JP3186259B2 - キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子多型解析方法および解析装置 - Google Patents
キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子多型解析方法および解析装置Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子診断もしくは医
療上必要な遺伝子検査上有用な遺伝子多型解析方法に関
する。
療上必要な遺伝子検査上有用な遺伝子多型解析方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトおよびその他の生物の遺伝子中に蓄
積された多型は、遺伝病や免疫機構などと関連して医学
的情報を多く含み、その迅速かつ正確な解析方法が望ま
れている。
積された多型は、遺伝病や免疫機構などと関連して医学
的情報を多く含み、その迅速かつ正確な解析方法が望ま
れている。
【０００３】例えば、免疫機構と非常に関係の深い組織
適合性抗原（ＨＬＡ）遺伝子中には４００種類以上の多
型が蓄積されており、これらの組み合わせにより１００
００種類以上の抗原型が存在する。この抗原型の決定
は、臓器移植の場合など特に重要な問題であるほか、多
くの疾病との関係が示唆されており、ＨＬＡ抗原型の決
定は今後診断や医療検査の分野で非常に重要になってく
る。
適合性抗原（ＨＬＡ）遺伝子中には４００種類以上の多
型が蓄積されており、これらの組み合わせにより１００
００種類以上の抗原型が存在する。この抗原型の決定
は、臓器移植の場合など特に重要な問題であるほか、多
くの疾病との関係が示唆されており、ＨＬＡ抗原型の決
定は今後診断や医療検査の分野で非常に重要になってく
る。
【０００４】また一塩基レベルの遺伝子多型の検出は、
遺伝子配列中の突然変異の検出を意味し、癌を始めとす
る多くの疾病の診断につながる。発癌や転移のメカニズ
ムに関しては遺伝子変異の寄与が示唆されており、多数
の検体に対して迅速に遺伝子多型および変異の分類決定
が可能となれば、診断や癌種の同定に非常に役立つと考
えられる。
遺伝子配列中の突然変異の検出を意味し、癌を始めとす
る多くの疾病の診断につながる。発癌や転移のメカニズ
ムに関しては遺伝子変異の寄与が示唆されており、多数
の検体に対して迅速に遺伝子多型および変異の分類決定
が可能となれば、診断や癌種の同定に非常に役立つと考
えられる。
【０００５】上記のような一塩基レベルの遺伝子多型を
好感度に検出する手段として、一本鎖ＤＮＡがとる高次
構造の違いを利用してＤＮＡの塩基配列多型を解析する
方法(Single Strand Conformation Polymorphism ; 以
下Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法と略称する）が、プロシーディン
グ オブ ナショナル アカデミイ オブ サイエンス
オブ ユーエスエ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｏｆ Ｕ．Ｓ．Ａ．）Ｖｏｌ．８６，ｐｐ２７６６〜２
７７０（１９８９）にあるようにＭ．Ｏｒｉｔａ等によ
って提案された。
好感度に検出する手段として、一本鎖ＤＮＡがとる高次
構造の違いを利用してＤＮＡの塩基配列多型を解析する
方法(Single Strand Conformation Polymorphism ; 以
下Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法と略称する）が、プロシーディン
グ オブ ナショナル アカデミイ オブ サイエンス
オブ ユーエスエ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｏｆ Ｕ．Ｓ．Ａ．）Ｖｏｌ．８６，ｐｐ２７６６〜２
７７０（１９８９）にあるようにＭ．Ｏｒｉｔａ等によ
って提案された。
【０００６】この方法は、適当な方法によって抽出され
たＤＮＡ塩基配列上の標的部分を、適当な変性手段によ
って互いに相補的な一組の一本鎖ＤＮＡに解離し、それ
らを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動する。
この時にそれぞれの一本鎖ＤＮＡの泳動速度は、該一本
鎖ＤＮＡがとる高次構造の影響を受けて変化し、しかも
この高次構造は該一本鎖ＤＮＡの配列によって特異的に
決まるので、この性質を利用して少なくとも一塩基の違
いによる配列多型を検出するものである。
