JP3508937B2 - Novel endo-type neutral cellulase and its production method - Google Patents
Novel endo-type neutral cellulase and its production methodInfo
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Description
【0001】[発明の背景][Background of the Invention]
【産業上の利用分野】本発明は、新規なセルラーゼおよ
びその製造法に関する。さらに詳しくは、スコプラリオ
プシス属に属する微生物より得られる新規なエンド型中
性セルラーゼおよびその製造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel cellulase and a method for producing the same. More specifically, it relates to a novel endo-type neutral cellulase obtained from a microorganism belonging to the genus Scopraliopsis and a method for producing the same.
【0002】[0002]
【従来の技術】近年、衣料用洗剤あるいは食器用洗剤な
どに著しい進展がみられ、とりわけ汚れを各種加水分解
酵素により分解する手法が取り入れられて、その洗浄力
を格段に上昇させることが行なわれている。ここで、こ
れらの酵素は、汚れを直接的に分解する他、汚れを低分
子量化することにより界面活性剤などの洗浄成分を補助
する等の役割を担っていると考えられる。2. Description of the Related Art In recent years, remarkable progress has been made in clothing detergents and dish detergents, and in particular, a method of decomposing dirt with various hydrolases has been introduced to remarkably increase the detergency. ing. Here, it is considered that these enzymes play a role of directly decomposing the dirt and assisting a cleaning component such as a surfactant by lowering the molecular weight of the dirt.
【0003】洗浄剤組成物に配合される加水分解酵素と
しては、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼあるいは
セルラーゼなどが使用されている。なかでもセルラーゼ
は最近実用化された酵素で、木綿などのセルロース繊維
の非結晶部分をエンド的に切断することによって、繊維
内部の汚れを溶出させて洗浄効果を高めるよう作用す
る。したがって、このような目的で使用されるセルラー
ゼとしては、極力繊維本体を傷つけないために高いエン
ド性を有したものが好ましい。さらに、洗浄剤は一般に
中性からアルカリ性を呈するために、上記のような高い
エンド性を中性〜アルカリ性で発揮する中性〜アルカリ
性セルラーゼが望まれている。Protease, lipase, amylase, cellulase and the like are used as hydrolytic enzymes to be added to the detergent composition. Among them, cellulase is an enzyme that has recently been put to practical use, and it acts to cut off the non-crystalline portion of the cellulose fiber such as cotton at the end to elute the dirt inside the fiber and enhance the cleaning effect. Therefore, as the cellulase used for such a purpose, one having a high end property is preferable in order not to damage the fiber body as much as possible. Furthermore, since detergents generally exhibit neutrality to alkalinity, neutral-alkaline cellulases that exhibit the above-mentioned high endo-activity in neutrality to alkalinity are desired.
【0004】このような条件を満たすセルラーゼとして
は、好アルカリ性バチルスの生産するアルカリ性セルラ
ーゼ(特公昭50-28515号公報、特願昭61-257776 号)、
あるいは同じくアルカリ性放線菌より得られたセルアル
カリ性セルラーゼ(特公平3-65150 号公報)などが知ら
れている。Cellulase satisfying such conditions includes alkaline cellulases produced by alkalophilic Bacillus (Japanese Patent Publication No. 50-28515, Japanese Patent Application No. 61-257776).
Alternatively, a cell alkaline cellulase obtained from alkaline actinomycetes (Japanese Patent Publication No. 3-65150) is also known.
【0005】しかしながら、これらはすべてアルカリ性
に最適pHを示すアルカリ酵素であり、更に中性洗剤に
使用され得る中性セルラーゼの開発が強く求められてい
た。一方、一般に強力なセルラーゼを発現する微生物と
してはカビなどの糸状菌が大半を占めており、かつ糸状
菌は培養が容易であるため糸状菌の生産する上記のよう
な有用セルラーゼの開発が望まれていた。However, all of these are alkaline enzymes which show the optimum pH for alkaline, and there has been a strong demand for the development of neutral cellulases which can be used in neutral detergents. On the other hand, generally, as a microorganism expressing a strong cellulase, filamentous fungi such as mold occupy the majority, and since filamentous fungi are easy to culture, development of useful cellulase as described above produced by filamentous fungi is desired. Was there.
