JP3324782B2 - 発現用プロモーターおよびその用途 - Google Patents

発現用プロモーターおよびその用途

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JP3324782B2 JP14057092A JP14057092A JP3324782B2 JP 3324782 B2 JP3324782 B2 JP 3324782B2 JP 14057092 A JP14057092 A JP 14057092A JP 14057092 A JP14057092 A JP 14057092A JP 3324782 B2 JP3324782 B2 JP 3324782B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は新規遺伝子発現用プロモ
ーターおよびその用途に関する。さらに詳しくは、本発
明は脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子のプロモー
ター領域を含有する組換えDNA、当該DNAを含有す
る組換えDNAおよび形質転換体に関する。
【0002】
【従来の技術】動物、特に高等動物では、その発生の時
期より各種器官の分化、成熟がおこり生体の各種機能を
発揮せしめるようになる。この過程で種々の器官特異的
な蛋白質の一過性の、あるいは恒常的な発現がおこり、
器官に特異性を付与することとなる。発生・分化の胎児
期や成熟期に特異的に発現し、作用している蛋白質の遺
伝子にはその時期にのみ作動する転写誘導系(プロモー
ター、エンハンサー)があって、このプロモーター部分
が蛋白質合成を指令するmRNAの転写を制御してい
る。さらにプロモーターにはホルモン依存性や、増殖因
子依存性を示すものも知られており、これらを利用した
薬物スクリーニング系やトランスジェニックマウスが既
に作成されて、薬物のスクリーニングや、生体機能の解
析に利用されている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】従って、発生・分化の
胎児期や成熟期にのみ作動するプロモーター部分を使っ
て、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結
し、これを卵細胞に注入していわゆるトランスジェニッ
ク動物(遺伝子移入動物)を作成すれば、発生・分化の
胎児期や成熟期にのみその蛋白質を合成させ、その生体
での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロ
モーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、こ
れが発現するような細胞株を樹立すれば、BDNFの合
成を促進もしくは抑制する作用を持つ薬剤のスクリーニ
ング系として使用できる。しかし大部分の遺伝子の転写
を指令するプロモーターには明確な発現時期特異性は検
出されず、特異性を示すプロモーターが渇望されてい
る。神経栄養因子は神経細胞の分化、成長および生存に
必須の栄養因子で、これ迄にNGF(Leui-Monntalcin
i, Ann. N. Y. Acad. Sci. 55:330,1952),
NGF−2/NT−3(ヨーロッパ特許出願公開第38
6,752号公報)お よびBDNF(J. Leibrock ら,
Nature 341:149,1989)などが知 られてい
る。このうちBDNFについては、そのmRNAの解析
から、胎生期よ り合成が始まり生後5週目に最も多く
合成されることが示唆されている(Y.Kaisho ら,Bioch
em. Biophy. Res. Commun.,174,379,199
1)。中枢神経系は、神経管から分化した神経細胞(ニ
ューロン)および神経膠細胞(グリア細胞)より構成さ
れ、複雑な機能を営む細胞社会と言える。この神経系で
分化の特定の時期に特異的に機能するプロモーターは機
能分化のための神経特異蛋白質の発現調節機構を解析す
るための手段として有用である。また、種々の遺伝子を
下流に連結させて細胞あるいは動物に移入することによ
り、それらを神経系細胞あるいは脳で特定の時期に特異
的に発現させることが出来る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、発生・分
化の特定の時期に作動するプロモーターとして、BDN
F遺伝子のプロモーターを見い出し、取り出すことを目
標として、ヒトBDNF cDNA断片をプローブとし
て、ヒトBDNFゲノム遺伝子をクローニングした。こ
の遺伝子を制限酵素消化してBDNFをコードしている
構造遺伝子の一部を含むその上流部分2.5kb DNAを
得、これを再びプラスミドDNA上にクローニングし
た。この2.5kb DNAの下流に、リポーター遺伝子と
