JP3491743B2 - Method for detecting denatured lipoprotein in blood - Google Patents

Method for detecting denatured lipoprotein in blood

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JP3491743B2
JP3491743B2 JP24444099A JP24444099A JP3491743B2 JP 3491743 B2 JP3491743 B2 JP 3491743B2 JP 24444099 A JP24444099 A JP 24444099A JP 24444099 A JP24444099 A JP 24444099A JP 3491743 B2 JP3491743 B2 JP 3491743B2
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壱夫 内田
新一 真柴
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Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】この発明は、血液中に存在するLD
L、HDL、VLDL、IDL、Lp(a)、Small,denseLDLなどのリ
ポ蛋白の変性(特に酸化変性)リポ蛋白がα1−アンチ
トリプシン、フィブリノーゲン又はフィブリン(各々の
分解産物を含む)、IgAもしくはフィブロネクチンと複
合体を形成して存在することを見出すとともに、この点
に着目した新規な変性リポ蛋白の検出方法に関するもの
で、動脈硬化性病変やアルツハイマー病などの早期診断
や治療上での薬効評価などに寄与せんとするものであ
る。
This invention relates to LDs existing in blood.
Denatured (especially oxidatively denatured) lipoproteins such as L, HDL, VLDL, IDL, Lp (a), Small, denseLDL. In addition to finding out that it exists in the form of a complex with, it relates to a novel method for detecting denatured lipoprotein focusing on this point. To contribute to.

【0002】[0002]

【発明が解決しようとする課題】動脈硬化症は大動脈、
冠状動脈、脳動脈および頚動脈に多く発生し、心筋梗
塞、脳梗塞などの主因となる疾患である。また、最近で
はアルツハイマー病も動脈硬化症と関係性の大きい疾患
であることがわかってきた。従来、血液中で、これらの
生体内での動脈硬化症の状態を直接反映する測定対象が
なく、血清中あるいは血漿中のLDL、Lp(a)、レムナン
トリポ蛋白、Small,dense LDL、酸化LDLなど、LDLを主
体とした血管壁脂質蓄積と関わりの深い、動脈硬化性病
変に関わるリポ蛋白として測定されてきた。なかんず
く、酸化LDLと粥状動脈硬化病変の進展との関連性がス
タインバーグ(Steinberg,D.et al. Engl.Med.32
0:915,1989)により、一方、Rossらが提唱した傷害反
応仮説(Ross,R.Nature.362:801,1993)によって
指摘されて以来、動脈硬化の進展における酸化LDLの関
与が注目されてきた。
The problem of arteriosclerosis is the aorta,
It frequently occurs in coronary arteries, cerebral arteries and carotid arteries, and is a major cause of myocardial infarction and cerebral infarction. Recently, it has been found that Alzheimer's disease is also a disease closely related to arteriosclerosis. Conventionally, there is no measurement target that directly reflects the in vivo arteriosclerosis state in blood, and serum or plasma LDL, Lp (a), remnant lipoprotein, Small, dense LDL, oxidized LDL As such, it has been measured as a lipoprotein involved in arteriosclerotic lesions, which is closely related to lipid accumulation mainly in LDL. Among other things, the association between oxidized LDL and the development of atherosclerotic lesions is Steinberg, D. et al. Engl. Med. 32.
0: 915, 1989), while the injury response hypothesis proposed by Ross et al. (Ross, R. Nature. 362: 801, 1993) has been pointed out, the involvement of oxidized LDL in the progression of arteriosclerosis has been noted. It was

