JP3544830B2 - Detection method, detection device and detection reagent - Google Patents

Description

【０００８】
本発明に係る検出方法によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能となる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能となる。
【０００９】
また、本発明に係る検出装置は、物質に対し分岐プローブを結合させる手段と、前記分岐プローブを備えた物質より増幅された情報を獲得する手段と、を具備した検出装置であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴としている。
【化５】

【００１０】
本発明に係る検出装置によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能となる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能となる。
【００１１】
さらに、本発明に係る検出試薬は、物質に結合する分岐プローブを具備した検出試薬であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴としている。
【化６】

【００１２】
本発明に係る検出試薬によれば、増幅された多量の情報を発信することが可能となる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能となる。
【００１３】
本発明において、物質としては、遺伝子（ゲノム上のある長さをもった特定の区画：構造遺伝子）等の核酸、生体を構成する各種の蛋白質、各種の抗原や抗体、脂質、糖、ダイオキシンやＰＣＢ等の催奇性物質、ベロ毒素、ハチ毒およびヘビ毒等の動物毒、ＬＳＤ等の薬物、各種の電解質およびこれらの複合体等を挙げることができ、上記物質は、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、微生物、細菌、ウイルス、植物体、動物体、食品、薬品、土壌、河川および海水等のいずれに由来するものであってもよい。また、上記物質の検出に当たり、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、微生物、細菌、ウイルス、植物体、動物体、食品、薬品、土壌、河川および海水等を直接用いることも可能であるが、例えば、遺伝子診断においては、血液や羊水等を試料として、該試料より核酸を抽出してこれを検出することになる。試料より核酸等の物質を抽出する方法は、物質の検出を妨げる結果を招く操作を行わない限り特に限定されるものではなく、例えば、試料より核酸を検出するにあたっては、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法、担体を用いる固液抽出法あるいはＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）やスマイテス卜（住友金属社製）等の市販のキットを利用することが可能である。
【００１４】
また、第１および第２の標識としては、核酸、蛋白質、各種の抗原、抗体、脂質および糖等の各種の物質を用いることができるが、第１および第２の標識は、相互認識しかつ結合する物質の組み合わせとなっていなければならない。相互認識し、かつ結合する標識の組み合わせとしては、アビジンとビオチン、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体等の種々の抗原と抗体、互いに相補的な塩基配列を備えた２つの核酸分子、適当な大きさの有機化合物とシクロデキストリン等のホスト−ゲスト分子、各種のレセプターとアンタゴニスト分子、金とジチオスレイトール、チオール化した核酸等の硫黄含有分子を挙げることができる。ここで、第１および第２の標識が結合する際の解離定数は、検出感度の低下を防止する観点から１０^−３ｍｏｌ／Ｌ以下である事が望ましい。さらに、本発明においては、第２の標識を介して第３の標識が提示されるが、第３の標識に対し、第３の標識を認識する第４の標識を結合させ、第４の標識を介して第５の標識を提示させるようにして、標識を介した伸長反応をほぼ無限に実施することができる。このとき、物質に対しどの程度の数の標識を結合させるかは、物質の存在量、各標識を備えた物質より獲得される情報の質および量等により適宜設定すればよい。また、第３の標識以降の伸長反応の各段階において、相互認識しかつ結合する標識の組み合わせは上述した組み合わせを適用することができ、各物質が結合する際の結合定数は上述した値をとることが望ましい。また、各標識は、分子全体が標識として機能する構成であってもよいし、分子中の一部に標識を備えるような分子として構成されていてもよい。
【００１５】
ここで、各標識の組み合わせ方について、第１〜第３の標識を例として詳述する。前述したように、第１および第２の標識は、相互認識し、かつ結合する組み合わせでなければならないが、この条件を満たす各標識の組み合わせ方として、以下に示す組み合わせ方を挙げることができる。すなわち、１）第１および第３の標識を同一種の標識とする組み合わせ方、２）第１および第３の標識を異種の標識とする組み合わせ方、３）第２および第３の標識を同一種の標識とする組み合わせ方を挙げることができる。ここで、各組み合わせ方を適用した場合について検討する。はじめに、１）の組み合わせ方を適用した場合、第２および第３の標識は相互認識し結合することができるので、例えば、第２および第３の標識を同一の分子中に備えた分子を準備すれば、該分子を連続して結合し伸長させることにより、物質を多数の第２および第３の標識で修飾することができる。このとき、第２および第３の標識を同一の分子中に備えた分子において、第２および第３の標識間での分子内結合を防止するように該分子を構成しなければならない。この場合、該分子の第２および第３の標識の間にＰＢＬＧ（ｐｏｌｙ− γ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）等の分子を介在させたり、該分子全体の構造を、第２および第３の標識間での分子内結合が生じないように設計すれば、第２および第３の標識間での分子内結合を防止することができる。また、２）の組み合わせ方を適用した場合、第３の標識は第１および第２の標識のいずれとも相互認識せず、また結合もしないので、第３の標識と相互認識し結合する第４の標識を第３の標識に結合させ、第４の標識を介して第５の標識を呈示させる工程を繰り返すことで、物質を多様かつ多数の標識で修飾することができる。このとき、各標識のすべてを異種の標識とすることができ、また、第４および第５の標識を結合させる段階以降に、相互認識しかつ結合する標識を備えた分子を用いるようにしてもよい。なお、各標識のすべてを異なる標識とした場合には、各標識を備えた分子において、相互認識する標識の結合による分子内結合が生じないことから、該分子の設計を自由度をもって行うことができる。さらに、３）の組み合わせ方を適用した場合、第３の標識は第１の標識と相互認識して結合するものの、第２の標識とは相互認識せず、また結合もしないので、第３の標識と相互認識し結合する第４の標識（第１の標識）を第３の標識に結合させるとともに該第４の標識を介して第５の標識（第１の標識）を呈示させ、次いで、第５の標識と相互認識し結合する第６の標識（第２の標識）を第５の標識に結合させるとともに第６の標識を介して第７の標識（第２の標識）を呈示させる工程を繰り返すことで、物質を多数の標識で修飾することができる。このとき、各標識のすべてを第１および第３（第２）の標識で統一することができ、また、第３および第４の標識を結合させる段階から、相互認識しかつ結合する２つの標識を備えた分子を用いるようにしてもよい。なお、第２および第３の標識が同一種で、第４および第５の標識が同一種（第２と第４の標識は異種）の場合には、第２および第３の標識を分子中に備えた分子と、第４および第５の標識を分子中に備えた分子との間での分子間結合を防止するように伸長させなくてはならない。さらに、物質に対し標識を連続して伸長するように結合させる場合には、上述した各標識の組み合わせ方を必要に応じて適宜選択し、これを組み合わせることも可能である。さらに、物質と結合する第１の標識に第２および第３の標識を設けた分子を構築すれば、該分子種を用いるのみで、該分子を連続して結合し伸長させることができる。また、第２の標識を介して第３の標識を複数呈示するようし、該操作を連続して繰り返していけば、さらに多数の各標識によって物質を修飾でき、物質の検出感度をさらに向上させることができる。なお、第２の標識を介して第３の標識を複数呈示した場合には、分子の高次構造に基づく立体障害により標識を連続的に伸長することが困難となる可能性があるので、立体障害を防止する高次構造の予測に基づき、第２の標識を介して第３の標識を複数呈示する分子を設計する必要がある。
【００１６】
また、物質に対し第１の標識を結合させる手段は、物質と第１の標識とが結合する条件を提供できるものであれば、物質および第１の標識の種類等に基づいて適宜選択することができる。例えば、物質が遺伝子であり、第１の標識が特定の塩基配列を備えた核酸分子である場合には、第１の標識に物質と特異的に結合する塩基配列を備えた核酸分子を設けておき、物質と第１の標識を備えた核酸分子との間でハイブリダイゼーションを行うことによって、第１の標識を核酸分子に結合させることができるので、この場合にはハイブリダイゼーションを実施できる手段を選択すればよい。また、抗原抗体反応に基づいて第１の標識を物質に結合させる場合にも、抗原抗体反応を実施できる手段を選択すればよい。また、第１の標識に対し該第１の標識を認識する第２の標識を結合させ、かつ第２の標識を介して第３の標識を呈示させる手段としては、第１の標識と第２の標識とが相互認識し、かつ結合する条件を提供できるものであれば、第１および第２の標識の種類等に基づいて適宜選択することができる。例えば、第１の標識が特定の塩基配列を備えた核酸分子である場合には、第１の標識を認識し特異的に結合する塩基配列を備えた第２の標識と第１の標識との間でハイブリダイゼーションを行うことによって、第２の標識を第１の標識に結合させることができるので、この場合には、例えば、ハイブリダイゼーションの実施可能な環境が実現できる手段を選択すればよい。また、抗原抗体反応に基づいて第２の標識を第１の標識に結合させる場合にも、例えば、抗原抗体反応の実施可能な環境が実現できる手段を選択すればよい。なお、第３の標識は、第２の標識と同一分子内に存在していてもよいし、第２の標識とは分離されて存在していてもよいが、第１および第２の標識が結合する際に第２の標識を通じて呈示されなくてはならない。