してのクロラムフェニコールアセチル転移酵素(CA
T)遺伝子を連結したプラスミドDNAを構築し、該D
NAで形質転換されたグリア細胞あるいは他の動物細胞
等の形質転換体でのCAT活性を測定することにより、
BDNF構造遺伝子上流部分2.5kb DNAに、BDN
Fプロモーターを見出すことが出来た。
【0005】本発明者らは、これらの知見に基づきさら
に研究した結果、本発明を完成した。すなわち本発明
は、(1)BDNF遺伝子のプロモーター領域を含有する
組換えDNA、(2)上記(1)記載の組換えDNAを含有
する組換えベクター、(3)下流に構造遺伝子を連結して
いる上記(2)記載の組換えベクター、(4)上記(2)また
は(3)記載のベクターを保持する形質転換体に関するも
のである。上記(1)記載のBDNF遺伝子のプロモータ
ーとしてはヒト由来のものであることが好ましい。また
該プロモーター領域は次の塩基配列 TGCTGGGATGGGGAGGAAGGGGAGAGTTGAAAGCTAGGGGAGCGAGACCTCGGGGCGTGCGATTCTCACTCG CTCCCTCCCGCCCCAGCGCCCACAGCCGGGGTTTCTGCAGAGGGAGAGGGACGCGGGGTTCCCCGGGGCTGA GGCTGGGGCTGGAACACCCCTCGAAGCCGCGGGCGTCCTGTCCAAGGCGCCCCAGGAGGGCGCAGGACTCGC AGGGCGATGTCGCGGGGCCCTAGGGGAGGAGGTGAGGACAGGCCCCGGGGGAGCGGGGAGTTCCGGGCGCCC CTCGGTTTCCCCGCGCGAGGAAAAGACGCGGCGTTCCCTTTAAGCGGCCGCCTCGAACGGGTATCGGTAGCG CGGGCGAGCGGGGAGCGGGGGGCGGGGGGCGGGGGGGGGGGCGGCGCCGTTTGACCAATCGAAGCTCAACCG AAGAGCTAAATAATGTCTGACCCGGGCGCAAG を含有あるいはその一部を含有するものが好ましい。上
記のその一部としては、上記塩基配列の一部であって、
プロモーター活性を有する部分をいう。
【0006】本発明のBDNFのプロモーター領域を含
有する組換えDNAは、たとえばつぎのようにして得る
ことができる。まずネイチャー(Nature),341,1
49(1989)に報告されているブタBDNFのアミ
ノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドをプローブ
として用いて、λgt10ベクターに組み込まれたヒト脳
のcDNAライブラリーをスクリーニングする。こうし
て得られたcDNAの最上流域をプローブとして例えば
ヒト遺伝子ライブラリーをスクリーニングして、このプ
ローブと反応するλファージのクローンを得る。このフ
ァージクローンよりDNAを抽出し、組みこまれている
ヒト遺伝子部分の制限酵素地図を作成し、cDNAの最
上流域プローブと反応する、例えば制限酵素消化による
DNA断片を、例えばプラスミドpUC118(Vieira.
J. and Messing J. (1987),Methods in Enzymolo
gy 153,3−11.)に再クローニングすることが出
来る。クローニングしたDNAの塩基配列を決定し、例
えばcDNAの塩基配列と比較検討することにより遺伝
子上の翻訳開始コドンの位置を知ることができる。ま
た、ヒトmRNAを用いて、例えばSIマッピング法〔B
erk, A. J.,とSharp, P. A., セル(Cell),12,7
21,1977〕を行えば、該遺伝子の転写開始点を知
ることもできる。
【0007】このようにして得られたBDNFのプロモ
ーター領域を含有せしめた組換えDNAを含有する組換
えベクターにおいて、BDNFプロモーターを組み込む
組換え用ベクターとしては、特に限定されないが、たと
えばpCDベクター、cDM8ベクター〔Aruffo, A.とSe
ed, B., プロシージングス オブ ザ ナショナルアカ
デミー オブ サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA),84,8573−8577(1987)〕,
レトロウイルスベクター〔Cone, R. D. と Mulligan,
R. C., プロシージングス オブ ザ ナショナル ア
カデミー オブサイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci,
USA),81,6349−6353(1984)〕な
ど動物細胞用のもの、pUC(Vieira, J. and Messing
J. (1987),Methods in Enzymology 153,3
−11)など大腸菌用のものなどが挙げられる。
【0008】組換えベクターにおいてプロモーター領域
