JP3457321B2 - Ｃｎｔｆシグナル形質導入経路を用いたアッセイ系 - Google Patents

Ｃｎｔｆシグナル形質導入経路を用いたアッセイ系

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Description

【発明の詳細な説明】 本願は、1993年７月29日付け出願の米国特許出願第08
/097,997号の一部継続出願であり、また1991年12月２日
付け出願の米国特許出願第07/801,562号の一部継続出願
である1992年４月８日付け米国特許出願第07/865,878号
の一部継続出願である。
1.緒言 本発明は、毛様体神経栄養因子（CNTF）、ならびにCN
TFと受容体成分を共有するインターロイキン−６（IL−
６）、オンコスタチンＭ（OSM）および白血病抑制因子
（LIF）のような他のサイトカインのサイトカイン活性
を検出および／あるいは測定するために使用することが
できるアッセイ系を提供する。本発明はさらに、CNTFの
作用物質あるいは拮抗物質として働く物質およびCNTFと
受容体成分を共有する因子を検出するために使用するこ
とができるアッセイ系を提供する。
2.発明の背景 2.1.毛様体神経栄養因子 毛様体神経栄養因子（CNTF）は、その名称が意味する
ように、in vitroで胚性ひな鳥の毛様体神経節ニュー
ロンの生存に特に必要とされるタンパク質である［Mant
horpeら、J.Neurochem.34:69−75（1980）］。その全文
を参考として本明細書中に包含するものとする、Sendtn
erらによる1990年９月14日付け出願の国際出願第PCT/U.
S.90/05241号に記載されるように、CNTFはクローニング
され、真核生物発現系ならびに細菌発現系で合成され
た。
過去10年にわたり、毛様体神経節ニューロンの生存を
支持する能力に加えて、多くの生物学的作用がCNTFに基
づくものとされてきた。CNTFは、周産期ラットの視神経
および脳における両能性グリア前駆体細胞の分化を誘発
すると考えられている［Hughesら、Nature335:70−73
（1988）］。さらに、CNTFは胚性ひな鳥の背根神経節感
覚ニューロンの生存を促進することが認められた［Skap
erとVaron、Brain Res.389:39−46（1986）］。
CNTFの、運動ニューロンおよび海馬ニューロンの生存
と分化を支持する能力、海馬星状膠細胞の増殖速度を上
昇させる能力を含めて、いくつかの新しい作用も発見さ
れている（国際出願第PCT/US90/05241号、前出）。
2.2.毛様体神経栄養因子受容体 その全文を参考として本明細書中に包含するものとす
る、Davisらによる1991年５月15日付け出願の「毛様体
神経栄養因子受容体」と題した米国特許出願第07/700,6
77号および1991年６月３日付け出願の国際出願第PCT/US
91/03896号に述べられているように、CNTFの受容体（CN
TFRあるいはCNTFRα）がクローニングされ、真核生物細
胞において発現された。
CNTFRの配列は、細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメ
インおよび細胞質ドメインを含む多くの受容体と異な
り、細胞質ドメインを持たないと思われることを示して
いる。さらに、CNTFRの膜貫通疎水性ドメインはタンパ
ク分解によるプロセシングを受け、グリコホスファチジ
ルイノシトール（GPI）結合と称される非一般的な結合
によって、成熟形CNTFRが細胞表面に固定されることに
なる（同上）。CNTFRのようなGPI結合タンパク質は、ホ
スファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素
によるGPIアンカーの切断を通して細胞表面から放出さ
れると考えられる。他の既知の受容体配列のうちで、CN
TFRは、IL−６、LIF、Ｇ−CSFおよびオンコスタチンＭ
（OSM）を含めて本文中でCNTF/IL−6/LIFファミリーと
称される多くの受容体に関連する［Bazan,Neuron7:197
−208（1991）;RoseとBruce,Proc.Natl.Acad.Sci.88:86
41−8645（1991）］が、IL−６受容体の配列に最も密接
に関連すると思われる。しかし、IL−６がGPI結合タン
パク質であることは示されていない［たとえばTagaら、
Cell58:573−581（1989）;Hibiら、Cell63:1149−1157
（1989）］。
CNTF受容体（CNTFR）のクローニング、配列決定およ
び発現は、CNTFRとCNTFが膜結合のシグナル形質導入成
分と相互作用する複合体を形成するであろうという発見
に導き、それ故可溶性CNTF/CNTFR受容体複合体の治療作
用を示唆した（たとえば、その全文を参考として本明細
書中に包含するものとする、「無細胞毛様体神経栄養因
子／受容体複合体」と題したYancopoulosらによる1991
年12月２日付け出願の同時係属の米国特許出願第801,56
2号を参照のこと）。
CNTFの高親和性結合およびその後の細胞の機能的反応
に関与する、そのようなシグナル形質導入成分のひとつ
は、IL−６、オンコスタチンＭ、LIFファミリーの受容
体に共通するβ成分である、gp130と同定された［Fukun
agaら、EMBO J.10:2855−2865（1991）;Gearingら、EM
BO J.10:2839−2848（1991）;Gearingら、Science255:
1434−1437（1992）;Ipら、Cell69:1121−1132（199
2）］。LIFに応答して結合およびシグナル形質導入に関
与するものとして同定されたもうひとつのβ成分（LIFR
β）は、CNTFへの応答に必要なβ成分と同じかあるいは
同様のものであると思われる（CNTFの結合およびシグナ
ル形質導入に必要なβ成分の同定の結果として、最初に
一般的にCNTFRと呼ばれていたものは現在はCNTFRαと称
される）。
IL−６は極めて多様な細胞に作用して、成長の促進と
阻害、および時として細胞分化を伴う特異的遺伝子発現
に影響を及ぼす多面発現性サイトカインであり、炎症、
自己免疫疾患およびリンパ系悪性腫瘍を含めたいくつか
の疾患に関与することが示唆された［Kishimotoら、Sci
ence258:593−（1992）］。LIF、Ｇ−CSFおよびOSMはす
べて、独自の成長調節作用を持つにもかかわらず、造血
ならびに他の過程においていくつかのIL−６と共通する
作用を有する広域作用因子である。たとえば、すべてが
マウスの骨髄性白血病細胞系、M1［Rose,1991 ＃137
7］の増殖を阻害し、分化を誘発することができる［Ros
eとBruce,Proc.Natl.Acad.Sci.88:8641−8645（199
1）］。LIFとオンコスタチンＭは、CNTFによって誘発さ
れる反応と区別することができないチロシンリン酸化お
よびニューロン細胞内の遺伝子活性化を誘発した（Ip
ら、1992、Cell69:1121−1132］。その全文を参考とし
て本明細書中に包含するものとする、「無細胞毛様体神
経栄養因子／受容体複合体」と題したYancopoulosによ
る1991年12月２日付け出願の同時係属の米国特許出願第
801,562号において、CNTFとCNTFRαは、結合して、CNTF
/IL−6/LIF受容体ファミリーに属するシグナル形質導入
受容体成分を発現するタイプの細胞における分化あるい
は増殖因子として使用することができる、安定で生物学
的に活性な複合体を形成する。その全文を参考として本
明細書中に包含するものとする、「無細胞毛様体神経栄
養因子／受容体複合体」と題する1992年４月８日付け出
願の米国特許出願第07/865,878号に述べられているよう
に、シグナル形質導入は、gp130とLIFRβの両方を発現
する細胞を可溶性CNTF/CNTFRα複合体で処理することに
よって開始することができる。あるいは、事前にはCNTF
に反応性ではないがLIFRβとgp130を発現する標的細胞
（LIF反応性細胞など）を、CNTFRαを細胞に付着させ、
その後CNTFで処理することによってCNTFに対して反応性
にすることができる。
CNTFの結合と受容体の活性化を取り巻く事象が最近明
らかにされたが［Davisら、Science253:59−63（199
1）;Ipら、Cell69:1121−1132（1992）;Stahlら、Cell7
4:587−590（1993）;Davisら、Science260:1805−1018
（1993）］、シグナル形質導入が細胞の内部で開始され
る機序はあまり理解されていない。インターロイキン
（IL）−３、IL−５、GM−CSF、Ｇ−CSF、EPO、GHおよ
びインターフェロンを含む拡大したサイトカインファミ
リーについての関連性の低い他の受容体のように［Baza
n,J.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6934−6938（1990）;
Bazan,J.F.Neuron7:197−208（1991）］、CNTF受容体β
のサブユニットgp130およびLIFRβは、それらの細胞質
領域内にプロテインチロシンキナーゼドメインを持たな
い［Hibiら、Cell63:1149−1157（1990）;Gearingら、E
MBO J.10:2839−2848（1991）］。これにもかかわら
ず、CNTFが誘発するβサブユニットの二量化によって、
CLIPと呼ばれる一組のチロシンリン酸化タンパク質が速
やかに蓄積される［Ipら、Cell69:1121−1132（199
2）］。
上述したように、CLIPのより顕著な２つはβサブユニ
ット自体として同定されたが、他のほとんどがまだ特徴
づけられていない。チロシンのリン酸化を遮断する阻害
因子は同時に遺伝子誘導のようなその後の下流の事象も
遮断するので、細胞質チロシンキナーゼの活性化はCNTF
の作用に必須であると思われる［Ipら、Cell69:1121−1
132（1992）］。
CNTFファミリーの因子によって活性化される細胞質チ
ロシンキナーゼを同定するための可能性のある糸口は、
他の関連性の低いサイトカインがJak/Tykファミリーの
キナーゼの活性化を生じさせるという知見からもたらさ
れた［Firmbach−Kraftら、Oncogene5:1329−1336（199
0）;Wilksら、Mol.Cell.Biol.11:2057−2065（1991）;H
arpurら、Oncogene7:1347−1353（1992）］。このファ
ミリーの非受容体細胞質プロテインチロシンキナーゼは
３つの既知の成員−Jak1、Jak2およびTyk2−から成り、
これらはすべて互いに等しく関連し合い、２つの潜在的
キナーゼドメインを持ち、且つSrc相同２（SH2）ドメイ
ンを持たないという異例の特徴を共有する。IFNαに不
応答性の細胞系における遺伝子欠損の補完に関する試験
は、IFNαのシグナル伝達カスケードの必要成分としてT
yk2の同定をもたらした［Velazquezら、Cell70:313−32
2（1992）］。最近、EPO、GM−CSFおよびGHのようなサ
イトカインの受容体が、Jak2と結合してそれを活性化す
ることが示された［Argetsingerら、Cell74:237−244
（1993）;Silvennoinenら、Proc.Natl.Acad.Sci USA,1
993（印刷中）;Witthuhnら、Cell74:227−236（199
3）］。キナーゼは受容体の膜に近い細胞質領域に結合
することが示された。Jak2結合を妨げるこの領域の突然
変異は同時にEPO誘発の増殖の消失をもたらし、Jak2がE
POのシグナル伝達において極めて重要な役割を果たすこ
とを示唆した。Jak1はこれらの受容体系のいずれによっ
ても有意に活性化されないことが報告されている。
CNTFと受容体成分を共有する造血因子の同定は、通常
そのような造血因子に対して反応性である標的細胞の活
性化のためにCNTFおよびその特異的受容体成分を利用す
ることを可能にするであろう。
3.発明の要約 本発明は、CNTF活性、あるいはCNTFと共通する受容体
成分（「CNTF受容体ファミリー」と称する）を利用する
LIF、オンコスタチンＭあるいはIL−６のような他のサ
イトカインの活性を検出および／または測定するために
使用することができるアッセイ系を提供する。本発明は
また、CNTF受容体ファミリーの成員の作用物質あるいは
拮抗物質として働く物質を同定するために使用すること
ができるアッセイ系を提供する。これは一部には、CNTF
受容体ファミリーの成員が、それらのシグナル形質導入
経路の一部として、CLIPシグナル形質導入経路およびJa
kファミリーのキナーゼを利用するという発見に基づ
く。
本発明はさらに無細胞CNTF/受容体複合体に関する。
これは一部には、無細胞CNTF/受容体複合体が、CNTF受
容体を発現するものよりも広域のスペクトルの細胞型に
対して生物学的に活性であるという発見に基づく。本発
明の特定の実施態様において、CNTF/受容体は、CNTF/IL
−6/LIF受容体ファミリーに属する受容体を発現するタ
イプの細胞中で分化因子として働く。
本発明はさらに、CNTFと無細胞CNTFRが、通常の生理
的緩衝条件下で安定で生物学的に活性なCNTF/受容体複
合体を形成する能力に基づく。本発明の非限定的な１つ
の特定の実施態様では、等モル量（たとえば80mM）の組
換えCNTFとCNTFRを通常の生理的緩衝条件下（100mMトリ
ス−HCl、50mMNaCl、pH8.0）で混合し、安定で生物学的
に活性なCNTF/受容体複合体を形成する。このCNTF/受容
体複合体はゲル濾過を通して精製し、下記に述べるアッ
セイにおいて使用することができる。
本発明はさらに、細胞分化因子の作用物質あるいは拮
抗物質のいずれかとして機能するCNTF/受容体複合体に
関連するハイブリッドあるいは突然変異型タンパク質を
提供する。たとえば、１つの特定の実施態様では、ハイ
ブリッドあるいは突然変異型CNTFRは、CNTFには結合で
きないがシグナル形質導入が可能である。このハイブリ
ッドあるいは突然変異型は、CNTFレベルに関わりなくCN
TF/IL−6/LIF受容体ファミリーの成員である受容体を発
現する細胞を含めて、CNTF/受容体複合体に反応性であ
る細胞の分化、増殖、成長あるいは生存を促進あるいは
増強することができる。また別の非限定的実施態様で
は、突然変異型受容体はCNTFに対する増大した結合親和
性を示すが、シグナル形質導入を有効に誘発することが
できない。そのような突然変異型は、細胞分化への二次
的作用を誘発することなくCNTFに結合し、CNTFを中和す
るのに有用である。
本発明はまた、in vitroまたはin vivo診断法なら
びにCNTF/受容体を含む特定の治療に対する感受性に関
して標的細胞を試験する際に使用するためのアッセイ系
を提供する。
本発明はさらに、CNTF関連の疾患だけでなく、無細胞
CNTF/受容体複合体または関連化合物に対して反応性で
ある何らかの標的細胞に関連した分化および／あるいは
増殖の疾患をも処置するための治療方法を提供する。
本発明はまた、細菌において実質的に精製された生物
学的に活性なCNTFRあるいは関連分子を製造する方法を
提供する。
本発明はまた、CNTFおよびLIFがIL−６形質導入受容
体成分であるgp130およびgp130様の第二受容体成分（LI
Fβと称する）を通してニューロン細胞に作用するこ
と、それと共に、CNTFおよびCNTFRと結合した時にIL−
６に匹敵するシグナル伝達経路を用いてシグナル形質導
入を開始するという発見に基づく。この発見に基づき、
本発明は、（おそらくそれらがgp130およびLIFRβを発
現する故に）通常LIFあるいはIL−６に反応性である細
胞において反応を誘発するためにCNTFおよびCNTFRを利
用することを提供する。
本発明はまた、CNTFを用いてかかる細胞におけるシグ
ナル形質導入を選択的に開始させることができるよう
に、CNTFR（CNTFRα）で細胞を標的する方法を提供す
る。
本発明はさらに、培養した胚性幹細胞の分化を妨げる
ためにLIFの代りにCNTFを使用することを提供する。
4.図面の説明 図1.ヒトCNTFの核酸配列（配列番号１）と推定アミノ
酸配列（配列番号２）。
図2.CNTFRをコードするcDNAの核酸配列（配列番号
３）と推定アミノ酸配列（配列番号４）。
図3.pRPN151の構築に使用されるPCRプライマーのDNA
配列。小文字は、タンパク質配列を変更せずに発現を至
適にするためにDNA配列を改変した位置を示す。セン
ス：（配列番号５），アンチセンス：（配列番号６）。
図4.pRPN151の物理的な制限地図。塩基対（bp）で示
すプラスミドの長さ、いくつかの単一制限部位の位置、
ならびにhCNTFR（点々の棒）とβラクタマーゼ（実線の
棒）遺伝子の物理的位置を示す。
図5.ゲル濾過による活性受容体の分離。（Ａ）280nm
の吸光度によってモニターしたS100−HRカラムの溶出プ
ロフィール。核酸は主要なピークの吸光度に約50％寄与
するが、より小さなピークには10％未満しか寄与しな
い。（Ｂ）分画９−14（20μl/レーン）および16−21
（200μl/レーン）中に溶出するタンパク質をSDS−PAGE
によって分析した。カラムに添加した全タンパク質抽出
物（レーンＥ）も、14、21、31、45、66および90kDのサ
イズマーカ（レーンＭ）に沿って示す。Ｒ−は40kDでの
受容体バンドの位置を示す。
図6.未変性PAGEによる受容体リガンド複合体の形成。
一定量の受容体（１μｇ）を指示量（μｇ）のラットCN
TFと混合し、未変性PAGEによって分析した。CNTFR、CNT
FおおびCNTF/受容体複合体に対応するバンドの位置を示
す。
図7.CNTF、LIFおよびFGFによる処理後のMAH細胞の増
殖。A.MAH細胞を250K/35mm皿の密度で平板培養し、培養
中でCNTF（10ng/ml）あるいはLIF（1ng/ml）によって４
日間処理した。培養期間終了時に、位相の明るい（phas
e−bright）細胞数を計数した。B.MAH細胞を6K/6mmウエ
ルの密度で平板培養し、CNTF（10ng/ml）あるいはLIF
（1ng/ml）で１〜４日間処理し、MTT染料を用いて生存
細胞数を定量した。C.種々の濃度のCNTF、LIFおよびFGF
をMAH細胞に加えた。培養期間は、3H−チミジンの取り
込みアッセイに先立ってCNTFとLIFについては４日間、F
GFについては３日間継続した。平板培養密度は、CNTFと
LIFについては6K/6mmウエル、FGFについては40K/16mmウ
エルであった。
図8.CNTFはニューロンの分化に影響を及ぼす。A.MAH
細胞をCNTF（10ng/ml）、LIF（1ng/ml）あるいはFGF（1
0ng/ml）で48時間処置し、その後CAT活性を測定した。
B.MAH細胞をCNTF（10ng/ml）で24時間処理した。全RNA
を調製し、CNTFRプローブおよびGAPDHプローブを用いた
ノーザン分析にかけた。CNTFRおよびGAPDHについての転
写サイズは2kbであった。
図9.CNTF、LIFおよびFGFに反応したタンパク質の用量
依存的なチロシンリン酸化。種々の濃度（0.1〜100ng/m
l）のCNTF、LIFあるいはFGFによる５分間の処理後、MAH
細胞（Ａ）あるいはEW−１（Ｂ）細胞から全細胞溶解産
物を調製した。実験方法に述べるように、溶解産物を抗
ホスホチロシン抗体で免疫沈降させ、電気泳動にかけ
て、抗ホスホチロシン抗体で免疫ブロットした。（Ｃ）
SK−Ｎ−LO細胞を50ng/mlのCNTFで５分または15分間処
理した後、上述したように抗ホスホチロシン免疫沈降お
よびブロッティング法を実施した。
図10.FGFあるいはNGF処理した細胞と比較したCNTFあ
るいはLIF処理細胞の独自のタンパク質チロシンリン酸
化パターン。A.EW−１細胞を50ng/mlのCNTF、LIFあるい
はFGFで５分間処理した。全細胞溶解産物を抗ホスホチ
ロシン抗体で免疫ブロットした。B.50ng/mlのCNTF、LIF
あるいFGFによる処理後のEW−１細胞から調製した全細
胞溶解産物を抗ホスホチロシン抗体を用いて免疫沈降さ
せた。対照として、ERK特異的抗体を用いてPC12細胞溶
解産物からERK1とERK2を沈降させた。ERK抗体による免
疫ブロッティング法を実施した。C.CNTF（50ng/ml）あ
るいはLIF（50ng/ml）で処理したEW−１細胞とNGF（50n
g/ml）で処理したPC12細胞から全細胞溶解産物を調製し
た。溶解産物を電気泳動にかけ、抗ホスホチロシン抗体
で免疫ブロットした。
図11.MAH細胞においてCNTFおよびLIFに反応したtis11
誘発に対するプロテインチロシンリン酸化変化の経時的
比較。A.MAH細胞を50ng/mlのCNTFあるいはLIFで５〜60
分間処理した。図３で述べたように、全細胞溶解産物を
免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体で免疫ブロットし
た。B.MAH細胞を同様にCNTFあるいはLIFで15〜120分間
処理した。全RNAを調製し、ホルムアルデヒドアガロー
スゲル電気泳動によって分別し、実験方法に述べるよう
にtis11およびｃ−fosDNAプローブにハイブリダイズし
た。C.MAHあるいはEW−１細胞をCNTF（50ng/ml）、LIF
（50ng/ml）あるいはFGFで30分間処理した。全RNAを調
製し、tis11およびｃ−fosの発現を上記のように分析し
た。tis11およびｃ−fosについての転写サイズは各々2.
