JP3279702B2 - ウイルス検査用試薬及びそれを用いた検査方法 - Google Patents
ウイルス検査用試薬及びそれを用いた検査方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウイルスのＤＮＡを用い
た検出試薬とそれを用いた検査方法に関し、とくに、ヘ
ルペス検査用試薬及びそれを用いた検査方法に関する。
た検出試薬とそれを用いた検査方法に関し、とくに、ヘ
ルペス検査用試薬及びそれを用いた検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヘルペスウイルスに属するウイルスに
は、単純ヘルペスウイルス１型(ＨＳＶ１)、同２型(Ｈ
ＳＶ２)、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、エプシ
ュタイン−バール（Epstein-Barr）ウイルス（ＥＢ
Ｖ）、水痘・帯状疱疹ウイルス（バリセラ−ゾスター
（Varicella-Zoster））ウイルス（ＶＺＶ）等６種が知
られている。これらヘルペスウイルスは体内に潜伏し、
免疫不全状態で再活性化し、様々な症状を引き起こすこ
とが医学上の問題になっている。一部のヘルペスウイル
スについて効果のある抗ウイルス剤が開発されて以来、
早期診断の必要性が高まってきている。ウイルス感染症
の診断では分離培養が基本であるが、ヘルペスウイルス
については増殖に時間がかかるなどの問題があった。ウ
イルスを分離培養せずにその遺伝子によって迅速に検出
する方法として特開昭62-217161号公報に記載されてい
るＰＣＲ(ポリメラーゼ チエーン リアクション（Pol
ymerase Chain Reaction)）法がある。この方法は２本
鎖ＤＮＡの各単鎖と各々相補的なオリゴヌクレオチドで
ある２種類のプライマーを使用して、特定の核酸配列部
位を増幅するものである。すなわち、まず、サンプルか
ら鋳型となる２本鎖ＤＮＡを準備し、各単鎖のＤＮＡに
２種類のプライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリ
メラーゼを作用させて各プライマーから相補鎖を伸長さ
せる。さらに、得られた２本鎖の延長生成物に対し、上
記の操作を複数回繰り返すことにより、上記２本鎖ＤＮ
Ａにおける各プライマー間にはさまれ、かつ検出しよう
とする領域を有するＤＮＡ断片を数時間で増幅して得る
ことができる。ＰＣＲで得られたＤＮＡは、分離用の担
体としてポリアクリルアミドやアガロース等のゲルを用
いて、電気泳動によって分子量分離した後、エチジウム
ブロマイド等の色素で染色して蛍光により可視化するこ
とで検出できる。あるいは、得られるＤＮＡの配列が予
想できる場合は、ブロッティングすなわちＰＣＲ産物Ｄ
ＮＡをナイロン等の膜に転写後、相補な配列を持つラジ
オアイソトープでラベルしたプローブをハイブリダイズ
させ、オートラジオグラフをとる操作で検出することが
できる。このＰＣＲ法ではプライマーの塩基配列を選択
することにより、種々のＤＮＡ領域を特異的に増幅する
ことができる。ＰＣＲでヘルペスウイルスの検出を行う
には、従来はそれぞれに特異的なプライマーを用いて増
幅を行っていた（蛋白質核酸酵素、35巻、17号、(1990)
3025頁から3033頁、3048頁から3054頁、3034頁から3040
頁）。
は、単純ヘルペスウイルス１型(ＨＳＶ１)、同２型(Ｈ
ＳＶ２)、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、エプシ
ュタイン−バール（Epstein-Barr）ウイルス（ＥＢ
Ｖ）、水痘・帯状疱疹ウイルス（バリセラ−ゾスター
（Varicella-Zoster））ウイルス（ＶＺＶ）等６種が知
られている。これらヘルペスウイルスは体内に潜伏し、
免疫不全状態で再活性化し、様々な症状を引き起こすこ
とが医学上の問題になっている。一部のヘルペスウイル
スについて効果のある抗ウイルス剤が開発されて以来、
早期診断の必要性が高まってきている。ウイルス感染症
の診断では分離培養が基本であるが、ヘルペスウイルス
については増殖に時間がかかるなどの問題があった。ウ
イルスを分離培養せずにその遺伝子によって迅速に検出
する方法として特開昭62-217161号公報に記載されてい
るＰＣＲ(ポリメラーゼ チエーン リアクション（Pol
ymerase Chain Reaction)）法がある。この方法は２本
鎖ＤＮＡの各単鎖と各々相補的なオリゴヌクレオチドで
ある２種類のプライマーを使用して、特定の核酸配列部
位を増幅するものである。すなわち、まず、サンプルか
ら鋳型となる２本鎖ＤＮＡを準備し、各単鎖のＤＮＡに
２種類のプライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリ
メラーゼを作用させて各プライマーから相補鎖を伸長さ
せる。さらに、得られた２本鎖の延長生成物に対し、上
記の操作を複数回繰り返すことにより、上記２本鎖ＤＮ
Ａにおける各プライマー間にはさまれ、かつ検出しよう
とする領域を有するＤＮＡ断片を数時間で増幅して得る
ことができる。ＰＣＲで得られたＤＮＡは、分離用の担
体としてポリアクリルアミドやアガロース等のゲルを用
いて、電気泳動によって分子量分離した後、エチジウム
ブロマイド等の色素で染色して蛍光により可視化するこ
とで検出できる。あるいは、得られるＤＮＡの配列が予
想できる場合は、ブロッティングすなわちＰＣＲ産物Ｄ
ＮＡをナイロン等の膜に転写後、相補な配列を持つラジ
オアイソトープでラベルしたプローブをハイブリダイズ
させ、オートラジオグラフをとる操作で検出することが
できる。このＰＣＲ法ではプライマーの塩基配列を選択
することにより、種々のＤＮＡ領域を特異的に増幅する
ことができる。ＰＣＲでヘルペスウイルスの検出を行う
には、従来はそれぞれに特異的なプライマーを用いて増
幅を行っていた（蛋白質核酸酵素、35巻、17号、(1990)
3025頁から3033頁、3048頁から3054頁、3034頁から3040
頁）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】複数種のヘルペスウイ
ルスの検出をＰＣＲで行うには、従来はそれぞれのウイ
ルスに特異的なプライマーを用意し反応する必要があ
り、試薬コストや試料調製の手間が多いという課題があ
った。また、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２のゲノムは70％前後の
高いＧＣ含量を持つため、通常の反応条件ではＰＣＲが