の下流に連結される構造遺伝子としては、種々の遺伝子
産物の発生・分化の胎児期や成熟期における中枢神経系
での機能を知るためのポリペプチドをコードする構造遺
伝子が挙げられる。その例としては、たとえば神経細胞
成長因子(NGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(basi
c FGF)、酸性線維芽細胞成長因子(acidic FG
F)などの神経栄養因子を始めとする他の成長因子、リ
ンホカインなどが挙げられる。上記構造遺伝子として、
後述のレポーター遺伝子を用いてもよい。レポーター遺
伝子としてはCAT(クロラムフェニコール アセチル
トランスフェラーゼ(Chloramphenicol acetyl trans
ferase)遺伝子,アルカリフォスファターゼ遺伝子の他
に、βガラクトシダーゼ遺伝子が汎用されているが、他
のいかなる構造遺伝子であっても、その遺伝子産物の検
出法があれば使用され得る。上記構造遺伝子をベクター
に組み込むには、プロモーター領域の下流に存在する適
当な制限酵素切断部位に、上記構造遺伝子が正しく転写
される方向に連結すればよい。上記組換えベクターによ
り形質転換する宿主としては、動物細胞、特にグリア細
胞や脳神経系の細胞が用いられ得る。また動物個体への
DNA移入への一過程としての卵細胞、あるいはES細
胞〔Evans, M. J. と Kaufman, K. H., ネイチャー(Na
ture),292,154(1981)〕も使用される。
これらの細胞の形質転換の方法としては、リン酸カルシ
ウム法〔Graham ら、ヴィロロジー(Virology)52
456(1973)〕、エレクトロポレーション法〔石
崎ら、細胞工学,,557(1986)〕、マイクロ
インジェクション法などが用いられる。
【0009】本発明のプロモーターを用いることによ
り、脳神経系などの細胞に、前記のような種々のポリペ
プチドを作らせることができる。また上記構造遺伝子と
して myc, ras をはじめとした癌遺伝子を用いると、得
られたベクターを動物(例、マウス,ラット,イヌ,ネ
コ)に投与し、該動物の脳神経系における発生・分化の
胎児期や成熟期に癌をはじめとする特定の病変をひき起
こさせた疾患モデル動物を製造することができる。さら
に、上記構造遺伝子が脳の遺伝的疾患(例、アルツハイ
マー病,パーキンソン病など)の治療に役立つペプチド
をコードするものである場合には、本発明のベクターを
直接、哺乳動物(例、マウス,ラット,イヌ,ネコ,ヒ
ト)の脳内に投与、あるいは培養した脳由来細胞にベク
ターを導入した後に、脳内に移植することにより、該疾
患の治療を行なうことができる。
【0010】また、癌抑制遺伝子を構造遺伝子としてベ
クターを構築し、該ベクターを腫瘍細胞に直接導入する
ことにより、脳腫瘍の治療を行なうことができる。また
さらに、本発明のプロモーターが、脳神経系の細胞にお
いて、特定の化合物によりプロモーター活性のコントロ
ールが行なわれることが分かれば、特定の化合物を生体
の脳に到達するように投与した場合、該特定の化合物の
プロモーター活性のコントロール能を知ることができる
ので、該化合物が脳内におけるBDNF遺伝子のプロモ
ーターを活性化し脳内においてBDNFの産生量を増大
させ、これにより痴呆症の治療を行なうことができる。
上記形質転換体は、該特定の化合物の存在下に培養し、
培養物中の遺伝子産物の量を測定し比較することによ
り、該化合物のプロモーター活性のコントロール能を知
ることができる。
【0011】該形質転換体の培養はそれ自体公知の方法
で行なう。培地としては、たとえば約5〜20%の牛血
清を含むMEM培地〔サイエンス(Science)122
501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー
(Virology),396(1959)〕、RPMI 1
640培地〔ザ ジャーナル オブ ジ アメリカン
メディカル アソシエーション(The Journal of Medic
al Association)199,519(1967)〕、19
9培地〔プロシージング オブ ザ ソサイエティ フ
ォー ザ バイオロジカル メディスン(Proceeding o
f the Society for the Biological Medicine)73
1(1950)〕などが挙げられる。pHは約6〜8で
あるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約1
5〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【0012】本願明細書および図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commision on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性
