JP3183863B2 - Apparatus and method for measuring change with time of chemiluminescence and fluorescence - Google Patents
Apparatus and method for measuring change with time of chemiluminescence and fluorescenceInfo
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Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、被測定試料におけ
る化学反応に伴い発生する化学発光の経時変化と、その
被測定試料への励起光の照射に伴い発生する蛍光の経時
変化とを測定する測定装置および測定方法に関するもの
である。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention measures the change over time of chemiluminescence generated by a chemical reaction in a sample to be measured and the change over time of fluorescence generated by irradiation of the sample to be measured with excitation light. The present invention relates to a measuring device and a measuring method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】白血球の一種であるヒト好中球により産
生されるスーパーオキサイド（Ｏ2 -）は、人体に侵入し
た細菌やウイルス等を殺傷するものであり、生体防御に
おいて重要な役割を担っている。このスーパーオキサイ
ドの産生には、好中球細胞内のカルシウムが関与してい
ると考えられているが、このカルシウムの役割について
は不明な点が多い。しかし、スーパーオキサイド産生機
能を欠いた慢性肉芽腫症患者の好中球は、好中球遊走性
ペプチドｆＭＬＰ（formyl-methionyl-leucyl-phenylal
anine ）により刺激されても細胞膜の脱分極が観察され
ないという特徴がある。このことは、同患者の好中球が
細胞外液中のカルシウムを細胞内に動員することができ
ないことを意味しており、好中球がスーパーオキサイド
産生に必要な細胞内カルシウム濃度上昇を得ることがで
きないと考えられている。2. Description of the Related Art Superoxide (O 2 − ) produced by human neutrophils, a type of leukocyte, kills bacteria and viruses that have invaded the human body and plays an important role in host defense. ing. It is thought that calcium in neutrophil cells is involved in the production of superoxide, but there are many unclear points about the role of this calcium. However, neutrophils from patients with chronic granulomatosis lacking the superoxide-producing function have the neutrophil chemotactic peptide fMLP (formyl-methionyl-leucyl-phenylal).
It is characterized in that no depolarization of the cell membrane is observed even when stimulated by anine). This means that the patient's neutrophils are unable to recruit calcium in the extracellular fluid into the cells, and neutrophils obtain the elevated intracellular calcium concentration required for superoxide production It is believed that you cannot.
【０００３】ここで、好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰ
は、好中球細胞表面上のｆＭＬＰ受容体に特異的に結合
し、細胞内カルシウム濃度を高めるような刺激を伝達さ
せるものであり、このカルシウム応答から幾つかの細胞
機能（その１つがスーパーオキサイド産生）の発現に向
けて細胞内で更に刺激が伝達される。また、慢性肉芽腫
症（ＣＧＤ： Chronic Granulomatous Disease）は感染
細菌が人体内で殺傷されずに留まることから、その患者
は、非常に細菌感染症にかかり易い状態にあり、細菌を
殺傷できない好中球の死骸が膿として蓄積したような症
状が多くの組織で見られる。Here, the neutrophil chemotactic peptide fMLP
Is a protein that specifically binds to the fMLP receptor on the surface of neutrophil cells and transmits a stimulus that increases the intracellular calcium concentration. This calcium response allows several cellular functions (one of which is superoxide). Further stimulation is transmitted intracellularly towards the expression of (production). Chronic granulomatous disease (CGD) is a condition in which infected bacteria remain in the human body without being killed, so the patient is very susceptible to bacterial infection, and is unable to kill bacteria. Symptoms of a dead sphere accumulating as pus are found in many tissues.
