JP3279702B2 - ウイルス検査用試薬及びそれを用いた検査方法 - Google Patents

ウイルス検査用試薬及びそれを用いた検査方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はウイルスのDNAを用い
た検出試薬とそれを用いた検査方法に関し、とくに、ヘ
ルペス検査用試薬及びそれを用いた検査方法に関する。
【0002】
【従来の技術】ヘルペスウイルスに属するウイルスに
は、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)、同2型(H
SV2)、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)、エプシ
ュタイン−バール(Epstein-Barr)ウイルス(EB
V)、水痘・帯状疱疹ウイルス(バリセラ−ゾスター
(Varicella-Zoster))ウイルス(VZV)等6種が知
られている。これらヘルペスウイルスは体内に潜伏し、
免疫不全状態で再活性化し、様々な症状を引き起こすこ
とが医学上の問題になっている。一部のヘルペスウイル
スについて効果のある抗ウイルス剤が開発されて以来、
早期診断の必要性が高まってきている。ウイルス感染症
の診断では分離培養が基本であるが、ヘルペスウイルス
については増殖に時間がかかるなどの問題があった。ウ
イルスを分離培養せずにその遺伝子によって迅速に検出
する方法として特開昭62-217161号公報に記載されてい
るPCR(ポリメラーゼ チエーン リアクション(Pol
ymerase Chain Reaction))法がある。この方法は2本
鎖DNAの各単鎖と各々相補的なオリゴヌクレオチドで
ある2種類のプライマーを使用して、特定の核酸配列部
位を増幅するものである。すなわち、まず、サンプルか
ら鋳型となる2本鎖DNAを準備し、各単鎖のDNAに
2種類のプライマーをハイブリダイズさせ、DNAポリ
メラーゼを作用させて各プライマーから相補鎖を伸長さ
せる。さらに、得られた2本鎖の延長生成物に対し、上
記の操作を複数回繰り返すことにより、上記2本鎖DN
Aにおける各プライマー間にはさまれ、かつ検出しよう
とする領域を有するDNA断片を数時間で増幅して得る
ことができる。PCRで得られたDNAは、分離用の担
体としてポリアクリルアミドやアガロース等のゲルを用
いて、電気泳動によって分子量分離した後、エチジウム
ブロマイド等の色素で染色して蛍光により可視化するこ
とで検出できる。あるいは、得られるDNAの配列が予
想できる場合は、ブロッティングすなわちPCR産物D
NAをナイロン等の膜に転写後、相補な配列を持つラジ
オアイソトープでラベルしたプローブをハイブリダイズ
させ、オートラジオグラフをとる操作で検出することが
できる。このPCR法ではプライマーの塩基配列を選択
することにより、種々のDNA領域を特異的に増幅する
ことができる。PCRでヘルペスウイルスの検出を行う
には、従来はそれぞれに特異的なプライマーを用いて増
幅を行っていた(蛋白質核酸酵素、35巻、17号、(1990)
3025頁から3033頁、3048頁から3054頁、3034頁から3040
頁)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】複数種のヘルペスウイ
ルスの検出をPCRで行うには、従来はそれぞれのウイ
ルスに特異的なプライマーを用意し反応する必要があ
り、試薬コストや試料調製の手間が多いという課題があ
った。また、HSV1、HSV2のゲノムは70%前後の
高いGC含量を持つため、通常の反応条件ではPCRが
困難である。このようなGC含量が高いDNAに対して
は、10%(v/v)グリセロール等の有機溶媒を加えることに
より反応が進みやすくなることが報告されているが(ア
ンプリフィケーションズ、5号、(1990)16頁から17頁(A
MPLIFICATIONS、5、(1990)、pp16-17))、これらの添
加剤はGC含量が高くない他のDNAに対しては阻害的
に作用するので、GC含量の異なる複数種のヘルペスウ
イルスを同時にPCRすることは容易ではないという課
題があった。上記の課題を解決することができれば、複
数種のヘルペスウイルスを1組のプライマーを用いて検
出することが可能になり、ヘルペスウイルスの検査を低
コスト化、簡便化、迅速化することに寄与できる。
【0004】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに鋭意研究を行った結果、複数のヘルペスウイルスD
NAを共通のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて
PCR増幅し、上記の課題を解決できることを見出し
た。すなわち本発明は、複数のヘルペスウイルスゲノム
の塩基配列を調べ、これらウイルス群に類似塩基配列が
あることを発見し、この類似塩基配列に基づいた共通塩
基配列プライマーを設計し、共通塩基配列プライマーを
複数のヘルペスウイルスのPCR増幅に用いるものであ
る。得られたPCR産物を塩基長で識別し、ウイルスを
同定することでヘルペスウイルスの検査を行うものであ