体がありうる場合は、特に明示しなければL−体を示す
ものとする。 DNA:デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン A,Ala:アラニン C,Cys:システイン D,Asp:アスパラギン酸 E,Glu:グルタミン酸 F,Phe:フェニルアラニン G,Gly:グリシン H,His:ヒスチジン I,Ile:イソロイシン K,Lys:リジン L,Leu:ロイシン M,Met:メチオニン N,Asn:アスパラギン P,Pro:プロリン Q,Gln:グルタミン R,Arg:アルギニン S,Ser:セリン T,Thr:スレオニン V,Val:バリン W,Trp:トリプトファン Y,Tyr:チロシン
【0013】後述の実施例2および実施例3で得られた
形質転換体 Escherichia coli DH1/pTB1429
および Escherichia coli DH1/pTB1528は財
団法人発酵研究所(IFO)および通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所(FRI)にそれぞれ寄託され
ている。受託日および受託番号を次の表1に示す。
【表1】 −−−−−−−──────────────────────────−−− 形 質 転 換 体 IFO FRI ─────────────────────────────────−−− Escherichia coli DH1/pTB 1429 IFO 15180 FERM BP-3427 (1991年5月17日) (1991年 5月29日) Escherichia coli DH1/pTB 1528 IFO 15332 FERM P-12979 (1992年5月28日) (1992年 6月 1日) ─────────────────────────────────−−−
【0014】参考例1 ヒトBDNF cDNAのクロー
ニング ブタゲノムDNA1μg(クロンテック社製)を鋳型と
し、先に報告されているブタゲノムBDNF(J. Leibr
ock ら,Nature 341,149(1989))の塩基
番号169から188までの5'−GACCATCCTTTTCCTTACT
−3’および907から926までの相補鎖である5'
−CACTATCTTCCCCTCTTAAT−3’のオリゴヌ クレオチド
プライマーを用いPCR法(94℃ 1min,60℃
2min,72℃ 3min,30cycles)によりブタBDN
F遺伝子を増幅後 Sau3AI消化し、540bpの断片
を調製しこれをプローブとし、ヒトグリオーマcDNA
ライブラ リー(クロンテック社製)1×107個のファ
ージをプラークハイブリダイゼー ション法によりニト
ロセルロースフィルターを用いてスクリーニングした。
反応は、6×SSC(1×SSC=0.15M NaC
l,0.015M Sodium Citrate),5×Denhalt's
100μg/ml,heat denatured salmon sperumDNA
0.1%SDS中 65℃ 16時間行った。反応後フ
ィルターを2×SSC室 温で5分 3回 更に1×S
SC65℃ 1.5時間洗浄した。洗浄後、フィル ター
のラジオオートグラムをとり(コダックXAR−5フィ
ルム)、プローブに対して反応するファージを探した。
この結果制限酵素EcoRI消化により1.3kbのcDNA
断片を与えるファージλhBDNF #7を得ることがで
きた。 ファージλhBDNF #7のcDNAはヒトB
DNFの全構造領域と約0.3kbの5' および3'非翻訳
領域を含むことが判明した〔図1〕。塩基配列より予想
される ヒトBDNFアミノ酸配列は247アミノ酸残
基よりなり、ブタBDNFと92%の相同性があり、成
熟タンパク質部分と思われる領域は100%一致した。
【0015】実施例1 ヒトBDNFゲノムDNAのク
ローニング 得られたヒトBDNF cDNAの5'非翻訳領域EcoR
I−DraIII 280bp断片〔図1〕をプローブとし、ヒ
トゲノムDNAライブラリー(クロンテックヒト胎盤ゲ
ノムDNA由来)2×106個ファージをスクリーニン
グした。反応は、6×SSC,5×denhalt's 100
μg/ml heat denatured salmon sperum DNA,0.1
%SDS中 65℃ 16時間行なった。反応後フィル
ターを2×SSC室温で15分 2回 更に1×SSC
65℃ 15分 2回洗浄しフィルターのラジオオー
トグラムをとりプローブに対して反応するファージを探
した。その結果、2×106個ファージより4種の陽性
クローンを得ることが出来、サザンブロットハイブリダ
イゼーションによりいずれのクローンもEcoRIの1.
