JP3425146B2 - Monoclonal antibody against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) - Google Patents
Monoclonal antibody against human TNF-binding protein I (TNF-BP I)Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、TNF結合タンパク質Ｉ（TNF−BP I）に対す
るモノクローナル抗体及びそれらを分泌するハイブリド
ーマ細胞系に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to monoclonal antibodies against TNF binding protein I (TNF-BP I) and hybridoma cell lines secreting them.
二つの形態上関連したサイトカイン腫瘍壊死因子（TN
F−α）及びリンホトキシン（TNF−β）は、腫瘍細胞に
対するin vitroにおけるそれらの細胞障害活性及びマウ
スモデルの腫瘍の出血性壊死を引き起こす能力の結果と
して当初見いだされた。それらのcDNAのクローニング及
びE.Coliにおけるそれらの発現は、事実上無制限の量で
それらのタンパク質を入手可能とし、高い特異的抗体及
び感受性イムノノアッセイの開発を可能とした。これら
のタンパク質の生物学的活性、炎症プロセスの多面的
（pleotropic）媒介物質としてのそれらの生理学的役割
及び病的状態におけるそれらの関与について豊富な情報
がある。具体的には、TNF−αの産生の増加は、例え
ば、敗血症性ショック、「移植細胞対宿主」病における
組織損傷及び大脳マラリア及び悪液質の発病と関連があ
った（バウトラー（Beutler）、1988年；ポール（Pau
l）及びルドル（Ruddle）、1988年；バウトラー及びセ
ラミ（Cerami）、1989年）。Two morphologically related cytokines tumor necrosis factor (TN
F-α) and lymphotoxin (TNF-β) were initially discovered as a result of their cytotoxic activity against tumor cells in vitro and their ability to cause hemorrhagic necrosis of tumors in a mouse model. Cloning of their cDNAs and their expression in E. Coli made available their proteins in virtually unlimited amounts, allowing the development of highly specific antibodies and sensitive immunoassays. There is a wealth of information on the biological activity of these proteins, their physiological role as pleotropic mediators of inflammatory processes and their involvement in pathological conditions. Specifically, increased production of TNF-α was associated with, for example, septic shock, tissue damage in “transplanted versus host” disease and the onset of cerebral malaria and cachexia (Beutler, 1988; Paul
l) and Ruddle, 1988; Boutler and Cerami, 1989).
TNF−αの考えられる望ましくない効果により、この
サイトカインのナチュラルインヒビターが調査されるこ
とになった。TNF−αに結合し、そのことによりその活
性を阻害するタンパク質は、腎不全患者（ペータ（Peet
re）ら、1988年）及び熱病患者（セキンジャー（Seckin
ger）ら、1988年）の尿に初めに同定された。見掛けの
分子量が約30kDaのこのタンパク質を精製し、ホモジナ
イズし、部分的に配列決定し（EP−A2 308 378）、その
cDNAをクローン化した（オルソン（Olsson）ら、1989
年；エンジェルマン（Engelmann）ら、1989年；ヒムラ
ー（Himmler）ら、1990年；シャル（Schall）ら、1990
年）。TNF−BPと呼称されるこのタンパク質はTNFレセプ
ター（TNF−Ｒ）の細胞外フラグメントであることを、
このcDNAの構造は示した。（このフラグメントはタンパ
ク質分解により放出されると仮定された）。これらの結
果は、TNF−αの完全な膜レセプターを単離することに
より確認され、それは他の作業部会により独立して行わ
れた（ロッシャー（Loetscher）ら、1990年）。全レセ
プタータンパク質は455アミノ酸（55〜60kDa）からな
り、;TNF−BPは、レセプターの細胞外ドメインの大部分
を構成し、３つすべてのＮ−グリコシレーション部位を
含む。尿から単離したTNF−BPは、タンパク質分解の結
果、Ｎ−末端が異質であり、従ってそれは161アミノ酸
（主部分）又は172アミノ酸からなる二つの分子種の混
合物であることが見いだされた（ヒムラー（Himmler）
ら、1990年）。近年、高分子量の第二のTNFレセプター
タイプのフラグメントである第二のTNF−結合タンパク
質の存在が示された（75〜80kDa;エンゲルマン（Engelm
ann）ら、1990a;スミス（Smith）ら、1990年；コーノ
（Kohno）ら、1990年）。その後、二つのレセプター及
び結合タンパク質はTNF−R I/TNF−BP I及びTNF−R II/
TNF−BP IIと呼ばれた（それぞれ、60kDa及び80kDaレセ
プターである）。配列を比較することにより、二つのタ
ンパク質は形態上関連していることが示された；具体的
には、システイン基の数及び分布が非常に類似してい
た。しかし、二つのレセプターは、免疫学的には互いに
異なるものである（エンゲルマンら、1990a;ブロッカウ
ス（Brockhaus）、1990年）。The possible undesired effects of TNF-α have led to the investigation of natural inhibitors of this cytokine. Proteins that bind to TNF-α and thereby inhibit its activity are associated with renal failure patients (Peet).
re) et al., 1988) and fever patients (Seckin jar (Seckin
ger) et al., 1988) was first identified in the urine. This protein with an apparent molecular weight of approximately 30 kDa was purified, homogenized and partially sequenced (EP-A2 308 378),
The cDNA was cloned (Olsson et al., 1989.
Year; Engelmann et al., 1989; Himmler et al., 1990; Schall et al., 1990.
Year). This protein, called TNF-BP, is an extracellular fragment of the TNF receptor (TNF-R),
The structure of this cDNA is shown. (This fragment was hypothesized to be released by proteolysis). These results were confirmed by isolating the complete membrane receptor for TNF-α, which was independently done by another working group (Loetscher et al., 1990). The entire receptor protein consists of 455 amino acids (55-60 kDa); TNF-BP constitutes the majority of the extracellular domain of the receptor and contains all three N-glycosylation sites. TNF-BP isolated from urine was found to be heterogeneous at the N-terminus as a result of proteolysis, thus it was a mixture of two molecular species consisting of 161 amino acids (main part) or 172 amino acids ( Himmler
Et al., 1990). Recently, the presence of a second TNF-binding protein, a fragment of the high molecular weight second TNF receptor type, has been shown (75-80 kDa; Engelm).
ann) et al., 1990a; Smith et al., 1990; Kohno et al., 1990). Thereafter, the two receptors and binding proteins were TNF-RI / TNF-BP I and TNF-R II /
It was called TNF-BP II (60 and 80 kDa receptors, respectively). Sequence comparisons showed that the two proteins were morphologically related; in particular, the number and distribution of cysteine groups were very similar. However, the two receptors are immunologically distinct from each other (Engelmann et al., 1990a; Brockhaus, 1990).
ヒト60kDaのTNF−レセプターは、TNF−αシグナル伝
達に必須の役割を担う。そのレセプターの活性は、タン
パク質ベースの幾つかの調節作用に依存する；フォルボ
ールエステル又は他の活性化因子であるタンパク質キナ
ーゼＣによる細胞の処理により、TNF−αの細胞結合部
位の数がすばやく減少する。このことは、TNF−BP Iに
対応するレセプターの細胞外部分のタンパク質分解によ
る放出と関係がある。異なる動態とはいえ、同様の影響
が様々な他の物質、具体的には生理学的リガンドTNF−
α及びTNF−βにより引き起こされる。ヒト及びラット
のTNF−R I上のタンパク質分解酵素に関する分解部位は
保持される；それらはすべての公知のタンパク質分解酵
素の特異性とは構造上異なるものである。従って、特異
性が高いタンパク質分解酵素はTNFの細胞の感受性をコ
ントロールする調節回路の一部であると思われる；これ
らの正確なメカニズムは未だ知られていない。近年この
現象はin vivoにおいて観察されてきた：癌患者へのTNF
−αの投与により、血清中のTNF−BP Iが有意に増加す
ることが見い出された（ランツLantz）ら、1990a）。The human 60 kDa TNF-receptor plays an essential role in TNF-α signaling. The activity of its receptor depends on several protein-based regulatory actions; treatment of cells with phorbol ester or another activator, protein kinase C, rapidly reduces the number of cell-binding sites on TNF-α. To do. This is associated with the proteolytic release of the extracellular portion of the receptor corresponding to TNF-BP I. Similar effects, albeit with different kinetics, are associated with various other substances, specifically the physiological ligand TNF-
Caused by α and TNF-β. Degradation sites for proteolytic enzymes on human and rat TNF-RI are retained; they are structurally distinct from the specificity of all known proteolytic enzymes. Therefore, highly specific proteolytic enzymes appear to be part of the regulatory circuit that controls the cellular sensitivity of TNF; their exact mechanism is not yet known. In recent years this phenomenon has been observed in vivo: TNF in cancer patients
It was found that administration of -α significantly increased TNF-BP I in serum (Rantz Lantz et al., 1990a).
従って、培養残留物又は体液中のTNF−BP Iの濃度
は、リガンドとの相互作用又は他の媒介物質による調節
の結果として、in vitro又はin vivoにおいてTNFレセプ
ターシステムの活性の指標となる；従って、体液中のTN
F−BP I濃度は、様々な疾患の有用なマーカーと考える
ことができる。Thus, the concentration of TNF-BP I in culture residues or body fluids is indicative of TNF receptor system activity in vitro or in vivo as a result of interaction with ligands or modulation by other mediators; , TN in body fluids
F-BP I concentration can be considered as a useful marker for various diseases.
従って、TNF−BP Iを検出する有効かつ感受性のある
方法及びそのような検出方法に有用なキットが必要にな
った。Therefore, there is a need for effective and sensitive methods of detecting TNF-BP I and kits useful for such detection methods.
TNF−R Iに対するモノクローナル抗体は記載されてき
ており、それらは可溶化されたレセプター（ブロックハ
ウス（Brockhaus）ら、1990年;EP A2 334 165;トーマ
（Thoma）ら、1990年）又は精製されたTNF−BP I（エン
ゲルマンら、1990b）を用いて免疫性を与えることによ
り製造された；しかし、その抗体がTNF−BP Iのイムノ
アッセイにおける使用に好適なことは示されてこなかっ
た。Monoclonal antibodies against TNF-RI have been described and they are solubilized receptors (Brockhaus et al., 1990; EP A2 334 165; Thoma et al., 1990) or purified TNF. -BP I (Engelman et al., 1990b) produced by immunization; however, it has not been shown that the antibody is suitable for use in TNF-BP I immunoassays.
ランツ（Lantz）ら（1990a）は、競合的ELISAを開発
した。それは３段階の試験方法において、TNF−BP Iで
コートした試験プレート、TNF−BP Iのポリクローナル
ウサギ抗体、ウサギ免疫グロブリンに対するビオチン標
識ヤギ抗体及びアビジン結合アルカリフォスファターゼ
を使用した。このアッセイにより、正常ドナーの血清中
のTNF−BP Iの存在が見出され、増加した濃度のTNF−BP
IはTNF−αで処理した腎不全患者又は癌患者の血清中
に見出された。Lantz et al. (1990a) developed a competitive ELISA. It used a test plate coated with TNF-BP I, a polyclonal rabbit antibody of TNF-BP I, a biotin-labeled goat antibody against rabbit immunoglobulin and avidin-conjugated alkaline phosphatase in a three-step test procedure. This assay found the presence of TNF-BP I in the serum of normal donors, increasing the concentration of TNF-BP I.
I was found in the sera of patients with renal failure or cancer treated with TNF-α.
EP A1 412 486には、TNF−BP Iのモノクローナル抗体
が記載されている。これらの抗体の一つは、コーティン
グ抗体としてサンドイッチELISAに使用された：ポリク
ローナルウサギ抗−TNF−BP I抗体は第二の抗体として
使用され、ポリクローナルヤギ抗−ウサギ抗体は第三の
酵素結合抗体として使用された。EP A1 412 486 describes TNF-BP I monoclonal antibodies. One of these antibodies was used as a coating antibody in a sandwich ELISA: a polyclonal rabbit anti-TNF-BP I antibody was used as the second antibody and a polyclonal goat anti-rabbit antibody as the third enzyme linked antibody. Was used.
公知のアッセイは、それらの構造及び要求される方法
には複雑であり、さらにポリクローナル抗体の使用は動
物の使用を含むので、それはますます避けるべきであ
る。Known assays are complicated by their structure and required methods, and the use of polyclonal antibodies involves the use of animals and should therefore be increasingly avoided.
本発明の目的は、TNF−BP Iを検出するための単純か
つ高感受性イムノアッセイの使用に好適な、ヒトTNF−B
P Iに特異的なモノクローナル抗体を製造することであ
る。It is an object of the present invention that human TNF-B suitable for use in a simple and sensitive immunoassay for detecting TNF-BP I.
To produce a monoclonal antibody specific for PI.
本発明は、tbp−１、tbp−２及びtbp−６と呼称され
るヒトTNF−BP Iのモノクローナル抗体、それらの活性
フラグメント及びこれらの抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系TBP−１、TBP−２及びTBP−６に関する。The present invention relates to human TNF-BP I monoclonal antibodies designated tbp-1, tbp-2 and tbp-6, their active fragments and the hybridoma cell lines TBP-1, TBP-2 and TBP-1, which produce these antibodies. Regarding TBP-6.