困難である。このようなＧＣ含量が高いＤＮＡに対して
は、10%(v/v)グリセロール等の有機溶媒を加えることに
より反応が進みやすくなることが報告されているが（ア
ンプリフィケーションズ、5号、(1990)16頁から17頁（A
MPLIFICATIONS、5、(1990)、pp16-17））、これらの添
加剤はＧＣ含量が高くない他のＤＮＡに対しては阻害的
に作用するので、ＧＣ含量の異なる複数種のヘルペスウ
イルスを同時にＰＣＲすることは容易ではないという課
題があった。上記の課題を解決することができれば、複
数種のヘルペスウイルスを１組のプライマーを用いて検
出することが可能になり、ヘルペスウイルスの検査を低
コスト化、簡便化、迅速化することに寄与できる。
ルスの検出をＰＣＲで行うには、従来はそれぞれのウイ
ルスに特異的なプライマーを用意し反応する必要があ
り、試薬コストや試料調製の手間が多いという課題があ
った。また、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２のゲノムは70％前後の
高いＧＣ含量を持つため、通常の反応条件ではＰＣＲが
困難である。このようなＧＣ含量が高いＤＮＡに対して
は、10%(v/v)グリセロール等の有機溶媒を加えることに
より反応が進みやすくなることが報告されているが（ア
ンプリフィケーションズ、5号、(1990)16頁から17頁（A
MPLIFICATIONS、5、(1990)、pp16-17））、これらの添
加剤はＧＣ含量が高くない他のＤＮＡに対しては阻害的
に作用するので、ＧＣ含量の異なる複数種のヘルペスウ
イルスを同時にＰＣＲすることは容易ではないという課
題があった。上記の課題を解決することができれば、複
数種のヘルペスウイルスを１組のプライマーを用いて検
出することが可能になり、ヘルペスウイルスの検査を低
コスト化、簡便化、迅速化することに寄与できる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに鋭意研究を行った結果、複数のヘルペスウイルスＤ
ＮＡを共通のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて
ＰＣＲ増幅し、上記の課題を解決できることを見出し
た。すなわち本発明は、複数のヘルペスウイルスゲノム
の塩基配列を調べ、これらウイルス群に類似塩基配列が
あることを発見し、この類似塩基配列に基づいた共通塩
基配列プライマーを設計し、共通塩基配列プライマーを
複数のヘルペスウイルスのＰＣＲ増幅に用いるものであ
る。得られたＰＣＲ産物を塩基長で識別し、ウイルスを
同定することでヘルペスウイルスの検査を行うものであ
る。本発明におけるヘルペス検査用試薬は上記のオリゴ
ヌクレオチドプライマーである。本発明において、複数
のヘルペスウイルスＤＮＡをＰＣＲ増幅するためのプラ
イマーの塩基配列は、複数のヘルペスウイルスゲノム上
に数十から数百塩基離れた２か所に位置する共通する類
似塩基配列である必要があり、さらに得られるＰＣＲ産
物が塩基長で識別できるように、２つのプライマーに挟
まれる領域の塩基長が異なることが条件である。塩基長
の差は、電気泳動で容易に識別するためには数十塩基以
上あることが好ましく、少なくとも10塩基は必要であ
る。
めに鋭意研究を行った結果、複数のヘルペスウイルスＤ
ＮＡを共通のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて
ＰＣＲ増幅し、上記の課題を解決できることを見出し
た。すなわち本発明は、複数のヘルペスウイルスゲノム
の塩基配列を調べ、これらウイルス群に類似塩基配列が
あることを発見し、この類似塩基配列に基づいた共通塩
基配列プライマーを設計し、共通塩基配列プライマーを
複数のヘルペスウイルスのＰＣＲ増幅に用いるものであ
る。得られたＰＣＲ産物を塩基長で識別し、ウイルスを
同定することでヘルペスウイルスの検査を行うものであ
る。本発明におけるヘルペス検査用試薬は上記のオリゴ
ヌクレオチドプライマーである。本発明において、複数
のヘルペスウイルスＤＮＡをＰＣＲ増幅するためのプラ
イマーの塩基配列は、複数のヘルペスウイルスゲノム上
に数十から数百塩基離れた２か所に位置する共通する類
似塩基配列である必要があり、さらに得られるＰＣＲ産
物が塩基長で識別できるように、２つのプライマーに挟
まれる領域の塩基長が異なることが条件である。塩基長
の差は、電気泳動で容易に識別するためには数十塩基以
上あることが好ましく、少なくとも10塩基は必要であ
る。
【０００５】本発明におけるプライマーは上記の条件を
満たすように、類似塩基配列を持つことが期待できるＤ
ＮＡポリメラーゼをコードする領域に注目し、塩基配列
のホモロジーの高いＨＳＶ１とＨＳＶ２を増幅産物の塩
基長で区別できるようにＨＳＶ１とＨＳＶ２間で挿入・
欠失がある領域をはさみ、かつ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺ
Ｖにも共通するような領域を検索し設計を行ったもので
ある。ただし、ＥＢＶとＶＺＶは相互のホモロジーが低
いため、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶに共通し、かつ、
ＥＢＶまたはＶＺＶのいずれか一方の計４種に共通する
塩基配列をそれぞれ選択した。複数のヘルペスウイルス
ゲノムから見出した類似塩基配列に基づくプライマーの
塩基配列の各ヘルペスウイルスゲノムの塩基配列とのミ
スマッチの許容範囲は、同一領域の塩基配列の異なる複
数のプライマーについてＰＣＲを行い調べた結果、原則
として各ウイルスゲノムの塩基配列と３’末端からの異
なる塩基の総数が５塩基目までは１以下であり、１０塩
基目までは２以下であり、１５塩基目までは３以下であ
ることが好ましいことを見出した。しかし、この範囲外
であってもプライマーとして動作可能であれば良く、範
囲を制限するものではない。例えば、ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ、18巻、1990年、999頁から1005頁（N
ucleic Acids Res.、18、(1990)、pp999-1005）に記載
のように、プライマーの３’末端にＴまたはＴＴ等が付
加されても、反応に影響の少ないことが報告されてい
る。本発明の主旨は複数種のウイルスゲノム中から見出
した類似塩基配列を共通プライマーとして使用すること
にある。
満たすように、類似塩基配列を持つことが期待できるＤ
ＮＡポリメラーゼをコードする領域に注目し、塩基配列
のホモロジーの高いＨＳＶ１とＨＳＶ２を増幅産物の塩
