JP3270043B2 - Ｂ群連鎖球菌検出用免疫検定 - Google Patents

Ｂ群連鎖球菌検出用免疫検定

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、試験液や身体からの分泌液などの流体中の
Ｂ群連鎖球菌（ストレプトコッカス・アガラクチアエ
（streptococcus agalactiae））多糖抗原の検出に関す
る。また、本発明は、ヒト、及び、他の動物（牛など）
を含む哺乳類におけるＢ群連鎖球菌の検出ないし診断に
も関する。
発明の背景 免疫検定法は、免疫反応に関与し得る物質の検出法と
してよく知られている。例えば試験液中の、このような
物質の検出は、標識剤と共に溶液をインキュベートし、
標識剤が溶液中に存在する物質と結合するかどうかを確
認することで行なうことができる。標識剤は物質と結合
するものであれば何でもよく、それは検定トレーサーで
標識される。検定トレーサーは、検定の原理により、放
射性同位元素である場合もあれば、化学的／生物学的標
識成分の場合もある。
免疫検定法にはいろいろな方式、例えば、シングルユ
ースデバイス（SUD:single use device）のようなELISA
（酵素結合イムノソルベント検定法:enzyme−linked im
munosorbent assay）、ラテックス凝集方式、放射性免
疫検定法などがある。ELISAは、物質（例えば抗原や抗
体）の存在を酵素活性に関連させる。この種の検定で
は、物質は、酵素標識をつけた標識剤（例えば、米国特
許第3,791,932号、第4,757,134号、第4,833,071号明細
書を参照されたい）を用いて検出される。またELISAで
は検出を行う前に、対象の物質を捕捉するために免疫吸
着剤を用いることもある。
SUDは、典型的には、検定中の抗原が結合する捕捉（c
apture）抗原を担持する膜から成る。そして、酵素など
の、基質に接触するとその後に発色する適切な標識を担
持する２番目の標識抗体を用いて“サンドイッチ”が作
られる。
ラテックス凝集方式では、抗原物質が、ミルク様の外
観を有するラテックスの形態のポリスチレンビーズに吸
着される。続いて、抗体を加えると、コートされたラテ
ックス粒子が凝集し、媒体の外観に目にみえる変化が生
じる。
放射免疫検定法は、酵素の代わりに例えばヨウ素125
などの放射性同位元素が使われる点を除いてELISAと同
じである。ガンマ・カウンターを用いて検出できる。
Ｂ群連鎖球菌（GBS）に感染すると、ヒトや動物では
健康に重大な危険が生じる。GBS感染は、例えば、乳牛
の乳腺炎の原因になる。しかし特に懸念されるのは、出
産時のGBS感染の発生である。出産前の母親がこのバク
テリアの保菌者であると、出産後感染の危険があるだけ
でなく、子供が産道を通るときに子供に感染させる場合
もある。新生児のこのような感染の予防は、子宮頚部ま
たは膣におけるGBSの存在の識別のための出産前検査を
行い、必要な場合は抗体治療を行うことにより可能であ
る（１）。このような場合には、分娩前に抗生物質によ
る治療を行う必要があるために、一夜培養法よりも、迅
速免疫診断検査が好ましい。
Ｂ群連鎖球菌は、５つの個々のGBS抗原型に共通する
群特異的多糖抗原（「Ｃ」物質）の存在により、他の連
鎖球菌と区別できる（２、３、４）。この共通GBS多糖
抗原には、Ｌ−ラムノース、Ｄ−ガラクトース、２−ア
セトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース及びＤ−グ
ルシトールが含まれる（５、６）。GBS多糖抗原の全体
構造は、以前に、下記に示す構造Ｉ、II、III及びIVを
有する４つの異なるオリゴ糖の単位から成ることが示さ
れている（５、６）。
オリゴ糖の単位Ｉ、II、III及びIVは、一種のホスホ
ジエステル結合（Ｄ−グルシトールのO6とＤ−ガラクト
ピラノースのO6の間）により連結され、複数で非常に分
枝の多いマルチアンテナリー構造であることが示されて
いる。GBS多糖抗原の全体構造を下記に示す（６）。
GBSの免疫診断検定は、GBS多糖抗原をターゲットとし
ている（７）。構造研究により、GBS多糖抗原には38個
のモノラムノースエピトープと４個のトリラムノースエ
ピトープがあることが知られている。また、末端の式α
−Ｌ−Rhap−１−［式中、Rhapはラムノースである。］
の基を包含するモノラムノース基が、GBS多糖抗原のイ
ムノドミナントとエピトープであることも知られている
（８）。しかし、このモノラムノース基は、多糖類と、
連鎖球菌Ｂ群、連鎖球菌Ｇ、肺炎球菌XXIIIの抗血清に
みられる交差反応性の多くの原因となっている（９）。
ある種の市販の、ELISAまたはラテックス凝集タイプ
のGBS多糖抗原の試験は、感度に欠け（10、11）、また
非GBS細菌抗原と交差反応を示す場合があること（12）
が多くの研究により判明している。妊娠中の女性の場
合、このような交差反応で誤りの結果が示されると、ま
だ生まれていない子供に不必要な抗生物質治療を受けさ
せることになる。GBSの感度に欠けると、治療を行わな
いというより重大な状況が生じる可能性があり、そうな
ると新生児のGBS疾患が増加する危険が生じる。
妊娠中の女性をスクリーニングする最適な時期は、陣
痛が始まる時であると報告されている。それ故に、特に
出産直前の妊娠中の女性のためには、GBSの存在を診断
する感度と特異性（交差反応性を有さない）が優れた、
かなり迅速な診断試験が必要とされるのである。本発明
は、GBSに対し、非常に感度と特異性に優れた迅速診断
試験を提供することを目的とする。
発明の要旨 本発明者らは、モノラムノース基のエピトープと比べ
て、GBSについて選択性の優れたエピトープを決定する
ため、エピトープを組織的に研究した。本発明者らは、
また、GBSに対するより優れた感度を示す測定法を見つ
けるために、いろいろな検定方式も研究した。
本発明者らは、驚いたことに、例えばツーサイト（tw
o−site）ELISA方式のように、モノラムノース基のエピ
トープが、トリラムノース基のエピトープと一緒に用い
る場合に、GBSの免疫診断に有効に使用できることを見
い出した。この組合せで、捕捉抗原に結合する捕捉エピ
トープとして用いられる場合、トリラムノース基のエピ
トープは、GBSに対する高い特異性に寄与し、酵素標識
抗体のターゲットとして使用されるモノラムノース基の
エピトープは感度を与え、捕捉抗体への結合に関し、酵
素標識抗原と捕捉エピトープの間の拮抗を防ぐ。
また、トリラムノース基のエピトープを、シングルサ
イト（single−site）ELISA方式において捕捉抗体のタ
ーゲットとして用いると、最大量の捕捉抗体（500ng/ウ
ェルの範囲）をコートするという標準的方法に従った場
合、GBS多糖抗原に対する感度が、1ng以下の多糖抗原と
いう重要な範囲で、ゼロ近くまで低下することも判明し
た。本発明者らは、トリラムノース捕捉抗体のコーティ
ング密度を500ng/ウェルから約160ng/ウェルにまで減少
させると、GBS多糖抗原に対する感度がわずかに低下し
てはいるが、シングルサイトELISAが機能することを見
い出した。
本発明の要旨は、抗原標識（marker）剤、不溶性担
体、不溶性担体の表面に固定化された捕捉抗原（captur
e）剤から成る免疫吸着剤組合せ物（immunoadsorbent c
ombination）を提供することである。抗原捕捉剤は、担
体にGBS多糖抗原を固定させる、GBS多糖抗原のトリラム
ノースエピトープと特異的に結合する親和性を有する。
トリラムノースエピトープは、式α−Ｌ−Rhap（１→
２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap−１−［式
中、Rhapはラムノースである。］の基から成る。抗原標
識剤は、その抗原が担体に結合した場合に、GBS多糖抗
原に結合する親和性を有する。
本発明の別の要旨は、抗原標識剤、不溶性担体、不溶
性担体の表面に固定化された抗原捕捉剤から成る、GBS
多糖抗原検出用の免疫吸着剤組合せ物を提供することで
ある。抗原捕捉剤は、GBS多糖を担体に固定させる、GBS
多糖抗原のモノラムノースエピトープに特異的に結合す
る親和性を有する。モノラムノースエピトープは、式α
−Ｌ−Rhap−１−［式中、Rhapはラムノースである。］
の基から成る。抗原標識剤は、その抗原が担体に結合し
た場合に、GBS多糖抗原と特異的に結合する親和性を有
する。
本発明のさらに別の要旨は、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を
検出するための免疫検定法を提供することである。この
方法は下記（ｉ）及び（ii）のステップから成る。
（ｉ）GBS多糖抗原を含む疑いのある試験液に、上記の
ようなGBSのモノラムノースまたはトリラムノースのエ
ピトープと結合する親和性を有し、不溶性に固定化され
た抗原捕捉剤を接触させる。
（ii）GBS多糖抗原が抗原捕捉剤と結合した場合にGBS多
糖抗原と結合する親和性を有する抗原標識剤を導入し
て、担体に結合したGBSの存在を検出する。
本発明のさらにまた別の要旨は、別々の容器に適切に
下記（ａ）〜（ｅ）を含む、GBS多糖抗原検出用の試験
キットを提供することである。
（ａ）不溶性担体の表面に固定化された、上記のような
GBSのモノラムノースまたはトリラムノースのエピトー
プと結合する親和性を有する抗原捕捉剤。
（ｂ）有機酸から成る、GBS多糖抗原をＢ群連鎖球菌か
ら亜硝酸水溶液抽出するための第１抽出剤。
（ｃ）無機亜硝酸塩から成る、GBS多糖抗原をＢ群連鎖
球菌から亜硝酸水溶液抽出するための第２抽出剤。（但
し、第１抽出剤と第２抽出剤は、水性媒体中で混合した
場所に互いに反応して亜硝酸を生成し得るものであ
る。） （ｄ）過剰の亜硝酸を中和するための中和剤。
（ｅ）GBS多糖抗原が担体と結合した場合に、抗原のモ
ノまたはトリラムノースエピトープと特異的に結合する
親和性を有する抗原標識剤。
また、本発明の要旨は、GBS多糖抗原に対する抗体産
生を賦活する免疫原複合体を提供することである。複合
体は、薬学的に許容可能な担体と結合した炭水化物から
成り、その炭水化物は、GBS多糖抗原のラムノースエピ
トープに対する抗体産生を賦活する免疫反応性を有す
る。ラムノースエピトープは、（ａ）式α−Ｌ−Rhap
（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap−１−
のトリラムノース基、（ｂ）式α−Ｌ−Rhap−１−のモ
ノラムノース基、または、（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）
に各々記載のトリラムノース及びモノラムトースの基の
混合物［各式中、Rhapはラムノースである。］から選択
される。
また、本発明の別の要旨は、不溶性担体と当該不溶性
担体の表面に固定化された抗原捕捉剤からなる免疫吸着
剤を提供することである。抗原捕捉剤は、（ａ）式α−
Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rh
ap−１−のトリラムノース基、及び（ｂ）式α−Ｌ−Rh
ap−１−のモノラムノース基［各式中、Rhapはラムノー
スである。）から選択されるラムノース部分から成る。
さらに、本発明の要旨は、不溶性担体、及び、当該担
体の表面に単位面積当り160ng以下のコーティング密度
でコートされた、Ｂ群連鎖球菌に対するトリラムノース
モノクローナル抗体から成る免疫吸着剤を提供すること
である。
さらにまた、本発明の要旨は、GBS多糖抗原に対す
る、ヒツジポリクローナル抗体から単離した抗体を提供
することである。
図面の簡単な説明 添付の図を参照して本発明を説明する。
図１は、表４に示す構造１〜22を有する種々のオリゴ
糖を用いて、ポリクローナル抗ウサギＢ群多糖特異性血
清（090R）へのＢ群多糖の結合についての定量的沈降阻
害を示す。
図２は、そのまま（native）のタイプI a（白丸）及
びタイプIII（黒丸）のＢ群多糖と、それぞれのナリン
ギナーゼ（Naringinase）処理物（白逆三角形と黒逆三
角形）の、ポリクローナル抗ウサギＢ群多糖特異的血清
（090R）での定量的沈降曲線を示す。
図３は、１−２−結合−α−Ｌ−トリラムノピラノシ
ド−アフィニティカラムを使用した、ポリクローナル抗
ウサギＢ群多糖特異性血清の分画を示し、末端α−Ｌ−
ラムノピラノシド特異性抗体は緩衝液Ａで溶出され、ト
リラムノシド特異性抗体は緩衝液Ｄで溶出される。
図４は、そのままのＢ群多糖とトリラムノシドアフィ
ニティ精製ポルクローナル抗ウサギＢ群多糖特異性血清