5kb断片がプローブと交差することが示された。そこ
で、このEcoRI1.5kb断片およびその上流約1.6kb
について全塩基配列を決定し、これを〔図2〕,〔図
3〕および〔図4〕の連続したものとして示す。すなわ
ち、ここで得られたヒトBDNF遺伝子5'上流領域を
含む約3.3kbの塩基配列を〔図2〕,〔図3〕および
〔図4〕の連続したものとして示す。〔図2〕,〔図
3〕および〔図4〕に示すように+29〜+294まで
がヒトBDNF cDNA λhBDNF #7の塩基配列
と完全に一致した。 さらにcDNA5'末端より上流に
TATA box 様配列(−26〜−19)、C AAT b
ox 様配列(−49〜−46)が認められたことにより
この領域付近が ヒトBDNF遺伝子のプロモーター領
域であり、+294より下流はイントロンであることが
示された。
【0016】実施例2 ヒトBDNF遺伝子のプロモー
ター活性の検定 クローニングしたゲノムDNA断片がプロモーター活性
をもつことを確認するためにプロモーター活性検査法の
一つであるCATアッセイ法を行った。CATをリポー
ター遺伝子とするプラスミドはpCAT−Basic plasmi
d, pCAT−Enhancer plasmid(プロメガ社製)をベク
ターとした。陽性コントロールにはpCAT−Control p
lasmid(プロメガ社製)を用いた。ヒトBDNFゲノム
遺伝子SacIサイトより上流部分を単離しT4DNAポ
リメラーゼにより平滑化した後HindIIIリンカー(pCAA
GCTTG 宝酒造製)を付加した断片をベクターのCAT遺
伝子上流のHindIIIサイトに導入した。5’上流域の欠
失については TAKARA キロシークエンス用デレーション
キットを用いて行なった。ヒトグリオーマHs683細
胞へのプラスミドの感染は、カルシウムフォスフェイト
法(M. Wigler ら、Cell ,777(1979))
を用いた。感染後10%FCS(fetal calf serum)を
含むDMEM培地で培養し、48時間後に細胞を集め
た。その細胞抽出液についてCAT酵素活性を測定し
た。CAT酵素活性は、細胞抽出液を5mM Acetyl Co
A, 0.25μCi 14C−クロラムフェニコール存在下3
7℃ 4時間反応させた後 酢酸エチルで抽出し、酢酸
エチルを蒸発乾固させた後 15μl 酢酸エチルに溶解
し、その7.5μlを薄層板(メルク社製)にスポットし
た。CHCl3:Methanol=95:1の展開溶媒で展開
させた後 オートラジオグラムをとった。まず、〔図
2〕、〔図3〕および〔図4〕における−2374〜+
11までの2.4kb DNA断片をpCAT−Basic plas
mid に挿入した発現プラスミドpTB1429を構築し
た。このプラスミドpTB1429を保存するため、こ
れを用いて大腸菌DH1を形質転換し、形質転換体E.