る。本発明におけるヘルペス検査用試薬は上記のオリゴ
ヌクレオチドプライマーである。本発明において、複数
のヘルペスウイルスDNAをPCR増幅するためのプラ
イマーの塩基配列は、複数のヘルペスウイルスゲノム上
に数十から数百塩基離れた2か所に位置する共通する類
似塩基配列である必要があり、さらに得られるPCR産
物が塩基長で識別できるように、2つのプライマーに挟
まれる領域の塩基長が異なることが条件である。塩基長
の差は、電気泳動で容易に識別するためには数十塩基以
上あることが好ましく、少なくとも10塩基は必要であ
る。
【0005】本発明におけるプライマーは上記の条件を
満たすように、類似塩基配列を持つことが期待できるD
NAポリメラーゼをコードする領域に注目し、塩基配列
のホモロジーの高いHSV1とHSV2を増幅産物の塩
基長で区別できるようにHSV1とHSV2間で挿入・
欠失がある領域をはさみ、かつ、CMV、EBV、VZ
Vにも共通するような領域を検索し設計を行ったもので
ある。ただし、EBVとVZVは相互のホモロジーが低
いため、HSV1、HSV2、CMVに共通し、かつ、
EBVまたはVZVのいずれか一方の計4種に共通する
塩基配列をそれぞれ選択した。複数のヘルペスウイルス
ゲノムから見出した類似塩基配列に基づくプライマーの
塩基配列の各ヘルペスウイルスゲノムの塩基配列とのミ
スマッチの許容範囲は、同一領域の塩基配列の異なる複
数のプライマーについてPCRを行い調べた結果、原則
として各ウイルスゲノムの塩基配列と3’末端からの異
なる塩基の総数が5塩基目までは1以下であり、10塩
基目までは2以下であり、15塩基目までは3以下であ
ることが好ましいことを見出した。しかし、この範囲外
であってもプライマーとして動作可能であれば良く、範
囲を制限するものではない。例えば、ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ、18巻、1990年、999頁から1005頁(N
ucleic Acids Res.、18、(1990)、pp999-1005)に記載
のように、プライマーの3’末端にTまたはTT等が付
加されても、反応に影響の少ないことが報告されてい
る。本発明の主旨は複数種のウイルスゲノム中から見出
した類似塩基配列を共通プライマーとして使用すること
にある。
【0006】上記のプライマーの全体の長さは、特に制
限されるものではないがウイルスDNAの目的領域と高
い特異性を持たせるためには17mer以上のオリゴヌクレ
オチドであることが好ましい。上記のプライマーは混合
して使用することも可能である。本発明の複数のヘルペ
スウイルスゲノムから見出した類似塩基配列に基づくプ
ライマー組の例として、HSV1、HSV2、CMV、
EBVに対して使用できるものとしてプライマーHP1
(配列番号14)とHP2(配列番号15)、プライマーH
P3(配列番号16)とHP2(配列番号15)、HSV
1、HSV2、CMV、VZVに対して使用できるもの
として、プライマーHP6(配列番号18)とHP4(配
列番号17)が挙げられる。また、本発明の上記のプラ
イマーを用いて、5種のヘルペスウイルスがPCR可能
な反応条件を調べた結果、GC含量の大きく異なる5種
のヘルペスウイルスを増幅するには、適当なDNAの変
性剤の添加が必要であり、グリセロールを変性剤として
用いる場合は、HSV1とHSV2については4%-10%(v
/v)、VZVは0%-4%(v/v)、CMVとEBVは0%-10%(v/
v)の範囲で良好なPCR増幅が可能であり、4%(v/v)前
後のグリセロールの添加により、5種のヘルペスウイル
スが全てPCR増幅できることを新たに見出した。変性
剤は、グリセロールに限らずジメチルスルホキシド等、
他の水溶性有機溶媒なども使用可能である。以上説明し
た本発明の手段がヘルペス以外の他のウイルスにも同様
に適用可能であることはいうまでもない。
【0007】
【作用】本発明のヘルペス検査用試薬の作用を例を挙げ
て説明する。配列番号1の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドは、HSV1(配列番号1)、HSV2(配列番
号4)、CMV(配列番号7)及びEBV(配列番号10)
の各ゲノムDNAの1部に共通な類似塩基配列を持ち、
配列番号2の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、
HSV1(配列番号2)、HSV2(配列番号5)、CMV
(配列番号8)、EBV(配列番号11)及びVZV(配列
番号12)の各ゲノムDNAの1部に共通な類似塩基配
列を持ち、配列番号3の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドは、HSV1(配列番号3)、HSV2(配列番号
6)、CMV(配列番号9)及びVZV(配列番号13)の
各ゲノムDNAの1部に共通な類似塩基配列を持ち、そ
れぞれのウイルスのゲノムDNAに相補的に結合し、P
CRプライマーとして機能する。それぞれのウイルスの
ゲノムにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