（090R）の結合の、１、２、３、４及び15（表４）によ
るELISE阻害を示す。
図５は、そのままのＢ群多糖とネズミモノクローナル
Ｂ群多糖特異性抗体（090R）の結合の、１、２、３、４
及び15（表４）によるELISA阻害を示す。
図６は、アフィニティ精製したヒツジ抗体とＢ群特異
的多糖の結合の阻害を示す。
図7A及び図7Bは、捕捉抗体としてトリラムノース特異
性モノクローナル抗体を用いたＢ群特異的多糖抗原の検
出用のシングルサイトELISA及びツーサイトELISAを示
す。
図8A及び図8Bは、捕捉抗体としてモノラムノース特異
性を有するヒツジのポリクローナル抗体を用いたＢ群特
異的多糖抗原検出用のシングルサイトELISA及びツーサ
イトELISAを示す。
図９は、捕捉抗体として、トリラムノース特異性を有
するモノクローナル抗体（白丸）またはモノラムノース
特異性を有するポリクローナル抗体（黒丸）を用いたGB
S細胞に対するELISAの感度を示す。いずれの場合も、標
識抗体としてペルオキシダーゼ標識モノラムノース特異
性ヒツジポリクローナルを用いている。
図10は、トリラムノース特異性モノクローナル抗体を
シングルサイトELISAの捕捉抗体として用いたELISAの感
度（白丸、図7Aの160ngの抗体コーティング密度で得た
データ）と、モノラムノースエピトープポリクローナル
抗体を標識抗体として用いたツーサイトELISAでの感度
（黒丸、図7Bの200ngの抗体コーティング密度で得たデ
ータ）を示す。
発明の詳細な説明 本発明において、下記の表現は、下記のように理解さ
れたい。
（ｉ）「免疫吸着剤」は、免疫反応に関係する物質を吸
着することができる物質（例えば、場合により、抗体ま
たは抗原）を意味する。
（ii）「免疫検定剤」は、免疫反応に関係する物質の存
在の試験にかかわることができる物質のすべて（例え
ば、場合により、抗体または抗原）を意味する。
（iii）「免疫原複合体」は、動物（例えば、哺乳類や
鳥類）に注入された場合に、それに対する抗体の産生な
いし増強を賦活ないし誘導する物質を意味する。
（iv）「抗原捕捉剤」は、抗原に結合できる物質（例え
ば抗体）を意味する。
（ｖ）「抗体捕捉剤」は、抗体に結合できる物質（例え
ば抗原）を意味する。
（vi）「結合する親和性」は、一般に、要素が、一緒に
結合するというように、別の要素と相互作用することが
可能であることを意味する。
（vii）「特異的に結合する親和性」は、一般に、要素
が、排他的または少なくとも優先的な形態、即ち、本発
明の目的に十分な形態で別の要素と相互作用が可能であ
ることを意味する。
（viii）「抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のトリ
ラムノースエピトープと特異的に結合する親和性を有す
る」は、抗原捕捉剤が、この捕捉剤とＢ群連鎖球菌多糖
抗原のその他の成分（例えばモノラムノースエピトー
プ）の間の相互作用が非常に低い、または、無視できる
（すなわち、トリラムノースエピトープとの相互作用
が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原またはＢ群連鎖球菌感染の検
出及び／または診断の目的に十分に特異的である）とい
うように、トリラムノースエピトープと排他的または少
なくとも優先的形態で相互作用が可能なことを意味す
る。
（ix）「抗原標識剤は、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のモノラ
ムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有す
る」は、抗原標識剤が、この標識剤とＢ群連鎖球菌の多
糖抗原のその他の成分（例えばトリラムノースエピトー
プ）との相互作用が非常に低い、または、無視できる
（すなわち、モノラムノースエピトープとの相互作用
が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原またはＢ群連鎖球菌感染の検
出及び／または診断の目的に十分に特異的である）とい
うように、排他的あるいは少なくとも優先的形態で相互
作用可能なことを意味する。
（ｘ）「シングルサイトELISA」は、捕捉抗体と標識
（プローブ）抗体がターゲットとするエピトープの部位
が、構造的に同じである（例えば、トリラムノースエピ
トープが捕捉抗体と標識抗体のターゲットとされる）よ
うなELISA方式検定を意味する。
（xi）「ツーサイトELISA」は、捕捉抗体と標識（プロ
ーブ）抗体がターゲットとするエピトープの部位が、構
造的に異なる（例えば、トリラムノースエピトープが捕
捉抗体のターゲットとされ、モノラムノースエピトープ
がマーカー抗体のターゲットとされる）ようなELISA方
式検定を意味する。
検定する物質（抗原）を含む試験液は、いかなる源由
来のものでもよい。従って、源はヒトであっても、例え
ば哺乳類や鳥類など他の動物であってもよい。例えば、
乳、尿、あるいは羊水などの流体（既知の方法で濃縮す
ることが必要なことがある）を試験することが望ましい
場合もある。あるいは、胃スワブ（swab）、尿生殖器ス
ワブ、胎盤スワブ、細菌の培養物またはコロニーの試験
が望ましい場合もある。試験液は、特に、スワブから得
た膣及び／または子宮頚部の分泌物から採取することが
できる。
GBS多糖抗原には、Ｂ群連鎖球菌から周囲の流体環境
に自然に放出されるものもあるが、検出目的に十分な量
の抗原が存在することにはならないことがある。それ
故、抽出手順が、そのままの細菌からGBS多糖抗原を試
料流体中を移行させるために必要なことがある。
一般に、抽出手順には、細菌の細胞壁へのGBS多糖抗
原の付着を破壊できる適切な抽出剤を用いてGBS細菌を
処理することがある。温度や抽出剤などの抽出条件は、
GBS多糖抗原に悪影響がないように選択される。GBS多糖
抗原の抽出は、例えば、単一化合物から成る、または、
相互作用により抽出を引き起こす２以上の化合物から成
る適切な抽出剤を含む水性媒体中で行うことができる。
適切な抽出法としては、例えば、酵素法（22）や亜硝酸
法がある。亜硝酸法では、混合した場合に（例えば、液
状媒体中で）反応が生じ亜硝酸を生成し得る少なくとも
２つの反応剤を組み合わせて、亜硝酸が、通常、インシ
トゥ（in situ）で生成される。試薬の１つは有機酸か
ら、またもう１つは無機亜硝酸塩から選ぶことができ
る。GBS多糖抗原の亜硝酸抽出に適切である限り、有機
酸と無機亜硝酸塩をどのように組み合わせても用いるこ
とができる。有機酸は、例えば、酢酸、コハク酸、クエ
ン酸などが使用できる。無機亜硝酸塩としては、例え
ば、アルカリ金属の亜硝酸塩（亜硝酸ナトリウムまたは
亜硝酸カリウムなど）を用いることができる。
そのままの細菌からGBS多糖抗原を常温常圧下で抽出
するための既知のミクロ亜硝酸抽出法の例は、スリフキ
ン（Slifkin）,Mら（23）が述べている。ミクロタイタ
ーウェル法を用いて、この種の抽出では最大抽出に達す
るまでに約20分要することが判明している。実際には、
検出の目的では５分から10分で十分である。
抽出手順は、一般に、次の（１）〜（７）のステップ
から成る。
（１）GBS細菌を含む疑いのある細菌試料を、GBS多糖抗
原を抽出できる適切な抽出剤と共にインキュベートし、
分析液を作成する。
（２）必要な場合は、適切なインキュベーション時間の
経過後、分析試料に中和剤を混合し、過剰な抽出剤を中
和する。
（３）得られた分析液に、本明細者に記載したような抗
原免疫吸着剤を接触させる。
（４）分析液を抗原免疫吸着剤と共にインキュベートす
る。
（５）抗原免疫吸着剤により捕捉されたGBS多糖抗原
を、所望の標識をつけた抗原標識剤と共にインキュベー
トする。
（６）このようにして得られた捕捉「サンドイッチ」
を、適切な洗浄剤、すなわち、「サンドイッチ」の構造
や結合した標識剤の活性に悪影響を与えない水溶液で洗
浄する。
（７）上記のステップ（５）で結合多糖抗原に捕捉され
た標識剤の性質に基づき、GBS多糖抗原／細菌の存在を
決定し、必要な場合にはその量を測定する。
抗原捕捉剤は、例えば、抗体（モノクローナルまたは
ポリクローナル）または、レクチンのようなその他の同
効物質から成る。同様に、抗原標識剤は、例えば、抗体
（モノクローナルまたはポリクローナル）またはGBS多
糖抗原に結合するために必要な親和性を有する同効物質
から成る。あるいは、抗原捕捉剤と抗原標識剤は、例え
ば所望の親和性ないし必要な親和性を有する断片である
Fab断片のような抗体の適切な断片から成ってもよい。
これらの剤は、また、シングルドメイン抗体（dABs:sin
gle domain antibody）（13）から成ってもよい。
抗原捕捉剤は、抗原捕捉剤がさらされる試験媒体に関
して不溶性となるよう、吸着または共有結合により担体
に固定化される。担体は、有機成分または無機成分のも
のでよい。例えば、担体はアミロース、デキストラン、
天然セルロースまたは変性セルロース、ポリエチレン、
ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、及
び、ケイ酸（ガラスなど）などから選ぶことができる。
抗原捕捉剤は、例えば、試験容器（即ち、試験管、ミク
ロタイタープレート、ガラスのキュベット、または上記
に類似した他の物体）の内壁、または、固体物体（即
ち、ガラス棒やその他いろいろな形状の物体）に固定化
される。使用される容器は、面積と体積の比が大きいも
のが好ましい。捕捉抗体は直接担体に固定化される場合
もあるし、または、グルタルアルデヒド、プロテインＡ
もしくはプロテインＢなどの中間物質の残基を介して固
定化される場合もある。
抗体、抗原、酵素、リガンドなどの活性物質を担体に
固定化する（即ち、不溶化する）ための既知の方法のい
ずれも使用できる（14）。捕捉抗体は、例えば、抗体を
含む緩衝液（例えば、0.1MのMaHCO3と５〜12μg/mlの捕
獲抗体から成る、pHが9.6の緩衝液0.2〜0.25ml）を、適
切な温度で適切な時間（例えば４℃で16時間）、担体の
機能表面に接触させることにより、ポリスチレンのミク
ロタイタープレート、ウェルまたはチューブから成る担
体の表面に固定化することができる。捕捉抗体の固定化
後、担体の活性表面を適切な洗浄剤で洗浄し、結合して
いない抗体を取り除くことができる。洗浄処理には、抗
体が可溶性の中性の洗浄用緩衝液を用いることもでき
る。これには例えば、0.15Mの塩化ナトリウムを含むpH
が7.4の0.02M塩化トリス緩衝液（以下、TBSと呼ぶ）、
0.05％のツウィーン（Tween）−20を含むTBS（以下、TB
STと呼ぶ）、あるいはツウィーン−20を0.05％含むpH7.
4の0.05Mリン酸ナトリウム緩衝食塩水という場合もあ
る。ツウィーン−20はポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレートの商標で、アトラスケミカル社（Atlas Ch
emical）から市販されている。このようにして得た免疫
吸着剤は、例えば室温から37℃の範囲の温度で乾燥に十
分な時間、例えば典型的には37℃で１時間乾燥し、その
後使用するまで約４℃で保管することができる。
抗原標識剤は、不溶性担体に結合したGBS多糖抗原に
結合するために必要な親和性を有していなくてはならな
い。標識剤は、結合GBS多糖抗原に存在し得る結合可能
な結合部位の内のいくつにも結合する親和性を有してい
てもよい。結合部位の結合可能性は、抗原標識剤と所望
の結合部位の性質により決まる。
前にも述べたように、GBS多糖抗原には38のモノラム
ノースエピトープと４つのトリラムノースエピトープが
ある。それ故に、抗原標識剤は、モノラムノースエピト
ープに特異的に結合する親和性を有していることが好ま
しい。こうすると、検定する物質の１個の分子に対して
標識を有する物質の多数の分子が結合することで、増幅
ができる。
好ましくは、抗原標識剤は、ヒツジの抗血清から得た
ポリクローナル抗体（例えば、BCH−402と表示されるGB
S多糖ヒツジ抗血清（カナダ国ケベック州ラバルのIAFバ
イオケムインターナショナル社））から成り、GBS多糖
抗原のモノラムノース抗体に結合する親和性を有する。
抗原標識剤は、検出を行なうための適切な標識または
トレーサー成分を有する。免疫検定に適切に用いられる
標識またはトレーサー、例えば、酵素、放射性同位元素
または蛍光標識を、標識抗体に結合できる。使用される
標識により、もちろん、検出法の性質は決まるものであ
る。
標識酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、
例えば、過酸化水素オキシドレダクターゼ（EC1.11.1.