TBP−１及びTBP−２と呼称されるハイブリドーマ細胞
系は1991年６月５日に、TBP−６と呼称される該細胞系
は1991年11月28日に、特許手続上の微生物寄託の国際的
承認に関するブダペスト条約に従い、European Collect
ion of Animal Cell Cultures（ECACC;ソールズベリ
ー、英国）に寄託された（TBP−1:寄託番号91060555、T
BP−2:寄託番号91060556、TBP−6:寄託番号9111281
1）。The hybridoma cell lines designated TBP-1 and TBP-2 were designated on June 5, 1991, and the cell line designated TBP-6 was designated on November 28, 1991 on the international basis of microbial deposits in patent procedure. According to the Budapest Treaty on Public Recognition, European Collect
ion of Animal Cell Cultures (ECACC; Salisbury, UK) (TBP-1: Deposit No. 91060555, T)
BP-2: Deposit No. 91060556, TBP-6: Deposit No. 9111281
1).
それ自体公知の方法を用いてヒトの尿から高度に精製
したTNF−BP Iを用いてマウスを免疫し、かつ陽性抗体
反応を示すマウスの脾臓細胞をメラノーマ細胞との融合
に使用してTNF−BP Iに対するモノクローナル抗体を分
泌する本発明のハイブリドーマ細胞を得た。第一の細胞
融合により、TNF−BP Iのモノクローナル抗体を製造す
る二つの培養物を生成した；第二の細胞融合により、第
三の抗体産生培養物を生成した。得られた抗体はtbp−
１及びtbp−２及びtbp−６と呼称された。抗体を精製
し、特性決定した:tbp−１及びtbp−６はIgG1−抗体で
あるのに対し、tbp−２はIgG2b−抗体である。３つの抗
体すべてが、ウエスタンブロットにおいてTNF−BP Iを
認識することができ、tbp−１は最も反応性が高いこと
が示された。tbp−２はより弱く反応したが、tbp−６は
最も弱い着色を示した。抗体により認識されたエピトー
プの特性決定をするために、可溶化TNF−レセプター
（トーマ（Thoma）ら、1990年）で免役することにより
得られた３つの抗体及びH398と呼称される第４の抗体を
調査した。調査した抗体はTNF−BP I分子上の３つの異
なるエピトープを認識し、tbp−２及びH398は同じかオ
ーバーラップしたエピトープを認識する。抗体との様々
な取合せにおいてTNF−αの存在下において行われたサ
ンドイッチELISAから、H398及びtbp−２により認識され
たエピトープはTNF−αの結合に関与するが、tbp−１及
びtbp−６により認識されたものはリガンド結合部位に
関連しないことが結論として導かれた。驚くべきこと
に、TNF−BP Iの幾つかのモノクローナル抗体は、過剰
のTNF−αの存在下においてTNF−BP Iを結合することが
できるだけでなく、さらにTNF−α及びTNF−βの細胞障
害活性に対してTNF−BP Iの防護効果を有意に増加する
ことが見出された。この効果は、二つの抗体tbp−１及
びtbp−６に観察された。（これらの二つの抗体は、TNF
−BP Iに対する抗体のグループに属し、TNF−BP Iの結
合に関してTNF−α及びTNF−βと競合しない。これに対
して、TNF−BP Iに結合するTNF−αと競合する抗体tbp
−２及びH398は、TNF−BP Iの活性を阻害する）。Mice were immunized with TNF-BP I highly purified from human urine using methods known per se, and spleen cells of mice showing a positive antibody reaction were used for fusion with melanoma cells to induce TNF- Hybridoma cells of the present invention secreting a monoclonal antibody against BPI were obtained. The first cell fusion produced two cultures producing TNF-BP I monoclonal antibodies; the second cell fusion produced a third antibody-producing culture. The obtained antibody is tbp-
1 and tbp-2 and tbp-6. Antibodies were purified and characterized: tbp-1 and tbp-6 are IgG1-antibodies, while tbp-2 are IgG2b-antibodies. All three antibodies were able to recognize TNF-BP I in Western blots, showing that tbp-1 was the most reactive. tbp-2 reacted weaker, while tbp-6 showed the weakest staining. Three antibodies obtained by immunizing with a soluble TNF-receptor (Thoma et al., 1990) and a fourth antibody designated H398 to characterize the epitope recognized by the antibody. investigated. The antibodies investigated recognize three different epitopes on the TNF-BP I molecule, tbp-2 and H398 recognize the same or overlapping epitopes. From sandwich ELISAs performed in the presence of TNF-α in various combinations with antibodies, the epitopes recognized by H398 and tbp-2 are involved in TNF-α binding, but by tbp-1 and tbp-6. It was concluded that what was recognized was not related to the ligand binding site. Surprisingly, some monoclonal antibodies of TNF-BP I are not only able to bind TNF-BP I in the presence of excess TNF-α, but also TNF-α and TNF-β cytotoxicity. It was found to significantly increase the protective effect of TNF-BP I on activity. This effect was observed with the two antibodies tbp-1 and tbp-6. (These two antibodies are TNF
Belongs to the group of antibodies against BPI and does not compete with TNF-α and TNF-β for TNF-BP I binding. In contrast, the antibody tbp that competes with TNF-α that binds to TNF-BP I
-2 and H398 inhibit the activity of TNF-BP I).
他の態様によると、本発明は、イムノアッセイにより
体液又は細胞培養残留物中のTNF−BP Iを検出するため
のtbp−１及び／又はtbp−２の使用に関する。According to another aspect, the invention relates to the use of tbp-1 and / or tbp-2 for detecting TNF-BP I in body fluids or cell culture residues by immunoassay.
（これらの抗体の使用に関連して、tbp−１及びtbp−２
という語句は、TNF−BP Iに結合する以下の活性フラグ
メントを含む。当業者は、活性抗体フラグメント（Fab
−断片）を製造する方法、例えば、酵素消化による方法
に通じているであろう）。(In connection with the use of these antibodies, tbp-1 and tbp-2
The term includes the following active fragments that bind TNF-BP I. Those skilled in the art will appreciate that active antibody fragments (Fab
-Fragments), for example by enzymatic digestion).
本発明は、また、イムノアッセイにより体液又は細胞
培養残留物においてTNF−BP Iを検出するためのtbp−１
及びtbp−６の使用に関する。抗体の組合せであるtbp−
1/tbp−６は、他の試験システムにおいてTNF−BP Iの測
定を混乱させる非常に高濃度のTNF−α及び／又はTNF−
βがあるサンプルにおける使用に特に好適である。The present invention also provides tbp-1 for detecting TNF-BP I in body fluids or cell culture residues by immunoassay.
And the use of tbp-6. Tbp- which is a combination of antibodies
1 / tbp-6 disrupts the measurement of TNF-BP I in other test systems at very high concentrations of TNF-α and / or TNF-
β is particularly suitable for use in some samples.
本発明の範囲に使用することができるイムノアッセイ
は、当業者に精通し、非常に多くの入手可能な標準的方
法に基づいている。これらの方法は、測定されるべき抗
原物質と一つ以上の抗体との複合体の形成に基づくもの
である。一つ以上の複合体のパートナーを標識し、該抗
原を検出及び／又は定量的に測定することができる。標
識は、例えば、結合した酵素、放射性同位体、金属キレ
ート又は螢光体、ケミルミネッセント物質又はバイオル
ミネッセント物質の形態をとってもよい。The immunoassays that can be used within the scope of the present invention are familiar to the person skilled in the art and are based on the numerous standard methods available. These methods are based on the formation of complexes between the antigenic substance to be measured and one or more antibodies. One or more partners of the complex can be labeled and the antigen can be detected and / or quantitatively measured. The label may take the form of, for example, a bound enzyme, radioisotope, metal chelate or fluorophore, chemiluminescent substance or bioluminescent substance.
競合的イムノアッセイの場合、分析されるべきサンプ
ル中の抗原は、抗体結合部位に結合する公知の量の標識
抗原と競合する。従って、抗体と結合する標識抗原の量
は、サンプル中の抗原の量に反比例する。In a competitive immunoassay, the antigen in the sample to be analyzed competes with a known amount of labeled antigen that binds to the antibody binding site. Therefore, the amount of labeled antigen that binds to the antibody is inversely proportional to the amount of antigen in the sample.
標識抗体を使用する試験において、標識結合抗体の量
は、抗原の量に正比例する。In tests using labeled antibodies, the amount of labeled bound antibody is directly proportional to the amount of antigen.
抗原に対する結合を互いに妨げる二つの抗体を使用す
る、抗体／抗原／抗体複合体の形成に基づいたアッセイ
は、「サンドイッチ」免疫アッセイとして知られる。Assays based on the formation of antibody / antigen / antibody complexes that use two antibodies that interfere with each other to bind an antigen are known as "sandwich" immunoassays.
モノクローナル抗体は制限されない量において一定の
質で入手可能であるので、モノクローナル抗体を用いた
イムノアッセイは、それらの一定の質及び複製可能性の
ために、ポリクノーナル抗体を使用するアッセイ以上の
重要な利点を有する。さらに、それらはポリクローナル
抗体に関連した欠点、即ち、それらを産生するために動
物を一定に使用すべきであるという欠点が避けられる。Because monoclonal antibodies are available in constant quantity and in constant quality, immunoassays with monoclonal antibodies offer important advantages over assays using polyclonal antibodies due to their constant quality and replicability. Have. Furthermore, they avoid the drawbacks associated with polyclonal antibodies, i.e. the constant use of animals to produce them.
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、サンド
イッチイムノアッセイ、具体的にはサンドイッチELISA
に使用される。Preferably, the monoclonal antibody of the invention is a sandwich immunoassay, specifically a sandwich ELISA.
Used for.
本発明のモノクローナル抗体は、サンドイッチ免疫ア
ッセイにおいてコーティング−及び標識結合抗体（labe
lling−coupled antibody）として使用することがで
き、かくしてポリクローナル抗体の使用を不必要にす
る。The monoclonal antibodies of the present invention can be used in sandwich immunoassays to coat and label labeled antibodies (labe).
lling-coupled antibody), thus obviating the use of polyclonal antibodies.
他の態様によると、本発明はイムノアッセイキット、
具体的にはtbp−１及び／又はtbp−２を含有するサンド
イッチイムノアッセイキットに関する。According to another aspect, the invention provides an immunoassay kit,
Specifically, it relates to a sandwich immunoassay kit containing tbp-1 and / or tbp-2.
本発明の好ましい態様は、サンドイッチイムノアッセ
イキット、好ましくはサンドイッチELISAキットであ
り、ここでtbp−１はコーテング抗体であり、tbp−２は
標識された、好ましくは酵素結合抗体である。A preferred embodiment of the invention is a sandwich immunoassay kit, preferably a sandwich ELISA kit, wherein tbp-1 is a coating antibody and tbp-2 is a labeled, preferably enzyme-linked antibody.
サンドイッチイムノアッセイにおいてtbp−２又はtbp
−１と抗体／抗原／抗体複合体を形成することができる
他の抗体でtbp−１又はtbp−２を置き換えることは本発
明の範囲において可能である。Tbp-2 or tbp in sandwich immunoassay
It is possible within the scope of the invention to replace tbp-1 or tbp-2 with other antibodies capable of forming an antibody / antigen / antibody complex with -1.
tbp−１又はtbp−２を他の抗体により置換するなら
ば、TNF−BP I又はその一部の同じエピトープを認識す
る抗体を、置換されるべきtbp−１又はtbp−２として使
用することが好ましい。If tbp-1 or tbp-2 is replaced by another antibody, it is possible to use an antibody recognizing TNF-BP I or part of the same epitope as tbp-1 or tbp-2 to be replaced. preferable.
サンドイッチイムノアッセイは、tbp−２又はtbp−１
と抗体／抗原／抗体複合体を形成するそれらの能力を基
礎としたイムノアッセイにおいて、抗体がtbp−１又はt
bp−２の置換体として好適であることを測定するために
使用することができる。イムノアッセイプレートをtbp
−１又はtbp−２でコートし、抗原を加え、調査される
べき標識抗体を施す。試験抗体の標識を測定することに
より決定することができるtbp−１又はtbp−２と抗体／
抗原／抗体複合体を形成可能な抗体は、tbp−１又はtbp
−２により抗原上の異なるエピトープを認識する。tbp
−１又はtbp−２とサンドイッチを形成することができ
ない抗体は、これら抗体と同じかオーバーラップしてい
るエピトープを認識する。The sandwich immunoassay is tbp-2 or tbp-1
In an immunoassay based on their ability to form antibody / antigen / antibody complexes with
It can be used to determine its suitability as a substitute for bp-2. Tbp immunoassay plate
-1 or tbp-2, add antigen and apply labeled antibody to be investigated. Antibody / tbp-1 or tbp-2 which can be determined by measuring the label of the test antibody
Antibodies capable of forming an antigen / antibody complex are tbp-1 or tbp
-2 recognizes different epitopes on the antigen. tbp
Antibodies unable to form a sandwich with -1 or tbp-2 recognize epitopes that are the same or overlap with these antibodies.