基長で区別できるようにＨＳＶ１とＨＳＶ２間で挿入・
欠失がある領域をはさみ、かつ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺ
Ｖにも共通するような領域を検索し設計を行ったもので
ある。ただし、ＥＢＶとＶＺＶは相互のホモロジーが低
いため、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶに共通し、かつ、
ＥＢＶまたはＶＺＶのいずれか一方の計４種に共通する
塩基配列をそれぞれ選択した。複数のヘルペスウイルス
ゲノムから見出した類似塩基配列に基づくプライマーの
塩基配列の各ヘルペスウイルスゲノムの塩基配列とのミ
スマッチの許容範囲は、同一領域の塩基配列の異なる複
数のプライマーについてＰＣＲを行い調べた結果、原則
として各ウイルスゲノムの塩基配列と３’末端からの異
なる塩基の総数が５塩基目までは１以下であり、１０塩
基目までは２以下であり、１５塩基目までは３以下であ
ることが好ましいことを見出した。しかし、この範囲外
であってもプライマーとして動作可能であれば良く、範
囲を制限するものではない。例えば、ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ、18巻、1990年、999頁から1005頁（N
ucleic Acids Res.、18、(1990)、pp999-1005）に記載
のように、プライマーの３’末端にＴまたはＴＴ等が付
加されても、反応に影響の少ないことが報告されてい
る。本発明の主旨は複数種のウイルスゲノム中から見出
した類似塩基配列を共通プライマーとして使用すること
にある。
【０００６】上記のプライマーの全体の長さは、特に制
限されるものではないがウイルスＤＮＡの目的領域と高
い特異性を持たせるためには17mer以上のオリゴヌクレ
オチドであることが好ましい。上記のプライマーは混合
して使用することも可能である。本発明の複数のヘルペ
スウイルスゲノムから見出した類似塩基配列に基づくプ
ライマー組の例として、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、
ＥＢＶに対して使用できるものとしてプライマーＨＰ１
(配列番号１４)とＨＰ２(配列番号１５)、プライマーＨ
Ｐ３(配列番号１６)とＨＰ２(配列番号１５)、ＨＳＶ
１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＶＺＶに対して使用できるもの
として、プライマーＨＰ６(配列番号１８)とＨＰ４(配
列番号１７)が挙げられる。また、本発明の上記のプラ
イマーを用いて、５種のヘルペスウイルスがＰＣＲ可能
な反応条件を調べた結果、ＧＣ含量の大きく異なる５種
のヘルペスウイルスを増幅するには、適当なＤＮＡの変
性剤の添加が必要であり、グリセロールを変性剤として
用いる場合は、ＨＳＶ１とＨＳＶ２については4%-10%(v
/v)、ＶＺＶは0%-4%(v/v)、ＣＭＶとＥＢＶは0%-10%(v/
v)の範囲で良好なＰＣＲ増幅が可能であり、4%(v/v)前
後のグリセロールの添加により、５種のヘルペスウイル
スが全てＰＣＲ増幅できることを新たに見出した。変性
剤は、グリセロールに限らずジメチルスルホキシド等、
他の水溶性有機溶媒なども使用可能である。以上説明し
た本発明の手段がヘルペス以外の他のウイルスにも同様
に適用可能であることはいうまでもない。
限されるものではないがウイルスＤＮＡの目的領域と高
い特異性を持たせるためには17mer以上のオリゴヌクレ
オチドであることが好ましい。上記のプライマーは混合
して使用することも可能である。本発明の複数のヘルペ
スウイルスゲノムから見出した類似塩基配列に基づくプ
ライマー組の例として、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、
ＥＢＶに対して使用できるものとしてプライマーＨＰ１
(配列番号１４)とＨＰ２(配列番号１５)、プライマーＨ
Ｐ３(配列番号１６)とＨＰ２(配列番号１５)、ＨＳＶ
１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＶＺＶに対して使用できるもの
として、プライマーＨＰ６(配列番号１８)とＨＰ４(配
列番号１７)が挙げられる。また、本発明の上記のプラ
イマーを用いて、５種のヘルペスウイルスがＰＣＲ可能
な反応条件を調べた結果、ＧＣ含量の大きく異なる５種
のヘルペスウイルスを増幅するには、適当なＤＮＡの変
性剤の添加が必要であり、グリセロールを変性剤として
用いる場合は、ＨＳＶ１とＨＳＶ２については4%-10%(v
/v)、ＶＺＶは0%-4%(v/v)、ＣＭＶとＥＢＶは0%-10%(v/
v)の範囲で良好なＰＣＲ増幅が可能であり、4%(v/v)前
後のグリセロールの添加により、５種のヘルペスウイル
スが全てＰＣＲ増幅できることを新たに見出した。変性
剤は、グリセロールに限らずジメチルスルホキシド等、
他の水溶性有機溶媒なども使用可能である。以上説明し
た本発明の手段がヘルペス以外の他のウイルスにも同様
に適用可能であることはいうまでもない。
【０００７】
【作用】本発明のヘルペス検査用試薬の作用を例を挙げ
て説明する。配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドは、ＨＳＶ１(配列番号１)、ＨＳＶ２(配列番
号４)、ＣＭＶ(配列番号７)及びＥＢＶ(配列番号１０)
の各ゲノムＤＮＡの１部に共通な類似塩基配列を持ち、
配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、
ＨＳＶ１(配列番号２)、ＨＳＶ２(配列番号５)、ＣＭＶ
(配列番号８)、ＥＢＶ(配列番号１１)及びＶＺＶ(配列
番号１２)の各ゲノムＤＮＡの１部に共通な類似塩基配
列を持ち、配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドは、ＨＳＶ１(配列番号３)、ＨＳＶ２(配列番号
６)、ＣＭＶ(配列番号９)及びＶＺＶ(配列番号１３)の
各ゲノムＤＮＡの１部に共通な類似塩基配列を持ち、そ
れぞれのウイルスのゲノムＤＮＡに相補的に結合し、Ｐ
ＣＲプライマーとして機能する。それぞれのウイルスの
ゲノムにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
挟まれる領域の塩基長は異なるので、得られる伸長反応
産物の長さはウイルスごとに異なり、例えば、配列番号
１の１部である配列番号１４のオリゴヌクレオチドと配
列番号２の１部である配列番号１５のオリゴヌクレオチ