たＤＮＡ塩基配列上の標的部分を、適当な変性手段によ
って互いに相補的な一組の一本鎖ＤＮＡに解離し、それ
らを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動する。
この時にそれぞれの一本鎖ＤＮＡの泳動速度は、該一本
鎖ＤＮＡがとる高次構造の影響を受けて変化し、しかも
この高次構造は該一本鎖ＤＮＡの配列によって特異的に
決まるので、この性質を利用して少なくとも一塩基の違
いによる配列多型を検出するものである。
【０００７】この方法は非常に簡便で、しかも一塩基の
違いによる多型も感度良く検出することが可能であるの
で、以前に発明されていた制限酵素切断多型解析法や、
配列特異的ＤＮＡプローブによる多型解析法に比べて非
常に有利であると考えられ、最近は、核酸増幅法（以下
ＰＣＲ法と略称する）と組み合わせて、多型解析や遺伝
子変異の同定にしばしば用いられている。
違いによる多型も感度良く検出することが可能であるの
で、以前に発明されていた制限酵素切断多型解析法や、
配列特異的ＤＮＡプローブによる多型解析法に比べて非
常に有利であると考えられ、最近は、核酸増幅法（以下
ＰＣＲ法と略称する）と組み合わせて、多型解析や遺伝
子変異の同定にしばしば用いられている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかし従来のＳ．Ｓ．
Ｃ．Ｐ.法は、スラブゲルを用いて電気泳動を行ってい
たため、多型解析に重要な情報となる電気泳動パタンの
高分離能化・定量化が困難であった。また、泳動・検出
に時間がかかる、試料を一本鎖に変性後ゲルに充填する
間に二本鎖への再会合が起こってしまう、高次構造維持
に重要な影響を与える泳動中の温度制御が困難である、
などの問題点もあった。
Ｃ．Ｐ.法は、スラブゲルを用いて電気泳動を行ってい
たため、多型解析に重要な情報となる電気泳動パタンの
高分離能化・定量化が困難であった。また、泳動・検出
に時間がかかる、試料を一本鎖に変性後ゲルに充填する
間に二本鎖への再会合が起こってしまう、高次構造維持
に重要な影響を与える泳動中の温度制御が困難である、
などの問題点もあった。
【０００９】そこで本発明の目的は、Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.
法による遺伝子多型解析を、従来よりも簡便に、高分解
能で、かつ短時間に行なう方法を提供することにある。
また、Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法による多型解析を、自動化可
能とすることも本発明の目的である。
法による遺伝子多型解析を、従来よりも簡便に、高分解
能で、かつ短時間に行なう方法を提供することにある。
また、Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法による多型解析を、自動化可
能とすることも本発明の目的である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、本発明では電気泳動・検出手段にオンカラム検出
のキャピラリー電気泳動法を用いた。また、インジェク
ション時に試料を解離温度まで加熱可能な恒温槽を試料
台に取り付け、解離温度のまま直接ゲル内にインジェク
ションが可能となるようにした。さらに、泳動中のキャ
ピラリー温度を恒温プレートにより制御した。
めに、本発明では電気泳動・検出手段にオンカラム検出
のキャピラリー電気泳動法を用いた。また、インジェク
ション時に試料を解離温度まで加熱可能な恒温槽を試料
台に取り付け、解離温度のまま直接ゲル内にインジェク
ションが可能となるようにした。さらに、泳動中のキャ
ピラリー温度を恒温プレートにより制御した。
【００１１】
【作用】電気泳動・検出手段にオンカラム検出のキャピ
ラリー電気泳動法を用いることにより、高次構造多型を
示すはずの試料の電気泳動パタンは、十分に分離した二
本のピークとして検出可能であった。１バンド当たりの
一本鎖ＤＮＡ量に関しても、高次構造により重なって検
出されるバンドと分離して検出されるバンドの定量が、
ピークの高さによって数値として直接読み取ることが可
能となり、パタン解析が正確に行ない得るようになっ
た。
ラリー電気泳動法を用いることにより、高次構造多型を
示すはずの試料の電気泳動パタンは、十分に分離した二
本のピークとして検出可能であった。１バンド当たりの
一本鎖ＤＮＡ量に関しても、高次構造により重なって検
出されるバンドと分離して検出されるバンドの定量が、