もし抗体tbp−１又はtbp−２の一つがサンドイッチイ
ムノアッセイにおいて置換されるならば、好ましくは、
標識結合抗体tbp−２は、tbp−２と同じかオーバーラッ
プするエピトープ特異性を有する抗体により置換され
る。好適な抗体の例は、トーマ（Thoma）ら（1990年）
により記載されたモノクローナル抗体H398であり、本発
明の範囲においてそれは同一かオーバーラップしている
エピトープに結合することを示すものである。If one of the antibodies tbp-1 or tbp-2 is replaced in a sandwich immunoassay, preferably
The labeled binding antibody tbp-2 is replaced by an antibody with the same or overlapping epitope specificity as tbp-2. An example of a suitable antibody is Thoma et al. (1990).
Is a monoclonal antibody H398, described in (1), which shows within the scope of the invention that it binds to identical or overlapping epitopes.
tbp−1/tbp−２を基づいた本発明によるサンドイッチ
ELISAの助けを借りると、ヒト血清、血漿、尿及び／又
は細胞培養残留物中において、約200ng/lの感受性かつ1
0％より高い正確度でTNF−BP Iを検出することが可能で
あった。Sandwiches according to the invention based on tbp-1 / tbp-2
With the help of ELISA, a sensitivity of about 200 ng / l and 1 in human serum, plasma, urine and / or cell culture residues was obtained.
It was possible to detect TNF-BP I with an accuracy higher than 0%.
驚くべきことに、TNF−レセプター、TNF−α及びTNF
−βのナチュラルリガンドは、tbp−１及びtbp−２が使
用される本発明のイムノアッセイの予測される質に影響
しないことが見出された:TNF−βはアッセイに測定可能
な影響を及ぼさないが、TNF−αは10μg/l以上の濃度の
シグナルに測定可能な変化を唯一生じる。健常人におけ
るTNF−αの濃度は20ng/l以下であるのが一般的であ
り、深刻な病的状態においてさえ、TNF−α濃度は１μg
/lをまれに越えるのみであるので（例えば、ラーデヴィ
ルタ（Lahdevirta）ら、1988年；オフナーら、1990
年）、自然な状態で分泌された内因性TNF−αにより本
発明が曲解されることは除外することができる。Surprisingly, TNF-receptor, TNF-α and TNF
The -β natural ligand was found not to affect the expected quality of the immunoassays of the invention where tbp-1 and tbp-2 are used: TNF-β has no measurable effect on the assay. However, TNF-α only produces measurable changes in the signal at concentrations above 10 μg / l. The concentration of TNF-α in a healthy person is generally 20 ng / l or less, and even in a serious morbid state, the TNF-α concentration is 1 μg.
It rarely exceeds / l (eg, Lahdevirta et al., 1988; Offner et al., 1990).
,) That the invention is distorted by endogenously secreted endogenous TNF-α can be excluded.
その感受性から見ると、モノクローナル抗体tbp−1/t
bp−２に基づいたイムノアッセイは、また、正常なレベ
ルから低下する方に逸脱したTNF−BP Iの濃度を検出す
ることができる。従って、TNF−BP Iの現象した産生に
より達成される体の機能的疾患を、診断に役立つように
見出すことができる。Judging from its sensitivity, the monoclonal antibody tbp-1 / t
A bp-2 based immunoassay can also detect concentrations of TNF-BP I that deviate from normal levels in a downward direction. Thus, the functional disorders of the body achieved by the phenomenonatic production of TNF-BP I can be found to be diagnostic.
血清、血漿及び尿及び細胞培養残留物におけるTNF−B
P Iを検出することに加え、モノクローナル抗体tbp−１
及びtbp−２は他の体液、例えば髄液又は気管支肺胞分
泌液においてTNF−BP Iを検出するためにも使用でき
る。TNF-B in serum, plasma and urine and cell culture residues
In addition to detecting PI, monoclonal antibody tbp-1
And tbp-2 can also be used to detect TNF-BP I in other body fluids such as spinal fluid or bronchoalveolar secretions.
驚くべきことに、本発明の範囲において行われる実験
において、tbp−１及びtbp−６の組合せを用いたサンド
イッチELISAに得られたシグナルは、10mg/lの範囲にお
いて極めて高いTNF−α又はTNF−β濃度によってでさえ
も影響されないことが見出された。Surprisingly, in the experiments carried out within the scope of the present invention, the signal obtained in the sandwich ELISA with the combination of tbp-1 and tbp-6 is very high in the range of 10 mg / l TNF-α or TNF-. It was found that even the β concentration was not affected.
抗体の組合せtbp−1/tbp−６は、サンドイッチイムノ
アッセイ、具体的にはサンドイッチELISAにおいて好ま
しく使用されるが、tbp−１及びtbp−６はコーティング
抗体及び標識抗体として使用されてもよい。The antibody combination tbp-1 / tbp-6 is preferably used in sandwich immunoassays, in particular sandwich ELISA, although tbp-1 and tbp-6 may be used as coating and labeled antibodies.
TNF−BP Iを検出するための一組の抗体tbp−1/tbp−
６の使用の例としては、白血球のような細胞がリポ多糖
で刺激されるin vitro実験から得られるサンプル、又は
多量のリポ多糖又はバクテリアで処理された実験動物か
ら得られる血清サンプルがあげられる。このような条件
下では、TNF−αは極めて多量に分泌される。A set of antibodies for detecting TNF-BP I, tbp-1 / tbp-
Examples of the use of 6 include samples obtained from in vitro experiments in which cells such as white blood cells are stimulated with lipopolysaccharide, or serum samples obtained from experimental animals treated with high amounts of lipopolysaccharide or bacteria. Under such conditions, TNF-α is secreted in a very large amount.
従って、本発明の助けにより、TNF−BP Iを検出する
高感受性の方法が提供され、そのことにより生理学的リ
ガンドTNF−α及びTNF−βによるTNF−レセプターの活
性及び様々な病的状態又はin vitroモデルにおける他の
媒介物質によるそのトランスモジュレーション（transm
odulation）を決定することができる。従って、体液に
おけるTNF−BP Iの検出は、TNF−α産生の増加を伴う病
的状態の診断又はそのような診断を確認するのに特に有
用である。Therefore, with the aid of the present invention, a sensitive method for detecting TNF-BP I is provided, whereby the activity of TNF-receptors by the physiological ligands TNF-α and TNF-β and various pathological conditions or in Its transmodulation (transm) by other mediators in an in vitro model
odulation) can be determined. Accordingly, detection of TNF-BP I in body fluids is particularly useful for diagnosing or confirming a pathological condition involving increased TNF-α production.
TNF−α測定に比べて、TNF−BP I測定の一つの利点
は、TNF−BP Iの正常レベルが血清中に見出され、その
ために僅かに上昇したレベルでさえも検出可能となり診
断が達成されるという事実にある。One advantage of the TNF-BP I assay over TNF-α assay is that normal levels of TNF-BP I are found in the serum, so that even slightly elevated levels can be detected and diagnosis achieved. It is in the fact that it is done.
TNF−αの導入と敗血症及び動物における内毒素（end
otoxaemic）反応の発生との明らかな相互作用にもかか
わらず、厳しいグラム陰性感染を患う患者におけるTNF
−αを測定すると相反する結果が生じた。このことは、
TNF−αの合成及び分泌をコントロールするメカニズム
に関連することを明らかとした。好適な刺激により活性
化された時、TNF−αはマクロファージにより直ちに分
泌され、その後マクロファージはさらなる刺激に耐性で
あるべきである。さらに、血漿における半減期は短く、
人ではたった15〜17分である。これらの現象から、血液
系におけるTNF−αの出現はすばやく、短命であり、そ
れゆえに検出が困難であるという理由は明らかにされた
（ミッチ（Michie）ら、1988年）。従って、もし血液が
正確な時間に患者から採取されないならば、TNF−α濃
度の増加は分析の瞬間に見出されないであろうと考えら
れる。ランツ（Lantz）ら（1990a）は、TNF−αの注入
後、血清中のTNF−BP Iレベルは、血清TNFレベルよりも
ゆっくりと下降することを立証した。これの発見によ
り、もしTNF−レセプターシステムの活性化に関連し
た、具体的にはTNF−αによる、病的状態の診断を設定
するならば、診断を基礎としたTNF−BP I濃度の測定は
特に都合がよく、ここでTNF−αレベルは、TNF−BP Iレ
ベルと比べるとよりすばやく低下することが示された。Introduction of TNF-α and sepsis and endotoxin in animals (end
TNF in patients with severe Gram-negative infection despite a clear interaction with the development of otoxaemic reactions
Measuring -α produced conflicting results. This is
It was clarified that it is related to the mechanism controlling TNF-α synthesis and secretion. When activated by a suitable stimulus, TNF-α should be secreted immediately by macrophages, after which the macrophages should be resistant to further stimuli. In addition, the half-life in plasma is short,
It takes only 15 to 17 minutes for a person. These phenomena have clarified why the appearance of TNF-α in the blood system is quick, short-lived and therefore difficult to detect (Michie et al., 1988). Therefore, it is believed that if blood is not drawn from the patient at the correct time, no increase in TNF-α concentration will be found at the moment of analysis. Lantz et al. (1990a) demonstrated that serum TNF-BP I levels fell more slowly than serum TNF levels after infusion of TNF-α. The discovery of this, if setting a diagnosis of pathological conditions associated with activation of the TNF-receptor system, specifically by TNF-α, would lead to a diagnostic-based measurement of TNF-BP I levels. Particularly advantageous, where TNF-α levels were shown to decrease more rapidly compared to TNF-BP I levels.
TNF−BP Iの測定の助けを借りて診断することができ
る疾患の例としては、グラム陰性又は一般的な細菌の感
染、敗血症性ショック、「移植細胞対宿主」病における
組織損傷及び大脳マラリア及び悪液質があげられる。Examples of diseases that can be diagnosed with the help of measuring TNF-BP I include Gram-negative or common bacterial infections, septic shock, tissue damage and cerebral malaria in “transplant cell versus host” disease and Cachexia.
本発明のイムノアッセイは、もし治療が正確に行われ
なければ生命を脅かす疾患である、敗血症性ショックの
診断に特に有益である。The immunoassays of the present invention are particularly useful in diagnosing septic shock, a life-threatening disease if treatment is not performed correctly.
モノクローナル抗体tbp−１及びtbp−２に基づいた本
発明のイムノアッセイにより、TNF−BP Iは平均濃度約2
ug/lで正常ドナーの血清中に検出することができる。上
昇したレベルは、ひどい火傷を負った患者の血清中に見
出された；非常に高いレベルは透析患者に見出された
が、慢性多発関節炎患者の血清はTNF−BP I濃度の上昇
を示さなかった。By an immunoassay of the present invention based on the monoclonal antibodies tbp-1 and tbp-2, TNF-BP I has an average concentration of about 2
It can be detected in the serum of normal donors at ug / l. Elevated levels were found in the sera of patients with severe burns; very high levels were found in dialysis patients, but sera from patients with chronic polyarthritis showed elevated TNF-BP I levels. There wasn't.
また、本発明のイムノアッセイは、第一に、尿中のTN
F−BP Iを検出する簡単な免疫学的方法を提供するもの
であり；正常ドナーの尿サンプルにおいて、平均約2ug/
lの濃度のTNF−BP Iが検出された。In addition, the immunoassay of the present invention is
It provides a simple immunological method for detecting F-BP I; in urine samples from normal donors, an average of about 2 ug /
l concentration of TNF-BP I was detected.
本発明のイムノアッセイは、尿中のTNF−BP Iの濃度
を測定することにより腎不全のケースに見出されるよう
な、尿と血清においてTNF−BP I濃度の上昇に相互関係
がある病的状態の診断に使用することができる。この方
法は、血液サンプルを要求しないこと及び尿の分析を基
礎とした診断を提供することができるという利点を有
し、それは患者にとってかなり好ましいことである。The immunoassay of the present invention is for the determination of pathological conditions that correlate with elevated TNF-BP I levels in urine and serum, as found in cases of renal failure by measuring the concentration of TNF-BP I in urine. Can be used for diagnosis. This method has the advantage that it does not require a blood sample and can provide a diagnosis based on the analysis of urine, which is quite favorable for the patient.
本発明のイムノアッセイに使用することができる「診
断」という語句は、また、TNF−レセプターシステムの
活性化に関連する疾患のコース、又は疾患の処置、例え
ばTNF−αの抗体を用いた処置に関する治療のコースを
モニタリングすることをカバーする。また、本発明のイ
ムノアッセイの使用は、TNF−α又はTNF−βが投与され
る治療の進行をモニタリングするのに好都合である。こ
れらの診断の応用のコースにおいて、体液のサンプルは
規則的な間隔をおいて患者から一般的に採取し、TNF−B
P Iのその含有量を試験した。The phrase "diagnosis" that can be used in the immunoassays of the present invention also refers to the course of a disease associated with activation of the TNF-receptor system, or the treatment of a disease, e.g., treatment with an antibody of TNF-a. Cover monitoring of the course. Also, the use of the immunoassay of the present invention is convenient for monitoring the progress of the treatment to which TNF-α or TNF-β is administered. In these diagnostic application courses, fluid samples are typically taken from patients at regular intervals and TNF-B
Its content of PI was tested.