3kb、2kbであった。
図12.EW−１およびM1細胞におけるCNTF、LIFあるいは
IL−６に反応したチロシンリン酸化変化の比較。EW−１
あるいはM1細胞をCNTF（50ng/ml）、LIF（50ng/ml）あ
るいはmIL−６（100ng/ml）で５分間処理した。上述し
たように全細胞溶解産物を免疫沈降させ、抗ホスホチロ
シン抗体で免疫ブロットした。
図13.CNTFおよびLIFが誘発するプロテインチロシンリ
ン酸化とtis11遺伝子発現へのプロテインキナーゼ阻害
因子の作用。MAH（Ａ）あるいはEW−１（Ｂ）細胞をプ
ロテインキナーゼ阻害因子であるＨ−７（40μg/ml）あ
るいはスタウロスポリン（100ng/ml）で15分間処理し、
その後CNTF（50ng/ml）、LIF（50ng/ml）あるいはmIL−
６（100ng/ml）を加えた。上述したように全細胞溶解産
物を免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体で免疫ブロッ
トした。tis11誘発へのプロテインキナーゼ阻害因子の
作用を調べるため、MAH（Ｃ）あるいはM1（Ｄ）細胞を
プロテインキナーゼ阻害因子Ｈ−７（40μg/ml）で30分
間処置し、その後CNTF（50ng/ml）、LIF（50ng/ml）あ
るいはmIL−６（100ng/ml）を加えた。全RNAを調製し、
tis11プローブを用いてノーザン分析にかけた。
図14.CLIPはCNTFとLIFによって同時調節され（Ａ）、
細胞表面に存在し（Ｂ）、CLIPのひとつ（CLIP2）はgp1
30である。A.CLIP1とCLIP2はCNTFとLIFによって同時調
節される。EW−１細胞を、図に示すようにCNTF（50ng/m
l）あるいはLIF（50ng/ml）のいずれかで５分または60
分間処理した;60分の時点を過ぎた後、追加のCNTF（レ
ーン３および７）あるいはLIF（レーン４および６）を
細胞にさらに５分間にわって加えた。次に全細胞溶解産
物を免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体で免疫ブロッ
トした。B.ビオチン化アッセイはCLIP1とCLIP2が細胞表
面に存在することを明らかにする。EW−１細胞を本明細
書中で述べるように表面ビオチニル化した。図は対照
（Ｃ）あるいはCNTFで刺激した（CNTF）細胞についての
抗ホスホチロシン免疫ブロット法を示す。これらの細胞
をビオチニル化あるいは非ビオチニル化（左側）した
後、ストレプトアビジンアガロース上で未結合（UB）あ
るいは結合（Ｂ）分画に分離した。C.CLIP2はgp130であ
る。図は対照（Ｃ）あるいはCNTF/LIFで刺激したEW−１
細胞からの溶解産物の抗ホスホチロシン免疫ブロット法
を示す。これらの細胞を抗ホスホチロシン抗体（αpTy
r）あるいはgp130特異的抗体（αgp130）で免疫沈降さ
せた。免疫沈降抗体は、図に示すように個々にあるいは
連続的に使用した。
図15.gp130mRNAの遍在分布はCNTFRαmRNAの限られた
ニューロン分布と対照をなす。図示した細胞系から全RN
Aを調製し、ヒトgp130cDNAプローブ（上パネル）あるい
はラットCNTFRcDNAプローブ（下パネル）のいずれかを
用いてノーザン分析にかけた;gp130プローブとげっ歯類
細胞系のハイブリダイゼーションが弱いのは交雑種（cr
oss−species）ハイブリダイゼーションが低いことによ
る。SH−SY5Y、神経芽細胞腫;EW−１、ユーイング肉腫;
SK−Ｎ−LO、神経上皮腫;MAH、交感神経副腎前駆体;M
1、骨髄前駆体;B9、CNTFに反応しないIL−６依存性Ｂ細
胞バイブリドーマ。
図16.組織中のgp130mRNAの遍在分布。図15におけるよ
うに全RNAおよびノーザン分析を実施した。
図17.gp130遮断抗体はCNTF/LIFが誘発するチロシンリ
ン酸化および遺伝子誘導を妨げる。抗体を、EW−１細胞
においてCNTFおよびLIFによって誘発されるチロシンリ
ン酸化を遮断する能力に関して検討した。CNTFあるいは
LIFによって誘発されるCLIP1およびCLIP2のチロシンリ
ン酸化（パネルＡ）、ならびにtis11遺伝子発現（パネ
ルＢ）は抗gp130によって完全に遮断された。
図18.ES細胞へのLIFとCNTFの作用。ES細胞は栄養補給
細胞（feeder cells）の不在下で維持されたが、LIF
（10〜20ng/ml）の存在下では、小さな細胞の未分化で
密なコロニーのままであった。低濃度のLIF（10ng/ml未
満）は、一部の細胞死の発生を伴って、内胚葉様の細胞
と大きな扁平細胞の存在が示すように、２〜７日間にわ
たってES細胞の分化を生じさせた（パネル18A）。5pg/m
l〜10ng/mlCNTFを含むゼラチンプレートで増殖したES細
胞は、分化と一部の細胞死を生じた。10ng/ml以上50ng/
mlCNTFまでの濃度のCNTFは、ES細胞を細胞の小さくて密
なコロニーとして維持した（パネル18B）。LIFあるいは
CNTFのいずれかの不在下で維持されたES細胞は、２〜７
日間にわたって内胚葉様あるいは大きくて扁平であるよ
うに見えた（パネル18C）。
図19.ES細胞におけるCNTFRの発現。CNTFRの発現を示
すES細胞およびラット脳からのRNAのノーザン分析。
図20.ES細胞におけるCNTFおよびLIFによるtis11の誘
導。ES細胞を平板培養し、CNTF（20ng/ml）あるいはLIF
（20ng/ml）のいずれかの存在下で未分化の状態に維持
した。全細胞RNAを調製し、ホルムアルデヒドアガロー
スゲルで電気泳動し、ナイロン膜に移して、32P標識tis
11プローブにハイブリダイズした。ES細胞において、CN
TFとLIFはtis11遺伝子発現の同様の誘導を生じた。
図21.G−CSF、IL−６、CNTFおよびLIF受容体複合体の
図式的モデル。A.図に示したサイトカイン受容体複合体
の既知の成分を描いたモデル。B.CLIP1がLIFRβである
と仮定した、CNTFおよびLIF受容体複合体の修正「統
一」モデル。Ｂの部分に示したモデルでは、CNTFRα
は、機能的LIF受容体複合体が機能的CNTF受容体複合体
に転換するために必要なすべてである。四角で示した因
子；αサブユニットはIL−６およびCNTF受容体複合体の
ために存在することが知られており、従って実線で描い
ている（CNTFRα／膜接合部に隣接する星印はGPI結合を
示す）。一方潜在的LIFRα成分は点線で示している。膜
結合として描かれているが、αサブユニットは同時に可
溶性補因子としても機能する。
図22.130kDaタンパク質およびチロシンキナーゼ活性
はCNTF受容体複合体を用いて同時精製する。EW−１細胞
を図示した因子で刺激し、次に細胞をBrij96界面活性剤
中で溶解し、ａ−LIFRbで免疫沈降させた。左パネルの
サンプルはａ−ホスホチロシンで免疫ブロットし、右側
のサンプルは実験方法の章で述べるようにin vitroキ
ナーゼ活性に関して試験した。
図23.Jak1、Jak2およびTyk2はCNTFファミリーの因子
と反応してチロシンリン酸化される。EW−１（パネルＡ
＆Ｂ）、U266（パネルＣ）あるいはSK−MES細胞（パネ
ルＤ）のいずれかを図に示した因子で刺激し、LIFRβ、
Jak1（J1）、Jak2（J2）あるいはTyk2（T2）に対する抗
血清で免疫沈降させ、その後抗ホスホチロシンで免疫ブ
ロットした。
図24.LIFRβは因子の不在下でJak1およびJak2と結合
する。COS細胞を、エピトープ標識したLIFRβ−myc3（L
IFR）をコードするプラスミド、あるいはあとに三重myc
標識が続く細胞質ドメインの74個のアミノ酸だけをコー
ドするLIFRβの切頭形バージョン（LIFRT74）と共に、J
ak1あるいはJak2をコードするプラスミドで同時トラン
スフェクトした。ａ−mycモノクローナル9E10による免
疫沈降反応後、Jak1（上パネル）あるいはJak2（下パネ
ル）に対する抗血清でサンプルを免疫ブロットした。下
パネルの矢印は、顕著な非特異的バックグラウンドバン
ドよりもゆっくりと移動するJak2バンドを示す。
図25.COSにおけるgp130とJak1あるいはJak2との同時
発現は、gp130のIL−６依存性チロシンリン酸化を促進
する。COS細胞を、Jak1あるいはJak2をコードするプラ
スミド0.5mg、ならびにgp130FLAGをコードするプラスミ
ド10mgで同時トランスフェクトし、図に示すように48時
間後にIL6＋sIL6Rαで刺激した。細胞溶解産物をａ−FL
AGモノクローナル抗体（IBI）で免疫沈降させ、抗ホス
ホチロシンで免疫ブロットした。
5.発明の詳細な説明 本発明は、無細胞CNTF/受容体複合体およびその関連
化合物、ならびに、適宜CNTFRを発現させる細胞の生
存、分化、増殖および／または成長の促進におけるその
利用に関している。制限をするためではなく、開示内容
を明らかにするために、本発明の詳細な説明は以下の細
目に分割される： （ｉ）CNTF/受容体複合体、 （ii）CNTF/受容体複合体の性質、 （iii）CNTF/受容体複合体の利用法。
本発明は、CNTFおよびLIFがIL−６シグナル形質導入
受容体成分gp130を含む共有シグナル伝達経路を介して
ニューロン細胞に対して作用し、CNTFおよびLIFはシグ
ナル形質導入を開始するためには第二のCLIPI/LIFRβ成
分を必要とする、というさらなる知見に基づいている。
さらに本発明は、受容体成分を共有しているこれらのサ
イトカインが共有のシグナル形質導入成分を利用してい
るという知見にも基づいている。これより、本発明の詳
細な説明はさらに以下の細目に分割される： （iv）CNTF、IL−６およびLIF共有シグナル形質導入成
分、 （ｖ）共有でユニークなシグナル形質導入成分の利用。
5.1 CNTF/受容体複合体 本発明は、安定で生物学的に活性な無細胞CNTF/受容
体複合体の形成に関連している。これは部分的には、有
用量のCNTFおよびCNTFRの産生および精製、ならびに、
それらの通常の生理学的条件下での安定で生物学的に活
性な複合体の形成能に基づいている。
たとえば、有用量のCNTFおよびCNTFRは、最初のクロ
ーニングと各々の対応タンパク質をコードする遺伝子の
配列決定により生成され得る。クローニングされた各々
の遺伝子はその後、原核細胞または真核細胞の発現系に
おいて発現できる。当業者が利用できる多数のプロトコ
ールのいずれかを利用してCNTFおよびCNTFRをクローニ
ング、配列決定することができる。例えば、全てが参考
により本明細書に包含される、Sendtnerらにより1990年
８月20日に出願された“Ciliary Neurotropic Facto
r"と標題のつけられた米国特許出願第07/570,651号、国
際出願番号第/PCT/US90/05241号に記載されたように、C
NTFを細菌発現系における発現に先立ってクローニング
と配列決定をすることが可能である。さらに、例えば、
CNTFRは、Davisらによって1991年５月15日に出願された
“The Ciliary Neurotropic Factor"と標題のつけら
れた米国特許出願第07/700,677号、およびDavisらによ
って1991年６月３日に出願された国際出願番号第PCT/US
91/03896号に記載されたように、クローニングと配列決
定をすることが可能である。適切な具体例により、実質
的に図１に示すような配列を持つCNTF、および、実質的
に図２に示すような配列を持つCNTFRが使用できる。
組換えCNTFR遺伝子は様々な方法で発現および精製す
ることが可能である。非限定的な好ましい本発明の具体
例において、CNTFRは以下のように組換えCNTFRを発現さ
せた細菌から作成される。ヒトCNTFRをコードする遺伝
子は、例えばpCP110のような細菌発現ベクター内でサブ
クローニングされる。生じたプラスミドpRPN151は成熟h
uCNTFRコード領域の327個のアミノ酸と、NH2末端に存在
するメチオニン、セリン、スレオニンの３個のアミノ酸
から成っている、ヒトCNTFR（huCNTFR）の組換え成熟形
態をコードする。実施例６に記載したような、コード領
域の開始部位における追加操作によりhuCNTFRの発現は
タンパク質の配列に変更をきたすことなくさらに最適化
される。ついで、この組換えプラスミドは大腸菌のRFJ2
6株のような適切な細菌株内に形質転換され、組換えタ
ンパク質の合成を引き起こすための当業界で公知の培養
条件下で増殖させると、有用量の組換えhuCNTFRが得ら
れる。
この組換えhuCNTFRは、その後、安定で生物学的に活
性なCNTF/受容体複合体を形成することのできる技法に
よって精製され得る。例えば、huCNTFRをRFJ26/pRPN151
細胞から封入体として回収し、その後、8Mのグアナジニ
ウムクロライド中で定量的に抽出し、下記の第７項に記
載したように透析することが可能である。CNTFRをさら
に精製するためには、従来のイオン交換法、疎水的相互
作用クロマトグラフィー、または、逆相クロマトグラフ
ィーなどの手法では活性なCNTFRを単離することが困難
になることがあるため、これらの方法を使用するは好ま
しくないと思われる。むしろ、本発明では、CNTFRをさ
らに精製するためのゲル濾過による方法が提示される。
本発明によれば、低濃度（たとえば＜２％）で発現され
るCNTFR以外のタンパク質もこの方法で精製される。
CNTFおよびCNTFRの精製後、CNTF/受容体複合体が形成
される。例えば、1:1、2:1、3:1などの、安定なCNTF/受
容体複合体を形成するCNTFおよびCNTFRの割合が利用さ
れる。例えば、等モル量（たとえば、80nM）の組換えCN
TFと組換えCNTFRを生理学的緩衝液（たとえば、100mMの