【０００４】このスーパーオキサイド産生を担う細胞内
カルシウム濃度上昇の実体が解明されれば、慢性肉芽腫
症患者の治療につながる新たな細胞機能診断法が確立さ
れるものと期待される。ところで、スーパーオキサイド
産生の測定は、例えば、好中球における化学反応に伴い
発生する化学発光を検出することにより可能である。ま
た、細胞内カルシウム濃度変化の測定は、例えば、好中
球にカルシウム蛍光指示薬を予め導入しておき、これに
励起光を照射して発生した蛍光を検出することにより可
能である。[0004] If the substance of the increase in intracellular calcium concentration responsible for the production of superoxide is elucidated, it is expected that a new method for diagnosing cell function leading to treatment of patients with chronic granulomatosis will be established. Meanwhile, the measurement of superoxide production can be performed, for example, by detecting chemiluminescence generated by a chemical reaction in neutrophils. The change in intracellular calcium concentration can be measured, for example, by introducing a calcium fluorescent indicator into neutrophils in advance, and irradiating the neutrophil with excitation light to detect fluorescence generated.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、化学発
光および蛍光それぞれを個別に検出する従来の技術で
は、スーパーオキサイド産生を担う細胞内カルシウム濃
度上昇の実体を解明することは困難である。すなわち、
同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれを同時
に実時間で検出することができないので、スーパーオキ
サイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な
関係を検出することができない。However, it is difficult to elucidate the substance of the increase in intracellular calcium concentration responsible for superoxide production by the conventional technique of individually detecting each of chemiluminescence and fluorescence. That is,
Since each of the chemiluminescence and fluorescence generated in the same sample cannot be detected simultaneously in real time, a delicate relationship between superoxide production and changes in intracellular calcium concentration cannot be detected.
【０００６】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、化学発光および蛍光それぞれの経時変
化を実時間で測定することができる装置および方法を提
供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and has as its object to provide an apparatus and a method capable of measuring the change over time of each of chemiluminescence and fluorescence in real time.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明に係る化学発光お
よび蛍光の経時変化測定装置は、(1) 被測定試料に励起
光をパルス的に繰り返し照射する励起手段と、(2) 励起
手段により励起光が被測定試料に照射されていないとき
に被測定試料で発生した化学発光を検出する化学発光検
出手段と、(3) 励起手段により励起光が被測定試料に照
射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出す
る蛍光検出手段と、を備え、化学発光検出手段および蛍
光検出手段により化学発光および蛍光それぞれの経時変
化を測定することを特徴とする。According to the present invention, there is provided an apparatus for measuring the change over time of chemiluminescence and fluorescence, comprising: (1) an excitation means for repeatedly irradiating a sample to be measured with excitation light in a pulsed manner; A chemiluminescence detecting means for detecting chemiluminescence generated in the sample to be measured when the sample is not irradiated with the excitation light, and (3) a chemiluminescence detecting means for detecting the chemiluminescence when the sample to be measured is irradiated with the excitation light by the excitation means. And a fluorescence detecting means for detecting the fluorescence generated in the measurement sample, wherein the chemiluminescence detecting means and the fluorescence detecting means measure the change over time of each of the chemiluminescence and the fluorescence.
【０００８】この装置によれば、被測定試料は、励起手
段により励起光がパルス的に繰り返し照射される。励起
手段により励起光が被測定試料に照射されていないとき
に被測定試料で発生した化学発光は、化学発光検出手段
により検出される。一方、励起手段により励起光が被測
定試料に照射されているときに被測定試料で発生した蛍
光は、蛍光検出手段により検出される。このようにし
て、同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれの
経時変化が実時間で検出される。According to this apparatus, the sample to be measured is repeatedly irradiated with the excitation light in a pulsed manner by the excitation means. Chemiluminescence generated in the sample to be measured when the sample to be measured is not irradiated with the excitation light by the excitation means is detected by the chemiluminescence detecting means. On the other hand, the fluorescence generated in the sample to be measured when the sample to be measured is irradiated with the excitation light by the excitation means is detected by the fluorescence detection means. In this way, the time-dependent changes in chemiluminescence and fluorescence generated in the same sample are detected in real time.
【０００９】また、本発明に係る化学発光および蛍光の
経時変化測定装置は、被測定試料の温度を制御する温度
制御手段を更に備えることを特徴とする。この場合に
は、被測定試料の温度は温度制御手段により制御される
ので、例えば被測定試料が細胞である場合に好適であ
る。Further, the apparatus for measuring the change with time of chemiluminescence and fluorescence according to the present invention is characterized by further comprising a temperature control means for controlling the temperature of the sample to be measured. In this case, since the temperature of the sample to be measured is controlled by the temperature control means, it is suitable, for example, when the sample to be measured is a cell.