挟まれる領域の塩基長は異なるので、得られる伸長反応
産物の長さはウイルスごとに異なり、例えば、配列番号
1の1部である配列番号14のオリゴヌクレオチドと配
列番号2の1部である配列番号15のオリゴヌクレオチ
ドによって、HSV1、HSV2、CMV及びEBVの
ゲノムから、それぞれ325bp、 337bp、 442bp、 178bp
のPCR産物が得られる。同様に配列番号3の1部であ
る配列番号18のオリゴヌクレオチドと配列番号2の1
部である配列番号17のオリゴヌクレオチドによって、
HSV1、HSV2、CMVおよびVZVのゲノムか
ら、それぞれ371bp、 383bp、 488bp、 323bpのPCR
産物が得られる。これらのPCR産物は電気泳動等の方
法で塩基長を確認することで、もとの試料中に含まれる
ウイルスを同定できる。
【0008】
【実施例】本発明の実施例を説明する。以下に示す手順
で、本発明のヘルペスウイルス検査用試薬を使用してヘ
ルペスウイルスDNAの検出を行った。ヘルペスウイル
スDNAを含む試料1から試料5を用意し、以下の反応
に使用した。試料1、試料2、試料5は、それぞれHS
V1、HSV2、VZVを含む患部拭い液を、試料3、
試料4は、それぞれCMV、EBVの細胞培養上清を、
各々アルカリ処理したものを用いた。アルカリ処理は以
下の手順で行った。10μl(マイクロリットル)の試料
液に同体積の0.25M KOH水溶液を加え、65°Cで10分
加熱する。その後、0.25M Tris-HCl(pH7.8)を30μl
(マイクロリットル)加え、中和する。試料1から5の
アルカリ処理液について以下の手順でPCRを行った。
配列番号14のプライマーHP1と配列番号15のプラ
イマーHP2を各10pmol、その他、200μM各dNTP、1.5m
M MgCl2、10mM Tris-HCl(pH8.5)、50mM KCl、0.001%(w/
v)ゼラチン、4%(v/v)グリセロール(各々最終濃度)に
なるように添加する。耐熱性DNAポリメラーゼ(パー
キイン−エルマ−シータス(Perkin-Elmer-Cetus)社
製)を1.25ユニット加え、蒸留水を全体で25μl(マイ
クロリットル)になるように加える。上記のウイルスD
NA試料を2.5μl(マイクロリットル)加えた後、蒸
発防止用のミネラルオイルを1滴重層し、サーマルサイ
クラー(パーキイン−エルマ−シータス(Perkin-Elmer
-Cetus)社製)を使用して、97℃、20秒、53℃、30秒、
77℃、60秒の熱サイクルを45回繰返した。得られた試料
1から試料5のPCR産物溶液のうち5μl(マイクロ
リットル)を、3%ニュシーブ(NuSieve)(FMC社製)、1
%アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマ
イド染色して、紫外光照射下で観察した。その結果、試
料1から4のPCR産物について、シングルバンドが確
認でき、試料1から試料4のPCR産物の塩基長はDN
A分子量マーカーから推測し、それぞれ期待される塩基
長である325bp、 337bp、 442bp、 178bpであると確認
でき、試料1から試料4のPCR産物がそれぞれHSV
1、HSV2、CMV、EBVのウイルスゲノムの増幅
産物であることが確認できた。以上のように、本実施例
では、試料1から試料4にそれぞれ含まれていたHSV
1、HSV2、CMV、EBV各ウイルスが、本発明の
ヘルペスウイルス検査用試薬である配列番号14のプラ
イマーHP1と配列番号15のプライマーHP2を使用
して検出できることが確認できた。また、同様に配列番
号17のプライマーHP4と配列番号18のプライマー
HP6を使用しPCR増幅し、電気泳動で同様の分析を
行った結果、試料1、試料2、試料3、試料5のPCR
産物について、シングルバンドが確認でき、試料1、試
料2、試料3、試料5のPCR産物の塩基長はDNA分
子量マーカーから推測し、それぞれ期待される塩基長で
ある371bp、 383bp、 488bp、 323bpであると確認で
き、試料1、試料2、試料3、試料5のPCR産物がそ
れぞれHSV1、HSV2、CMV、VZVのウイルス
ゲノムの増幅産物であることが確認できた。以上のよう
に、本実施例では、試料1、試料2、試料3、試料5に
それぞれ含まれていたHSV1、HSV2、CMV、V
ZV各ウイルスが、本発明のヘルペスウイルス検査用試
薬である配列番号17のプライマーHP4と配列番号3
のプライマーHP5を使用して検出できることが確認で
きた。
【0009】
【発明の効果】本発明によれば、複数種のヘルペスウイ
ルス(HSV1、HSV2、CMVとEBV、VZVの
いずれかの計4種)を1組のプライマーを用いてPCR
増幅して検出、同定することが可能である。
【0010】これによって、上記ヘルペスウイルスのD
NAを用いた検査についての試薬コストと検査に必要な
反応操作の回数を低減できる。
【0011】[配列表] 配列番号 :1 配列の長さ:27 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :GGGGTACAGGCTGGCAAAG