ピークの高さによって数値として直接読み取ることが可
能となり、パタン解析が正確に行ない得るようになっ
た。
【００１２】キャピラリー電気泳動法を用いてＳ．Ｓ．
Ｃ．Ｐ.解析を行なうと、電気泳動担体の温度制御の精
度を容易に向上させることが可能となる。単位放熱面積
当たりの発生熱量に対応する体積／面積比（Ｖ／Ｓ比）
で比較すると、１ｍｍの厚さのスラブゲル（Ｖ／Ｓ＝
０．５ｍｍ）を用いて電気泳動を行なった場合に比べ
て、直径１００μｍ（Ｖ／Ｓ＝０.０２５ｍｍ）のキャ
ピラリーを用いた場合には、約２０倍の放熱効率がある
ことになる。
Ｃ．Ｐ.解析を行なうと、電気泳動担体の温度制御の精
度を容易に向上させることが可能となる。単位放熱面積
当たりの発生熱量に対応する体積／面積比（Ｖ／Ｓ比）
で比較すると、１ｍｍの厚さのスラブゲル（Ｖ／Ｓ＝
０．５ｍｍ）を用いて電気泳動を行なった場合に比べ
て、直径１００μｍ（Ｖ／Ｓ＝０.０２５ｍｍ）のキャ
ピラリーを用いた場合には、約２０倍の放熱効率がある
ことになる。
【００１３】Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法の多型分離原理は、配
列の違いにより所定の温度状況における安定な高次構造
が違うことを利用して多型分離を行なうというものであ
る。すなわちＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法では泳動中に温度に依
存した配列特異的な高次構造維持が必要なので、泳動中
に泳動担体が均一な温度であることがかなり重要な条件
なのである。この点からもキャピラリー電気泳動法によ
ってＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.を行なえば、従来は分離できなか
った配列多型の分離検出が可能となる。
列の違いにより所定の温度状況における安定な高次構造
が違うことを利用して多型分離を行なうというものであ
る。すなわちＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法では泳動中に温度に依
存した配列特異的な高次構造維持が必要なので、泳動中
に泳動担体が均一な温度であることがかなり重要な条件
なのである。この点からもキャピラリー電気泳動法によ
ってＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.を行なえば、従来は分離できなか
った配列多型の分離検出が可能となる。
【００１４】キャピラリーの温度調節プレートにペルテ
ィエ素子を使用する利点も大きい。ペルティエ素子は印
加する電圧の極性を代えることにより、一つの素子で冷
却・加温の両者とも実現可能である。キャピラリーゲル
という発熱源を有しかつ室温近くの温度に正確に温度制
御を行なうことが必要となる本発明のような装置におい
ては、上記のように冷却と加温を任意の時間に選択制御
することが可能であることは重要な点である。この事に
より、５℃〜６０℃の全ての領域にわたって、設定温度
±０.１℃の精度での温度制御が可能となった。
ィエ素子を使用する利点も大きい。ペルティエ素子は印
加する電圧の極性を代えることにより、一つの素子で冷
却・加温の両者とも実現可能である。キャピラリーゲル
という発熱源を有しかつ室温近くの温度に正確に温度制
御を行なうことが必要となる本発明のような装置におい
ては、上記のように冷却と加温を任意の時間に選択制御
することが可能であることは重要な点である。この事に
より、５℃〜６０℃の全ての領域にわたって、設定温度
±０.１℃の精度での温度制御が可能となった。
【００１５】また電気泳動に要する時間は、従来のスラ
ブゲルによるＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法の場合の２時間〜５時
間以上に比べて１/６〜１/１０と大幅に短縮された。
ブゲルによるＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法の場合の２時間〜５時
間以上に比べて１/６〜１/１０と大幅に短縮された。
【００１６】キャピラリー電気泳動は、微少量の試料で
も十分に泳動・検出が可能である。紫外線による吸光度
検出のキャピラリー電気泳動の場合、濃度ならば５×１
／１０8ｍｏｌ／Ｌ、絶対量ならば５×１／１０19グラ
ムで十分検出ができる。これらの量は、従来のスラブゲ
ルによる検出感度に比べても十分に良好な感度であると
いえる。より高い感度が必要な場合は、蛍光標識により
感度を高めることも可能である。