ドによって、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ及びＥＢＶの
ゲノムから、それぞれ325bp、 337bp、 442bp、 178bp
のＰＣＲ産物が得られる。同様に配列番号３の１部であ
る配列番号１８のオリゴヌクレオチドと配列番号２の１
部である配列番号１７のオリゴヌクレオチドによって、
ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶおよびＶＺＶのゲノムか
ら、それぞれ371bp、 383bp、 488bp、 323bpのＰＣＲ
産物が得られる。これらのＰＣＲ産物は電気泳動等の方
法で塩基長を確認することで、もとの試料中に含まれる
ウイルスを同定できる。
て説明する。配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドは、ＨＳＶ１(配列番号１)、ＨＳＶ２(配列番
号４)、ＣＭＶ(配列番号７)及びＥＢＶ(配列番号１０)
の各ゲノムＤＮＡの１部に共通な類似塩基配列を持ち、
配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、
ＨＳＶ１(配列番号２)、ＨＳＶ２(配列番号５)、ＣＭＶ
(配列番号８)、ＥＢＶ(配列番号１１)及びＶＺＶ(配列
番号１２)の各ゲノムＤＮＡの１部に共通な類似塩基配
列を持ち、配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドは、ＨＳＶ１(配列番号３)、ＨＳＶ２(配列番号
６)、ＣＭＶ(配列番号９)及びＶＺＶ(配列番号１３)の
各ゲノムＤＮＡの１部に共通な類似塩基配列を持ち、そ
れぞれのウイルスのゲノムＤＮＡに相補的に結合し、Ｐ
ＣＲプライマーとして機能する。それぞれのウイルスの
ゲノムにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列に
挟まれる領域の塩基長は異なるので、得られる伸長反応
産物の長さはウイルスごとに異なり、例えば、配列番号
１の１部である配列番号１４のオリゴヌクレオチドと配
列番号２の１部である配列番号１５のオリゴヌクレオチ
ドによって、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ及びＥＢＶの
ゲノムから、それぞれ325bp、 337bp、 442bp、 178bp
のＰＣＲ産物が得られる。同様に配列番号３の１部であ
る配列番号１８のオリゴヌクレオチドと配列番号２の１
部である配列番号１７のオリゴヌクレオチドによって、
ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶおよびＶＺＶのゲノムか
ら、それぞれ371bp、 383bp、 488bp、 323bpのＰＣＲ
産物が得られる。これらのＰＣＲ産物は電気泳動等の方
法で塩基長を確認することで、もとの試料中に含まれる
ウイルスを同定できる。
【０００８】
【実施例】本発明の実施例を説明する。以下に示す手順
で、本発明のヘルペスウイルス検査用試薬を使用してヘ
ルペスウイルスＤＮＡの検出を行った。ヘルペスウイル
スＤＮＡを含む試料１から試料５を用意し、以下の反応
に使用した。試料１、試料２、試料５は、それぞれＨＳ
Ｖ１、ＨＳＶ２、ＶＺＶを含む患部拭い液を、試料３、
試料４は、それぞれＣＭＶ、ＥＢＶの細胞培養上清を、
各々アルカリ処理したものを用いた。アルカリ処理は以
下の手順で行った。10μｌ（マイクロリットル）の試料
液に同体積の0.25M KOH水溶液を加え、６５°Ｃで10分
加熱する。その後、0.25M Tris-HCl(pH7.8)を30μｌ
（マイクロリットル）加え、中和する。試料１から５の
アルカリ処理液について以下の手順でＰＣＲを行った。
配列番号１４のプライマーＨＰ１と配列番号１５のプラ
イマーＨＰ２を各10pmol、その他、200μM各dNTP、1.5m
M MgCl2、10mM Tris-HCl(pH8.5)、50mM KCl、0.001%(w/
v)ゼラチン、4%(v/v)グリセロール（各々最終濃度）に
なるように添加する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（パー
キイン−エルマ−シータス（Perkin-Elmer-Cetus）社
製）を1.25ユニット加え、蒸留水を全体で25μｌ（マイ
クロリットル）になるように加える。上記のウイルスＤ
ＮＡ試料を2.5μｌ（マイクロリットル）加えた後、蒸
発防止用のミネラルオイルを１滴重層し、サーマルサイ
クラー（パーキイン−エルマ−シータス（Perkin-Elmer
-Cetus）社製）を使用して、97℃、20秒、53℃、30秒、
77℃、60秒の熱サイクルを45回繰返した。得られた試料
１から試料５のＰＣＲ産物溶液のうち5μｌ（マイクロ
リットル）を、3％ニュシーブ（NuSieve）(FMC社製)、1
%アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマ
イド染色して、紫外光照射下で観察した。その結果、試
料１から４のＰＣＲ産物について、シングルバンドが確
認でき、試料１から試料４のＰＣＲ産物の塩基長はＤＮ
Ａ分子量マーカーから推測し、それぞれ期待される塩基
長である325bp、 337bp、 442bp、 178bpであると確認
でき、試料１から試料４のＰＣＲ産物がそれぞれＨＳＶ
１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＥＢＶのウイルスゲノムの増幅
産物であることが確認できた。以上のように、本実施例
では、試料１から試料４にそれぞれ含まれていたＨＳＶ
１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＥＢＶ各ウイルスが、本発明の
ヘルペスウイルス検査用試薬である配列番号１４のプラ
イマーＨＰ１と配列番号１５のプライマーＨＰ２を使用
して検出できることが確認できた。また、同様に配列番
号１７のプライマーＨＰ４と配列番号１８のプライマー
ＨＰ６を使用しＰＣＲ増幅し、電気泳動で同様の分析を
行った結果、試料１、試料２、試料３、試料５のＰＣＲ
産物について、シングルバンドが確認でき、試料１、試
料２、試料３、試料５のＰＣＲ産物の塩基長はＤＮＡ分
子量マーカーから推測し、それぞれ期待される塩基長で
ある371bp、 383bp、 488bp、 323bpであると確認で
き、試料１、試料２、試料３、試料５のＰＣＲ産物がそ
れぞれＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＶＺＶのウイルス
ゲノムの増幅産物であることが確認できた。以上のよう
に、本実施例では、試料１、試料２、試料３、試料５に
それぞれ含まれていたＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、Ｖ
ＺＶ各ウイルスが、本発明のヘルペスウイルス検査用試
薬である配列番号１７のプライマーＨＰ４と配列番号３
のプライマーＨＰ５を使用して検出できることが確認で
きた。
で、本発明のヘルペスウイルス検査用試薬を使用してヘ
ルペスウイルスＤＮＡの検出を行った。ヘルペスウイル
スＤＮＡを含む試料１から試料５を用意し、以下の反応
に使用した。試料１、試料２、試料５は、それぞれＨＳ
Ｖ１、ＨＳＶ２、ＶＺＶを含む患部拭い液を、試料３、
試料４は、それぞれＣＭＶ、ＥＢＶの細胞培養上清を、
各々アルカリ処理したものを用いた。アルカリ処理は以
下の手順で行った。10μｌ（マイクロリットル）の試料
液に同体積の0.25M KOH水溶液を加え、６５°Ｃで10分
加熱する。その後、0.25M Tris-HCl(pH7.8)を30μｌ
（マイクロリットル）加え、中和する。試料１から５の
アルカリ処理液について以下の手順でＰＣＲを行った。
配列番号１４のプライマーＨＰ１と配列番号１５のプラ
イマーＨＰ２を各10pmol、その他、200μM各dNTP、1.5m
M MgCl2、10mM Tris-HCl(pH8.5)、50mM KCl、0.001%(w/
v)ゼラチン、4%(v/v)グリセロール（各々最終濃度）に
なるように添加する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（パー
キイン−エルマ−シータス（Perkin-Elmer-Cetus）社
製）を1.25ユニット加え、蒸留水を全体で25μｌ（マイ
クロリットル）になるように加える。上記のウイルスＤ
ＮＡ試料を2.5μｌ（マイクロリットル）加えた後、蒸
発防止用のミネラルオイルを１滴重層し、サーマルサイ
クラー（パーキイン−エルマ−シータス（Perkin-Elmer
-Cetus）社製）を使用して、97℃、20秒、53℃、30秒、
77℃、60秒の熱サイクルを45回繰返した。得られた試料
１から試料５のＰＣＲ産物溶液のうち5μｌ（マイクロ
リットル）を、3％ニュシーブ（NuSieve）(FMC社製)、1
%アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマ
イド染色して、紫外光照射下で観察した。その結果、試
料１から４のＰＣＲ産物について、シングルバンドが確
認でき、試料１から試料４のＰＣＲ産物の塩基長はＤＮ
Ａ分子量マーカーから推測し、それぞれ期待される塩基
長である325bp、 337bp、 442bp、 178bpであると確認
でき、試料１から試料４のＰＣＲ産物がそれぞれＨＳＶ
１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＥＢＶのウイルスゲノムの増幅
産物であることが確認できた。以上のように、本実施例
では、試料１から試料４にそれぞれ含まれていたＨＳＶ
１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＥＢＶ各ウイルスが、本発明の
ヘルペスウイルス検査用試薬である配列番号１４のプラ
イマーＨＰ１と配列番号１５のプライマーＨＰ２を使用
して検出できることが確認できた。また、同様に配列番
号１７のプライマーＨＰ４と配列番号１８のプライマー
ＨＰ６を使用しＰＣＲ増幅し、電気泳動で同様の分析を
行った結果、試料１、試料２、試料３、試料５のＰＣＲ
産物について、シングルバンドが確認でき、試料１、試
料２、試料３、試料５のＰＣＲ産物の塩基長はＤＮＡ分
子量マーカーから推測し、それぞれ期待される塩基長で
ある371bp、 383bp、 488bp、 323bpであると確認で
き、試料１、試料２、試料３、試料５のＰＣＲ産物がそ
れぞれＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、ＶＺＶのウイルス
ゲノムの増幅産物であることが確認できた。以上のよう
に、本実施例では、試料１、試料２、試料３、試料５に
それぞれ含まれていたＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶ、Ｖ
ＺＶ各ウイルスが、本発明のヘルペスウイルス検査用試
薬である配列番号１７のプライマーＨＰ４と配列番号３
のプライマーＨＰ５を使用して検出できることが確認で
きた。
【０００９】
【発明の効果】本発明によれば、複数種のヘルペスウイ
ルス（ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶとＥＢＶ、ＶＺＶの
いずれかの計４種）を１組のプライマーを用いてＰＣＲ
増幅して検出、同定することが可能である。
ルス（ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣＭＶとＥＢＶ、ＶＺＶの
いずれかの計４種）を１組のプライマーを用いてＰＣＲ
増幅して検出、同定することが可能である。
【００１０】これによって、上記ヘルペスウイルスのＤ
ＮＡを用いた検査についての試薬コストと検査に必要な
反応操作の回数を低減できる。
ＮＡを用いた検査についての試薬コストと検査に必要な
反応操作の回数を低減できる。
【００１１】［配列表］ 配列番号 ：１ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＧＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣＧＡＡＣＡＣ 配列番号 ：２ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：３ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧ 配列番号 ：４ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＧＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣＡＡＡＣＡＣ 配列番号 ：５ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：６ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＣＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧ 配列番号 ：７ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＧＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣＧＡＡＣＡＣ 配列番号 ：８ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：９ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＣ 配列番号 ：１０ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＣＧＧＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣＣＡＣＣＡＣ 配列番号 ：１１ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：１２ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＣＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣ
ＡＧ 配列番号 ：１３ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＣＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＧＴ
ＴＡＴＧＧＧＣＣＴＧ 配列番号 ：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＡＣ
ＡＣ 配列番号 ：１５ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣ
ＣＧ 配列番号 ：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＧＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣ 配列番号 ：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣ
ＡＧ 配列番号 ：１８ 配列の長さ：２４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴ
ＧＧＧＣＣ
ＴＣＧＡＡＣＡＣ 配列番号 ：２ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：３ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧ 配列番号 ：４ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＧＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣＡＡＡＣＡＣ 配列番号 ：５ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：６ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＣＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧ 配列番号 ：７ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＧＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣＧＡＡＣＡＣ 配列番号 ：８ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：９ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＴ
ＴＧＴＧＧＧＣＣ 配列番号 ：１０ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＣＧＧＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣＣＡＣＣＡＣ 配列番号 ：１１ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣ
ＡＧＡＴＣＣＧ 配列番号 ：１２ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＣＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣ
ＡＧ 配列番号 ：１３ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＧＣＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＧＴ
ＴＡＴＧＧＧＣＣＴＧ 配列番号 ：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＡＣ
ＡＣ 配列番号 ：１５ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣ
ＣＧ 配列番号 ：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＧＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＴＣ 配列番号 ：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＡＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣ
ＡＧ 配列番号 ：１８ 配列の長さ：２４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡプライマー 配列 ：ＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴ
ＧＧＧＣＣ