TNF−BP Iに結合するのにTNF−α及び／又はTNF−β
と競合せず、TNF−BP Iの防護効果を増す、TNF−BP Iの
モノクローナル抗体を本発明に従って使用し、TNF−α
及び／又はTNF−βが損傷効果を有する疾患の治療の範
囲内でTNF−BP Iの効果を増強してもよい。（TNF−αに
対するTNF−BP Iの防護効果は、比較的弱いことが見出
された（ランツ（Lantz）ら、1990b、ローチャー（Loet
scher）ら、1991年）。TNF-α and / or TNF-β for binding to TNF-BP I
Monoclonal antibodies of TNF-BP I, which do not compete with TNF-BP I and increase the protective effect of TNF-BP I, were used according to the invention and
And / or the effect of TNF-BP I may be enhanced within the treatment of diseases in which TNF-β has a damaging effect. (The protective effect of TNF-BP I on TNF-α was found to be relatively weak (Lantz et al., 1990b, Locher
scher) et al., 1991).
内因性TNF−BP I及び治療用に投与された外因性TNF−
BP Iの両方に関するこれらの抗体の防護効果の強化を利
用するために、抗体をそれ自体で又は治療剤として好適
な標品においてTNF−BP Iと組み合わされてもよい。Endogenous TNF-BP I and therapeutically administered exogenous TNF-
To take advantage of the enhanced protective effect of these antibodies on both BP I, the antibodies may be combined with TNF-BP I either by themselves or in a preparation suitable as a therapeutic agent.
TNF−α及びTNF−βに対するTNF−BP Iの防護効果を
増強するこの種類の抗体の例としてはtbp−１及びtbp−
６があげられる。この目的に関するTNF−BP Iの他の抗
体の適性は、バイオアッセイにおいて該抗体をそれらの
効果についてTNF−BP Iで試験することにより確認され
る。モノクローナル抗体の用量は、TNF−BP Iの量に従
って調節され、TNF−BP Iの量を基準として等モルから
約100倍モル過剰量の範囲内であるのが好適である。Examples of antibodies of this type that enhance the protective effect of TNF-BP I against TNF-α and TNF-β are tbp-1 and tbp-
6 is given. The suitability of other antibodies of TNF-BP I for this purpose is confirmed by testing the antibodies with TNF-BP I for their effect in a bioassay. The dose of the monoclonal antibody is adjusted according to the amount of TNF-BP I, and is preferably in the range of equimolar to about 100-fold molar excess based on the amount of TNF-BP I.
本発明が適用される他の分野は、アフィニティクロマ
トグラフィによりTNF−BP Iを精製するために固定され
た形態（immobilised form）のモノクローナル抗体tbp
−１、tbp−２及びtbp−６の使用である。Another field to which the invention applies is the immobilized form of the monoclonal antibody tbp for purifying TNF-BP I by affinity chromatography.
-1, tbp-2 and tbp-6.
さらに、本発明のモノクローナル抗体、具体的にはtb
p−１は免疫ブロットにおいてTNF−BP Iを検出するのに
使用できる。Furthermore, the monoclonal antibody of the present invention, specifically tb
p-1 can be used to detect TNF-BP I in immunoblots.
図面の簡単な説明 図1:モノクローナル抗体を使用したTNF−BP IのELISA。Brief description of the drawings Figure 1: TNF-BP I ELISA using monoclonal antibody.
図2:血清及び尿サンプルのTNF−BP IのELISAに関する代
表的検量線。Figure 2: Representative calibration curve for TNF-BP I ELISA of serum and urine samples.
図3:TNF−BP Iの免疫反応性に関するTNF−αの効果。Figure 3: Effect of TNF-α on TNF-BP I immunoreactivity.
図4:ヒト血清及び尿におけるTNF−BP I濃度。Figure 4: TNF-BP I concentration in human serum and urine.
図5:サンドイッチELISAにおいてTNF−BP Iを検出するTN
F−αの効果。Figure 5: TN detecting TNF-BP I in sandwich ELISA
The effect of F-α.
図6:細胞障害性バイオアッセイにおけるTNF−BP Iの防
護効果に対するモノクローナル抗体の効果。Figure 6: Effect of monoclonal antibody on the protective effect of TNF-BP I in cytotoxic bioassay.
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。 The present invention will be specifically described by the following examples.
実施例１
ヒトTNF−BP Iに特異的なモノクローナル抗体の製造
ａ）免疫処置
生後約６週間の３匹の雌性BABL/cマウスを、EP A2 39
3 438に記載した方法により、以下の計画に従って、均
一に精製したTNF−BP Iを用いて免疫した。Example 1 Production of Monoclonal Antibody Specific for Human TNF-BP I a) Immunization Three female BABL / c mice, about 6 weeks old, were treated with EP A2 39.
According to the method described in No. 3438, immunization was performed with TNF-BP I uniformly purified according to the following scheme.
第一の免疫：マウスあたり９μｇのTNF−BP Iを完全フ
ロインドアジュバントにおいて腹腔内投与により投与し
た。First immunization: 9 μg / mouse of TNF-BP I was administered by intraperitoneal administration in complete Freund's adjuvant.
第二の免疫：第一の免疫の３週間後、マウスあたり９μ
ｇのTNF−BP Iを不完全フロインドアジュバンドにおい
て腹腔内投与した。Second immunization: 9 μ per mouse 3 weeks after the first immunization
g TNF-BP I was administered intraperitoneally in incomplete Freund's adjuvant.
第三の免疫：第二の免疫の５週間後、マウスあたり９μ
ｇのTNF−BP Iを不完全フロインドアジュバンドにおい
て腹腔内投与した。Third immunization: 5 weeks after the second immunization, 9 μ per mouse
g TNF-BP I was administered intraperitoneally in incomplete Freund's adjuvant.
８日後、血清サンプルをマウスから採取し、TNF−BP
Iの抗体の形成をサンドイッチELISAにより調査した。こ
れを行うためにTNF−BP Iのウサギ抗体でコートした試
験プレートにTNF−BP Iを結合し、マウス免疫グロブリ
ンのペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体を用いて特異的抗
体を検出した。試験血清は1:102、1:103、1:104及び1:1
05の希釈液において適用した。３匹のマウスすべてが10
5までの希釈液において陽性の反応を示した（バックグ
ラウンドの２倍以上の吸収量）。第三の免疫の約８週間
後、最も高いタイマーのマウスに３日間連続的に、PBS
中の４μｇのTNF−BP Iを用いて追加刺激を与えた：こ
のマウスの脾臓細胞を、次の日にハイブリドーマ細胞と
の融合に使用した。第３の免疫の８ヶ月後に、使用した
マウスにTNF−BP Iの第４の量（15μｇ）を追加的に与
え、７週間後に追加刺激を与えたこと以外は、第二の免
疫を同様の方法で行った。After 8 days, a serum sample was taken from the mouse and TNF-BP
The formation of antibodies to I was investigated by sandwich ELISA. To do this, TNF-BP I was bound to a test plate coated with a TNF-BP I rabbit antibody and a specific antibody was detected using a mouse immunoglobulin peroxidase-conjugated rabbit antibody. Test sera were 1:10 2 , 1:10 3 , 1:10 4 and 1: 1
It was applied at 0 5 dilution. 10 in all 3 mice
A positive reaction was shown in the diluted solutions up to 5 (absorption amount more than twice the background). Approximately 8 weeks after the third immunization, the mice with the highest timer were treated with PBS for 3 consecutive days.
A boost was given with 4 μg of TNF-BP I in: The spleen cells of this mouse were used the next day for fusion with hybridoma cells. The second immunization was similar except that the mice used were additionally given a fourth dose of TNF-BP I (15 μg) 8 months after the third immunization and boosted 7 weeks later. Made by way.
ｂ）融合：
最後の注射１日の後、マウスの脾臓を滅菌条件下で取
り出し、機械で切り（chop up）、血清のない培地（RPM
I 1640）で洗った。約108個の脾臓細胞を、コーラー（K
ohler）及びミルスタイン（Milstein）（1975年）の方
法を用いて、PEG4000の存在下において約５×107P3X63A
g8.653 BALB/cメラノーマ細胞と融合した（キルニー（K
earney）ら、1979年）。その後、該細胞をHAT−選択培
地（ペニシリンＧナトリウム100U/ml、ストレプトマイ
シン50U/ml及び20％FCS−10-4Mヒポキサンチン、４×10
-7Mアミノプテリン及び1.6×10-5Mチミジンで補ったRPM
I 1640）に懸濁し、「フィーダーレイヤー（Feeder Lay
er）」としてマウス腹膜細胞を含有する16の96−ウェル
ミクロタイタープレートに分配した。11日後、上清を取
り出し、抗体産生について試験した。選択培地において
成長した1500培養物のうち、90％以上のものがハイブリ
ドーマの発育を示した。b) Fusion: One day after the last injection, the spleen of the mouse is removed under sterile conditions, chop up and serum free medium (RPM.
I 1640). Approximately 10 8 spleen cells were
Ohler) and Milstein (1975), in the presence of PEG4000, about 5 × 10 7 P3X63A.
g8.653 BALB / c fused with melanoma cells (Kirney (K
earney) et al., 1979). Then, the cells were treated with HAT-selective medium (penicillin G sodium 100 U / ml, streptomycin 50 U / ml and 20% FCS-10 −4 M hypoxanthine, 4 × 10 4.
RPM supplemented with -7 M aminopterin and 1.6 x 10 -5 M thymidine
I 1640) and suspended in the "Feeder Lay
)) ”was distributed in 16 96-well microtiter plates containing mouse peritoneal cells. After 11 days, the supernatant was removed and tested for antibody production. Of the 1500 cultures grown in the selection medium, 90% or more showed hybridoma development.
ｃ）ハイブリドーマ培養残留物のスクリーニング
特に規定しない限り、以下の緩衝液をすべてのELISA
実験に使用した：
コーティング緩衝液:0.05M炭酸カルシウム pH9.6
洗浄媒体:Tween20を0.5g/lで含むpH7.4のリン酸緩衝
食塩溶液（PBS）
試験緩衝液：ウシ血清アルブミン（5g/l）及びTween
20（0.5g/l）を含むPBS
基質溶液:0.05Mクエン酸カリウム中、テトラメチルベ
ンジンヒドロクロライド（0.1g/l）及び過ホウ酸ナトリ
ウム（0.05g/l）、pH5.0
停止溶液（Stopping solution）:2M 硫酸
96−ウェルのイムノノアッセイプレートを、1:3000の
血清希釈液（50μl/ウェル、４℃で一晩又は37℃で１時
間インキュベーション）に相当する濃度のコーティング
緩衝液中、硫酸アンモニウム沈澱物（50％飽和）で部分
的に精製したTNF−BP Iのウサギ抗体でコートした。そ
のプレートを一度洗い、周囲温度で１時間、試験緩衝液
で遮蔽した。その後ハイブリドーマ残留物（50μｌ）を
抗原（50μｌ、試験緩衝液中10μg TNF−BP I/l）と一
緒に加え、その皿を２時間周囲温度でインキュベートし
た。それらを一度洗い、マウス免疫グロブリンのペルオ
キシダーゼ結合ウサギ抗体の溶液（DAKO、デンマーク、
試験緩衝液の1:5000の希釈液、50μl/ウェル）を加え、
プレートを周囲温度で２時間インキュベートした。その
後、それらを３回洗い、基質溶液200μｌを各ウェルに
加えた。20〜40分後、50μｌの停止溶液を加えることに
より反応を止めた。その溶液の吸収量を、陰性コントロ
ールとしての培養培地及び陽性コントロールとしての希
釈マウス免疫血清を使用し、450nm（標準:690nm）の波
長でELISAリーダーにおいて測定した。第一の免疫処置
で調査した培養物のうちたった２つが、いずれかの抗体
産生を示した（TBP−１及びTBP−２）；第二の融合は第
三の抗体−陽性細胞系（TBP−６）を生じた。該陽性培
養物を、約25日後にHAT−培地からHT−培地に移し、さ
らに10日後、それらを正常培養培地（RPMI 1640完全、
１％抗生物質、10％Ｌ−グルタミン、10％FCS）に移し
た。c) Screening of hybridoma culture residue Unless otherwise specified, the following buffers were used for all ELISAs.
Used in the experiment: Coating buffer: 0.05M calcium carbonate pH 9.6 Washing medium: Phosphate buffered saline solution (PBS) containing Tween 20 at 0.5 g / l, pH 7.4 Test buffer: Bovine serum albumin (5 g / l ) And Tween
PBS substrate solution containing 20 (0.5 g / l): tetramethylbenzidine hydrochloride (0.1 g / l) and sodium perborate (0.05 g / l) in 0.05 M potassium citrate, pH 5.0 Stopping solution (Stopping solution): 2M sulfuric acid 96-well immunoassay plate in 1: 3000 serum dilution (50 μl / well, overnight at 4 ° C. or 1 hour incubation at 37 ° C.) in coating buffer at a concentration equivalent to Coated with partially purified TNF-BP I rabbit antibody with ammonium sulfate precipitate (50% saturation). The plate was washed once and shielded with test buffer for 1 hour at ambient temperature. The hybridoma residue (50 μl) was then added together with the antigen (50 μl, 10 μg TNF-BP I / l in test buffer) and the dish was incubated for 2 hours at ambient temperature. They are washed once and a solution of mouse immunoglobulin peroxidase-conjugated rabbit antibody (DAKO, Denmark,
1: 5000 dilution of test buffer, 50 μl / well),
The plate was incubated for 2 hours at ambient temperature. After that, they were washed 3 times and 200 μl of substrate solution was added to each well. After 20-40 minutes, the reaction was stopped by adding 50 μl of stop solution. The absorbed amount of the solution was measured in an ELISA reader at a wavelength of 450 nm (standard: 690 nm) using a culture medium as a negative control and diluted mouse immune serum as a positive control. Only two of the cultures examined in the first immunization showed production of either antibody (TBP-1 and TBP-2); the second fusion was the third antibody-positive cell line (TBP-). 6) occurred. The positive cultures were transferred from HAT-medium to HT-medium after about 25 days and after 10 more days they were placed in normal culture medium (RPMI 1640 complete,
1% antibiotic, 10% L-glutamine, 10% FCS).
