACCAACTCGACCAGTAGGC-3 ′], and a thymine CPG column was fitted with a primer 2 [5′-CGGGTGGTCTTATATGATGAT- 3 ′] was synthesized.
[0028]
A disposable syringe (2.5 ml) containing 2.5 ml of aqueous ammonia (about 30%) was connected to the CPG column in which the synthesis step was completed, and the aqueous ammonia was extruded into the column to elute the synthesized DNA fragment. The vial containing the recovered DNA ammonia solution was sealed, heated at 55 ° C. for 6 hours, cooled to room temperature, and concentrated. The concentrate is lyophilized, dissolved in 10 mM triethylammonium acetate (hereinafter, referred to as TEA-A) (pH 7.4), and the precipitate is removed. Then, an L-6200 type high performance liquid chromatography apparatus (Hitachi, Ltd.) , HPLC), equipped with a separation column (YMC-Pack ODS-AM313: YMC), purified using a concentration gradient of 95 mM-TEA-A containing 5% acetonitrile and acetonitrile, and purified the main peak. collected. The obtained precipitate was suspended by adding 80% acetic acid (adjusted with acetonitrile), kept at room temperature for 30 minutes, and dried under reduced pressure. The dried product was dissolved in 10 mM-TEA-A, extracted with diethyl ether, purified by a second HPLC, and the main peak was collected. The purified DNA primer thus obtained was dried under reduced pressure and stored, and used in Examples described later.
[0029]
<Example 6>
Specificity of primer pair
1.25 U of a heat-resistant DNA polymerase (Toyobo) produced by Thermus thermophilus was added to 25 μl of a reaction solution [80 mM-KCl, 1.5 mM-MgCl ₂ 10 mM Tris-HCl (pH 8.9), 0.05% (w / v) bovine serum albumin, 0.1% sodium cholate, 0.1% Triton X-100 (Toyobo), 50 μM dGTP, dATP, dTTP And dCTP (Perkin-Elmer), unless otherwise specified, containing 250 μg of target DNA and 0.1 μM of each primer]. The DNA was subjected to PCR in a PCR processor (Zyreactor: Atto Corp.).
Thermal denaturation: 94 ° C for 1 minute
Annealing (duplex formation reaction): 56 ° C. for 2.5 minutes
Primer extension reaction: 3 minutes at 72 ° C
This cycle was repeated 35 times to amplify. In the final cycle, the reaction was further performed at 72 ° C. for 7 minutes in order to convert the remaining product of the PCR into a complete duplex.
[0030]
After 35 cycles of PCR treatment using the crude DNA obtained in Example 1, the PCR product was analyzed by agarose electrophoresis. The results are shown in FIG.
In FIG. 2, (A) shows ethidium bromide staining, and (B) shows the results of Southern blot hybridization using the probe AccI-HincII.
The blotted DNA is as follows.
Candida albicans M1012A serotype
Candida albicans M1445B serotype
C. tropicalis M1017
C. guilliermondii M1023
C. krusei M1005
C. parapsilosis M1015
C. kefir M1004
C. glabrata M4002
Saccharomyces cerevisiae LL20
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Escherichia coli JM109
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
5 strains of Candida albicans A serotype
Candida albicans B serotype 5 strains
[0031]
As is clear from FIG. 2, of the 12 standard strains including 7 strains of the genus Candida, a 125 base fragment was detected only in DNA of serotypes A and B of Candida albicans, and amplified in other strains. No band was observed.
Table 1 below shows the results obtained by performing PCR on a large number of strains other than the standard strain, and analyzing the PCR products on an agarose gel. A 125 base fragment was observed in all 35 strains of Candida albicans serotypes A and B. On the other hand, in the strains not belonging to Candida albicans and the human cell lines, no amplified DNA fragments were detected.
In addition, all 13 tested Candida stellite ideas belonging to Candida albicans taxonomically were also PCR-positive (see Table 1).
[0032]