フロントページの続き (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (72)発明者 古山 宏子 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (72)発明者 杉浦 正彦 東京都杉並区高円寺南１丁目34番５号 株式会社 ビー・エム・エル内 (72)発明者 山口 敏和 東京都杉並区高円寺南１丁目34番５号 株式会社 ビー・エム・エル内 (56)参考文献 Ｒｏｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ｅｔ ａ ｌ．，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａ ｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ ｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｄ ＮＡ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａ ｌ Ｆｌｕｉｄ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅ ｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｃｕｔ，Ｊ Ｃｌ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ. 29，Ｎｏ．11，ｐ．2412−2417 Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．, Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃ ｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍ ｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｅｒｐ ｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔ ｙｐｅ ２ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓ ｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈ，Ｇｅｎｅ，Ｖｏ ｌ．52，Ｎｏ．２−３，ｐ．129−137 Ｋｏｕｚａｉｒｉｄｅｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙ ｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ ｙｔｏｍｅｇａｌｉｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｓｅ ｇｅｎｅ, Ｊ Ｖｉｒｏｌ，Ｖｏｌ．61，Ｎｏ. １，ｐ．125−133 Ｌａｒｄｅｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａ ｌ．，Ｒｅｌａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏ ｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｖｉｒ ｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓ，ＥＭＢＯ Ｊ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ. １，ｐ．169−175 Ｋｏｓｔｍａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａ ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅ ｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ｄｅｔｅｒ ｍｉｎｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓ ｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒ ｉｂｏｔｙｐｉｎｇ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．30，Ｎｏ. ８，ｐ．2084−2087 Ｋｗｏｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆ ｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ−ｔｅｍ ｐｌａｔｅ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ｏ ｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃ ｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ： ｈｕｍ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃ ｙ ｖｉｒｕｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．18，Ｎｏ. ４，ｐ．999−1005 Ｖｉｌｃｅｋ，Ｓ．，Ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｈ ｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１（ＢＨＶ− １）ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ＰＣＲ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ. 41，Ｎｏ．２，ｐ．245−247 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 - 1/70 C12N 15/33 - 15/51 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 単純ヘルペスウイルス１型ウイルス（ＨＳ
Ｖ１），単純ヘルペスウイルス２型ウイルス（ＨＳＶ
２），ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ），及び，エ
プシュタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の各ウイルス
のゲノムのＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマーであ
り，配列番号１４のＤＮＡプライマー及び配列番号１５
