JP3568522B2 - リンパ球遊走に不可欠なｄｏｃｋ２の機能ドメイン及び会合分子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、欠失変異体を用いたＤＯＣＫ２機能ドメインの同定や、ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとの結合を干渉する物質のスクリーニング、とりわけＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯとＴｉａｍ等のＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、これらスクリーニング方法を利用するアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬の探索方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫応答は、生体にとって感染に対する必須の防御機構であり、免疫細胞は、種々の感染源に迅速に対処すべく生体内を常にパトロールしている。このように構成細胞が絶えず動き回るという特徴は、他の生命複雑系においては認められず、免疫系独自に進化したものである。免疫細胞のうち、好中球、マクロファージといった細胞は感染の初期防御において機能する一方、Ｔリンパ球及びＢリンパ球はその抗原受容体を介して外来異物を認識することで抗原特異的な免疫応答を引き起こすことが知られている。上記Ｔ及びＢリンパ球は、胸腺、骨髄といった１次リンパ組織で分化し、脾臓、リンパ節、パイエル板（小腸のリンパ組織）といった２次リンパ組織の特定のコンパートメントへ移動した後、ここで、種々の組織から集められた抗原を、かかる抗原受容体を介して認識することにより特異的な免疫応答を惹起する。この際、リンパ球が２次リンパ組織の特定の部位に移動することは、免疫応答の成立において極めて重要である。これまで、リンパ球の移動が、種々のケモカインと総称されるタンパク質によって導かれることは知られているが、リンパ球の運動性そのものを制御する分子機構に関しては不明であった。
【０００３】
細胞運動には、細胞極性の変化と細胞骨格の再構築が必須であり（例えば、非特許文献１参照。）、これらはいずれもＲｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２といった低分子量Ｇタンパク質によって制御されていることが知られている（例えば、非特許文献２〜５参照。）。この中でもとりわけＲａｃは、葉状突起と呼ばれるアクチンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動力を提供している（例えば、非特許文献３，６参照。）。他方、線虫（Caenorhabditis elegans）、ヒト及びショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）において、ＣＥＤ５、ＤＯＣＫ１８０、Myoblast city（ＭＢＣ）という構造上相同性を示す分子が同定され、これらの分子はその頭文字をとってＣＤＭファミリー分子と呼ばれており、いずれもＲａｃの上流で機能することで細胞骨格の再構築に関与すると考えられている（例えば、非特許文献７〜１２参照。）。上記ＣＥＤ−５及びMyoblast Cityが特定タイプの細胞の運動に重要であることが突然変異体を用いた遺伝学的解析から明らかになっているが（例えば、非特許文献８，９，１２参照。）、ＣＤＭファミリータンパク質が、哺乳類において生理的にどのように機能するかは未だ不明であった。
【０００４】
ＤＯＣＫ２（ＫＩＡＡ０２０９；DNA Res. 3, 321-329）は、ヒト造血細胞で特異的に発現するＣＤＭファミリータンパク質の他のメンバーをコードし、上記ＤＯＣＫ２が２９３Ｔ腎細胞においてＲａｃに結合し、Ｒａｃを活性化することが知られている（例えば、非特許文献１３参照。）。一方、本発明者らは、マウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーよりＣＤＭファミリーに属する新規遺伝子Ｈｃｈを単離し、かかる遺伝子産物が１８２８のアミノ酸から成り、そのＮ末端にはＳＨ３ドメインがコードされていることを見い出した（例えば、非特許文献１４参照。）。また、マウス組織を用いたノーザンブロット解析において、ＤＯＣＫ１８０がさまざまな臓器に発現しているのに対して、Ｈｃｈの発現は胸腺及び脾臓に限局していることや、細胞株を用いた解析より２種類の変異Ｔ細胞株を除いて、Ｈｃｈの発現がＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージのいずれにおいても認められることを確認した。またＨｃｈの発現を欠く変異Ｔ細胞株にＨｃｈを導入することで細胞形態の著明な変化と接着性の亢進が観察されることを明らかにしている。Ｈｃｈのコードする１８２８アミノ酸のうち１６７７アミノ酸はヒトＤＯＣＫ２と同一であり、ＨｃｈはマウスＤＯＣＫ２ホモログと考えられたが、上記ＤＯＣＫ２の生理的機能は不明であった。
【０００５】
本発明者らは、上記のようにＣＤＭファミリーに属し、且つリンパ球特異的に発現する分子としてＤＯＣＫ２を同定し、ノックアウトマウスを作製することで、この分子がリンパ球遊走に不可欠であることを明らかにした（例えば、非特許文献１４参照。）。ＤＯＣＫ２欠損リンパ球では種々のケモカイン刺激によっても活性型Ｒａｃは検出できない。それ故、ＤＯＣＫ２はＲａｃの活性化を介してリンパ球遊走を制御していると考えられる。しかしながら、ＤＯＣＫ２がどのような機序でＲａｃを活性化するのか依然として不明である。Ｒａｃは分子スイッチとして機能し、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）により活性化される。ＤＯＣＫ２はＲａｃと結合するものの、その構造上ＧＥＦとして機能するとは考えにくい。それ故、ＤＯＣＫ２は他の分子を介してＧＥＦをリクルートすることによりＲａｃを活性化していると推測される。
【０００６】
最近、線虫において、ＣＤＭファミリー分子の一種であるＣＥＤ−５と会合し、細胞骨格を制御する分子であるＣＥＤ−１２が同定され、その哺乳類ホモログとしてＥＬＭＯ１，２，３が報告された（例えば、非特許文献１５参照。）。また、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）としてこれまでに数１０種類のものが知られており、これらＧＥＦの中でも、Ｒａｃ特異的なＧＥＦとして機能する分子として、胸腺腫細胞株の浸潤を規定するＴｉａｍ１，２（例えば、非特許文献１６、１７参照。）や、Ｔ細胞受容体シグナルを制御するＶａｖ１（例えば、非特許文献１８参照。）の他Ｖａｖ２、Ｖａｖ３や、Ｔｒｉｏ（例えば、非特許文献１９参照。）や、ＳＴＥＦ（例えば、非特許文献２０参照。）や、Ｐ−Ｒｅｘ１（例えば、非特許文献２１参照。）が知られており、これら５種類はいずれも共通のドメインをもっており、ＧＴＰをＲａｃに付与する機能を有している。
【０００７】
【非特許文献１】
Cell 84, 359-369, 1996
【非特許文献２】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5027-5031, 1995
【非特許文献３】
Science 279, 509-514 1998
【非特許文献４】
J. Cell Biol. 141, 1147-1157, 1998
【非特許文献５】
Science 287, 1037-1040, 2000
【非特許文献６】
Cell 103, 227-238, 2000
【非特許文献７】
Mol. Cell Biol. 16, 1770-1776, 1996
【非特許文献８】
J. Cell Biol. 138, 589-603, 1997
【非特許文献９】
Nature 392, 501-504, 1998
【非特許文献１０】
Genes Dev. 12, 3331-3336, 1998
【非特許文献１１】
Genes Dev. 12, 3337-3342, 1998
【非特許文献１２】
Nature Cell Biol. 2, 131-136, 2000
【非特許文献１３】
Biochem. Biophys. Acta 1452, 179-187, 1999
【非特許文献１４】
Nature, 412, 826-831, 2001
【非特許文献１５】
Cell, 107, 27-41, 2001
【非特許文献１６】
Cell, 77, 537-549, 1994
【非特許文献１７】
Nature, 375, 338-340, 1995
【非特許文献１８】
Nature, 385, 169-172, 1997
【非特許文献１９】
J. Cell Science, 113, 729-739, 2000
【非特許文献２０】
J. Biol. Chem., 277, 2860-2868, 2002
【非特許文献２１】
Cell, 108, 809-821, 2002
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
自己免疫疾患や移植片拒絶は、標的組織にリンパ球が浸潤することによりもたらされる。そのため、これらの疾患や病態を治療あるいは予防する上で、ＤＯＣＫ２は格好の標的分子になると考えられる。本発明の課題は、欠失変異体を用いたＤＯＣＫ２機能ドメインの同定や、ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとの結合を干渉する物質のスクリーニング、とりわけＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯとＴｉａｍ等のＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、これらスクリーニング方法を利用するアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬の探索方法等等を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
ＤＯＣＫ２はＮ末端のＳＨ３ドメインを含む１８２８アミノ酸残基からなるリンパ球特異的に発現する分子であり、Ｒａｃを活性化し、細胞骨格を制御することでリンパ球の運動性を規定している。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインを含むＮ末端の５０４アミノ酸残基を欠失したＤＯＣＫ２変異体ではＲａｃ活性化能が著しく低下し、アクチン重合を惹起できないことを見い出し、この領域に結合する分子としてＥＬＭＯ１を同定した。また、ＳＨ３ドメインの１アミノ酸変異により、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との結合が完全に阻害されることから、ＤＯＣＫ２はＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１に会合していることを見い出した。さらに、ＥＬＭＯ１が、Ｒａｃ特異的なＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）として機能するＴｉａｍ１と結合することを見い出した。すなわち、ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介してＴｉａｍ１をリクルートすることによりＲａｃを活性化していることを見い出した。したがって、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメイン、ＥＬＭＯ１、Ｔｉａｍ１という分子間相互作用を阻害することで、リンパ球遊走を人為的に制御しうることを見い出した。本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項１）や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項２）や、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項３）や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項４）に関する。
【００１１】
また本発明は、ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメイン及び／又はＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域が、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグと結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項５）や、ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインに対する抗体又はＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインと融合した他のペプチドに対する抗体により分画されたＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインに、ＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域に対する抗体を作用させ、会合形成の程度を評価することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項６）や、ＧＴＰ結合型の活性型Ｒａｃを検出することにより、会合形成の程度を評価することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項７）や、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質が、リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項８）に関する。
【００１２】