【００１０】また、本発明に係る化学発光および蛍光の
経時変化測定装置は、被測定試料が液体であって、その
被測定試料を攪拌する攪拌手段を更に備えることを特徴
とする。この場合には、被測定試料は攪拌手段により攪
拌されるので、被測定試料が懸濁液である場合に好適で
ある。Further, the apparatus for measuring the change with time of chemiluminescence and fluorescence according to the present invention is characterized in that the sample to be measured is a liquid and further provided with a stirring means for stirring the sample to be measured. In this case, since the sample to be measured is stirred by the stirring means, it is suitable when the sample to be measured is a suspension.
【００１１】本発明に係る化学発光および蛍光の経時変
化測定方法は、被測定試料に励起光をパルス的に繰り返
し照射して、励起光が被測定試料に照射されていないと
きに被測定試料で発生した化学発光を検出し、励起光が
被測定試料に照射されているときに被測定試料で発生し
た蛍光を検出して、化学発光および蛍光それぞれの経時
変化を測定することを特徴とする。この方法によれば、
同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれの経時
変化は実時間で検出される。According to the method for measuring the change with time of chemiluminescence and fluorescence according to the present invention, a sample to be measured is irradiated with excitation light repeatedly in a pulsed manner, and the sample to be measured is irradiated when the sample is not irradiated with excitation light. The method is characterized in that the generated chemiluminescence is detected, the fluorescence generated in the sample to be measured when the sample is irradiated with the excitation light is measured, and the time-dependent change of each of the chemiluminescence and the fluorescence is measured. According to this method,
Time-dependent changes in chemiluminescence and fluorescence generated in the same sample are detected in real time.
【００１２】[0012]
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。Embodiments of the present invention will be described below in detail with reference to the accompanying drawings. In the description of the drawings, the same elements will be denoted by the same reference symbols, without redundant description.
【００１３】先ず、本発明に係る化学発光および蛍光の
経時変化測定装置の実施形態について説明する。図１
は、本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測
定装置の構成図である。First, a description will be given of an embodiment of an apparatus for measuring the change with time of chemiluminescence and fluorescence according to the present invention. FIG.
1 is a configuration diagram of an apparatus for measuring a change with time of chemiluminescence and fluorescence according to the present embodiment.
【００１４】被測定試料を容れるサンプルホルダ１は、
サーモバス２と配管３，４を介して接続されており、被
測定試料の温度を所定温度に制御することができる。ま
た、サンプルホルダ１は、被測定試料を攪拌するマグネ
ティックスターラを備えている。このマグネティックス
ターラは、マグネティックスターラコントローラ５によ
り制御される。また、サンプルホルダ１は、被測定試料
や試薬を導入するためのサンプルディスペンサ６と接続
されている。The sample holder 1 for holding the sample to be measured is
The temperature of the sample to be measured can be controlled to a predetermined temperature because it is connected to the thermobus 2 via the pipes 3 and 4. Further, the sample holder 1 includes a magnetic stirrer for stirring the sample to be measured. This magnetic stirrer is controlled by a magnetic stirrer controller 5. The sample holder 1 is connected to a sample dispenser 6 for introducing a sample to be measured and a reagent.
【００１５】サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
に励起光をパルス的に照射する励起手段は、励起光源１
１、光ファイバ１２、ＮＤフィルタ１３、チョッパ１
４、シャッタ１５、チョッパコントローラ１６およびシ
ャッタコントローラ１７を備えている。励起光源１１
は、励起光を出力するものであり、光ファイバ１２は、
その励起光源１１から出力された励起光をＮＤフィルタ
１３へ導く。ＮＤフィルタ１３は、被測定試料に照射さ
れる励起光の強度を調整する。チョッパ１４は、チョッ
パコントローラ１６により制御されて回転し、ＮＤフィ
ルタ１３を透過した励起光の通過／遮断の制御を行い、
励起光を被測定試料にパルス的に照射するためのもので
ある。シャッタ１５は、シャッタコントローラ１７によ
り制御されて開閉し、開いているときに励起光を被測定
試料にパルス的に照射する。The excitation means for irradiating the sample to be measured contained in the sample holder 1 with excitation light in a pulsed manner includes an excitation light source 1.