ｄ）ハイブリドーマのクローニング
陽性培養物を制限希釈方法によりクローン化した。10
0μｌの培地が細胞１つを含むように希釈を行い、その
後96ウェルの皿のウェルをこの容量で充たした（全部で
３つの皿を調製し、前の日に各ウェルをマウス腹膜マク
ロファージ懸濁液100μｌで充たした。）。培養残留物
を上記のようにELISAにより試験した；各培養物から得
た陽性クローンを貯蔵し、増やし、凍結させた。d) Cloning of hybridoma Positive cultures were cloned by the limiting dilution method. Ten
Dilutions were made so that 0 μl of medium contained one cell, then the wells of a 96-well dish were filled with this volume (a total of 3 dishes were prepared, each day the wells were suspended with mouse peritoneal macrophages). The solution was filled with 100 μl.). Culture residues were tested by ELISA as described above; positive clones from each culture were pooled, expanded and frozen.
ｅ）モノクローナル抗体の産生
in vivoにおいて抗体を産生するために、約107細胞を
各ハイブリドーマ培養物から取り、0.5mlの不完全フロ
インドアジュバントであらかじめ２日又は３日処理した
BALB/cマウスの腹膜組織内に注入した。約10〜14日後、
腹水を取り出した。形成したモノクローナル抗体を硫酸
アンモニウム沈澱物により精製し、その後キャリヤー結
合タンパク質−Ｇのアフィニティクロマトグラフィを行
った。e) Production of monoclonal antibodies For the production of antibodies in vivo, approximately 10 7 cells were taken from each hybridoma culture and pretreated with 0.5 ml of incomplete Freund's adjuvant for 2 or 3 days.
BALB / c mice were injected intraperitoneally. After about 10-14 days,
Ascites was removed. The formed monoclonal antibody was purified by ammonium sulphate precipitation followed by carrier-bound protein-G affinity chromatography.
細胞培養における抗体産生のため、ウシ胎児血清（FC
S）をタンパク質−Ｇセファロースのクロマトグラフィ
により精製し、ウシIgGを除去した；この血清調製物を
ハイブリドーマ培養物に５％濃度において使用した。抗
体を、タンパク質−Ｇ−セファロースを使用して培養残
留物から再び単離した。代わりの方法として、細胞を血
清を含まない媒体（血清フリー（serum−free）及びタ
ンパク質フリー（protein−free）のハイブリドーマ媒
体、Messrs.SIGMA、カタログNo.5−2772、USA）におい
て成長させ、さらに抗体をタンパク質−Ｇ−セファロー
スのクロマトグラフィにより同様に単離した。For the production of antibodies in cell culture, fetal calf serum (FC
S) was purified by protein-G sepharose chromatography to remove bovine IgG; this serum preparation was used in hybridoma cultures at 5% concentration. Antibodies were isolated again from the culture residue using Protein-G-Sepharose. Alternatively, cells are grown in serum-free medium (serum-free and protein-free hybridoma medium, Messrs.SIGMA, Catalog No. 5-2772, USA), and Antibodies were similarly isolated by protein-G-sepharose chromatography.
実施例２
モノクローナル抗体の特性決定
抗体のサブアイソタイプ（subisotype）を、ペルオキ
シダーゼ結合ウサギ抗体（セロテック、オックスフォー
ド、GB）を使用して決定した。tbp−１及びtbp−６はIg
G1−抗体であるのに対し、tbp−２はIgG2−抗体であっ
た。Example 2 Characterization of Monoclonal Antibodies The subisotype of antibodies was determined using a peroxidase-conjugated rabbit antibody (Serotech, Oxford, GB). tbp-1 and tbp-6 are Ig
Tbp-2 was an IgG2-antibody, whereas it was a G1-antibody.
ウエスタンブロットにおいて、３つの抗体すべてはTN
F−BP Iを認識した;tbp−１は強い反応性を示し、tbp−
２はより小さな強さで反応したがtbp−６は非常にわず
かな着色を生じたのみであった。In Western blot, all three antibodies were TN
F-BP I was recognized; tbp-1 showed strong reactivity and tbp-
2 reacted with lesser intensity, but tbp-6 produced only a very slight coloration.
抗体により認識されたエピトープを決定するために、
３つの抗体tbp−１、tbp−２及びtbp−６及び抗体H398
であって可溶化したTNF−レセプターで免疫することに
よりトーマ（Thoma）ら（1990年）により開発されたも
のをセイヨウワサビのペルオキシダーゼに結合し、ELIS
Aにより特性決定した：試験プレートを非標識抗体（10m
g/l）の一つでそれぞれコートし、その後抗原の一組の
希釈液を加え、その後酵素結合抗体の一つを施した。こ
の実験は可能なかぎりの取りあわせで行った〔図.1:A:t
bp−1;B:tbp−２、C:tbp−６、D:H398。印は、ペルオキ
シダーゼ結合体を示す:tbp−１（黒丸）、tbp−２（黒
四角）、tbp−６（黒三角）、H398（白丸）〕。各抗体
種のどれも「サンドイッチ」を形成可能でないことが見
出され、そのことは抗原がモノマーの形態において存在
することを示していた。抗体tbp−１とtbp−２、tbp−
６又はH398の組合せ及びtbp−２とtbp−６又はtbp−６
とH398の組合せは用量依存シグナルを生ずることが可能
であったが、H398と結合したtbp−２は反応しなかっ
た。このことから、抗体はTNF−BP I分子の３つの異な
るエピトープを認識すると結論づけられた;tbp−２及び
H398は同一かオーバーラップしたエピトープに結合し
た。さらなる開発のため、試験の取りあわせを、tbp−
１がコーティング抗体を構成し、tbp−２がペルオキシ
ダーゼ結合抗体を構成するものから選択した。To determine the epitope recognized by the antibody,
Three antibodies tbp-1, tbp-2 and tbp-6 and antibody H398
And developed by Thoma et al. (1990) by immunizing with solubilized TNF-receptor bound to horseradish peroxidase
Characterized by A: Test plates were labeled with unlabeled antibody (10m
g / l) each and then a set of dilutions of the antigen was added, followed by one of the enzyme linked antibodies. This experiment was carried out with as many combinations as possible [Fig. 1: A: t
bp-1; B: tbp-2, C: tbp-6, D: H398. Symbols indicate peroxidase conjugates: tbp-1 (black circle), tbp-2 (black square), tbp-6 (black triangle), H398 (white circle)]. It was found that none of each antibody species was able to form a "sandwich", indicating that the antigen was present in monomeric form. Antibodies tbp-1, tbp-2, tbp-
6 or H398 combination and tbp-2 and tbp-6 or tbp-6
The combination of and H398 was capable of producing a dose-dependent signal, whereas t398-2 bound to H398 did not react. From this it was concluded that the antibody recognizes three different epitopes of the TNF-BP I molecule; tbp-2 and
H398 bound to the same or overlapping epitopes. For further development, the test arrangement was
1 constitutes the coating antibody and tbp-2 is selected from those constituting the peroxidase-conjugated antibody.
実施例３
酵素結合イムノソルベントアッセイ（サンドイッチ−EL
ISA）の開発
ヒト血清中のTNF−BP Iを検出するELISAの使用に照ら
し、まず、すべての様々な培地を、サンプル及びスタン
ダードに希釈培地としてのそれらの適性について調査し
た。FCS及びウシ血清の両方が使用可能な用量−活性曲
線を生成したが、貯蔵した正常ヒト血清は非常に高いブ
ランク値を示した。この現象は、非特異的反応性又は抗
原の存在によるかどうかをチェックするために、固定し
たTNF−αを含むアフィニティカラムにヒト血清をとお
した。クロマトグラフィカラムのスルーフロー（throug
hflow）を希釈媒体として使用した時、ブランク値は、
ウシ血清で得られたものとほぼ等しかった。このこと
は、正常ヒト血清が、免疫反応性かつ生物学的活性なTN
F−BP Iを含むことを示していた。使用した血清プール
中のTNF−BP Iの濃度は約１μg/lと評価された。50％ウ
シ血清を用いて描いたスタンダードカーブは、TNF−BP
Iが除去された50％ヒト血清のものと区別できなかっ
た。従って、前者の培地をその後の試験すべてに使用し
た（使用したウシ血清の供給物のすべては様々な会社か
ら得られ、そのうちの二つのみが好適であることが分か
った；他のものすべては繁殖性が乏しいことを示し
た。）。Example 3 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Sandwich-EL
ISA) development In light of the use of ELISA to detect TNF-BP I in human serum, firstly all different media were investigated for their suitability as dilution media in samples and standards. Both FCS and bovine serum produced usable dose-activity curves, whereas stored normal human serum showed very high blank values. To check if this phenomenon was due to non-specific reactivity or the presence of antigen, human serum was passed through an affinity column containing immobilized TNF-α. Chromatographic column through flow (throug
When using hflow) as the dilution medium, the blank value is
It was almost equal to that obtained with bovine serum. This means that normal human serum shows that immunoreactive and biologically active TN
It was shown to contain F-BP I. The concentration of TNF-BP I in the serum pool used was estimated to be approximately 1 μg / l. The standard curve drawn using 50% bovine serum is TNF-BP.
It was indistinguishable from that of 50% human serum with I removed. Therefore, the former medium was used for all subsequent tests (all of the bovine serum supplies used were obtained from various companies, only two of which proved to be suitable; all others were It was shown that the fertility was poor.).
標準方法に従って試験を設定し、行った。 The test was set up and conducted according to standard methods.
まず、血清中のTNF−BP Iを測定するアッセイを開発
するための予試験において、いわゆる２段階アッセイ、
即ちその後に洗浄工程が続くサンプルのインキューショ
ンと、該抗体−酵素結合体を用いたインキュベーション
が別々に行われる方法には、より速くより好都合な１段
階方法を越える利点はないことが見出された。さらに、
予試験は、コーティング抗体の濃度を多様にするためか
つ免疫反応のインキュベーション時間を多様にするため
に行われた。First, in a preliminary test for developing an assay for measuring TNF-BP I in serum, a so-called two-step assay,
Thus, it has been found that a method in which the incubation of the sample, followed by a washing step, and the incubation with the antibody-enzyme conjugate are carried out separately has no advantages over the faster and more convenient one-step method. Was done. further,
Pretests were performed to vary the concentration of coating antibody and to vary the incubation time of the immune reaction.
最適化したアッセイを行い、血清中のTNF−BP Iを以
下のように測定した：
96ウェルのイムノアッセイプレートを、コーティング緩
衝液中3mg/lの濃度のモノクローナル抗体tbp−１でコー
トした（４℃で一晩又は周囲温度で１時間;100μl/ウェ
ル）。ウェルを一度洗い、残っている結合部位を、周囲
温度で１時間、200μｌの試験緩衝液で遮蔽した。他の
洗浄サイクルの後、列２及び11のウェルに100μｌの50
％ウシ血清/50％PBSを入れた。TNF−BP Iの標準溶液
（実施例1aを参照されたい。20μg/lの50％ウシ血清/50
％PBS、100μｌ）を、A2及びA11のウェルにピペットで
移した；比1:2の段階希釈液を、列２及び11のウェルに
直接作成した。他のすべてのウェルにPBS 50μｌを加
え、血清サンプルを２度ピペットで移した（50μl/ウェ
ル）。試験緩衝液中のペルオキシダーゼ結合抗体tbp−
２の溶液50μｌを、好適な希釈液が予試験において確認
された後に、すべてのウェルに入れた。（セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼに対する抗体の結合（ベーリンガー
マンハイム）をウィルソン（Wilson）及びナカネ（Naka
ne）（1978年）により記載された方法に従って行っ
た。）。プレートを、プレート振動装置（plate vibrat
ing apparatus）において、周囲温度で３時間インキュ
ベートした。その後、プレートを３回洗い、基質溶液
（200μｌ）加え、50μｌの停止溶液を添加することに
より反応を止め、吸収量の値を上記のように測定した。
サンプルにおけるTNF−BP Iの濃度をTitercalcプログラ
ム（Hewlett Packard）を使用して計算した。An optimized assay was performed and TNF-BP I in serum was measured as follows: 96-well immunoassay plates were coated with monoclonal antibody tbp-1 at a concentration of 3 mg / l in coating buffer (4 ° C). Overnight or at ambient temperature for 1 hour; 100 μl / well). The wells were washed once and the remaining binding sites were blocked with 200 μl of test buffer for 1 hour at ambient temperature. After another wash cycle, 100 μl of 50 wells in rows 2 and 11
% Bovine serum / 50% PBS was included. A standard solution of TNF-BP I (see Example 1a. 20 μg / l 50% bovine serum / 50).