【0006】[発明の概要]発明者らは、中性に最大活
性を示しエンド性の高いセルラーゼを生産する微生物を
主にカビなどの糸状菌を中心として検索した結果、スコ
プラリオプシス属に属する糸状菌が、好気的培養により
目的とする新規セルラーゼを効率良く生産することを見
い出し、本発明を完成するに至った。[Summary of the Invention] [0006] The inventors of the present invention, as a result of searching mainly for filamentous fungi such as fungi, search for a microorganism that produces a cellulase with maximum neutrality and high endogeneity, and belongs to the genus Scopraliopsis. The present inventors have found that a filamentous fungus efficiently produces a desired novel cellulase by aerobic culture, and completed the present invention.
【0007】[0007]
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、中性
付近で最大活性を示しかつ高いエンド性を有した新規セ
ルラーゼおよびその製造法を提供することを目的として
いる。SUMMARY OF THE INVENTION It is therefore an object of the present invention to provide a novel cellulase which exhibits maximum activity in the vicinity of neutrality and has high endogeneity, and a method for producing the same.
【0008】また、上記新規セルラーゼ産生能を有する
新規菌株を提供することを目的としている。Another object of the present invention is to provide a novel strain having the above-mentioned novel cellulase-producing ability.
【0009】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明による新規セルラ
ーゼは、次のような理化学的性質を有するもの、であ
る。
(a) 作用および基質特異性;カルボキシメチルセルロー
ス(CMC)などのセルロースに特異的に作用し、その
β‐1,4‐グリコシド結合をエンド型の機作により切
断して著しい粘度低下をきたすものの、還元糖の生成は
ほとんど認められない。
(b) 最適pH:最適pHは6.0〜7.0である。
(c) 安定pH:30℃、30分間の処理条件において、
pH7.0〜12.0で安定である。
(d) 最適温度:最適作用温度は約50〜60℃である。
(e) 安定温度:pH9.0、10分間の処理条件におい
て、55℃まで安定である。
(f) 分子量:約22,000(SDS電気泳動法)
(g) 等電点:約3.7〜3.8である。The novel cellulase according to the present invention has the following physicochemical properties. (a) Action and substrate specificity: It acts specifically on cellulose such as carboxymethylcellulose (CMC), and its β-1,4-glycosidic bond is cleaved by an endo-type mechanism to cause a significant decrease in viscosity, Almost no production of reducing sugar is observed. (b) Optimum pH: The optimum pH is 6.0 to 7.0. (c) Stable pH: 30 ° C for 30 minutes,
It is stable at pH 7.0 to 12.0. (d) Optimum temperature: The optimum working temperature is about 50-60 ° C. (e) Stable temperature: It is stable up to 55 ° C. under the treatment conditions of pH 9.0 and 10 minutes. (f) Molecular weight: about 22,000 (SDS electrophoresis) (g) Isoelectric point: about 3.7 to 3.8.
【0010】また、本発明による上記新規セルラーゼの
製造法は、スコプラリオプシス属に属し、上記セルラー
ゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で得
られる培養物より該新規セルラーゼを分離する工程とを
包んでなるもの、である。The method for producing the novel cellulase according to the present invention comprises a step of culturing a microorganism belonging to the genus Scopraliopsis and having the cellulase-producing ability, and separating the novel cellulase from the culture obtained in the step. It is one that encloses the process.
【0011】さらにまた、本発明による上記新規セルラ
ーゼ産生能を有する新規菌株は、スコプラリオプシス・
ブレビカウリスTOTO−9211株(FERM−P−
13285)である。Furthermore, a novel strain having the above-mentioned novel cellulase-producing ability according to the present invention is Scopulariopsis.
Brevi Kauris TOTO-9221 strain (FERM-P-
13285).