7）のこともある。ホースラディッシュペルオキシダー
ゼは既知の還元アミノ化法を用いて抗体などの物質に結
合させることができる（14、15）。例えば、本発明者ら
は、NaBH4をより弱い還元剤であるNaCNBH3に代え、抗体
に対するペルオキシダーゼの初期反応比を2:1とした、
ティファーセン（Tijesen）アミノ化法を使うとより有
利であることを見い出した。より弱い還元剤の使用によ
り、NaBH4を用いて得た複合体に比べ、約1.2倍ほど感度
の優れた抗体−酵素の複合体が得られることが判明して
いる。さらに、上記の反応比を用いると、NaCNBH3を還
元剤として用いた場合の抗体に対する酵素の最終比は、
NaBH4を還元剤として用いた場合の比が1.6であるのに対
して、2.2となる。
このような方法で得られる酵素抗体複合体は、従来の
方法により複合体を透析処理することにより精製して、
存在し得る反応しなかったペルオキシダーゼ及び抗体を
除去することができる。あるいは、残った反応物はアフ
ィニティゲル法で除去することができる。例えば、抗体
−酵素複合体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダー
ゼとその複合体を結合するが、遊離IgG抗体とは結合し
ないコンカナバリンＡレクチンアフィニティゲルを含む
カラムで処理される。そして、結合した複合体は適切な
溶離剤を用いるとカラムから溶出し、得られた溶出物
は、複合体とは結合するが、ペルオキシダーゼ自体には
結合しないα−Ｌ−ラムノース−１−アフィニティゲル
を含むカラムで処理される。すると複合体はラムノース
溶離剤によりカラムから溶出される。得られた溶出物に
は、その後透析を行ない、遊離ラムノースを取り除く。
以下、ELISA方式について本発明の組合せ物と試験キ
ットを説明する。しかし、本発明はいかなる検定方式に
も適用でき、ELISA方式に限定されないことを理解され
たい。従って、本発明は、例えば、ラテックス凝集方式
や放射線免疫検定方式にも適用できる。
組合せ物または試験キットは、例えば、容器の表面に
固定化された抗原捕捉剤を含む容器から成る試験装置を
包含することもできる。組合せ物または試験キットは、
また、膣または子宮頚部から試験試料を採取するために
使用し、上記のような容器に挿入できる試料採取綿棒も
包含することができる。
さらに、組合せ物または試験キットは、抗原標識剤の
標識の性質により、標識抗原に会合したGBS多糖抗原検
出用の検出基質も包含することができる。検出基質は、
標識剤に使用される標識の性質により、１つ以上の成分
から成ることがあり、例えば第２検出基質成分の3,3',
5,5'−テトラメチルベンジジンと組み合わせた第１検出
基質成分のH2O2から成ることがある。組合せ物または試
験キットは、この他に、抗原標識剤とのインキュベーシ
ョン後に、非結合抗原標識剤を取り除くために、免疫吸
着剤を洗浄する洗浄剤も包含することができる。
本発明では、検出基質の成分は、各々の容器内で別々
の溶液とすることができ、あるいは１つの容器内で事前
に混合した溶液とすることができる。別々にする場合
は、使用前に混合するか、または、試験容器に別々に入
れる。
本発明は、また、親和性を有する抗体画分を（ポリク
ローナル抗体から）分離、回収、精製し、抗原捕捉／標
識剤として有用にするためのアフィニティゲルとして使
用することができる免疫吸着剤を提供する。この免疫吸
着剤は、不溶性担体と不溶性担体の表面に固定化された
抗体捕捉剤から成る。抗体捕捉剤は、（ａ）式α−Ｌ−
Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap−
１−のトリラムノース基、及び（ｂ）式α−Ｌ−Rhap−
１−のモノラムノース基［各式中、Rhapはラムノースで
ある。］から選択されるラムノース部分から成る。トリ
ラムノース免疫吸着剤（即ち、抗体捕捉剤がトリラムノ
ース基から成るもの）は、溶液を処理し、トリラムノー
スエピトープと相互作用する抗体を吸着する（即ち、分
離するか、捕捉する）ために使用できる。同様に、モノ
ラムノース免疫吸着剤（即ち、抗体捕捉剤がモノラムノ
ース基から成るもの）は、溶液を処理し、モノラムノー
スエピトープと相互作用する抗体を吸着するため使用で
きる。
抗体捕捉剤のラムノース部分がモノラムノース基から
成るモノラムノース抗体免疫吸着剤は、Ｌ−ラムノース
（例えば、米国ウィスコンシン州のアルドリッヒ・ケミ
カル社製）をセファロースCL−48（カナダ国ケベック州
ドーヴァルのファーマシア・ファイン・ケミカルズ社か
ら入手できるゲルの商標名）に既知の手順を用いて結合
することで得ることができる（20、21）。
あるいは、モノラムノース抗体免疫吸着剤は、モノラ
ムノースが本明細書に記載の不溶性担体に結合されるこ
とを除いて、上記のモノラムノース免疫原複合体を得る
方法と同じ方法により、合成した（４）誘導体である５
−メトオキシカルボニルペンチル−α−Ｌ−ラムノピラ
ノシドを出発物質として得ることができる。
抗体捕捉剤のラムノース部分がトリラムノース基から
成るトリラムノース抗体免疫吸着剤は、同様の方法で得
ることができる。
本発明は、また、GBS多糖抗原の、式α−Ｌ−Rhap−
１−のモノラムノース［式中、Rhapはラムノースであ
る。］のモノラムノースエピトープに結合する特異的親
和性を有する抗体の調製方法を提供する。この方法は、
ラムノース免疫吸着剤に、適切なポリクローナル抗体を
含む免疫血清を接触させ、（溶出により）成分に結合し
た抗体画分を溶出物として回収し、このようにして得ら
れた溶出物にトリラムノース免疫吸着剤を接触させ、こ
のように処理された所望の抗体を含む溶出物を回収する
ことから成る。
上記の方法は修正して、GBS多糖抗原の上記のモノラ
ムノースエピトープに結合する特異的親和性を有する抗
体と、上記のGBS多糖抗原のトリラムノースエピトープ
に結合する特異的親和性を有する抗体の調製にも用いる
ことができる。修正方法は、適切なポリクローナル抗体
を含む免疫血清をトリラムノース免疫吸着剤に接触さ
せ、（溶出により）所望の抗体を含む各々の抗体画分
を、成分に結合した物質から回収することから成る。
また、本発明は、適切な動物（例えば哺乳類または鳥
類）に注入することにより、GBS多糖抗原に対するモノ
クローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生を賦活
する免疫原複合体を提供する。免疫原複合体は、医薬的
に許容可能な担体、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ
血清アルブミンまたは破傷風トキソイドなどのポリマー
ないしタンパク質に結合した炭水化物から成る。炭水化
物は、GBS多糖抗原の、（ａ）式α−Ｌ−Rhap（１→
２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap−１−のトリ
ラムノース基、（ｂ）式α−Ｌ−Rhap−１−のモノラム
ノース基、または、（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）に各々
記載のトリラムノース及びモノラムノース基の混合物
［各式中、Rhapはラムノースである。］から選択される
ラムノースエピトープに対する抗体産生を賦活する免疫
反応性を有する。
炭水化物は、例えば上記のラムノース部分（ａ）、
（ｂ）及び／または（ｃ）から成ることがある。さら
に、免疫原複合体は、医薬的に許容可能な担体に結合し
たGBS多糖抗原から成ることがある。
一般に、炭水化物を医薬的に許容可能な担体に結合さ
せるためには、従来の方法を用いることができる。従っ
て、免疫原複合体は、炭水化物、例えば本明細書に記載
のラムノース部分から成る物質を、結合を行なうために
必要な物質及び／または担体の活性化を含む方法を用い
て、医薬的に許容可能な担体に結合することで調製する
ことができる。例えば、ラムノース部分は、開始物質と
してGBS多糖抗原自体を用いて担体に結合できる。ある
いは、適切なオリゴ糖の単位、部分、誘導体を使用する
こともできる。ラムノース部分から成るオリゴ糖は、GB
S多糖抗原から得ることができ、また、既知の手順にし
たがって合成することもできる（６、７）。
開始物質としての炭水化物物質は、例えば下記のよう
な一般的形態をとることができる。
［式中、Ｒは、Ｈまたは有機部分もしくは反応性部分で
ある。］ Ｒが水素の場合、例えば、適切なスペーサー基を介し
てラムノース基を医薬的に許容可能な担体に結合するの
が望ましいことがある。担体（例えばタンパク質）への
結合のための活性化は、ピドラジンまたはナトリウムメ
タペリオデートを用いて達成できる。Ｒはさらに−（CH
2）５−COOMe、Ｄ−グルシトール、または、下記式の基
の場合もある。
モノラムノース基を含むモノラムノース免疫原複合体
は、合成誘導体である５−メトキシカルボニルペンチル
−α−Ｌ−ラムノシド（７）を開始物質として得ること
ができる。この誘導体は、ヒドラジン水化物で活性化さ
れ、タンパク質担体に結合されて、モノラムノース複合
体を得ることができる。トリラムノース免疫原複合体、
すなわち、トリラムノース基を含む免疫原複合体は、相
当する５−メトキシカルボニルペンチル−α−Ｌ−トリ
ラムノシド誘導体を開始物質として、同様の方法で得る
ことができる。
上記のような免疫原複合体は、おそらく、ラムノース
基を不溶性担体に結合する場合の中間物として使用する
こともできる。このようにして得られた抗体免疫吸着剤
は、例えばELISAタイプの測定において、血清診断剤と
して用いることができる。複合体は、上記に述べたよう
に、従来の固定化法を用いて表面に結合させることがで
きる。
上記のような免疫血清は、例えば、上記に述べたよう
な免疫原複合体に以前にさらされたことがある適切な動
物（例えば哺乳類や鳥類）の血液から作り出せる。例え
ば、医薬的に許容可能な担体、例えば破傷風トキソイド
に結合されたGBS多糖抗原から成る免疫原複合体は、リ
ン酸緩衝液食塩水中の複合体溶液とフロイント完全アジ
ュバントを混合して得た乳濁液を、適切なマウスの腹腔
内に毎月連続して注入すると、抗体の産生を誘発するこ
とができる。GBS多糖抗原に対する抗体の力価が検出可
能になったときに、ハイブリドーマ細胞を通常の方法で
得ることができる（16）。
本発明の好ましい態様では、抗原捕捉剤と抗原標識剤
を、ツーサイトサンドイッチ・タイプの免疫検定となる
ように設定することができる。この検定では、抗体は、
GBS多糖抗原の異なるエピトープに対して個々に親和性
を有する。好ましくは、抗原捕捉剤はトリラムノースエ
ピトープと結合する親和性を有し、抗原標識剤はモノラ
ムノースエピトープと結合する親和性を有する。このツ
ーサイト抗体の設定では、トリラムノースエピトープを
捕捉部位として用いるため特異性が増加し、抗原標識剤
のターゲットとしてより多数のモノラムノースエピトー
プを使用する結果、感度も増加する。
本発明で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ細胞系を用いる従来の方法を用いて得ることができ
る。このため、GBS多糖抗原に結合する所望の親和性を
有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞系を用いることができる。例えば、コーラー（Kohle
r）とミルステイン（Milstein）の方法（17）をモノク
ローナル抗体の生成に用いることができる。スターリ
（Stathli）ら（18）の方法を、同じ抗原の異なるエピ
トープに対するモノクローナル抗体の識別に用いること
ができる。
抗原捕捉剤がモノクローナル抗体から成る場合は、抗
体はＢ群連鎖球菌多糖抗原のトリラムノースエピトープ
に結合するための必要な親和性を有している必要があ
る。上記の性質を有するならば、モノクローナル抗体は
いかなるアイソタイプでもよい。
モノクローナル抗体GBS1/18:6/D1は、GBS多糖抗原の
トリラムノースエピトープを認識するモノクローナル抗
体の一例であり、好ましくは、捕捉抗体として使用され
る。抗体はIgG3アイソタイプで、GBSの血清型I a、I
b、I c、II、IIIと相互作用することが判明している。
この抗体は、カナダ国ケベック州ラバルのIAFバイオケ
ムインターナショナル社によりBCH−406とも表示されて
いる。
上記のIgG3モノクローナル抗体は、既知の方法を用い