【0003】しかし、最近の研究では酸化LDLのみなら
ず酸化HDL(Nakajima,T et al.Biochem Biophys Biopy
s Res Conmmun.217:407,1995)が動脈硬化症患部に
局在する事実、大村らは(大村寛敏,他.動脈硬化.2
5:No4,126,1997)冠動脈硬化症において、血清HDL中
の過酸化脂質量が増大しているのを認め、動脈硬化の形
成にHDLの酸化変性も関与していることを報告してい
る。同様に、楠実らは(楠美嘉晃,他.動脈硬化.24:
327,1996)動脈内膜に酸化等による変性Lp(a)が沈着
しているのを認め、Lp(a)の動脈硬化進展機序に変性L
p(a)の関与の可能性を示唆している。また最近の疫学
調査では、アルツハイマー病の発症の背景には動脈硬化
があることが指摘されており(Kalaria,RN.Pharmacol&
Ther.72:193,1996)、リポ蛋白の酸化変性やapoEの表
現型と動脈硬化症やアルツハイマー病の発症との関連が
注目されている(Prem Kumar,DRD.et al.Am J Patho
l.148:2083,1996)。
However, in recent studies, not only oxidized LDL but also oxidized HDL (Nakajima, T et al. Biochem Biophys Biopy
s Res Conmmun. 217: 407, 1995) is localized in the affected area of arteriosclerosis, and Omura et al. (Hiroshi Omura et al. Atherosclerosis. 2
5: No4, 126, 1997) In coronary arteriosclerosis, the amount of lipid peroxide in serum HDL was increased, and it was reported that oxidative degeneration of HDL is also involved in the formation of arteriosclerosis. . Similarly, Kusunoki et al. (Kusumi Yoshiaki, et al. Atherosclerosis. 24:
327, 1996) Denatured Lp (a) due to oxidation etc. was found to have been deposited on the intima of the arteries, and denatured Lp (a) was considered to be the mechanism of arteriosclerosis development
This suggests a possible involvement of p (a). A recent epidemiological study has pointed out that the background of the onset of Alzheimer's disease is arteriosclerosis (Kalaria, RN.Pharmacol &
Ther.72: 193, 1996), oxidative degeneration of lipoproteins and apoE phenotype are associated with the onset of arteriosclerosis and Alzheimer's disease (Prem Kumar, DRD. Et al. Am J Patho).
l.148: 2083, 1996).

【0004】即ち、活性酸素によりVLDLが酸化修飾され
てヘパリン結合能を失い、難溶性の沈澱を形成すること
によって脂質過酸化物が血管や神経組織に蓄積し、細胞
を傷害することが予想されている(平村和行,他.Jpn J
Electroph.42:27,1998)。 最近までは、動脈硬化
の発症進展に関して、LDLに関する生化学的、分子生物
学的研究の進歩が大きく、酸化LDLがatherogenicityの
主役であることが強調されすぎているきらいがある。し
かし、近年の研究の成果として、上述のごとく動脈硬化
症やアルツハイマー病の発症・進展への関与物質とし
て、LDLのみでなく、HDL、Lp(a)、VLDLなど多種の酸
化変性リポ蛋白が含まれることが明らかとなった。
That is, it is expected that VLDL is oxidatively modified by active oxygen and loses heparin-binding ability to form a sparingly soluble precipitate, whereby lipid peroxide accumulates in blood vessels and nerve tissues and damages cells. (Kazuyuki Hiramura, et al. Jpn J
Electroph. 42:27, 1998). Until recently, there has been a great deal of progress in biochemical and molecular biological research on LDL with regard to the development of arteriosclerosis, and it is often overemphasized that oxidized LDL is a major player in atherogenicity. However, as a result of recent research, not only LDL but also various oxidatively modified lipoproteins such as HDL, Lp (a), and VLDL are included as substances involved in the onset and progression of arteriosclerosis and Alzheimer's disease as described above. It became clear that

【0005】さらに、各リポ蛋白の被酸化性に大きな差
があり、HDL、Lp(a)、Small,dense LDLは酸化され易
く、粒子径の大きなLDLやVLDLは酸化されにくい特性を
有することもわかってきた。また、LDLに分類されるsma
ll,dense LDLは糖尿病罹患者に多く出現するLDLであ
り、動脈硬化症全てを反映できないことも明かとなっ
た。そこで、LDLのみならず、特に被酸化性の強いHDLや
Lp(a)の酸化変性体にも注目する必要が生じてきた。
Furthermore, there is a large difference in the oxidizability of each lipoprotein, and HDL, Lp (a), Small and dense LDL are easily oxidized, and LDL and VLDL having a large particle size are also difficult to be oxidized. I understand. Also, sma classified as LDL
It was also clarified that ll and dense LDL are LDL that frequently appear in diabetic patients and cannot reflect all arteriosclerosis. Therefore, not only LDL but also HDL, which is particularly oxidizable,
It has become necessary to pay attention to the oxidative modification of Lp (a).

【0006】しかし、現状ではこれら各種リポ蛋白の変
性体を血中で安易に測定する方法が存在しなかった。し
たがって、本研究は、動脈硬化症やアルツハイマー病の
発症・進展と深く関わる、各種変性リポ蛋白の新規な検
出方法を提供することを課題とする。
However, at present, there is no method for easily measuring the modified forms of these various lipoproteins in blood. Therefore, it is an object of the present study to provide a novel method for detecting various denatured lipoproteins, which is closely related to the onset and progress of arteriosclerosis and Alzheimer's disease.