【0012】本発明によるセルラーゼは中性付近に最適
pHを有しかつ高いエンド性で作用する。従って、衣料
用洗剤や柔軟剤に洗浄効果を高める目的で添加された
り、または、研究用試薬などとして広範囲の分野におい
て使用され得る。また、本発明による菌株は、上記セル
ラーゼを効率よく菌体外に分泌するので、簡便な工程で
効率よくその生産を行うことができる点で有利である。The cellulase according to the present invention has an optimum pH in the vicinity of neutrality and acts with high endogeneity. Therefore, it can be added to laundry detergents and softeners for the purpose of enhancing the cleaning effect, or can be used in a wide range of fields as research reagents and the like. Further, the strain according to the present invention efficiently secretes the above cellulase to the outside of the bacterial cell, and is therefore advantageous in that it can be efficiently produced by a simple process.
【0013】[発明の具体的説明]新規セルラーゼ産生菌株
本発明による新規セルラーゼは微生物を用いて生産する
ことができる。特に好ましくは、本発明によるセルラー
ゼは、スコプラリオプシス属、特にスコプラリオプシス
・ブレビカウリス(Scopulariopsis brevicaulis )T
OTO−9211株により生産される。この菌株は発明
者らにより広島市の一般家屋空気中より分離されたもの
である。この菌株は糸状不完全菌であり、下記に示すよ
うな菌学的性質を有する。
I.形態的性質
1 大型分生子:なし
2 分生子:表面粗、球形、8μm、連鎖状
3 分生子形式:環紋型
II.各種培地における生育状態
1 ポテトデキストロース寒天培地(29℃、11日間
培養)
集落直径:60〜82mm
ビロード状、明褐色、平坦、表面無色
2 ツアペック寒天培地(29℃、11日間培養)
集落直径:45mm
ビロード状、淡黄褐色、表面無色
III.生理学的性質
1 生育pH範囲:3.0〜11.0
最適生育pH:4.0〜10.0、アルカリ耐性
2 生育温度範囲:10〜50℃
最適生育温度:25〜35℃
3 中性セルラーゼ産生能を有する。[Detailed Description of the Invention] Novel Cellulase-Producing Strain The novel cellulase according to the present invention can be produced by using a microorganism. Particularly preferably, the cellulase according to the invention is of the genus Scopulariopsis, in particular Scopulariopsis brevicaulis T.
Produced by OTO-9211 strain. This strain was isolated from the air of a general house in Hiroshima City by the inventors. This strain is a filamentous incomplete bacterium and has mycological properties as shown below. I. Morphological properties 1 Large conidia: None 2 Conidia: Surface rough, spherical, 8 μm, concatenated 3 Conidia Form: ring-shaped II. Growth state in various media 1 Potato dextrose agar medium (29 ° C, 11 days culture) Colony diameter: 60-82mm Velvet, light brown, flat, surface colorless 2 Tuapec agar medium (29 ° C, 11 days culture) Colony diameter: 45mm Velvety, light yellowish brown, colorless surface III. Physiological properties 1 Growth pH range: 3.0 to 11.0 Optimal growth pH: 4.0 to 10.0, alkali tolerance 2 Growth temperature range: 10 to 50 ° C Optimal Growth temperature: 25 to 35 ° C. 3 Neutral cellulase-producing ability.
【0014】以上の菌学的性質を有する本菌株は、カー
マイケル(J.W.Carmichael et al.)らのジェネラ オブ
ハイフォマイセテス(Genera of Hyphomycetes,1980
)およびバロン(G.L.Barron)のザ ジェネラ オブ
ハイフォマイセテス フロムソイル(The Genera of H
yphomycetes from Soil)を参照した結果、形態学的に
スコプラリオプシス属に属する一菌種であることが判明
した。さらに分生子が粗な球形であることなどから、本
菌株をスコプラリオプシス・ブレビカウリス(Scopular
iopsis brevicaulis)TOTO−9211と命名した。
なお、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
番号第13285号(FERM−P−13285)のも
と寄託されている。The present strain having the above-mentioned mycological properties is a genera of Hyphomycetes (1980) by Carmichael et al.
) And the General of GLBarron
Hyphomy Ceteth From Soil (The Genera of H
As a result, it was found that the strain was a morphologically belonging to the genus Scopraliopsis. In addition, since the conidia have a rough spherical shape, this strain can be used for Scopulariopsis brevicauris (Scopular
iopsis brevicaulis) TOTO-9221.