も十分に泳動・検出が可能である。紫外線による吸光度
検出のキャピラリー電気泳動の場合、濃度ならば５×１
／１０8ｍｏｌ／Ｌ、絶対量ならば５×１／１０19グラ
ムで十分検出ができる。これらの量は、従来のスラブゲ
ルによる検出感度に比べても十分に良好な感度であると
いえる。より高い感度が必要な場合は、蛍光標識により
感度を高めることも可能である。
【００１７】さらに、試料をＤＮＡ解離温度まで加熱
し、ＤＮＡが一本鎖に解離した状態のままでゲル中に導
入することにより、すべての試料ＤＮＡが一本鎖として
電気泳動される。
し、ＤＮＡが一本鎖に解離した状態のままでゲル中に導
入することにより、すべての試料ＤＮＡが一本鎖として
電気泳動される。
【００１８】従来のスラブゲルを用いた電気泳動の場合
は、電気泳動担体であるゲルへの試料導入部は常時バッ
ファ槽内にあるのでＤＮＡ解離温度以上に加熱すること
はかなり難しく、ゲルとほぼ同一温度の泳動バッファを
介して試料をゲル中に導入するため、ゲルへの導入時に
相補鎖同士の再会合反応が起こる、もしくはゲル導入時
に適当な変性剤を必要とするなどの問題点があった。な
ぜなら、分子内で安定な高次構造をとる温度は、再会合
が十分に起こりやすい温度領域にあるからである。
は、電気泳動担体であるゲルへの試料導入部は常時バッ
ファ槽内にあるのでＤＮＡ解離温度以上に加熱すること
はかなり難しく、ゲルとほぼ同一温度の泳動バッファを
介して試料をゲル中に導入するため、ゲルへの導入時に
相補鎖同士の再会合反応が起こる、もしくはゲル導入時
に適当な変性剤を必要とするなどの問題点があった。な
ぜなら、分子内で安定な高次構造をとる温度は、再会合
が十分に起こりやすい温度領域にあるからである。
【００１９】しかし、キャピラリー電気泳動法の場合
は、導入前に試料をあらかじめＤＮＡ解離温度にまで加
熱しておくことが可能なので、前記のような問題点は解
決される。これは、本発明で用いたキャピラリー電気泳
動装置では試料容器と泳動用バッファが別になってお
り、試料導入の時だけキャピラリー先端を試料溶液に接
触し試料を導入するので、試料をあらかじめＤＮＡ解離
温度にまで加熱しておくことが可能となるためである。
は、導入前に試料をあらかじめＤＮＡ解離温度にまで加
熱しておくことが可能なので、前記のような問題点は解
決される。これは、本発明で用いたキャピラリー電気泳
動装置では試料容器と泳動用バッファが別になってお
り、試料導入の時だけキャピラリー先端を試料溶液に接
触し試料を導入するので、試料をあらかじめＤＮＡ解離
温度にまで加熱しておくことが可能となるためである。
【００２０】この事により、途中再会合反応により二本
鎖となったＤＮＡのバンドが、検出ピークの乱れとなる
事がなくなり、シャープな泳動パタンが得られるだけで
なく、導入された全てのＤＮＡの高次構造多型が検出で
きるので、微量な試料ＤＮＡの導入でも十分に多型が検
出可能となった。
鎖となったＤＮＡのバンドが、検出ピークの乱れとなる
事がなくなり、シャープな泳動パタンが得られるだけで
なく、導入された全てのＤＮＡの高次構造多型が検出で
きるので、微量な試料ＤＮＡの導入でも十分に多型が検
出可能となった。
【００２１】
【実施例】以下に本発明の実施例を一塩基レベルの突然
変異配列の検出例を用いて説明する。
変異配列の検出例を用いて説明する。
【００２２】検出する目標多型部位としてはヒトのｆａ
ｃｔｏｒΙΧ遺伝子中から１７１ｂｐの領域を選んだ。
この遺伝子部位には１２種類の点突然変異による多型が
存在することが知られている（Ｇｏｂｉｎｄａ Ｓａｒ
ｋａｒ ｅｔ．ａｌ；Ｎｕｃｌｅａｔｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４， ｐ
８７１−８７８）。
ｃｔｏｒΙΧ遺伝子中から１７１ｂｐの領域を選んだ。
この遺伝子部位には１２種類の点突然変異による多型が
存在することが知られている（Ｇｏｂｉｎｄａ Ｓａｒ
ｋａｒ ｅｔ．ａｌ；Ｎｕｃｌｅａｔｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４， ｐ
８７１−８７８）。
【００２３】解析したヒトのＤＮＡはＭａｎｉａｔｉｓ
の方法（ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＣｌｏｎｉｎｇ ｐ ２８
０−２８１（１９８２））に従って検体細胞から抽出し
た。１μｇの上記ゲノムＤＮＡを１００μｌの５０ｍＭ
ＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液中に、各２００μＭのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、２０ｐｍｏｌ：
２０ｐｍｏｌのモル比で調製したオリゴヌクレオチドプ
ライマとともに溶解し、その中にサーマス・アクアティ
カスからのポリメラーゼ（Ｔａｑ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ）を２．５ｕｎｉｔ加えた。これに４０μｌの鉱油を
重層した後、９２℃で２分、５５℃で２分、７２℃で２
分のサイクルを４０回繰り返すことにより、目標部位の
二本鎖ＤＮＡを特異的に増幅した。この反応液から鉱油
を取り除いた後、２５０μｌの５Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ
4 エタノールを加え０℃，１４０００×ｇで３０分間
遠心分離を行い、上層部の溶液を取り除き（エタノール
沈殿）沈殿物（ペレット状）を８０％エタノールで洗っ
た（エタノールリンス；脱塩）後、乾燥した沈殿物を５
０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９），
１．０ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶解
し、該溶液をキャピラリー電気泳動に供した。
の方法（ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＣｌｏｎｉｎｇ ｐ ２８
０−２８１（１９８２））に従って検体細胞から抽出し
た。１μｇの上記ゲノムＤＮＡを１００μｌの５０ｍＭ
ＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液中に、各２００μＭのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、２０ｐｍｏｌ：
２０ｐｍｏｌのモル比で調製したオリゴヌクレオチドプ
ライマとともに溶解し、その中にサーマス・アクアティ
カスからのポリメラーゼ（Ｔａｑ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ）を２．５ｕｎｉｔ加えた。これに４０μｌの鉱油を
重層した後、９２℃で２分、５５℃で２分、７２℃で２
分のサイクルを４０回繰り返すことにより、目標部位の
二本鎖ＤＮＡを特異的に増幅した。この反応液から鉱油
を取り除いた後、２５０μｌの５Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ
4 エタノールを加え０℃，１４０００×ｇで３０分間
遠心分離を行い、上層部の溶液を取り除き（エタノール
沈殿）沈殿物（ペレット状）を８０％エタノールで洗っ
た（エタノールリンス；脱塩）後、乾燥した沈殿物を５
０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９），
１．０ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶解
し、該溶液をキャピラリー電気泳動に供した。
【００２４】図１に本実施例で用いたキャピラリー電気
泳動装置をブロック図で示す。本発明によるキャピラリ
ー電気泳動装置は、高電圧電源部１−１、キャピラリー
１−２、試料保持容器兼試料温度調節プレート１−３、
キャピラリー保持部兼キャピラリー温度調節プレート１
−４、駆動部１−５、バッファー槽１−６、１−７、光
学検出部１−８、および光学検出部１−８で検出された
データを処理するデータ処理部１−９からなる。試料温
度調節プレート１−３とキャピラリー温度調節プレート
１−４はそれぞれ独立の温度調節器１−１０、１−１１
に接続され、特にキャピラリー温度調節プレート１−１
１はキャピラリー軸方向に±０.１℃の精度で５℃〜６
０℃の範囲で調節できるように構成されている。
泳動装置をブロック図で示す。本発明によるキャピラリ
ー電気泳動装置は、高電圧電源部１−１、キャピラリー
１−２、試料保持容器兼試料温度調節プレート１−３、
キャピラリー保持部兼キャピラリー温度調節プレート１
−４、駆動部１−５、バッファー槽１−６、１−７、光
学検出部１−８、および光学検出部１−８で検出された
データを処理するデータ処理部１−９からなる。試料温
度調節プレート１−３とキャピラリー温度調節プレート
１−４はそれぞれ独立の温度調節器１−１０、１−１１
に接続され、特にキャピラリー温度調節プレート１−１
１はキャピラリー軸方向に±０.１℃の精度で５℃〜６
０℃の範囲で調節できるように構成されている。