トリス−HCl、50mMのNaCl、pH8.0）中で室温にて混和で
きる。ついでこの混合物をゲル濾過用カラムにいれる
と、下記に記載した様々なアッセイに利用されるCNTF/
受容体複合体に対応するピークが回収される。
本発明により、共有結合をした、または、共有結合を
していないCNTFとCNTFRの複合体が得られる。
本発明はさらに、細胞の分化を促進または拮抗するた
めに使用され得る、複合体または分子に関している。特
に本発明の具体例において、こうした作用を有するCNTF
/受容体複合体は、ハイブリッドまたはキメラ核酸配列
によりコードされる。このハイブリッドまたはキメラ核
酸配列は、CNTFおよびCNTFR双方の機能部分をコードす
る配列の翻訳によって結合させるなどの当業界で公知の
様々な組換えDNA法のいずれかにより構築でき、ハイブ
リッドまたはキメラ核酸配列の発現が、発現プラスミド
内でのハイブリッド遺伝子の配向だけでなく原核細胞ま
たは真核細胞の宿主系と相容する多数のプロモーター成
分のうちのいずれかで制御されるような、原核細胞また
は真核細胞発現プラスミドのいずれかへサブクローニン
グできる。本発明の好ましい具体例において、CNTFおよ
びCNTFRの機能部分をコードする核酸配列は、同一の方
向および同一の調節配列の制御のもとでサブクローニン
グされ、“ジシストリック”構造を生ずる。CNTFとCNTF
R遺伝子の融合結合部に広がる核酸領域は、翻訳に先立
つ初期転写のスプライシングを促進する配列を有する
か、またはこの領域は、宿主細胞において活性なプロテ
アーゼ性により翻訳後のタンパク質分解過程を促進する
ことが当業界で公知のペプチド配列をコードすることに
なる。こうしたハイブリッドまたはキメラ分子の構造
は、CNTF/受容体複合体のふたつの機能成分の等モル量
の発現を促進し、原核細胞または真核細胞の宿主細胞か
らのCNTF/受容体複合体の直接的な精製を可能にするも
のである。本発明は、突然変異体CNTFRをコードする核
酸配列にも関連している。所与のCNTFR遺伝子はin vit
roまたはin vivoにおいて突然変異を起こして、コード
領域の部位特異的変化、付加または欠失を生ずることが
ある。in vitroでの部位特異的突然変異誘発［Hutchin
sonら、J.Biol.Chem.253:6651（1978）］、TABリンカー
の利用（Pharmacia）など、突然変異原性に関する当業
界で公知の技術が使用できる。本発明の様々な非制限的
な具体例において、上述のように調製されたハイブリッ
ドまたは突然変異分子または複合体は、天然のCNTF/受
容体複合体とは異なる様々な性質を有している。たとえ
ば、こうしたハイブリッドまたは突然変異体はCNTFの不
在下（すなわち、CNTF/受容体複合体を形成せずに）
で、シグナル形質導入を促進することができる。
別の例として、ハイブリッドまたは突然変異体はシグ
ナル形質導入を生ずることなくCNTFと結合することが可
能である。ついで、これらのCNTFR遮断突然変異体また
はハイブリッドについてCNTF存在下でのシグナル形質導
入の拮抗剤としての能力を下記のいずれかの測定系にお
いて測定することができる。好ましい具体例において、
CNTFR遮断突然変異体またはハイブリッドは、CNTRに対
する天然のCNTFRの親和力よりも強い親和力で、CNTFと
結合することが可能である。さらに本発明の別の具体例
において、生じた複合体がシグナル形質導入をすること
のできないようにCNTFRに対して結合するCNTF突然変異
体を作成する、ことができる。
5.2 CNTF/受容体複合体の性質 本発明は安定なCNTF/受容体複合体に関するものであ
る。特に、第5.1項および実施例６に記載したような本
発明の具体例において、室温にて生理学的緩衝溶液中に
等モル量のCNTFとCNTFRを添加することによって、生物
学的に活性なCNTF/受容体複合体が形成される。この特
別に具体例のCNTF/受容体複合体は、CNTFまたはCNTFRの
精製分画に比べて、天然のポリアクリルアミドゲル内で
異なる移動度を有する。
CNTF/受容体複合体は、その生物学的活性にしたがっ
て特徴づけることも可能である。CNTF反応性細胞では、
CNTF/受容体複合体の活性はCNTFの活性に対応する。
CNTFは一次ニューロンの生存はもちろん、細胞の分化
も促進する。例えば、CNTFRを発現するCNTFに対する標
的細胞には毛様体神経節、脊髄後根神経節、海馬、およ
び運動ニューロンの細胞などがある。
これらの標的細胞におけるCNTFの生物学的応答は、シ
グナル形質導入経路（たとえば、下記の第９項を参照）
におけるCNTF/受容体複合体が酸化することによって伝
達される。たとえば、CNTFはMAHセルラインの成長抑制
と分化を仲介する。MAHセルラインにCNTFを接触させる
と、３種類の異なるCLIPタンパク質のチロシンのリン酸
化のパターンが急激に生ずる。さらに、これらのCLIP遺
伝子のリン酸化は、特徴的な即時型早期遺伝子、tis11
の導入の直前に生ずる。CNTFに応答したこれらの早期リ
ン酸化現象は、これらのシグナル形質導入経路の存在を
示すものである。
しかし、これらの細胞がここでは“シグナル形質導入
成分”と表現されている第２の成分、すなわち、受容体
分子と相互作用して、たとえばIL6受容体系または白血
病阻止因子（LIF）のβ鎖と関連したgp130などのシグナ
ル形質導入を誘発する第２の成分、を発現するとする
と、本発明の別の具体例において、CNTF/受容体複合体
は、CNTF受容体（たとえば、下記の第８項を参照）を発
現しない標的細胞に対して上述と類似した作用を仲介す
る。これらのシグナル形質導入成分を発現する細胞は、
ここではCNTF/受容体複合体応答性と呼ぶ。CNTF/受容体
複合体に対する標的細胞は、CNTF/受容体複合体の投与
に応答してin vitroにおけるシグナル形質導入アッセ
イによる同定の役にたつもの（たとえば、上記で考察し
たような、表現型分化、即時型早期遺伝子の発現または
CLIPタンパク質のリン酸化を示す標的細胞など）であれ
ば、どのような細胞でも差し支えないし、または、CNTF
/受容体複合体の正常な生理学的作用を模倣または変更
するハイブリッドまたは突然変異体でも差し支えない。
CNTF/受容体複合体、または関連ハイブリッドまたは
突然変異化合物の標的細胞に対する影響は、特定の型の
細胞に特徴的な多数の表現型応答および／または生化学
的応答のいずれかによって検定可能である。標的細胞が
CNTFに対して応答性である場合には、複合体の活性は毛
様体神経節、脊髄後根神経節、および運動ニューロンな
どの生存のようなCNTF関連生化学作用の関数として測定
することができる。
標的細胞がCNTFに対して応答性でないが、CNTF/受容
体複合体応答性である場合には、他の分化マーカーにつ
いて検定することができる。例えば、CNTF/受容体複合
体、またはそのハイブリッドまたは突然変異タンパク質
の、IL−６またはLIF受容体経路と類似した方法での分
化促進能を検討するために、M1セルラインが利用でき
る。未分化のM1細胞は丸くて明相であり基質に接着する
ことがない。分化によって、CNTF/IL−6/LIF受容体を通
じて促進されるように、M1細胞の分化が進み、基質に接
着するようになる。そのため、M1培養物はこの分化表現
型について容易に評点を付けることができる。
MAH細胞についての上述の記述のように、CLIPまたはJ
AKタンパク質のパターン、または即時型早期遺伝子（た
とえば、tis11;下記の第９項を参照）のリン酸化または
活性化の他のパターンにおける変更などのような、細胞
特異性マーカーも利用できる。
M1細胞におけるCNTF/受容体複合体の表現型分化促進
能（たとえば、IL−6/LIF受容体の属するもの）より、
この複合体に応答する他の標的細胞はCNTF/受容体複合
体に対する標的細胞であることが示される。M1セルライ
ンのような骨髄性白血病細胞に加えて、CNTF/受容体に
対する他の潜在的標的細胞、またはそのハイブリッドお
よび突然変異体には、白血病細胞、造血幹細胞、骨髄巨
核芽細胞およびその前駆細胞、DA1細胞、破骨細胞、骨
芽細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎上皮細胞、胚幹細胞、腎
メサンギウム細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞などが含まれる。
CNTF/受容体複合体に対する標的細胞は、CNTF/受容体
複合体の投与に応答してin vitroにおけるシグナル形
質導入アッセイによる同定の役にたつもの（たとえば、
上記で考察したような、表現型分化、即時型早期遺伝子
の発現またはCLIPまたはJAKタンパク質のリン酸化を示
す標的細胞など）であれば、どのような細胞でも差し支
えないし、または、CNTF/受容体複合体の正常な生理学
的作用を模倣または変更するハイブリッドまたは突然変
異体でも差し支えない。
5.2.1 125I−hCNTF直接結合アッセイ 上記で考察したように、本発明の別の具体例は、CNTF
の結合能を変化させるCNTFR突然変異体の単離に関す
る。本発明の好ましい具体例において、pCMX−hCNTFR
（l2）（受託番号はNRRL Ｂ−18789）の突然変異は、D
avisらによって1991年５月15日に出願された“The Cil
iary Neurotropic Factor"と標題のつけられた米国特
許出願第07/700,677号に記載された125I−hCNTF直接結
合アッセイにしたがって誘発される。要約すると、10μ
ｇのhCNTF（10mM NaPO4中560μg/ml、pH7.4）は6ng/μ
ｌ（Sigma）のラクトペルオキシダーゼを用いて20℃で1
5分間反応させると1mCiの125INaによりヨウ素化でき
る。15分後に0.1MのNaI、0.1％BSAおよび0.1％チトクロ
ームＣ、0.3％HOAc、0.05％フェノールレッドおよび0.0
2％NaN3を加えた等容量の緩衝液により反応が停止でき
る。アリコートを採取してTCA沈殿物量が測定できる。
残りは0.05MのNaPO4、0.1MのNaCl、0.5mg/mlの硫酸プロ
タミンおよび1mg/mlのBSAにより平衡化したバイオラッ
ドPD−10バイオゲルカラムに注入できる。分画を採集し
てTCA沈殿物量が測定できる。次に、COS細胞を突然変異
させたプラスミドDNAにトランスフェクションさせる。4
8時間後に培地を除去して、125I−hCNTFを単独で、また
は未標識hCNTFと共に含有する0.25mlの結合緩衝液（10
％FBSおよび0.1％NaN3を含むRPM11640）に換える。125I
−hCNTFと共に室温にて60分間インキュベートする。イ
ンキュベート完了後に、125I−hCNTF溶液を除去して、
細胞を1.0mlの結合緩衝液で３回洗浄し、0.25mlの0.1N
NaOHに溶解する。この溶解液を12×75mmのポリスチレ
ン製試験管に移し、ガンマカウンター中に置く。少なく
とも100倍過剰の未標識hCNTFを添加することによって、
非特異的結合が測定できる。最後に洗浄した後は、平板
をオートラジオグラフにかけることが可能である。
CNTF結合が高値であるか、低値であるか、存在しない
かにかかわらず、その後の分析にはCNTFR突然変異体が
選択できる。分化アッセイでは各々の突然変異体のシグ
ナル形質導入促進能を測定するために、興味深いトラン
スフェクションを行ったセルラインからの上清が利用で
きる。
5.2.2.シグナル形質導入測定法 上記で考察したように、M1細胞アッセイは、CNTF/IL
−6/LIF受容体のシグナル形質導入能を測定するために
有用である。
このアッセイ系は、本発明の具体態様をさらに行うた
め、つまり、CNTFと結合することなくシグナルを形質導
入する突然変異CNTF受容体、およびCNTFと結合するがシ
グナル形質導入を引き起こすことのない突然変異CNTF受
容体を識別するためにも有用である。たとえば、CNTFR
突然変異体が125I−hCNTF直接結合アッセイにおいて、
ほとんどまたはまったくシグナルを生じなかった場合、
この突然変異受容体はM1アッセイにおいて表現型分化促
進能についての評点が付けられることになる。逆に言え
ば、結合の増加を示すCNTFR突然変異体もM1系で検定で
きることになる。突然変異CNTF受容体は、様々な量の未
標識CNTFと混合され、M1アッセイにおいて表現型分化促
進能についての評点が付けられることになる（たとえ
ば、突然変異CNTFRはシグナル形質導入経路に対して拮
抗剤として働く）。
本発明のさらなる具体例において、CNTF/IL−6/LIFの
様々な標的細胞がM1細胞について記述したものと同様の
型のアッセイを用いて識別され得る。
あるいは、下記の第９項に記載したように、標的細胞
は、CLIPまたはJAKタンパク質のリン酸化もしくは即時
型早期遺伝子誘発などのような、シグナル形質導入を示
すアッセイ系において識別され得る。たとえば、推定標
的細胞の培養物を有効濃度のCNTF/受容体複合体に曝露
し、CLIPまたはJAKタンパク質のリン酸化、tis11即時型
早期遺伝子発現の誘発などについて評価すれば、その細
胞が実際にCNTF/受容体複合体の標的であることを示す
シグナル形質導入の証拠が検討できる。
5.3.CNTF/受容体複合体の利用 本発明によれば、CNTF/受容体複合体、またはそのハ
イブリッドまたは突然変異体は、上述の5.2項に記載し
たように、CNTF/IL−6/LIF受容体の受容体を発現する細
胞、または特徴によって証明されるような適切なシグナ
ル形質導入成分を発現する細胞（たとえば、CLIPまたは
JAKタンパク質のリン酸化および／または即時型早期遺
伝子の誘発）など、CNTF/受容体複合体に対して反応性