【0007】[0007]

【課題を解決するための手投】生体の主要な構成成分と
して蛋白質、脂質、糖質、核酸があげられるが、最も酸
化されやすいのは脂質であり、酸素添加反応が起こり、
いわゆる過酸化脂質が生成する。脂質が酸化されやすい
のは多くの脂質がリノール酸やアラキドン酸のような高
度不飽和脂肪酸のエステルとなっているためである。リ
ポ蛋白は脂質と蛋白質から構成されており、リポ蛋白が
酸化された場合には、脂質、蛋白質共に酸化変性を受け
る。この生体脂質が非酵素的に酸化される引き金として
は、活性酸素が考えられている。この過酸化脂質の測定
は順相HPLC法などの分析化学的手法が用いられ、健常人
の生体内でも確実に脂質の非酵素的酸化が起きているこ
とが証明されている(山本順寛,他.蛋白質・核酸・酵
素・44:1253,1999)。
[Measures to solve the problem] Proteins, lipids, sugars, and nucleic acids are listed as the main constituents of the living body, but the most oxidizable is the lipid, which undergoes an oxygenation reaction,
So-called lipid peroxide is produced. Lipids are easily oxidized because many lipids are esters of highly unsaturated fatty acids such as linoleic acid and arachidonic acid. Lipoproteins are composed of lipids and proteins, and when lipoproteins are oxidized, both lipids and proteins undergo oxidative modification. Active oxygen is considered as a trigger for non-enzymatic oxidation of this biological lipid. The measurement of this lipid peroxide uses analytical chemistry methods such as normal phase HPLC method, and it has been proved that non-enzymatic oxidation of lipid occurs reliably in the body of healthy humans (Yamamoto Junhiro, et al. .Protein / nucleic acid / enzyme44: 1253, 1999).

【0008】上述のごとく現状では、血液中の総過酸化
脂質量の把握は可能であるが、リポ蛋白個別の酸化変性
度を知る方法は現在のところ存在せず、LDLの酸化変性
体が血液中に存在することの実証は、本発明者らの特願
平8-317162号による方法によって初めて成された。さら
に本発明者は、特願平11-109001号、特願平11-207913号
に開示した手法によっても血液中の酸化変性LDLの検出
が可能であることを発見した。
As described above, at present, it is possible to grasp the total amount of lipid peroxide in blood, but there is no method for ascertaining the degree of oxidative denaturation of each lipoprotein. It was demonstrated for the first time by the method of Japanese Patent Application No. 8-317162 of the present inventors. Furthermore, the present inventor has discovered that the method disclosed in Japanese Patent Application Nos. 11-109001 and 11-207913 can also detect oxidatively modified LDL in blood.

【0009】そして、その後、更なる研究と検討を繰り
返した結果、循環血液中にLDL以外のリポ蛋白の酸化変
性体が存在する事実を発見して本発明に至った。即ち、
特願平8-317162号、特願平11-109001号および、特願平1
1-207913号の手法を発展させて、血液中の各種リポ蛋白
の変性体を個別に測定可能な検出方法を確立して本発明
を完成させたものである。
[0009] Then, as a result of repeated research and examination, the present inventors discovered the fact that oxidatively modified forms of lipoproteins other than LDL exist in circulating blood, and reached the present invention. That is,
Japanese Patent Application No. 8-317162, Japanese Patent Application No. 11-109001 and Japanese Patent Application No. 1
The present invention was completed by developing the method of 1-207913 and establishing a detection method capable of individually measuring denatured products of various lipoproteins in blood.

【0010】より具体的に説明すると、本発明は、各種
リポ蛋白(カイロミクロン、VLDL、IDL、LDL、Lp(a)、H
DL)が酸化変性を受けると血漿蛋白(特にα1−アンチ
トリプシンやフィブリノーゲン又はフィブリン(各々の
分解産物を含む)、IgA、フィブロネクチンなど)と複
合体を形成し、且つ、いずれの複合体も動脈硬化症疾患
と関連性が高い点を見出して完成されたものである。
More specifically, the present invention provides various lipoproteins (chylomicrons, VLDL, IDL, LDL, Lp (a), H
When DL) undergoes oxidative degeneration, it forms a complex with plasma proteins (especially α1-antitrypsin, fibrinogen or fibrin (including their respective degradation products), IgA, fibronectin, etc.), and any of these complex forms arteriosclerosis. It was completed by finding points that are highly related to illness.