coli DH1/pTB1429(IFO 15180,F
ERM BP−3427)を作製した。
【0017】上記プラスミドpTB1429を用いてヒ
トグリオーマHs683細胞を形質転換し、形質転換体
ヒトグリオーマHs683/pTB1429を製造した。
この形質転換体を10%FCSを含むDMEM培地で2
日間培養した後、細胞を集め、その細胞抽出液につい
て、Widen. SG らの方法(J. Biol. Chem. 263,1
6992−16998(1988))を用いてアッセイ
を行なった。結果を〔図5〕および〔図6〕のレーン1
に示す。なお、〔図5〕は用いたプラスミド中に含まれ
るヒトBDNF遺伝子の5’上流領域の範囲を、〔図
6〕はCATアッセイの結果のオートラジオグラムの結
果を示す。〔図6〕に示したように、陽性コントロール
(〔図6〕においてレーンPとして示す。)として使用
したSV40初期プロモーターの支配下に発現されたC
AT活性よりは低いものの明らかなCAT活性が観察さ
れ、このゲノムDNA断片中に functional なプロモー
ター活性をもつDNA断片が存在することが確認され
た。次に、いわゆるサイレンサー エンハンサー等の存
在による活性発現制御がなされているかを知るために種
々の deletion mutant を構築し、同様のCATアッセ
イを行なった。結果を〔図5〕および〔図6〕に示す。
〔図5〕および〔図6〕において、レーン1から8はそ
れぞれpTB1429,pTB1430,pTB143
2,pTB1433,pTB 1434,pTB1435,
pTB1436,pTB1437をそれぞれトランス フ
ェクトした時の結果を示す。なお、pTB1430は、
−2158〜+11ま での領域を、pTB1432は、
−1751〜+11までの領域を、pTB1433は、
−1493〜+11までの領域を、pTB1434は、
−908〜+11 までの領域を、pTB1435は、−
699〜+11までの領域を、pTB1436は、−4
63〜+11までの領域を、pTB1437は、−30
8〜+11ま での領域を、それぞれpCAT−Basic
プラスミドに導入したベクターである。 〔図5〕およ
び〔図6〕に示すように、−463〜+11より上流側
では互いに顕著な差がなくCAT活性が観察されたのに
対して、−308〜+11ではその活性が認められなか
った。さらに、−308〜+11 DNA断片をSV4
0のエンハンサーをもつCATベクターpCAT−Enhan
cer plasmid に導入し同様のアッセイを行なったところ
陰性コントロールの約10倍の活性が認められた〔図
7〕。〔図7〕のレーンPは陽性コントロール(pCA
T−Control plasmid)を、レーンNは陰性コントロー
ル(pCAT−Enhancer plasmid)を、レーン1から3
は−699〜+11,− 463〜+11,−308〜
+11までのヒトBDNF遺伝子断片をそれぞ れp C
AT−Enhancer plasmid に導入したpTB1438,p
TB1439,pTB1 440をトランスフェクトした
時の結果をそれぞれ示す。以上のことから、ヒトBDN
F遺伝子プロモーター中には はっきりとしたサイレン
サーは存在せず、コアのプロモーター活性としては−3
08までで充分であること、また−463〜−308の
領域にエンハンサー活性をもつ部分が存在していること
が示唆されていると考えられた。
【0018】実施例3 ヒトBDNFプロモーター−アルカリフォスファターゼ
融合プラスミドを導入したヒトグリオーマHs683安
定株の確立 アルカリフォスファターゼをリポーター遺伝子とするプ
ラスミドの構築は〔図8〕および〔図9〕に示した。
【化1】 ,1−10(1988))の EcoRI−KpnI
2.0Kbp断片を単離し、T4DNAポリメラーゼに
より平滑化した後、EcoRIリンカー(pGGAAT
TCC 宝酒造製)を付加した断片をベクターpTB3
89(Y.Onoら、Science 236,1116−1120
(1987))のEcoRI サイトに導入したpTB
1330を構築した。次にpTB1330のHindII
I−XhoI 4.7kbを単離しT4DNAポリメラー
ゼにより平滑化した後、T4DNAライゲースにより結
合したpTB1329を構築しこれをベクターとした。
ヒトBDNFゲノム遺伝子EcoRI−SacI 0.