【００２５】また本発明におけるキャピラリー温調プレ
ートは、アルミ性のプレート１−１２をペルティエ素子
１−１３によって温度制御するもので、ペルティエに印
加する電圧の極性を代えることによって冷却、加温のど
ちらも可能となる。試料温度調節部１−３および１−１
０は、ＤＮＡ解離温度まで試料を加熱できるように構成
されている。本実施例では行なわなかったが、氷冷温度
での試料導入もできるように構成することも、ペルティ
エ素子等を利用することで可能となる。
ートは、アルミ性のプレート１−１２をペルティエ素子
１−１３によって温度制御するもので、ペルティエに印
加する電圧の極性を代えることによって冷却、加温のど
ちらも可能となる。試料温度調節部１−３および１−１
０は、ＤＮＡ解離温度まで試料を加熱できるように構成
されている。本実施例では行なわなかったが、氷冷温度
での試料導入もできるように構成することも、ペルティ
エ素子等を利用することで可能となる。
【００２６】高電圧電源部１−１は、出力電圧０〜３０
ｋＶで、極性切り替えが容易な高電圧電源を使用して、
試料容器１−３とバッファー槽１−７との間の電極１−
１４、１−１５、試料容器１−３に併設されたバッファ
ー槽１−６とバッファー槽１−７との間の電極１−１
６、１−１５を使用して電圧を印加している。
ｋＶで、極性切り替えが容易な高電圧電源を使用して、
試料容器１−３とバッファー槽１−７との間の電極１−
１４、１−１５、試料容器１−３に併設されたバッファ
ー槽１−６とバッファー槽１−７との間の電極１−１
６、１−１５を使用して電圧を印加している。
【００２７】キャピラリーゲル電気泳動装置への試料の
導入は、まず試料を所定の温度に加温した後、電気泳動
部のガラスキャピラリー（１−２）先端を試料容器１−
３に移動させて、電極１−１４、１−１５に所定の極性
の電圧を印加することにより、試料容器内の試料を電気
泳動的にガラスキャピラリー１−２内に導入した。この
場合、印加電圧と電圧印加時間を制御することにより、
ピコリットルオーダーの導入試料量を制御することがで
きる。１ピコリットルはキャピラリーの長さにしておよ
そ１ミリの見当である。
導入は、まず試料を所定の温度に加温した後、電気泳動
部のガラスキャピラリー（１−２）先端を試料容器１−
３に移動させて、電極１−１４、１−１５に所定の極性
の電圧を印加することにより、試料容器内の試料を電気
泳動的にガラスキャピラリー１−２内に導入した。この
場合、印加電圧と電圧印加時間を制御することにより、
ピコリットルオーダーの導入試料量を制御することがで
きる。１ピコリットルはキャピラリーの長さにしておよ
そ１ミリの見当である。
【００２８】その後、電気泳動部のガラスキャピラリー
先端をバッファー槽１−６に移動し、電極１−１６、１
−１５間に所定の電圧を印加して電気泳動を行なった。
先端をバッファー槽１−６に移動し、電極１−１６、１
−１５間に所定の電圧を印加して電気泳動を行なった。
【００２９】本実施例で用いた実施条件を以下の表にま
とめる。
とめる。
【００３０】
【表１】
【００３１】ただし、本実施例で用いた実施条件は単な
る一例であり、例えばゲル組成、バッファー組成、印加
電圧、設定温度などについても、特に本発明に対して制
限を与えるものではない。
る一例であり、例えばゲル組成、バッファー組成、印加
電圧、設定温度などについても、特に本発明に対して制
限を与えるものではない。
【００３２】次に、本実施例の泳動検出結果を図２〜図
４に示す。
４に示す。
【００３３】図２は、変異を有する検体試料にたいして
ＰＣＲによる目的領域の増幅後一本鎖への変性解離過程
無しに直接泳動を行なった場合の泳動結果であり、図
３、図４は目的領域の増幅後一本鎖に解離し電気泳動に
供したものである。データ上縦軸は吸光度（ａｂｓ）で
あり、横軸は導入後の泳動時間（分）である。ここで、
図２、図３は、正常検体の泳動結果であり、図４に示し
た検体は、正常ＤＮＡと変異ＤＮＡのヘテロ接合型検体
の泳動結果である。
ＰＣＲによる目的領域の増幅後一本鎖への変性解離過程
無しに直接泳動を行なった場合の泳動結果であり、図
３、図４は目的領域の増幅後一本鎖に解離し電気泳動に
供したものである。データ上縦軸は吸光度（ａｂｓ）で
あり、横軸は導入後の泳動時間（分）である。ここで、
図２、図３は、正常検体の泳動結果であり、図４に示し
た検体は、正常ＤＮＡと変異ＤＮＡのヘテロ接合型検体
の泳動結果である。
【００３４】図２ではピークは１６分の位置に一つのみ
検出されており、他の分子量マーカの泳動結果との比較
から１７１ｂｐの二本鎖ＤＮＡのピークである。