さらに本発明は、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質が、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの結合を阻害する物質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項９）や、ＥＬＭＯが、ＥＬＭＯ１であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、請求項１〜１０のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とするアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬の探索方法（請求項１１）や、請求項１〜１１のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とするＲａｃを活性化して細胞骨格の再構築を促進する、リンパ球遊走抑制に起因する疾病に対する治療薬の探索方法（請求項１２）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法としては、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価する方法や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価する方法や、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価する方法や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価する方法であれば、特に制限されるものではなく、上記、ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメイン及び／又はＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域として、これらとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合した融合タンパク質又は融合ペプチドとして用いてもよい。また、上記ＥＬＭＯとしては、ＥＬＭＯ１、ＥＬＭＯ２、ＥＬＭＯ３を具体的に挙げることができるが、中でもＥＬＭＯ１を好適に例示することができる。
【００１４】
上記ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとしては、ＥＬＭＯと会合しうる機能を有するＤＯＣＫ２の変異体で、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインの全部又は一部を含むペプチドを例示することができ、具体的には、ＤＯＣＫ２の１位から５０２位のアミノ酸残基からなるＤＯＣＫ２Ｎや、ＤＯＣＫ２の１位から１３１１位のアミノ酸残基からなるＤＯＣＫ２ΔＣを挙げることができる。また、上記ＥＬＭＯのＣ末端領域としては、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインと会合しうる機能を有するＥＬＭＯの変異体で、ＥＬＭＯのＣ末端領域の全部又は一部を含むペプチドを例示することができ、具体的には、ＥＬＭＯ１の１４７位から７２７位のアミノ酸残基からなるＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１や、ＥＬＭＯ１の３４５位から７２７位のアミノ酸残基からなるＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８を挙げることができる。以下、ＤＯＣＫ２と上記ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインを合わせて「ＤＯＣＫ２等」、ＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯと上記ＥＬＭＯのＣ末端領域を合わせて「ＥＬＭＯ等」ということがある。
【００１５】
上記ＤＯＣＫ２変異体やＥＬＭＯ変異体は、ＤＯＣＫ２遺伝子やＥＬＭＯ遺伝子を常法により改変することにより調製することができる。ＤＯＣＫ２遺伝子としては、Ｈｃｈ（マウスＤＯＣＫ２）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＹ０２７４３８；Nature, Vol412, 23 August, 826-831, 2001）、ヒトＤＯＣＫ２遺伝子（ＸＭ＿０４７９６１；DNA Res. 3, 321-329）を具体的に挙げることができるが、ＤＯＣＫ２遺伝子の由来はマウス及びヒト等に限られるものではない。また、ＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯ遺伝子としては、マウスＥＬＭＯ１遺伝子（ＡＦ３９８８８３；Cell, Vol.107 (1), 27-41, 2001）、ヒトＥＬＭＯ１遺伝子（ＡＦ３９８８８５；Cell, Vol.107 (1), 27-41, 2001）の他、ＥＬＭＯ２遺伝子（ヒトＡＦ３９８８８６、マウスＡＦ３９８８８４）、ＥＬＭＯ３遺伝子（ヒトＮＭ＿０２４７１２）を具体的に挙げることができるが、ＤＯＣＫ２遺伝子やＥＬＭＯ遺伝子の由来はマウス及びヒト等に限られるものではない。なお、マウスＤＯＣＫ２のアミノ酸配列については配列番号１に、ヒトＤＯＣＫ２のアミノ酸配列については配列番号２に、マウスＥＬＭＯ１のアミノ酸配列については配列番号３に、ヒトＥＬＭＯ１のアミノ酸配列については配列番号４に示す。
【００１６】
上記ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質や融合ペプチドにおける、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質や融合ペプチドは、常法により作製することができ、ＨＡタグに対する特異抗体を利用して、ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ１等とＨＡタグとの融合タンパク質や融合ペプチドを分離・分画することができる。
【００１７】
ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等と被検物質とを接触させる方法としては、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を評価することができる接触方法であれば特に制限されるものではなく、セルフリー系で被検物質の存在下、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等とを接触させる方法や、ＤＯＣＫ２等発現細胞に、ＥＬＭＯ等やＥＬＭＯ等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターを被検物質と共に導入する方法や、ＥＬＭＯ等発現細胞に、ＤＯＣＫ２等やＤＯＣＫ２等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターを被検物質と共に導入する方法や、ＤＯＣＫ２等・ＥＬＭＯ等非発現細胞に、ＤＯＣＫ２等やＤＯＣＫ２等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターと、ＥＬＭＯ等やＥＬＭＯ等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターと、被検物質とを導入する方法を挙げることができる。
【００１８】
上記被検物質との接触のために用いられる細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができるが、動物細胞が好ましい。また、かかる細胞内にＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等を導入する方法としては、上記の遺伝子を導入する方法の他に、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いることもできる。
【００１９】
また、上記発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクターが好ましく、かかる動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、動物細胞用発現ベクターに代えてリポソームを用いることもできる。そして、かかる動物細胞用発現ベクターの細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００２０】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を評価する方法としては、分離・分画されたＤＯＣＫ２等にＥＬＭＯ等に対する抗体を作用させ、あるいは、分離・分画されたＥＬＭＯ等にＤＯＣＫ２等に対する抗体を作用させ、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を免疫化学的に測定・評価する方法を挙げることができ、ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等を分離・分画するには、ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等に対する特異抗体、タグ特異的抗体を用いることができる。また、タンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく検出できる酵母のtwo hybrid systemや、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーや、立体構造の変化を検出できるＮＭＲ法を使用して、その会合形成の程度を測定・評価する方法を挙げることができる。その他、大腸菌発現系を用いたfar western法、アフィニティクロマトグラフィーを利用する方法等の公知の相互作用するタンパク質の探索法を好適に例示することができる。
【００２１】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を評価するもう一つの方法として、ＧＴＰ結合型の活性型Ｒａｃを検出する評価方法を挙げることができる。活性型Ｒａｃの検出には、ＰＡＫ１ Ｒａｃ結合ドメインのＧＳＴ融合タンパク質を用いたプルダウン法を用いることができる。
【００２２】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法における被検試料としては、例えばペプチド、タンパク質、合成化合物、微生物発酵物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞紬出物、真核単細胞抽出物又は動物細胞抽出物あるいはそれらのライブラリーを挙げることができる。また、本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、コントロール実験を併用することができる。コントロールとしては、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成に影響を及ぼすことのないネガティブコントロール、及び／又はＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成に影響を及ぼすポジティブコントロールを用いることができる。
【００２３】
上記ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質としては、リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質、特にＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの結合を阻害する物質等のリンパ球遊走制御機能の抑制物質を挙げることができる。リンパ球遊走制御機能としては、ＤＯＣＫ２遺伝子の発現に依拠するリンパ球の運動性を制御する機能であれば特に制限されるものではないが、Ｒａｃを活性化してＲａｃ−ＧＴＰ結合体とし、細胞骨格の再構築、特にリンパ球におけるアクチン重合を促進する機能や、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２次リンパ組織へのホーミング機能や、ＥＬＣケモカイン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中への移出機能や、ＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣＤ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の遊走機能等を具体的に例示することができる。
【００２４】
本発明はまた、ＥＬＭＯとＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法としては、ＥＬＭＯとＧＥＦと被検物質とを接触させ、次いでＥＬＭＯとＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法や、ＥＬＭＯのＮ末端領域とＧＥＦと被検物質とを接触させ、次いでＥＬＭＯのＮ末端領域とＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、また、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法としては、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとＧＥＦと被検物質とを接触させ、あるいは、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯとＧＥＦと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度、あるいは、ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、上記ＥＬＭＯとして、ＤＯＣＫ２と結合したＥＬＭＯを用いることもできる。
【００２５】
上記ＥＬＭＯとしては、ＥＬＭＯ１、ＥＬＭＯ２、ＥＬＭＯ３を具体的に挙げることができるが、中でもＥＬＭＯ１を好適に例示することができ、また、上記ＧＥＦとしては、Ｔｉａｍ１、Ｔｉａｍ２、Ｖａｖ１、Ｖａｖ２、Ｖａｖ３、Ｔｒｉｏ、ＳＴＥＦ、Ｐ−Ｒｅｘ１などのＲａｃ特異的なＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子が好ましく、中でもＴｉａｍ１を好適に例示することができる。上記Ｔｉａｍ１遺伝子としては、マウスＴｉａｍ１遺伝子（ＮＭ＿００９３８４；Cell, Vol.77 (4), 537-549, 1994）、ヒトＴｉａｍ１遺伝子（ＮＭ＿００３２５３；Oncogene Vol. 10(7), 1371-1376, 1995）を具体的に挙げることができるが、Ｔｉａｍ１遺伝子の由来はマウス及びヒト等に限られるものではない。なお、マウスＴｉａｍ１のアミノ酸配列を配列番号５に、ヒトＴｉａｍ１のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２６】