て腹水（マウスまたはその他の動物）から得ることがで
きる（16）。得られたIgG3モノクローナル抗体は、アイ
（Ey）,P.I.らの方法を用いて、プロテインＡアフィニ
ティクロマトグラフィーにより腹水から精製することが
できる（19）。このため、例えば、腹水は、既知の方法
で、IgG3抗体を分泌する（カナダのケベック州ラバルの
IAFバイオケムインターナショナル社により）BCH−136
と表示されるハイブリドーマ細胞系を用いて得ることが
できる。このハイブリドーマで得た腹水の試料は、プロ
テインＡセファロース−4Bカラムを用いたプロテインＡ
アフィニティクロマトグラフィーで精製できる。本発明
では、この種のカラムからの溶出は、4.5のpHで可能で
あり、1mlの腹水当り2.1mgのIgGの収率であることが判
明している。
あるいは、抗原捕捉剤または抗原標識剤として有用な
抗体は、まず動物の体内に有効な量の賦活剤を注入し、
GBS多糖抗原に対する所望の抗体産生を起こさせ、その
後に動物の抗血清から所望の抗体を回収することによっ
て得ることができる。動物は、例えば、ウサギ、ウマ、
ヤギ、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ニワトリな
どから選ぶことができる。賦活剤は、本明細書に記載す
るような免疫原複合体から成ってもよい。所望の抗体
は、これも本明細書に記載の抗体免疫吸着剤を用いるこ
ともある、従来の方法を用いて抗血清から精製すること
ができる。
本発明者らが行った結合阻害の研究から、BCH−406モ
ノクローナル抗体は、トリラムノースエピトープ［α−
Ｌ−ラムノース−（１→２）ラムノース（１→２）ラム
ノース−１］に対して非常に高い特異性を有することが
示された。ジラムノース「ラムノース（１→２）ラムノ
ース−１−］との相互作用は、1/20しか有効でないこと
が判明し、また遊離ラムノースとの相互作用は無視でき
ることが判明した。
本発明者らはまた、アフィニティ精製したヒツジのポ
リクローナル抗体の特異性の研究から、別々の２つのラ
ムノース含有エピトープが同等に相互作用できることを
見い出した。この２つのラムノースは、ラムノース（１
−３）ガラクトースとラムノース（１−３）グルシトー
ル構造で、併せて抗原の１モル当り30モルの数である。
これは、シングルサイトELISAにトリラムノースエピト
ープのみを用いた場合に得られるものより、10倍以上の
数の標識抗体付着部位が得られる可能性があることを意
味する。実際、図7Aと図7Bに示すように（後で論じ
る）、0.37ngの抗原濃度において、シングルサイトELIS
Aの場合と比較し、ツーサイトELISAでは4.2倍以上のシ
グナルが観察された。
GBS多糖抗原を含むと考えられる試験液、例えば血清
や分析物は、多糖抗原を免疫吸着剤に結合するを助ける
インキュベーション条件下で、抗原免疫吸着剤に接触さ
せ、インキュベートすることができる。その後、既知の
方法（14）にしたがい、適切な抗原標識剤（例えば末端
α−Ｌ−ラムノースを特異的に示すポリクローナル抗体
−酵素複合体）をこのように結合された多糖抗原に接触
させ、これら２つを一緒にインキュベートして、標識剤
を「サンドイッチ」状に免疫吸着剤を結合した多糖抗原
に結合させ、検出を行なう。このように、結合した多糖
抗原は所望の感度を与えるのに十分な量の抗原標識剤に
さらされる。インキュベーション後、適切な洗浄緩衝液
で洗浄して余分な標識剤を取り除く。GBS多糖抗原の存
在は、結合したGBS多糖抗原に結合した酵素を適切な検
出基質にさらすことにより測定できる。抗原の存在の有
無は、色の変化の有無で分かる。存在する細菌の量は、
試験での発色と比較するための検量色表（カラーチャー
ト）によって、または分光光度計と抗原の標準曲線によ
って測定できる。
本発明では、ELISAタイプの測定は、例えば、下記
（ａ）〜（ｋ）の手順によって行なうことができる。
（ａ）細菌試料（例えば疑わしい細菌を含む試料採取綿
棒）を、容器の内側表面に適切な抗原捕捉剤を固定化し
た試験容器に入れ、（ｂ）亜硝酸ナトリウムの水溶液と
酢酸の水溶液を加え、（ｃ）得られた抽出混合物と共
に、室温で約５分から20分、時々撹拌しながら、綿棒を
インキュベートし、（ｄ）例えば、0.2％ツウィーン−2
0を含むpH7.4の0.2M塩化トリス溶液などの中和剤を加
え、（ｅ）所望の酵素レベルを有する所望の抗原標識剤
を加え、（ｆ）このようにして得た混合物を適当な時間
（例えば10〜15分）室温にて容器内で、時々撹拌しなが
らインキュベートし、（ｇ）綿棒（ある場合）と試験容
器に残っている溶液を取り除き、試験容器の内側表面を
TBSTで洗浄し、洗浄溶液を捨て、（ｈ）酵素検出基質を
洗浄した容器に加え、（ｉ）酵素検出基質混合物を試験
容器の内側表面に接触させて、室温で適切な時間（例え
ば10〜15分）、必要であれば時々撹拌しながら、インキ
ュベートし、（ｊ）得られた試験容器内の混合物に、GB
S多糖抗原／細菌の存在を示す色の変化があるかを目視
で検査し、及び／または（ｋ）（既知の方法で分光光度
計を用いて）吸光度検査を行ない色の変化を記録し、必
要な場合には、酵素／基質活性を停止させるのに十分な
量の無機酸（たとえばH2SO4）を、0.5Nの最終酸濃度を
得るに十分な量（１〜3Nの硫酸を50〜100μｌ）になる
よう、混合物に加えて検査を行なう。必要により、綿棒
は上記のステップ（ｄ）の前、ステップ（ａ）の前、ま
たは（ｆ）の前で取り除くことができる。しかし、ステ
ップ（ｆ）の後で取り除くのが好ましい。流体中に十分
な量の抗原がある場合、例えば乳を培養してウシを試験
する場合などは、抽出ステップは一般には必要ではな
い。
前記したように、最大量の捕捉抗体をコートするとい
う標準的な方法で、トリラムノースエピトープを用いた
シングルサイトELISAを行うと、感度は1ng未満の抗原と
いう重要な範囲でゼロ近くまで低下した。いかなる理論
に拘束されるものではないが、これについて有り得る説
明としては、各GBSにある限定数（４個）のトリラムノ
ースエピトープが、完全に捕捉抗体に結合し、そのため
標識のついた第２抗体が付着することができなくなる、
というものである。捕捉抗体の密度を500ng/ウェルから
160ng/ウェルに減少させると、感度が少し低下するが、
ELISAは機能することが判明した。これはおそらく、ウ
ェルの壁にある抗体の結合部位の間隔を、全てのトリラ
ムノースエピトープが結合しないようにあけることであ
る。最適密度が160ng/ウェルよりむしろ200ng/ウェルで
あるツーサイトELISAでのコーティング密度の効果から
（図7Bを参照）、このように減少させたコーティングに
よりシグナルが約20％低下すると推定される。このた
め、幾分かの感度の損失と、捕捉抗体のコーティングを
正確に制御する必要から、トリラムノースエピトープは
シングルサイトELISAにおいて使用するのにあまり適し
ていない。
一方、ヒツジのポリクローナル抗体が結合するモノラ
ムノースエピトープは、抗体のコーティング密度にかか
わらず、シングルサイトELISAで機能する。これは多
分、抗原分子当りのこのエピトープの数がより多いため
（38モル／モル）である。しかし、このエピトープは、
抗原の濃度が著しく高い場合に限り、緑膿菌（Pseudomo
nas aerogenosa）との交差反応を示すという欠点があ
る。
トリラムノースエピトープを介しての複数部位付着
（multisite attachment）は、このようにツーサイトEL
ISAにとっては著しい利点である。抗原がIgG及びIgM抗
体に多価結合することによって得られる、機能的親和性
の増加は、それぞれ103倍及び106倍のオーダーであると
示されている（28）。さらに、全ての４つのトリラムノ
ースエピトープによることもあり得るGBS多糖抗原の多
価の捕捉は、この抗原の捕捉について固相の機能的親和
性を有意に増加させると期待できる。
図１には、表４に示すオリゴ糖を用いて、ウサギのポ
リクローナル抗血清とＢ群多糖の沈降を阻害する実験か
ら得られた阻害曲線が示されている。これらは、Ｂ群多
糖（５、６）の断片であるか、あるいはこれらの構造的
同族体であり、合成法（７）またはＢ群多糖の分解
（５、６）で得られた。ポリクローナルのウサギGBS抗
血清に関連する２つの別個の特異性が、これらの実験で
識別できる。まず第１は末端１−２−結合α−Ｌ−トリ
ラムノピラノシドに関連する主たる特異性であり、第２
は末端α−Ｌ−ラムノピラノシドに関連する。これは次
のように推測できる。
オリゴ糖１、２及び３はすべて同じように優れた結合
の阻害剤で、全てに１−２−結合α−Ｌ−トリラムノピ
ラノシドエピトープが含まれる。オリゴ糖１及び２に
は、Ｂ群多糖を構成するオリゴ糖断片が余分に含まれる
という事実（６）にもかかわらず、これらの三糖のアグ
リコンは、それらの阻害特性にとって比較的重要ではな
い。
オリゴ糖１及び３から末端α−Ｌ−ラムノピラノシル
残基を取り除き、それぞれオリゴ糖５及び４にすると、
阻害特性はかなり低下する。従って、トリラムノピラノ
シドエピトープの末端α−Ｌ−ラムノピラノシル残基と
末端から２番目のα−Ｌ−ラムノピラノシル残基の間に
ある末端１−２−結合は、結合にとって重要である。こ
れはまた、上記の末端１−２−結合が１−３−結合また
は１−４−結合に代わったオリゴ糖12、13及び14を用い
て行った実験でも確認されている。オリゴ糖３として表
されているトリラムノースエピトープ全体の末端α−Ｌ
−（１−２）−結合をα−Ｌ−（１−４）−結合に変え
ただけのオリゴ糖12では、α−Ｌ−トリラムノピラノシ
ドエピトープに対する抗体について非阻害的となった。
末端α−Ｌ−ラムノピラノシドエピトープに基づく抗
体群は、この構造上の特徴を含むオリゴ糖12、13、14及
び15を用いた阻害実験（図１を参照）で最も良く識別さ
れる。これらの実験に用いた他のオリゴ糖もまたこの構
造の特徴を有するが、しかしこれらオリゴ糖には余分の
エピトープ構造が含まれているために、阻害特性はより
複雑である。α−Ｌ−ラムノピラノシドエピトープの単
純な単量的性質は、メチルα−Ｌ−ラムノピラノシド15
がオリゴ糖12、13及び14と同効の阻害剤であるという事
実でも示されている。
図１では、また、ウサギの抗血清中の第３のエピトー
プに関連する抗体の存在が、オリゴ糖６と８の阻害性質
によって示されている。オリゴ糖12、13、14及び15と同
様に、オリゴ糖８にもまた末端α−Ｌ−ラムノピラノシ
ル残基が含まれているが、オリゴ糖８は前述のオリゴ糖
類より優れた阻害剤である。このため、３番目のエピト
ープ特異性は、オリゴ糖８の末端α−Ｌ−ラムノピラノ
シル残基と別の隣接するグリコース成分の両方が関連し
ていると考えられる。末端α−Ｌ−ラムノピラノースも
また第３のエピトープにとって重要であるという事実
は、これをオリゴ糖８から除去すると、得られたオリゴ
糖８は完全に阻害機能がなくなるという事実からも確認
できる。第３のエピトープは、またＢ群多糖の実際の成
分であるオリゴ糖６に存在する。
図２はウサギのポリクローナル抗血清の血清学におけ
るα−Ｌ−トリラムノピラノシドエピトープの優位性を
示す。これは、２つの源からのそのままのＢ群多糖、及
び、ナリンギナーゼ（α−Ｌ−トリラムノシダーゼ）で
処理した生成物（即ち、Ｂ群多糖（100mg）をペニシリ
ウム種（EC3.2.1.40、ミネソタ州セントルイスのシグマ
社）の10単位のナリンギナーゼで処理して得られた生成
物）の比較によっても確認された。ナリンギナーゼはＢ
群多糖のα−Ｌ−トリラムノピラノシドエピトープか
ら、末端（１−２）−結合α−Ｌ−トリラムノピラノシ
ドを特異的に除去することが知られている（６）。I a
群とIII群から得たＢ群多糖は、全く同じ沈降曲線を描
き、これはまた各々のナリンギナーゼ処理生成物でも同
じである。沈降曲線から、α−Ｌ−トリラムノピラノシ
ドエピトープに特異性を有する抗体は、沈降した抗体全
体のほぼ2/3（66％）と推測できる。Ｂ群多糖に特異性
を有する他の抗体はすべて、α−Ｌ−トリラムノピラノ
シドへの特異性を有するものも含め、ナリンギナーゼで
処理したＢ群多糖で沈降する。
図３は、上記のウサギの抗血清の、α−Ｌ−トリラム
ノピラノシドとα−Ｌ−トリラムノピラノシドエピトー
プに基づくエピトープ特異性のものへの分画を示す。こ
れは、α−Ｌ−トリラムノピラノシドエピトープが固体
支持体にうまく結合したアフィニティカラムを用いて行
った。α−Ｌ−ラムノピラノシドに特異的な抗体は、0.