検出されており、他の分子量マーカの泳動結果との比較
から１７１ｂｐの二本鎖ＤＮＡのピークである。
【００３５】これに対して一本鎖に解離後の泳動結果で
ある図４では、ピークが１６分〜１９分の間に４本のピ
ークが検出された。このうち２本のピークに関しては、
図３にも検出されているものと同じ正常ＤＮＡのピーク
である。また他の２本のピークは変異を有するＤＮＡに
よるものである。
ある図４では、ピークが１６分〜１９分の間に４本のピ
ークが検出された。このうち２本のピークに関しては、
図３にも検出されているものと同じ正常ＤＮＡのピーク
である。また他の２本のピークは変異を有するＤＮＡに
よるものである。
【００３６】以上のように、本発明によって遺伝子上の
少なくとも一塩基以上の変異の有無を短時間に非常に簡
便に、しかも明確に検出することが可能となった。
少なくとも一塩基以上の変異の有無を短時間に非常に簡
便に、しかも明確に検出することが可能となった。
【００３７】また、本実施例では行なわなかったが、上
記のようなキャピラリー電気泳動装置を使用することに
より、同時に異なる温度でのＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.解析を行
なうことも可能となる。Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法での多型の
分離は温度条件に影響されやすく、新たな多型を分離す
る場合には最適温度の条件決定にかなりの時間を費やす
ことがある。スラブゲルでは同時にいろいろな温度で泳
動を行なうことは、装置の大型化等の問題から困難であ
るが、キャピラリー電気泳動装置ならば、同時に異なっ
た条件の泳動を行い、最適条件を短時間に見つけること
が可能となると考えられる。
記のようなキャピラリー電気泳動装置を使用することに
より、同時に異なる温度でのＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.解析を行
なうことも可能となる。Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法での多型の
分離は温度条件に影響されやすく、新たな多型を分離す
る場合には最適温度の条件決定にかなりの時間を費やす
ことがある。スラブゲルでは同時にいろいろな温度で泳
動を行なうことは、装置の大型化等の問題から困難であ
るが、キャピラリー電気泳動装置ならば、同時に異なっ
た条件の泳動を行い、最適条件を短時間に見つけること
が可能となると考えられる。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、少なくとも一塩基以上
の配列の違いによる遺伝子多型を、従来用いられてきた
スラブゲルによるＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法に比べて、かなり
短時間により正確により簡便に検出することが可能とな
る。また、遺伝子変異診断や多型解析の高スループット
な手段として有用であるが、従来は繁雑な作業ゆえに自
動化が困難であったＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法を本発明のよう
に実現することにより、自動化へ可能性が大きく広がる
と考えられる。
の配列の違いによる遺伝子多型を、従来用いられてきた
スラブゲルによるＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法に比べて、かなり
短時間により正確により簡便に検出することが可能とな
る。また、遺伝子変異診断や多型解析の高スループット
な手段として有用であるが、従来は繁雑な作業ゆえに自
動化が困難であったＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ.法を本発明のよう
に実現することにより、自動化へ可能性が大きく広がる
と考えられる。
【００３９】この事により、癌などにたいする遺伝子診
断の分野や、臓器移植時等に行なう遺伝子多型の検査の
分野などの発展に寄与できる。
断の分野や、臓器移植時等に行なう遺伝子多型の検査の
分野などの発展に寄与できる。
【図１】本実施例で用いたキャピラリー電気泳動装置の
ブロック図
ブロック図
【図２】本実施例における正常検体（二本鎖）の泳動結
果の例を示す図
果の例を示す図
【図３】本実施例における正常検体のＳ.Ｓ.Ｃ.Ｐ.解析
結果の例を示す図
結果の例を示す図
【図４】本実施例における変異を有する検体のＳ.Ｓ.