【0011】なお典型的には、本発明は、各種酸化変性
リポ蛋白とα1−アンチトリプシンの複合体を特異的に
認識する抗体、各種酸化変性リポ蛋白とIgAの複合体を
認識する特異抗体、各種酸化変性リポ蛋白とフィブロネ
クチンの複合体を認識する特異抗体、もしくは、抗ヒト
フィブリノーゲン抗体を固相抗体として用い、各リポ蛋
白の酸化変性体と反応させた後に、酵素をはじめとする
標識物をラベルした各リポ蛋白を構成するアポ蛋白に対
する抗体を反応させて、血液中の酸化変性リポ蛋白を分
別測定する検出方法である。
[0011] Typically, the present invention provides an antibody that specifically recognizes a complex of various oxidized denatured lipoproteins and α1-antitrypsin, a specific antibody that recognizes a complex of various oxidized denatured lipoproteins and IgA, Specific antibodies that recognize the complex of various oxidatively modified lipoproteins and fibronectin, or anti-human fibrinogen antibody is used as a solid-phase antibody, and after reacting with the oxidatively modified products of each lipoprotein, labeled products such as enzymes This is a detection method in which an antibody against an apoprotein that constitutes each labeled lipoprotein is reacted to differentially measure oxidatively modified lipoprotein in blood.

【0012】この場合、血液中のリポ蛋白を超遠心法や
化学物質を用いた沈澱法で分画したものを試料とするこ
とも、血清や血漿をそのまま試料として測定することも
可能である。リポ蛋白を分画して試料とする場合は、固
相抗体として抗ヒトIgA、抗ヒトα1−アンチトリプシ
ン、抗ヒトフィブロネクチン抗体が使える。この検出方
法によれば、生体内でフリーラジカル連鎖酸化反応が進
行している状況を、各リポ蛋白の被酸化の状態として
(HDL、Lp(a)、Small,dense LDLは特に易酸化性であ
る)把握することが可能となる。また、この検出の臨床
応用としては、動脈硬化症やアルツハイマー病の早期診
断や、動脈硬化症治療薬投与時の薬効評価などに好適で
ある。
In this case, it is possible to use a sample obtained by fractionating lipoprotein in blood by an ultracentrifugation method or a precipitation method using a chemical substance, or to measure serum or plasma as it is as a sample. When the lipoprotein is fractionated and used as a sample, anti-human IgA, anti-human α1-antitrypsin, or anti-human fibronectin antibody can be used as the solid phase antibody. According to this detection method, the situation in which the free radical chain oxidation reaction is progressing in the living body is taken as the oxidation state of each lipoprotein (HDL, Lp (a), Small, dense LDL are particularly oxidizable). It is possible to grasp. In addition, clinical applications of this detection are suitable for early diagnosis of arteriosclerosis and Alzheimer's disease, and evaluation of drug efficacy during administration of therapeutic agents for arteriosclerosis.

【0013】[0013]