【００１７】
また、標識を備えた物質より獲得される情報としては、標識より生じる信号や、標識あるいは標識の設けられた分子に予め固定化された標識剤より生じる信号等を挙げることができ、これらの情報を獲得するにあたっては、例えば、各標識を備えた物質に電圧を印加し、該印加した電圧によって生じた信号を測定する方法や、各標識を備えた物質に紫外線等を照射し、該紫外線の照射により生じた光学的な信号を測定する方法等を挙げることができる。電圧の印加によって生じた信号を測定する手段としては、例えば、電流値、電気伝導度、電位、抵抗値、電気容量、インダクタンスおよびインピーダンス等の電気的な信号を検出する手段や、蛍光、化学発光および電気化学発光を検出する手段を挙げることができる。また、紫外線の照射により生じた信号を測定する手段としては、例えば、蛍光を検出する手段を挙げることができる。
【００１８】
また、物質に対し各標識を連続的に結合させて伸長するにあたっては、該物質を予め担体に固定化しておくことが望ましい。これは、例えば、核酸分子間のハイブリダイゼーションを行う場合のように、物質に対し各標識を連続的に結合させて伸長する際に洗浄操作が必要なとき、該洗浄操作を容易に実施できるようにするためであるが、物質を担体に固定化するに際し、例えば、金、銀、銅、チタン、ニッケル、白金、炭素、水銀、パラジウム等の電極、光ファイバー、水晶振動子、ＩＳＦＥＴおよび各種の半導体素子等を担体とし、物質を該担体に固定化すれば、各標識を備えた物質からの情報を獲得するに際し電気的な測定を行う場合、容易に該情報を検出することが可能となる。また、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等、一般的に遺伝子操作に用いる担体であってもよく、ポリプロピレン等からなるマイクロタイタープレート、ポリスチレン、ラテックス等のビーズ、磁気微粒子、金コロイド等を担体として用いることも可能である。また、固定化の方法も特に限定されるものではなく、共有結合、物理吸着および化学吸着等により固定化することが可能てある。さらに、固定化に際しては、物質に特異的に結合する、例えば、抗体、抗原または核酸等の物質をあらかじめ担体に結合しておき、該物質を介して担体に対し物質を結合してもよい。
【００１９】
さらに、本発明に係る検出試薬は、上記第１および第２の標識を備えていればよいが、例えば、抗体、抗原または核酸等の物質と特異的に結合する物質を担体に結合しておき、上記標識とともに該担体を備えるように構成することも可能である。さらに、標識を介した伸長反応を実施する際に用いる緩衝液や酵素等を備えるように構成することも可能である。なお、検出試薬は、ＤＮａｓｅ 、ＲＮａｓｅ あるいは各種のプロテアーゼ等により汚染されないよう密閉して保存できるように構成する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２１】
はじめに、第２および第３の標識としてアビジンおよびビオチンを適用し、一分子中にアビジンおよびビオチンを備えた物質を用いた検出方法について説明する。この場合、分子中のアビジンおよびビオチンにより分子内結合が生じないよう、分子中のアビジン−ビオチン間にスペーサを配置したり、剛直な分子構造をとらせたり、またはアビジン−ビオチン間で結合が生じない分子構造をとらせる必要があることから、例えば、α−ヘリックス構造を備えたポリアミド、ポリイミド、アラミド繊維、ステロイド、カリックスアレン、アルケン等の分子を介して、その末端にアビジンおよびビオチンをそれぞれ導入する。なお、アビジンおよびビオチンを導入するにあたっては、これを複数導入してもよく、また必ずしも同数である必要はない。また、上述したように、アビジンおよびビオチンをそれぞれ異なる分子にのみ備えるように構成することもでき、このとき、物質に対し各標識を連続的に結合させて伸長させる場合には、同一分子中にアビジンあるいはビオチンが２つ以上存在するように構成することが望ましい。なお、必要に応じて、アビジンおよび／またはビオチンを導入した分子を、例えば、ルミノ一ルおよびアクリジニュウムエステル誘導体等の発光物質、ＦＩＴＣおよびローダミン等の蛍光物質、ルテニウム錯体、ルシゲニンおよびユウロピウム等の電気化学発光物質、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ等の酵素、トリニトロベンゼンスルホン酸およびジニトロベンゼンスルホン酸等のハプテン、ビオチン、アビジン、スピンラベル剤および放射性同位元素等の標識剤により予め標識しておくことも可能である。また、標識剤として、ビオローゲン、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ピスベンズイミダゾール、エチジウム、エチジウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマイシンマイトマイシン、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ピピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体、フェロセンカルポン酸、フェロセンアルデヒド等のフェロセン誘導体、フェリ／フェロシアン化カリウム、ハイドロキノン、カフェイン酸等のキノン誘導体等の電気化学的に活性な物質を適用することもできる。こうして、物質の備えた多数の標識剤より得られる情報を獲得すれば、高感度な物質の検出を実施することが可能となる。なお、電気化学的に可逆的な酸化還元を示す挿入剤を適用した場合、電位走査を数回〜数百回繰り返すことで酸化還元電流を繰り返して測定できることから検出信号の効果的な増幅を行うことが可能になり、さらに高感度な物質の検出を実施することが可能となる。例えば、アビジンおよびビオチンを同一分子内に備えた物質により、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出する場合には、ニトロセルロースフィルタに対しＨＢＶの遺伝子に対して特異的に結合するプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）を固定化する。ここに、ＨＢＶを含む、あるいは含まれると思われるサンプルおよびＨＢＶに対して特異的に結合し、かつプローブＡとは異なる塩基配列を備えたプロ一ブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行う。なお、プローブＢはあらかじめアビジンで標識してある。ハイブリダイゼーション反応後、蛍光色素フルオレセインで標識され、同一分子内に分子量１０００のポリエチレンを介してアビジンおよびビオチンが導入された分子を添加する。ここで、該分子を同時にあるいは交互に添加すると、該分子はアビジンおよびビオチンの結合により次々と結合してゆくので、アビジンおよびビオチンによる多量の情報（信号）を得ることが可能となる。最後に、フィルタを洗浄し、該フィルタより生じる蛍光強度を測定すれば、ＨＢＶ遺伝子の検出を行うことができる。
【００２２】
また、第２および第３の標識としてアビジンおよびビオチンを適用した場合、アビジンおよびビオチンは異種の分子内にそれぞれ存在していてもよいが、この場合には、それぞれの分子内にアビジンおよびビオチン分子の少なくとも一方が複数存在する必要がある。この条件は、アビジンおよびビオチンを第２および第３の標識として用いた場合に限定されず、相互認識し結合しうる全ての標識に共通である。例えば、同一分子内にアビジン２つ備えた分子Ａと、同一分子内にビオチンを２つ備えた分子Ｂを合成し、該分子Ａおよび分子Ｂを用いてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出する場合には、ニトロセルロースフィルタにＨＢＶに対するプローブＡを固定化する。ここに、ＨＢＶを含む、あるいは含むと思われるサンプルおよびＨＢＶに対するプローブＢを添加してハイブリダイゼーションを行う。なお、分子Ａおよび分子Ｂはあらかじめ蛍光色素（フルオレセイン）で標識され、プローブＢはあらかじめアビジンで標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、蛍光色素で標識した分子Ａおよび分子Ｂを交互あるいは同時に添加する。最後に、フィルタを洗浄し、該フィルタより生じる蛍光強度を測定すれば、ＨＢＶ遺伝子の検出を行うことができる。
【００２３】
さらに、第２および第３の標識として核酸分子を用いた場合には、検出感度を向上させる目的から、例えば、図１および図２に示した分岐プローブを適用できる。このとき、ＤＮＡ合成装置を用いてフォスフォアミダイト法で３′−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−５′からなる塩基配列を備えた核酸を合成した後に、例えば、下記一般式で示される試薬を２回作用させ、その後、３′−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＣ−５′からなる塩基配列を備えた核酸を合成する。すると、５つに枝別れした分岐プローブ（図１）を得ることができる。また、上記試薬を３回作用させ、その後、３′−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＣ−５′からなる塩基配列を備えた核酸を合成すると、９つに枝別れした分岐プローブ（図２）を得ることができる。なお、上記試薬を作用させる回数は、分岐プローブに要求される枝別れ数（側鎖の数）に応じて適宜設定すればよい。
【００２４】
【化７】