上記ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法における、ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価する方法、他のペプチドと融合しているＥＬＭＯ又はそのＮ末端領域やＧＥＦを用いる方法などを含め、前記ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法における手法を準用することができる。
【００２７】
以上の本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１などＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法、特にリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法を利用すると、ＤＯＣＫ２を標的としたアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する予防・治療薬のスクリーニングが可能となる。例えば、リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる抗ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン抗体、ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン結合分子（低分子化合物を含む）、ＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＣ末端領域のＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン結合部位を特異的に認識する抗体、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＣ末端領域のＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン結合部位に結合する分子（低分子化合物を含む）、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＮ末端領域のＴｉａｍ１などＧＥＦ結合部位を特異的に認識する抗体、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＮ末端領域のＴｉａｍ１などＧＥＦ結合部位に結合する分子（低分子化合物を含む）、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのアンチセンス鎖等のリンパ球遊走制御機能の抑制物質は、リンパ球の運動性を人為的に抑制しうることが期待されることから、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬となりうる可能性がきわめて大きい。かかる治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができ、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる。
【００２８】
また、本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯ１とＴｉａｍ１との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法、特にリンパ球遊走制御機能の促進物質のスクリーニング方法を利用すると、Ｒａｃを活性化して細胞骨格の再構築を促進しうることから、リンパ球遊走抑制に起因する疾病、例えば、各種癌や、薬剤・放射線照射によって引き起こされる免疫不全症などに対する予防・治療薬のスクリーニングが可能となる。
【００２９】
さらに、本発明のＤＯＣＫ２機能阻害物質のスクリーニング方法としては、ＳＨ３ドメインを含むＤＯＣＫ２のＮ末端領域を標的とし、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインと該ＳＨ３ドメイン結合タンパク質と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＳＨ３ドメイン結合タンパク質との会合形成の程度を評価する方法や、完全長ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２欠失変異体を発現する遺伝子導入細胞株を用い、これらの細胞株におけるＲａｃ活性化の程度を測定・評価し、ＤＯＣＫ２の機能ドメインを同定し、該機能ドメインと会合する機能ドメイン会合分子を探索し、ＤＯＣＫ２の機能ドメインと機能ドメイン会合分子と被検物質とを接触させ、ＤＯＣＫ２の機能ドメインと機能ドメイン会合分子との会合形成の程度を評価する方法を挙げることができ、被検物質と接触させる方法や会合形成の程度を評価する方法やＲａｃ活性化の程度を測定方法などは、上述した方法を用いることができ、ＤＯＣＫ２の機能ドメインの同定方法や完全長ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２欠失変異体を発現する遺伝子導入細胞株の作製は以下の実施例記載の方法を用いることができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（ＤＯＣＫ２のＮ末端の領域とＥＬＭＯ１との結合）
線虫において最近ＣＥＤ−５と会合し、細胞骨格を制御する分子としてＣＥＤ−１２が同定され、その哺乳類ホモログとしてＥＬＭＯ１が報告された（非特許文献１５）。そこで、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１とが結合するか否かを検討するために、PcDNA/His maxベクター（Invitrogen社製）を用いてＣ末端にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ：配列番号７）を挿入した完全長ＤＯＣＫ２あるいは種々のＤＯＣＫ２欠失変異体をコードする遺伝子コンストラクト（ＰｃＤＮＡ
ＤＯＣＫ２−ＨＡ、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ Ｎ−ＨＡ、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＣ−ＨＡ、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＮ−ＨＡ）を構築し、PcDNA V5-Hisベクター（Invitrogen社）にＥＬＭＯ１ ｃＤＮＡを挿入した遺伝子（ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５）と共に２９３Ｔ細胞（九州大学畠山鎮次博士より分与）に遺伝子導入した。ＤＯＣＫ２コンストラクトは本発明者らが単離した遺伝子（非特許文献１４）より、ＥＬＭＯ１コンストラクトはマウス組織ｃＤＮＡよりＰＣＲ法を用いて常法により作製した。使用したＤＯＣＫ２欠失変異体をコードする遺伝子は以下の通りであり、これを図１Ａに模式的に示す。
１）ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ Ｎ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の１位から５０２位のアミノ酸残基をコードする遺伝子
２）ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＣ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の１位から１３１１位のアミノ酸残基をコードする遺伝子
３）ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＮ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の５０５位から１８２８位のアミノ酸残基をコードする遺伝子
【００３１】
遺伝子導入後４８時間で細胞を回収し、Lysis buffer（Cell signaling社製）で溶解した後、total cell lysate及び抗ＨＡ抗体（Roche社製）による免疫沈降物を対象に抗Ｖ５抗体（Invistorgen社製）を用いたウェスタンブロット法にて解析した。total cell lysateではいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１に相当する約１００ＫＤのバンドが検出された（図１Ｂ；上段）。しかしながら、免疫沈降物においては、完全長ＤＯＣＫ２、ＤＯＣＫ２ΔＣ、ＤＯＣＫ２ Ｎをコードする遺伝子を導入した場合ＥＬＭＯ１に相当するバンドが認められたが、ＤＯＣＫ２のＮ末端５０４位までのアミノ酸残基を欠くＤＯＣＫ２ΔＮを発現させた場合は検出できなかった（図１Ｂ；中段下段）。このことから、ＤＯＣＫ２はそのＮ末端の５０２個のアミノ酸残基の領域でＥＬＭＯ１と会合することが明らかとなった。
【００３２】
実施例２（Ｎ末端領域を欠失したＤＯＣＫ２ΔＮでのＲａｃの活性化）
ＥＬＭＯ１との会合がＤＯＣＫ２の機能にどのような影響を及ぼすかを検討するため、PBJ1ベクターを用いて完全長ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２のＮ末端５０４アミノ酸残基を欠失した変異体（ＤＯＣＫ２ΔＮ）をコードする遺伝子コンストラクトを構築し、これらをＤＯＣＫ２遺伝子の発現を欠くＴ細胞株ＢＥα１６−３（National Jewish CenterのPhilippa Marrack博士より分与）に導入した安定遺伝子導入細胞株を樹立した。Ｎ３−５はＤＯＣＫ２を発現する野生型Ｔ細胞株であり、１７−１１（非特許文献１４)及び８４−３は本発明者らが樹立した、それぞれ完全長ＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２ΔＮを発現する遺伝子導入細胞株である。本発明者らが作製した抗ＤＯＣＫ２ポリクロナール抗体を用いたウェスタンブロット解析において、１７−１１と８４−３におけるＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２ΔＮの発現はほぼ同程度であった（図２Ａ、参考写真１参照。）。そこで１７−１１と８４−３を対象に、これらの細胞株におけるＲａｃ活性化をＰＡＫ１ Ｒａｃ結合ドメインのＧＳＴ融合タンパク質を用いたプルダウン法にて比較解析した。完全長ＤＯＣＫ２を発現する１７−１１においてはＧＴＰ結合型の活性型Ｒａｃが容易に検出できたが、ＥＬＭＯ１との結合部位を欠くＤＯＣＫ２ΔＮを発現する８４−３ではＲａｃ活性化能が顕著に低下していた（図２Ｂ、参考写真１参照。）。１７−１１と８４−３をＰＩ（propidium iodide）で核染色したところ、親株であるＢＥα１６−３と異なり、いずれにおいても核が偏在する−すなわち細胞の極性化が起こっているという所見が得られた（図２Ｃ；上段、参考写真１参照。）。しかしながら、これらの細胞をＦ−アクチンのプローブであるファロイジンで染色した場合、アクチン重合は１７−１１においてのみ認められ、８４−３ではＤＯＣＫ２の発現を欠くＢＥα１６−３と同様全く検出されなかった（図２Ｃ；下段、参考写真１参照。）。このことから、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合はＲａｃのfull activationにも、それに伴う細胞骨格の再構築にも極めて重要であることが示唆された。以上のことから、ＥＬＭＯ１との結合に重要なＮ末端領域を欠失したＤＯＣＫ２ΔＮではＲａｃ活性化能が顕著に低下し、アクチン重合を誘導できないことがわかった。
【００３３】
実施例３（ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインを介してのＥＬＭＯ１との会合）
ＤＯＣＫ２はＮ末端にはタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが知られているＳＨ（Src-homology）３ドメインがコードされている。ＤＯＣＫ２のＮ末端の５０２個のアミノ酸残基がＥＬＭＯ１との会合に重要であることを見い出したので、これがＳＨ３ドメインを介したものであるのかどうかにつき検討を加えた。ＳＨ３ドメインには共通して保存されたアミノ酸残基が存在している。そこで、PcDNA/His max ベクターを用いてＣ末端にＨＡタグを挿入した種々のＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体をコードする遺伝子コンストラクトを構築し、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５と共に２９３Ｔ細胞に遺伝子導入することで図１Ｂと同様に解析した。ＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体をコードする遺伝子は以下のとおりである。
１）ＰｃＤＮＡ Ｌ２７Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の２７位のロイシンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
２）ＰｃＤＮＡ Ｇ３２Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の３２位のグリシンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
３）ＰｃＤＮＡ Ｐ６０Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の６０位のプロリンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
４）ＰｃＤＮＡ Ｆ６３Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の６３位のフェニルアラニンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
【００３４】
ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメインを含む１０位から８９位までのアミノ酸配列を図３Ａに示す。total cell lysateにおいてはいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１に相当する約１００ＫＤのバンドが検出された（図３Ｂ；上段）。しかしながら抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降物を対象とした場合、ＥＬＭＯ１に相当するバンドはＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２−ＨＡ及びＰｃＤＮＡ Ｌ２７Ｅ−ＨＡを導入した以外では検出できなかった（図３Ｂ；中段）。一方、いずれの遺伝子を導入した場合でもＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体の発現は同程度であった（図３Ｂ；下段）。以上の結果は、ＳＨ３ドメインの１アミノ酸置換でＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合が完全に阻害されることを示すものであり、これらのことから、ＤＯＣＫ２はそのＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１に結合していることが明らかとなった。
【００３５】
実施例４（ＥＬＭＯ１のＣ末端領域とＤＯＣＫ２との結合）
次にＤＯＣＫ２と結合するＥＬＭＯ１の機能ドメインを同定するため、PcDNAV5Hisベクターを用いて、種々のＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子コンストラクトを構築し、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２−ＨＡと共に２９３Ｔ細胞に遺伝子導入することで解析した。ここで使用したＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子は以下の通りであり、これを図４Ａに模式的に示す。
１）ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１−Ｖ５；ＥＬＭＯ１の１４７位から７２７位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子
２）ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８−Ｖ５；ＥＬＭＯ１の３４５位から７２７位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子
３）ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１０−Ｖ５；ＥＬＭＯ１の１位から６１３位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子
【００３６】
total cell lysate においてはいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１もしくはその欠失変異体に相当するバンドが検出された（図４Ｂ；上段）。しかしながら、抗ＨＡ抗体による免疫沈降物においては、抗Ｖ５抗体に反応するバンドは完全長ＥＬＭＯ１、ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１及びＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８をコードする遺伝子を導入した場合には認められるものの、ＥＬＭＯ１の６１４位から７２７位までのアミノ酸残基を欠くＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１０を発現させた場合は検出できなかった（図４Ｂ；中段、下段）。このことから、ＥＬＭＯ１の６１４位から７２７位までのアミノ酸残基を含むＣ末端の領域がＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメインとの会合に重要であることが示された。これらのことから、ＥＬＭＯ１はそのＣ末端の領域でＤＯＣＫ２に結合していることがわかった。
【００３７】
実施例５（ＥＬＭＯ１のＮ末端領域とＴｉａｍ１との結合）
Ｔｉａｍ１は胸腺腫細胞株の浸潤を規定する分子として同定されたものであり、Ｒａｃ特異的なＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）として機能することが知られている（Cell 77, 537-549, 1994、Nature375, 338-340, 1995）。ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合がＲａｃのfull activationに必要であることから、ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介してＴｉａｍ１をリクルートしているという可能性が考えられた。この仮説を検証するために、マウス組織ｃＤＮＡよりＰＣＲ法を用いて増幅したＴｉａｍ１遺伝子を基に、PCIベクター（Promega社製）を用いて、Ｃ末端にＨＡタグを挿入したＴｉａｍ１をコードするコンストラクト（PCI Ｔｉａｍ１−ＨＡ）を構築し、完全長ＥＬＭＯあるいは種々のＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子（ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌＰＨ−Ｖ５、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８−Ｖ５、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１）と共に２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し解析した。ＰｃＤＮＡ
ＥＬＭＯ１−ｄｅｌＰＨ−Ｖ５はＥＬＭＯ１の１位から５６５位までと６９５位から７２７位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子であり、ここで使用したＥＬＭＯ１欠失変異体を図５Ａに模式的に示す。total cell lysateにおいてはいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１もしくはその欠失変異体に相当するバンドが検出された（図５Ｂ；上段）。抗ＨＡ抗体による免疫沈降物においてもＰｃＤＮＡ
ＥＬＭＯ１−Ｖ５及びＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌＰＨ−Ｖ５を導入した場合、抗Ｖ５抗体に反応するバンドが検出された（図５Ｂ；中段、下段）。このことは、Ｔｉａｍ１とＥＬＭＯ１とが結合するということを示している。しかしながら、ＥＬＭＯ１のＮ末端の１４６位まであるいは３４４位までのアミノ酸残基を欠失させた変異体ではこのような結合は認められず（図５Ｂ；中段、下段）、これらのことから、ＥＬＭＯ１はそのＮ末端でＴｉａｍ１と会合していることが示された。
【００３８】
以上より、１）ＤＯＣＫ２はＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１のＣ末端の領域に結合すること、２）ＥＬＭＯ１はそのＮ末端の領域を介してＴｉａｍ１と結合すること、３）ＥＬＭＯ１と結合できないＤＯＣＫ２変異体ではＲａｃ活性化能が著しく低下することが明らかとなった。このことから、ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介して、ＲａｃのＧＥＦとして機能するＴｉａｍ１をリクルートすることによりＲａｃを活性化していることが示された（図６）。
【００３９】
自己免疫疾患や移植片拒絶は、標的組織にリンパ球が浸潤することによって惹起されるため、これら疾患や病態を治療あるいは予防する上でＤＯＣＫ２シグナル伝達は格好の標的となる。今回の知見は、ＤＯＣＫ２、ＥＬＭＯ１、Ｔｉａｍ１という分子間相互作用が細胞運動に不可欠なＲａｃ活性化を制御しているということを示すものであり、これらの分子間相互作用を遮断することでリンパ球浸潤を阻止し得るものと考えられる。それ故、これら分子間相互作用は自己免疫疾患や移植片拒絶の治療法や予防法の開発に向け今後の創薬の標的になるものと期待される。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＯＣＫ２の分子間相互作用を解明し、ＤＯＣＫ２を標的としたリンパ球遊走制御物質及びリンパ球遊走制御方法を提供することができる。また、本発明によれば、ＤＯＣＫ２の分子間相互作用を阻害することによる、自己免疫疾患や移植片拒絶反応の予防薬又は治療薬を提供することができる。
【００４１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＯＣＫ２がそのＮ末端の領域でＥＬＭＯ１と結合することを示す図である。Ａは、ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２欠失変異体の構造を模式的に示す図である。図中、黒塗りはＳＨ３ドメインである。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２欠失変異体をコードする遺伝子を、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５と共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し、免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＥＬＭＯ１との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図２】ＥＬＭＯ１との結合に重要なＮ末端領域を欠失したＤＯＣＫ２ΔＮではＲａｃ活性化能が顕著に低下し、アクチン重合を誘導できないことを示す図である。Ａは、ＢＥα１６−３、Ｎ３−５、及び遺伝子導入細胞株（１７−１１、８４−３）におけるＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２ΔＮの発現を、ＤＯＣＫ２に対するポリクロナール抗体を用いたウェスタンブロット法にて解析した図である。図中、ＮＳは非特異的なバンドを示す。
Ｂは、８４−３、１７−１１、ＢＥα１６−３の細胞抽出液をＰＡＫ１ Ｒａｃ結合ドメインのＧＳＴ融合タンパク質でプルダウンし、抗Ｒａｃ抗体で染色することにより活性型Ｒａｃを検出した図である。
Ｃは、ＢＥα１６−３、１７−１１、８４−３をpropidium iodide及びファロイジン（phalloidin）で染色することで細胞の極性化及びアクチン重合につき検討した図である。
【図３】ＤＯＣＫ２がそのＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１と会合することを示す図である。
Ａは、ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメインを含む１０−８９のアミノ配列を示す図である。グルタミン酸に置換したアミノ酸残基を太字で示す。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体をコードする遺伝子を、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５と共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し、免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＥＬＭＯ１との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図４】ＥＬＭＯ１がそのＣ末端の領域でＤＯＣＫ２に結合していることを示す図である。
Ａは、ＥＬＭＯ１及びこの実験で使用したＥＬＭＯ１欠失変異体の構造を模式的に示す図である。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子を、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２−ＨＡあるいはコントロールベクターと共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＤＯＣＫ２との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図５】ＥＬＭＯ１がそのＮ末端の領域でＴｉａｍ１に結合していることを示す図である。
Ａは、ＥＬＭＯ１及びこの実験で使用したＥＬＭＯ１欠失変異体の構造を模式的に示す図である。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子を、ＰＣＩ Ｔｉａｍ１−ＨＡあるいはコントロールベクターと共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＴｉａｍ１との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図６】ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化機構の模式図である。
ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介して、ＲａｃのＧＥＦとして機能するＴｉａｍをリクルートすることでＲａｃを活性化することを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、欠失変異体を用いたＤＯＣＫ２機能ドメインの同定や、ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとの結合を干渉する物質のスクリーニング、とりわけＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯとＴｉａｍ等のＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、これらスクリーニング方法を利用するアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬の探索方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫応答は、生体にとって感染に対する必須の防御機構であり、免疫細胞は、種々の感染源に迅速に対処すべく生体内を常にパトロールしている。このように構成細胞が絶えず動き回るという特徴は、他の生命複雑系においては認められず、免疫系独自に進化したものである。免疫細胞のうち、好中球、マクロファージといった細胞は感染の初期防御において機能する一方、Ｔリンパ球及びＢリンパ球はその抗原受容体を介して外来異物を認識することで抗原特異的な免疫応答を引き起こすことが知られている。上記Ｔ及びＢリンパ球は、胸腺、骨髄といった１次リンパ組織で分化し、脾臓、リンパ節、パイエル板（小腸のリンパ組織）といった２次リンパ組織の特定のコンパートメントへ移動した後、ここで、種々の組織から集められた抗原を、かかる抗原受容体を介して認識することにより特異的な免疫応答を惹起する。この際、リンパ球が２次リンパ組織の特定の部位に移動することは、免疫応答の成立において極めて重要である。これまで、リンパ球の移動が、種々のケモカインと総称されるタンパク質によって導かれることは知られているが、リンパ球の運動性そのものを制御する分子機構に関しては不明であった。