% PBS, 100 μl) was pipetted into the A2 and A11 wells; serial dilutions in the ratio 1: 2 were made directly in the wells of rows 2 and 11. 50 μl PBS was added to all other wells and serum samples were pipetted twice (50 μl / well). Peroxidase-conjugated antibody tbp- in test buffer
50 μl of the solution of 2 was added to all wells after the appropriate dilution was confirmed in the pretest. (The binding of antibodies to horseradish peroxidase (Boehringer Mannheim) was determined by Wilson and Nakane.
ne) (1978). ). Plate the plate vibrat
ing apparatus) was incubated at ambient temperature for 3 hours. The plate was then washed 3 times, the substrate solution (200 μl) was added, and the reaction was stopped by adding 50 μl of stop solution and the absorption value was measured as described above.
The concentration of TNF-BP I in the sample was calculated using the Titercalc program (Hewlett Packard).
検量線をプロットする時に10％FCSを含む細胞培地を
使用し、サンプルを希釈せずに使用したこと以外は、細
胞培養残留物を分析するために同様の方法においてアッ
セイを設定した。The assay was set up in a similar manner to analyze cell culture residues, except that cell culture medium with 10% FCS was used when plotting the calibration curve and the sample was used undiluted.
改良（２段階）方法を尿中のTNF−BP Iを測定するた
めに開発した。この必要性は、いくつかのサンプルの低
いpH値及び試験の妨げとなる他の説明されない因子のた
めに生じた。pH値により引き起こされる影響は、緩衝能
力が不十分なために標準試験緩衝液により補うことがで
きなかった。最も酸性の強いサンプル（pH5）でさえ中
性のpHにまで引き上げることができることを確実にする
ために、強いリン酸緩衝液（0.5M）が必要であった。こ
の測定は、いくつかのサンプルがなお繁殖性の乏しさを
示す場合には、十分ではなかった。この問題は２段階試
験方法を使用することにより解決された（サンプル及び
結合体の継続的なインキュベーション）；血清アッセイ
について記載したようにプレートをコートし、遮蔽し、
洗った。その後、0.5モルのリン酸ナトリウム緩衝液pH
7.4中、ウシ血清アルブミン（5g/l）及びTween20（0.5g
/19からなる溶液を、プレート中のウェルにピペットを
用いて移した（50μl/ウェル）。その検量線を、同じ溶
液を用いて描いた。その後尿サンプル（50μl/ウェル；
測定を２度行った）を加え、プレートを振動装置上で２
時間インキュベートした。その後、プレートを洗い、試
験緩衝液中の酵素結合体の溶液100μｌを加え、その後
インキュベーションをさらに２時間行った。プレートの
最終処理及びTNF−BP Iの定量的測定を血清試験につい
て上記したように行った。An improved (2-step) method was developed to measure TNF-BP I in urine. This need arises because of the low pH value of some samples and other unexplained factors that hinder the test. The effects caused by pH values could not be compensated by standard test buffers due to insufficient buffering capacity. A strong phosphate buffer (0.5M) was needed to ensure that even the most acidic samples (pH 5) could be raised to neutral pH. This measurement was not sufficient if some samples still showed poor fertility. This problem was solved by using a two-step test method (continuous incubation of sample and conjugate); coating plates, shielding as described for serum assays,
washed. Then 0.5 molar sodium phosphate buffer pH
7.4, bovine serum albumin (5g / l) and Tween20 (0.5g
The solution consisting of / 19 was pipetted into the wells in the plate (50 μl / well). The calibration curve was drawn using the same solution. Then urine sample (50 μl / well;
The measurement was performed twice) and the plate was placed on a vibrating device for 2
Incubated for hours. The plate was then washed, 100 μl of a solution of enzyme conjugate in test buffer was added, followed by incubation for a further 2 hours. Final treatment of plates and quantitative measurement of TNF-BP I was performed as described above for serum testing.
一般的な検量線を図２に示した（黒丸：血清サンプ
ル、白丸：尿サンプル）；それは、0.3〜10μg/lの濃度
範囲においてTNF−BP Iの定量的測定を認めた。ブライ
ンドの値に３つの標準偏差を合わせたものに相当するシ
グナルを生じる濃度として定義した血清中の検出可能な
最低量を、0.2μg/l（独立したアッセイの平均）と測定
した。1mg/l（標準試験範囲と比較して100倍過剰な量）
までの濃度において「大量フック（high−dose hoo
k）」効果（過剰の抗原）は見出されなかった。尿サン
プルの試験の感受性は、比較可能であった。細胞培養サ
ンプルの感受性は、これらのサンプルが希釈されないで
使用されるので、約0.1μg/lである。A general calibration curve is shown in FIG. 2 (black circles: serum sample, white circles: urine sample); it showed a quantitative measurement of TNF-BP I in the concentration range of 0.3-10 μg / l. The lowest detectable amount in serum, defined as the concentration that produced a signal corresponding to the blind value plus three standard deviations, was determined to be 0.2 μg / l (mean of independent assays). 1 mg / l (100 times more than the standard test range)
Up to a concentration of "high-dose hoo
k) ”effect (excess antigen) was not found. The sensitivities of testing urine samples were comparable. The sensitivity of the cell culture samples is about 0.1 μg / l as these samples are used undiluted.
血清アッセイの正確性を、６つの異なる試験において
２及び10μg/の濃度のTNF−BP Iを含む血清サンプルを
分析することにより試験した。アッセイ内（intra−ass
ay）変動係数はそれぞれ4.7％及び5.9％であり、アッセ
イ間（inter−assay）変動係数はそれぞれ6.6％及び7.5
％であった。直線性を、血清中のTNF−BP Iの一組の外
部２倍希釈液（0.3〜10μg/l濃度）を調査することによ
り測定し、測定した値の回帰直線を、予期した値と比較
することにより実験により計算した。３つの独立した試
験において、相関係数0.998〜１を得た。The accuracy of the serum assay was tested by analyzing serum samples containing TNF-BP I at concentrations of 2 and 10 μg / in 6 different tests. In-assay (intra-ass
ay) Coefficients of variation are 4.7% and 5.9%, respectively, and inter-assay coefficients of variation are 6.6% and 7.5%, respectively.
%Met. Linearity is measured by examining a set of external 2-fold dilutions of TNF-BP I in serum (0.3-10 μg / l concentration) and the regression line of the measured values is compared to the expected value. This was calculated experimentally. A correlation coefficient of 0.998-1 was obtained in three independent tests.
血清アッセイによるTNF−BP Iの検出を、外因性TNF−
BP Iを７の正常ドナーの血清に二つの異なる濃度（１及
び５μg/l）において加えることにより調査した。この
実験は、すべてのサンプルが様々な濃度の外因性TNF−B
P Iを含んでいたという事実により、さらに困難になっ
た；従って、検出率を計算する前にこれらの値を引かな
ければならなかった。平均検出率は、１μg/lにおいて8
3±15％であり、５μg/lにおいて85±13％であることが
見出された（範囲：それぞれ62〜101％、65〜105％）。Detection of TNF-BP I by serum assay was performed using exogenous TNF-
BPI was investigated by adding sera from 7 normal donors at two different concentrations (1 and 5 μg / l). This experiment showed that all samples had varying concentrations of exogenous TNF-B.
The fact that it contained PI made it even more difficult; therefore, these values had to be subtracted before calculating the detection rate. Average detection rate is 8 at 1 μg / l
It was found to be 3 ± 15% and 85 ± 13% at 5 μg / l (range: 62-101%, 65-105% respectively).
外因性TNF−BP Iを加えた14の尿サンプルにおける改
良尿アッセイによるTNF−BP Iの検出を、血清サンプル
に関して行ったものと同様の方法で調査した；公称濃度
５μg/lに関する平均検出率は83±15％であった（範囲:
52〜104％）。The detection of TNF-BP I by the modified urine assay in 14 urine samples with exogenous TNF-BP I was investigated in a similar manner to that performed for serum samples; the average detection rate for a nominal concentration of 5 μg / l is 83 ± 15% (range:
52-104%).
TNF−レセプターの生理学的リガンドがTNF−BP Iの抗
体との相互作用に影響を及ぼすかどうかを測定するため
に、増加した濃度の組み換えTNF−α（グレー（Gray）
ら、1984年）及び組み換えTNF−β（ペンニカ（Pennic
a）ら、1984年）の存在下、それぞれの場合E.Coliか
ら、かつ99％より高い純度で、一定の濃度のTNF−BP I
（５μg/l）を用いてELISAを行った。図３から分かるよ
うに（Ｃは、TNF−BP Iを含まないアッセイのバックグ
ラウンドを示すものである。）、TNF−αは、10μg/l以
上の濃度の抗体とTNF−BP Iの反応を阻害する；これに
対して、TNF−βは、非常に高い濃度（100mg/lまで）で
さえも活性を示さなかった。To determine whether TNF-receptor physiological ligands affect the interaction of TNF-BP I with antibodies, increased concentrations of recombinant TNF-α (Gray) were used.
1984) and recombinant TNF-β (Pennic (Pennic
a) et al., 1984), in each case from E. Coli and with a purity higher than 99%, at a constant concentration of TNF-BP I.
ELISA was performed using (5 μg / l). As can be seen from FIG. 3 (C shows the background of the assay not containing TNF-BP I), TNF-α showed the reaction between TNF-BP I and the antibody at a concentration of 10 μg / l or more. Inhibits; in contrast, TNF-β showed no activity even at very high concentrations (up to 100 mg / l).
実施例４
TNF−BP Iの安定性
ａ）血清中の安定性
貯蔵した正常血清の濾過−滅菌サンプルを、様々な温
度で24時間貯蔵した；さらにサンプルを何回かの凍結／
解凍サイクルにかけた。表１から分かるように、37℃に
おけるインキュベーションも、繰り返した凍結及び解凍
のいずれも、TNF−BP Iの免疫反応性に影響を及ぼさな
かった。サンプルは、外因性TNF−BP I（サンプル1:1.2
μg/l）を含む貯蔵したヒト血清及び外因性TNF−BP Iを
加えた同じ血清サンプル（サンプル2:最終濃度５μg/
l）からなるものであった。Example 4 Stability of TNF-BP I a) Stability in Serum Filtration of stored normal serum-sterilized samples were stored for 24 hours at various temperatures;
Thaw cycle. As can be seen from Table 1, neither incubation at 37 ° C. nor repeated freezing and thawing affected TNF-BP I immunoreactivity. The sample is exogenous TNF-BP I (Sample 1: 1.2
Human serum containing 100 μg / l) and the same serum sample supplemented with exogenous TNF-BP I (Sample 2: 5 μg / l final concentration)
l).
ｂ）尿の安定性
試験をａ）に明記したように行った;pH値が広範囲な
３つのサンプルを調査した。表１から分かるように、凍
結及び解凍の後、TNF−BP Iはすべてのサンプルにおい
て安定であった。すべてのサンプルは、どのような活性
も失うことなく、37℃までの温度で24時間貯蔵すること
ができた。尿サンプルを３つの異なるドナーから得た
（サンプル1:pH5.1、1.9μg/l;サンプル2:pH5.9、4.0μ
g/l;サンプル3:pH7.2、3.7μg/l）。「nd」は、「測定
せず」を示す。b) Urine stability tests were performed as specified in a); three samples with a wide range of pH values were investigated. As can be seen from Table 1, TNF-BP I was stable in all samples after freezing and thawing. All samples could be stored at temperatures up to 37 ° C. for 24 hours without losing any activity. Urine samples were obtained from 3 different donors (Sample 1: pH 5.1, 1.9 μg / l; Sample 2: pH 5.9, 4.0 μ
g / l; Sample 3: pH 7.2, 3.7 μg / l). "Nd" indicates "not measured".
実施例５
ヒト血清におけるTNF−BP Iの検出
42の正常ドナー（血液ドナー及び実験スタッフ）から
得た血清を、実施例３に記載した血清サンドイッチELIS
Aを使用して調査した。TNF−BP I濃度は、0.5〜5.4μg/
lで様々であり、平均は2.1μg/lであった（標準偏差1.0
μg/l;図４）。同時に得られる血清、EDTA−血漿、クエ
ン酸加血漿及びヘパリン血漿は、二人から入手可能であ
った;TNF−BP I濃度は有意に異なっていなかった（ドナ
ーA:1.7、2.0、1.6及び1.9μg/l;ドナーB:1.8、1.8、1.
8及び1.9μg/l）。慢性多発性関節炎の15人の患者の血
清中のTNF−BP I濃度は、健常人のもの（2.3±0.79μg/
l;範囲:1.2〜3.9μg/l）とは有意に異なっていなかっ
た。有意に上昇したレベルは、厳しい火傷を負った患者
の血清に見出された（6.5±1.7μg/l;範囲:3.1〜9.1μg
/l;n＝10）。腎不全患者（ｎ＝６）は、20〜69μg/lの
範囲の著しく高い濃度を示した（平均±標準偏差:49±1
7μg/l）。Example 5 Detection of TNF-BP I in human serum Serum obtained from 42 normal donors (blood donor and experimental staff) was used as serum sandwich ELIS as described in Example 3.