一方で、分岐プローブ間を結合させる直鎖の核酸分子５′−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３′を同様に合成しておく。そして、分岐プローブと該核酸分子とを交互に添加してハイブリダイゼーションを実施すれば、分岐プローブの備えた枝（側鎖）の数に応じて更に側鎖が広がるように伸長することになる。したがって、分岐プローブおよび／または分岐プローブ間を結合させる直鎖の核酸に標識剤により標識をしたり、あるいは最後のハイブリダイゼーションが実施された段階で標識剤により核酸を標識して増幅された信号を獲得すれば、簡単に高感度な物質の検出が可能になる。もちろん、核酸に基づく情報（信号）を獲得する場合も全く同様にして簡単に高感度な物質の検出が可能になる。なお、分岐直後の核酸には、側鎖に起因する立体障害のため分岐プローブ間を結合させる直鎖の核酸が結合しにくくなる傾向があるので、５塩基以上からなるスペーサを導入することが望ましい。また、上記分岐プローブの作製に際しては、上記立体障害を防止する観点から、以下に示した式（１）を満足するように作製することが望ましい。すなわち、分岐プローブ中の分岐（側鎖）の数をＬ、核酸の長さ（塩基の数）をｎ、試薬による反応回数をｍとすると、
１０³ｎ（Ｌ＋１）（１−Ｌ^m）／（１−Ｌ）＜１．３×１０³ｎ³ｍ³ （１）
を満たすｎ、ｍおよびＬの組み合わせから選択して分岐プローブを作製することが望ましい。さらに、この条件で、Ｌ^mが最大になる組み合わせから選択して分岐プローブを作製することが望ましい。上記分岐プローブおよび分岐プローブ間を結合する核酸により、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出する場合には、ニトロセルロースフィルタに対しＨＢＶの遺伝子に対して特異的に結合するプローブＡを固定化する。ここに、ＨＢＶを含む、あるいは含まれると思われるサンプル、ＨＢＶと分岐プローブとに対して特異的に結合し、かつプローブＡとは異なる塩基配列を備えたプロ一ブＣ、分岐プローブおよび分岐プローブ間を結合する核酸を添加してハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション反応後、図３に示したように、フェロセン３１で分岐プローブ３２間を結合する核酸３３を標識すると、フェロセン３１による多量の情報（信号）を得ることが可能となる。最後に、ニトロセルロースフィルタを洗浄し、該フィルタを通じて電圧を印可してフェロセンより生じる電流値を測定すれば、ＨＢＶ遺伝子の検出を行うことができる。なお、上記ハイブリダイゼーションは、通常、イオン強度０．０１〜５、ｐΗ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。緩衝液中にはハイブリダイゼーションの促進剤である硫酸デキストラン、サケ精子ＤＮＡやウシ胸腺ＤＮＡ等のキャリア核酸、核酸の分解を防止するためにＥＤΤΑおよび界面活性剤等を添加することが可能である。ハイブリダイゼーションを行う際にキャリア核酸が混在する場合にはハイブリダイゼーションを阻害する可能性があるのでキャリア核酸の添加には慎重を期し、必要に応じて既知の塩基配列からなるキャリア核酸を添加するとよい。一方、試料より抽出した核酸がＤＮＡの場合には、９０℃以上で熱変性させ緩衝液中に混合する。なお、試料より抽出した核酸を９０℃以上で熱変性させた後、０℃で急冷して緩衝液中に混合することもできる。また、試料より抽出した核酸がＲＮＡの場合には、特に熱変性を実施する必要はない。ハイブリダイゼーション中は、攪拌又は震盪等の操作を行って反応速度を高めることも可能である。そして、１０〜９０℃の下、１分以上１晩程度の反応時間でハイブリダイゼーションを行えばよい。
【００２５】
また、図４は、電極を用いた検出装置の一実施形態を示した図である。図４において、４１は物質と特異的に結合するプローブ４２を固定化した電極、４３は反応槽であり、電源４４が電極４１および反応槽４３を介して回路を形成するように接続されている。また、回路の内部には、電流計４５、電圧計４６および可変抵抗４７が配置されており、反応槽４３内でハイブリダイゼーション等の反応を行った後に電圧を印加して回路に流れる電流等を測定するように構成されている。なお、反応槽４３の内部に保持される溶液は容易に置換することができ、測定時には反応槽４３の内部を新鮮なハイブリダイゼーション溶液等で置換することが可能である。図４における検出装置によれば、反応槽４３の内部に緩衝液（例えば、ハイブリダイゼーション溶液）、物質あるいは該物質を備えたサンプルおよび第１〜第３の標識を保持させ、それぞれの間でハイブリダイゼーション等の反応を行ってそれぞれを結合させる。このとき、ハイブリダイゼーションを行った場合には、該ハイブリダイゼーションの温度および時間は上述したように設定されることが望ましい。また、抗原抗体反応やゲスト−ホスト等の間の反応の場合にも、適宜反応条件を設定すればよい。次いで、好ましくは、反応槽４３および電極４１を洗浄し、反応槽４３の内部に新鮮な溶液（例えばハイブリダイゼーション溶液）を満たして電源４４を動作させ、電流値あるいは電圧値等を電流計４５や電圧計４６を用いて測定する。そして、測定結果より、サンプル中に含まれる物質の存在および量（濃度）が算出される。なお、上述したように、各種の標識剤を用いて検出感度をより向上させることが可能である。ここで、上記電極は、例えば、図５および図６に示した構成をとることができる。図５および図６は、上記電極の構成例を示す上面図（図５（ａ）および図６（ａ））およびＡ−Ｂ線で切断した場合の断面図（図６（ｂ）および図６（ｂ））である。図５においては、電極の基礎をなす基板５２上に導電体５１を形成している。そして、導電体５１および基板５２の一部に絶縁体５４を形成させた後、フォトリソグラフィーにより開口して露出した導電体からなる開口部５３を形成している。また、図６においては、電極の基礎をなす基板５２上に、まず接着層５５を形成している。そして、接着層５５の上に導電体５１を形成させた後、フォトリソグラフィーにより開口して露出した導電体からなる開口部５３を形成させている。
【００２６】
また、図７および図８は、上記電極を用いて完全に自動化された検出装置の一実施態様の構成を示す図である。
【００２７】
図７および図８において、検出装置は、上記の電極を具備した電極ホルダーと、上記電極および試料（物質）を反応させるための、温度可変の反応槽を具備した反応部と、反応（ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応等による標識の連続的な伸長反応）後に電極を洗浄するための、温度可変の洗浄槽を具備した第一洗浄部と、反応後の洗浄済み電極を挿入剤等の標識剤と反応させるための、温度可変の標識剤溶液槽を具備した標識剤反応部と、標識剤による反応後に電極を洗浄するための、温度可変洗浄槽を具備した第二洗浄部と、標識剤による反応後の洗浄済み電極の電気化学測定を行うための電気化学的測定部と、前記の電気化学的測定により得たデータを分析するための分析ユニットと、上記の一連の反応（ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応等による標識の連続的な伸長反応）、洗浄、標識剤による反応、洗浄、電気化学的測定を制御するための操作ユニットと、前記の反応部、第一洗浄部、標識剤反応部、第二洗浄部、電気化学的測定部を隣接してのせた移動装置とを備えている。なお、上記検出装置には、さらに、検出用の試料（検体）を搬入する搬入口と、試料から核酸等を抽出するための試料調整ユニットと、該搬入口と該試料調製ユニットとの間および該試料調製ユニットと前記反応部との間の、試料の移動を行う搬送ユニットと、前記の反応（ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応等による標識の連続的な伸長反応）、洗浄、挿入剤反応時に生じる廃液を保管する気ための廃棄物保管ユニットとを備えていることが好ましい。
【００２８】
図７に示した検出装置７０は、上記電極を保持するための電極固定ホルダ７１、反応槽７２、第１洗浄槽７３、標識剤反応槽７４、第２洗浄槽７５および電気化学測定槽７６、並びに反応槽７２、洗浄槽７３、標識剤反応槽７４、洗浄槽７５および電気化学測定槽７６をのせた移動装置７７、並びに分析ユニット７８および操作ユニット７９を具備している。これらの槽の間での電極の移動は、移動装置７７を使って反応槽７２等を動かすことにより達成される。反応槽７２に、試料あるいは予め試料から抽出しておいた核酸等の物質を含有した溶液を入れておき、電極固定ホルダ７１に固定された上記電極を反応槽７２に浸す。次いで、反応槽７２中で、物質とプローブを固定化した電極との結合および物質に標識を連続的に結合させて伸長反応を行う工程と、洗浄工程と、標識剤反応工程と、洗浄工程と、電気化学工程とを順次行う。次の第１洗浄槽７３では、通常、電極を２５℃から８０℃の間で温度制御しながら洗浄する。この工程により、非特異的に電極に結合した核酸や蛋白質等を取り除くことができる。次に、標識剤溶液槽７４で、洗浄済み電極を２５℃から８０℃の間の温度で制御して、標識剤と電極上に形成された物質−標識複合体との反応を行わせる。次の第２洗浄槽７５では、電極を２５℃から８０℃の間で温度制御しながら洗浄する。更に、電気化学測定槽７６で、電気的な測定を行う。測定終了後、分析ユニット７８に予め記録されている検量線を参考にして試料中の検出対象の物質（例えば、遺伝子等）の濃度がアウトプットされる。以上の操作を、それぞれの槽及びユニットと電気的につながれた操作ユニット７９を通じて行う。また、図８に示した検出装置８０は、図７に示した検出装置に加えて、試料搬入口８１と、試料調製ユニット８３と、該試料搬入口８１と該試料調製ユニット８３との間、および該試料調製ユニット８３と上記検出装置７０との間を結ぶ試料搬送ユニット８２、並びに廃棄物保管ユニット８５とを備えている。この態様においては、試料を試料搬入口８１に入れた後、該試料は、試料搬送ユニット８２を通って試料調製ユニット８３に運ばれ、該試料調製ユニット８３で核酸等の物質の抽出や菌体の洗浄等が行われる。抽出された物質は該試料搬送ユニッ卜８２を通って上記検出装置７０に運ばれて上述した検出が行われる。また、廃棄物保管ユニット８５に、洗浄工程等において生じた廃棄物を一時的に保存する。なお、上記実施の形態においては、電極固定ホルダに電極を保持し、電気的な測定を電気化学測定槽で行っているが、電極の代わりにマイクロタイタープレートを適用することもできるし、電気化学測定槽の代わりに光学的な測定を行う光学機器を搭載するように構成することもでき、検出装置の各構成は、検出に用いる物質や検出する情報の量および質に鑑みて適宜設定すればよい。
【００２９】
また、図９、図１０および図１１は、検出試薬の一実施態様の構成を示す図である。図９に示したように、検出試薬９０は、直径０．３ｍｍの開口部５３を備えた金電極５０、チューブ９１および９２を備えており、金電極５０、チューブ９１および９２は、例えば、以下に示す構成を備えている。すなわち、ＨＢＶ遺伝子検出試薬として、開口部５３にＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）を固定化し、チューブ９１にはＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えアビジンで標識されたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）が収納されるとともに、チューブ９２には分子量１０００のＰＢＬＧ分子の末端にアビジンとビオチンが導入され、さらにへキスト３３２５８で標識された分子Ｃが収納された構成である。また、他のＨＢＶ遺伝子検出試薬として、開口部５３にＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡを固定化し、チューブ９１にはＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えアビジンで標識されたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）が収納されるとともに、チューブ９２には同一分子内にビオチンを複数備えフェロセンで標識した分子Ｄおよびフェロセンで標識したアビジンからなる分子Ｅが収納された構成である。なお、分子ＥはポリエチレンイミンとＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｄ−ｂｉｏｔｉｎ とカルボキシフェロセンを反応させて得ることができる。さらに、ＨＣＶ遺伝子検出試薬として、開口部５３にＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＤ（５’−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’）を固定化し、チューブ９１にはＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＥ（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）が収納されるとともに、チューブ９２にはプローブＥと結合する分岐プローブおよびフェロセンで標識され分岐プローブ同士を結合させるプローブＦ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）が収納された構成である。
【００３０】
また、図１０に示したように、検出試薬１００は、抗血清抗体を固定化したラテックスビーズを収納したチューブ１０１、アビジン標識した抗ＡＦＰ抗体を収納したチューブ１０２、分子量１００００のＰＢＬＧを介してアビジンおよびビオチンを備えＨＲＰ酵素で標識された物質Ｆを収納したチューブ１０３およびＨＲＰ酵素の基質としてＡＢＴＳを収納したチューブから構成されている。 さらに、図１１に示したように、検出試薬１１０は、各ウェル１１１にＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＧ（５’−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ−３’：ＳＫ３８）を固定化したマイクロタイタープレート１１２、５’末端にチオール基を導入しＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＨ（５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’：ＳＫ３９）を収納したチューブ１１３、金のコロイド粒子を収納したチューブ１１４およびジチオスレイトールを収納したチューブから構成されている。なお、本発明に係る検出試薬は、上記実施の形態に何ら限定されるものではなく、標識の種類および保存形態等は検出対象となる物質や標識の特性等にあわせて適宜設定されることはいうまでもない。
【００３１】
（実施例１）
実施の形態に記載した検出装置を用いて血清中よりＨＢＶの検出を行った。はじめに、ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）は、５’末端にチオール基が導入され、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化されている。次に、ＨＢＶの核酸を含むサンプルおよびＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブＢはあらかじめアビジンにて標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、分子量１０００のＰＢＬＧ分子の末端にアビジンとビオチンが導入されヘキスト３３２５８で標識された分子を添加し、洗浄後、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＢＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として５０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＢＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、１００ｎＡのヘキスト３３２５８に由来の電流値が得られた。したがって、１０００コピー以上のＨＢＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３２】
（実施例２）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＢＶの核酸を含むサンプルおよびＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブＢはあらかじめアビジンにて標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、同一分子内にアビジン４つ備えフェロセンで標識された分子Ｆと、同一分子内にビオチンを４つ備えフェロセンで標識された分子Ｇとを添加し、洗浄後、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＢＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として１０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＢＶを１００００コピー含む試料の場合１００ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、１００００コピー以上のＨＢＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３３】
（実施例３）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＢＶの核酸を含むサンプルおよびＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブＢはあらかじめアビジンにて標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、同一分子内にアビジンを２つ備えフェロセンで標識された分子Ｈを添加して洗浄し、同一分子内にビオチンを２つ備えフェロセンで標識された分子Ｉを添加した。上記分子Ｈおよび分子Ｉによる伸長反応を３０回繰り返し、洗浄後、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＢＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として１０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＢＶを５０００コピー含む試料の場合５０ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、５０００コピー以上のＨＢＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３４】
（実施例４）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離し、あらかじめ抗血清抗体を固定化したラテックスビーズと反応させた。次に、該ラテックスビーズとアビジンにより標識した抗ＡＦＰ抗体とを反応させ、洗浄後、分子量１００００のＰＢＬＧを介してアビジンおよびビオチンを備えた分子Ｊを添加した。なお、分子ＪはあらかじめＨＲＰ酵素で標識されている。上記反応後、洗浄を行って基質ＡＢＴＳを添加し吸光度を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた吸光度から評価した。その結果、ＡＦＰを０．１ｐｇ含む試料の場合、ＡＦＰを含まない試料を用いた場合と比較して吸光度の変化が有為に観察された。したがって、０．１ｐｇ以上のＡＦＰを検出できることが確認された。
【００３５】