Ｃ.Ｐ.解析結果の例を示す図
Ｃ.Ｐ.解析結果の例を示す図
1-1…高電圧電源、1-2…ガラスキャピラリー、1-3…試
料容器および試料温度調節プレート、1-4…キャピラリ
ー温度調節プレート、1-5…キャピラリー駆動装置、1-6
…バッファー槽、1-7…バッファー槽、1-8…光学検出
器、1-9…データ処理装置、1-10…試料容器温度調節
器、1-11…キャピラリー温度調節器、1-12…アルミプレ
ート、1-13…ペルティエ素子、1-14…電極、1-15…電
極、1-16…電極。
料容器および試料温度調節プレート、1-4…キャピラリ
ー温度調節プレート、1-5…キャピラリー駆動装置、1-6
…バッファー槽、1-7…バッファー槽、1-8…光学検出
器、1-9…データ処理装置、1-10…試料容器温度調節
器、1-11…キャピラリー温度調節器、1-12…アルミプレ
ート、1-13…ペルティエ素子、1-14…電極、1-15…電
極、1-16…電極。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｚ (56)参考文献 特開 平５−332992（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/447 ＢＥＩＬＳＴＥＩＮ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (4)
- 【請求項１】生物又はウイルスの核酸を含む二本鎖ＤＮ
Ａの所定の領域について、該ＤＮＡ領域を互いに相補的
な一本鎖ＤＮＡに解離後ゲル電気泳動によって泳動し、
一本鎖ＤＮＡが配列多型に特異的に取る高次構造多型を
利用して該ＤＮＡの配列多型を解析する方法において、
電気泳動分析を内径１００μｍ以下のキャピラリーに収
納されたゲルを用いた電気泳動法によって行うことを特
徴とする核酸の分析方法。 - 【請求項２】該キャピラリーを一定温度に制御しながら
電気泳動、検出を行うことを特徴とする請求項１記載の
核酸の分析方法。 - 【請求項３】ＤＮＡ試料をＤＮＡの解離温度以上に加温
した状態で直接キャピラリーゲル内に充填することを特
徴とする請求項１記載の核酸の分析方法。 - 【請求項４】試料を収容しかつ該試料を所定の温度に加
温する温度調製装置と、電気泳動を行なうキャピラリー
と、該キャピラリーを所定の温度に制御する温度調節器
と、キャピラリー両端に高電圧を印加できる電源装置
と、キャピラリー先端部を所定の範囲内で移動する駆動
装置と、キャピラリー内を泳動してくる試料を検出する
光学的検出器と、該検出器から出力される信号を処理す
る処理装置とからなることを特徴とする核酸の分析装
置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29116192A JP3186259B2 (ja) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子多型解析方法および解析装置 |
| US08/111,508 US5409586A (en) | 1992-08-26 | 1993-08-24 | Method for analyzing nucleic acid or protein and apparatus therefor |
| US08/378,973 US5458761A (en) | 1992-08-26 | 1995-01-27 | Method for analyzing nucleic acid or protein and apparatus therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29116192A JP3186259B2 (ja) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子多型解析方法および解析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06138090A JPH06138090A (ja) | 1994-05-20 |
| JP3186259B2 true JP3186259B2 (ja) | 2001-07-11 |
Family
ID=17765239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29116192A Expired - Fee Related JP3186259B2 (ja) | 1992-08-26 | 1992-10-29 | キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子多型解析方法および解析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3186259B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2808089B1 (fr) * | 2000-04-25 | 2002-07-05 | Sebia Sa | Dispositif perfectionne d'analyse d'echantillons par electrophorese multicapillaire a thermo-regulation solide/solide |
| JP4598989B2 (ja) * | 2001-05-29 | 2010-12-15 | アロカ株式会社 | 電気泳動装置 |
| WO2005083414A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Hitachi High-Technologies Corporation | 試料の分析方法ならびに分析装置及び導入方法 |
| CA2634735A1 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-12 | I-Stat Corporation | Molecular diagnostics amplification system and methods |
-
1992
- 1992-10-29 JP JP29116192A patent/JP3186259B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06138090A (ja) | 1994-05-20 |
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