Surveyed using A. TNF-BP I concentration is 0.5-5.4 μg /
The mean was 2.1 μg / l (standard deviation 1.0
μg / l; FIG. 4). Serum, EDTA-plasma, citrated plasma and heparin plasma obtained at the same time were available from two persons; TNF-BP I concentrations were not significantly different (donor A: 1.7, 2.0, 1.6 and 1.9). μg / l; Donor B: 1.8, 1.8, 1.
8 and 1.9 μg / l). Serum TNF-BP I concentrations in 15 patients with chronic polyarthritis were those of healthy individuals (2.3 ± 0.79 μg /
l; range: 1.2 to 3.9 μg / l). Significantly elevated levels were found in the serum of patients with severe burns (6.5 ± 1.7 μg / l; range: 3.1-9.1 μg
/ l; n = 10). Patients with renal failure (n = 6) showed significantly higher concentrations in the range of 20-69 μg / l (mean ± standard deviation: 49 ± 1).
7 μg / l).
実施例６
尿サンプルに特異的な実施例３において開発したサン
ドイッチELISAを使用して、16の正常ドナーの尿サンプ
ルのTNF−BP I濃度を測定した。それは、0.78〜4.3μg/
lで多様であった（平均±標準偏差:2.2±1.2μg/l）。
雌性（2.1±1.4μg/l;n＝９）と雄性（2.2±1.0μg/l;n
＝７）のドナー間に有意な差は見られなかった。Example 6 The sandwich ELISA developed in Example 3 specific for urine samples was used to measure TNF-BP I concentrations in urine samples from 16 normal donors. It is 0.78-4.3 μg /
It varied in l (mean ± standard deviation: 2.2 ± 1.2 μg / l).
Female (2.1 ± 1.4 μg / l; n = 9) and Male (2.2 ± 1.0 μg / l; n
= 7), no significant difference was found between the donors.
実施例７
ヒト細胞系由来の培養残留物中のTNF−BP Iの測定
開発したELISAがヒト細胞培養により製造されたTNF−
BP Iを検出するのに好適かどうかを測定するために、一
組の細胞系を調査した。一般的に、新鮮な培地での希釈
又は付着細胞の通過の数日後、培地（10％ FCSを含む）
を濃密な培養物から採取した。10％FCSを含有する培地
を、標準希釈液として使用した；アッセイを一段階方法
により行った。TNF−BP Iは、細胞系A549（肺癌;1.1μg
/l）、HeLa（子宮癌（cervical cancer）;0.38μg/l）
及びNamalwa（バーキットリンパ腫;0.25μg/l）の残留
物に検出可能であったが、細胞系U937（細網肉腫）、Eo
L−３（好酸球白血病）、Raji（バーキットリンパ
腫）、HL−60（骨髄性白血病）、U266（骨髄腫）及びLu
KII（エプスタインバーウイルスにより永遠性が与えら
れた（immortalised）Ｂ−細胞系リンパ芽球腫細胞系）
において検出制限値以下であった。初期の結果によると
（ランツ（Lantz）ら、1990b）、TNF−β（10μg/l）の
存在において培養されたHL−60細胞は、増加した量のTN
F−BP Iを放出したことが観察された；この処置の４日
後、0.45μg/lの濃度が達成された。Example 7 Measurement of TNF-BP I in culture residues derived from human cell lines The developed ELISA is a TNF- produced by human cell culture.
A set of cell lines was investigated to determine if it was suitable for detecting BPI. Generally, several days after dilution with fresh medium or passage of adherent cells, medium (containing 10% FCS)
Were harvested from dense cultures. Medium containing 10% FCS was used as a standard diluent; the assay was performed by the one-step method. TNF-BP I is a cell line A549 (lung cancer; 1.1 μg
/ l), HeLa (cervical cancer; 0.38 μg / l)
And Namalwa (Burkitt lymphoma; 0.25 μg / l) were detectable in the residue, but cell lines U937 (reticulosarcoma), Eo
L-3 (eosinophil leukemia), Raji (Burkitt lymphoma), HL-60 (myeloid leukemia), U266 (myeloma) and Lu
KII (B-cell line lymphoblastoma cell line immortalized by Epstein-Barr virus)
Was less than the detection limit value. According to initial results (Lantz et al., 1990b), HL-60 cells cultured in the presence of TNF-β (10 μg / l) showed increased amounts of TN.
It was observed to release F-BP I; after 4 days of this treatment a concentration of 0.45 μg / l was achieved.
実施例８
ａ）TNF−BP Iに対する抗体の結合におけるTNF−αの影
響の測定
TNF−αがTNF−BP Iに対する抗体の結合に影響するか
どうかを測定するために、一段階サンドイッチELISA
を、多くの異なる取りあわせにおいて行った。モノクロ
ーナル抗体の一つを、抗原をぬぐい取るためのコーティ
ング抗体として使用し、一定の量のTNF−BP Iを様々な
濃度のTNF−αの存在下において使用し、さらにセイヨ
ウワサビのペルオキシダーゼで標識した第二のモノクロ
ーナル抗体を使用した。ELISAを、実施例３に記載した
ように実質的に行い：プレートをコーティング緩衝液中
の10μg/mlの抗体でコートし、洗浄し、試験緩衝液で遮
蔽した。（様々な濃度のTNF−αの存在下、）最終濃度5
ng/mlのTNF−BP I及びペルオキシダーゼ結合抗体を用い
た一段階インキュベーションを試験緩衝液において周囲
温度で３時間行った。その後プレートを洗浄し、基質溶
液で発育させ、その後反応を止め、吸収量をプレートリ
ーダーにおいて450nmで測定し、690nmにおける吸収量を
引いた。これらの実験結果を図５に示した：表Ａ〜Ｄ
は、抗体tbp−１、tbp−２、tbp−６及びH398でコート
したプレートの結果を示した；印は、抗体tbp−１（黒
丸）、tbp−２（白丸）、tbp−６（黒長方形）及びH398
（白長方形）のペルオキシダーゼ結合体を表すものであ
る；バックグラウンドシグナル（TNF−BP Iを含まない
もの）をＣで示した。抗体tbp−１及びtbp−６の組合せ
で得られたシグナルは、試験した最も高いTNF−α濃度
により影響されなかった（10μg/ml）。対照してみる
と、tbp−２又はH398を含むすべての組合せは、TNF−α
に感受性であったが、異なる用量−活性比を示した。
（これらの結果は、H398及びtbp−２がTNF−α結合部位
に関連したエピトープを認識するのに対し、tbp−１及
びtbp−６が独立したエピトープを定義することを示す
ものである。）
ｂ）TNF−BP Iに対する抗体の結合におけるTNF−βの影
響の測定
アッセイを、ａ）に記載したような、TNF−βに関す
るモノクローナル抗体tbp−１及びtbp−６を用いて行っ
た。また、TNF−βの場合、10μg/mlの濃度ではアッセ
イは妨害されないことが見出された。Example 8 a) Determination of the effect of TNF-α on the binding of antibodies to TNF-BP I To determine whether TNF-α affects the binding of antibodies to TNF-BP I, a one-step sandwich ELISA.
Was done in many different arrangements. One of the monoclonal antibodies was used as a coating antibody to wipe off the antigen, a constant amount of TNF-BP I was used in the presence of various concentrations of TNF-α and further labeled with horseradish peroxidase. A second monoclonal antibody was used. The ELISA was performed essentially as described in Example 3: Plates were coated with 10 μg / ml antibody in coating buffer, washed and shielded with test buffer. Final concentration 5 (in the presence of various concentrations of TNF-α)
A one-step incubation with ng / ml TNF-BP I and peroxidase-conjugated antibody was carried out in test buffer for 3 hours at ambient temperature. The plate was then washed and grown in substrate solution, then the reaction was stopped and the absorption was measured at 450 nm in a plate reader and the absorption at 690 nm was subtracted. The results of these experiments are shown in Figure 5: Tables AD
Shows the results of plates coated with antibodies tbp-1, tbp-2, tbp-6 and H398; marks show antibodies tbp-1 (black circles), tbp-2 (white circles), tbp-6 (black rectangles). ) And H398
(White rectangle) represents a peroxidase conjugate; background signal (without TNF-BP I) is indicated by C. The signal obtained with the combination of antibodies tbp-1 and tbp-6 was not affected by the highest TNF-α concentration tested (10 μg / ml). In contrast, all combinations containing tbp-2 or H398 resulted in TNF-α
, But showed different dose-activity ratios.
(These results show that H398 and tbp-2 recognize epitopes associated with the TNF-α binding site, whereas tbp-1 and tbp-6 define independent epitopes.) b) Determination of the effect of TNF-β on the binding of antibodies to TNF-BP I The assay was performed with the monoclonal antibodies tbp-1 and tbp-6 for TNF-β as described in a). In the case of TNF-β, it was found that a concentration of 10 μg / ml did not interfere with the assay.
実施例９
モノクローナル抗体の生物学的活性を測定するための細
胞毒性バイオアッセイ
ａ）TNF−αに対するTNF−BP Iの防護効果に関する抗体
の影響
TNF−αの細胞毒性活性を、1986年にクラーマー（Kra
mer）及びカルバー（Carver）により記載された方法を
使用して本質的に測定した。この目的のため、マウスＬ
−Ｍ細胞（ATCCCCL 1.2）をミクロタイタープレート中
で一晩培養し、TNF−α標品を、一連の２倍希釈液に加
え、アクチノマイシンＤを加え、最終濃度１μg/mlを得
た。このプレートを39℃で18〜20時間インキュベート
し、細胞を0.5％クリスタルバイオレットで染色し、吸
収量を540nmで測定された。（細胞のコントロール及び
ブランクの値は、各プレートにおいて４倍で提供され
た）。定義により、細胞の50％を除去する溶液は１ユニ
ット/mlを含むものである。アッセイ条件下において、
使用した組み換えヒトTNF−αの特異的活性は５×107ユ
ニット/mgタンパク質であった;4×104E/mlの固定化した
活性を有する86/659（NIBSC、英国）であるTNF−αに関
する参考標品は、５×104E/mlを示した。中和アッセイ
を、一定の量のTNF−α（最終濃度20E/ml）及び／又は
モノクローナル抗体と１時間37℃で、培地中、TNF−BP
Iの段階希釈液をプレインキュベーティングすることに
より行った。その後、培養液をプレートから移し、プレ
インキュベートしたTNF−α/TNF−BP I/抗体溶液を100
μｌの量において細胞に加えた。プレートを上記のよう
にインキュベートし、染色した。細胞（ED50）に関する
50％防護効果を示すTNF−BP I濃度を図から測定した。
行ったバイオアッセイの結果を図６に示した；印は以下
の結果を示すものである:TNF−BP Iのみ（黒丸；破
線）、以下の濃度で抗体と合わせたTNF−BP I、0.01μg
/ml（白三角）、0.1μg/ml（黒三角）、１μg/ml（白長
方形）、10μg/ml（黒長方形）又は100μg/ml（白
丸）。Example 9 Cytotoxicity Bioassay for Measuring Biological Activity of Monoclonal Antibodies a) Effect of Antibodies on Protective Effect of TNF-BP I Against TNF-α Kra
mer) and Carver. To this end, the mouse L
M cells (ATCC CCL 1.2) were cultured overnight in a microtiter plate, TNF-α preparation was added to a series of 2-fold dilutions and actinomycin D was added to give a final concentration of 1 μg / ml. The plates were incubated at 39 ° C for 18-20 hours, the cells were stained with 0.5% crystal violet and the absorbance was measured at 540 nm. (The control and blank values for cells were provided in quadruplicate on each plate). By definition, a solution that removes 50% of cells contains 1 unit / ml. Under assay conditions,
The specific activity of the recombinant human TNF-α used was 5 × 10 7 units / mg protein; 86/659 (NIBSC, UK) with an immobilized activity of 4 × 10 4 E / ml Reference for TNF-α The standard product showed 5 × 10 4 E / ml. Neutralization assay was performed using a fixed amount of TNF-α (final concentration 20E / ml) and / or monoclonal antibody for 1 hour at 37 ° C, TNF-BP in culture medium.
This was done by preincubating the serial dilutions of I. Then, the culture solution was transferred from the plate, and the preincubated TNF-α / TNF-BP I / antibody solution was added to 100
Cells were added in a volume of μl. Plates were incubated and stained as above. Regarding cells (ED50)
The TNF-BP I concentration showing 50% protective effect was measured from the figure.
The results of the bioassays performed are shown in Figure 6; the marks indicate the following results: TNF-BP I only (black circles; dashed line), TNF-BP I combined with antibody at the following concentrations, 0.01 μg.
/ ml (white triangle), 0.1 μg / ml (black triangle), 1 μg / ml (white rectangle), 10 μg / ml (black rectangle) or 100 μg / ml (white circle).