【実施例】以下、本発明について具体的に説明する。 [血清中あるいは血漿中の変性LDL/α1−アンチトリ
プシン複合体の測定] 1.IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl,
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg/mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1/wellで分注する。 2.4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1%
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05%アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1/
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1/wellで3回洗浄する。 3.マイクロプレートに55mg/ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin合有1%BSA溶液を100μl/wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加する。 4.室温下一晩反応させる。 5.0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回洗浄する。 6.ビオチン標識Fab´化IgG-apoB-427モノクローナル抗
体を1%BSA溶液で1.6μg/mlとし、100μ1/well文注す
る。 7.37℃下1.5時間反応させる。 8.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 9.HRP標識アビジンD(Vector Laboratories社製)を1
%カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1/well分注
する。 10.37℃下30分間反応させる。 11.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 12.発色試薬を100μ1/well分注し、室温下30分間反応
させる。 13.1Mリン酸水溶液を100μ1/well分注し、反応を停止
する。 14.主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15.人工的に調整した変性LDL/α1−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性LDL/α
1−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
The present invention will be described in detail below. [Measurement of modified LDL / α1-antitrypsin complex in serum or plasma] 1. IgG-O.AT-4 monoclonal antibody was added to 0.05M Tris-HCl,
Dissolve it in 0.15M NaCl pH8.0 buffer at 20 μg / ml, and dispense at 100 μl / well into a microplate. After physically adsorbing at 2.4 ° C overnight, wash 3 times with distilled water, 0.1%
Sucrose, bovine serum albumin, 0.05 M containing 0.05% sodium azide, Tris-HCl buffer adjusted to pH 7.5 100 μl /
Dispense well and leave at room temperature for 30 minutes or longer, then discard the liquid 4
Dry at ℃. Dry the microplate with distilled water 25
Wash 3 times with 0 μl / well. 3. 55 mg / ml Mouse Gamma Globulin on the microplate
And Rabbit Gamma Globulin combined 1% BSA solution 100 μl / wel
Dispense l and add 50 μl of serum or standard solution. Four. Incubate overnight at room temperature. 5. Wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 6. The biotin-labeled Fab'-conjugated IgG-apoB-427 monoclonal antibody is adjusted to 1.6 µg / ml with 1% BSA solution, and 100 µl / well is injected. 7. Incubate at 37 ℃ for 1.5 hours. 8.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 9. HRP-labeled avidin D (Vector Laboratories) 1
Dilute 15000 times with 100% casein solution and dispense 100 μl / well. 10. Incubate at 37 ℃ for 30 minutes. 11.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 12. Dispense 100 μl / well of coloring reagent and react at room temperature for 30 minutes. Dispense 100 μl / well of 13.1M phosphoric acid aqueous solution to stop the reaction. 14. It measures light at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 620 nm. 15. Modified LDL / α in the sample from the calibration curve obtained by artificially modified denatured LDL / α1-antitrypsin complex
Calculate the 1-antitrypsin complex concentration.

【0014】[血清中あるいは血漿中の変性Lp(a)/
α1−アンチトリプシン複合体の測定] 1.IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl,
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg/mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1/wellで分注する。 2.4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1%
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05%アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1/
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1/wellで3回洗浄する。 3.マイクロプレートに55mg/ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin含有1%BSA溶液を100μ1/wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μ1添加する。 4.室温下一晩反応させる。 5.0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回洗浄する。 6.ビオチン標識Fab´化IgG-Lp(a)ポリクローナル抗
体を1%BSA溶液で1.6μg/mlとし、100μ1/well分注す
る。 7.37℃下1.5時間反応させる。 8.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 9.HRP標識アビジンD(Vector Laboratories社製)を1
%カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1/well分注
する。 10.37℃下30分間反応させる。 11.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 12.発色試薬を100μ1/well分注し、室温下30分間反応
させる。 13.1Mリン酸水溶液を100μ1/well分注し、反応を停止
する。 14.主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15.人工的に調整した変性Lp(a)/α1−アンチトリ
プシン複合体により求めた検量線から試料中の変性Lp
(a)/α1−アンチトリプシン複合体濃度を算出す
る。
[Denatured Lp (a) / in serum or plasma
Measurement of α1-antitrypsin complex] 1. IgG-O.AT-4 monoclonal antibody was added to 0.05M Tris-HCl,
Dissolve it in 0.15M NaCl pH8.0 buffer at 20 μg / ml, and dispense at 100 μl / well into a microplate. After physically adsorbing at 2.4 ° C overnight, wash 3 times with distilled water, 0.1%
Sucrose, bovine serum albumin, 0.05 M containing 0.05% sodium azide, Tris-HCl buffer adjusted to pH 7.5 100 μl /
Dispense well and leave at room temperature for 30 minutes or longer, then discard the liquid and
Dry at ℃. Dry the microplate with distilled water 25
Wash 3 times with 0 μl / well. 3. 55 mg / ml Mouse Gamma Globulin on a microplate
And 1% BSA solution containing Rabbit Gamma Globulin 100μ1 / wel
Dispense l and add 50 μl of serum or standard solution. Four. Incubate overnight at room temperature. 5. Wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 6. Biotin-labeled Fab'-conjugated IgG-Lp (a) polyclonal antibody is adjusted to 1.6 µg / ml with 1% BSA solution, and 100 µl / well is dispensed. 7. Incubate at 37 ℃ for 1.5 hours. 8.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 9. HRP-labeled avidin D (Vector Laboratories) 1
Dilute 15000 times with 100% casein solution and dispense 100 μl / well. 10. Incubate at 37 ℃ for 30 minutes. 11.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 12. Dispense 100 μl / well of coloring reagent and react at room temperature for 30 minutes. Dispense 100 μl / well of 13.1M phosphoric acid aqueous solution to stop the reaction. 14. It measures light at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 620 nm. 15. Denatured Lp in the sample from the calibration curve determined by artificially adjusted denatured Lp (a) / α1-antitrypsin complex
(A) / α1-antitrypsin complex concentration is calculated.