In addition, this strain has been deposited under the deposit number 13285 (FERM-P-13285) at the Institute of Microbial Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology.
【0015】培養条件
上記菌株を培養するための培地は格別である必要はな
く、通常の培地を用いることができる。炭素源として各
種セルロース(紙、パルプ、セルロース粉末、綿な
ど)、セルロース誘導体(カルボキシメチルセルロー
ス、酢酸セルロースなど)、セルロース加工品(リン酸
膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロースなど)、ある
いは麩、木粉などの天然性基質、またはグルコースなど
を用いることができる。窒素源としては硝酸塩、アンモ
ニウム塩などの無機物、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵
母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カゼイ
ン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭
素源や窒素源の他に各種の塩、例えばマグネシウム塩、
カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必要に応じ
て添加してもよい。さらに、別に殺菌した炭酸ナトリウ
ムあるいは炭酸水素ナトリウムなどを添加して、培地の
pHをアルカリ性としても良い。 Culture Conditions The medium for culturing the above-mentioned strain does not have to be special, and an ordinary medium can be used. Carbon sources such as various types of cellulose (paper, pulp, cellulose powder, cotton, etc.), cellulose derivatives (carboxymethyl cellulose, cellulose acetate, etc.), processed cellulose products (phosphoric acid-swelling cellulose, alkali-swelling cellulose, etc.), or wheat, wood flour, etc. A natural substrate, glucose or the like can be used. As the nitrogen source, inorganic substances such as nitrates and ammonium salts, urea, peptone, dry yeast, yeast extract, soybean powder, corn steep liquor, casein, meat extract, amino acid and the like can be used. In addition to these carbon and nitrogen sources, various salts such as magnesium salts,
You may add potassium salt, sodium salt, phosphate etc. as needed. Furthermore, the pH of the medium may be made alkaline by adding separately sterilized sodium carbonate or sodium hydrogen carbonate.
【0016】培養は、このような培地中で培地温度20
〜50℃、好ましくは25〜35℃で3日〜7日間好気
的に攪拌または振盪しながら行う。Culture is carried out in such a medium at a medium temperature of 20.
It is carried out at -50 ° C, preferably 25-35 ° C for 3 to 7 days under aerobic stirring or shaking.
【0017】本発明による新規なセルラーゼは、上記の
ような条件のもとでの培養によって、主として培養液中
に分泌され、蓄積される。The novel cellulase according to the present invention is mainly secreted and accumulated in the culture medium by the culture under the above conditions.
【0018】酵素の採取
上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するため
には、既知の精製法を単独もしくは併用して利用するこ
とができる。本酵素は主として菌体外(培養液中)に分
泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除
去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などに
よる塩析;メタノール、エタノール、アセトンなどの有
機溶媒による沈殿法;アビセルによる吸着法:限外濾
過;ゲル濾過クロマトグラフィー;イオン交換クロマト
グラフィー、その他各種クロマトグラフィーを、単独も
しくは併用して、精製することができる。 Collection of Enzyme In order to collect and purify the enzyme of the present invention from the above culture solution, known purification methods can be used alone or in combination. Since the present enzyme is mainly secreted outside the cells (in the culture solution), a crude enzyme solution can be easily obtained by removing the cells by filtration or centrifugation.
This crude enzyme is further purified by known methods such as salting out with ammonium sulfate; precipitation with organic solvents such as methanol, ethanol and acetone; adsorption with Avicel: ultrafiltration; gel filtration chromatography; ion exchange chromatography, Other various chromatographies can be used alone or in combination for purification.
【0019】好ましい精製法を示せば次の通りである。
まず、培養濾液に70%飽和硫安を添加して塩析を行な
い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでSephadex
G‐75(ファルマシア社製)カラムにより、脱塩を兼
ねたゲル濾過を行なう。この活性画分をDEAE‐トヨ
パール650M(東ソー社製)によるイオン交換クロマ
トグラフィー(0 〜0.5MNaCl濃度勾配により溶出)を行
なう。この活性画分を濃縮後、PBE94(ファルマシ
ア社製)カラムによるクロマトフォーカシング(pH勾配
により溶出)を行なうことにより、SDS電気泳動的に
均一な精製酵素を得ることができる。The preferred purification method is as follows.