The contents represented by a, b, and c in the above table are as follows.
a: ethidium bromide staining
b: Southern blot hybridization with probe AH22
c: Currently considered to belong to Candida albicans (Meyer, SA, DG Ahern, and D. Yarrow. 1984. Genus 4. Candida Berkhout, p. 585-844. In NJ. W. Kreger-van Rij (ed.), The Year: a taxonomic study, 3rd ed. Ersevier Science Publishers BV, Amsterdam.)
[0033]
<Example 7>
PCR sensitivity
In order to examine the sensitivity for detecting Candida albicans, the method described in Example 2 ⁴ , 10 ³ , 10 ² DNA prepared from a sample containing 10 and 3 Candida albicans cells was added to 25 μl of a PCR reaction solution, and each amplification product was subjected to agarose electrophoresis and Southern blot hybridization using the probe prepared in Example 4. (See Example 6). The result is shown in FIG.
According to FIG. 3, the limit of detection by ethidium bromide staining is 10 cells of Candida albicans, while up to 3 cells can be detected by Southern blot hybridization. When only Candida tropicalis was added when preparing DNA from cells in a blood sample, Candida albicans 100 cells were the detection limit in ethidium bromide staining, but Candida tropicalis and the factor antibody MAb- When DNA was prepared by adding both of them, the sensitivity was increased almost 10-fold.
[0034]
【The invention's effect】
(1) The PCR method using the combination of the primer 1 and the primer 2 according to the present invention specifically amplifies a region of 125 bases in a DNA region (EO3) of about 2 kb derived from mitochondrial DNA (mtDNA) of Candida albicans. You can do it. This DNA region is specifically present in both Candida albicans serotypes A and B, whereas it is not present in bacteria belonging to other Candida species. Therefore, by amplifying the base sequence of the region by the primer of the present invention and preferably using the probe of the present invention as a DNA testing step, even if only a small amount of DNA is present in the sample, Candida albicans can be specifically Can be detected.
[0035]
(2) Candida albicans can be specifically detected by using a 225-base AH22 obtained by treating a DNA fragment EO3 of about 2 kb derived from Candida albicans mtDNA with restriction enzymes AccI and HincII as a probe.
[0036]
(3) As a method for preparing DNA of Candida albicans from a sample containing only a small amount of Candida albicans, Candida albicans is added as a carrier to the sample, and the sediment obtained by centrifugation is mixed with Candida albicans and Mannan common to Candida tropicalis. By adding and suspending the antibody MAb-5 against antigen factor 5, care is taken not to lose Candida albicans cells in the sample, whereby the detection sensitivity by the PCR method can be increased.
[0037]
(4) Using a DNA sample of Candida albicans prepared from an actual sample by the above-described method and combining the PCR method and the AH22 group, the sample can be detected if there are 3 cells of Candida albicans in the sample. As described above, the present invention can provide a novel means for rapid detection of Candida albicans with excellent specificity and sensitivity and a means for rapid diagnosis of candidiasis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a probe setting position in a DNA fragment EO3 derived from Candida albicans DNA and a portion amplified by a primer.
FIG. 2 (A) is a diagram (photograph) showing the result of analyzing the specificity of a primer by ethidium bromide staining.
(B) A diagram (photograph) showing the results of analyzing the specificity of the primers by Southern blot hybridization.
FIG. 3 (A) is a diagram (photograph) showing the results of analyzing the sensitivity of detecting Candida albicans by ethidium bromide staining.
(B) A diagram (photograph) showing the results of analyzing the sensitivity of detecting Candida albicans by Southern blot hybridization and the results.

Claims

(1) a first DNA primer having an oligonucleotide portion of at least 15 bases of the base sequence of the following primer 1 and (2) a second DNA primer containing an oligonucleotide portion of at least 15 bases of the base sequence of the following primer 2 And a combination of
(3) DNA polymerase,
{Circle around (4)} Candida albicans characterized in that a mixture containing a DNA extract derived from Candida albicans in a test sample is subjected to a DNA amplification step, and then the obtained reaction solution is subjected to a DNA inspection step. ) Detection method.
Primer 1: 5 'CACCACTCGACCAGTAGGC-3'
Primer 2: 5'CGGGTGGTCTATAATTGAGAT-3 '

In preparing a DNA extract derived from Candida albicans in a test sample, Candida tropicalis, which has Candida albicans antigen factor 5 in common, is added to the test sample as a carrier, and an anti-factor 5 antibody is added. The method for detecting Candida albicans according to claim 1, wherein an aggregate (Candida albicans and Candida tropicalis) is formed in the presence of MAb-5, and a DNA extract derived from Candida albicans is prepared from the aggregate.

A DNA fragment for detecting Candida albicans, comprising the following 225 bases:
ATACG CTACC TGACC CCACC TGAAA
TATAA TACCC CAGGT GGGCC TGCCC
CACCC ACCAA CTCGA CCAGT AGGCC
AGCTG CTTCC GCCCT TTATT TAATA
TTTAT TTATT AGGAA TTATT TTCCT
TACCT ATAAA AATAA TATTT TATAT
ATAGA AGATA TCTCA ATAGA GACCA
CCCGA CCTAC CGCAT AAATG TGGTG
AGGGA TAAAC CCCAC ATTGT GGGTT

The Candida albicans detection according to claim 3, wherein the mitochondrial DNA of Candida albicans is digested with a restriction enzyme EcoO1091 to obtain a DNA fragment (EO3) of about 2 kb, which is further treated with two types of restriction enzymes AccI and HincII. DNA fragment for use.

A Candida albicans detection probe labeled with the DNA fragment according to claim 3 or 4.

A method for detecting Candida albicans, comprising contacting the probe according to claim 5 with a test sample (a DNA extract derived from Candida albicans in the test sample) and detecting a signal from the probe.