の細胞のin vitroまたはin vivoにおける分化、増殖
または生存を促進するために利用することができる。突
然変異体またはハイブリッドは細胞の分化または生存を
拮抗することもある。
5.3.1.in vitroにおける使用 本発明は、潜在的な治療または診断でのCNTF/受容体
複合体の使用を目的とした新しい標的細胞を識別するた
めに利用することができる。例えば、形態変化（たとえ
ば、丸から偏平細胞への進行、細胞の伸展過程、浮遊状
態から付着細胞への変化）または生化学的マーカー（た
とえば、細胞特異的マーカー、即時型早期遺伝子tis11
のような細胞遺伝子の活性化、または、CLIPまたはJAK
タンパク質のようなリン酸化パターンの変化）または細
胞の成長や増殖を識別するアッセイを、こうした新しい
標的細胞を識別するために利用することができる。
逆に、CNTF/受容体複合体に応答する細胞は、ハイブ
リッドまたは突然変異化合物に関連するCNTF/受容体複
合体を識別するために利用することができる。たとえ
ば、こうした細胞を様々な濃度のハイブリッドまたは突
然変異化合物に関連するCNTF/受容体複合体に曝露し
て、細胞増殖、細胞形態、CLIPまたはJAKタンパク質の
リン酸化、即時型早期遺伝子の誘発などの生理学的作用
の有無および強さを測定することができる。ハイブリッ
ドまたは突然変異体がCNTF/受容体複合体作用の作動剤
として働く場合には、生理学的変化はCNTF/受容体複合
体によって生ずる作用と同様でなければならない。一
方、ハイブリッドまたは突然変異体がCNTF/受容体複合
体作用の拮抗剤として働く場合には、CNTF/受容体複合
体作用に伴う生理学的変化は消失または除去されなけれ
ばならない。
形態学的または生化学的パターンの変化を通じてCNTF/
受容体複合体に対して応答性であると識別された標的細
胞は、診断用アッセイにおける利用が可能であると思わ
れる。こうしたアッセイには、患者から生検により採取
した細胞の、CNTF/受容体複合体、またはその受容体の
中でシグナル形質導入を促進または拮抗するハイブリッ
ドまたは突然変異体を用いる特定の治療プロトコールに
対する感受性についての試験が含まれる。
本発明は、CNTFまたはCNTFR発現のパターンにおける
変化と、それによるCNTF/受容体複合体の形成を伴う神
経系の疾患および障害の診断に利用できる。たとえば、
患者から採取した細胞におけるCNTF/受容体複合体に対
する異常応答は、この患者における神経系の障害の診断
を裏付けることができる。
こうした細胞生検は、特に、副交感神経ニューロン、
コリン作動性ニューロン、脊髄ニューロン、神経芽細
胞、および副腎髄質細胞など、CNTFに対して応答すると
知られているニューロンの損傷および破壊を生ずる状態
など、CNTF発現の変化を伴う状態、障害、疾患を検出
し、予知し、診断し、監視するために利用することがで
きる。例えば、こうした疾患および状態には中枢神経系
外傷、梗塞、感染症、変質性神経疾患、悪性腫瘍、また
は、制限するものではないが、アルツハイマー病、パー
キンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症
などの術後変化などがある。
さらなる具体例において、本発明は上述のようなバイ
オアッセイを通じて識別された標的細胞について有用性
がある。こうした標的細胞はin vitroの系において、
例えば、特に以下の細胞についての疾患または障害にお
いて、悪性腫瘍または新生物などの分化障害または疾患
を検出し、予知し、診断し、監視するために利用できる
と思われる：白血病細胞、造血幹細胞、骨髄巨核芽細胞
およびその前駆細胞、DA1細胞、破骨細胞、骨芽細胞、
肝細胞、脂肪細胞、腎上皮細胞、胚幹細胞、腎メサンギ
ウム細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞など。
5.3.2.in vivoにおける使用 本発明は、CNTFに対して非応答性の細胞と同様にCNTF
に対して応答性の細胞を含む、CNTF/受容体複合体に反
応性の細胞の障害を治療するために利用できる。本発明
の好ましい具体例において、CNTF/IL−6/LIFのひとつを
発現する細胞の傷害は、これらの方法によって治療され
る。例えば、これらの傷害の例としては、以下の細胞が
関与するものが含まれる：白血病細胞、造血幹細胞、骨
髄巨核芽細胞およびその前駆細胞、DA1細胞、破骨細
胞、骨芽細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎上皮細胞、胚幹細
胞、腎メサンギウム細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞など。
そのため、本発明は、CNTFに関連した神経学的または
分化の障害または疾患に罹患した患者を有効量のCNTF/
受容体複合体、またはそのハイブリッドまたは突然変異
体による治療する方法を提供するものである。CNTF/受
容体複合体またはその適切なハイブリッドまたは突然変
異体は、Sendtnerらによって国際出願第PCT/US90/05241
号に記載されたCNTFについての記述、および、Davisら
によって1991年５月15日に出願された“The Ciliary
Neurological Receptor"と標題のつけられた米国特許
出願れ第07/700,677号におけるCNTFRについての記述の
ような障害または疾患を治療するために利用することが
できる。CNTF/受容体複合体、CNTFと結合することなく
シグナル形質導入を引き起こすCNTFR突然変異体、また
はCNTF/受容体複合体拮抗剤（たとえば、シグナル形質
導入を引き起こさずにCNFTと高い結合親和性を有するCN
TFR突然変異体）の投与を含む治療方法は、本発明の対
象範囲内である。
本発明は、適当な薬剤学的キャリア体内にCNTF/受容
体複合体、またはそのハイブリッドまたは突然変異体を
含む薬剤組成物を提供する。
CNTF/受容体複合体、そのハイブリッドまたは突然変
異体は、全身または局所に投与することが可能である。
例えば、静脈内投与、くも膜下投与、動脈内投与、鼻腔
内投与、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、または局所
注射もしくは外科的インプラントなど、当業界での知ら
れている適切な投与様式を利用することができる。徐放
性剤処方物としても提供される。
5.3.2.1.有効成分の形成 安定なCNTF/受容体複合体、またはそのハイブリッド
または突然変異体を含むことのできる有効成分は、例え
ば、注射（たとえば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
神経内、神経周囲、髄腔内、脳室内、くも膜下など）、
上皮または粘膜層を通じての吸収（たとえば、口腔粘
膜、直腸粘膜および腸粘膜など）；または、細胞内また
は組織インプラントなどの徐放性インプラントなどによ
る、適切な経路でのin vivoへの投与のために、適切な
薬剤学的キャリア体内で処方されなければならない。
投与様式によっては、有効成分は、生理食塩水などの
液状キャリアにいれた形で処方されたり、リポゾーム、
マイクロカプセル、ポリマーまたはロウをベースとした
制御放出型製剤に組み込まれたり、錠剤、ピルまたはカ
プセル剤の形で処方されることがある。
処方で利用される有効成分の濃度は、必要とされる有
効量および利用される投与様式に依存する。利用される
用量は、有効成分の循環血漿中濃度が有効な水準に達す
るように、十分な量でなければならない。たとえば、CN
TF/受容体複合体が有効成分である場合、循環血清中濃
度が約50ピコモル濃度から100ナノモル濃度の範囲で使
用される。有効用量は、in vitroまたは動物モデルで
の試験系による用量反応曲線から外挿することができ
る。
別の具体例では、複数のCNTF/受容体複合体が、直接
または、ビーズのような別の成分を通じて互いに結合し
あった形で、CNTF/受容体複合体製剤が供給されてい
る。
5.4 CNTF、IL−６およびLIFは、シグナル形質導入成分
を共有する。
MAHセルラインにおいてCNTFおよびLIFの両者によって
活性化されたシグナル形質導入経路を、その他の神経セ
ルラインと同様に、造血セルラインにおいてLIFおよびI
L−６で活性化される経路と比較した。参考文献として
本明細書に含まれる1991年３月28日に出願された米国特
許出願第676、847号には、CNTF、CNTFレセプター、およ
びシグナルトランスデューサーgp130との間における相
互作用の可能性を記述した。今回記述した試験では、CN
TFのシグナル化経路がgp130に関与していることを示す
所見について確認し、さらにLIFもまたIL−６のシグナ
ルトランスデューサーgp130に関与するシグナル伝達経
路を利用していることを明らかにした。今回の試験では
また、CNTFおよびLIFが第２のgp130様レセプター成分を
共有しているとの知見も示されている。この知見は、LI
Fレセプター複合物を、機能的なCNTF反応性レセプター
複合物に変更するために必要なものが、CNTFR（CNTFR
α）そのものであることを示唆している。
IL−６の場合、IL−６とそのレセプターとの複合物が
gp130に結合し、何らかの方法で形質導入過程を活性化
する［Taga et al.,Cell 58:573−581（1989）;Hibi
et al.,Cell 63:1149−1157（1990）］。gp130が機
能性シグナルを形質導入する能力は、チロシンへのリン
酸化を行う能力に相関している［Murakami et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11349−11353（1991）］。
本研究において、我々は、IL−６の遠い親戚であるCNTF
およびLIFに対する反応性を比較するセルラインを同定
した。今回試験したCNTF反応性の神経セルラインは、LI
Fに対して識別不能な表現型と生化学的反応を明らかに
呈した。これとは対照的に、LIF反応性の造血セルライ
ンは、CNTFに反応しなかった。神経細胞におけるCNTFと
LIFの反応は、３つのCLIPのチロシンのリン酸化を開始
させ、CLIPのうち少なくとも二つ（CLIP1およびCLIP2
の）は細胞表面タンパク質であり、安定した免疫沈降性
を呈する複合体を形成させるべく相互作用させる能力を
有する。
CLIPリン酸化に先立ち、キナーゼ阻害剤に関する研究
を基にした研究は、続いて起こる特徴的な遺伝子誘導を
行うために必要となる。LIFおよびCNTFの用量反応は類
似しており、リン酸化と遺伝子誘導に関するタイムコー
スおよび阻害剤のプロフィールも互いに類似しており、
いずれかの因子を使用した前処理を実施することによっ
て、もう一方の因子に対するダウン制御反応が起こると
予測される。CNTFとLIFに誘導されたシグナル伝達の事
象が、本質的には神経細胞内において互いに識別不能で
あるばかりでなく、造血細胞においてLIFにより誘導さ
れたシグナル伝達の事象と同一である。CLIP1のリン酸
化がCNTFおよびLIF反応に特異的な性質であることを除
けば、上記の事象は、造血細胞においてIL−６に誘導さ
れた事象と類似している。本発明者らは、CLIPの一つ
（CLIP2）がIL−６ シグナルトランスデューサーであ
るgp130であるという証拠を提示することによって、CNT
F、LIFおよびIL−６のシグナル伝達経路が互いに類似し
ていることの根拠を提供している。
本発明者らの所見は、様々なCNTFおよびLIFレセプタ
ー成分と、gp130/CLIP2との相互作用に関する多くの質
問を提示している。CNTFはIL6R関連CNTFRに直接結合す
ることができる［Davis et al.,Science 253:59−63
（1991）］。このCNTFRは、本発明者らのデータとIL−
６系への類似性（図21A）を基に考えると、gp130と相互
に作用するであろう。しかし、CNTFレセプター複合物も
また、CLIP1と呼ばれる別の細胞表面タンパク質を含ん
でおり、このタンパク質はCNTFに反応してリン酸化され
るチロシンであり、gp130と直接反応することができる
（図21A）。LIFは、最近クローニングされた分子量約19
0kDのgp130関連レセプター成分（本明細書におけるLIF
R）と結合することが知られ、LIF−レセプターβ（本発
明におけるLIFR）の存在が提唱されている［Gearing e
t al.,Cell 66:9−10（1991）］。本発明者らのデー
タは、LIFレセプター複合体もまたCLIP1およびgp130と
結合することを示している（図21A）。結局、IL−6/CNT
F/LIF関連GSFレセプターに対するレセプター複合物は、
gp130関連Ｇ−CSFレセプターのホモダイマーであること
が明らかとなっている［Fukunaga et al.,EMBO J.1
0:2855−2865（1991）］（図21A）。
図21Aに示したレセプター複合物は、構造的に関連す
るリガンドへの結合を仲介するが、これらは、記述され
ているように、異なっているという点が満足されていな
い。より「均一な」レセプターモデルを提唱することも
可能であるが、LIFRβと大きさがほぼ等しいCLIP1は、
事実上はLIFRβである（図21B）。よって、CNTFおよびL
IFレセプター複合物の各々が異なる大きさの２つのgp13
0様成分であるLIFRβ/CLIP1とgp130自体を利用する。本
発明者らの共沈殿データに基づけば、これら二つのβ成
分が直接に相互作用し、チロシン上で誘導的にリン酸化
されやすくなる。かかるレセプターの構造を補足する
と、最近の架橋データ［Godard et al.,J.Biol.Chem.