2Mのα−Ｌ−ラムノースを含む緩衝液を用いてカラムか
ら溶出した。異なるアルカリ性を有するグリシンを含む
緩衝液でカラムからさらに溶出を行なうと、最終的には
pH11.5で、トリラムノピラノシドに特異性を有する抗体
が溶出された。２つの異なる特異性を有する抗体を含む
画分は、α−Ｌ−ラムノピラノシド複合体とα−Ｌ−ト
リラムノピラノシド複合体をコーティング抗原として用
いたELISAで画分をモニターすることで識別した。
図４は、アフィニティ精製したα−Ｌ−トリラムノピ
ラノシドに特異性を有する抗体を用いたELISA阻害実験
を示す。Ｂ群多糖はELISAプレートのウェルに結合しな
いため、Ｂ群多糖−BSA複合体をコーティング抗原とし
て用いた。末端α−Ｌ−トリラムノピラノシドエピトー
プ（オリゴ糖１、２及び３）を含むオリゴ糖は全て、結
合に対し同効の阻害剤であった。α−Ｌ−ジラムノピラ
ノシド（オリゴ糖４）はより効果の少ない阻害剤である
が、結合を阻害することはできる。メチルα−Ｌ−ラム
ノピラノシドの低い阻害特性で証明されているように、
α−Ｌ−ラムノピラノシドに特異性を有する抗体が先に
この画分から除去されているため、オリゴ糖４がこの抗
体の画分をなお阻害するという事実から、この抗体の特
異性はα−Ｌ−トリラムノピラノシドエピトープ全体に
対するものであることが示された。
図５は、Ｂ群多糖特異的モノクローナル抗体（16）、
及び、コーティング抗原としてＢ群多糖−BSA複合体を
用いたELISA阻害実験から得た結合曲線を示す。本質的
には、上記のアフィニティ精製したウサギのポリクロー
ナル抗血清でも同じ結果が得られた。同じく、末端α−
Ｌ−トリラムノピラノシドエピトープを含む全てのオリ
ゴ糖（１、２及び３）は優れた阻害剤であり、α−Ｌ−
ジラムノピラノシド（オリゴ糖４）は、それほど優れた
阻害剤でないとしても、阻害剤としての機能を有してい
た。メチルα−Ｌ−ラムノピラノシド（31）はこの系で
は非常に効果のない阻害剤である。
トリラムノシド及びモノラムノシドのエピトープ以外
と関連する特異性を有する抗体もまた、ウサギのポリク
ローナル抗血清中で識別できた。四糖α−Ｌ−Rhap−
（１−３）α−Ｄ−Galp（１−３）β−Ｄ−GlcpNAc
（１−４）α−Ｌ−Rhapを含むオリゴ糖は、末端モノラ
ムノシドエピトープだけより、上記の抗体へのＢ群多糖
の結合を阻害する優れた阻害剤であった。四糖はオリゴ
糖Ｉ及びIIの構造的特徴を有しており、それ故にＢ群多
糖内部にＩ及びIIがあるにもかかわらず、四糖は免疫機
構に関わることができるのである。
図６は、精製したヒツジのポリクローナル抗体の特異
性に関連するものである。これは、表４に示す群特異性
多糖の断片を用いたELISAの阻害研究で評価された。抗
体結合の阻害剤を試験するために、PBST中の抗体（100
μｌ）と抑制剤（100μｌ）を、低結合タイプのミクロ
タイタープレート（米国マクリーンのフローラボラトリ
ー（Flow Laboratories）、リンブロ／タイターテック
（Linbro/Titertek）EIA）のウェルで、室温で１時間予
備混合した。この阻害剤／抗体溶液の100μｌの容量
を、GBS多糖−BSA複合体コートミクロタイターウェルに
移し、１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼで
標識したウサギの抗ヒツジと酵素基質を上記に述べたよ
うに加えた。ラムノース−（１−３）−グルシトール
（オリゴ糖１、７及び10）またはラムノース−（１−
３）−ガラクトース（オリゴ糖８）のいずれかを含む断
片は、固相群特異性多糖−BSA複合体に対するPAb結合の
阻害剤としては、同じように有効であった。ラムノース
−（１−３）−グルシトールとラムノース−（１−３）
−ガラクトースの両方を含むオリゴ糖６は、これらの配
列の一方だけを含む断片より阻害剤として有力であっ
た。遊離ラムノースとラムノースのメチルグリコシドは
どちらも、非常に弱い阻害剤であり、10-5〜10-4Mの濃
度のオリゴ糖１、６、７、８及び10と同じ阻害を得るた
めには１×10-1Mの濃度を必要とすることが判明した。
単糖による抑制は、性質は弱いが、特異的のようであ
る。なぜなら、他の単糖（グルコース、Ｎ−アセチル−
Ｄ−グルコサミン）及び二糖（ラクトース、メリビオー
ズ及びスクロース）は１×10-1Mの濃度では阻害できな
かったからである。オリゴ糖（３及び４）は両方とも非
常に弱い阻害剤で、トリラムノシル基及びジラムノシル
基はラムノース単糖ぐらいしか有効でないことを示し
た。興味深いことに、試験を行った構造の中で最も弱か
ったが、ガラクトースもまた阻害することが分かった。
ガラクトースは、Rha（１−３）Gal（１−３）GlcNAc枝
の２番目の糖として、ポリクローナル抗体のＢ群多糖抗
原への結合に有意な役割を果たしているのかもしれな
い。グルシトール、ラムノース−（１−３）−グルシト
ールを含む二糖は非常に有効な阻害剤であったにもかか
わらず、グルシトールは、同様な濃度範囲で試験した場
合には阻害剤として機能しなかった。
図7A及び図7Bは、トリラムノシル基及びラムノシル基
を含むエピトープ用いたシングルサイトELISA及びツー
サイトELISAの感度に関するものである。トリラムノシ
ドに特異性を有するモノクローナル抗体が、捕捉抗体と
して使用された。図7Aでは、トリラムノシドに特異性を
有するペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体が
第２の抗体として使用された。図7Bでは、アフィニティ
精製され、ペルオキシダーゼ標識したヒツジのポリクロ
ーナル抗体が、第２の抗体として使われている。各ミク
ロタイターウェルをコートするために使用された抗体の
量はＸ軸に示されている。また、ウェルに加えられたＢ
群特異性を有する抗体の量は、0ng（白丸）、0.37ng
（黒丸）、1.11ng（白逆三角形）、3.33ng（黒逆三角
形）、10ng（白四角形）、100ng（黒四角形）である。
ミクロタイターウェルにコートされたモノクローナル
抗体の密度の関数としての感度は、GBS多糖濃度が低い
ときは（0.37ng/試験）、２面性を有することが判明し
た。最大シグナルは、ウェルのMab当り160ngで生じた
が、より高いコーティング密度では、シグナルはほとん
どゼロまで低下した。前記したように、この現象につい
て最も有力な説明は、抗体分子が多くの点で捕捉され
（すなわち、４つのトリラムノピラノシルエピトープす
べてが捕捉抗体層に結合している）、ペルオキシダーゼ
の標識がついたMabが付着できる抗原部位が残されてい
なかった、ということである。図7Aに示されているデー
タのこの解釈の確証となる観察は、200ng/ウェル以上の
Mabのコーティング密度で生じる阻害は、抗原濃度が高
い場合は見られないこと、即ち、0.37ngの曲線と100ng
の曲線との比較である。抗原が大量に余っている状態で
は、抗原の別の分子の抗原からのトリラムノシルエピト
ープが、捕捉層の抗体結合部位を占めると予測される。
こうなると、ペルオキシダーゼの標識がついた第２の抗
体が結合するために、各捕捉された抗原の４つのトリラ
ムノシド結合部位のうちの３つが残ることになる。トリ
ラムノシルエピトープを用いたシングルサイトELISA
は、捕捉抗体の密度がほぼ160ng/ウェル以外に保たれて
いると、可能なことが明白である。
図7Bは、モノクローナル抗体が捕捉抗体として、ポリ
クローナル抗体が標識された第２の抗体として用いられ
ているツーサイトELISAについて示す。図7Aに示すシン
グルサイトELISAと対照的に、捕捉層コーティング密度
に対する影響が示されていないことが分かる。その代わ
りに、0.37ngの抗原レベルにおいて、プラスチックが飽
和状態になり生じるシグナルがプラトー状態になるま
で、通常の線形関係がコーティング密度とシグナルの間
にみられる。このデータでは、第２の標識抗体の付着に
おいて捕捉抗体の干渉がないことが示されているが、こ
れは特異性が異なるためである。
図8A及び8Bは、抗原の捕捉のためにポリクローナルモ
ノラムノース含有エピトープを用いて行った同様の１対
の実験の結果を示す。シングルサイトELISA（図8A）、
ツーサイトELISA（図8B）のいずれでも、第２のペルオ
キシダーゼの標識がされた抗体の付着に捕捉層が干渉し
たという証拠はない。ポリクローナルには結合部位とし
て30カ所、つまり15のRha（１−３）Galと15のRha（１
−３）グルシトールがあり得るため、捕捉抗体のコーテ
ィング密度にかかわらず、ペルオキシダーゼの標識がさ
れた第２の抗体には付着部位が十分あるように思われ
る。
Ｂ群多糖を検出するために、ミクロタイタープレート
を200μｌのモノクローナルまたはポリクローナル抗体
の５μg/ml溶液でコートした。PBSTの200μｌ中の抗原
を30分間ウェルに入れ、次いで、PBSTで５回洗浄した。
PBSTで１万分の１に希釈したペルオキシダーゼで標識が
された第２の抗体を各ウェルに加え、30分後にウェルを
PBSTで再度５回洗浄した。酸素基質を追加し、吸光度を
読み取った。
図９は、図7B及び図8Bに示した２つのELISAの相対感
度を示す。血清型IIIのＢ群連鎖球菌細胞を上記に説明
したように抽出し、トリラムノースに特異性を有するモ
ノクローナル抗体（白丸）またはモノラムノシルエピト
ープに特異性を有するポリクローナル抗体（黒丸）でコ
ートしたミクロタイターウェルに移した。捕捉のための
トリラムノシルエピトープと、第２の抗体のペルオキシ
ダーゼ標識モノラムノース特異ヒツジポリクローナルの
付着部位としてモノラムノース含有エピトープを用いた
ツーサイトELISAは、モノラムノース含有エピトースを
捕捉及び標識第２抗体の両方のために用いたシングルサ
イトELISAと類似する感度を有することが分かった。ど
ちらのELISAの場合でも、新生児の分娩時の感染と相関
する３×104cfu（１）を検出するために必要な感度を有
していた。
図10は、捕捉抗体としてトリラムノース特異的モノク
ローナルを用いた２つのELISAの感度を示す。モノラム
ノース特異的抗体をプローブ（ツーサイトELISA、黒
丸）として用いた場合には、トリラムノシド特異的抗体
を使用した場合（シングルサイトELISA、白丸）より感
度が４〜５倍に増加したことが示された。
実際の細菌に対するツーサイトELISAの感度は、サン
プル当り３×104cfuを超えるGBSは、新生児の分娩時の
感染の発生と相関関係にあることを報告している研究の
観点からすると興味深い。図９に示すように、ツーサイ
トELISAでは実際に、この数の細菌の検出が可能で、従
って、予防的抗生物質治療が必要な女性を判断する場合
に役立つ感度を備えている。
プローブエピトープとしてモノラムノース構造を、ま
た捕捉エプトープとしてトリラムノースまたはモノラム
ノースを用いるシングルサイトELISA及びツーサイトELI
SAの特異性調査を、膣のフローラの代表細菌についての
ライブラリー（27）を用いて行った。この結果を表５に
示す。2.4×107cfu/試験の濃度、即ち、膣スワブに回収
される細菌の数（27）を超えるものが、試験された。シ
ングルサイトELISAは緑膿菌と主に（２倍未満であった
が）交差反応することが判明した。緑膿菌は、膣のフロ
ーラの部分では通常は見つからないヒトの病原菌であ
る。この生物は、ツーサイトELISAではほとんど検出で
きなかった。このことは、非常に高い特異性を示してい
る。どちらのELISAでも重大な交差反応性は見られなか
った。
以下の実施例で説明する実験では、表５に示す連鎖球
菌細菌の培養物の代表例とその他の細菌の培養物をイン
スティテュットアーマンドフラッピール（Institut Arm
and−Frappier、カナダ国ケベック州モントリオール）
の品質管理研究所から入手した。
さらに、GBS（特にステロタイプ18−WHO番号123−83
5）の従来の培養法を用いた。また細菌数も従来の方法
により測定した（24）。既知の数の、表５に示す連鎖球
菌細菌とその他の細菌を含む溶液を調製した。
実施例 本発明を、以下の非制限的な実施例により説明する。
実施例１ （抗原）免疫吸着剤を作成するための、ポリスチレン容
器担体上への抗原捕捉剤の固定化 ポリスチレンウェルとチューブを以下に示すように処
理した。活性化させる担体の表面を処理液でコーティン
グし、４℃で16時間インキュベートした。この処理液を
捨て、被処理表面をPBST（1ml）で３回、TBS（1ml）で
１回洗浄し、さらにTBS（5ml）で２回洗浄して、未結合
の抗体を除去した。こうして得られた免疫吸着剤を（37
℃で１時間）乾燥させ、４℃においてデシケータ中で保
存した。
前述の固定化法には、下記のものを使用した。