【０００３】
細胞運動には、細胞極性の変化と細胞骨格の再構築が必須であり（例えば、非特許文献１参照。）、これらはいずれもＲｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２といった低分子量Ｇタンパク質によって制御されていることが知られている（例えば、非特許文献２〜５参照。）。この中でもとりわけＲａｃは、葉状突起と呼ばれるアクチンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動力を提供している（例えば、非特許文献３，６参照。）。他方、線虫（Caenorhabditis elegans）、ヒト及びショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）において、ＣＥＤ５、ＤＯＣＫ１８０、Myoblast city（ＭＢＣ）という構造上相同性を示す分子が同定され、これらの分子はその頭文字をとってＣＤＭファミリー分子と呼ばれており、いずれもＲａｃの上流で機能することで細胞骨格の再構築に関与すると考えられている（例えば、非特許文献７〜１２参照。）。上記ＣＥＤ−５及びMyoblast Cityが特定タイプの細胞の運動に重要であることが突然変異体を用いた遺伝学的解析から明らかになっているが（例えば、非特許文献８，９，１２参照。）、ＣＤＭファミリータンパク質が、哺乳類において生理的にどのように機能するかは未だ不明であった。
【０００４】
ＤＯＣＫ２（ＫＩＡＡ０２０９；DNA Res. 3, 321-329）は、ヒト造血細胞で特異的に発現するＣＤＭファミリータンパク質の他のメンバーをコードし、上記ＤＯＣＫ２が２９３Ｔ腎細胞においてＲａｃに結合し、Ｒａｃを活性化することが知られている（例えば、非特許文献１３参照。）。一方、本発明者らは、マウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーよりＣＤＭファミリーに属する新規遺伝子Ｈｃｈを単離し、かかる遺伝子産物が１８２８のアミノ酸から成り、そのＮ末端にはＳＨ３ドメインがコードされていることを見い出した（例えば、非特許文献１４参照。）。また、マウス組織を用いたノーザンブロット解析において、ＤＯＣＫ１８０がさまざまな臓器に発現しているのに対して、Ｈｃｈの発現は胸腺及び脾臓に限局していることや、細胞株を用いた解析より２種類の変異Ｔ細胞株を除いて、Ｈｃｈの発現がＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージのいずれにおいても認められることを確認した。またＨｃｈの発現を欠く変異Ｔ細胞株にＨｃｈを導入することで細胞形態の著明な変化と接着性の亢進が観察されることを明らかにしている。Ｈｃｈのコードする１８２８アミノ酸のうち１６７７アミノ酸はヒトＤＯＣＫ２と同一であり、ＨｃｈはマウスＤＯＣＫ２ホモログと考えられたが、上記ＤＯＣＫ２の生理的機能は不明であった。
【０００５】
本発明者らは、上記のようにＣＤＭファミリーに属し、且つリンパ球特異的に発現する分子としてＤＯＣＫ２を同定し、ノックアウトマウスを作製することで、この分子がリンパ球遊走に不可欠であることを明らかにした（例えば、非特許文献１４参照。）。ＤＯＣＫ２欠損リンパ球では種々のケモカイン刺激によっても活性型Ｒａｃは検出できない。それ故、ＤＯＣＫ２はＲａｃの活性化を介してリンパ球遊走を制御していると考えられる。しかしながら、ＤＯＣＫ２がどのような機序でＲａｃを活性化するのか依然として不明である。Ｒａｃは分子スイッチとして機能し、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）により活性化される。ＤＯＣＫ２はＲａｃと結合するものの、その構造上ＧＥＦとして機能するとは考えにくい。それ故、ＤＯＣＫ２は他の分子を介してＧＥＦをリクルートすることによりＲａｃを活性化していると推測される。
【０００６】
最近、線虫において、ＣＤＭファミリー分子の一種であるＣＥＤ−５と会合し、細胞骨格を制御する分子であるＣＥＤ−１２が同定され、その哺乳類ホモログとしてＥＬＭＯ１，２，３が報告された（例えば、非特許文献１５参照。）。また、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）としてこれまでに数１０種類のものが知られており、これらＧＥＦの中でも、Ｒａｃ特異的なＧＥＦとして機能する分子として、胸腺腫細胞株の浸潤を規定するＴｉａｍ１，２（例えば、非特許文献１６、１７参照。）や、Ｔ細胞受容体シグナルを制御するＶａｖ１（例えば、非特許文献１８参照。）の他Ｖａｖ２、Ｖａｖ３や、Ｔｒｉｏ（例えば、非特許文献１９参照。）や、ＳＴＥＦ（例えば、非特許文献２０参照。）や、Ｐ−Ｒｅｘ１（例えば、非特許文献２１参照。）が知られており、これら５種類はいずれも共通のドメインをもっており、ＧＴＰをＲａｃに付与する機能を有している。
【０００７】
【非特許文献１】
Cell 84, 359-369, 1996
【非特許文献２】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5027-5031, 1995
【非特許文献３】
Science 279, 509-514 1998
【非特許文献４】
J. Cell Biol. 141, 1147-1157, 1998
【非特許文献５】
Science 287, 1037-1040, 2000
【非特許文献６】
Cell 103, 227-238, 2000
【非特許文献７】
Mol. Cell Biol. 16, 1770-1776, 1996
【非特許文献８】
J. Cell Biol. 138, 589-603, 1997
【非特許文献９】
Nature 392, 501-504, 1998
【非特許文献１０】
Genes Dev. 12, 3331-3336, 1998
【非特許文献１１】
Genes Dev. 12, 3337-3342, 1998
【非特許文献１２】
Nature Cell Biol. 2, 131-136, 2000
【非特許文献１３】
Biochem. Biophys. Acta 1452, 179-187, 1999
【非特許文献１４】
Nature, 412, 826-831, 2001
【非特許文献１５】
Cell, 107, 27-41, 2001
【非特許文献１６】
Cell, 77, 537-549, 1994
【非特許文献１７】
Nature, 375, 338-340, 1995
【非特許文献１８】
Nature, 385, 169-172, 1997
【非特許文献１９】
J. Cell Science, 113, 729-739, 2000
【非特許文献２０】
J. Biol. Chem., 277, 2860-2868, 2002
【非特許文献２１】
Cell, 108, 809-821, 2002
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
自己免疫疾患や移植片拒絶は、標的組織にリンパ球が浸潤することによりもたらされる。そのため、これらの疾患や病態を治療あるいは予防する上で、ＤＯＣＫ２は格好の標的分子になると考えられる。本発明の課題は、欠失変異体を用いたＤＯＣＫ２機能ドメインの同定や、ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとの結合を干渉する物質のスクリーニング、とりわけＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯとＴｉａｍ等のＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、これらスクリーニング方法を利用するアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬の探索方法等等を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
ＤＯＣＫ２はＮ末端のＳＨ３ドメインを含む１８２８アミノ酸残基からなるリンパ球特異的に発現する分子であり、Ｒａｃを活性化し、細胞骨格を制御することでリンパ球の運動性を規定している。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインを含むＮ末端の５０４アミノ酸残基を欠失したＤＯＣＫ２変異体ではＲａｃ活性化能が著しく低下し、アクチン重合を惹起できないことを見い出し、この領域に結合する分子としてＥＬＭＯ１を同定した。また、ＳＨ３ドメインの１アミノ酸変異により、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との結合が完全に阻害されることから、ＤＯＣＫ２はＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１に会合していることを見い出した。さらに、ＥＬＭＯ１が、Ｒａｃ特異的なＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）として機能するＴｉａｍ１と結合することを見い出した。すなわち、ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介してＴｉａｍ１をリクルートすることによりＲａｃを活性化していることを見い出した。したがって、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメイン、ＥＬＭＯ１、Ｔｉａｍ１という分子間相互作用を阻害することで、リンパ球遊走を人為的に制御しうることを見い出した。本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項１）や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項２）や、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項３）や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項４）に関する。
【００１１】
また本発明は、ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメイン及び／又はＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域が、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグと結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項５）や、ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインに対する抗体又はＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインと融合した他のペプチドに対する抗体により分画されたＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインに、ＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域に対する抗体を作用させ、会合形成の程度を評価することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項６）や、ＧＴＰ結合型の活性型Ｒａｃを検出することにより、会合形成の程度を評価することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項７）や、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質が、リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項８）に関する。
【００１２】
さらに本発明は、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質が、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの結合を阻害する物質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項９）や、ＥＬＭＯが、ＥＬＭＯ１であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、請求項１〜１０のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とするアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬の探索方法（請求項１１）や、請求項１〜１１のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とするＲａｃを活性化して細胞骨格の再構築を促進する、リンパ球遊走抑制に起因する疾病に対する治療薬の探索方法（請求項１２）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法としては、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価する方法や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価する方法や、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価する方法や、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価する方法であれば、特に制限されるものではなく、上記、ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメイン及び／又はＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域として、これらとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合した融合タンパク質又は融合ペプチドとして用いてもよい。また、上記ＥＬＭＯとしては、ＥＬＭＯ１、ＥＬＭＯ２、ＥＬＭＯ３を具体的に挙げることができるが、中でもＥＬＭＯ１を好適に例示することができる。