TCGAACAC 配列番号 :2 配列の長さ:26 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :ACCATCTACGACGGCCAGC
AGATCCG 配列番号 :3 配列の長さ:29 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :AGCGTGCTGAAGCACAGGT
TGTGGGCCTG 配列番号 :4 配列の長さ:27 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :GGGGTACAGGCTGGCAAAG
TCAAACAC 配列番号 :5 配列の長さ:26 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :ACCATCTACGACGGCCAGC
AGATCCG 配列番号 :6 配列の長さ:29 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :AGCGTACTGAAGCACAGGT
TGTGGGCCTG 配列番号 :7 配列の長さ:27 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :AGGGTAGAGGCTGGCAAAG
TCGAACAC 配列番号 :8 配列の長さ:26 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :GTCATCTTTGACGGACAGC
AGATCCG 配列番号 :9 配列の長さ:27 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :AGGGTGGAGTAGCAGAGGT
TGTGGGCC 配列番号 :10 配列の長さ:27 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :CGGGTAGAGGCTGGCAAAG
TCCACCAC 配列番号 :11 配列の長さ:26 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :GTGCTGGACGATGGGCAGC
AGATCCG 配列番号 :12 配列の長さ:22 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :GCTATTTACGACGGACAGC
AG 配列番号 :13 配列の長さ:29 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :AGCGTGGTAAAACATAAGT
TATGGGCCTG 配列番号 :14 配列の長さ:21 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :CAGGCTGGCAAAGTCGAAC
AC 配列番号 :15 配列の長さ:21 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :CTACGACGGCCAGCAGATC
CG 配列番号 :16 配列の長さ:21 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :GGGGTACAGGCTGGCAAAG
TC 配列番号 :17 配列の長さ:21 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :ACCATCTACGACGGCCAGC
AG 配列番号 :18 配列の長さ:24 配列の型 :核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成DNAプライマー 配列 :GTGCTGAAGCACAGGTTGT
GGGCC
フロントページの続き (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪1丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (72)発明者 古山 宏子 東京都国分寺市東恋ケ窪1丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (72)発明者 杉浦 正彦 東京都杉並区高円寺南1丁目34番5号 株式会社 ビー・エム・エル内 (72)発明者 山口 敏和 東京都杉並区高円寺南1丁目34番5号 株式会社 ビー・エム・エル内 (56)参考文献 Rozenberg,F.et a l.,Amplification a nd Characterizatio n of Herpesvirus D NA in Cerebrospina l Fluid from Patie nts with Acut,J Cl in Microbiol,Vol. 29,No.11,p.2412−2417 Tsurumi,T.et al., Nucleotide sequenc e of the DNA polym erase gene of herp es simplex virus t ype 2 and comparis