（ａ）ポリスチレン担体（および付随処理液） ヌンク（Nunc）（Nunc inter Med.デンマーク）の高
結合性マイクロタイタープレート（ウェル洗浄処理液
は、５μg/mlの抗体捕獲抗体を含有する0.2mlの炭酸水
素ナトリウム緩衝液（0.1M NaHCO3、pH9.6）から成
る。） ヌンクイムノチューブ（処理溶液は、５μg/mlの抗体
捕獲抗体を含有する0.25mlの炭酸水素ナトリウム緩衝液
（0.1M NaHCO3、pH9.6）から成る。） （ｂ）（Ｂ群連鎖球菌多糖類抗体のトリラムノースエピ
トープと直接反応する）抗体捕獲抗体 既知の方法（16）に従い、IgG3モノクローナル抗体BC
H−406（IAF BioChem International Inc.、カナダ国ケ
ベック州ラバル）を調製し、プロテインＡ−セファロー
ス4Bカラム（アイ（Ey）らの方法（19））を用いて腹水
から精製した。
実施例２ トリラムノース（抗体）免疫吸着剤の調製： トリラムノース基を含む抗体捕獲剤 α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−
Ｌ−Rhap−Ｄ−グルシトールは、合成（４）、及び、Ｂ
群多糖類をフッ化水素酸水溶液による分解の両方により
得た（３）。
室温で1.5mlの0.1Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液
中にα−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α
−Ｌ−Rhap−Ｄ−グルシトール（50mg）を溶解し、制御
過ヨウ素酸酸化法（16）法に従って、アルデヒドを選択
的に末端グルシトール残基に導入することによって、α
−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−
Rhap−Ｄ−グルシトールを活性化させた。10分間の酸化
反応後、0.5mlのエチレングリコールを添加し、反応を
停止させ、この溶液を４℃で20分間放置した。この溶液
を回転式エバポレータ中（＜40℃）で濃縮した。この濃
縮物をセファデックス61Gカラム（Parmacia）にかけ、
水で溶出させ、低分子化合物から分離した。この溶出物
をWaters R403型示差式屈折計でモニターし、酸化オリ
ゴ糖に相当する溶出物画分を凍結乾燥した。
酸化されたトリラムノシド（45mg）を水（3ml）に溶
解し、酢酸アンモニウム（500mg）およびナトリウムシ
アノボロヒドリド（50mg）と反応させた。この反応混合
液を、0.1Mの水酸化ナトリウムでpH9に調整し、この溶
液を37℃で48時間インキュベートした。アミノ基を含有
する生成トリラムノシドを、アルデヒドを含むトリラム
ノシド誘導体について前述した方法に従って精製した。
精製したアミノ官能性トリラムノシドを対象として、TN
BSの変法による分析（30）を行うと、アミノ基の取り込
みが90％を超えることが示された。
アミノ官能性トリラムノシド（35mg）を、0.1M炭化水
素ナトリウム緩衝液（5ml）に溶解し、この溶液を、5ml
（湿潤ゲル）のアフィゲル（Affigel）10（Ｎ−ヒドロ
キシスクシイミド型）（Bio−rad Laboratories,リッチ
モンド,CA）と共に４℃で16時間振とうした。得られた
ゲルを水及びPBSで洗浄し、0.035アジ化ナトリウム含有
PBS中に懸濁して４℃で保存した。取り込まれたトリラ
ムノシドの量（5mgトリラムノシド/ml湿潤ゲル）は、ハ
プテン結合ゲルの水洗浄液から回収した未反応オリゴ多
糖の量から計算した。
実施例３ モノラムノース（抗体）免疫吸着剤の調製： モノラムノース基を含む抗体捕獲剤 Ｌ−ラムノース（Aldrich chemical company Inc.ウ
ィスコンシン,USA）は、フォルンステド（Fornsted）及
びポラース（Porath）の方法（20）を利用し、蒸留水で
注意深く洗浄した、100mlのセファロースCL−4Bカラム
を、pH11の0.5Mカルボン酸緩衝液及び10mlのジビニルス
ルホンブリッジ（DVS,Aldrich chemical company,USA）
と共にインキュベートすることによって、セファロース
CL−4Bカラム（Pharmacia Fine Chemicals,Dorval,Queb
ec,Canadaから入手できるゲルの商標）にカップリング
させた。この混合液を、撹拌しながら室温で70分間放置
し、続いてガラスフィルターに移して蒸留水で注意深く
洗浄した。活性化させたこのゲル（100ml）に、pH10の
0.5Mカルボン酸緩衝液中の、20％（W/V）Ｌ−ラムノー
ス溶液100mlを添加して、室温において一晩カップリン
グ反応を進行させた。この生成物をガラスフィルター上
でさらに蒸留水で洗浄し、pH8.5の0.5M炭酸水素緩衝液
に懸濁した。2mlの２−メルトカプトエタノールを、懸
濁液100mlに対してそれぞれ添加した。２時間後にふた
たび生成物を回収し、蒸留水で注意深く洗浄した。
実施例４ 免疫原複合体の調製： Ｂ群連鎖球菌多糖類抗体−タンパク質複合体 既存の方法（５）に従って、Ｂ群連鎖球菌（菌株ATCC
12400すなわち菌株090タイプI a、菌株ATCC 12386すな
わち090RのＢ群）を増殖させ、既存の方法（５）に従っ
て培養上清からＢ群連鎖球菌多糖抗原を得た。109cfuに
おけるGBSの希釈液は、コロニーカウント法によって調
製した。
このＢ群連鎖球菌多糖抗原（120mg）を、塩基を用い
て部分的に解重合した後（50℃で5mlの水酸化ナトリウ
ムと30分反応）、この溶液をレキシン（Rexin）101
（H+）イオン交換樹脂で中和し、透析し凍結乾燥した。
このときの残渣をpH8.8の0.2M硫酸アンモニウム液（2m
l）に溶解し、10単位のアルカリフォスファターゼ（E.
C.3.1.3.1）（Millipore Corp.,Freehold,NJ）を用いて
室温で16時間処理した。冷フェノールで抽出を行い過剰
の酵素を除去して、残った水溶液を透析し凍結乾燥し
た。末端部アルデヒド基を、部分的に解重合させたＢ群
抗原における末端Ｄ−グルシトール残基へ導入する方法
は、制御過ヨウ素酸酸化法（29）に従った。前述のＢ群
連鎖球菌多糖抗原（100mg）を水（10ml）に溶解し、室
温において等容量の0.02Mメタ過ヨウ素酸ナトリウムで
８分間処理した。このとき、エチレングリコール（20m
l）を添加して過剰の過ヨウ素酸を分解し、この溶液を
４℃で20分間放置してから凍結乾燥した。過ヨウ素酸へ
さらしても、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原の抗原性に対しては
有害な影響が及ばなかったことは、Ouchterlony免疫拡
散実験において、酸化多糖が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原特
異性のウサギ抗血清に対して沈降能力を維持していたこ
とにより判定した。
酸化されたＢ群連鎖球菌多糖抗原（50mg）を、pH8.2
の0.1M炭化水素ナトリウム緩衝液1mlに溶解し、前述の
方法（29）に従って、10mgのBSA（St.LouisのSigma社か
ら入手したウシ血清アルブミン）または（Institut Arm
and Frappier,Laval,Quebecから入手した破傷風トキソ
イド製剤から得られる）単量体TTを同緩衝液1ml中に添
加して溶解した。この溶液にシアノボロ水素化ナトリウ
ム（sodium cyanoborohydride）（15mg）を添加し、マ
グネチックスターラーを用いて室温で４日間撹拌を続け
た。この複合体を、Bio−Gel A−5m（200−400メッシ
ュ）カラム（1.6×90cm）（Bio−Rad Laboratories,Ric
hmond,CA）を用い、溶離剤として水を使用してゲル濾過
法により精製した。カラムから溶出した画分を、Waters
R403型示差式屈折計と、280nmにおけるU.V.分光計によ
ってモニターした。このカラムを使用して、複合体から
過剰の多糖類抗原を分離し、複合体とTTまたはBSAの溶
出プロフィールを比較すると、全体が複合体状態である
ことが示された。Ｂ群連鎖球菌多糖−タンパク質複合体
を含有する画分を個々にプールし、透析および凍結乾燥
を行った。この複合体におけるタンパク含量をローリー
（Lowry）法（31）に従って測定し、炭水化物の含量を
Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を標準物質として、Dubois法（3
2）に従って測定した。TTのタンパク／多糖比は1:2.4と
なり、BSAでは1:3.0となった。複合体の純度は、ゲル濾
過カラム（Superose 12 HR10/30,Pharmacia）を用いたF
PLC（Pharmacia）によって確認した。膣フローラ（vagi
nal flora）（27）の代表種（表５参照）を含有する一
連の細菌については、Institute Armand Frappier,Lave
l,Canadaによって調製した。0.15Mの塩化ナトリウム中
における109cfu/mlの希釈液は、MacFatland光学密度法
により調製した。この細菌に最終濃度２％のホルマリン
を添加して殺菌し、使用時まで−80℃で保存した。GBS
の抗原型は以下の通りであった。Streptococcus agalac
tiae I a（ATCC 12400）,I b（ATCC 12401）,II（ATCC
12973）,III（ATCC 12403）． 実施例５ 免疫複合体の調製： モノラムノース−BSA複合体及びトリラムノース−BSA複
合体 ５−メトキシペンチルでＤ−グルシトール誘導体を置
き換え、相当する１−Ｏ−Ｄ−グルシトール−α−Ｌ−
ラムノピラノシド及び１−Ｏ−Ｄ−グルシトール−α−
Ｌ−トリラムノピラノシド誘導体を合成する過程におい
て使用することを除いては、前述の方法（７）に従っ
て、５−メトキシカルボニルペンチル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシド及び５−メトキシカルボニルペンチル２−Ｏ
−［２−Ｏ−（α−Ｌ−ラムノピラノシル）−α−Ｌ−
ラムノピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシドを調製
した。
前述のオリゴ糖メチルエステル（100mg）およびヒド
ラジン水化物（500μｌ）の無水エタノール（2.5ml）中
の溶液を０℃に20時間維持した。この溶液を減圧下濃縮
し、水溶液からの凍結乾燥によって、ヒドラジンの痕跡
量を最終的に除去した。無定形の残渣を、N,N−ジメチ
ルホルムアミド（4ml）中で−50℃まで冷却し、ジクロ
ロメタン（100ml）中の四酸化二窒素（N2O4）（4.6g）
を添加した。温度を−10℃から−20℃に15分間維持し、
反応混合液を０℃でBSA（300mg）の水性緩衝液（20ml）
（pH9）へ直接添加した。この溶液を０℃に12時間維持
し、透析及び凍結乾燥を行った。
複合体の炭水化物含量は、システイン−硫酸法（27）
によって測定した。両複合体におけるBSA分子一つ当り
約40ハプテンが取り込まれていることが示された。
実施例６ 抗原標識剤の調製： モノラムノースエピトープに対するポリクローナル抗体
誘導体、即ち、セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼと
結合させた抗体 （Ａ）抗体誘導体の調製 ポリクローナル抗血清は、サフォーク（Suffox）ヒツ
ジを、２部のフロイントコンプリートアジュバント（Gi
bco Laboratories,Grand Island,USA）と、0.5mgのGBS
多糖−破傷風トキソイド複合体を含有する１部のPBS
（0.05MのNa2HPO4/NaH2PO4,pH7.4,0.15M NaCl）とのエ
マルジョンを用いて経皮的に免疫して得た。この複合体
はホルマリンで殺菌したＢ群連鎖球菌よりも抗原性が高
いことが判明した。注射後74日に大量に採血し、この全
血から抗血清750mlを（通常の方法で）分離し、この抗
血清を使用時まで−76℃で保存した。
Ｂ群連鎖球菌多糖抗体のモノラムノースエピトープと
相互作用をする抗体画分を、以下に述べる一連の操作に
従って、上記のヒツジ抗血清から単離した。
ステップ１ 免疫血清250mlを２×緩衝液Ａで２倍に希釈し、3.5cc
のRha3カラムを通した（5ml/hr,4℃）。トリラムノース
（抗体）免疫吸着剤（本明細書に記載したもの）を含有
するRha3カラムは、0.05MのNaH2PO4/NaHPO4,0.3Mの塩化
ナトリウムおよび0.01％アジ化ナトリウムから成るpH7.