（実施例５）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＤ（５′−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＣＶの核酸を含むサンプルおよびＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＥ（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。次に、図１に示した構成の分岐プローブと、フェロセンで標識され該分岐プローブを連続的に伸長させるためプローブＦ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）とを交互に添加して１０回にわたりハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行い、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＣＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＣＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として５０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＣＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、１００ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、１０００コピー以上のＨＣＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３６】
（実施例６）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＤ（５′−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＣＶの核酸を含むサンプルおよびＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＥ（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。次に、図２に示した構成の分岐プローブと、フェロセンで標識され該分岐プローブを連続的に伸長させるためプローブＦ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）とを交互に添加して１０回にわたりハイブリダイゼーションを行った。さらに、フェロセンにて標識されたプローブＧ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーション行い、ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行って燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）により電流値を測定した。また、ＨＣＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＣＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として５０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＣＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、１００ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、１０００コピー以上のＨＣＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３７】
（実施例７）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＨ（５′−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ−３’：ＳＫ３８）をマイクロタイタープレートのウェルの底部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＩＶの核酸を含むサンプルおよびＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備え、５’末端にチオール基が導入されたプローブＩ（５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’：ＳＫ３９）を添加してハイブリダイゼーションを行った。次に、金コロイド粒子を添加して洗浄しジチオスレイトールを反応させた。金コロイド粒子の添加とジチオスレイトールによる反応を１０回繰り返した後、金コロイドの凝集の程度を確認した。なお、ＨＩＶを含まない試料を用いた場合には、金コロイドの凝集塊はほとんど観察されなかった。これに対し、ＨＩＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、金コロイドの凝集塊が大きく成長していた。したがって、１０００コピー以上のＨＩＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３８】
（実施例８）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗ダイオキシン抗体を結合させた。次に、ビオチン標識したダイオキシンとダイオキシンが含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジンおよび同一分子内にビオチンを複数備えた物質Ｋを交互に１０回にわたり添加した。なお、物質Ｋは、ポリエチレンイミンと５−（ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｅｎｔｙｌ Ｄ−ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｅ とを反応させて得た。最後に、ビオチン標識したＨＲＰ酵素を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、ダイオキシンを０．１ｐｇ含む試料を用いた場合には、ダイオキシンを含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、０．１ｐｇ以上のダイオキシンを検出できることが確認された。
【００３９】
（実施例９）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗ベロ毒素抗体を結合させた。次に、ビオチン標識したベロ毒素とベロ毒素が含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジンおよび同一分子内にビオチンを複数備えた物質Ｋを交互に１０回にわたり添加した。最後に、ビオチン標識したＨＲＰ酵素を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、ベロ毒素を０．１ｐｇ含む試料を用いた場合には、ベロ毒素を含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、０．１ｐｇ以上のベロ毒素を検出できることが確認された。
【００４０】
（実施例１０）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗大腸菌抗体を結合させた。次に、ビオチン標識した抗Ｏ−１５７抗体と大腸菌が含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジンおよび同一分子内にビオチンを複数備えた物質Ｋを交互に１０回にわたり添加した。最後に、ビオチン標識したＨＲＰ酵素を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、大腸菌Ｏ−１５７を１００個含む試料を用いた場合には、大腸菌Ｏ−１５７を含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、１００個以上の大腸菌Ｏ−１５７を検出できることが確認された。
【００４１】
（実施例１１）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗大腸菌抗体を結合させた。次に、ビオチン標識した抗Ｏ−１５７抗体と大腸菌が含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、Ｏ−１５７血清およびＯ−１５７抗体を交互に１０回にわたり添加した。最後に、ＨＲＰ酵素を結合した抗Ｏ−１５７抗体を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、大腸菌Ｏ−１５７を１００個含む試料を用いた場合には、大腸菌Ｏ−１５７を含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、１００個以上の大腸菌Ｏ−１５７を検出できることが確認された。
【００４２】
【発明の効果】
以上、詳述したように、本発明に係る検出方法によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能な検出方法を提供することができる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能な検出方法を提供することができる。
【００４３】
また、本発明に係る検出装置によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能な検出装置を提供することができる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能な検出装置を提供することができる。
【００４４】
さらに、本発明に係る検出試薬によれば、増幅された多量の情報を発信することが可能な検出試薬を提供することができる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能な検出試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】分岐プローブの構成を示した図である。
【図２】分岐プローブの構成を示した図である。
【図３】分岐プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った場合の模式図である。
【図４】検出装置の実施形態を示した図である。
【図５】電極の構成例を示した図である。
【図６】電極の構成例を示した図である。
【図７】電極を備えた検出装置の一実施態様を示した図である。
【図８】電極を備えた検出装置の一実施態様を示した図である。
【図９】検出試薬の一実施態様を示した図である。
【図１０】検出試薬の一実施態様を示した図である。
【図１１】検出試薬の一実施態様を示した図である。
【符号の説明】
１０、２０……分岐プローブ ３１……フェロセン
３２……分岐プローブ ３３……核酸
３４……ニトロセルロースフィルタ ３５……プローブＡ
３６……プローブＣ ４１……電極 ４２……プローブ
４３……反応槽 ４４……電源 ４５……電流計 ４６……電圧計
５１……導電体 ５２……基板 ５３……開口部 ５４……絶縁体
５５……接着層 ７０、８０……検出装置 ７１……電極固定ホルダ
７２……反応槽 ７３……第１洗浄槽 ７４……標識剤溶液槽
７５……第２洗浄槽 ７６……電気化学測定槽 ７７……移動装置
７８……分析ユニット ７９……操作ユニット ８１……試料搬入口
８２……試料搬送ユニット ８３……試料調製ユニット
８４……制御ユニット ８５……廃棄物保管ユニット
８６……廃液保管ユニット ８７……試薬供給ユニット
８８……分析ユニット ９０、１００、１１０……検出試薬
９１、９２、１０１〜１０３、１１３〜１１４……チューブ
１１１……ウェル １１２……マイクロタイタープレート[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a detection method, a detection device, and a detection reagent for detecting substances such as nucleic acids, proteins, and organochlorine compounds.
[0002]
[Prior art]
Generally, genetic information defined by a gene is translated into a protein such as an enzyme or a hormone via a messenger RNA, and the living body is maintained by the action of the protein or the enzyme. By the way, the total number of human genes is said to be 50,000 to 100,000. However, if any abnormality or change (for example, deletion, duplication, etc.) occurs in those genes, the characteristics, type, and Since the amount or the like is changed or the protein is not synthesized, homeostasis in a biological system cannot be maintained, and a disorder such as various diseases is caused in a living body. Therefore, the biologicalgeneBy detecting, disease can be identified or prevented. Further, by detecting genes such as viruses and bacteria present in the living body, the occurrence of diseases caused by the viruses and bacteria can be suppressed, or by quantifying the detected genes, the degree of progression of the diseases can be reduced. You can know.
[0003]
In recent years, disease identification and preventiongeneHow to diagnose based ongeneDiagnosis)geneIt has become possible with the advancement of engineering. In addition, various antigens, for example, antigens such as AFP and CEA used as cancer markers and hormones are detected by using an immunological technique, which is useful for diagnosis of diseases such as cancer.
[0004]
By the way, in the field of gene diagnosis, the detection sensitivity has been increasing. For example, in the case of hepatitis C virus gene diagnosis, 10⁵-10⁶Sensitivity that can detect nucleic acids up to about copy / mL is required. Similarly, high detection sensitivity is also required in tests of viruses and bacteria such as HIV and HBV, detection of cancer genes, and the like, and further higher sensitivity is required. Further, in order to reduce the burden on the patient, the amount of the sample to be collected has been reduced, and in the measurement of blood electrolytes and the like, detection has already been performed from a sample of several microliters. In addition, since proteins such as cancer markers and hormones are present only in minute amounts in living organisms, higher sensitivity is inevitably required for their detection. Conventionally, the above-mentioned substance is labeled with, for example, a chemiluminescent substance, a radioisotope, a fluorescent substance, or the like to obtain a signal from the label, or the substance is amplified by an enzymatic reaction such as polymerase chain reaction (PCR method). Have been detected.
[0005]
However, the method of obtaining a signal from a label by performing labeling with a chemiluminescent substance, a radioisotope, a fluorescent substance, or the like has insufficient sensitivity, and it is difficult to cope with the required high sensitivity. There was a problem. In addition, in a method of amplifying a substance by an enzymatic reaction such as a PCR method, an expensive enzyme such as Taq polymerase must be used, and there is a problem that a large economical burden is required for detection.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above conventional example, and has as its object to provide a detection method, a detection apparatus, and a detection reagent which are excellent in economic efficiency and operability while detecting a substance with high sensitivity.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The detection method according to the present invention is a detection method comprising: a step of binding a branch probe to a substance; and a step of acquiring information amplified from a substance having the branch probe. It is characterized in that it is produced by reacting a nucleic acid with a reagent represented by the following general formula, and further synthesizing a side chain nucleic acid from this reaction part.
Embedded image