on with th,Gene,Vo l.52,No.2−3,p.129−137 Kouzairides,T.et al.,Sequence and t ranscription analy sis of the human c ytomegalivirus DNA polymerasse gene, J Virol,Vol.61,No. 1,p.125−133 Larder,B.A.et a l.,Related functio nal domains in vir us DNA polymerase s,EMBO J,Vol.6,No. 1,p.169−175 Kostman,J.R.et a l.,Molecular epide miology of Pseudom onas cepacia deter mined by polymeras e chain reaction r ibotyping,J Clin M icrobiol,Vol.30,No. 8,p.2084−2087 Kwok,S.et al.,Eff ects of primer−tem plate mismatches o n the polymerase c hain reaction: hum an immunodeficienc y virus,Nucleic Ac ids Res,Vol.18,No. 4,p.999−1005 Vilcek,S.,Detecti on of the bovine h erpesvirus−1(BHV− 1)genome by PCR,J Virol Methods,Vol. 41,No.2,p.245−247 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12Q 1/68 - 1/70 C12N 15/33 - 15/51 G01N 33/50 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 単純ヘルペスウイルス1型ウイルス(HS
    V1),単純ヘルペスウイルス2型ウイルス(HSV
    2),ヒトサイトメガロウイルス(CMV),及び,エ
    プシュタイン−バールウイルス(EBV)の各ウイルス
    のゲノムのPCRに使用されるDNAプライマーであ
    り,配列番号14のDNAプライマー及び配列番号15
    のDNAプライマーの1組のDNAプライマーからな
    り,単純ヘルペスウイルス1型ウイルス(HSV1),
    単純ヘルペスウイルス2型ウイルス(HSV2),ヒト
    サイトメガロウイルス(CMV),及び,エプシュタイ
    ン−バールウイルス(EBV)からそれぞれ,325b
    p,337bp,442bp,178bpの塩基長をも
    つPCR産物を生成し,前記PCR産物を用いてウイル
    スの同定を行なうことを特徴とするウイルス検査用試
    薬。
  2. 【請求項2】 単純ヘルペスウイルス1型ウイルス(HS
    V1),単純ヘルペスウイルス2型ウイルス(HSV
    2),ヒトサイトメガロウイルス(CMV),及び,水
    痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)の各ウイルスのゲノム
    のPCRに使用されるDNAプライマーであり,配列番
    号17のDNAプライマー及び配列番号18のDNAプ
    ライマーの1組のDNAプライマーからなり,単純ヘル
    ペスウイルス1型ウイルス(HSV1),単純ヘルペス
    ウイルス2型ウイルス(HSV2),ヒトサイトメガロ
    ウイルス(CMV),及び,水痘・帯状疱疹ウイルス
    (VZV)からそれぞれ,371bp,383bp,4
    88bp,323bpの塩基長をもつPCR産物を生成
    し,前記PCR産物を用いてウイルスの同定を行なうこ
    とを特徴とするウイルス検査用試薬。
  3. 【請求項3】 請求項1に記載のウイルス検査用試薬を用
    いて,試料中に含まれる前記各ウイルスのゲノムを変性
    剤として濃度4%のグリセロールを用いるPCRにより
    増幅して得られる塩基長の差が10塩基以上である前記
    PCR産物を電気泳動して,前記試料中に含まれるウイ
    ルスを同定することを特徴とするウイルス検査方法。
  4. 【請求項4】 請求項2に記載のウイルス検査用試薬を用
    いて,試料中に含まれる前記各ウイルスのゲノムを変性
    剤として濃度4%のグリセロールを用いるPCRにより
    増幅して得られる塩基長の差が10塩基以上である前記
    PCR産物を電気泳動して,前記試料中に含まれるウイ
    ルスを同定することを特徴とするウイルス検査方法。
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Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH06253900A (ja) 1994-09-13

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