4の緩衝液（緩衝液Ａ）を使い、あらかじめ平衡化し
た。
ステップ２ ステップ１においてRha3カラムを通した流体画分を一
緒にして、（12ml/hr4℃で）Rha1カラムのベッドを通し
た。このRha1カラムは、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化し
た15ccのモノラムノース（抗体）免疫吸着剤（本明細書
に記載したもの）のベッドを含有していた。緩衝液Ａ中
の0.1Mのα−Ｌ−ラムノースによるベッドの溶出によ
り、溶出の第１〜９ベッド容積の間に（モノラムノース
結合性の）画分が生じた。556mgのタンパクを含有す
る、この（モノラムノース結合性の）画分（119ml）
は、緩衝液2Lに対し７回にわたり透析を行い、α−Ｌ−
ラムノースの痕跡量を全部除去した。
ステップ３ ステップ２で得られた（モノラムノース結合性の）透
析画分をステップ１で述べたRha3の別のカラムに通し
た。Rha3カラムを通した画分を回収したところ、アプラ
イしたタンパクのうち401mgすなわち81％が画分に含ま
れることが判明した。
前述のようなアフィニティー精製法によって（通常の
方法で）得られた抗体誘導体を、セファクリルＳ−300
カラムを用いたゲル濾過で評価した。セファクリルＳ−
300スーパーファイン（Pharmacia（Canada）Inc.,Dorva
l,Canada）のカラム（1.6×100cm）を、HBS緩衝液（0.3
Mの塩化ナトリウムおよび0.01％アジ化ナトリウムを含
有する0.05MのHEPES緩衝液、pH7.4）で平衡化した。こ
のカラムを、市販の、分子量が1,350ダルトンから670,0
00ダルトンの範囲のゲル濾過標準物質混合物（BioRad l
aboratories,Missisauga,Canada）を用いて校正した。H
BSに溶解した精製抗体13.8mgを、5ml/hrの流速において
４℃でゲルに通し、溶出したタンパク質の位置を280nm
における吸光度から読みとった。アプライしたタンパク
質の93％を含有する単一の所要主要ピークが、標準IgG
と同一の溶出体積で回収された。アプライしたタンパク
の２％を含有する分子量約5000の小さいピークが発生し
た。これらの結果から、この精製方法においては、IgG
と同一のタイプの抗体が高い純度で得られることが示さ
れた。（ポリクローナル）抗体誘導体の特異性を測定し
たところ、マイクロタイタープレートに結合した［ラム
ノース（１−２）ラムノース（１−２）ラムノース］の
牛血清アルブミン複合体には、結合できないことが判明
した。しかし、［Ｌ−ラムノース−１−］またはＢ群連
鎖球菌多糖抗原ユニットを含有する複合体では、強い反
応性が認められた。よって、得られた抗体は、Ｂ群連鎖
球菌多糖抗原上に認められる末端モノラムノース基と反
応している。
（Ｂ）抗体標識剤の調製 セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼ（すなわち過酸
化水素酸化還元酵素、EC 1.11.1.7）を、還元的アミノ
化法（15）を使用して、得られた抗体誘導体（画分）と
結合させた。但し、NaBH4の代わりにNaCNBH3を使用し
た。また、セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼと抗体
の初期反応比をも2:1として反応させた。このあと、単
純透析を行い、NaCNBH3などの残留反応物をすべて除去
した。
実施例７ トリラムノースエピトープ特異性抗体及びモノラムノー
スエピトープ特異性抗体の調製 トリラムノースエピトープ特異性抗体及びモノラムノ
ースエピトープ特異性抗体は、前述したトリラムノース
（抗原）免疫吸着剤等を使い、適切なウサギ高血清をア
フィニティークロマトグラフィー処理することにより、
以下のように得た（分離及び精製した）。
（ａ）ウサギ抗血清の調製 ニュージーランド白色ウサギを、マクカーティ（McCa
rty）及びランスフィールド（Lancefield）らの方法（3
3）に従ってホルマリン殺菌した生物全体（菌株090R/AT
CC 12386）で免疫した。GBS1/18:6/D1と表示される。GB
S多糖（16）に対するマウスIgGモノクローナル抗体が腹
水中に生成し、プロテインＡアフィニティークロマトグ
ラフィーにて精製した。腹水は、プリスタン感作Balb/c
マウスにハイブリドーマ細胞を注入することにより生成
させた。
（ｂ）トリラムノシドエピトープに対するポリクローナ
ル抗体のアフィニティー精製 トリラムノシド結合ゲル（3.5mL）を含有するカラム
（直径1cm）を、PBSで平衡化した。PBSで1:1に希釈した
ウサギ抗血清を5ml/hの流速でカラムに流した。続い
て、カラムを一連の緩衝液（A,B,C及びＤ）を使い、５
〜10倍のベッド容量の各緩衝液で溶出した。溶出プロフ
ィールは表３に示し、タンパク質についてはUV分光計に
て280nmで測定した。末端部のＬ−ラムノースに特異的
な抗体については、PBS中に0.2MのＬ−ラムノースを溶
解させた緩衝液Ａで溶出した。未確認タンパクについて
は、pH10.5の0.1Mグリシンを含有する緩衝液Ｂで溶出し
た。緩衝液Ｃ（pH11.0、0.1Mのグリシンを含有）を用い
てさらに溶出したところ、少量の未確認タンパクを得
た。トリラムノースに特異的な最終抗体は、緩衝液Ｄ
（pH11.5、0.1Mのグリシンを含有）を使用して得た。緩
衝液Ａ及び緩衝液Ｄを用いて得られた二つの抗体画分の
特異性は、ラムノシド−BSA複合体及びトリラムノシド
−BSA複合体を用いてELISA法（後述）により確認した。
両複合体の調製については前述のとおりである。緩衝液
Ａによって溶出した抗体画分は、両複合体と反応し、緩
衝液Ｄによって溶出した抗体画分は、トリラムノシド−
BSA複合体とのみ反応した。ほかの画分は、いずれの複
合体とも反応しなかった。
（ｃ）モノラムノース含有エピトープに対するポリクロ
ーナル抗体のアフィニティー精製 GBS多糖類−破傷風トキソイド複合体で免疫してから
３カ月後に採取したヒツジ血清は、Ｂ群連鎖球菌多糖−
BSA、トリアムノシル−BSA及びモノラムノシル−BSAの
ユニットに対する抗体について高い力価を示した。表１
に、モノラムノシル含有エピトープに対するポリクロー
ナル抗体の血清からの分離についてまとめて示す。
まず、α−Ｌ−（１−２）−トリラムノシドユニット
を含有するアフィニティーゲルに血清を通すことによ
り、α−Ｌ−トリラムノシドに結合する抗体を除去し
た。これは、緩衝液Ａ（0.05NのNa2HPO4/NaH2PO4,pH7.
4、0.30M塩化ナトリウム及び0.01％アジ化ナトリウム）
で、アフィニティーゲルの3.5mlのカラムを平衡化し、
等容量の２×緩衝液Ａを用いて希釈した免疫血清250ml
を、４℃において流速5ml/hrでゲルに通した。この過程
により、抗ラムノシル結合抗体のうち93％以上を除去し
た。同時に、ゲルに抗ラムノース結合活性が約63％保持
された。このことは、多糖抗原（６）における枝分かれ
していない（末端の）及び／または枝分かれしている
（内部の）トリラムノースユニットの（末端部の）ラム
ノースが、血清中に存在する抗モノラムノース結合活性
の大半を占めることを示している。抗モノラムノース結
合活性の残部（約37％）を含有するフロースルー画分
を、モノラムノースユニットを含むアフィニティーゲル
に通し、0.1MのＬ−ラムノースで溶出すると、556mgの
タンパクを含有するタンパク質画分が放出された。続い
て、透析を行ない、ラムノースを除去し、溶出したタン
パク質画分を、α−Ｌ−（１−２）−トリラムノシドア
フィニティカラムに再び通し、少量残っている抗トリラ
ムノピラノシド結合活性の残留分（元の約５％）を除去
した。２度目のトリラムノシドカラムのフロースルー画
分を合わせ、50％グリセロールに調整して−20℃で保存
した。トリラムノシル−BSA及びラムノシル−BSAでコー
ティングしたマイクロタイタープレートを使い、ELISA
法によってアフィニティーカラムからの抗体収率を測定
した。最終精製画分は、オリジナルの抗モノラムノース
結合活性に対して28.5％の活性を示すPAbを401mg含んで
いた。精製抗体を校正済みのゲル濾過カラムを通すこと
により、溶出したタンパク質のほとんど全体（97.9％）
がIgGから成ることが示された。
実施例８ 試料綿棒（specemen swab）から採取したＢ群連鎖球菌
（多糖抗原／細菌）の測定用ELISAタイプ検定 試験法は、以下に示したステップから構成された。
1.細菌溶液50μｌをレーヨン綿棒（Straplex）上にアプ
ライし、試料綿棒を抗体でコーティングした免疫検定チ
ューブまたはマイクロタイタープレートウエルへ入れ
る。マイクロタイターウエル（Immuno 4,Dynatech Labo
ratories Inc.,Chantilly,USA）を、0.10M Na2HCO3/Na2
HCO3緩衝液、pH9.6に溶解した抗体で、４℃において一
晩コーティングし、0.05％V/VのTween−20（PBST）を含
有するPBSで37℃において１時間ブロックし、PBSTで３
回洗浄してからPBSで３階洗浄して、37℃で１時間乾燥
させる。
2.2Mの硝酸ナトリウムを100μｌ添加する。
3.0.1Mの酢酸を100μｌ添加する。
4.綿棒を適宜回転させながら５分間置く。
5.0.2％のTween−20を含有するpH7.4の0.02M塩化トリス
を50μｌ添加する。
6.100μｌのペルオキシダーゼ複合体溶液（pH7.4の0.02
Mトリス塩酸、0.15M塩化ナトリウムから成り（すなわち
TBS）、１％正常ヒツジ血清、及び、標識剤としてペル
オキシダーゼ標識ポリクローナル抗体誘導体１μg/mL
（前述のとおり）を含む）を添加する。
7.綿棒を適宜回転させながら10分間置く。
8.綿棒を廃棄し、免疫検定チューブまたはマイクロタイ
ターウエルを、0.05％TWEEN−20を含有する（６×）TBS
で洗浄する。
9.テトラメチルベンジジン／過酸化水素から成る基質
を、ボス（Bos）らの方法（26）に従って添加する。
10.10分後に、チューブ／ウェル上の青色の発色を肉眼
で観察する。または、15分後にBio−Tek Instruments I
nc.,Vermont社製の分光光度計を使って、650nmでマイク
ロタイターウェルを測定した。感度をあげるためには1N
硫酸100μｌを添加して、450nmでマイクロタイターウェ
ルを測定する。免疫検定チューブを使う場合は、3N硫酸
を50μｌ添加して、酸の添加後に、基質溶液を、コーテ
ィングしていないマイクロタイターのプレートに移して
測定する。
抗原に対する抗体の結合性を測定するために、２μg/
mlの多糖−BSA複合体を100μｌでコーティングした。PB
STで希釈した抗体（100μｌ）を各ウエルにピペッティ
ングし、30分後にウエルを５回、PBSTで洗浄した。Fc特
異性のウサギ抗ヒツジIgG（100μｌ）（Jackson Immuno
research Laboratories Inc.,West Grove,USA）を添加
し、30分後に再びPBSTでウエルを５回洗浄した。各ウエ
ルに、ペルオキシダーゼに対するH2O2/テトラメチルベ
ンジジン基質（26）を添加して、15分後に650nmでの吸
光度を読みとった。
実施例９ Ｂ群連鎖球菌多糖抗原の測定における、亜硝酸による抽
出の及ぼす影響 実施例８に示したELISA法に続いて、Ｂ群連鎖球菌細
菌を１×106cfuを含む細菌の試験試料を使って試験を行
った。ただし、ステップ１から５までは、コーティング
していないマイクロタイタープレートを使い、ステップ
４における抽出時間については、表２に示したようにさ
まざまな時間をとった。表２で示した抽出時間の終了時
に、抽出物を、前述のようにIgG3モノクローナル抗体/B
CH−406でコーティングしたマイクロタイターウエルに
移した。試験の結果のアウトラインを次の表２に示す。
実施例10 Ｂ群連鎖球菌を対象とした実施例８のELISA法では、
A,B,C,D,E,FおよびＢ群連鎖球菌細菌由来の市販の抽出
物（Difco Co.Laboratories,Detroit Michigan U.S.A）
を使用した。これらの抽出物は、連鎖球菌における各タ
イプの多糖類を含む。マイクロタイターウエル方式に従
って試験を行ったところ、Ｂ群連鎖球菌からの抽出物
は、1/50,1/100,1/200,1/400,1/800,1/1600および1/320
0の各希釈範囲において、1.00（650nm）を超える吸光度
変化を示した。このほかの群においては、抽出物が陽性
を示すことはなかった。
実施例11 実施例８におけるELISA法を、既知数のホルマリン殺
菌Ｂ群連鎖球菌、Ｂ群血清型10（GBS18）と、正常ヒト
糞便中細菌E.lentumを使用して評価した。各試験におい
て、0.15MのNaCl150μｌ中の細菌を、微生物学用綿棒
（Starplex Plain S.09 from Scientific,Mississauga,
Ontario,Canada）へ各検定法実施直前にアプライした。
前述のごとく活性化した免疫検定チューブ（Nunc）にお
いて、検定を行った。比較の目的で、Binax Kitも使用
した。結果は表３に示す。
綿棒（膣由来）一つあたりのE.lentumの予測値は、約
２×107CFUである。すなわち、自然の状態において、膣
フローラ（34）に関して報告されている数に基づいてい
る。前述の表３に示したように、免疫検定チューブを使
用した場合には、E.lentumは、この範囲では、かろうじ
て検出可能なシグナルを生じた。
実施例12 沈降反応阻害試験は、ウサギ抗血清をPBSで10倍に希
釈した液100μｌに増加する種々の濃度の阻害剤を混合
し、37℃で１時間放置して行なった。抗原過剰域におい
て沈降する抗体の最大量より少し少量の沈降に十分な、
Ｂ群多糖（0.5μｇ）を、最終容量が200μｌとなるよう
に添加した。カバット（Kabat）及びメイヤー（Mayer）
らの方法（35）に従って、定量的な沈降分析を行った。
PBSで10倍に希釈したウサギ抗Ｂ群多糖特異的血清を、
多糖を増加する種々の濃度で最終容量が200μｌとなる
ように混合した（PBSで調製）。チューブを37℃で１時
間放置し、４℃で４日放置したものを遠心分離して、冷
PBSで２回洗浄し、再び遠心分離して、ペレット中のタ
ンパク質の量をローリーらの方法（31）により測定し
た。
ポリクローナルウサギ抗Ｂ群連鎖球菌多糖血清と、相
同性Ｂ群多糖の定量的沈降反応により、1ml当り1.2mgの
多糖特異性の抗体が含まれていることが判明した。
当業者であれば、本発明の要旨をはずれることなく、
抗原捕獲剤、抗原標識剤、標識、炭水化物、（不溶性）
担体（容器型を含む）、抗原固定化の量、抽出条件、容
器型担体の面積／体積比などのさまざまなパラメータを
変更できることは明らかであろう。
GBS細菌はすべて、あらかじめ低結合性タイタープレ
ート（Linbro/Titertek ETA）のウエル中で、亜硝酸抽
出法により抽出された。200μｌの0.15M塩化ナトリウム
中の細菌、25μｌの5.6N亜硝酸ナトリウム及び25μｌの
1.4N酢酸を混ぜ、15分間置き、pH10.0の1.4Nトリス塩酸
25μｌで中和した。この抽出液のうち200μｌの分液
を、抗体でコーティングしたプレートに移してELISA法
を開始し、Ｂ群連鎖球菌を検出した。各抽出液（100μ
ｌ）の等価（2.4×107cfu）の分液を、モノラムノース
特異性ポリクローナル抗体（シングルサイトELISA）１
μｌまたはトリラムノシド特異性モノクローナル抗体
（ツーサイトELISA）でコーティングしたプレートに移
した。ペルオキシダーゼ標識第二抗体を、両方の場合に
おけるモノラムノースエピトープ特異性ポリクローナル
抗体とした。
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (73)特許権者 999999999 プレジデント・アンド・フェロウズ・オ ブ・ハーバード・カレッジ アメリカ合衆国、マサチューセッツ・ 02138、ケンブリッジ、クインジー・ス トリート・17 (72)発明者 ジェニングズ，ハロルド・ジェイ カナダ国、オンタリオ・Ｋ１Ｊ・６Ｇ ６、グロスター ウッドグレン・クレセ ント・2049 (72)発明者 マイカン，フランシス カナダ国、オンタリオ・Ｋ１Ｎ・７Ｓ ６、オタワ、ネルソン・ストリート・ 429 (72)発明者 シャリフォール，ロバート・ジェイ カナダ国、ケベック・Ｈ７Ｖ・１Ｂ７、 ラバル、ブルバール・ドゥ・プレリー・ 531、ビルディング・ナンバー・10 (72)発明者 ラクロア，マーシャル カナダ国、ケベック・Ｈ７Ｖ・１Ｂ７、 ラバル、ブルバール・ドゥ・プレリー・ 531 (72)発明者 フェルドマン，ロバート イギリス国、ロンドン・ＮＷ９・８Ｔ Ｂ、オールド・チャーチ・レーン、オー ルド・ストリート・アンドルーズ・マン ションズ・10Ａ (72)発明者 カスパー，デニス・エル アメリカ合衆国、マサチューセッツ・ 02115、ボストン、ロングウッド・アベ ニュー・180 チャニング・ラボラトリ ーズ (72)発明者 ポツガイ，ヴィンス アメリカ合衆国、メリーランド・20852、 ロックビル、パークローン・テラス・ 5112、アパートメント・201 (56)参考文献 Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．, 65（12），2764 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ，19（４），457 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/569 A61K 39/395 A61K 39/40 C07K 14/315 G01N 33/53 G01N 33/577 C12P 21/08