[0008]
According to the detection method according to the present invention,IfSince a wide range of information can be obtained, a substance can be detected with high sensitivity. MaTa, YuIt is possible to exhibit excellent economy and operability.
[0009]
Further, the detection device according to the present invention is a detection device comprising: means for binding a branch probe to a substance; and means for acquiring information amplified from a substance having the branch probe. The probe is characterized in that it is prepared by reacting a nucleic acid with a reagent represented by the following general formula, and further synthesizing a side chain nucleic acid from the reaction part.
Embedded image

[0010]
According to the detection device according to the present invention,IfSince a wide range of information can be obtained, a substance can be detected with high sensitivity. MaTa, YuIt is possible to exhibit excellent economy and operability.
[0011]
Further, the detection reagent according to the present invention is a detection reagent provided with a branched probe that binds to a substance, wherein the branched probe reacts a nucleic acid with a reagent represented by the following general formula, It is characterized by being produced by synthesizing a nucleic acid for use.
Embedded image

[0012]
According to the detection reagent of the present inventionIfIt is possible to transmit a wide range of information. MaTa, YuIt is possible to exhibit excellent economy and operability.
[0013]
In the present invention, substances include nucleic acids such as genes (specific sections having a certain length on the genome: structural genes), various proteins constituting the living body, various antigens and antibodies, lipids, sugars, dioxins, and the like. Teratogenic substances such as PCB, vero toxin, animal poisons such as bee venom and snake venom, drugs such as LSD, various electrolytes and complexes thereof, and the like. The above substances include blood, leukocytes, serum, It may be derived from urine, feces, semen, saliva, cultured cells, tissue cells, microorganisms, bacteria, viruses, plants, animals, foods, drugs, soil, rivers, seawater, and the like. In the detection of the above substances, blood, leukocytes, serum, urine, feces, semen, saliva, cultured cells, tissue cells, microorganisms, bacteria, viruses, plants, animals, foods, drugs, soil, rivers, seawater, etc. Can be used directly. For example, in genetic diagnosis, blood, amniotic fluid, or the like is used as a sample, and nucleic acids are extracted from the sample and detected. The method of extracting a substance such as a nucleic acid from a sample is not particularly limited as long as an operation that results in hindering the detection of the substance is not performed.For example, in detecting a nucleic acid from a sample, a phenol-chloroform method or the like is used. It is possible to use a liquid-liquid extraction method, a solid-liquid extraction method using a carrier, or a commercially available kit such as QIAamp (manufactured by QIAGEN) or Smitest (manufactured by Sumitomo Metal).
[0014]
Also, the firstAnd the secondAs the label, various substances such as nucleic acids, proteins, various antigens, antibodies, lipids and sugars can be used, and the first and second labels are a combination of substances that recognize and bind to each other. Must be. Examples of the combination of labels that recognize and bind to each other include various antigens and antibodies such as avidin and biotin, DNP and anti-DNP antibody, two nucleic acid molecules having base sequences complementary to each other, and an appropriately sized organic molecule. Examples include compounds and host-guest molecules such as cyclodextrin, various receptors and antagonist molecules, gold and dithiothreitol, and sulfur-containing molecules such as thiolated nucleic acids. Here, the dissociation constant when the first and second labels bind is 10 from the viewpoint of preventing a decrease in detection sensitivity.^-3mol / L or less is desirable. Furthermore, in the present invention, the third label is presented via the second label, and the fourth label that recognizes the third label is bound to the third label. , The fifth label can be presented via, and the extension reaction via the label can be performed almost infinitely. At this time, the number of labels to be bound to the substance may be appropriately set depending on the amount of the substance, the quality and amount of information obtained from the substance having each label, and the like. In addition, in each stage of the extension reaction after the third label, the combination of the labels that recognize and bind to each other can apply the above-described combination, and the binding constant when each substance binds takes the above-described value. It is desirable. Further, each label may be configured such that the entire molecule functions as a label, or may be configured as a molecule in which a part of the molecule is provided with the label.
[0015]
Here, how to combine the respective signs will be described in detail by taking the first to third signs as an example. As described above, the first and second labels must be a combination that recognizes and binds to each other, and the following combinations can be given as examples of combinations of the labels that satisfy this condition. That is, 1) a combination in which the first and third labels are of the same kind, 2) a combination in which the first and third labels are of different types, and 3) the combination of the second and third labels. There can be mentioned a combination method that forms a kind of sign. Here, the case where each combination method is applied will be examined. First, when the combination method 1) is applied, since the second and third labels can recognize and bind to each other, for example, a molecule having the second and third labels in the same molecule is prepared. The substance can then be modified with multiple second and third labels by successively binding and extending the molecule. At this time, in a molecule having the second and third labels in the same molecule, the molecule must be configured so as to prevent intramolecular binding between the second and third labels. In this case, a molecule such as PBLG (poly-γ-benzyl-L-glutamate) is interposed between the second and third labels of the molecule, or the structure of the whole molecule is changed to the second and third labels. If the design is made so that no intramolecular bonding occurs between the labels, the intramolecular bonding between the second and third labels can be prevented. Further, when the combination of 2) is applied, the third label does not recognize and bind to either of the first and second labels, and therefore, the fourth label that recognizes and binds to the third label is used. Is attached to the third label, and the step of presenting the fifth label via the fourth label is repeated, whereby the substance can be modified with various and numerous labels. At this time, all of the labels can be different types of labels, and after the step of binding the fourth and fifth labels, molecules having labels that recognize and bind to each other may be used. Good. When all of the labels are different labels, since intramolecular bonding does not occur due to binding of the labels recognizing each other in the molecule having each label, it is possible to design the molecule with a degree of freedom. it can. Furthermore, when the combination of 3) is applied, the third label mutually recognizes and binds to the first label, but does not mutually recognize and binds to the second label. A fourth label (the first label) that mutually recognizes and binds to the label is bound to the third label and the fifth label (the first label) is presented via the fourth label, A step of binding a sixth label (second label) mutually recognizing and binding to the fifth label to the fifth label and presenting the seventh label (second label) via the sixth label Can be used to modify the substance with multiple labels. At this time, all of the labels can be unified with the first and third (second) labels, and from the step of combining the third and fourth labels, the two labels that recognize and bind to each other can be used. May be used. When the second and third labels are of the same species and the fourth and fifth labels are of the same species (the second and fourth labels are different), the second and third labels are used in the molecule. Must be extended so as to prevent intermolecular binding between the molecule provided with the fourth and fifth labels in the molecule. Further, when the label is bound to the substance so as to extend continuously, it is possible to appropriately select a combination of the above-described labels as necessary and combine them. Furthermore, by constructing a molecule in which the second label and the third label are provided on the first label that binds to the substance, the molecule can be continuously bound and extended only by using the molecular species. Further, if a plurality of third labels are presented via the second label and the operation is repeated continuously, the substance can be modified with a larger number of each label, and the detection sensitivity of the substance is further improved. be able to. In the case where a plurality of third labels are presented via the second label, steric hindrance based on the higher-order structure of the molecule may make it difficult to continuously extend the label. It is necessary to design a molecule that presents a plurality of third labels via the second label based on the prediction of a higher-order structure that prevents obstacles.
[0016]
The means for binding the first label to the substance may be appropriately selected based on the type of the substance and the first label, as long as it can provide conditions for binding the substance and the first label. Can be. For example, when the substance is a gene and the first label is a nucleic acid molecule having a specific base sequence, a nucleic acid molecule having a base sequence that specifically binds to the substance is provided on the first label. The first label can be bound to the nucleic acid molecule by performing hybridization between the substance and the nucleic acid molecule provided with the first label. In this case, a means capable of performing hybridization is provided. Just choose. In the case where the first label is bound to the substance based on the antigen-antibody reaction, a means capable of performing the antigen-antibody reaction may be selected. Means for binding a second label recognizing the first label to the first label and presenting a third label via the second label include a first label and a second label. The label can be appropriately selected based on the types of the first and second labels, as long as it can provide conditions for mutual recognition and binding with the label. For example, when the first label is a nucleic acid molecule having a specific base sequence, the second label having a base sequence that recognizes the first label and specifically binds to the first label. Since the second label can be bound to the first label by performing hybridization between them, in this case, for example, a means that can realize an environment in which hybridization can be performed may be selected. Also, when the second label is bound to the first label based on the antigen-antibody reaction, for example, a means capable of realizing an environment in which the antigen-antibody reaction can be performed may be selected. Note that the third label may be present in the same molecule as the second label, or may be present separately from the second label. Must be presented through a second label upon binding.
[0017]
Examples of information obtained from a substance having a label include a signal generated from a label and a signal generated from a labeling agent previously immobilized on a label or a molecule provided with the label. For example, to obtain a signal, a voltage is applied to a substance provided with each label, a method of measuring a signal generated by the applied voltage, or a substance provided with each label is irradiated with ultraviolet light or the like. A method of measuring an optical signal generated by irradiation can be used. Means for measuring a signal generated by applying a voltage include, for example, a means for detecting an electric signal such as a current value, an electric conductivity, a potential, a resistance value, an electric capacity, an inductance and an impedance, a fluorescent light, a chemiluminescence, and the like. And means for detecting electrochemiluminescence. Further, as a means for measuring a signal generated by irradiation with ultraviolet light, for example, a means for detecting fluorescence can be cited.
[0018]
In addition, when each label is continuously bound to a substance and extended, it is preferable that the substance is immobilized on a carrier in advance. This is so that, when a washing operation is required when each label is continuously bound to a substance and extended, for example, when performing hybridization between nucleic acid molecules, the washing operation can be easily performed. To make the substanceCarrierWhen immobilized on, for example, gold, silver, copper, titanium, nickel, platinum, carbon, mercury, palladium and other electrodes, optical fibers, quartz oscillators, ISFET and various semiconductor elements and the like as a carrier, the substance is the carrier In the case where the information is immobilized on the substrate, information can be easily detected when an electrical measurement is performed when acquiring information from the substance provided with each label. In addition, a carrier generally used for genetic manipulation, such as a nitrocellulose membrane or a nylon membrane, may be used.A microtiter plate made of polypropylene or the like, beads such as polystyrene, latex, magnetic fine particles, gold colloid, or the like may be used as the carrier. Is also possible. In addition, the method of immobilization is not particularly limited, and the immobilization can be performed by covalent bonding, physical adsorption, chemical adsorption, or the like. Further, at the time of immobilization, a substance that specifically binds to a substance, for example, a substance such as an antibody, an antigen or a nucleic acid may be bound to a carrier in advance, and the substance may be bound to the carrier via the substance.
[0019]
Furthermore, the detection reagent according to the present invention is characterized in that:And the secondThe label may be provided, for example, a substance that specifically binds to a substance such as an antibody, an antigen or a nucleic acid may be bound to a carrier, and the carrier may be provided together with the label. is there. Furthermore, it is also possible to provide a buffer, an enzyme, or the like used when performing an extension reaction via a label. The detection reagent is configured to be sealed and stored so as not to be contaminated by DNase, RNase or various proteases.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[0021]
First, a detection method in which avidin and biotin are applied as the second and third labels and a substance including avidin and biotin in one molecule will be described. In this case, a spacer is arranged between avidin and biotin in the molecule, a rigid molecular structure is formed, or a bond between avidin and biotin is formed so that intramolecular binding is not caused by avidin and biotin in the molecule. For example, avidin and biotin are introduced into their terminals via molecules such as polyamide, polyimide, aramid fiber, steroid, calixarene, alkene, etc. having an α-helix structure, since it is necessary to take a molecular structure that does not have I do. In introducing avidin and biotin, a plurality of avidins and biotins may be introduced, and it is not always necessary to use the same number. In addition, as described above, avidin and biotin can be provided only in different molecules, respectively. At this time, when each label is continuously bound to a substance to extend the same, the same molecule is used. It is desirable that two or more avidins or biotins be present. If necessary, a molecule into which avidin and / or biotin is introduced may be used as a light-emitting substance such as luminol and acridinium ester derivatives, a fluorescent substance such as FITC and rhodamine, a ruthenium complex, lucigenin, europium and the like. Electrochemiluminescent substances, enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase and glucose oxidase, haptens such as trinitrobenzenesulfonic acid and dinitrobenzenesulfonic acid, biotin, avidin, spin-labeling agents and labeling agents such as radioisotopes in advance. It is also possible to put. As a labeling agent, viologen, Hoechst 33258, Hoechst 33342, pisbenzimidazole, ethidium, ethidium bromide, acridine, aminoacridine, acridine orange, proflavin, erybutycin, actinomycin D, donomycin mitomycin, and tris (phenanthroline) zinc complex , Tris (phenanthroline) ruthenium complex, tris (phenanthroline) cobalt complex, di (phenanthroline) zinc complex, di (phenanthroline) ruthenium complex, di (phenanthroline) cobalt complex, bipyridine platinum complex, terpyridine platinum complex, phenanthroline platinum complex, tris (Bipyridyl) zinc complex, tris (bipyridyl) ruthenium complex, tris (bipyridyl) cobalt complex , Di (bipyridyl) zinc complex, di (pipyridyl) ruthenium complex, di (bipyridyl) cobalt complex, ferrocene derivatives such as ferrocenecarponic acid and ferrosenaldehyde, quinone derivatives such as potassium ferri / ferrocyanide, hydroquinone and caffeic acid. Electrochemically active substances can also be applied. Thus, if information obtained from a large number of labeling agents provided with the substance is obtained, it becomes possible to detect the substance with high sensitivity. When an intercalating agent exhibiting electrochemically reversible oxidation-reduction is applied, the potential scan is repeated several to several hundred times, so that the oxidation-reduction current can be measured repeatedly, so that the detection signal is effectively amplified. This makes it possible to detect a substance with higher sensitivity. For example, when hepatitis B virus (HBV) is detected using a substance containing avidin and biotin in the same molecule, a probe A (5 ′) that specifically binds to the HBV gene on a nitrocellulose filter is used. -TCCCTTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCT-3 ') is immobilized. Here, probe B (5′-GGACTTCTCTCCAATTTTCTAGGG-3 ′) which specifically binds to a sample containing or suspected of containing HBV and has a nucleotide sequence different from that of probe A, and Add and perform hybridization. The probe B has been labeled with avidin in advance. After the hybridization reaction, a molecule labeled with the fluorescent dye fluorescein and having avidin and biotin introduced via polyethylene having a molecular weight of 1,000 in the same molecule is added. Here, when the molecules are added simultaneously or alternately,TheSince the molecules are successively bound by the binding of avidin and biotin, a large amount of information (signal) by avidin and biotin can be obtained. Finally, the HBV gene can be detected by washing the filter and measuring the fluorescence intensity generated from the filter.
[0022]
When avidin and biotin are applied as the second and third labels, avidin and biotin may be present in different molecules, respectively. In this case, the avidin and biotin molecules are contained in the respective molecules. At least one of them must exist. This condition is not limited to using avidin and biotin as the second and third labels, but is common to all labels that can recognize and bind to each other. For example, a molecule A having two avidins in the same molecule and a molecule B having two biotins in the same molecule are synthesized, and hepatitis B virus (HBV) is detected using the molecules A and B. In some cases, probe A for HBV is immobilized on a nitrocellulose filter. Here, hybridization is performed by adding a probe B containing HBV and a sample containing or likely containing HBV. The molecules A and B are labeled with a fluorescent dye (fluorescein) in advance, and the probe B is labeled with avidin in advance. After the hybridization reaction, molecules A and B labeled with a fluorescent dye are alternately or simultaneously added. Finally, the HBV gene can be detected by washing the filter and measuring the fluorescence intensity generated from the filter.
[0023]
Further, when nucleic acid molecules are used as the second and third labels, for example, the branched probes shown in FIGS. 1 and 2 can be applied for the purpose of improving detection sensitivity. At this time, after synthesizing a nucleic acid having a base sequence consisting of 3′-GAGAGAGAGACCCCCCCCCCCC-5 ′ by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer, for example, reacting a reagent represented by the following general formula twice, A nucleic acid having a base sequence consisting of 3'-CCCCCCCCCCCCCCAAGTAACC-5 'is synthesized. Then, five branched probes (FIG. 1) can be obtained. When the above reagent is allowed to act three times, and then a nucleic acid having a base sequence consisting of 3'-CCCCCCCCCCCCCAAGTAACC-5 'is synthesized, it is possible to obtain nine branched probes (FIG. 2). In addition, the number of times the above-described reagent is allowed to act may be appropriately set according to the number of branches (the number of side chains) required for the branched probe.
[0024]
Embedded image