1, optical fiber 12, ND filter 13, chopper 1
4, a shutter 15, a chopper controller 16 and a shutter controller 17. Excitation light source 11
Outputs excitation light, and the optical fiber 12
The excitation light output from the excitation light source 11 is guided to the ND filter 13. The ND filter 13 adjusts the intensity of the excitation light applied to the sample to be measured. The chopper 14 rotates under the control of the chopper controller 16 and controls the passage / cutoff of the excitation light transmitted through the ND filter 13.
This is for irradiating the sample to be measured with excitation light in a pulsed manner. The shutter 15 opens and closes under the control of the shutter controller 17, and irradiates the sample under test with excitation light in a pulsed manner when it is open.
【００１６】サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
で発生した化学発光を検出する化学発光検出手段は、レ
ンズ２１、ダイクロイックミラー２２、フィルタ２３、
レンズ２４、シャッタ２５、光電子増倍管２６、シャッ
タコントローラ２７および高電圧電源２８を備えてい
る。レンズ２１およびレンズ２４は、被測定試料で発生
した化学発光を光電子増倍管２６の受光面に集光する。
ダイクロイックミラー２２は、被測定試料で発生した化
学発光を反射させるとともに、被測定試料で発生した蛍
光を透過させる。フィルタ２３は、化学発光の波長成分
を選択的に透過させる。シャッタ２５は、シャッタコン
トローラ２７により制御されて開閉し、開いているとき
に化学発光を光電子増倍管２６の受光面に入射させる。
光電子増倍管２６は、高電圧電源２８から供給された高
電圧により駆動され、受光面に入射した化学発光の強度
に応じた化学発光検出信号を出力する。The chemiluminescence detecting means for detecting the chemiluminescence generated in the sample to be measured contained in the sample holder 1 includes a lens 21, a dichroic mirror 22, a filter 23,
The camera includes a lens 24, a shutter 25, a photomultiplier tube 26, a shutter controller 27, and a high-voltage power supply 28. The lenses 21 and 24 focus the chemiluminescence generated in the sample to be measured on the light receiving surface of the photomultiplier tube 26.
The dichroic mirror 22 reflects the chemiluminescence generated in the sample to be measured and transmits the fluorescence generated in the sample to be measured. The filter 23 selectively transmits the wavelength component of chemiluminescence. The shutter 25 opens and closes under the control of a shutter controller 27, and causes the chemiluminescence to be incident on the light receiving surface of the photomultiplier tube 26 when opened.
The photomultiplier tube 26 is driven by the high voltage supplied from the high voltage power supply 28 and outputs a chemiluminescence detection signal corresponding to the intensity of the chemiluminescence incident on the light receiving surface.
【００１７】サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
で発生した蛍光を検出する蛍光検出手段は、レンズ２
１、ダイクロイックミラー２２、レンズ３１、フィルタ
３２、モノクロメータ３３、光電子増倍管３４および高
電圧電源３５を備えている。レンズ２１およびレンズ３
１は、被測定試料で発生した蛍光をモノクロメータ３３
の入力開口部に集光する。フィルタ３２は、励起光の波
長成分を遮断するとともに、蛍光の波長成分を選択的に
透過させる。モノクロメータ３３は、入力した蛍光を分
光して、所望の波長成分のみを出力する。光電子増倍管
３４は、高電圧電源３５から供給された高電圧により駆
動され、モノクロメータ３３から出力された蛍光の強度
に応じた蛍光検出信号を出力する。The fluorescent light detecting means for detecting the fluorescent light generated in the sample to be measured contained in the sample holder 1 comprises a lens 2
1, a dichroic mirror 22, a lens 31, a filter 32, a monochromator 33, a photomultiplier tube 34, and a high voltage power supply 35. Lens 21 and lens 3
Reference numeral 1 denotes a monochromator 33 for converting the fluorescence generated from the sample to be measured.
Focus on the input aperture of The filter 32 blocks the wavelength component of the excitation light and selectively transmits the wavelength component of the fluorescence. The monochromator 33 splits the input fluorescence and outputs only a desired wavelength component. The photomultiplier tube 34 is driven by the high voltage supplied from the high voltage power supply 35 and outputs a fluorescence detection signal according to the intensity of the fluorescence output from the monochromator 33.