【００１４】
上記ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとしては、ＥＬＭＯと会合しうる機能を有するＤＯＣＫ２の変異体で、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインの全部又は一部を含むペプチドを例示することができ、具体的には、ＤＯＣＫ２の１位から５０２位のアミノ酸残基からなるＤＯＣＫ２Ｎや、ＤＯＣＫ２の１位から１３１１位のアミノ酸残基からなるＤＯＣＫ２ΔＣを挙げることができる。また、上記ＥＬＭＯのＣ末端領域としては、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインと会合しうる機能を有するＥＬＭＯの変異体で、ＥＬＭＯのＣ末端領域の全部又は一部を含むペプチドを例示することができ、具体的には、ＥＬＭＯ１の１４７位から７２７位のアミノ酸残基からなるＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１や、ＥＬＭＯ１の３４５位から７２７位のアミノ酸残基からなるＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８を挙げることができる。以下、ＤＯＣＫ２と上記ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインを合わせて「ＤＯＣＫ２等」、ＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯと上記ＥＬＭＯのＣ末端領域を合わせて「ＥＬＭＯ等」ということがある。
【００１５】
上記ＤＯＣＫ２変異体やＥＬＭＯ変異体は、ＤＯＣＫ２遺伝子やＥＬＭＯ遺伝子を常法により改変することにより調製することができる。ＤＯＣＫ２遺伝子としては、Ｈｃｈ（マウスＤＯＣＫ２）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＹ０２７４３８；Nature, Vol412, 23 August, 826-831, 2001）、ヒトＤＯＣＫ２遺伝子（ＸＭ＿０４７９６１；DNA Res. 3, 321-329）を具体的に挙げることができるが、ＤＯＣＫ２遺伝子の由来はマウス及びヒト等に限られるものではない。また、ＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯ遺伝子としては、マウスＥＬＭＯ１遺伝子（ＡＦ３９８８８３；Cell, Vol.107 (1), 27-41, 2001）、ヒトＥＬＭＯ１遺伝子（ＡＦ３９８８８５；Cell, Vol.107 (1), 27-41, 2001）の他、ＥＬＭＯ２遺伝子（ヒトＡＦ３９８８８６、マウスＡＦ３９８８８４）、ＥＬＭＯ３遺伝子（ヒトＮＭ＿０２４７１２）を具体的に挙げることができるが、ＤＯＣＫ２遺伝子やＥＬＭＯ遺伝子の由来はマウス及びヒト等に限られるものではない。なお、マウスＤＯＣＫ２のアミノ酸配列については配列番号１に、ヒトＤＯＣＫ２のアミノ酸配列については配列番号２に、マウスＥＬＭＯ１のアミノ酸配列については配列番号３に、ヒトＥＬＭＯ１のアミノ酸配列については配列番号４に示す。
【００１６】
上記ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質や融合ペプチドにおける、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質や融合ペプチドは、常法により作製することができ、ＨＡタグに対する特異抗体を利用して、ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ１等とＨＡタグとの融合タンパク質や融合ペプチドを分離・分画することができる。
【００１７】
ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等と被検物質とを接触させる方法としては、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を評価することができる接触方法であれば特に制限されるものではなく、セルフリー系で被検物質の存在下、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等とを接触させる方法や、ＤＯＣＫ２等発現細胞に、ＥＬＭＯ等やＥＬＭＯ等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターを被検物質と共に導入する方法や、ＥＬＭＯ等発現細胞に、ＤＯＣＫ２等やＤＯＣＫ２等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターを被検物質と共に導入する方法や、ＤＯＣＫ２等・ＥＬＭＯ等非発現細胞に、ＤＯＣＫ２等やＤＯＣＫ２等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターと、ＥＬＭＯ等やＥＬＭＯ等をコードする遺伝子がインテグレイトされた発現ベクターと、被検物質とを導入する方法を挙げることができる。
【００１８】
上記被検物質との接触のために用いられる細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができるが、動物細胞が好ましい。また、かかる細胞内にＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等を導入する方法としては、上記の遺伝子を導入する方法の他に、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いることもできる。
【００１９】
また、上記発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクターが好ましく、かかる動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、動物細胞用発現ベクターに代えてリポソームを用いることもできる。そして、かかる動物細胞用発現ベクターの細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００２０】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１などのＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を評価する方法としては、分離・分画されたＤＯＣＫ２等にＥＬＭＯ等に対する抗体を作用させ、あるいは、分離・分画されたＥＬＭＯ等にＤＯＣＫ２等に対する抗体を作用させ、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を免疫化学的に測定・評価する方法を挙げることができ、ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等を分離・分画するには、ＤＯＣＫ２等やＥＬＭＯ等に対する特異抗体、タグ特異的抗体を用いることができる。また、タンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく検出できる酵母のtwo hybrid systemや、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーや、立体構造の変化を検出できるＮＭＲ法を使用して、その会合形成の程度を測定・評価する方法を挙げることができる。その他、大腸菌発現系を用いたfar western法、アフィニティクロマトグラフィーを利用する方法等の公知の相互作用するタンパク質の探索法を好適に例示することができる。
【００２１】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成の程度を評価するもう一つの方法として、ＧＴＰ結合型の活性型Ｒａｃを検出する評価方法を挙げることができる。活性型Ｒａｃの検出には、ＰＡＫ１ Ｒａｃ結合ドメインのＧＳＴ融合タンパク質を用いたプルダウン法を用いることができる。
【００２２】
本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法における被検試料としては、例えばペプチド、タンパク質、合成化合物、微生物発酵物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞紬出物、真核単細胞抽出物又は動物細胞抽出物あるいはそれらのライブラリーを挙げることができる。また、本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法において、コントロール実験を併用することができる。コントロールとしては、ＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成に影響を及ぼすことのないネガティブコントロール、及び／又はＤＯＣＫ２等とＥＬＭＯ等との会合形成に影響を及ぼすポジティブコントロールを用いることができる。
【００２３】
上記ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質としては、リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質、特にＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの結合を阻害する物質等のリンパ球遊走制御機能の抑制物質を挙げることができる。リンパ球遊走制御機能としては、ＤＯＣＫ２遺伝子の発現に依拠するリンパ球の運動性を制御する機能であれば特に制限されるものではないが、Ｒａｃを活性化してＲａｃ−ＧＴＰ結合体とし、細胞骨格の再構築、特にリンパ球におけるアクチン重合を促進する機能や、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２次リンパ組織へのホーミング機能や、ＥＬＣケモカイン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中への移出機能や、ＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣＤ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の遊走機能等を具体的に例示することができる。
【００２４】
本発明はまた、ＥＬＭＯとＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法としては、ＥＬＭＯとＧＥＦと被検物質とを接触させ、次いでＥＬＭＯとＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法や、ＥＬＭＯのＮ末端領域とＧＥＦと被検物質とを接触させ、次いでＥＬＭＯのＮ末端領域とＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、また、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法としては、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとＧＥＦと被検物質とを接触させ、あるいは、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯとＧＥＦと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度、あるいは、ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、上記ＥＬＭＯとして、ＤＯＣＫ２と結合したＥＬＭＯを用いることもできる。
【００２５】
上記ＥＬＭＯとしては、ＥＬＭＯ１、ＥＬＭＯ２、ＥＬＭＯ３を具体的に挙げることができるが、中でもＥＬＭＯ１を好適に例示することができ、また、上記ＧＥＦとしては、Ｔｉａｍ１、Ｔｉａｍ２、Ｖａｖ１、Ｖａｖ２、Ｖａｖ３、Ｔｒｉｏ、ＳＴＥＦ、Ｐ−Ｒｅｘ１などのＲａｃ特異的なＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子が好ましく、中でもＴｉａｍ１を好適に例示することができる。上記Ｔｉａｍ１遺伝子としては、マウスＴｉａｍ１遺伝子（ＮＭ＿００９３８４；Cell, Vol.77 (4), 537-549, 1994）、ヒトＴｉａｍ１遺伝子（ＮＭ＿００３２５３；Oncogene Vol. 10(7), 1371-1376, 1995）を具体的に挙げることができるが、Ｔｉａｍ１遺伝子の由来はマウス及びヒト等に限られるものではない。なお、マウスＴｉａｍ１のアミノ酸配列を配列番号５に、ヒトＴｉａｍ１のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２６】
上記ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法における、ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合形成の程度を評価する方法、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価する方法、他のペプチドと融合しているＥＬＭＯ又はそのＮ末端領域やＧＥＦを用いる方法などを含め、前記ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法における手法を準用することができる。
【００２７】