On the other hand, a linear nucleic acid molecule 5'-GGTTCATTGGCTCTCTCTCT-3 'for binding between the branched probes is synthesized in the same manner. When the hybridization is carried out by alternately adding the branch probe and the nucleic acid molecule, the branch probe is extended so that the side chain is further expanded in accordance with the number of branches (side chains). Therefore, the branched probe and / or the linear nucleic acid binding between the branched probes may be labeled with a labeling agent, or the signal amplified by labeling the nucleic acid with the labeling agent at the stage of performing the final hybridization may be used. Once obtained, it is possible to easily detect highly sensitive substances. Of course, even in the case of acquiring information (signal) based on nucleic acids, it is possible to detect a highly sensitive substance simply and simply. In addition, it is desirable to introduce a spacer consisting of 5 or more bases into the nucleic acid immediately after branching, since a linear nucleic acid binding between the branched probes tends to be difficult to bind due to steric hindrance caused by the side chain. . In preparing the branched probe, from the viewpoint of preventing the steric hindrance, it is preferable to prepare the branched probe so as to satisfy the following expression (1). That is, if the number of branches (side chains) in the branched probe is L, the length of the nucleic acid (the number of bases) is n, and the number of reactions with the reagent is m,
10^Threen (L + 1) (1-L^m) / (1-L) <1.3 × 10^Threen^Threem^Three (1)
It is desirable to prepare a branched probe by selecting from combinations of n, m, and L that satisfy the following. Further, under this condition, L^mIt is desirable to produce a branched probe by selecting from the combinations that maximize. When the hepatitis B virus (HBV) is detected by the above-mentioned branched probe and the nucleic acid binding between the branched probes, a probe A that specifically binds to the HBV gene is immobilized on a nitrocellulose filter. Here, a sample containing or suspected of containing HBV, a probe C that specifically binds to HBV and a branched probe and has a base sequence different from that of probe A, a branched probe, and a branched probe Hybridization is performed by adding a nucleic acid that binds between them. After the hybridization reaction, as shown in FIG. 3, when the nucleic acid 33 that binds between the branch probes 32 is labeled with ferrocene 31, a large amount of information (signal) by the ferrocene 31 can be obtained. Finally, the HBV gene can be detected by washing the nitrocellulose filter, applying a voltage through the filter and measuring a current value generated from ferrocene. The above hybridization is usually performed in a buffer having an ionic strength of 0.01 to 5 and a p of 5 to 10. It is possible to add dextran sulfate as a hybridization promoter, carrier nucleic acids such as salmon sperm DNA and bovine thymus DNA, and EDII and a surfactant to prevent degradation of the nucleic acids in the buffer. When carrying out hybridization, if carrier nucleic acids are mixed, hybridization may be inhibited, so care should be taken in adding carrier nucleic acids, and if necessary, carrier nucleic acids having a known base sequence should be added. . On the other hand, when the nucleic acid extracted from the sample is DNA, the nucleic acid is heat denatured at 90 ° C. or higher and mixed in a buffer. The nucleic acid extracted from the sample may be heat denatured at 90 ° C. or higher, then rapidly cooled at 0 ° C. and mixed in a buffer. When the nucleic acid extracted from the sample is RNA, it is not necessary to perform heat denaturation. During the hybridization, it is also possible to increase the reaction rate by performing operations such as stirring or shaking. Then, hybridization may be performed at 10 to 90 ° C. for a reaction time of about 1 minute to about 1 night.
[0025]
FIG. 4 is a diagram showing an embodiment of a detection device using electrodes. In FIG. 4, reference numeral 41 denotes an electrode on which a probe 42 that specifically binds to a substance is immobilized, and reference numeral 43 denotes a reaction tank, and a power supply 44 is connected to form a circuit via the electrode 41 and the reaction tank 43. . Further, an ammeter 45, a voltmeter 46, and a variable resistor 47 are arranged inside the circuit, and after a reaction such as hybridization is performed in the reaction tank 43, a voltage or the like is applied to supply a current or the like flowing through the circuit. It is configured to measure. The solution held in the reaction tank 43 can be easily replaced, and the inside of the reaction tank 43 can be replaced with a fresh hybridization solution or the like at the time of measurement. According to the detection device shown in FIG. 4, a buffer (for example, a hybridization solution), a substance or a sample provided with the substance and the first to third labels are held inside the reaction tank 43, and a high A reaction such as hybridization is performed to bind the two. At this time, when hybridization is performed, it is desirable that the temperature and time of the hybridization be set as described above. In the case of an antigen-antibody reaction or a reaction between a guest and a host, reaction conditions may be appropriately set. Next, preferably, the reaction tank 43 and the electrode 41 are washed, the reaction tank 43 is filled with a fresh solution (for example, a hybridization solution), the power supply 44 is operated, and the current value or the voltage value is measured by the ammeter 45 or the like. It measures using the voltmeter 46. Then, from the measurement result, the presence and amount (concentration) of the substance contained in the sample are calculated. As described above, the detection sensitivity can be further improved by using various labeling agents. Here, the electrodes can have the configuration shown in FIGS. 5 and 6, for example. 5 and 6 are top views (FIGS. 5 (a) and 6 (a)) showing a configuration example of the electrode, and cross-sectional views taken along line AB (FIGS. 6 (b) and 6). (B)). In FIG. 5, a conductor 51 is formed on a substrate 52 which forms the basis of an electrode. Then, after an insulator 54 is formed on a part of the conductor 51 and the substrate 52, an opening 53 made of a conductor which is opened and exposed by photolithography is formed. In FIG. 6, an adhesive layer 55 is first formed on a substrate 52 that forms the basis of an electrode. Then, after the conductor 51 is formed on the adhesive layer 55, an opening 53 made of a conductor that is opened and exposed by photolithography is formed.
[0026]
FIG. 7 and FIG. 8 are diagrams showing the configuration of an embodiment of a detection apparatus completely automated using the above-mentioned electrodes.
[0027]
7 and 8, the detection apparatus includes an electrode holder having the above-mentioned electrode, a reaction section having a temperature-variable reaction tank for reacting the electrode and a sample (substance), and a reaction (hybridization). And a first washing unit equipped with a temperature-variable washing tank for washing the electrodes after a continuous elongation reaction of the label due to an antigen-antibody reaction, etc., and washing the washed electrode after the reaction with a labeling agent such as an intercalating agent. A labeling agent reaction section having a temperature-variable labeling solution tank for reacting, a second cleaning section having a temperature-variable cleaning tank for washing the electrode after the reaction with the labeling agent, and a reaction with the labeling agent An electrochemical measurement unit for performing an electrochemical measurement of the washed electrode that has been subsequently cleaned, an analysis unit for analyzing data obtained by the above-described electrochemical measurement, and the above-described series of reactions (hybridization) An operation unit for controlling the label extension reaction by the antigen-antibody reaction or the like), washing, reaction with the labeling agent, washing, and electrochemical measurement, and the above-described reaction section, first washing section, and labeling agent reaction section , A second cleaning unit, and a moving device having an electrochemical measurement unit mounted adjacent thereto. In addition, the detection device further includes a loading port for loading a sample (specimen) for detection, a sample adjustment unit for extracting nucleic acids and the like from the sample, and a gap between the loading port and the sample preparation unit. A transport unit that moves a sample between the sample preparation unit and the reaction unit, and a reaction that occurs during the above-described reaction (a continuous elongation reaction of a label by hybridization, an antigen-antibody reaction, etc.), washing, and an intercalating agent reaction. Preferably, a waste storage unit for storing waste liquid is provided.
[0028]
The detection device 70 shown in FIG. 7 includes an electrode fixing holder 71 for holding the electrodes, a reaction tank 72, a first washing tank 73, a labeling agent reaction tank 74, a second washing tank 75, and an electrochemical measurement tank 76, And a reaction tank 72, a washing tank 73,SignA moving device 77 having a reagent reaction tank 74, a washing tank 75 and an electrochemical measurement tank 76 mounted thereon, and an analysis unit 78 and an operation unit 79 are provided. The electrodes are moved between these tanks by using a moving device 77.72It is achieved by moving etc. A solution containing a sample or a substance such as a nucleic acid previously extracted from the sample is put in the reaction tank 72, and the electrode fixed to the electrode fixing holder 71 is immersed in the reaction tank 72. Next, in the reaction tank 72, the step of performing the extension reaction by binding the substance to the electrode having the probe immobilized thereon and continuously binding the label to the substance, a washing step, a labeling agent reaction step, and a washing step And an electrochemical process are sequentially performed. Next1In the cleaning tank 73, the electrode is normally cleaned while controlling the temperature between 25 ° C and 80 ° C. By this step, nucleic acids, proteins, and the like that are nonspecifically bound to the electrodes can be removed. Next, in the labeling agent solution tank 74, the washed electrode is controlled at a temperature between 25 ° C. and 80 ° C. to cause a reaction between the labeling agent and the substance-labeling complex formed on the electrode. Next2In the cleaning tank 75, the electrodes are cleaned while controlling the temperature between 25 ° C and 80 ° C. Further, electrical measurement is performed in the electrochemical measurement tank 76. After the measurement is completed, the concentration of the substance to be detected (for example, a gene or the like) in the sample is output with reference to a calibration curve recorded in advance in the analysis unit 78. The above operation is performed through the operation unit 79 which is electrically connected to each tank and unit. The detection device 80 illustrated in FIG. 8 includes, in addition to the detection device illustrated in FIG. 7, a sample entrance 81, a sample preparation unit 83, and a space between the sample entrance 81 and the sample preparation unit 83. And a sample transport unit 82 connecting the sample preparation unit 83 and the detection device 70, and a waste storage unit85And In this embodiment, after a sample is put into the sample loading port 81, the sample is carried to the sample preparation unit 83 through the sample transfer unit 82, and the sample preparation unit 83 extracts substances such as nucleic acids and removes bacterial cells. Is performed. The extracted substance is conveyed to the detection device 70 through the sample transport unit 82, and the above-described detection is performed. Further, the waste storage unit 85 temporarily stores waste generated in the cleaning process and the like. In the above embodiment, the electrodes are held in the electrode fixing holder, and the electric measurement is performed in the electrochemical measurement tank. However, a microtiter plate can be used instead of the electrodes, and the electrochemical measurement can be performed. It is also possible to mount an optical device for performing optical measurement instead of the measuring tank.Each configuration of the detection device can be appropriately set in consideration of the substance used for detection and the amount and quality of information to be detected. Good.
[0029]
FIGS. 9, 10 and 11 are diagrams showing the configuration of an embodiment of the detection reagent. As shown in FIG. 9, the detection reagent 90 includes a gold electrode 50 and a tube 91 and 92 having an opening 53 having a diameter of 0.3 mm. Is provided. That is, as a HBV gene detection reagent, a 20-mer probe A (5′-TCCCTTCCATCCTGCTGCTATGCCTCCATCT-3 ′) having a base sequence complementary to the base sequence of HBV in the opening 53 was immobilized, and HBV The probe B (5'-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3 ') which has a base sequence complementary to the base sequence of and is labeled with avidin is housed, and avidin and biotin are added to the end of a PBLG molecule having a molecular weight of 1000 in the tube 92. This is a configuration in which the molecule C introduced and further labeled with Hoechst 33258 is housed. As another HBV gene detection reagent, a 20-mer probe A having a base sequence complementary to the HBV base sequence was immobilized in the opening 53, and the tube 91 was complementary to the HBV base sequence. A probe B (5'-GGACTTCTCTCAATTTCTCGGGG-3 ') containing a unique base sequence and labeled with avidin is housed in the tube 92. The tube 92 is provided with a plurality of biotins in the same molecule and labeled with a molecule D and a ferrocene. In this configuration, a molecule E composed of avidin is stored. The molecule E can be obtained by reacting polyethyleneimine, N-succinimidyl D-biotin and carboxyferrocene. Furthermore, HCVgeneAs a detection reagent, a 20-mer probe D (5′-CCTGTGAGGAACTACTGTC-3 ′) having a base sequence complementary to the base sequence of HCV in the opening 53 was immobilized, and the base sequence of HCV was fixed to the tube 91. On the other hand, a probe E (5'-TTCACGCAGAAAGCGTCTAGCTCTCTCTCT-3 ') having a complementary base sequence is housed therein, and a probe F which is bound with the probe E and a probe F which is labeled with ferrocene and which binds the branched probes, are contained in the tube 92. (5′-GGTTCATGGCTCTCTCTCT-3 ′).
[0030]
Further, as shown in FIG. 10, the detection reagent 100 is composed of a tube 101 containing latex beads on which an antiserum antibody is immobilized, a tube 102 containing an anti-AFP antibody labeled with avidin, and avidin via a PBLG having a molecular weight of 10,000. 103 containing a substance F labeled with HRP enzyme and containing biotin and a tube containing ABTS as a substrate for the HRP enzymeFromIt is configured. Further, as shown in FIG. 11, the detection reagent 110 has a 20-mer probe G (5′-ATAATCCACCCACCCCAGTAGGAGAAAT-3 ′: SK38) having a base sequence complementary to the base sequence of HIV in each well 111. Plate containing a probe H (5′-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3 ′: SK39) containing a base sequence complementary to the base sequence of HIV by introducing a thiol group at the 5 ′ end of Tube containing colloidal gold particles and tube containing dithiothreitolFromIt is configured. It should be noted that the detection reagent according to the present invention is not limited to the above-described embodiment at all, and the type and storage form of the label may be appropriately set according to the substance to be detected and the properties of the label. Needless to say.