【００１８】アンプ４１は、光電子増倍管２６から出力
された化学発光検出信号を増幅するとともに、光電子増
倍管３４から出力された蛍光検出信号をも増幅する。フ
ォトンカウンタ４２は、アンプ４１により増幅されて出
力された化学発光検出信号および蛍光検出信号それぞれ
を入力し、また、チョッパコントローラ１６による励起
光の通過／遮断の制御信号を入力する。そして、フォト
ンカウンタ４２は、これらの信号に基づいて、励起光が
被測定試料に照射されていないときに光電子増倍管２６
が検出した化学発光の光子数を計数し、励起光が被測定
試料に照射されているときに光電子増倍管３４が検出し
た蛍光の光子数を計数する。コンピュータ４３は、フォ
トンカウンタ４２により計数された化学発光の光子数お
よび蛍光の光子数に基づいて被測定試料の解析を行う。The amplifier 41 amplifies the chemiluminescence detection signal output from the photomultiplier tube 26 and also amplifies the fluorescence detection signal output from the photomultiplier tube 34. The photon counter 42 receives the chemiluminescence detection signal and the fluorescence detection signal amplified and output by the amplifier 41, and also receives a control signal for passing / blocking the excitation light by the chopper controller 16. Then, based on these signals, the photon counter 42 sets the photomultiplier tube 26 when the excitation light is not irradiated on the sample to be measured.
The number of photons of chemiluminescence detected by the photomultiplier is counted, and the number of photons of fluorescence detected by the photomultiplier tube 34 when the sample to be measured is irradiated with the excitation light is counted. The computer 43 analyzes the sample under measurement based on the number of chemiluminescent photons and the number of fluorescent photons counted by the photon counter 42.
【００１９】なお、励起手段におけるシャッタ１５から
サンプルホルダ１に到る光学系、化学発光検出手段にお
けるサンプルホルダ１から光電子増倍管２６に到る光学
系、および、蛍光検出手段におけるサンプルホルダ１か
ら光電子増倍管３４に到る光学系は、暗箱５１内に収め
られている。The optical system from the shutter 15 in the excitation means to the sample holder 1, the optical system from the sample holder 1 in the chemiluminescence detection means to the photomultiplier tube 26, and the sample system 1 in the fluorescence detection means The optical system reaching the photomultiplier tube 34 is housed in a dark box 51.
【００２０】次に、本実施形態に係る化学発光および蛍
光の経時変化測定装置の動作を説明するとともに、本実
施形態に係る化学発光および蛍光の経時変化測定方法に
ついても説明する。また、以下の説明では具体的な実施
例として被測定試料がヒト好中球様細胞である場合につ
いて説明する。ここで、ヒト好中球様細胞は、ヒト単球
系株細胞ＴＨＰ−１を０．５ｍＭのＢｔ2ｃＡＭＰ（ジ
ブチリル環状アデノシンリン酸）を含む１０％血清入り
ＲＰＭＩmediumで細胞密度を３×１０5細胞／ｍｌに合
わせ、これを３日間３７℃で５％ＣＯ2存在下で培養し
たものである。Next, the operation of the apparatus for measuring the temporal change in chemiluminescence and fluorescence according to the present embodiment will be described, and the method for measuring the temporal change in chemiluminescence and fluorescence according to the present embodiment will also be described. In the following description, a case where the sample to be measured is human neutrophil-like cells will be described as a specific example. Here, the human neutrophil-like cells were prepared by transforming the human monocyte lineage cell THP-1 into RPMImedium containing 0.5 mM Bt 2 cAMP (dibutyryl cyclic adenosine phosphate) and containing 10% serum to a cell density of 3 × 10 5. Cells / ml and cultured for 3 days at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
【００２１】被測定試料である好中球様細胞は、予め、
カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３（1-[2-amino-5-(2,
7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxyl]-2
-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraac
etic acid ）で処理され、また、化学発光試薬ＣＬＡ
（ウミホタルルシフェリン誘導体、2-methyl-6-phenyl-
3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one）が添加され
て、懸濁液とされる。この被測定試料は、石英セルに容
れられてサンプルホルダ１にセットされる。サンプルホ
ルダ１にセットされた被測定試料は、サーモバス２によ
り一定温度３７℃に維持され、マグネティックスターラ
コントローラ５により制御されたマグネティックスター
ラにより攪拌される。The neutrophil-like cells to be measured are prepared in advance.