以上の本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１などＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯとＧＥＦとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法、特にリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法を利用すると、ＤＯＣＫ２を標的としたアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する予防・治療薬のスクリーニングが可能となる。例えば、リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる抗ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン抗体、ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン結合分子（低分子化合物を含む）、ＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＣ末端領域のＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン結合部位を特異的に認識する抗体、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＣ末端領域のＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメイン結合部位に結合する分子（低分子化合物を含む）、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＮ末端領域のＴｉａｍ１などＧＥＦ結合部位を特異的に認識する抗体、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのＮ末端領域のＴｉａｍ１などＧＥＦ結合部位に結合する分子（低分子化合物を含む）、ＥＬＭＯ１などＥＬＭＯのアンチセンス鎖等のリンパ球遊走制御機能の抑制物質は、リンパ球の運動性を人為的に抑制しうることが期待されることから、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬となりうる可能性がきわめて大きい。かかる治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができ、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる。
【００２８】
また、本発明のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、ＥＬＭＯ１とＴｉａｍ１との会合に干渉する物質のスクリーニング方法や、Ｒａｃ活性化促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法、特にリンパ球遊走制御機能の促進物質のスクリーニング方法を利用すると、Ｒａｃを活性化して細胞骨格の再構築を促進しうることから、リンパ球遊走抑制に起因する疾病、例えば、各種癌や、薬剤・放射線照射によって引き起こされる免疫不全症などに対する予防・治療薬のスクリーニングが可能となる。
【００２９】
さらに、本発明のＤＯＣＫ２機能阻害物質のスクリーニング方法としては、ＳＨ３ドメインを含むＤＯＣＫ２のＮ末端領域を標的とし、ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインと該ＳＨ３ドメイン結合タンパク質と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＳＨ３ドメイン結合タンパク質との会合形成の程度を評価する方法や、完全長ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２欠失変異体を発現する遺伝子導入細胞株を用い、これらの細胞株におけるＲａｃ活性化の程度を測定・評価し、ＤＯＣＫ２の機能ドメインを同定し、該機能ドメインと会合する機能ドメイン会合分子を探索し、ＤＯＣＫ２の機能ドメインと機能ドメイン会合分子と被検物質とを接触させ、ＤＯＣＫ２の機能ドメインと機能ドメイン会合分子との会合形成の程度を評価する方法を挙げることができ、被検物質と接触させる方法や会合形成の程度を評価する方法やＲａｃ活性化の程度を測定方法などは、上述した方法を用いることができ、ＤＯＣＫ２の機能ドメインの同定方法や完全長ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２欠失変異体を発現する遺伝子導入細胞株の作製は以下の実施例記載の方法を用いることができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（ＤＯＣＫ２のＮ末端の領域とＥＬＭＯ１との結合）
線虫において最近ＣＥＤ−５と会合し、細胞骨格を制御する分子としてＣＥＤ−１２が同定され、その哺乳類ホモログとしてＥＬＭＯ１が報告された（非特許文献１５）。そこで、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１とが結合するか否かを検討するために、PcDNA/His maxベクター（Invitrogen社製）を用いてＣ末端にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ：配列番号７）を挿入した完全長ＤＯＣＫ２あるいは種々のＤＯＣＫ２欠失変異体をコードする遺伝子コンストラクト（ＰｃＤＮＡ
ＤＯＣＫ２−ＨＡ、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ Ｎ−ＨＡ、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＣ−ＨＡ、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＮ−ＨＡ）を構築し、PcDNA V5-Hisベクター（Invitrogen社）にＥＬＭＯ１ ｃＤＮＡを挿入した遺伝子（ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５）と共に２９３Ｔ細胞（九州大学畠山鎮次博士より分与）に遺伝子導入した。ＤＯＣＫ２コンストラクトは本発明者らが単離した遺伝子（非特許文献１４）より、ＥＬＭＯ１コンストラクトはマウス組織ｃＤＮＡよりＰＣＲ法を用いて常法により作製した。使用したＤＯＣＫ２欠失変異体をコードする遺伝子は以下の通りであり、これを図１Ａに模式的に示す。
１）ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ Ｎ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の１位から５０２位のアミノ酸残基をコードする遺伝子
２）ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＣ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の１位から１３１１位のアミノ酸残基をコードする遺伝子
３）ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２ΔＮ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の５０５位から１８２８位のアミノ酸残基をコードする遺伝子
【００３１】
遺伝子導入後４８時間で細胞を回収し、Lysis buffer（Cell signaling社製）で溶解した後、total cell lysate及び抗ＨＡ抗体（Roche社製）による免疫沈降物を対象に抗Ｖ５抗体（Invistorgen社製）を用いたウェスタンブロット法にて解析した。total cell lysateではいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１に相当する約１００ＫＤのバンドが検出された（図１Ｂ；上段）。しかしながら、免疫沈降物においては、完全長ＤＯＣＫ２、ＤＯＣＫ２ΔＣ、ＤＯＣＫ２ Ｎをコードする遺伝子を導入した場合ＥＬＭＯ１に相当するバンドが認められたが、ＤＯＣＫ２のＮ末端５０４位までのアミノ酸残基を欠くＤＯＣＫ２ΔＮを発現させた場合は検出できなかった（図１Ｂ；中段下段）。このことから、ＤＯＣＫ２はそのＮ末端の５０２個のアミノ酸残基の領域でＥＬＭＯ１と会合することが明らかとなった。
【００３２】
実施例２（Ｎ末端領域を欠失したＤＯＣＫ２ΔＮでのＲａｃの活性化）
ＥＬＭＯ１との会合がＤＯＣＫ２の機能にどのような影響を及ぼすかを検討するため、PBJ1ベクターを用いて完全長ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２のＮ末端５０４アミノ酸残基を欠失した変異体（ＤＯＣＫ２ΔＮ）をコードする遺伝子コンストラクトを構築し、これらをＤＯＣＫ２遺伝子の発現を欠くＴ細胞株ＢＥα１６−３（National Jewish CenterのPhilippa Marrack博士より分与）に導入した安定遺伝子導入細胞株を樹立した。Ｎ３−５はＤＯＣＫ２を発現する野生型Ｔ細胞株であり、１７−１１（非特許文献１４)及び８４−３は本発明者らが樹立した、それぞれ完全長ＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２ΔＮを発現する遺伝子導入細胞株である。本発明者らが作製した抗ＤＯＣＫ２ポリクロナール抗体を用いたウェスタンブロット解析において、１７−１１と８４−３におけるＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２ΔＮの発現はほぼ同程度であった（図２Ａ、参考写真１参照。）。そこで１７−１１と８４−３を対象に、これらの細胞株におけるＲａｃ活性化をＰＡＫ１ Ｒａｃ結合ドメインのＧＳＴ融合タンパク質を用いたプルダウン法にて比較解析した。完全長ＤＯＣＫ２を発現する１７−１１においてはＧＴＰ結合型の活性型Ｒａｃが容易に検出できたが、ＥＬＭＯ１との結合部位を欠くＤＯＣＫ２ΔＮを発現する８４−３ではＲａｃ活性化能が顕著に低下していた（図２Ｂ、参考写真１参照。）。１７−１１と８４−３をＰＩ（propidium iodide）で核染色したところ、親株であるＢＥα１６−３と異なり、いずれにおいても核が偏在する−すなわち細胞の極性化が起こっているという所見が得られた（図２Ｃ；上段、参考写真１参照。）。しかしながら、これらの細胞をＦ−アクチンのプローブであるファロイジンで染色した場合、アクチン重合は１７−１１においてのみ認められ、８４−３ではＤＯＣＫ２の発現を欠くＢＥα１６−３と同様全く検出されなかった（図２Ｃ；下段、参考写真１参照。）。このことから、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合はＲａｃのfull activationにも、それに伴う細胞骨格の再構築にも極めて重要であることが示唆された。以上のことから、ＥＬＭＯ１との結合に重要なＮ末端領域を欠失したＤＯＣＫ２ΔＮではＲａｃ活性化能が顕著に低下し、アクチン重合を誘導できないことがわかった。
【００３３】
実施例３（ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインを介してのＥＬＭＯ１との会合）
ＤＯＣＫ２はＮ末端にはタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが知られているＳＨ（Src-homology）３ドメインがコードされている。ＤＯＣＫ２のＮ末端の５０２個のアミノ酸残基がＥＬＭＯ１との会合に重要であることを見い出したので、これがＳＨ３ドメインを介したものであるのかどうかにつき検討を加えた。ＳＨ３ドメインには共通して保存されたアミノ酸残基が存在している。そこで、PcDNA/His max ベクターを用いてＣ末端にＨＡタグを挿入した種々のＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体をコードする遺伝子コンストラクトを構築し、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５と共に２９３Ｔ細胞に遺伝子導入することで図１Ｂと同様に解析した。ＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体をコードする遺伝子は以下のとおりである。
１）ＰｃＤＮＡ Ｌ２７Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の２７位のロイシンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
２）ＰｃＤＮＡ Ｇ３２Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の３２位のグリシンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
３）ＰｃＤＮＡ Ｐ６０Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の６０位のプロリンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
４）ＰｃＤＮＡ Ｆ６３Ｅ−ＨＡ；ＤＯＣＫ２の６３位のフェニルアラニンをグルタミン酸に置換した変異体をコードする遺伝子
【００３４】
ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメインを含む１０位から８９位までのアミノ酸配列を図３Ａに示す。total cell lysateにおいてはいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１に相当する約１００ＫＤのバンドが検出された（図３Ｂ；上段）。しかしながら抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降物を対象とした場合、ＥＬＭＯ１に相当するバンドはＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２−ＨＡ及びＰｃＤＮＡ Ｌ２７Ｅ−ＨＡを導入した以外では検出できなかった（図３Ｂ；中段）。一方、いずれの遺伝子を導入した場合でもＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体の発現は同程度であった（図３Ｂ；下段）。以上の結果は、ＳＨ３ドメインの１アミノ酸置換でＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合が完全に阻害されることを示すものであり、これらのことから、ＤＯＣＫ２はそのＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１に結合していることが明らかとなった。
【００３５】
実施例４（ＥＬＭＯ１のＣ末端領域とＤＯＣＫ２との結合）