[0031]
(Example 1)
HBV was detected from serum using the detection device described in the embodiment. First, a serum component was separated from human peripheral venous blood to extract nucleic acids. On the other hand, a 20-mer probe A (5'-TCCCTTCCATCCTGCTGCTATGCCTCCATCT-3 ') having a base sequence complementary to the base sequence of HBV has a thiol group introduced at the 5' end, and the gold electrode shown in FIG. It is fixed to the opening by chemisorption. Next, hybridization was carried out by adding a sample containing an HBV nucleic acid and a probe B (5'-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3 ') having a base sequence complementary to the base sequence of HBV. The probe B is labeled with avidin in advance. After the hybridization reaction, a molecule in which avidin and biotin are introduced at the end of the PBLG molecule having a molecular weight of 1,000 and labeled with Hoechst 33258 is added, and after washing, electrochemical measurement (cyclic voltammetry) is performed in a phosphate buffer. To measure the current value. The HBV detection was evaluated from the obtained current value. When a sample containing no HBV was used, a current value of 50 nA was observed as a background current. In contrast, when a sample containing 1000 copies of HBV was used, a current value derived from Hoechst 33258 of 100 nA was obtained. Therefore, it was confirmed that nucleic acids derived from HBV of 1000 copies or more can be detected.
[0032]
(Example 2)
Nucleic acids were extracted by separating serum components from human peripheral venous blood. On the other hand, a thiol group was introduced into the 5 ′ end of a 20-mer probe A (5′-TCCCTTCCATCCTGCTGCTATGCCTCCATCT-3 ′) having a base sequence complementary to the base sequence of HBV, and a thiol group was introduced into the gold electrode shown in FIG. It was immobilized on the opening by chemisorption. Next, hybridization was carried out by adding a sample containing an HBV nucleic acid and a probe B (5'-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3 ') having a base sequence complementary to the base sequence of HBV. The probe B is labeled with avidin in advance. After the hybridization reaction, a molecule F containing four avidins in the same molecule and labeled with ferrocene and a molecule G containing four biotins in the same molecule and labeled with ferrocene are added, and after washing, a phosphate buffer is added. The electrochemical measurement (cyclic voltammetry) was performed to measure the current value. The HBV detection was evaluated from the obtained current value. When a sample containing no HBV was used, a current value of 10 nA was observed as a background current. In contrast, in the case of the sample containing 10,000 copies of HBV, a current value derived from 100 nA of ferrocene was obtained. Therefore, it was confirmed that nucleic acids derived from HBV of 10,000 copies or more can be detected.
[0033]
(Example 3)
Nucleic acids were extracted by separating serum components from human peripheral venous blood. On the other hand, a thiol group was introduced into the 5 ′ end of a 20-mer probe A (5′-TCCCTTCCATCCTGCTGCTATGCCTCCATCT-3 ′) having a base sequence complementary to the base sequence of HBV, and a thiol group was introduced into the gold electrode shown in FIG. It was immobilized on the opening by chemisorption. Next, hybridization was carried out by adding a sample containing an HBV nucleic acid and a probe B (5'-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3 ') having a base sequence complementary to the base sequence of HBV. The probe B is labeled with avidin in advance. After the hybridization reaction, a molecule H containing two avidins in the same molecule and labeled with ferrocene was added and washed, and a molecule I containing two biotins in the same molecule and labeled with ferrocene was added. The above elongation reaction with molecule H and molecule I was repeated 30 times, and after washing, an electrochemical measurement (cyclic voltammetry) was performed in a phosphate buffer to measure a current value. The HBV detection was evaluated from the obtained current value. When a sample containing no HBV was used, a current value of 10 nA was observed as a background current. On the other hand, in the case of the sample containing 5000 copies of HBV, a current value derived from 50 nA of ferrocene was obtained. Therefore, it was confirmed that 5000 or more copies of HBV-derived nucleic acids can be detected.
[0034]
(Example 4)
Serum components were separated from human peripheral venous blood and reacted with latex beads on which antiserum antibodies had been immobilized in advance. Next, the latex beads were reacted with an anti-AFP antibody labeled with avidin. After washing, a molecule J comprising avidin and biotin was added via PBLG having a molecular weight of 10,000. The molecule J is labeled with an HRP enzyme in advance. After the above reaction, washing was performed, the substrate ABTS was added, and the absorbance was measured. The detection of HBV was evaluated from the obtained absorbance. As a result, in the case of the sample containing 0.1 pg of AFP, a change in absorbance was significantly observed as compared with the case of using the sample not containing AFP. Therefore, it was confirmed that AFP of 0.1 pg or more could be detected.
[0035]
(Example 5)
Nucleic acids were extracted by separating serum components from human peripheral venous blood. On the other hand, a thiol group was introduced at the 5 ′ end of a 20-mer probe D (5′-CCTGTGGAGAACTACTGTC-3 ′) having a base sequence complementary to the base sequence of HCV, and the gold electrode shown in FIG. It was immobilized on the opening by chemisorption. Next, hybridization was performed by adding a sample containing an HCV nucleic acid and a probe E (5'-TTCACGCAGAAAGCGTCTAGCTCTCTCTCT-3 ') having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of HCV. Next, a branched probe having the structure shown in FIG. 1 and a probe F (5′-GGTTCATTGGCTCTCTCCTCT-3 ′) alternately added with a ferrocene-labeled probe to continuously extend the branched probe were added to the probe for 10 times. Hybridization was performed. After the hybridization reaction, washing was performed, and an electrochemical measurement (cyclic voltammetry) was performed in a phosphate buffer to measure a current value. The detection of HCV was evaluated from the obtained current value. When a sample containing no HCV was used, a current value of 50 nA was observed as a background current. In contrast, when a sample containing 1000 copies of HCV was used, a current value derived from 100 nA of ferrocene was obtained. Therefore, it was confirmed that a nucleic acid derived from HCV of 1000 copies or more can be detected.
[0036]
(Example 6)
Nucleic acids were extracted by separating serum components from human peripheral venous blood. On the other hand, a thiol group was introduced at the 5 ′ end of a 20-mer probe D (5′-CCTGTGGAGAACTACTGTC-3 ′) having a base sequence complementary to the base sequence of HCV, and the gold electrode shown in FIG. It was immobilized on the opening by chemisorption. Next, hybridization was performed by adding a sample containing an HCV nucleic acid and a probe E (5'-TTCACGCAGAAAGCGTCTAGCTCTCTCTCT-3 ') having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of HCV. Next, a branched probe having the structure shown in FIG. 2 and a probe F (5′-GGTTCATTGGCTCTCTCTCT-3 ′), which is labeled with ferrocene to continuously extend the branched probe, are alternately added, and high-pressure is performed 10 times. Hybridization was performed. Further, a probe G (5′-GGTTCATTGG-3 ′) labeled with ferrocene is added for hybridization. After the hybridization reaction, washing is performed, and electrochemical measurement in a phosphate buffer solution (cyclic voltammetry). ) Was measured. The detection of HCV was evaluated from the obtained current value. When a sample containing no HCV was used, a current value of 50 nA was observed as a background current. In contrast, when a sample containing 1000 copies of HCV was used, a current value derived from 100 nA of ferrocene was obtained. Therefore, it was confirmed that a nucleic acid derived from HCV of 1000 copies or more can be detected.
[0037]
(Example 7)
Nucleic acids were extracted by separating serum components from human peripheral venous blood. On the other hand, a 20-mer probe H (5'-ATAATCCACCTCACCAGTAGGAGAAAT-3 ': SK38) having a base sequence complementary to the HIV base sequence was immobilized on the bottom of the well of a microtiter plate by chemisorption. Next, a probe containing an HIV nucleic acid and a probe I having a base sequence complementary to the HIV base sequence and having a thiol group introduced at the 5 ′ end (5′-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3 ′: SK39) were added. To perform hybridization. Next, colloidal gold particles were added and washed, and dithiothreitol was reacted. After repeating the addition of colloidal gold particles and the reaction with dithiothreitol ten times, the degree of aggregation of the colloidal gold was confirmed. When a sample containing no HIV was used, almost no aggregate of colloidal gold was observed. On the other hand, when a sample containing 1000 copies of HIV was used, aggregates of colloidal gold grew greatly. Therefore, it was confirmed that 1000 or more copies of HIV-derived nucleic acid can be detected.
[0038]
(Example 8)
An anti-dioxin antibody was bound to the bottom of the well of the microtiter plate. Next, biotin-labeled dioxin and a sample presumed to contain dioxin were added to the wells of the microtiter plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing, avidin and substance K having a plurality of biotins in the same molecule were alternately added 10 times. The substance K was obtained by reacting polyethyleneimine with 5- (n-succinimidyloxycarbonyl) pentyl D-biotinamide. Finally, a biotin-labeled HRP enzyme was reacted, and color development based on the enzymatic reaction between the HRP enzyme and the substrate ABTS was detected. As a result of the detection, when the sample containing 0.1 pg of dioxin was used, a significant change in absorbance was confirmed as compared with the case where a sample containing no dioxin was used. Therefore, it was confirmed that dioxin of 0.1 pg or more could be detected.
[0039]
(Example 9)
An anti-verotoxin antibody was bound to the bottom of the well of the microtiter plate. Next, a biotin-labeled verotoxin and a sample suspected of containing verotoxin were added to the wells of the microtiter plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing, avidin and substance K having a plurality of biotins in the same molecule were alternately added 10 times. Finally, a biotin-labeled HRP enzyme was reacted, and color development based on the enzymatic reaction between the HRP enzyme and the substrate ABTS was detected. As a result of the detection, a significant change in absorbance was confirmed when a sample containing 0.1 pg of verotoxin was used, as compared with the case where a sample containing no verotoxin was used. Therefore, it was confirmed that 0.1 pg or more of verotoxin could be detected.
[0040]
(Example 10)
An anti-E. Coli antibody was bound to the bottom of the well of the microtiter plate. Next, a biotin-labeled anti-O-157 antibody and a sample presumed to contain E. coli were added to the wells of the microtiter plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing, avidin and substance K having a plurality of biotins in the same molecule were alternately added 10 times. Finally, a biotin-labeled HRP enzyme was reacted, and color development based on the enzymatic reaction between the HRP enzyme and the substrate ABTS was detected. As a result of the detection, when the sample containing 100 Escherichia coli O-157 was used, a significant change in absorbance was confirmed as compared with the case where a sample not containing Escherichia coli O-157 was used. Therefore, it was confirmed that 100 or more Escherichia coli O-157 could be detected.
[0041]
(Example 11)
An anti-E. Coli antibody was bound to the bottom of the well of the microtiter plate. Next, a biotin-labeled anti-O-157 antibody and a sample presumed to contain E. coli were added to the wells of the microtiter plate and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing, O-157 serum and O-157 antibody were alternately added 10 times. Finally, an anti-O-157 antibody bound to the HRP enzyme was reacted, and color development based on the enzyme reaction between the HRP enzyme and the substrate ABTS was detected. As a result of the detection, when the sample containing 100 Escherichia coli O-157 was used, a significant change in absorbance was confirmed as compared with the case where a sample not containing Escherichia coli O-157 was used. Therefore, it was confirmed that 100 or more Escherichia coli O-157 could be detected.
[0042]
【The invention's effect】
As described above, according to the detection method of the present invention,IfSince a wide range of information can be obtained, it is possible to provide a detection method capable of detecting a substance with high sensitivity. MaTa, YuIt is possible to provide a detection method capable of exhibiting improved economy and operability.
[0043]
Further, according to the detection device of the present invention,IfSince a wide range of information can be obtained, a detection device capable of detecting a substance with high sensitivity can be provided. MaTa, YuIt is possible to provide a detection device capable of exhibiting improved economy and operability.
[0044]
Furthermore, according to the detection reagent of the present invention,IfIt is possible to provide a detection reagent capable of transmitting a wide range of information. Further, it is possible to provide a detection reagent capable of exhibiting excellent economic efficiency and operability.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a branch probe.
FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a branch probe.
FIG. 3 is a schematic diagram when hybridization is performed using a branched probe.
FIG. 4 is a diagram showing an embodiment of a detection device.
FIG. 5 is a diagram showing a configuration example of an electrode.
FIG. 6 is a diagram showing a configuration example of an electrode.
FIG. 7 is a diagram showing one embodiment of a detection device provided with electrodes.
FIG. 8 is a diagram showing one embodiment of a detection device provided with electrodes.
FIG. 9 is a diagram showing one embodiment of a detection reagent.
FIG. 10 is a diagram showing one embodiment of a detection reagent.
FIG. 11 is a diagram showing one embodiment of a detection reagent.
[Explanation of symbols]
10, 20: Branch probe 31: Ferrocene
32: Branch probe 33: Nucleic acid
34 nitrocellulose filter 35 probe A
36: Probe C 41: Electrode 42: Probe
43: reaction tank 44: power supply 45: ammeter 46: voltmeter
51: Conductor 52: Substrate 53: Opening 54: Insulator
55 ... Adhesive layer 70, 80 ... Detector 71 ... Electrode fixing holder
72 reaction tank 73 first cleaning tank 74 labeling agent solution tank
75 second tank 76 electrochemical measurement tank 77 moving device
78 analysis unit 79 operation unit 81 sample loading port
82: Sample transport unit 83: Sample preparation unit
84 Control unit 85 Waste storage unit
86: Waste liquid storage unit 87: Reagent supply unit
88 analysis unit 90, 100, 110 detection reagent
91, 92, 101-103, 113-114……tube
111: Well 112: Microtiter plate