First, 70% saturated ammonium sulfate is added to the culture filtrate for salting out, and the obtained precipitate is dissolved in a buffer solution. Then Sephadex
Gel filtration that also serves as desalting is performed using a G-75 (manufactured by Pharmacia) column. This active fraction is subjected to ion exchange chromatography with DEAE-Toyopearl 650M (manufactured by Tosoh Corporation) (elution with a gradient of 0 to 0.5 M NaCl). After concentration of this active fraction, chromatofocusing with a PBE94 (Pharmacia) column (elution with a pH gradient) is performed to obtain a purified enzyme that is uniform by SDS electrophoresis.
【0020】酵素の性質
本発明によるセルラーゼの性質は次に示される通りであ
る。なお、以下において活性測定法とは次の方法をいう
ものとする。 Properties of the enzyme The properties of the cellulase according to the present invention are as shown below. In addition, in the following, the activity measuring method means the following method.
【0021】(活性測定法)50mMリン酸緩衝液(pH
7.0 )に溶解した0.5%のCMCを基質として使用
し、その粘度低下をオストワルド粘度計により測定す
る。基質溶液5mlに酵素液の適当量を添加し、30℃
において反応させる。次いで、一定時間毎の溶液の流下
速度を測定しその比粘度を求める。本条件において、1
分間に基質1μMを1回切断するに要する酵素量をセル
ラーゼ活性の1単位とする。以下に活性単位の計算式を
示す。
セルラーゼ活性(unit/ml)=a/ηsp
a :基質、溶媒、温度等により決定される定数(本条
件では0.735 )
ηsp:酵素反応時間1分あたりの比粘度の低下率
(1) 作用および基質特異性
CMCなどのセルロース誘導体を基質として、活性測定
法に準じて酵素反応を行ない、その粘度低下と還元糖の
生成量を調べた。その結果、本酵素は各種セルロースに
作用し、そのβ‐1,4‐グリコシド結合をエンド的に
切断して急速に粘度の低下を引き起こすものの、還元糖
の生成はほとんど認められなかった。(Activity measuring method) 50 mM phosphate buffer (pH
0.5% CMC dissolved in 7.0) is used as a substrate, and its viscosity reduction is measured by Ostwald viscometer. Add an appropriate amount of enzyme solution to 5 ml of substrate solution and
React at. Then, the flow rate of the solution is measured at regular intervals to determine the specific viscosity. Under these conditions, 1
The amount of enzyme required to cleave 1 μM of substrate once per minute is defined as 1 unit of cellulase activity. The formula for calculating the activity unit is shown below. Cellulase activity (unit / ml) = a / η sp a: substrate, solvent, constant determined by the temperature and the like (0.735 in this condition) eta sp: reduction ratio of specific viscosity per minute enzyme reaction time (1) Action And substrate specificity Cellulose derivatives such as CMC were used as a substrate to carry out an enzymatic reaction according to the activity measurement method to examine the decrease in viscosity and the amount of reducing sugar produced. As a result, this enzyme acted on various celluloses and endoly cleaved the β-1,4-glycoside bond to cause a rapid decrease in viscosity, but almost no production of reducing sugars was observed.
【0022】(2) 最適pHおよび安定pH
本酵素を用いて、pH4.0〜9.0の範囲で活性測定
法に準じて酵素反応を行なった。なお、緩衝液として
は、ブリットン‐ロビンソン(Britton-Robinson)広域
緩衝液を使用した。その相対活性は図1のAに示される
通りである。これより、本酵素の最適pHは30℃にお
いて約6.0〜7.0であることが分かる。(2) Optimum pH and stable pH Using this enzyme, an enzymatic reaction was carried out in the range of pH 4.0 to 9.0 according to the activity measuring method. As the buffer, Britton-Robinson broad range buffer was used. Its relative activity is as shown in Figure 1A. From this, it can be seen that the optimum pH of the present enzyme is about 6.0 to 7.0 at 30 ° C.