一定の量のTNF−α（20細胞毒性ユニット/mlに相当す
る400pg/ml）の存在において、半−最大防護（half−ma
ximum protection）は、270±44ng/mlのTNF−BP I濃度
（６つの独立試験の平均）が得られることが見出され
た。モノクローナル抗体tbp−２をTNF−BP Iと一緒に加
えた時、TNF−BP Iの防護効果が減少した：抗体濃度
１、10又は100μg/mlにおいて、半−最大防護に要求さ
れるTNF−BP Iの濃度は、それぞれ380、1,000及び12,00
0ng/mlに増加した。H398は、TNF−BP Iの防護効果を同
様の程度にまで減少した（最終値、840、3,800及び＞2
0,000ng/ml）。（TNFを含まずに100μg/mlまでの量のこ
れらの抗体を用いた細胞を処理することにより、いかな
る種類の細胞毒性活性も生じなかった；また、抗体は、
TNF−BP Iを含まずにTNFの細胞毒性に対して細胞を防護
しないことが見出された。）
しかし、驚くべきことに、抗体tbp−１は、TNF−BP I
の防護効果を増加した。100ng/mlまでの抗体濃度におい
て、細胞は、40ng/mlという低い用量においてTNF−BP I
により完全に保護された。tbp−６は同様であったが、
定量的には活性はより低かった（この抗体はELISAにお
いて低い活性を示し、低い親和性を有すると仮定され
る）。過剰な量の抗体（10μg/ml）の存在下、半−最大
保護は、TNF−BP I濃度7.3±0.5ng/ml（tbp−１）又は5
3±13ng/ml（tbp−６）において見出すことができ、そ
れらは（４つの実験において行われるタイトレーション
により立証された）防護効果において約40倍又は５倍の
増加に相当するものである。同じTNF−α濃度であるがT
NF−BP Iを含まないで行われるコントロール試験におい
て、抗体は活性を示さなかった。In the presence of a constant amount of TNF-α (400 pg / ml, equivalent to 20 cytotoxic units / ml), half-max protection (half-ma
ximum protection) was found to give a TNF-BP I concentration of 270 ± 44 ng / ml (average of 6 independent tests). When the monoclonal antibody tbp-2 was added together with TNF-BP I, the protective effect of TNF-BP I was reduced: TNF-BP required for half-maximal protection at antibody concentrations of 1, 10 or 100 μg / ml. The concentrations of I are 380, 1,000 and 12,00 respectively.
It increased to 0 ng / ml. H398 reduced the protective effect of TNF-BP I to a similar extent (final value, 840, 3,800 and> 2.
0,000 ng / ml). (Treatment of cells with TNF-free amounts of these antibodies up to 100 μg / ml did not result in any kind of cytotoxic activity;
It was found that without TNF-BP I it does not protect cells against the cytotoxicity of TNF. However, surprisingly, the antibody tbp-1 showed that TNF-BP I
Increased the protective effect of. At antibody concentrations up to 100 ng / ml, cells showed TNF-BP I at doses as low as 40 ng / ml.
Fully protected by. tbp-6 was similar,
The activity was quantitatively lower (the antibody showed low activity in the ELISA and is assumed to have low affinity). In the presence of excess amounts of antibody (10 μg / ml), half-maximal protection was achieved with TNF-BP I concentrations of 7.3 ± 0.5 ng / ml (tbp-1) or 5
It can be found at 3 ± 13 ng / ml (tbp-6), which corresponds to an approximately 40-fold or 5-fold increase in protective effect (demonstrated by titration performed in 4 experiments). Same TNF-α concentration but T
In a control test performed without NF-BP I, the antibody showed no activity.
ｂ）TNF−βに対するTNF−BP Iの防護効果についての抗
体の影響
ａ）に記載したように行われるＬ−Ｍ細胞を用いたバ
イオアッセイにおいて、TNF−βの細胞毒性活性は、TNF
−αのものよりも高かった（300E/ng対50E/ng）。ま
た、TNF−BP Iは、TNF−βの同じ細胞毒性量（66pg/ml
に相当する20E/ml）に対する細胞毒性効果の阻害を示し
たが、要求される用量は少なくとも10倍という多量なも
のであった（ED50＝3,800ng/mlであり、TNF−αの270ng
/mlと比較される）。抗体tbp−１及びtbp−６（10μg/m
l）の添加は、TNF−αに関するものと同様の範囲にまで
防護効果を増強した；半−最大防護効果は、それぞれ53
ng/ml及び500ng/mlに達成された。b) Effect of the antibody on the protective effect of TNF-BP I on TNF-β. In the bioassay using LM cells performed as described in a), the cytotoxic activity of TNF-β was determined to be TNF-β.
-Higher than that of α (300E / ng vs 50E / ng). In addition, TNF-BP I is the same cytotoxic amount of TNF-β (66 pg / ml
, But the required dose was at least 10-fold higher (ED50 = 3,800 ng / ml, TNF-α 270 ng).
/ ml). Antibodies tbp-1 and tbp-6 (10 μg / m
The addition of l) enhanced the protective effect to the same extent as for TNF-α; the half-maximal protective effect was 53
Achieved ng / ml and 500 ng / ml.
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:91 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＥＣＡＣＣ ９１１１２８１１ 微生物の受託番号 ＥＣＡＣＣ ９１０６０５５６ (56)参考文献 特開 平２−154695（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−213670（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−192662（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開412486（ＥＰ，Ａ １) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏ ｌ．143，（1991）ｐ. Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．87，（1991）ｐ. 3127−3131 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 5/20 A61K 39/395 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (51) Int.Cl. 7 Identification Code FI C12P 21/08 G01N 33/577 B G01N 33/53 C12R 1:91 33/577 C12N 5/00 B // (C12P 21/08 15/00 C C12R 1:91) Accession number for microorganisms ECACC 91112811 Accession number for microorganisms ECACC 91060556 (56) References JP-A 2-154695 (JP, A) JP-A 61-213670 (JP, A) JP Sho 62-192662 (JP, A) European Patent Application Publication 412486 (EP, A 1) Journal of Immunological Methods, Vol. 143, (1991) p. Proc. Nalt. Acad. Sc i USA, Vol. 87, (1991) p. 3127-3131 (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) C12P 21/08 C12N 5/20 A61K 39/395 G01N 33/577 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)
Claims (19)
60555）により分泌されるtbp−１及びハイブリドーマ細
胞系TBP−６（ECACC 91112811）により分泌されるtbp−
６、と呼称されるヒトTNF−BPIに対するモノクローナル
抗体、又はその抗原結合性断片。1. A hybridoma cell line TBP-1 (ECACC 910
60555) and tbp-secreted by the hybridoma cell line TBP-6 (ECACC 91112811).
6, a monoclonal antibody against human TNF-BPI, or an antigen-binding fragment thereof.
5（TBP−１）及び91112811（TBP−６）で寄託されてい
るハイブリドーマ細胞系TBP−１及びTBP−６。Claim 2: In ECACC, the deposit number is 9106055 respectively.
Hybridoma cell lines TBP-1 and TBP-6 deposited at 5 (TBP-1) and 91112811 (TBP-6).
tbp−１と接触させ、サンプルに含まれるTNF−BP Iとtb
p−１との２成分系又は３成分系複合体の形成を測定す
ることを特徴とする、サンプルにおけるTNF−BP Iの測
定方法。3. The antibody according to claim 1, which is a sample.
Contact with tbp-1 and add TNF-BP I and tb contained in the sample
A method for measuring TNF-BP I in a sample, which comprises measuring the formation of a binary or ternary complex with p-1.
測定することを特徴とするサンプルにおけるTNF−BP I
の測定方法であって、使用した第一の抗体が請求の範囲
第１項に記載のtbp−１であり、使用した第二の抗体がt
bp−１と抗体／抗原／抗体複合体を形成することができ
る抗体である方法。4. TNF-BP I in a sample characterized by measuring the formation of a ternary antibody / antigen / antibody complex.
And the second antibody used is tbp-1 according to claim 1, wherein the second antibody used is tbp-1.
A method which is an antibody capable of forming an antibody / antigen / antibody complex with bp-1.
60556）により分泌されるtbp−２を第二の抗体として使
用することを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の方
法。5. The hybridoma cell line TBP-2 (ECACC 910
Method according to claim 4, characterized in that tbp-2 secreted by 60556) is used as the second antibody.
請求の範囲第３項〜第５項のいずれか１項に記載の方
法。6. The sample is a body fluid,
The method according to any one of claims 3 to 5.
の範囲第６項記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the body fluid is serum.
の範囲第６項記載の方法。8. The method according to claim 6, wherein the body fluid is blood plasma.
範囲第６項記載の方法。9. The method according to claim 6, wherein the body fluid is urine.
特徴とする、請求の範囲第３項〜第５項のいずれか１項
に記載の方法。10. The method according to any one of claims 3 to 5, characterized in that the sample is a cell culture residue.
求の範囲第１項記載のtbp−１と接触させること、 ｂ）ａ）において形成した複合体を、tbp−１と抗体／
抗原／抗体複合体を形成することができる請求の範囲第
５項で定義した抗体tbp−２と接触させ、一方、この工
程で使用した抗体は測定可能な標識を有するものである
こと、 ｃ）形成した抗体／抗原／抗体複合体の量が標識を測定
することにより測定されることを特徴とする、請求の範
囲第４項〜第10項のいずれか１項に記載の方法。11. A) contacting a sample with tbp-1 according to claim 1, which is bound to a carrier, and b) forming the complex formed in a) with tbp-1 and antibody /
Contacting with the antibody tbp-2 as defined in claim 5 capable of forming an antigen / antibody complex, while the antibody used in this step has a measurable label, c) The method according to any one of claims 4 to 10, characterized in that the amount of antibody / antigen / antibody complex formed is measured by measuring the label.
のエピトープ又はその領域を認識する抗体を使用するこ
とを特徴とする、請求の範囲第11項に記載の方法。12. The same TNF-BP I as tbp-2 in b).
12. The method according to claim 11, characterized in that an antibody that recognizes the epitope or region thereof is used.
ことを特徴とする、請求の範囲第11項又は第12項に記載
の方法。13. The method according to claim 11 or 12, characterized in that an enzyme-linked antibody is used in b).
に記載のtbp−１を、他の容器に請求の範囲第５項で定
義した抗体tbp−２を含み、ここで２つの抗体のうちの
１つが個体キャリヤーに結合していてもよく、一方他の
抗体が測定可能な標識を有しており、所望によりtbp−
２がtbp−１と抗体／抗原／抗体複合体を形成すること
ができる他の抗体と置き換えられていてもよいことを特
徴とする、請求の範囲第４項〜第13項のいずれか１項に
記載の方法を実施するためのサンドイッチイムノアッセ
イキット。14. A kit comprising tbp-1 according to claim 1 in one container and the antibody tbp-2 defined in claim 5 in another container, wherein two antibodies are provided. One of them may be attached to a solid carrier, while the other antibody carries a measurable label, optionally tbp-
14. Any one of claims 4 to 13 characterized in that 2 may be replaced by another antibody capable of forming an antibody / antigen / antibody complex with tbp-1. A sandwich immunoassay kit for carrying out the method described in 1.
TNF−BP Iのエピトープ又はオーバーラップしたエピト
ープに結合することを特徴とする、請求の範囲第14項に
記載のキット。15. The antibody replacing tbp-2 is the same as tbp-2.
Kit according to claim 14, characterized in that it binds to an epitope of TNF-BP I or an overlapping epitope.
体tbp−１及びtbp−６と接触させ、サンプルに含まれる
TNF−BP Iと抗体との３成分系複合体の形成を測定する
ことを特徴とする、サンプルにおけるTNF−BP Iの測定
方法。16. A sample is contacted with the antibodies tbp-1 and tbp-6 according to claim 1 and contained in the sample.
A method for measuring TNF-BP I in a sample, which comprises measuring the formation of a ternary complex of TNF-BP I and an antibody.
p−１又はtbp−６と接触させること、 ｂ）ａ）において形成した複合体をtbp−６又はtbp−１
と接触させ、この工程で使用した抗体は測定可能な標識
を有するものであること、 ｃ）形成した抗体／抗原／抗体複合体の量が標識を測定
することにより測定されることを特徴とする、請求の範
囲第16項に記載の方法。17. a) tb having a sample bound to a carrier
contacting with p-1 or tbp-6, b) the complex formed in a) is tbp-6 or tbp-1
And the antibody used in this step has a measurable label, and c) the amount of antibody / antigen / antibody complex formed is measured by measuring the label. The method according to claim 16.
に記載のtbp−１を、他の容器に請求の範囲第１項に記
載の抗体tbp−６を含み、一方２つの抗体のうちの１つ
が個体キャリヤーに結合していてもよく、他の抗体が測
定可能な標識を有していてもよいことを特徴とする、請
求の範囲第17項に記載の方法を実施するためのサンドイ
ッチイムノアッセイキット。18. A kit comprising tbp-1 according to claim 1 in one container and the antibody tbp-6 according to claim 1 in another container, wherein one of two antibodies 18. To carry out the method according to claim 17, characterized in that one of them may be bound to a solid carrier and the other antibody may carry a measurable label. Sandwich immunoassay kit.
ル抗体tbp−１及び／又はtbp−６を含む、TNF−α及び
／又はTNF−βに対する内因性又は外因性TNF−BP Iの防
御効果を増すための製薬組成物。19. A protective effect of endogenous or exogenous TNF-BP I against TNF-α and / or TNF-β, which comprises the monoclonal antibody tbp-1 and / or tbp-6 according to claim 1. A pharmaceutical composition for increasing the body weight.
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