【0015】[血清中あるいは血漿中の変性HDL/α1
−アンチトリプシン複合体の測定] 1.IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl,
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg/mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1/wellで分注する。 2.4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1%
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05%アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1/
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1/wellで3回洗浄する。 3.マイクロプレートに55mg/ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin含有1%BSA溶液を100μ1/wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加する。 4.室温下一晩反応させる。 5.0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回洗浄する。 6.ビオチン標識Fab´化IgG-apoAlポリクローナル抗体
を1%BSA溶液で1.6μg/mlとし、100μ1/well分注す
る。 7.37℃下1.5時間反応させる。 8.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 9.HRP標識アビジンD(Vector Laboratories社製)を1
%カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1/well分注
する。 10.37℃下30分間反応させる。 11.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 12.発色試薬を100μ1/well分注し、室温下30分間反応
させる。 13.1Mリン酸水溶液を100μ1/well分注し、反応を停止
する。 14.主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15. 人工的に調整した変性HDL/α1−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性HDL/α
1−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
[Denatured HDL / α1 in serum or plasma
-Measurement of antitrypsin complex] 1. IgG-O.AT-4 monoclonal antibody was added to 0.05M Tris-HCl,
Dissolve it in 0.15M NaCl pH8.0 buffer at 20 μg / ml, and dispense at 100 μl / well into a microplate. After physically adsorbing at 2.4 ° C overnight, wash 3 times with distilled water, 0.1%
Sucrose, bovine serum albumin, 0.05 M containing 0.05% sodium azide, Tris-HCl buffer adjusted to pH 7.5 100 μl /
Dispense well and leave at room temperature for 30 minutes or longer, then discard the liquid and
Dry at ℃. Dry the microplate with distilled water 25
Wash 3 times with 0 μl / well. 3. 55 mg / ml Mouse Gamma Globulin on a microplate
And 1% BSA solution containing Rabbit Gamma Globulin 100μ1 / wel
Dispense l and add 50 μl of serum or standard solution. Four. Incubate overnight at room temperature. 5. Wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 6. The biotin-labeled Fab'-conjugated IgG-apoAl polyclonal antibody was adjusted to 1.6 μg / ml with 1% BSA solution, and 100 μl / well was dispensed. 7. Incubate at 37 ℃ for 1.5 hours. 8.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 9. HRP-labeled avidin D (Vector Laboratories) 1
Dilute 15000 times with 100% casein solution and dispense 100 μl / well. 10. Incubate at 37 ℃ for 30 minutes. 11.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 12. Dispense 100 μl / well of coloring reagent and react at room temperature for 30 minutes. Dispense 100 μl / well of 13.1M phosphoric acid aqueous solution to stop the reaction. 14. It measures light at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 620 nm. 15. Denatured HDL / α in the sample from the calibration curve obtained by artificially prepared denatured HDL / α1-antitrypsin complex
Calculate the 1-antitrypsin complex concentration.