Claims (42)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】不溶性担体、前記不溶性担体上に固定化さ
    れ、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を前記担体に結合させる抗原
    捕捉剤、及び、前記抗原捕捉剤により捕捉された前記Ｂ
    群連鎖球菌多糖抗原に結合する抗原標識剤から成り、前
    記抗原捕捉剤及び前記抗原標識剤の少なくとも一方は、
    式α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−
    Ｌ−Rhap−１［式中、Rhapはラムノースである。］のト
    リラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有
    する抗体である免疫検定組合せ物。
  2. 【請求項２】前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原
    由来の、式α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→
    ２）α−Ｌ−Rhap−１［式中、Rhapはラムノースであ
    る。］のトリラムノースエピトープに特異的に結合する
    親和性を有する抗体であり、前記抗原標識剤が、Ｂ群連
    鎖球菌多糖抗原由来の、式α−Ｌ−Rhap−１のモノラム
    ノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する抗
    体である請求の範囲第１項に記載の免疫検定組合せ物。
  3. 【請求項３】前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体であ
    る請求の範囲第２項に記載の免疫検定組合せ物。
  4. 【請求項４】前記抗原標識剤が、ヒツジポリクローナル
    抗体である請求の範囲第２項に記載の免疫検定組合せ
    物。
  5. 【請求項５】前記不溶性担体が、前記抗原捕捉剤を固定
    化して含む容器から成る請求の範囲第２項に記載の免疫
    検定組合せ物。
  6. 【請求項６】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで
    標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素で
    ある請求の範囲第４項に記載の免疫検定組合せ物。
  7. 【請求項７】前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原
    由来の、式α−Ｌ−Rhap−１［式中、Rhapはラムノース
    である。］のモノラムノースエピトープに特異的に結合
    する親和性を有する抗体であり、前記抗原標識剤が、Ｂ
    群連鎖球菌多糖抗原由来の、式α−Ｌ−Rhap（１→２）
    α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap−１［式中、Rhap
    はラムノースである。］のトリラムノースエピトープに
    特異的に結合する親和性を有する抗体である請求の範囲
    第１項に記載の免疫検定組合せ物。
  8. 【請求項８】前記抗原捕捉剤が、ヒツジポリクローナル
    抗体である請求の範囲第７項に記載の免疫検定組合せ
    物。
  9. 【請求項９】前記不溶性担体が、前記ポリクローナル抗
    体を固定化して含む容器から成る請求の範囲第７項に記
    載の免疫検定組合せ物。
  10. 【請求項１０】前記抗原標識剤がモノクローナル抗体で
    ある請求の範囲第７項に記載の免疫検定組合せ物。
  11. 【請求項１１】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第７項に記載の免疫検定組合せ物。
  12. 【請求項１２】前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗
    原由来の、式α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１
    →２）α−Ｌ−Rhap−１［式中、Rhapはラムノースであ
    る。］のトリラムノースエピトープに特異的に結合する
    親和性を有する抗体であり、前記抗原標識剤もまた前記
    トリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を
    有する抗体である請求の範囲第１項に記載の免疫検定組
    合せ物。
  13. 【請求項１３】前記抗原捕捉剤及び前記抗原標識剤がモ
    ノクローナル抗体である請求の範囲第12項に記載の免疫
    検定組合せ物。
  14. 【請求項１４】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第12項に記載の免疫検定組合せ物。
  15. 【請求項１５】（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑い
    のある試料の試験溶液に、不溶性担体に固定化した、式
    α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ
    −Rhap−１［式中、Rhapはラムノースである。］のトリ
    ラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有す
    る抗体である抗原捕捉剤を接触させ、（ii）式α−Ｌ−
    Rhap−１のモノラムノースエピトープに特異的に結合す
    る親和性を有する抗体である抗原標識剤を導入して、前
    記抗原捕捉剤に捕捉されたＢ群連鎖球菌多糖抗原の存在
    を検出することから成る、試料中のＢ群連鎖球菌多糖抗
    原を検出するための免疫検定法。
  16. 【請求項１６】前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体で
    ある請求の範囲第15項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記抗原標識剤が、ヒツジモノクローナ
    ル抗体である請求の範囲第15項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第15項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑い
    のある試料の試験溶液に、不溶性担体に固定化した、式
    α−Ｌ−Rhap−１のモノラムノースエピトープに特異的
    に結合する親和性を有する抗体である抗原捕捉剤を接触
    させ、（ii）式α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap
    （１→２）α−Ｌ−Rhap−１［式中、Rhapはラムノース
    である。］のトリラムノースエピトープに特異的に結合
    する親和性を有する抗体である抗原標識剤を導入して、
    前記抗原捕捉剤に捕捉されたＢ群連鎖球菌多糖抗原の存
    在を検出することから成る、試料中のＢ群連鎖球菌多糖
    抗原を検出するための方法。
  20. 【請求項２０】前記抗原標識剤がモノクローナル抗体で
    ある請求の範囲第19項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記抗原捕捉剤が、ヒツジモノクローナ
    ル抗体である請求の範囲第19項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第19項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑い
    のある試料の試験溶液に、不溶性担体に固定化した、式
    α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ
    −Rhap−１［式中、Rhapはラムノースである。］のトリ
    ラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有す
    る抗体である抗原捕捉剤を接触させ、（ii）同じく、前
    記トリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性
    を有する抗体である抗原標識剤を導入して、前記抗原捕
    捉剤に捕捉されたＢ群連鎖球菌多糖抗原の存在を検出す
    ることから成る、試料中のＢ群連鎖球菌多糖抗原を検出
    するための方法。
  24. 【請求項２４】前記抗原捕捉剤及び前記抗原標識剤がモ
    ノクローナル抗体である請求の範囲第23項に記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第23項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】試料中に存在するＢ群連鎖球菌からのＢ
    群連鎖球菌多糖抗原の抽出のため、試料を亜硝酸水溶液
    で処理することにより、試験溶液を得る請求の範囲第15
    項〜第25項のいずれか一項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】（ａ）不溶性担体上に固定化され、式α
    −Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−
    Rhap−１［式中、Rhapはラムノースである。］のトリラ
    ムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する
    抗体である抗原捕捉剤、（ｂ）有機酸から成る、Ｂ群連
    鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出
    のための第１抽出剤、（ｃ）無機亜硝酸塩から成る、Ｂ
    群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液
    抽出のための第２抽出剤（但し、第１抽出剤と第２抽出
    剤は、水性溶媒中で混合された場合に、共に反応して亜
    硝酸を生成し得るものである）、（ｄ）過剰の亜硝酸を
    中和するための中和剤、及び（ｅ）α−Ｌ−Rhap−１の
    モノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を
    有する抗体である抗原標識剤から成る、Ｂ群連鎖球菌多
    糖抗原検出用試験キット。
  28. 【請求項２８】前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体で
    ある請求の範囲第27項に記載の試験キット。
  29. 【請求項２９】前記抗原標識剤が、ヒツジポリクローナ
    ル抗体である請求の範囲第27項に記載の試験キット。
  30. 【請求項３０】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第27項に記載の試験キット。
  31. 【請求項３１】（ａ）不溶性担体上に固定化され、α−
    Ｌ−Rhap−１［式中、Rhapはラムノースである。］のモ
    ノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有
    する抗体である抗原捕捉剤、（ｂ）有機酸から成る、Ｂ
    群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液
    抽出のための第１抽出剤、（ｃ）無機亜硝酸塩から成
    る、Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸
    水溶液抽出のための第２抽出剤（但し、第１抽出剤と第
    ２抽出剤は、水性溶媒中で混合された場合に、共に反応
    して亜硝酸を生成し得るものである）、（ｄ）過剰の亜
    硝酸を中和するための中和剤、及び（ｅ）式α−Ｌ−Rh
    ap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap−１
    のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性
    を有する抗体である抗原標識剤から成る、Ｂ群連鎖球菌
    多糖抗原検出用試験キット。
  32. 【請求項３２】前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体で
    ある請求の範囲第31項に記載の試験キット。
  33. 【請求項３３】前記抗原標識剤が、ヒツジポリクローナ
    ル抗体である請求の範囲第31項に記載の試験キット。
  34. 【請求項３４】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第31項に記載の試験キット。
  35. 【請求項３５】（ａ）不溶性担体上に固定化され、式α
    −Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−Rhap（１→２）α−Ｌ−
    Rhap−１［式中、Rhapはラムノースである。］のトリラ
    ムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する
    抗体である抗原捕捉剤、（ｂ）有機酸から成る、Ｂ群連
    鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出
    のための第１抽出剤、（ｃ）無機亜硝酸塩から成る、Ｂ
    群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液
    抽出のための第２抽出剤（但し、第１抽出剤と第２抽出
    剤は、水性溶媒中で混合された場合に、共に反応して亜
    硝酸を生成し得るものである）、（ｄ）過剰の亜硝酸を
    中和するための中和剤、及び（ｅ）トリラムノースエピ
    トープに特異的に結合する親和性を有する抗体である抗
    原標識剤から成る、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原検出用試験キ
    ット。
  36. 【請求項３６】前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体で
    ある請求の範囲第35項に記載の試験キット。
  37. 【請求項３７】前記不溶性担体が容器であり、前記抗体
    が、前記容器に、前記容器の単位面積当り160ng以下の
    濃度でコートされている請求の範囲第27項に記載の試験
    キット。
  38. 【請求項３８】前記抗原標識剤が、モノクローナルまた
    はポリクローナルの抗体である請求の範囲第27項に記載
    の試験キット。
  39. 【請求項３９】前記抗原標識剤が、検出可能なマーカー
    で標識され、前記マーカーが酵素または放射性同位元素
    である請求の範囲第27項に記載の試験キット。
  40. 【請求項４０】前記有機酸が、酢酸、コハク酸及びクエ
    ン酸から成る群から選択され、前記無機亜硝酸塩が、亜
    硝酸ナトリウム及び亜硝酸カリウムから成る群から選択
    される請求の範囲第27項、第31項または第35項に記載の
    試験キット。
  41. 【請求項４１】患者の膣または子宮頸から試験細菌試料
    を採取するための試料採取綿棒を包含し、前記綿棒は、
    前記容器に挿入可能である請求の範囲第40項に記載の試
    験キット。
  42. 【請求項４２】（ｆ）抗原物質とのインキュベーション
    後に、前記不溶性担体を洗浄して、非結合の抗原標識剤
    を除去するための洗浄剤、及び、（ｇ）（ｉ）第１検出
    基質成分であるH2O2、及び（ii）第１検出剤と組み合わ
    せの第２検出基質成分である3,3',5,5'−テトラメチル
    ベンジジンを組み合わせて成る検出基質を更に含んで成
    る請求の範囲第41項に記載のキット。
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