267（印刷中）］から、LIFが、LIFRβ/CLIP1とgp130に
対応するサイズからみて、明らかに異なる二つの明瞭な
タンパク質に結合できることが分かっている。LIFとCNT
Fレセプターの複合体において二つのβ成分が関与して
いることは、Ｇ−CSFレセプターの構造（図21B）に類似
していることを暗示しており、IL−６レセプターがgp13
0のホモダイマーを含む可能性を提示している。実際、
レセプターチロシンキナーゼとある種のサイトカインレ
セプターに関して提唱されているように、β−サブユニ
ットのダイマー化および／または活性化がシグナル伝達
の過程を活性化させている［Aaronson et al.,Scienc
e 254:1146−1153（1991）、De Vos et al.,Scienc
e 255:306−312（1992）］。
図21Bに示したモデルにおいて、βレセプター成分は
β成分に作用して、諸因子の結合を修飾し、共有されて
いる形質導入機構にリガンド特異的性を与える。架橋に
関するデータ［Godard et al.,J.Biol.Chem.267（印
刷中）］は、Ｇ−CSFの場合と同様に、LIFにとってはか
かる成分は不要であることを提唱していると考えられ
る。よって、機能性LIFレセプターを機能性CNTFレセプ
ターに転換するには、CNTFR成分のみで充分であると考
えられる。後者の可能性は、CNTFRの発現が神経系、副
腎、座骨神経および骨格筋に制限されていること［Davi
s et al.,Science 253:59−63（1991）］を考慮に入
れると、CNTF反応性を呈する神経細胞のすべてがLIFに
対しても同一の反応性を呈する理由が説明でき［前記の
文献及びRao et al.,Dev.Biol.139:65−74（1990）を
参照］、よって、神経系の外部においてLIF反応性細胞
は、CNTFに反応しない。
興味深いことに、IL−６またはCNTFの成分は、その形
質導入成分と相互作用するために膜へ結合する必要はな
い［TAGA et al.,Cell 58:573−581（1989）］。よ
って、レセプターの可溶化成分と共にこれらの成分を含
む複合体は、（適正なレセプターを発現しないので）、
因子自体と反応する能力のない細胞にとっては、ヘテロ
ダイマー形成因子として作用するが、適正な形質導入成
分を発現する。かかるヘテロダイマー複合体がin vivo
において可溶化因子として実際に作用する可能性は、レ
セプター成分と、通常存在するヘテロダイマー因子であ
る天然キラー細胞刺激因子の二つのサブユニットのうち
の一つとが相同であることによって裏付けられる［Gear
ing and Cosman,Cell 66:9−10（1991）］。さらに
は、細胞表面とCNTFRとを結ぶグリコシル−フォスファ
チジルイノシトール結合が、独特であって、さらには開
裂しやすいことが、このレセプター成分の放出を制御す
る役割を指す［Davis et al.,Science 253:59−63
（1991）］。
前述のレセプターモデルにはさらに実験的に修正を加
える必要があるが、これらモデルは、明らかに意味のあ
る先例を有している。Ｇタンパク質がカップリングした
レセプターの過剰は、同様に、シグナル形質導入を行う
小数の造血細胞性Ｇタンパク質と反応し、様々なシグナ
ル列（神経伝達物質、ポリペプチドホルモン、臭気物
質）を比較的控えめな数のシグナル伝達経路上に収束さ
せる［Gilman,Ann.Rev.Biochem.56:615−647（198
7）］。gp130にカップリングしているレセプター系に対
してより直接的な意味をもつのは、IL−３、IL−５、お
よびGM−CSFである。重複している活性と、IL−3,IL−
５およびGM−CSFにより誘導される類似のチロシンリン
酸化反応では、これらの因子が明瞭なレセプター因子を
使用するが、成分を共有するという所見へ達する（Nico
la and Metcalf,Cell 67:1−４（1991）、Miyajima
et al.Annu.Rev.Immunol（1992）（印刷中）を参照
のこと）。このレセプター成分は、再度、主に因子への
結合に関与するが、広範な細胞質ドメインを欠いている
ため、シグナル形質導入能力をもたない。共有されたサ
ブユニットは、高い親和性を有する結合にとって必要と
なり、チロシンのリン酸化に関わるシグナル形質導入現
象の開始にあずかっている。gp130（および多分LIFR/CL
IP1）と共に、このサブユニット自体が、チロシンのリ
ン酸化を受けるが、本来のキナーゼ活性を有することは
ない。これらのサブユニットがチロシンリン酸化を受け
るメカニズムについてはほとんど知られていないが、マ
ルチコンポーネントIL−２レセプターもまた、高い親和
性を有する結合とシグナル形質導入に関わる一つのサブ
ユニット（IL−2R）を利用しており、この鎖はsrc様の
チロシンキナーゼ（lck）によってチロシンリン酸化を
受け、これらと物理的に結合する（Miyajima et al.,
印刷中、を検討のこと）。興味深いことに、CLIPリン酸
化とIL−２誘導性のlckのリン酸化は、キナーゼ阻害剤
に対して同様の感受性を示す［Hatakeyama et al.,Sc
ience 252:1523−1528（1991）］。すなわち、二つの
リン酸化が、スタウロスポリンに感受性を示してもＨ−
７には示さないことから、類似のチロシンキナーゼが関
与している。CLIP3は、かかるsrc−関連キナーゼの候補
になると考えられる。
いくつかの重要な点では、CNTFが、その遠縁関係のサ
イトカインと比較した場合、極めて独特な様相を呈する
ことがわかっている。ここで最も重要なことは、CNTFが
極めて制限されたレセプター成分分布を有しているため
に、CNTFへ反応するのは原則的に神経系の細胞になる
［Davis et al.,Science 253:59−63（1991）］。こ
の制限は、CNTFに関連したサイトカインの活性が広いこ
とと比べると対照的である。CNTFの実例からは、付加的
に関連するサイトカインが活性を呈する範囲が、きわめ
て制限される可能性を示唆している。MAHセルラインを
同定することにより、FGFとNGF等のように無関係のレセ
プター系を使う因子と同様に、CNTFおよびLIFへ生理的
に関係する反応を示す神経細胞前駆体を提供する。MAH
セルラインを利用することにより、明らかなシグナル伝
達経路を利用して様々な因子がどのように神経前駆体細
胞の成長と分化に影響するのかが理解できるに違いな
い。MAH細胞と造血セルラインのサイトカインに対する
反応性を対比させると、たがいにきわめて類似した開始
シグナルの認知と翻訳を変更する明確な細胞関係のメカ
ニズムをも洞察できるに相違ない。
5.5 共通あるいはユニークなのレセプター成分の利用 本明細書で説明するように、CNTFとLIFは、レセプタ
ー複合体／シグナル形質導入経路を共有している。よっ
て、CNTF単独か、またはCNTFR（CNTFα）との組み合わ
せが、通常はLIFに反応を示す細胞内において、反応開
始の手段として有用であると考えられる。細胞は、自分
のもっているレセプター成分に依存して、CNTF単独また
はCNTFとCNTFRとの組み合わせのいずれかに反応する。
細胞がgp130、LIFRβおよびCNTFα（ES細胞の場合に生
じる）を有するならば、CNTF単独でLIFに対して同一の
影響を及ぼすであろう。細胞がgp130とLIFRβのみを有
する場合は、CNTFとCNTFRが組み合わされて、LIFの影響
を模倣するであろう。
5.5.1 胎児幹細胞の分化を妨げるためのCNTFの利用 最近、本発明者らは、CNTFがLIFに代わってES細胞の
分化を妨げることを検討した。胎児幹（ES）細胞である
前移植段階でのマウス胎児から単離した分化全能細胞を
培養し、in vitroで操作して、再び宿主の胎児中へ形
質導入すると、その細胞が正常に発達し、生殖細胞を含
む細胞連関（cell lineages）に寄与することができる
ようになる。よって、ES細胞は、マウスに特異的な突然
変異を質導入するための理想的なベクター系を提供でき
る。
分化全能性を呈するES細胞を経代培養するには、線維
芽細胞の培養層（例えばSTO細胞）または可溶化因子で
ある白血病阻害因子（LIF）の存在のいずれかが必要と
なる（Smith,et al.Nature 336:699−690（1988）、W
illiams,et al,Nature 3365,684−687（1988））。培
養層の利用は極めて高い信頼度を有するが、培養層の調
製には時間がかかる。STO細胞の増殖を停止させるに
は、マイトマイシンＣを添加したのち２−３時間の処理
を要し、PBSで数回洗ってから、STO細胞をゼラチンでコ
ートした平板に播くことができる。この平板は翌日利用
することができるが、プレーティング後一週間経過した
時点で良好となるに過ぎない（Robertson,Nature 323,
445−448（1987））。培養層の問題を回避するには、Wi
lliams et al.,Nature（1988）supraおよびPease an
d Williams,Exp.Cell Res.190,209−211.,（1990）
が、LIFが培地に含まれるならば生殖細胞キメラを形成
する能力を保持する培養細胞を欠いた状態でES細胞が保
持されることを知見した。
CNTFの存在下あるが培養細胞およびLIFの不在下でで
培養されるES細胞は、小さな細胞が密集したコロニーが
有する幹細胞の形態の特徴を保持している。本報は、ES
細胞の分化を妨げるものとしてのLIF以外の因子を初め
て取りあげている。互いに類似した反応を示す２つの因
子の存在によって、一層、ES細胞が分化から迂回するメ
カニズムを研究する機会を提供している。
5.5.2 CNTF/CNTFRを使ったLIF応答細胞の活性化 本明細書に記述するように、CNTFとCNTFRまたは可溶
性CNTFR（sCNTFR）を組み合わせると、LIFに反応するあ
らゆる細胞に結合して、それを活性化させる。しかし、
LIF反応性細胞は、きわめて遍在しており、CNTFとその
可溶性レセプターを細胞の活性化に利用しても、特異性
を増強する限りでは、予見できる利点を得られるとは期
待できない。さらに、CNTFRがGPIのアンカーによって細
胞表面へ付着するのであれば、可溶性レセプター/CNTF
複合体の効率はかなり低くなる。
CNTF/CNTFRの特異性およびその有効性を増大させるた
めに、本発明では、CNTFRと標的細胞表面とを複合化さ
せることにより、細胞への標的を予期し、続いてCNTFを
使用し、かかる細胞を活性化する代替的具体例として
は、CNTF/CNTFR複合体をかかる方法で修飾し、特定の標
的細胞に対して特異的にしている。
細胞表面に対するCNTFR等のタンパク質の標的化の方
法は当業界で公知である。一般に、かかるタンパク質
は、標的細胞とCNTFRにも結合する能力のある分子すな
わち連結分子を使って細胞表面に付着する。好ましく
は、かかる連結分子によって標的細胞上で天然に存在す
るレセプターへ自由に結合できる。たとえば、末端部に
ガラクトースを有する連結分子がCNTFRへ付着すること
によって、肝におけるアシアログリコプロテインレセプ
ターへのかかる複合体の付着が可能となる。他の例とし
ては、Fc部分を含む連結分子がCNTFRへ付着することに
より、Fcレセプターを有する標的細胞へCNTFRが付着で
きるようになる例がある。
または、連結分子としては、抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体が効果的である。たとえば、特別な細胞表
面レセプターを認識する抗体は、CNTFRに連結すること
ができる。または、エピトープはCNTFRへ結合すること
ができ、この場合、かかるエピトープはCNTFR−エピト
ープ複合体と標的細胞上のエピトープの両者に結合する
連結抗体によって認識される。標的細胞に対する抗体が
未知のエピトープに結合する場合は、無作為なペプチド
発現ライブラリーに作動することによってこのエピトー
プが認識されうる［たとえば、PNAS 89:1865（1992）
を参照のこと］。
CNTFRが標的細胞の表面に付着する場合は、この細胞
がCNTFの付加によって活性化される。または、連結分子
（標的細胞の表面に付着する能力のある分子）に付着す
るCNTFRは、CNTFと組み合わせることができる。このよ
うな場合は、CNTF/CNTFR/連結分子が活性化剤となる。
5.5.3 CNTFR拮抗剤の同定 IL−６、LIFおよびCNTFの共有しているシグナル形質
導入経路に関する本明細書での認識は、CNTFに結合し、
LIFRβとgp130と相互に作用して複合体を形成するが、
シグナルを形質導入でえない可溶性CNTFRアナログの認
識は、LIFまたはIL−６による活性化の効果的な阻害剤
として機能することになる。CNTFの突然変異体もまた、
これらの活性を表示すると考えられる。
特殊な具体例においては、HepG2細胞は、フィブリノ
ーゲンを含む様々な遺伝子の転写においてアップレギュ
レーションを行う際に関与する「急性期反応」において
LIFおよびIL−６とに反応するが、この細胞はCNTF作動
薬または拮抗薬のアッセイ系を提供するために使用され
る。ChATから構成されるレポーター構造物と、反応性の
遺伝子の上流配列（フィブリノーゲンプロモーター）
が、ChAT活性をアップレギュレートすることにより、IL
−６による機能的シグナル伝達を正確にレポートする。
細胞内に隠れているか、または細胞表面の酵素（アルカ
リフォスファターゼ等の）に結合しているとして報告さ
れている構造物は、レポーターによるLIFまたはIL−６
の活性化を遮断する能力のためにCNTF−sCNTFRの突然変
異体をスクリーニングするために利用することができ
る。この突然変異体がHepG−２細胞へ形質導入され、96
穴プレートにおいてスクリーニングされる。
または、CNTFRで形質転換されたHepG−２細胞は、CNT
F活性因子および／または阻害因子をスクリーニングす
るために価値あるアッセイ系を提供すると考えられる。
5.5.4アッセイ系 本発明では、CNTF活性を検出および／または測定する
ために使用するアッセイ系およびアッセイ方法を提供す
るか、あるいはCNTFまたはCNTFレセプター類のその他の
サイトカインのいずれかへの作用薬または拮抗薬として
作用する薬物を同定するために使用される。この活性
は、CNTFまたはその他関連サイトカイン、あるいは今ま
でに同定されていない、レセプター成分を利用するかま
たはCNTFレセプター類に共通のシグナル形質導入経路を
利用するようなその他の因子の生物活性であると解釈さ
れる。CNTFの生物活性は、Sendtner et al.らによっ
て1990年９月14日に出願された国際出願第PCT/U.S.90/0
5421号において記述されている。IL−６の生物活性は、
Kishimoto et al.Science 258:593（1992）に記述さ
れている。OSMの生物活性は、Rose and Bruce,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,88:8641−8645（1991）、およびGrov
e,et al.,J.Biol.Chem.266:18194−18199（1991）、Li
u,et al.,J.Biol.Chem.267:16783−16766（1992）にお
いて記述され、LIFの生物活性は、Chang and Gough,F
ocus 14:6−９（1991）、およびEscary,et al.Nature
363:361−363（1993）に記述されている。さらに、CN
TFレセプターファミリーと、かかる活性に対して作動薬
または拮抗薬となる薬物は、共に被験薬として言及され
ている。
従って、本発明は、被験薬の活性に関する検出法また
は測定法を提供する。かかる方法は、それぞれ、少なく
とも、Jak−１、Jak−２、およびTyk2あるいはCLIPのよ
うなその他のシグナル形質導入成分から選択されたシグ
ナル形質導入成分とレセプターのβ−成分を発現する細
胞と関与し、CNTFレセプター類の一員と反応してリン酸
化されるべく測定される。
本明細書で説明されているβレセプター成分と、シグ
ナル形質導入成分を発現する細胞は、天然に、または遺
伝子工学的に発現するよう仕向けられる。たとえば、Ja
k1をコードする核酸配列は、12.1節の下に記述されてい
るが、形質導入、トランスフェクション、マイクロイン
ジェクションまたはエレクトロポレーションにより、あ
るいはトランスジェニック動物を介して当業界で公知の
方法を使用して細胞内へ導入される。たとえば、12.1.2
の下に記述されているCOS細胞の形質導入を参照するこ
と。
本発明によって、細胞を被験薬へ曝露し、β成分また
はシグナル形質導入成分のいずれかにおけるチロシンリ
ン酸化を、被験薬の入っていない同一の成分に関するチ
ロシンリン酸化と比較する。
本発明におけるその他の具体例では、前述の細胞が被
験薬と接触した結果生じたチロシンリン酸化を、CNTFレ
セプター群に同一の細胞を曝露して得られたチロシンリ
ン酸化と比較している。かかるアッセイにおいては、細
胞が細胞外レセプター（α−成分）を発現させるか、ま
たは可溶性レセプター成分の存在下で被験薬を細胞に曝
露させる。よって、たとえば、cNTFの作動薬または拮抗
薬を同定するべく設計されたアッセイ系においては、そ
の細胞がα−成分、CNTFRα、β−成分gp130、LIFRβお
よびJak1等のシグナル形質導入成分を発現することにな
る。細胞は被験薬に曝露され、β成分またはシグナル形
質導入成分のチロシンリン酸化のいずれかが、CNTFの存
在下で生じたリン酸化パターンと比較される。または、
被験薬へ曝露された結果生じたチロシンリン酸化を、被
験薬を含まない条件下のチロシンリン酸化と比較する。
あるいは、たとえば、IL−６の関与しているアッセイ系
は、β成分gp130と、Jak1、Jak2またはTyk2等のシグナ
ル形質導入タンパク質を発現する細胞を、可溶性IL−６
レセプターと関連する被験薬に曝露させる（12.2.4節の
下を参照のこと）。
本発明におけるその他の具体例としては、αレセプタ
ー成分を含まないものがある。かかるアッセイ系では、
細胞表面レセプター成分に結合しないシグナル形質導入
を開始させるか、または遮断する能力のある小さな分子
を認識するのに有効である。
本発明におけるその他の具体例としては、特異的レセ
プターのβ成分を発現し、二つ以上のシグナル形質導入
成分を発現する細胞が、形質形質導入誘発リガンドが存
在しない場合であってもβ成分のチロシンリン酸化を呈
すると考えられる。かかる細胞は、被験薬がシグナル形
質導入経路におけるこのステップを阻害する能力がある
かを、細胞に被験薬を接触させてチロシンリン酸化への
被験薬の影響を測定することによって測定するのに有用
である。
6.実施例：大腸菌におけるヒトCNTF受容体の生成 1.材料と方法 1.pCP110の構成 親プラスミド発現ベクター、pCP110は、Masiakowski
らによりJ.Neurochem.57:1003−1012（1991）に報告さ
れている。
2.huCNTFR1発現ベクターの構成 プラスミドpRPN151は、pCP110の特定SallとEagl制限
部位間のDNAを、図３に示したDNAプライマーの使用によ
りプラスミドpCMX−hCNTFR（12）から複写したPCRフラ
グメントと代えることにより生じた。ヒトCNTFRは、成
熟huCNTFR配列の327のアミノ酸とNH2末端配列Met−Ser
−Thrの３つの付加アミノ酸から成る。３つの付加アミ
ノ酸は、希望のアミノ酸位置で翻訳開始を合図するた
め、および続く遺伝子工学操作を簡略化するために含ま
れていた。同時に、DNA配列が、タンパク質配列の修正
なしで発現を最適化するためにコーディング領域の最初
の部分で修正された。これは、センスPCRプライマー内
に希望の変化を組み入れることにより達成される（図
３）。次に、プラスミドpRPN151を大腸菌株RFJ26内にト
ランスフェクトした。RFJ26/pRPN151細胞の適当な誘導
条件下で、huCNTFRは総蛋白の10−20％を表すレベルに
達した。
3.huCNTFRの精製 組換えラットおよびヒトCNTF（国際出願番号.PCT/U.