【0016】[血清中あるいは血漿中の変性VLDL/α1
−アンチトリプシン複合体の測定] 1.IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl,0.
15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg/mlで溶解し、マイクロ
プレートに100μ1/wellで分注する。 2.4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1%
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05%アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1/
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1/wellで3回洗浄する。 3.マイクロプレートに55mg/ml Mouse Gamma Globuli
nとRabbit Gamma Globulin合有1%BSA溶液を100μ1/we
ll分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加す
る。 4.室温下一晩反応させる。 5.0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回洗浄する。 6.ビオチン標識Fab´化IgG-apoEポリクローナル抗体
を1%BSA溶液で1.6μg/mlとし、100μ1/well分注す
る。 7.37℃下1.5時間反応させる。 8.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 9.HRP標識アビジンD(Vector Laboratories社製)を1
%カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1/well分注
する。 10.37℃下30分間反応させる。 11.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 12.発色試薬を100μ1/well分注し、室温下30分間反応
させる。 13.1Mリン酸水溶液を100μ1/well分注し、反応を停止
する。 14.主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15.人工的に調整した変性VLDL/α1−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性VLDL/α
1−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
[Denatured VLDL / α1 in serum or plasma
-Measurement of antitrypsin complex] 1. IgG-O.AT-4 monoclonal antibody was added to 0.05M Tris-HCl, 0.
Dissolve at 20 μg / ml in 15M NaCl pH8.0 buffer and dispense at 100 μl / well into a microplate. After physically adsorbing at 2.4 ° C overnight, wash 3 times with distilled water, 0.1%
Sucrose, bovine serum albumin, 0.05 M containing 0.05% sodium azide, Tris-HCl buffer adjusted to pH 7.5 100 μl /
Dispense well and leave at room temperature for 30 minutes or longer, then discard the liquid and
Dry at ℃. Dry the microplate with distilled water 25
Wash 3 times with 0 μl / well. 3. 55 mg / ml Mouse Gamma Globuli on a microplate
n and Rabbit Gamma Globulin combined 1% BSA solution 100μ1 / we
and add 50 μl of serum or standard solution. Four. Incubate overnight at room temperature. 5. Wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 6. Biotin-labeled Fab'-conjugated IgG-apoE polyclonal antibody is adjusted to 1.6 µg / ml with 1% BSA solution, and 100 µl / well is dispensed. 7. Incubate at 37 ℃ for 1.5 hours. 8.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 9. HRP-labeled avidin D (Vector Laboratories) 1
Dilute 15000 times with 100% casein solution and dispense 100 μl / well. 10. Incubate at 37 ℃ for 30 minutes. 11.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 12. Dispense 100 μl / well of coloring reagent and react at room temperature for 30 minutes. Dispense 100 μl / well of 13.1M phosphoric acid aqueous solution to stop the reaction. 14. It measures light at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 620 nm. 15. Denatured VLDL / α in the sample from the calibration curve obtained using the artificially prepared denatured VLDL / α1-antitrypsin complex
Calculate the 1-antitrypsin complex concentration.

【0017】[血清中の変性LDL/フィブリノーゲンま
たはフィブリン(各々の分解産物を含む)複合体の測
定] 1.IgG-フィブリノーゲンポリクローナル抗体を0.05M T
ris-HCl,0.15M NaClpH8.0緩衝液に20μg/mlで溶解
し、マイクロプレートに100μ1/wellで分注する。 2.4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1%
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05%アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1/
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1/wellで3回洗浄する。 3.マイクロプレートに55mg/ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin合有1%BSA溶液を100μ1/wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μ1添加する。 4.室温下一晩反応させる。 5.0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回洗浄する。 6.ビオチン標識Fab´化IgG-apoB-427モノクローナル抗
体を1%BSA溶液で1.6μg/mlとし、100μ1/well分注す
る。 7.37℃下1.5時間反応させる. 8.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 9.HRP標識アビジンD(Vector Laboratories社製)を1
%カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1/well分注
する。 10.37℃下30分間反応させる。 11.3.と同様、0.005%Tween20溶液250μ1/wellで5回
洗浄する。 12.発色試薬を100μ1/well分注し、室温下30分間反応
させる。 13.1Mリン酸水溶液を100μ1/well分注し、反応を停止
する。 14.主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15.人工的に調整した変性LDL/フィブリノーゲン複合
体により求めた検量線から試料中の変性LDL/フィブリ
ノーゲンまたはフィブリン(各々の分解産物を含む)複
合体濃度を算出する。
[Measurement of denatured LDL / fibrinogen or fibrin (including each degradation product) complex in serum] 1. IgG-Fibrinogen polyclonal antibody 0.05MT
Dissolve at 20 μg / ml in ris-HCl, 0.15M NaCl pH8.0 buffer, and dispense at 100 μl / well on a microplate. After physically adsorbing at 2.4 ° C overnight, wash 3 times with distilled water, 0.1%
Sucrose, bovine serum albumin, 0.05 M containing 0.05% sodium azide, Tris-HCl buffer adjusted to pH 7.5 100 μl /
Dispense well and leave at room temperature for 30 minutes or longer, then discard the liquid and
Dry at ℃. Dry the microplate with distilled water 25
Wash 3 times with 0 μl / well. 3. 55 mg / ml Mouse Gamma Globulin on a microplate
And Rabbit Gamma Globulin combined 1% BSA solution 100μ1 / wel
Dispense l and add 50 μl of serum or standard solution. Four. Incubate overnight at room temperature. 5. Wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 6. Biotin-labeled Fab'-conjugated IgG-apoB-427 monoclonal antibody is adjusted to 1.6 µg / ml with 1% BSA solution, and 100 µl / well is dispensed. 7. Incubate at 37 ℃ for 1.5 hours. 8.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 9. HRP-labeled avidin D (Vector Laboratories) 1
Dilute 15000 times with 100% casein solution and dispense 100 μl / well. 10. Incubate at 37 ℃ for 30 minutes. 11.3. Similarly, wash with 0.005% Tween20 solution 250 μl / well 5 times. 12. Dispense 100 μl / well of coloring reagent and react at room temperature for 30 minutes. Dispense 100 μl / well of 13.1M phosphoric acid aqueous solution to stop the reaction. 14. It measures light at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 620 nm. 15. The concentration of the modified LDL / fibrinogen or fibrin (including each degradation product) complex in the sample is calculated from the calibration curve obtained by the artificially modified denatured LDL / fibrinogen complex.