のＤＮＡプライマーの１組のＤＮＡプライマーからな
り，単純ヘルペスウイルス１型ウイルス（ＨＳＶ１），
単純ヘルペスウイルス２型ウイルス（ＨＳＶ２），ヒト
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ），及び，エプシュタイ
ン−バールウイルス（ＥＢＶ）からそれぞれ，３２５ｂ
ｐ，３３７ｂｐ，４４２ｂｐ，１７８ｂｐの塩基長をも
つＰＣＲ産物を生成し，前記ＰＣＲ産物を用いてウイル
スの同定を行なうことを特徴とするウイルス検査用試
薬。 - 【請求項２】 単純ヘルペスウイルス１型ウイルス（ＨＳ
Ｖ１），単純ヘルペスウイルス２型ウイルス（ＨＳＶ
２），ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ），及び，水
痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の各ウイルスのゲノム
のＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマーであり，配列番
号１７のＤＮＡプライマー及び配列番号１８のＤＮＡプ
ライマーの１組のＤＮＡプライマーからなり，単純ヘル
ペスウイルス１型ウイルス（ＨＳＶ１），単純ヘルペス
ウイルス２型ウイルス（ＨＳＶ２），ヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ），及び，水痘・帯状疱疹ウイルス
（ＶＺＶ）からそれぞれ，３７１ｂｐ，３８３ｂｐ，４
８８ｂｐ，３２３ｂｐの塩基長をもつＰＣＲ産物を生成
し，前記ＰＣＲ産物を用いてウイルスの同定を行なうこ
とを特徴とするウイルス検査用試薬。 - 【請求項３】 請求項１に記載のウイルス検査用試薬を用
いて，試料中に含まれる前記各ウイルスのゲノムを変性
剤として濃度４％のグリセロールを用いるＰＣＲにより
増幅して得られる塩基長の差が１０塩基以上である前記
ＰＣＲ産物を電気泳動して，前記試料中に含まれるウイ
ルスを同定することを特徴とするウイルス検査方法。 - 【請求項４】 請求項２に記載のウイルス検査用試薬を用
いて，試料中に含まれる前記各ウイルスのゲノムを変性
剤として濃度４％のグリセロールを用いるＰＣＲにより
増幅して得られる塩基長の差が１０塩基以上である前記
ＰＣＲ産物を電気泳動して，前記試料中に含まれるウイ
ルスを同定することを特徴とするウイルス検査方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04895393A JP3279702B2 (ja) | 1993-03-10 | 1993-03-10 | ウイルス検査用試薬及びそれを用いた検査方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04895393A JP3279702B2 (ja) | 1993-03-10 | 1993-03-10 | ウイルス検査用試薬及びそれを用いた検査方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253900A JPH06253900A (ja) | 1994-09-13 |
| JP3279702B2 true JP3279702B2 (ja) | 2002-04-30 |
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ID=12817645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04895393A Expired - Fee Related JP3279702B2 (ja) | 1993-03-10 | 1993-03-10 | ウイルス検査用試薬及びそれを用いた検査方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3279702B2 (ja) |
-
1993
- 1993-03-10 JP JP04895393A patent/JP3279702B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Ｋｏｓｔｍａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．８，ｐ．２０８４−２０８７ |
| Ｋｏｕｚａｉｒｉｄｅｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｓｅ ｇｅｎｅ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．１，ｐ．１２５−１３３ |
| Ｋｗｏｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ： ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４，ｐ．９９９−１００５ |
| Ｌａｒｄｅｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｌａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．１６９−１７５ |
| Ｒｏｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｃｕｔ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１１，ｐ．２４１２−２４１７ |
| Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈ，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．２−３，ｐ．１２９−１３７ |
| Ｖｉｌｃｅｋ，Ｓ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１（ＢＨＶ−１）ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ＰＣＲ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．２，ｐ．２４５−２４７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06253900A (ja) | 1994-09-13 |
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