S.90/05241,Sendtnerらにより1990年９月14日に出願さ
れた）に関して述べられている様に、RFJ26/pRPN151細
胞中で合成された受容体の大部分は、封入体に局在し、
この封入体から受容体を8M塩化グアニジン中に定量的に
抽出し、透析により可溶性形状で回収した。
活性な正しく折りたたまれた受容体の回収は、正しく
折りたたまれCntfr分子がボイドボリューム（void vol
ume）の凝集蛋白から真のサイズで溶出するように、ゲ
ル濾過により達成された。
6.2.結果 その様なカラムから溶出したタンパク質の280nmでの
吸光度による分析および還元SDS−PAGEゲル上での電気
泳動により、受容体の大部分は明らかに凝集形状でボイ
ドボリュー」（純度30−40％）で溶出したが、固有の分
子量位置（40kD）で、はっきりした鋭いピーク（純度80
−90％）において溶出した受容体もあることが明らかに
なった。この鋭いピークの受容体は、再生条件により、
開始材中受容体の10−50％を示した（図５）。
天然ゲルにおける溶出特性の分析により、ボイドピー
ク中の受容体タンパク質は凝集タンパク質に関して予想
される様にゲルに入り込まなかったが、40kDピーク中の
受容体は通常のコンホメーションを持つ分子集団に関し
て予想されるように鋭いピークとして移動した。
7.実施例:CNTF/受容体複合体の形成 第6.1.3項に記載した様に回収された40kDピークは、
精製ラットCNTFによる混合実験において使用した。。
7.1.材料と方法 Goldenbergによる記載〔Creighton編集の「Protein
Structure」に記載したゲル電気泳動法によるタンパク
質コンホメーションの分析；オックスフォードのIRL出
版局（1989年）〕に従って、一定量の受容体をラットCN
TF量を増加させながら混合し、それををpH7.4の天然ゲ
ル系で流した。
さらに、精製受容体とラットCNTFを、室温で生理的緩
衝液（100mM Tris−HCl、50mM NaCl、pH8.0）中で混
合し、Superdex−75カラム（Pharmacia）にロードし
た。受容体−CNTF混合物に相当する吸光度ピークを回収
し、その試料の一部を上記に記載された様にゲル濾過に
供するまで、５℃で48時間保存した。
7.2.結果 ボイドピークからの受容体をラットCNTFと混合して、
天然ゲルにおいて分析した時、受容体は多少のCNTFと一
緒にウェルに残っていた。これに対して、40kDピークか
らの受容体をラットCNTFと混合すると、２つのタンパク
質がゲルの新たな位置に単一バンドとして移動した（図
６）。ゲルの移動性の変化は、CNTFとCNTF受容体濃度が
ほぼ等モル濃度の時に完璧と思われる。これらの結果
は、hucntfrがCNTFと固く結合することを示唆する。
その時、上記と同じゲル濾過カラム上の混合試料の一
部の分析により、主な吸光度ピークに溶出したタンパク
質は全て受容体−CNTF複合体に相当し、個々のタンパク
質成分に相当するピークは確認されないことが示され
る。対照として、さらに混合試料の第二部分を、0.1％
トリフルオロ酢酸−アセトニトリル中でC8カートリッジ
（Applied Biosystems）を使用して逆相クロマトグラ
フィーにより分析した。予想通りに、強酸−有機溶媒混
合物において他の受容体を使用して以前に観察された様
に〔Cunninghamら、Science、254、821−825（199
1）〕、受容体−CNTF複合体は個々の２つの成分に分離
し、その組成が確認される。
これらの結果から、これらの実験条件下、すなわち80
nMの受容体濃度およびCNTF濃度、またほぼ生理的なイオ
ン強度、pHおよび温度条件下で、組換えCNTF受容体はCN
TFと安定な複合体を形成することが示された。
8.実施例:CNTF/受容体複合体は骨髄性白血病細胞の分化
（differentiation）を促進する 8.1.材料と方法 8.1.1.細胞培養条件 M1細胞、骨髄性白血病誘導細胞系を、ダルベッコの修
正イーグル培地と10％ウマ血清中で培養した。それらの
細胞を、50000細胞／ウェルの密度となるように、NUNC2
4ウェルプレートに植えこんだ。各ウェルにサイトキン
類および／またはCNTF受容体を加え、５日後に、分化し
た表現型に関して培養にスコアーをつけた。可溶性CNTF
受容体を大腸菌によって生成され、均質化するまで精製
した。
8.1.2.表現型によるスコアリング 未分化M1細胞は丸くて、相が輝いていおり、基質に付
着しない。これらのスコアーは（−）とする。細胞が分
化するにつれ、それらの細胞は基質に付着し、相の輝き
が低下し、恐らく不規則形から紡錘形の組織形態とな
り、そして突起をのばす。これらの特徴を持つ程度によ
り、培養に対し、（＋）から（＋＋＋＋）のスコアーを
つける。最適条件下で、IL−６処理は（＋＋）のスコア
ーを提供し、LIFは（＋＋＋）のスコアーを提供する。
極端に高い濃度のCNTFとCNTFRはこれらの特徴の発現が
最強であり、（＋＋＋＋）のスコアーを付けられた。
8.2.結果 20ng/mlの濃度で、IL−６（＋＋）およびLIF（＋＋
＋）に対する細胞の最大反応が観察された。表１に、種
々組合せのラットCNTFと可溶性ヒト受容体により処理し
たMI細胞の反応を示す。表２に、ヒトCNTFとヒト受容体
の種々組合せに対する細胞の反応を示す。明らかに、CN
TFとCNTF受容体の組合せは、反応を引き起こす場合に単
独よりも有効である。受容体単独では、試験したどの濃
度でも分化は誘導されなかったが、CNTF単独により非常
に高濃度では反応が誘導される様であった。最後に、幾
つかの実験に関して、天然の（native）受容体がCOS細
胞において生成し、ホスホリパーゼＣ処理により細胞表
面から切断した。これらの実験において、可溶性受容体
の濃度は測定しなかった。この受容体と200ng/mlのラッ
トCNTFの結合によっても、分化は引き起こされたが、CN
TF単独、CNTFR単独の何れもこの効果を示さなかった。
9.実施例:CNTFは、CLIPタンパク質のリン酸化と即時型
遺伝子の発現を媒介する場合においてLIFと類似してい
る。
9.1.材料および方法 9.1.1.試薬類 本試験において使用する組換えラットCNTFの調製およ
び精製については、すでに記載されている〔Masiakowsk
iら、J.Neurochem.57:1003−1012（1991）〕。ネズミIL
−６（mIL−６）はUBI（Upstate Biotech.,Inc.NY）か
ら購入し、組換えヒトLIFはAMGEN Biologicals（CA）
から購入した。ウシ脳から精製したbFGFはＲ＆Ｄ Syst
emsから購入し、NGFはマウス顎下腺から精製した。使用
したプロテインキナーゼ阻害剤としては、Ｈ−７〔１−
（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペライ
ンジヒドロクロリド（Seikagaku Kogyo Co.）および
スタウロスポリン（staurosporine）（Kamiya Biomed.
Co.）であった。アガロースビーズに結合した抗ホスホ
チロシンモノクローナル抗体はUpstate Biotech.,Inc.
（NY）からのものであった。
9.1.2.細胞の構成 MAH細胞は、以前に記載された様に〔Birrenら、Neuro
n4:189−201（1990）〕、培養中で維持した。手短に言
うと、細胞を6K/6mmウェルまたは40K/16mmウェルの密度
で、予めポリ−Ｄ−リシン（100μg/ml）とラミニン（1
0μg/ml）でコーティングした皿上においた。使用した
培地は10％FBSおよびデキサメサゾン（５μＭ）を補充
した修正L15−CO2培地であった。IARC−EW−１（ユーイ
ング（Ewing）肉腫細胞）とSK−Ｎ−LO（神経上皮腫細
胞）は2mM Ｌ−グルタミンと100単位/mlのペニシリン
およびストレプトマイシンを補充した10％ウシ胎仔血清
によりRPMI培地中で培養した。PC12細胞は６％ウマ血
清、６％子牛血清、2mM−Ｌグルタミンおよび100単位/m
lのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダ
ルベッコの修正イーグル培地中で培養した。
9.1.3.MTTアッセイ,3H−チミジン組み込みアッセイおよ
びChATアッセイ MTT染料の添加（最終濃度0.5mg/ml）の前に、種々の
処理期間で、MAH細胞を因子で処理した。インキュベー
ションを８時間続け、生細胞により吸収された染料製品
を可溶性にするためにDMSOを添加した。Flow Titretek
multiscan装置を使用して、570−650nmでの光学的密
度を定量した。3H−チミジン組み込みアッセイに関して
は、細胞を種々因子により、様々な処理期間で処理し、
3H−チミジン（NEN−NET−027E）を最終濃度１μCi/ml
となるように添加し、37℃で４時間インキュベートし
た。次に、細胞をPBSで３回洗浄し、NaOH（0.5N）によ
り室温で２時間溶解させ、そして3H−DNAを数えた。ChA
Tは標準的な技術を使用して実施した。簡単に言うと、
種々の因子で細胞を処理し、氷冷PBSで洗浄し、20mMト
リス−HCl（pH8.6）と0.1％トリトンＸ−100を含有する
ChATハーベストバッファーを加えて氷上で15分間インキ
ュベートした。細胞抽出物を、11mM塩化コリン、0.2mM1
4C−アセチルCoA、0.14mMフィゾスチグミン、300mM Na
Cl、50mM Na2PO4、20mM EDTAを含有する反応混合物と
一緒に37℃で60分間インキュベートした。この混合物の
アリコートをアセトニトリル／テラフェニルボロン（5m
g/ml）を含有するシンチレーション液と混合し、カウン
トした。
9.1.4.RNAの分離および分析 細胞を、100mm皿に５×106細胞の密度でのせた。総RN
Aを、前に記載された様に〔Chomczynskiら、Anal.Bioch
em.162:156−159（1987）〕、チオシアン酸グアニジニ
ウム法により調製した。RNA 10μｇを、ホルムアルデ
ヒドアガロースゲル上で電気泳動して分離し、ナイロン
膜（MSI）に移し、無作為オリゴプライミング（oligo−
priming）（Stratagene）で標識した32P−プローブにハ
イブリダイズさせた。使用したプローブとしては、tis1
1（2.3kb EcoR1フラグメント）、ｃ−fos（1kb Pstフ
ラグメント）、ラットCNTF受容体（rCNTFR、0.4kb Pst
フラグメント），およびGAPDH（1.25kb Pstフラグメン
ト）であった。
9.1.5.タンパク質分離、免疫沈降およびイムノブロッテ
ィング（immunoblotting） タンパク質チロシンリン酸化の検出のため、約１−２
×106の細胞を血清なしの特定培地中で60分間飢餓状態
にし、種々因子で５分間処理し、そして以前に記載され
た様に〔Glassら、Cell 66:405−413（1991）〕、蛋白
溶解物をRIPAバッファー（プロテイナーゼおよびホスフ
ァターゼ阻害剤を補充した）で調製した。総タンパク質
試料を調製するために、タンパク質付加染料をRIPA溶解
物上清に直接加えて、90℃で３分間沸騰した。その代わ
りの方法として、RIPA溶解物からの上清をアガロース結
合抗ホスホチロシン抗体（agarose conjugated anti
−phosphotyrosine antibodies）（4G10）100μｌと一
緒に４℃で一晩沈降させて、RIPAバッファーで３回洗浄
した。１×タンパク質付加染料200μｌでアガロースビ
ーズからタンパク質を溶出し、３分間沸騰した。総タン
パク質試料または免疫沈降物50μｌを10％SDS−ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動し、以前に記載された様
に［Glassら、Cell 66:405−413］、抗ホスホチロシン
抗体でイムノブロットし、125I標識ヤギ抗マウスポリク
ローナル抗体（4.91μCi/μg/mlバッファー（DuPout）
の１μｌ）で特定タンパク質を検出した。PC12細胞にお
けるERKタンパク質の免疫沈降に関しては、細胞溶解物
をERK−特異性抗体（Zymed.Inc.）で、次にアガロース
に結合したヤギ抗マウスIgG抗体で免疫沈降させた。沈
降物を上記のように電気泳動し、同じERK抗体によりイ
ムノブロットした。
9.1.6.細胞表面ビオチン化（biotinylation）化アッセ
イ CLIPリン酸化を誘導するためにLIFまたはCNTFと５分
間インキュベーとした後に、細胞を1mMオルトバナダー
ト（PBSV）補充PBS5mlで洗浄してから、膜−不浸透性試
薬、NHS−SS−ビオチン（３−スルホスクシンイミド
３−〔２−（ジオチンアミド）エチル〕ジチオ〕プロピ
オナート;Pierce）1mg/mlを含有するPBSV中で、氷上10
分間インキュベートした。次に、細胞のプレートをオル
トバナダートを含有するトリス緩衝食塩水で洗浄して、
上記のようにRIPAバッファーで溶解した。溶解物を、上
記のように固定化抗ホスホチロシン抗体で沈降させてか
ら、１％SDSを含有する50mMトリスpH8.2中で５分間沸騰
させることにより、このビーズから結合リンタンパク質
を取り除いた。20Lストレプタビジン−アガロース（Pie
rce）と１時間インキュベートすることにより、この溶
液からビオチン化タンパク質を沈降させた。非ビオチン
化タンパク質を含有する上清を、試料バッファー追加後
に、SDS−PAGEにかけた。ビオチン化タンパク質を含有
するビーズを結合バッファー中で１回洗浄してから、２
倍量の10％β−メルカプトエタノール含有SDS PAGE試
料バッファー中で５分間沸騰させることによりビーズか
ら結合ビオチン化タンパク質を溶出させた。これらの試
料に対して、上記の様に、抗ホスホチロシンイムノブロ
ッティングを行った。
9.2.結果 9.2.1.CNTFおよびLIFはMAH細胞の増殖阻止と分化を媒介
する。
本実施例において使用したMAH細胞系は、交感副腎前
駆体をｖ−myc癌遺伝子により不滅化することにより誘
導された〔Birrenら、Neuron 4:189−201（1990）〕。
MAH細胞をCNTFにより処理することにより、これらの細
胞の培養により通常生じる細胞数増加が劇的に遮断され
た。LIFは、成熟交感神経ニューロンに対してCNTFの効
果と類似した効果を示すが、このLIFによっても、４日
間にわたり本質的に一定に維持したCNTFまたはLIF処理
培養中で通常生じるMAH細胞数の増加が遮断されたが、
一方対照培養は指数関数的速度で増加し続けた（図7
B）。CNTFおよびLIFの効果は非常に類似した用量依存性
を示し、EC50値は約50pg/ml（または2pM）（図7C）であ
った。この用量依存性は毛様体ニューロンに対するCNTF
の生存効果に関して観察されたものと類似している〔Ma
siakowskiら、J.Neurochem 57:1003−1012（199
1）〕。以前に示された様に〔Birrenら、Neuron 4:189
−201（1990）〕、CNTFまたはLIFの何れとも異なり、塩
基性の線維芽細胞成長因子（FGF）は、これらの細胞に
対して有効な分裂促進剤として働く（図7C、差し込み
図）。
CNTFまたはLIFの何れも、MAH細胞において、ニューラ
イトの拡張あるいはその他の形態学的変化を引き起こさ
なかった。しかし、細胞周期の分析により、CNTF処理MA
H細胞は、細胞周期のG1期で阻止されることが示され、
増殖状態と細胞分化間の変遷を誘導する多くの因子が暗
示された。CNTFは、交感神経前駆細胞のコリン作動性分
化を誘導し、CNTFおよびLIFは何れも成熟交感神経ニュ
ーロンのコリン作動性分化を誘導することが示されてい
る。CNTFおよびLIFがMAH細胞に対して分化作用を示すと
いう可能性を追求するため、我々は、これらのリガンド
に対する反応におけるコリンアセチルトランスフェラー
ゼ（ChAT）活性の誘導に関して、アッセイした。図8Aに
示した様に、CNTFまたはLIFによりMAH細胞を処理するこ
とにより、約２倍のChAT活性増加が生じたが、bFGFは効
果を示さなかった。さらに、MAH細胞をCNTFにより24時
間処理することにより、NGFでPC12細胞分化を刺激した
時に、低親和性NGF受容体mRNAが増加した。
同時に、上記のデータにより、CNTFは、交感副腎前駆
細胞に対して増殖停止／分化因子として作用することが
示唆される。これらの作用は、FGFの作用とはまったく
異なると思われる。FGFは、MAH細胞に対して分裂促進剤
として作用する他に、これらの細胞に関するニューライ
トの拡張を誘導し、ニューロンの分化を惹起する（しか
し、コリン作動性分化を惹起しない）。すなわちFGF−
誘導分化はNGF依存性細胞を生み出す可能性がある。こ
のように、多数の因子がニューロン前駆細胞の分化に正
常に影響を及ぼし得る可能性がある。MAH細胞は、ニュ
ーロン分化の種々側面の媒介における種々因子の役割を
詳細に分析すのための非常に有用なモデル系であると思
われる。
9.2.2.CNTFおよびLIFは細胞タンパク質の識別不可能な
チロシンリン酸化パターンを速やかに誘導する サイトカイン類は内因性チロシンキナーゼ活性を含有
する受容体を利用しないが、チロシンリン酸化は種々の
異なるサイトカイン類により速やかに誘導される。CNTF
が反応細胞においてチロシンリン酸化を誘導するかどう
かを決定するために、またこれらのリン酸化をそれと遠
縁の構造を有する関連物により誘導されるリン酸化と比
較するために、我々は先ず神経上皮腫およびユーイング
肉腫のみならびMAH細胞におけるCNTFおよびLIF反応を検
討した。図９に示した様に、CNTFおよびLIGは何れも、M
AH細胞、ユーイング肉腫（EW−１）および神経上皮腫