【0018】[血清中の変性Lp(a)、変性HDL/フィブ
リノーゲンまたはフィブリン複合体の測定]上述と同様
にビオチン標識Fab´化抗体にLp(a)抗体、apoAl抗体
を用いればよい。
[Measurement of denatured Lp (a), denatured HDL / fibrinogen or fibrin complex in serum] Lp (a) antibody and apoAl antibody may be used as the biotin-labeled Fab'-conjugated antibody as described above.

【0019】[冠動脈疾患における血中変性(LDL、Lp
(a)、HDL濃度)]冠動脈造影検査により、1segmentに5
0%以上の有意狭窄病変を有するものを冠動脈硬化症と
定め、これに基づき冠動脈硬化症と診断された者、CAD
(+)群(n=26)、基準値以下のCAD(-)群(n=21)
を対象に変性(LDLおよびLp(a)/α1−アンチトリプ
シン複合体、変性HDL/α1−アンチトリプシン複合体
を測定し、比較的検討したところ、いずれの変性リポ蛋
白についてもCAD(+)群が有意な高値を示した(図
1)。
[Blood degeneration in coronary artery disease (LDL, Lp
(A), HDL concentration)] 5 in 1 segment by coronary angiography
Those with 0% or more significant stenotic lesions are defined as coronary atherosclerosis, and those diagnosed with coronary atherosclerosis based on this, CAD
(+) Group (n = 26), CAD (-) group below standard value (n = 21)
Deterioration (LDL and Lp (a) / α1-antitrypsin complex, denatured HDL / α1-antitrypsin complex were measured and comparatively examined. Showed a significantly high price (Fig.
1).

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】冠動脈硬化症における血中の変性リポ蛋白(LD
L、Lp(a)、HDL)の濃度を図示したものである。
1] Denatured lipoprotein (LD in blood in coronary atherosclerosis)
L, Lp (a), HDL) concentrations are illustrated.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 33/53 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (58) Fields surveyed (Int.Cl. 7 , DB name) G01N 33/53

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】 高比重リポ蛋白(HDL)が変性されてな
る変性リポ蛋白とα1−アンチトリプシンとの複合体を
測定対象にする血液中の変性リポ蛋白の検出方法であっ
て、 前記複合体中のα1−アンチトリプシンを特異的に認識
する抗体を固相抗体とし、かつ酵素をはじめとする標識
物質を標識した抗ヒトapoA1抗体を標識抗体として用い
る、血液中の変性リポ蛋白の検出方法。
1. A high-density lipoprotein (HDL) is not denatured.
Complex of denatured lipoprotein with α1-antitrypsin
It is a method for detecting denatured lipoprotein in blood to be measured.
Te, specifically recognize α1- antitrypsin in said composite
The solid-state antibody is used as an antibody, and the enzyme and other labels are used.
Using anti-human apoA1 antibody labeled with a substance as a labeled antibody
A method for detecting denatured lipoprotein in blood.
【請求項2】 Lp(a)が変性されてなる変性リポ蛋白と
α1−アンチトリプシンとの複合体を測定対象にする血
液中の変性リポ蛋白の検出方法であって、 前記複合体中のα1−アンチトリプシンを特異的に認識
する抗体を固相抗体とし、かつ酵素をはじめとする標識
物質を標識した抗ヒトLp(a)抗体を標識抗体として用い
る、血液中の変性リポ蛋白の検出方法。
2. A modified lipoprotein obtained by modifying Lp (a).
Blood whose complex is α1-antitrypsin
A method for detecting denatured lipoprotein in a liquid, which specifically recognizes α1-antitrypsin in the complex.
The solid-state antibody is used as an antibody, and the enzyme and other labels are used.
Anti-human Lp (a) antibody labeled with a substance is used as a labeled antibody
A method for detecting denatured lipoprotein in blood.
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