7kbpを単離し、T4DNAポリメラーゼにより平滑
化した後HindIIIリンカー(pCAAGCTTG
宝酒造製)を付加した断片をベクターのアルカリフォス
ファターゼ遺伝子上流のHindIIIサイトに導入した
pTB1528を構築した。このプラスミドpTB15
28を保存するため、 これを用いて大腸菌DH1を形質
転換し、形質転換体E.coli DH1/pTB1528
(IFO 15332,FERMP−12979)を作
製した。薬剤耐性マーカーはneo遺伝子を持つpTB
6(R.Sasadaら、Cell Structure and Function 12,
205−217(1987))を用いた。pTB152
8とpTB6をヒトグリオーマHs683細胞へ同時に
感染させ感染後48時間後より500μg/mlG41
8(O-2-Amino-2,7-dideoxy-D-glycero-α-D-glucohept
opyranosyl[1→4]-O-3-deoxy-4C-methyl-3-[methylamin
o]-β-L-arabinopyranosyl-D-streptamine、 シグマ
社),10%FCS( fetal calf Serum )を含むDM
EM培地で培養し、ネオマイシン耐性株を取得した。
取得したネオマイシン耐性株より、アルカリフォスファ
ターゼを安定に発現する2個のクローンを得た。 アル
カリフォスファターゼ活性は、p−nitrophenylphosphat
e を基質としA405吸光度の増加として測定した。培養
上清を65℃5分処理後12000×g 5分遠心した
上清100μlを1×SEAPアッセイバッファー
(1.0M diethanolamine, pH9.8,0.5mM M
gCl2,10mM L−homoarginine )に調整し、最
終量を200μlとした。96−wellマイクロタイ
タープレートに入れ、20μlの120mM p−nitrop
henylphosphate (in 1×SEAP assay Buffer)を加え
405を測定した。アルカリフォスファターゼ1mU
は、1pmole基質を1分間に加水分解するアルカリ
フォスファターゼの量とし、1mU=0.04ΔA405
/minで示される。〔図10〕には取得した2個のクロ
ーン(Hs683/pTB1528−1およびHs68
3/pTB1528−2)について細胞の増殖曲線とア
ルカリフォスファターゼ活性を示した。
【0019】
【発明の効果】本発明のBDNFのプロモーターは、遺
伝子を効率良く発現させる作用を有するので、疾患モデ
ル動物の作製、生体の疾患の治療,薬剤スクリーニング
系の設定などにおいて用いるベクターに組込むプロモー
ターとして使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】は、参考例1で得られたクローン化されたヒト
BDNF cDNAの塩基配列、およびこれから翻訳され
るアミノ酸配列を示す。
【図2】は、実施例1で得られたヒトBDNF遺伝子
5’上流領域の−2373〜−1294までの塩基配列
を示す。
【図3】は、実施例1で得られたヒトBDNF遺伝子
5’上流領域の−1293〜−214までの塩基配列を
示す。
【図4】は、実施例1で得られたヒトBDNF遺伝子
5’上流領域を含む−213〜+879までの塩基配列
を示す。
【図5】は、用いたプラスミド中に含まれるヒトBDN
F遺伝子の5’上流領域の範囲を示す。
【図6】は、実施例2で得られた、CATアッセイの結
果のオートラジオグラムを示す。
【図7】は、実施例2で得られた、CATアッセイの結
果のオートラジオグラムを示す。
【図8】は、実施例3で得られた、プラスミドpTB1
329の構築図を表す。
【図9】は、実施例3で得られた、プラスミドpTB1
528の構築図を表す。
【図10】は、実施例3で得られた、2個のクローンに
ついて細胞の増殖曲線とアルカリフォスファターゼ活性
の結果を表す。
【符号の説明】
Aは、増殖曲線を表わす。 Bは、アルカリ性フォスファターゼ活性を表わす。 ●は、Hs683/pTB1528−1の結果を表す。
【化2】
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−262995(JP,A) 特開 昭61−132185(JP,A) 特開 昭60−259188(JP,A) Leibrock J.et al, Molecular cloning and expression of brain−derived neur otrophic factor,Na ture,英国,1989年 9月14日,V ol.341,149−152 Kaisho Y.et al,Re gional expression of the nerve growt h factor gene fami ly in rat brain du ring development,B iochem.Biophys.Re s.Commun.,米国,1991年 1 月15日,Vol.174,No.1,379− 385 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 CA(STN) GenBank/EMBL/DDBJ/G eneSeq BIOSIS/MEDLINE/WPID S(STN) PubMed