Calcium fluorescent indicator fluo-3 (1- [2-amino-5- (2,
7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl) phenoxyl] -2
-(2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N, N, N ', N'-tetraac
etic acid) and the chemiluminescent reagent CLA
(Seafly luciferin derivative, 2-methyl-6-phenyl-
3,7-dihydroimidazo [1,2-a] pyrazin-3-one) is added to form a suspension. The sample to be measured is contained in a quartz cell and set on the sample holder 1. The sample to be measured set in the sample holder 1 is maintained at a constant temperature of 37 ° C. by the thermo bath 2 and is stirred by a magnetic stirrer controlled by a magnetic stirrer controller 5.
【００２２】以上の測定準備が終了すると、チョッパ１
４はチョッパコントローラ１６により制御されて一定速
度で回転し、シャッタ１５はシャッタコントローラ１７
により制御されて開く。チョッパ１４による励起光の通
過／遮断の周期は、例えばミリ秒程度である。When the above measurement preparation is completed, the chopper 1
4 is controlled by a chopper controller 16 and rotates at a constant speed.
Open controlled by. The cycle of passing / blocking the excitation light by the chopper 14 is, for example, about milliseconds.
【００２３】励起光源１１から出力された励起光は、光
ファイバ１２を経てＮＤフィルタ１３に入射し、ＮＤフ
ィルタ１３により光量が調整され、チョッパ１４に入射
する。そして、チョッパ１４に入射した励起光は、チョ
ッパ１４により通過／遮断の制御を受け、シャッタ１５
を通過して、サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
にパルス的に照射される。励起光源１１は、波長４８８
ｎｍのレーザ光を出力するアルゴンレーザ光源が用いら
れる。Excitation light output from the excitation light source 11 enters the ND filter 13 via the optical fiber 12, the amount of light is adjusted by the ND filter 13, and enters the chopper 14. Then, the excitation light incident on the chopper 14 is controlled to pass / block by the chopper 14 and the shutter 15
, The sample to be measured held in the sample holder 1 is irradiated in a pulsed manner. The excitation light source 11 has a wavelength of 488.
An argon laser light source that outputs a laser beam of nm is used.
【００２４】被測定試料で発生した化学発光は、レンズ
２１およびレンズ２４により集光され、ダイクロイック
ミラー２２により反射され、フィルタ２３およびシャッ
タ２５を通過し、光電子増倍管２６の受光面に入射す
る。光電子増倍管２６からは、受光面に入射した化学発
光の強度に応じた化学発光検出信号が出力される。この
化学発光は、スーパーオキサイドと化学発光試薬ＣＬＡ
とが化学反応してＣＬＡ酸化物が生成される際に発生す
る化学発光である。すなわち、化学発光強度は、スーパ
ーオキサイド産生量を表している。The chemiluminescence generated in the sample to be measured is collected by the lens 21 and the lens 24, reflected by the dichroic mirror 22, passes through the filter 23 and the shutter 25, and enters the light receiving surface of the photomultiplier tube 26. . The photomultiplier tube 26 outputs a chemiluminescence detection signal corresponding to the intensity of the chemiluminescence incident on the light receiving surface. This chemiluminescence is based on superoxide and chemiluminescent reagent CLA.
Is chemiluminescence generated when a CLA oxide is generated by a chemical reaction. That is, the chemiluminescence intensity indicates a superoxide production amount.