次にＤＯＣＫ２と結合するＥＬＭＯ１の機能ドメインを同定するため、PcDNAV5Hisベクターを用いて、種々のＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子コンストラクトを構築し、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２−ＨＡと共に２９３Ｔ細胞に遺伝子導入することで解析した。ここで使用したＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子は以下の通りであり、これを図４Ａに模式的に示す。
１）ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１−Ｖ５；ＥＬＭＯ１の１４７位から７２７位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子
２）ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８−Ｖ５；ＥＬＭＯ１の３４５位から７２７位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子
３）ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１０−Ｖ５；ＥＬＭＯ１の１位から６１３位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子
【００３６】
total cell lysate においてはいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１もしくはその欠失変異体に相当するバンドが検出された（図４Ｂ；上段）。しかしながら、抗ＨＡ抗体による免疫沈降物においては、抗Ｖ５抗体に反応するバンドは完全長ＥＬＭＯ１、ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１及びＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８をコードする遺伝子を導入した場合には認められるものの、ＥＬＭＯ１の６１４位から７２７位までのアミノ酸残基を欠くＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１０を発現させた場合は検出できなかった（図４Ｂ；中段、下段）。このことから、ＥＬＭＯ１の６１４位から７２７位までのアミノ酸残基を含むＣ末端の領域がＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメインとの会合に重要であることが示された。これらのことから、ＥＬＭＯ１はそのＣ末端の領域でＤＯＣＫ２に結合していることがわかった。
【００３７】
実施例５（ＥＬＭＯ１のＮ末端領域とＴｉａｍ１との結合）
Ｔｉａｍ１は胸腺腫細胞株の浸潤を規定する分子として同定されたものであり、Ｒａｃ特異的なＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）として機能することが知られている（Cell 77, 537-549, 1994、Nature375, 338-340, 1995）。ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯ１との会合がＲａｃのfull activationに必要であることから、ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介してＴｉａｍ１をリクルートしているという可能性が考えられた。この仮説を検証するために、マウス組織ｃＤＮＡよりＰＣＲ法を用いて増幅したＴｉａｍ１遺伝子を基に、PCIベクター（Promega社製）を用いて、Ｃ末端にＨＡタグを挿入したＴｉａｍ１をコードするコンストラクト（PCI Ｔｉａｍ１−ＨＡ）を構築し、完全長ＥＬＭＯあるいは種々のＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子（ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌＰＨ−Ｖ５、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ８−Ｖ５、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌ１）と共に２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し解析した。ＰｃＤＮＡ
ＥＬＭＯ１−ｄｅｌＰＨ−Ｖ５はＥＬＭＯ１の１位から５６５位までと６９５位から７２７位までのアミノ酸残基をコードする遺伝子であり、ここで使用したＥＬＭＯ１欠失変異体を図５Ａに模式的に示す。total cell lysateにおいてはいずれも抗Ｖ５抗体でＥＬＭＯ１もしくはその欠失変異体に相当するバンドが検出された（図５Ｂ；上段）。抗ＨＡ抗体による免疫沈降物においてもＰｃＤＮＡ
ＥＬＭＯ１−Ｖ５及びＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−ｄｅｌＰＨ−Ｖ５を導入した場合、抗Ｖ５抗体に反応するバンドが検出された（図５Ｂ；中段、下段）。このことは、Ｔｉａｍ１とＥＬＭＯ１とが結合するということを示している。しかしながら、ＥＬＭＯ１のＮ末端の１４６位まであるいは３４４位までのアミノ酸残基を欠失させた変異体ではこのような結合は認められず（図５Ｂ；中段、下段）、これらのことから、ＥＬＭＯ１はそのＮ末端でＴｉａｍ１と会合していることが示された。
【００３８】
以上より、１）ＤＯＣＫ２はＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１のＣ末端の領域に結合すること、２）ＥＬＭＯ１はそのＮ末端の領域を介してＴｉａｍ１と結合すること、３）ＥＬＭＯ１と結合できないＤＯＣＫ２変異体ではＲａｃ活性化能が著しく低下することが明らかとなった。このことから、ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介して、ＲａｃのＧＥＦとして機能するＴｉａｍ１をリクルートすることによりＲａｃを活性化していることが示された（図６）。
【００３９】
自己免疫疾患や移植片拒絶は、標的組織にリンパ球が浸潤することによって惹起されるため、これら疾患や病態を治療あるいは予防する上でＤＯＣＫ２シグナル伝達は格好の標的となる。今回の知見は、ＤＯＣＫ２、ＥＬＭＯ１、Ｔｉａｍ１という分子間相互作用が細胞運動に不可欠なＲａｃ活性化を制御しているということを示すものであり、これらの分子間相互作用を遮断することでリンパ球浸潤を阻止し得るものと考えられる。それ故、これら分子間相互作用は自己免疫疾患や移植片拒絶の治療法や予防法の開発に向け今後の創薬の標的になるものと期待される。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＯＣＫ２の分子間相互作用を解明し、ＤＯＣＫ２を標的としたリンパ球遊走制御物質及びリンパ球遊走制御方法を提供することができる。また、本発明によれば、ＤＯＣＫ２の分子間相互作用を阻害することによる、自己免疫疾患や移植片拒絶反応の予防薬又は治療薬を提供することができる。
【００４１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＯＣＫ２がそのＮ末端の領域でＥＬＭＯ１と結合することを示す図である。Ａは、ＤＯＣＫ２及びＤＯＣＫ２欠失変異体の構造を模式的に示す図である。図中、黒塗りはＳＨ３ドメインである。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２欠失変異体をコードする遺伝子を、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５と共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し、免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＥＬＭＯ１との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図２】ＥＬＭＯ１との結合に重要なＮ末端領域を欠失したＤＯＣＫ２ΔＮではＲａｃ活性化能が顕著に低下し、アクチン重合を誘導できないことを示す図である。Ａは、ＢＥα１６−３、Ｎ３−５、及び遺伝子導入細胞株（１７−１１、８４−３）におけるＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２ΔＮの発現を、ＤＯＣＫ２に対するポリクロナール抗体を用いたウェスタンブロット法にて解析した図である。図中、ＮＳは非特異的なバンドを示す。
Ｂは、８４−３、１７−１１、ＢＥα１６−３の細胞抽出液をＰＡＫ１ Ｒａｃ結合ドメインのＧＳＴ融合タンパク質でプルダウンし、抗Ｒａｃ抗体で染色することにより活性型Ｒａｃを検出した図である。
Ｃは、ＢＥα１６−３、１７−１１、８４−３をpropidium iodide及びファロイジン（phalloidin）で染色することで細胞の極性化及びアクチン重合につき検討した図である。
【図３】ＤＯＣＫ２がそのＳＨ３ドメインを介してＥＬＭＯ１と会合することを示す図である。
Ａは、ＤＯＣＫ２ ＳＨ３ドメインを含む１０−８９のアミノ配列を示す図である。グルタミン酸に置換したアミノ酸残基を太字で示す。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＤＯＣＫ２あるいはＤＯＣＫ２ ＳＨ３変異体をコードする遺伝子を、ＰｃＤＮＡ ＥＬＭＯ１−Ｖ５と共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し、免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＥＬＭＯ１との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図４】ＥＬＭＯ１がそのＣ末端の領域でＤＯＣＫ２に結合していることを示す図である。
Ａは、ＥＬＭＯ１及びこの実験で使用したＥＬＭＯ１欠失変異体の構造を模式的に示す図である。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子を、ＰｃＤＮＡ ＤＯＣＫ２−ＨＡあるいはコントロールベクターと共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＤＯＣＫ２との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図５】ＥＬＭＯ１がそのＮ末端の領域でＴｉａｍ１に結合していることを示す図である。
Ａは、ＥＬＭＯ１及びこの実験で使用したＥＬＭＯ１欠失変異体の構造を模式的に示す図である。
Ｂは、２９３Ｔ細胞にＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ１欠失変異体をコードする遺伝子を、ＰＣＩ Ｔｉａｍ１−ＨＡあるいはコントロールベクターと共にトランスフェクトし、４８時間後に細胞を回収し免疫沈降及びウェスタンブロット法を用いてＴｉａｍ１との結合を解析した図である。左側に解析に供したサンプルの種類、免疫沈降及びウェスタンブロットに用いた抗体を示す。
【図６】ＤＯＣＫ２によるＲａｃ活性化機構の模式図である。
ＤＯＣＫ２はＥＬＭＯ１を介して、ＲａｃのＧＥＦとして機能するＴｉａｍをリクルートすることでＲａｃを活性化することを示す図である。
Claims (12)
- ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯと被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯとの会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯのＣ末端領域との会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域と被検物質とを接触させ、次いでＤＯＣＫ２のＳＨ３ドメインとＥＬＭＯのＣ末端領域との会合形成の程度を評価することを特徴とするＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメイン及び／又はＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域が、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグと結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインに対する抗体又はＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインと融合した他のペプチドに対する抗体により分画されたＤＯＣＫ２若しくはそのＳＨ３ドメインに、ＥＬＭＯ若しくはそのＣ末端領域に対する抗体を作用させ、会合形成の程度を評価することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＧＴＰ結合型の活性型Ｒａｃを検出することにより、会合形成の程度を評価することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質が、リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質が、ＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの結合を阻害する物質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- ＥＬＭＯが、ＥＬＭＯ１であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法。
- 請求項１〜１０のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とするアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬の探索方法。
- 請求項１〜１１のいずれか記載のＤＯＣＫ２とＥＬＭＯとの会合に干渉する物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とするＲａｃを活性化して細胞骨格の再構築を促進する、リンパ球遊走抑制に起因する疾病に対する治療薬の探索方法。
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