（SK−Ｎ−LO）において３つのタンパク質（CNTF−およ
びLIF−可誘導性リンタンパク質に関してp200CLIP1、p1
60CLIP2、およびp75CLIP3と示した）のチロシンリン酸
化を速やかに誘導した。誘導されたリン酸化パターン
は、何れの因子に関しても検討した種々細胞系において
識別不可能であった。このように、CNTFに対して異なる
表現型の反応（すなわち、細胞成長に関して）を持つCN
TF受容体陽性細胞系は、CNTFに対する反応において識別
不可能なリン酸化パターンを示した。観察されたチロシ
ンリン酸化反応は用量依存性で、CNTFおよびLIFの何れ
に関しても、10ng/mlで最大の反応が誘導された。
CLIPのリン酸化がCNTFおよびLIF反応の特異的特徴で
あるかどうかを決定するために、我々はCNTFとLIFのリ
ン酸化パターンを、FGFおよびNGFのパターンと比較し
た。MAH細胞およびEW−１細胞はいずれも、FGFに反応す
るが、何れの細胞系においてもFGFに対する反応におい
てCLIP類はリン酸化されない（図９）。同様に、NGF−
反応性褐色芽細胞腫細胞系、PC12におけるNGFに対する
反応において、CLIP類はリン酸化されなかった（図10
C）。
細胞外シグナル制御キナーゼすなわちERKsと呼ばれる
セリン／トレオニンプロテインキナーゼ族が、最近確認
され、特徴づけが行われ、分子的にクローン化された
〔Boultonら、Cell 65:663−675（1991）〕。MAPまた
はMBPキナーゼとしても知られるERKsの活性化は、チロ
シンリン酸化を必要とし〔Boultonら、Cell 65:663−6
75（1991）〕、受容体チロシンキナーゼ類のそれらの同
族リガンドへの結合により速やかに生じる（たとえば、
NGFに関しては図10Cを参照せよ）。ERKsは、受容体チロ
シンキナーゼ類を利用しない種々セットの分裂促進剤お
よび分化誘発薬に対する反応においても活性化される。
我々は、EW−１細胞におけるCNTF、LIFおよびFGFに対す
る反応におけるERKリン酸化を検討することを選択し
た。FGFとは対照的に、CNTFあるいはLIFは、ERK2として
識別され得る40kDタンパク質（図10A）の速やかなチロ
シンリン酸化を誘導しなかった（図10B）。
我々の発見により、p200CLIP1、p160CLIP2、およびp7
5CLIP3のチロシンリン酸化の誘導は、CNTFおよびLIFに
より活性化されるシグナル伝達経路の特徴であり、その
経路に比較的特異的であることが示される。p160CLIP2
にサイズが類似しているタンパク質は、IL−６およびLI
Fの両方に反応してチロシン上でリン酸化される〔Nakaj
imaおよびWall、Mol.Cell.Biol.11:1409−1418（199
1）:Lordら、Mol.Cell.Biol.11:4371−4379（199
1）〕。これらの誘導タンパク質間の考えられ得る関係
に関しては、以下で取り扱うこととする。CNTFおよびLI
F受容体により媒介される反応と異なり、チロシンキナ
ーゼ受容体を活性化する反応、たとえばFGFおよびNGFに
より誘導される反応などはCLIPリン酸化をもたらさな
い。逆に、チロシンキナーゼ受容体の刺激により、CNTF
あるいはLIFの何れによっても速やかにリン酸化されな
いERKsの速やかな活性化が生じる。
9.2.3.CLIPsの速やかで一過性のリン酸化は特徴的な即
時型反応（immediate−early response）遺伝子TIS11
の誘導に先行する。
リガンド受容体相互作用により惹起されるシグナル形
質導入カスケードの誘導は、多くの場合、チロシンリン
酸化の活性化を続行してから、次に、即時型反応遺伝子
を活性化する。p160の速やかで一過性のチロシンリン酸
化が即時型遺伝子発現のLIFおよびIL−６による活性化
に先行することは以前に報告されている〔Nakajimaおよ
びWall、Mol.Cell.Biol.11:1409−1418（1991）、Lord
ら、Mol.Cell.Biol.11:4371−4379（1991）〕。図11に
おいて、我々は、CLIPsのCNTF−およびLIF−誘導チロシ
ンリン酸化の時間的経過と即時型遺伝子発現の活性化と
を比較した。我々は、特に、IL−６媒介反応の特徴であ
ると思われる１つの即時型反応遺伝子tis11の発現、お
よびIL−６反応に特異的であるとは考えられないもう１
つの即時型反応遺伝子ｃ−fosの発現を検討した。MAH細
胞におけるCNTFおよびLIFの両方による３つのCLIPのチ
ロシンリン酸化の誘導は迅速で、５分以内に生じ、30分
までに有意に低下した（図11）。両因子に関するリン酸
化の速度論はEW−１細胞においては類似していた。
MAH細胞において、CNTFおよびLIFは何れも、CLIPリン
酸化の誘導に続いて、tis11遺伝子発現を誘導した。45
分で最大活性化が生じ、120分までに対照レベルに戻っ
た（図11B）。tis11に関して類似した遺伝子活性化速度
論がEW−１細胞において観察された。ｃ−fos発現の誘
導は、CNTFあるいはLIFの何れによっても、MAH細胞にお
いて観察されなかった（図11B）。しかし、bFGFは、CNT
FおよびLIFとは異なり、MAH細胞においてtis11遺伝子誘
導の不在下において、ｃ−fos遺伝子発現を誘導した
（図11C）。CNTFおよびLIFは、EW−１細胞においてtis1
1とｃ−fosの両方を誘導した（図11C）。
本発明者らの結果から、その次にtis11遺伝子発現を
伴った３つのCLIPの迅速なリン酸化は、ニューロン細胞
系におけるCNTFおよびLIF反応の特徴であることが示唆
される。
160kDリンタンパク質（CLIP2）およびtis11の両方の
関与に加えて、これらの事象のタイミングは、ニューロ
ン細胞においてCNTFおよびLIFにより利用される形質導
入経路と、造血細胞においてIL−６およびLIFにより活
性化される経路との間の類似性を示唆する。このチロシ
ンリン酸化事象の直接的比較により、顕著な類似性と違
いが示される。LIFは、M1骨髄前駆細胞系において、CLI
P1、CLIP2およびCLIP3にサイズが等しいタンパク質のチ
ロシンリン酸化を誘導するが、IL−６はこれらの蛋白質
のうちCLIP2（恐らくp160）およびCLIP3に相当する２つ
のタンパク質のチロシンリン酸化のみを誘導する。しか
し、CNTFはM1細胞において検出可能なチロシンリン酸化
を誘導しない（図12）。
特定のリン酸化事象は、異なるプロテインキナーゼ阻
害剤を使用して区別することができる。我々は、CNTF−
およびLIF−誘導リン酸化が同じであるという証拠をさ
らに提供するため、またtis11活性化をもたらすキナー
ゼカスケードがCNTF、LIFおよびIL−６に関して類似し
ているかどうかを決定するために、プロテインキナーゼ
阻害剤スタウロスポリンとＨ−７を使用した。Ｈ−７
は、IL−６によるtis11遺伝子誘導に必要な下流部での
キナーゼ（downstream kinase）を特異的に遮断し、初
期のチロシンリン酸化事象に影響を及ぼさないため、使
用した〔NakajimaおよびWall、Mol.Cell.Biol.11:1409
−1481（1991）:Lordら、Mol.Cell.Biol.11:4371−4379
（1991）〕。図13に示した様に、MAH細胞、EW−１細胞
のいずれでも、CNTF−およびLIF−誘導チロシンリン酸
化事象は何れも、スタウロスポリンにより遮断される
が、Ｈ−７により遮断されない。しかし、Ｈ−７は、MA
H細胞におけるCNTFおよびLIFによるtis11遺伝子誘導
（図13C）、あるいはM1細胞におけるIL−６およびLIFに
よるtis11遺伝子誘導（図13D）を同様に遮断した。リン
酸化データから予想されるように、スタウロスポリンも
tis11遺伝子誘導を遮断した。
このように、プロテインキナーゼ阻害剤の使用と共
に、リン酸化事象の直接比較により、ニューロン細胞系
においてCNTFおよびLIFにより活性化されるシグナル伝
達経路は造血細胞系においてLIFにより使用される経路
に相当することが示される。さらに、この経路は、造血
細胞におけるIL−６活性化経路と区別できるが、その新
奇特徴の多くを共有する。
このように、tis11遺伝子誘導は、これらの遠縁関係
のサイトカイン類の幾つかに対する反応の特徴であると
思われ、したがって、これらの異なるサイトカイン類に
よる誘導の機構はプロテインキナーゼ阻害剤に対して類
似した感受性を発揮する。
M1細胞は、CNTF受容体を発現せず、CNTFに反応しなか
ったが、一方、試験されたMAH、ユーイング肉腫および
神経上皮腫細胞系はIL−６に反応しなかった。CNTF、LI
FあるいはIL−６に対する反応性を区別する細胞系が見
出される得るという発見は、これらの因子の２つが同一
受容体を使用しないことを示唆する。
9.2.4.CNTFまたはLIFによる前処理に起因したCLIP1およ
びCLIP2のダウンレギュレーションはCNTFまたはLIF追加
により逆転できない。
CNTFおよびLIFがシグナル形質導入成分を共有する場
合に予想される様に、CNTFあるいはLIFによる前処理に
よるCLIP1およびCLIP2のリン酸化のダウンレギュレーシ
ョンは、引き続いてその他の因子を追加することにより
克服できなかった（図14A）。さらに、これらの因子の
亜飽和濃度は、MAH細胞成長阻害に対して追加効果（add
itive effect）を示したが、飽和濃度はもはや相加効
果を示さなかった。
9.2.5.細胞表面におけるCLIPsの発現 CLIPsが細胞表面上で発現されたかどうかを決定する
ために、我々は、特異的に細胞表面タンパク質のビオチ
ン化を生み出すアッセイ〔Stahlら、Biochemistry 29:
5405−5412（1990）〕を使用した。このアッセイによ
り、CLIP1とCLIP2がビオチン化され得る細胞外ドメイン
を実際に発現したことが示された（図14B）。CLIP1の表
面位置も、そのみかけのサイズがペプチド−Ｎ−グリコ
シダーゼＦ処理時に減少したという発見と調和した。
10.実施例:CLIP2の特徴づけ 10.1.CLIP2はgp130と一致する CNTFとLIFの両方に反応するヒト細胞系と協力して、
ヒトgp130に特異的なモノクローナル抗体（AM64）〔Hib
iら、Cell 63:1149−1157（1990）〕を使用して、IL−
６、CNTFおよびLIFがgp130を共用する可能性を検討し
た。この抗体はどのgp130関連タンパク質も結合させな
かったし、齧歯動物種からのgp130も結合させなかっ
た。gp130の免疫沈降により、gp130はEW−１細胞におい
てCNTFまたはLIFの何れかに反応して強力にチロシンリ
ン酸化されることが示唆され、このリン酸化されたgp13
0はCLIP2と一緒に同時移動（co−migrate）することが
示された（図14Cにおいて３および７レーンを２および
６レーンと比較）。さらに、抗−gp130抗体は、CNTF/LI
F誘導EW−１細胞抽出物からCLIP2を完全に枯渇させるた
めに使用できた（図14Cにおいて、４および８レーンを
２および６レーンと比較）。これらのデータから、我々
は、CLIP2が実際gp130であると推測し、したがって、gp
130はCNTFおよびLIFの両方に反応してチロシンリン酸化
されると推測する。興味深いことに、CLIP1は、AM64抗
体を使用した時に、gp130と部分的に共同沈降し、この
２つの分子は複合体Ｋ（complex）で見出される可能性
が示唆される。あまり厳しくない細胞溶解状態（たとえ
ば、ジギトニンを使用している）でも、CNTF処理に反応
してgp130と一緒に共同沈降するCLIP1の量を増加させる
ことができた。
10.2.抗−gp130抗体はCLIPsのチロシンリン酸化およびt
is11誘導を選択的に遮断した EW−１細胞を、抗−gp130抗体反応混液（２μg/ml）
の存在下あるいは不在下、特定培地で１時間飢餓状態に
した。この細胞を、それぞれチロシンリン酸化アッセイ
前とRNA分析前に、種々因子で５分間または45分間処理
した。
肝癌細胞系におけるIL−６反応を阻害することが分か
っている抗−gp130抗体を、EW−１細胞においてCNTFお
よびLIFにより誘導されるチロシンリン酸化を遮断する
能力に関して検討した。データにより、CNTFまたはLIF
により誘導されるCLIP1およびCLIP2のチロシンリン酸化
（図17A）ならびにtis11遺伝子発現（図17B）は何れ
も、抗−gp130抗体により完全に遮断された。他方、無
関係のリガンド、EGFにより誘導されるチロシンリン酸
化は影響されなかった。
10.3.gp130は遍在的に発現するが、CNTFR発現は制限さ
れる。
gp130の転写物はIL−6Rに関する転写物よりも非常に
広範に分布していたという所見に基づいて、以前に、gp
130は、IL−６以外の因子に関してトランスデューサー
として機能するかもしれないと考えられていた〔Hibi
ら、Cell 63:1149−1157（1990）〕。この考え、およ
びgp130はCNTFおよびLIFシグナリング系により共有され
るという我々の発見と調和して、我々は、gp130転写物
はIL−６に反応する（しかし、CNTFに反応しない）両造
血系（注：図15、M1およびB9細胞系）、ならびにCNTFお
よびLIFに反応する（しかし、IL−６に反応しない）成
人脳組織（図16）およびニューロン系（注：図15、MA
H、EW−１、SK−Ｎ−LOおよびSH−SY5Y細胞系）におい
て、発現していることを見出している。これとは対照的
に、CNTFR mRNAは、制限された分布を示し、この実験
では、CNTFに反応する脳およびニューロン系でのみ発現
している（図15）。
11.実施例:ES細胞のCNTFに対する反応 11.1 LIFまたはCNTFとのES細胞培養 本試験で使用された129/Svl/Ev XY ES細胞系（Eliz
abeth Robertsonによる寄贈）は、黒色アグーチ（BB
AA）マウスから誘導した（Robertsonら、Nature 323:4
45−448（1986）。典型的には、ES細胞はSTO細胞（マイ
トマイシンC,Sigma Chemical Co.,により増殖が停止
される）の支持細胞層上で増殖させ、10％FBS（Lot番号
11111020、Hycline）、0.1mMβ−メルカプトエタノール
（Sigma Chemical Co.）、Ｌ−グルタミン 292mg/m
l、ペニシリンＧ 100U/ml、および硫酸ストレプトマイ
シン 100mcg/ml（Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよび
硫酸ストレプトマイシンの100×ストック、Irvine Sci
entific）を補充したダルベッコの修正イーグル培地（D
MEM、Irvine Scientific）で維持した。予防段階とし
て、分化を防止するために、LIF（組換えヒトLIF、Amge
n Biologicals）を10ng/ml濃度で加えた。以前に記載
されたように、ES細胞を、３−４日毎に、新たに作成し
た支持細胞プレート上で継代した（Robertsonら、Natur
e 323:445−448（1986））。
CNTFのES細胞に対する効果を決定するために、STO細
胞およびLIFをES細胞培養物から取り除いた。ES細胞
を、LIF（20ng/ml）存在下で、ゼラチンコーティングプ
レート（ブタ皮膚からの0.1％ゼラチン、Sigma Chemic
al Co.）上で２回継代させ、２回目の継代後にSTO細胞
はほとんど残存していなかった。ES細胞をLIF（20ng/m
l）存在下で１日間増殖させ、洗浄してLIFを取り除き、
次にCNTFまたはLIFの存在下あるいは因子なしで７日間
培養した。
11.2 RNA分析 総RNAをES細胞から調製し、記載されたチオシアン酸
グアニジン法（Chomczynskiら、Anal.Biochem.162:156
−159（1987）により、STO支持細胞不在下で増殖させ、
LIF（20ng/ml）存在下で維持した。RNA 10mcgを、ホル
ムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン
膜（MSI）に移して、無作為オリゴプライミング（Strat
agene）により標識した32P標識CNTF受容体cDNAプローブ
（800bp、Pst1フラグメント）にハイブリダイズした。
11.3 ES細胞へのCNTF結合 組換えラットCNTFを、Bolton−Hunter法（Bolton−Hu
nter、Biochem J.133:529−539（1973）を使用してヨ
ウ素化した。ES細胞を、2.5×106細胞/35mmウェルの密
度で、ゼラチンプレートにプレートし、結合前にLIF 2
0ng/mlの存在下で４日間増殖させた。ウェルから培地を
取り除き、細胞をアッセイバッファー〔PBS、pH7.4、BS
A（1mg/ml）、0.1mMバシトラシン、1mM PMSFおよびロ
イペプチン（１μg/ml）を含有する〕で１回ウォッシュ
した。細胞を、125I−rCNTF（700pM）と一緒に、室温で
２時間インキュベートし、次に、アッセイバッファーで
２回迅速にウオッシュした。細胞を、１％SDSを含有す
るPBSで溶解し、放射能に関してモニターした。
11.4 結果 11.4.1.ES細胞培養 支持細胞の不在下、LIF（10−20ng/ml）存在下で維持
されたES細胞は、小細胞の未分化中型（compact）コロ
ニーとして存続した。しかし、低濃度のLIF（10ng/ml未
満）により、内胚葉様細胞と大きな平たい細胞の存在に
より確認されるように、２−７日間にわたりES細胞の分
化が生じた。多少の細胞死も生じた（図18、パネル
Ａ）。CNTFが支持細胞の不在下でES細胞を未分化状態で
維持するかどうかを決定するために、ES細胞をCNTF濃度