【0023】また、本酵素を所定のpH緩衝液に加え、
30℃で30分間保持した後の残存活性を測定した。緩
衝液として、ブリットン‐ロビンソン緩衝液(pH3.0 〜
12.0)およびKCl‐NaOH緩衝液(pH13.0)を使用
した。その結果は図1のBに示される通りである。これ
より、本酵素の安定pH域は30℃で30分間の処理条
件下においてpH7.0〜12.0であることが分か
る。Further, the present enzyme is added to a predetermined pH buffer solution,
The residual activity was measured after holding at 30 ° C. for 30 minutes. Britton-Robinson buffer (pH 3.0-
12.0) and KCl-NaOH buffer (pH 13.0). The result is as shown in B of FIG. From this, it can be seen that the stable pH range of the present enzyme is pH 7.0 to 12.0 under the treatment condition of 30 ° C. for 30 minutes.
【0024】(3) 最適温度および安定温度
本酵素を用いて、pH7.0、30〜70℃の範囲の温
度条件下で活性測定法に準じて酵素反応を行なった。そ
の相対活性は図2のAに示される通りである。これよ
れ、本酵素の最適作用温度は約50〜60℃であること
が分かる。(3) Optimum temperature and stable temperature Using this enzyme, an enzymatic reaction was carried out according to the activity measuring method under the temperature conditions of pH 7.0 and 30 to 70 ° C. Its relative activity is as shown in Figure 2A. From this, it can be seen that the optimum working temperature of the present enzyme is about 50 to 60 ° C.
【0025】また、本酵素を所定の緩衝液(pH9.0 )に
加え、30〜70℃の範囲の温度条件下で10分間保持
した後の残存活性を測定した。その結果は図2のBに示
される通りである。これより、本酵素は55℃まで安定
であることが分かる。Further, the present enzyme was added to a predetermined buffer solution (pH 9.0), and the remaining activity was measured after holding for 10 minutes under the temperature condition of 30 to 70 ° C., and the residual activity was measured. The result is shown in FIG. 2B. This shows that this enzyme is stable up to 55 ° C.
【0026】(4) 分子量
本酵素の分子量をSDS電気泳動法により測定したとこ
ろ、分子量は約20,000〜22,000であった。(4) Molecular weight The molecular weight of this enzyme was measured by SDS electrophoresis, and the molecular weight was about 20,000 to 22,000.
【0027】(5) 等電点
本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したとこ
ろ、等電点は約3.5〜3.8であった。(5) Isoelectric point The isoelectric point of the present enzyme was measured by the isoelectric focusing method, and the isoelectric point was about 3.5 to 3.8.
【0028】[0028]
【実施例】本発明を以下の実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which should not be construed as limiting the invention thereto.
【0029】実施例1 粗酵素粉末の調製
スコプラリオプシス・ブレビカウリスTOTO−921
1株の前培養液400ml(28℃、3日間振盪培養)
を、CMC(Na塩)1%、グルコース3%、酵母エキス
0.5%、NaNO3 0.3%、K2 HPO4 0.1
%、MgSO4 ・7H2 O 0.05%、KCl 0.
05%、FeSO4 ・7H2 O 0.001%、Tri
tonX‐100 0.1%を含有する培地(pH7.0 )
20Lを入れたジャーファメンターに植菌し、28℃で
3日間、攪拌速度300rpm、通気量20L/分で培
養した。培養終了後、培養液を8,000rpm、10
分間遠心分離して菌体を除去した。得られた上清液を凍
結乾燥して、0.0025単位/mgの粗酵素粉末40
0gを得た。 Example 1 Preparation of crude enzyme powder Scopulariopsis brevicauris TOTO-921
400 ml of preculture liquid for 1 strain (28 ° C, 3 days shaking culture)
CMC (Na salt) 1%, glucose 3%, yeast extract 0.5%, NaNO 3 0.3%, K 2 HPO 4 0.1
%, MgSO 4 · 7H 2 O 0.05%, KCl 0.