Claims (6)

A step of binding a branch probe to a substance, and a step of acquiring information amplified from the substance having the branch probe, wherein the branch probe has a nucleic acid represented by the following general formula: A method for producing a side chain nucleic acid from the reaction part.

The detection method according to claim 1, wherein the branch probe satisfies the following expression.
[10 ³ n (L + 1) (1-L ^m )] / (1-L) <1.3 × 10 ³ n ³ m ³
(Where L is the number of branches, n is the length of the nucleic acid, and m is the number of reactions with the reagent). A detection device comprising: means for binding a branch probe to a substance; and means for acquiring information amplified from the substance having the branch probe, wherein the branch probe has a nucleic acid represented by the following general formula: A detection device, which is produced by reacting a reagent to be used and further synthesizing a nucleic acid for a side chain from the reaction part.

The detection device according to claim 3, wherein the branch probe satisfies the following expression.
[10 ³ n (L + 1) (1-L ^m )] / (1-L) <1.3 × 10 ³ n ³ m ³
(Where L is the number of branches, n is the length of the nucleic acid, and m is the number of reactions with the reagent). A detection reagent comprising a branch probe that binds to a substance, wherein the branch probe is prepared by reacting a nucleic acid with a reagent represented by the following general formula, and further synthesizing a side chain nucleic acid from the reaction part. A detection reagent, characterized in that:

The detection reagent according to claim 5, wherein the branch probe satisfies the following expression.
[10 ³ n (L + 1) (1-L ^m )] / (1-L) <1.3 × 10 ³ n ³ m ³
(Where L is the number of branches, n is the length of the nucleic acid, and m is the number of reactions with the reagent).

Images