を変えてゼラチンプレート上で増殖させた。低濃度5pg/
mlから10ng/mlのCNTFにより、分化と多少の細胞死が生
じた。しかし、濃度10ng/mlから50ng/mlまでのCNTFはES
細胞を小細胞の中型コロニーとして維持した。（図18、
パネルＢ）。LIFまたはCNTFの何れかの不在下で維持さ
れたES細胞は、２−７日間にわたり内胚葉に類似してい
るか、あるいは大きく平たいと思われた（図18、パネル
Ｃ）。
11.4.2. ES細胞におけるCNTFの発現 ES細胞からのRNAのノーザン分析により、成熟ラット
脳に比較して低レベルではあるが、CNTF受容体mRNAが存
在することが示された（図19）。
11.4.3. CNTFのES細胞への結合 ES細胞は、85％の特異的125I−rCNTF結合を示し、総
結合cpmave＝10235＋157、非特異性cpmave＝1517＋163
であった。
11.4.4. ES細胞におけるCNTFおよびLIFによるtis11誘
導 ES細胞をゼラチンコーティング皿にプレートし、CNTF
（20ng/ml）あるいはLIF（20ng/ml）の存在下で未分化
状態で維持した。細胞を特定培地において２回ウォッシ
ュし、CNTF（50ng/ml）あるいはLIF（50ng/ml）添加45
分前に、特定培地中で２時間飢餓状態にした。総細胞RN
Aを調製し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気
泳動し、ナイロン膜（MSI）に移し、32P−標識tis11プ
ローブにハイブリダイズした（図20）。ES細胞におい
て、CNTFおよびLIFは何れも、類似したtis11遺伝子発現
誘導を生み出し、ES細胞のこれらの両サイトカイン類に
対する反応性が示された。
12.実施例:JAK族キナーゼ類はCNTF族因子類によるシグ
ナル形質導入に関与する。
12.1 材料および方法 12.1.1.試薬類 LIFRβ（Stahlら、J.Bio Chem.268:7628−7631（199
3））、gp130（Davisら、Science 260:1805−1808（19
93））、Jak1およびJak2（Silvennoinenら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、1993（印刷中））に特異的な抗血清類が
記載されている。Tyk2に対するウサギ抗血清が産生さ
れ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）融
合タンパク質として表されるTyk2の一部分に対して精製
された（Velazquezら、Cell 70:313−322（1992）;S.P
ellegrini、未発表の結果）。エピトープ標識LIFRβお
よびgp130のCOS発現に適切な発現プラスミド類は、以前
に記載されている（DAVISら、Science 260:1805−1808
（1993））が、検出能を改善するために、LIFRβコーデ
ィング配列が、mycエピトープの３つの連続コピーを含
むように修正されたことは除かれる。ネズミJak1および
Jak2に関するcDNA全長がプラスミドpRK5中に提供された
（J.Ihleら、未発表）。
12.1.2.方法 細胞系を、以前に記載されたように（IPら、Cell 6
9:1121−1132（1992））継代し、維持した。DEAEプロト
コール〔Davisら、Science 260:1805−1808（1993）〕
により、COS細胞のトランスフェクションを行った。細
胞プレートを、無血清のRPMI培地において２−４時間飢
餓状態にし、次に、指示因子50ng/mlで５分間刺激し
た。１％Brij96（Sigma）あるいは１％NP−40（Boehrin
ger）を指示にしたがって使用したことを除き、以前に
記載された様〔Stahlら、J.Bio Chem.268:7628−7631
（1993）〕に、細胞を収集して溶解した、免疫沈降、電
気泳動、および、モノクローナル抗体4G10（Upstate B
iotechnology）および増強化学ルミネセンス（Amersha
n）を介した検出による抗ホスホチロシンイムノブロッ
ティングを、以前の記載（Id）に従い実施した。in vi
troキナーゼアッセイに関して、ウォッシュしたビーズ
を20mM Hepes（pH7.2）、10mM MnCl2、30mMオルソバ
ナジン酸ナトリウムおよび〔ｇ−32P〕ATP（NEN Dupon
t）10mCi中において、室温で15分間インキュベートし
た。電気泳動試料バッファーを加えて、得られた試料を
沸騰させ、SDS−PAGEにかけ、そしてPVDFに電気ブロッ
トした。次に、オートラジオグラフィー前に、セリンお
よびスレオニンホスフェートを破壊するために、この膜
を、1M NaOH中、65℃で60分間インキュベートした。
12.2.結果 12.2.1.CNTF誘導反応は130kDaタンパク質と関係があ
る。
CNTF添加後に、CNTF、CNTFRα、gp130、およびLIFRβ
から成る受容体複合体が生じる。界面活性剤Brij96によ
る細胞溶解後における、LIFRβ（図22）またはgp130
（未図示）に対する抗体による受容体複合体の免疫沈降
（IP）により、チロシンリン酸化された130kDaタンパク
質が一緒に精製される。LIFおよびOSMはgp130およびLIF
Rβに結合し、gp130およびLIFRβをヘテロに量体化する
〔Gearingら、Science 255:1434−1437（1992）;Bauma
nnら、J.Biol.Chem.268:8414−8417（1993）:Davisら、
Science 260:1805−1808（1993）〕が、LIFおよびOSM
は、同じ外観を持つタンパク質のチロシンリン酸化およ
び会合も示す（図22）。精製受容体複合体も、関連130k
Daタンパク質のみならず、in viroでgp130およびLIFR
βのチロシンリン酸化を引き起こす関連タンパク質チロ
シンキナーゼ活性を示す。このチロシンキナーゼ活性
も、CNTF不在下においてLIFRβと関係があるが、130kDa
タンパク質はCNTF不在下において存在しないかあるいは
有意にリン酸化されない。このin vitroにおけるキナ
ーゼ活性は、スタウロスポリンに対して、完全な細胞へ
のCNTF添加時に観察されるものと同じ感受性を示すこと
を確認した他の実験により、この関連チロシンキナーゼ
活性は、CNTF誘導反応を媒介する細胞において要求され
る活性に直接関与することが示唆された。さらに、NP−
40中での細胞の溶解は130kDaタンパク質あるいはチロシ
ンキナーゼ活性の同時精製を提供しないことから、130k
Daタンパク質は、このキナーゼの十分な候補であると思
われる（未表示）。
12.2.2.CNTFおよび関連因子はJAK1、JAK2およびTYK2の
チロシンリン酸化を誘導する Jak1、Jak2、あるいはTyk2の一部分に対して産生した
特異的抗血清を使用した実験は、これらの３つのキナー
ゼは全て、CNTF、LIF、OSMおよびIL−６による刺激後
に、チロシンリン酸化されるようになることを示した。
図23Aは、CNTFがEW−１細胞においてJak1とJak2の両方
のチロシンリン酸化を誘導することを示しており、した
がって、これらのタンパク質はα−LIFRβにより免疫沈
降した受容体複合体と一緒に精製する130および131kDa
タンパク質と同時に移動すると考えられる。さらに、EW
−１細胞への、LIFおよびOSM（未図示）のみならずIL−
６プラスsIL6Rα（図23B）の添加によっても、Jak1およ
びJak2のリン酸化が生じるが、Tyk2のリン酸化は生じな
い。これとは対照的に、IL−６刺激U266細胞はTyk2およ
びJak1のチロシンリン酸化を示すが、Jak2のリン酸化状
態に明らかな変化はない。OSM処理SK−MES細胞は、同様
にJak2のチロシンリン酸化を示し、Tyk2およびJak1に極
小さな変化を引き起こす。これらの場合の各々におい
て、Jak類またはTyk2のチロシンリン酸化は、それらのi
n vitroチロシンキナーゼ活性の増加と関係がある（未
図示）。これらの結果は、GM−CSF、EPO、Ｇ−CSF、IFN
−γ、あるいはIL−３による刺激によりJak2のチロシン
リン酸化しか生じないことを示す過去の結果とは対照的
である〔（Argetsingerら、Cell 74:237−244（199
3）;Silvennoinenら、Proc.Natl.Acad Sci.USA（印刷
中;1993）;Witthuhnら、Cell 74:227−236（199
3）〕。本発明者らは、これらの実験から、CNTF因子族
はJak1、Jak2およびTyk2を活性化できるが、Jak/Tyk族
のメンバーが特殊細胞で活性化される場合に多少のばら
つきがあると結論づける。
12.2.3.Jak類はCNTFβ受容体成分と関連する。
Jak類が因子不在下においてβ受容体成分と結合する
かどうかを決定するために、COS細胞における一過性の
トランスフェクションを使用した。これらの実験は、モ
ノクローナル抗体9E10により認識されるｃ−mycの10個
のアミノ酸部分を含有するLIFRβのカルボキシル末端エ
ピトープ標識版を使用した〔Davisら、Science 253:59
−63（1991）〕。COS細胞は、LIFRβおよびJak1またはJ
ak2の全長版をコードする適切な発現ベクターにより同
時にトランスフェクションされ、したがって、Brij 96
溶解物は9E10により免疫沈降され、Jak1またはJak2に対
する抗血清によりブロットされた（図24）。これらの実
験により、何れかのJakが追加リガンドの不在下におい
てLIFRβと結合することが示される。さらに、細胞質ド
メインの最初アミノ酸76個のみを保持するLIFRβの切り
欠き版も、Jak1およびJak2に十分に結合することができ
る。これには、LIFRβの膜隣接領域がJak結合ドメイン
として関与し、これは、この受容体領域間では因子結合
時におけるシグナル形質導入に必要であることが分かっ
ているgp130とEPORのそれらと相同であることと一致す
る。〔Murakamiら、Science 260:11349−11353（199
1）;Witthuhnら、Cell 74:227−236（1993）〕。
12.2.4.受容体β−成分とJak類との同時トランスフェク
ションにより、リガンド誘導機能性反応が生じる。
受容体β成分のJak類との同時トランスフェクション
がリガンド誘導機能性反応を復元できるかどうかを確立
するために、COS細胞におけるさらなる実験が行われ
た。エピトープ標識gp130FLAGおよびIL−６がこれらの
実験に選択された。gp130は、IL−６＋可溶性IL−6Rα
に反応してホモ二量体化し、チロシンリン酸化されるよ
うになり、LIFRβとの同時トランスフェクションに関す
る要求を取り除くからである〔Murakamiら、Proc.Natl.
Acad.Sci.88:11349−11353（1993）:Davisら、Science
260:1805−1808（1993）〕。IL−６＋sIL6Rαによる
刺激後に、mockトランスフェクション化COS細胞（１レ
ーン）あるいはgp130FLAGトランスフェクション化COS細
胞（２−３レーン）は何れも、抗FLAGによる免疫沈降お
よびα−PTyrイムノブロッティング後に、gp130の本質
的チロシンリン酸化を示さなかった（図25）。これとは
対照的に、Jak1（４−５レーン）、Jak2（６−７レー
ン）あるいはJak1およびJak2の両方（８−９レーン）の
何れかとの同時トランスフェクションはIL6＋sIL6Rαに
よる刺激時にgp130のチロシンリン酸化誘導の本質的増
加を引き起こす。
12.3.考察 これらの結果から、Jak類はCNTF受容体β成分と結合
し、従って、CNTF、LIF、IL6あるいはOSMに反応してチ
ロシンリン酸化されるようになり、それに付随してチロ
シンキナーゼを活性化することが示唆される。β成分の
リガンド誘導ヘテロ−あるいはホモ−二量体化がそれら
結合の近接並列位置関係をもたらすため、これは、トラ
ンスリン酸化を介して生じる〔StahlおよびYancopoulo
s、Cell 74:587−590（1993）〕。Jak1またはJak2の何
れかとの同時トランスフェクション時におけるgp130の
リガンド誘導チロシンリン酸化のCOS細胞における機能
的復元は、Jak1、Jak2あるいはTyk2が受容体βサブユニ
ット二量体化時に細胞の内側で活性化される最初のキナ
ーゼとして機能することができ、したがって、Jakキナ
ーゼ族を、CNTF因子族のシグナル形質導入を媒介する場
合における最も近い細胞内ステップとして配置するとい
う考えと一致する。
参考 ここで引用した種々の出版物は、そのまま参考文献に
組み入れられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ストー，ネイル アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・ 10512、キヤメル、ケント・シヨア・ド ライブ、アール・デイー・ナンバー・10 (72)発明者 ヤンコポーロス，ジヨージ・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・ 10598、ヨークタウン・ハイツ、バプテ イスト・チヤーチ・ロード・1519 (72)発明者 アイル，ジエイムズ・エヌ アメリカ合衆国、テネシー・38120、メ ンフイス、リバービユー・410 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/566 C12N 15/09 C12P 21/02 G01N 33/50 G01N 33/53 C12P 21/02

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】被検物質が毛様体神経栄養因子（CNTF）受
    容体族の成員の作用物質あるいは拮抗物質として働く能
    力を測定する方法であって： （ａ）CNTF受容体族の成員のβ受容体成分とJakの成員
    を共発現する細胞を提供し； （ｂ）ステップ（ａ）の細胞を被検物質と接触させ； （ｃ）該細胞におけるJakの成員のチロシンリン酸化の
    量を測定し；および （ｄ）ステップ（ｃ）において測定したチロシンリン酸
    化の量を、該被検物質に接触していないステップ（ａ）
    の細胞中の同じJakの成員のチロシンリン酸化と比較す
    ることからなる方法。
  2. 【請求項２】該CNTF受容体族の成員がCNTF、LIF、OSMお
    よびIL−６から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】該β成分がgp130である、請求項１または
    ２に記載の方法。
  4. 【請求項４】該β成分がLIFRβである、請求項１または
    ２に記載の方法。
  5. 【請求項５】ステップ（ａ）の細胞がβ−受容体成分と
    してgp130およびLIFRβの両方を共発現する請求項１ま
    たは２に記載の方法。
  6. 【請求項６】Jakの成員がJak1、Jak2およびTyk2から選
    択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】ステップ（ａ）の該細胞がさらにCNTF受容
    体族の成員のα受容体成分を発現する、請求項１〜６の
    いずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】CNTF受容体族の成員のα−受容体成分が、
    該披検物質と共に可溶性形態で加えられる請求項１〜７
    のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】該α成分がCNTFRαあるいはIL−6Rαであ
    る、請求項７または８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体族の
    成員に対する作用活性（agonistic activity）または拮
    抗活性（antagonistic activity）を測定する方法であ
    って： （ａ）CNTF受容体族の成員のβ受容体成分とJakの成員
    を共発現する細胞を提供し； （ｂ）CNTF受容体族の成員のα受容体成分の存在下でス
    テップ（ａ）の細胞を被検物質に接触させ； （ｃ）該細胞におけるJakの成員のチロシンリン酸化の
    量を測定し；および （ｄ）ステップ（ｃ）において測定したチロシンリン酸
    化の量を、CNTF受容体族の成員と接触させたステップ
    （ａ）の細胞中の同じJakの成員のチロシンリン酸化と
    比較し、被検物質がCNTF受容体族の成員の作用物質ある
    いは拮抗物質として機能するか否かを確認することから
    なる方法。
  11. 【請求項１１】毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体族の
    β−受容体成分およびJakの成員を共発現するよう遺伝
    子工学的に処理された細胞であって、自然にはβ−受容
    体成分およびJakを共発現しない細胞。
  12. 【請求項１２】更にCNTF受容体族のα−受容体成分を発
    現する請求項11に記載の細胞。
  13. 【請求項１３】β−受容体成分およびJakで共形質転換
    された請求項11または12に記載の細胞。
  14. 【請求項１４】COS細胞である請求項11〜13のいずれか
    １項に記載の細胞。
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