05%, FeSO 4 · 7H 2 O 0.001%, Tri
TonX-100 medium containing 0.1% (pH 7.0)
The jar fermenter containing 20 L was inoculated and cultured at 28 ° C. for 3 days at a stirring rate of 300 rpm and an aeration rate of 20 L / min. After completion of the culture, the culture solution was adjusted to 8,000 rpm, 10
The cells were removed by centrifugation for a minute. The obtained supernatant is freeze-dried to obtain 0.0025 units / mg of crude enzyme powder 40.
0 g was obtained.
【0030】実施例2 精製酵素の調製
実施例1と同様の培地22Lを入れたジャーフェメンタ
ーに、スコプラリオプシス・ブレビカウリスTOTO−
9211株の前培地液400mlを植菌した。これを実
施例1と同様に培養した後、遠心分離により上清液20
Lを得た。この上清液のpH7.0における活性は0.
048単位/mlであった。次いで、この上清液に硫安
粉末を70%飽和になるまで加え、一夜放置の後8,0
00rpmで10分間遠心分離してその沈殿を回収し
た。この沈殿を50mM Tris‐HCl緩衝液(pH
7.0 )に溶解し、同緩衝液によりあらかじめ平衡化して
おいたSephadexG‐75(Pharmacia )カラムに供して
ゲル濾過を行なった。活性画分を濃縮、脱塩後DEAE
‐トヨパール650M(東ソー)によりイオン交換クロ
マトグラフィーを行なった。酵素の溶出は、0〜0.5
M NaClの濃度勾配法により行なった。次いで、活
性画分を濃縮、脱塩後PBE94カラムに供してクロマ
トフォーカシングを行ない、pH勾配法により酵素溶出
させた。活性画分を回収することにより、10単位/m
lの精製酵素液40mlを得た。これはSDS電気泳動
において単一のバンドを示し、酵素タンパクとして均一
であることが確認された。 Example 2 Preparation of Purified Enzyme A jar fementor containing 22 L of the same medium as in Example 1 was added to Scopraliopsis brevicauris TOTO-.
400 ml of the pre-medium solution of strain 9211 was inoculated. After culturing this in the same manner as in Example 1, the supernatant liquid 20 was centrifuged.
L was obtained. The activity of this supernatant solution at pH 7.0 was 0.
It was 048 units / ml. Then, ammonium sulfate powder was added to this supernatant until it became 70% saturated, and the mixture was allowed to stand overnight for 8.0
The precipitate was recovered by centrifugation at 00 rpm for 10 minutes. This precipitate is added to 50 mM Tris-HCl buffer (pH
It was dissolved in 7.0) and applied to a Sephadex G-75 (Pharmacia) column which had been equilibrated with the same buffer solution in advance for gel filtration. Active fractions are concentrated and desalted before DEAE
-Ion exchange chromatography was performed with Toyopearl 650M (Tosoh). Elution of enzyme is 0-0.5
It was performed by the gradient method of M NaCl. Then, the active fraction was concentrated and desalted, and then subjected to PBE94 column for chromatofocusing, and the enzyme was eluted by the pH gradient method. 10 units / m by collecting the active fraction
40 ml of the purified enzyme solution (1) was obtained. This showed a single band on SDS electrophoresis and was confirmed to be homogeneous as an enzyme protein.
【0031】[0031]
【発明の効果】前記セルラーゼは中性付近で最大活性を
示しかつ高いエンド性を有していることから、衣料用洗
剤等に洗浄効果を高める目的で添加することができる。EFFECTS OF THE INVENTION Since the cellulase exhibits maximum activity in the vicinity of neutrality and has a high end property, it can be added to a detergent for clothes or the like for the purpose of enhancing the cleaning effect.
【図1】本発明によるセルラーゼの(A)最適pHを示
すグラフおよび(B)安定pH範囲を示すグラフであ
る。1 is a graph showing (A) optimum pH and (B) stable pH range of cellulase according to the present invention.