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 脳由来神経栄養因子(BDNF)のプロ
    モーター領域が次の配列 TGCTGGGATGGGGAGGAAGGGGAGAGTTGAAAGCTAGGGGAGCGAGACCTCGGGGCGTGCGATTCTCACTCG CTCCCTCCCGCCCCAGCGCCCACAGCCGGGGTTTCTGCAGAGGGAGAGGGACGCGGGGTTCCCCGGGGCTGA GGCTGGGGCTGGAACACCCCTCGAAGCCGCGGGCGTCCTGTCCAAGGCGCCCCAGGAGGGCGCAGGACTCGC AGGGCGATGTCGCGGGGCCCTAGGGGAGGAGGTGAGGACAGGCCCCGGGGGAGCGGGGAGTTCCGGGCGCCC CTCGGTTTCCCCGCGCGAGGAAAAGACGCGGCGTTCCCTTTAAGCGGCCGCCTCGAACGGGTATCGGTAGCG CGGGCGAGCGGGGAGCGGGGGGCGGGGGGCGGGGGGGGGGGCGGCGCCGTTTGACCAATCGAAGCTCAACCG AAGAGCTAAATAATGTCTGACCCGGGCGCAAG を含有する組換えDNA。
  2. 【請求項2】 脳由来神経栄養因子(BDNF)のプロ
    モーター領域が次の配列 GCTGGGATGGGGAGGAAGGGGAGAGTTGAAAGCTAGGGGAGCGAGACCTCGGGGCGTGCGATTCTCACTCGC TCCCTCCCGCCCCAGCGCCCACAGCCGGGGTTTCTGCAGAGGGAGAGGGACGCGGGGTTCCCCGGGGCTGAG GCTGGGGCTGGAACACCCCTCGAAGCCGCGGGCGTCCTGTCCAAGGCGCCCCAGGAGGGCGCAGGACTCGCA GGGCGATGTCGCGGGGCCCTAGGGGAGGAGGTGAGGACAGGCCCCGGGGGAGCGGGGAGTTCCGGGCGCCCC TCGGTTTCCCCGCGCGAGGAAAAGACGCGGCGTTCCCTTTAAGCGGCCGCCTCGAACGGGTATCGGTAGCGC GGGCGAGCGGGGAGCGGGGGGCGGGGGGCGGGGGGGGGGGCGGCGCCGTTTGACCAATCGAAGCTCAACCGA AGAGCTAAATAATGTCTGACCCGGGCGCAAGGCGCAGCCTGG を含有する組換えDNA。
  3. 【請求項3】 脳由来神経栄養因子(BDNF)のプロ
    モーター領域が次の配列 AACACCCCTCGAAGCCGCGGGCGTCCTGTCCAAGGCGCCCCAGGAGGGCGCAGGACTCGCAGGGCGATGTCG CGGGGCCCTAGGGGAGGAGGTGAGGACAGGCCCCGGGGGAGCGGGGAGTTCCGGGCGCCCCTCGGTTTCCCC GCGCGAGGAAAAGACGCGGCGTTCCCTTTAAGCGGCCGCCTCGAACGGGTATCGGTAGCGCGGGCGAGCGGG GAGCGGGGGGCGGGGGGCGGGGGGGGGGGCGGCGCCGTTTGACCAATCGAAGCTCAACCGAAGAGCTAAATA ATGTCTGACCCGGGCGCAAGGCGCAGCCTGG を含有する組換えDNA。
  4. 【請求項4】 プロモーター領域がヒト由来である請求
    項1ないし請求項3記載の組換えDNA。
  5. 【請求項5】 請求項1ないし請求項4記載の組換えD
    NAを含有する組換えベクター。
  6. 【請求項6】 下流に構造遺伝子を連結している請求項
    5記載の組換えベクター。
  7. 【請求項7】 請求項5または請求項6記載の組換えベ
    クターを保持する形質転換体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Kaisho Y.et al,Regional expression of the nerve growth factor gene family in rat brain during development,Biochem.Biophys.Res.Commun.,米国,1991年 1月15日,Vol.174,No.1,379−385
Leibrock J.et al,Molecular cloning and expression of brain−derived neurotrophic factor,Nature,英国,1989年 9月14日,Vol.341,149−152

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