【図2】本発明によるセルラーゼの(A)最適pH作用
温度を示すグラフおよび(B)安定温度範囲を示すグラ
フである。FIG. 2 is a graph showing (A) optimum pH action temperature and (B) stable temperature range of the cellulase according to the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐 藤 博 福岡県北九州市小倉北区中島二丁目1番 1号 東陶機器株式会社内 (72)発明者 荒 井 基 夫 大阪府堺市鴨谷台3丁2番20−204号 (72)発明者 南 憲 二 大阪府東大阪市中野21番地82号 (56)参考文献 World J. Microbio l. Biotechnol., 1990, Vol.6, No.1, p ages 64−6 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 9/14 - 9/46 JSTPlus(JOIS) BIOSIS/WPI(DIALOG)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Hiroshi Sato 2-1-1 Nakajima, Kokurakita-ku, Kitakyushu City, Fukuoka Prefecture Totoki Equipment Co., Ltd. (72) Inventor Motoo Arai Kamodaidai, Sakai City, Osaka Prefecture 3-2-20-204 (72) Inventor Kenji Minami 82-82 Nakano, 21 Nakano, Higashiosaka-shi, Osaka (56) References World J. Microbio l. Biotechnol. , 1990, Vol. 6, No. 1, pages 64-6 (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) C12N 9/14-9/46 JSTPlus (JOIS) BIOSIS / WPI (DIALOG)
Claims (5)
opulariopsis brevicaulis)TOTO−9211株から
得られるセルラーゼであって、下記の理化学的性質を有
するセルラーゼ。 (a) 作用および基質特異性;カルボキシメチルセルロ
ース(CMC)などのセルロースに特異的に作用し、そ
のβ-1,4-グリコシド結合をエンド型の機作により切
断して著しい粘度低下をきたすものの、還元糖の生成は
ほとんど認められない。 (b) 最適pH:最適pHは6.0〜7.0である。 (c) 安定pH:30℃、30分間の処理条件におい
て、pH7.0〜12.0で安定である。 (d) 最適温度:最適作用温度は約50〜60℃であ
る。 (e) 安定温度:pH9.0、10分間の処理条件にお
いて、55℃まで安定である。 (f) 分子量:約20,000〜22,000(SDS
電気泳動法) (g) 等電点:約3.5〜3.8である。1. A Scopulariopsis brevicauris (Sc
opulariopsis brevicaulis) TOTO-9221 cellulase having the following physicochemical properties. (a) Action and substrate specificity: It acts specifically on cellulose such as carboxymethylcellulose (CMC), and its β-1,4-glycoside bond is cleaved by an endo-type mechanism to cause a significant decrease in viscosity, Almost no production of reducing sugar is observed. (b) Optimum pH: The optimum pH is 6.0 to 7.0. (c) Stable pH: Stable at pH 7.0 to 12.0 under the treatment condition of 30 ° C. for 30 minutes. (d) Optimum temperature: The optimum working temperature is about 50-60 ° C. (e) Stable temperature: It is stable up to 55 ° C. under the treatment conditions of pH 9.0 and 10 minutes. (f) Molecular weight: about 20,000 to 22,000 (SDS
Electrophoresis method) (g) Isoelectric point: about 3.5 to 3.8.
載のセルラーゼ生産能を有する微生物を培養する工程
と、該工程で得られた培養物より該セルラーゼを分離す
る工程とを含んでなる、セルラーゼの製造法。2. A method comprising culturing a microorganism belonging to the genus Scopraliopsis and having the cellulase-producing ability according to claim 1, and separating the cellulase from the culture obtained in the step. Method for producing cellulase.
の中性〜アルカリ性で行なわれる、請求項2記載の製造
法。3. The culture of the microorganism has a pH of 7.0 to 11.0.
3. The method according to claim 2, which is carried out neutral to alkaline.
カウリスTOTO−9211株である、請求項2記載の
セルラーゼの製造法。4. The method for producing cellulase according to claim 2, wherein the microorganism is Scopulariopsis brevicauris strain TOTO-9221.
るスコプラリオプシス・ブレビカウリスTOTO−92
11株(FERM P−13285)。5. Scopraliopsis brevicauris TOTO-92 having cellulase-producing ability according to claim 1.
11 strains (FERM P-13285).
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1993
- 1993-02-16 JP JP2690793A patent/JP3508937B2/en not_active Expired - Fee Related
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World J. Microbiol. Biotechnol., 1990, Vol.6, No.1, pages 64−6 |
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