【００２５】一方、被測定試料で発生した蛍光は、レン
ズ２１およびレンズ３１により集光され、ダイクロイッ
クミラー２２およびフィルタ３２を透過し、モノクロメ
ータ３３により分光されて所望の波長成分のみが出力さ
れ、その所望の波長成分のみが光電子増倍管３４の受光
面に入射する。光電子増倍管３４からは、モノクロメー
タ３３から出力された蛍光の強度に応じた蛍光検出信号
が出力される。この蛍光は、好中球様細胞内の遊離カル
シウムイオンとカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３とが
結合して生成された錯体に励起光が照射されて発生する
蛍光である。すなわち、蛍光強度は、好中球様細胞内の
遊離カルシウムイオンの濃度を表している。なお、励起
光の散乱光は、ダイクロイックミラー２２、フィルタ３
２およびモノクロメータ３３それぞれにより遮断される
ので、光電子増倍管３４の受光面に入射することはな
い。On the other hand, the fluorescent light generated from the sample to be measured is condensed by the lens 21 and the lens 31, passes through the dichroic mirror 22 and the filter 32, is separated by the monochromator 33, and outputs only the desired wavelength component. Only the desired wavelength component is incident on the light receiving surface of the photomultiplier tube. From the photomultiplier tube 34, a fluorescence detection signal corresponding to the intensity of the fluorescence output from the monochromator 33 is output. This fluorescence is fluorescence generated by irradiating excitation light to a complex formed by binding of free calcium ions in neutrophil-like cells and the calcium fluorescent indicator fluo-3. That is, the fluorescence intensity indicates the concentration of free calcium ions in neutrophil-like cells. The scattered light of the excitation light is transmitted to the dichroic mirror 22 and the filter 3.
2 and the monochromator 33, the light is not incident on the light receiving surface of the photomultiplier tube.
【００２６】光電子増倍管２６から出力された化学発光
検出信号、および、光電子増倍管３４から出力された蛍
光検出信号それぞれは、アンプ４１に入力し、アンプ４
１により増幅される。アンプ４１により増幅されて出力
された化学発光検出信号および蛍光検出信号それぞれ
は、フォトンカウンタ４２に入力する。また、チョッパ
コントローラ１６による励起光の通過／遮断の制御信号
も、フォトンカウンタ４２に入力する。そして、フォト
ンカウンタ４２により、励起光が被測定試料に照射され
ていないときに光電子増倍管２６が検出した化学発光の
光子数が計数され、励起光が被測定試料に照射されてい
るときに光電子増倍管３４が検出した蛍光の光子数が計
数される。The chemiluminescence detection signal output from the photomultiplier tube 26 and the fluorescence detection signal output from the photomultiplier tube 34 are input to an amplifier 41,
Amplified by 1. Each of the chemiluminescence detection signal and the fluorescence detection signal amplified and output by the amplifier 41 is input to the photon counter 42. Further, a control signal for passing / blocking the excitation light by the chopper controller 16 is also input to the photon counter 42. Then, the photon counter 42 counts the number of photons of chemiluminescence detected by the photomultiplier tube 26 when the sample to be measured is not irradiated with the excitation light. The number of fluorescence photons detected by the photomultiplier tube 34 is counted.
【００２７】以上のように励起光照射、化学発光検出お
よび蛍光検出を行いながら、サンプルディスペンサ６よ
り刺激薬が被測定試料（好中球様細胞）へ滴下される。
刺激薬として例えば好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰが用
いられる。そして、コンピュータ４３により、刺激薬の
被測定試料への滴下、化学発光強度（スーパーオキサイ
ド産生量）および蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）の
間の因果関係や時間的関係が解析される。As described above, the stimulant is dropped from the sample dispenser 6 onto the sample to be measured (neutrophil-like cells) while performing the excitation light irradiation, the chemiluminescence detection, and the fluorescence detection.
As a stimulant, for example, the neutrophil chemotactic peptide fMLP is used. The computer 43 analyzes the causal relationship and the temporal relationship between the stimulant dropped onto the sample to be measured, the chemiluminescence intensity (superoxide production amount), and the fluorescence intensity (intracellular calcium concentration).
【００２８】図２は、化学発光および蛍光の経時変化測
定の結果を示すグラフである。このグラフには、化学発
光強度（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度
（細胞内カルシウム濃度）が示されている。被測定試料
は、上述したようなカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３
で処理され化学発光試薬ＣＬＡが添加された好中球様細
胞を、１ｍＭの細胞外カルシウム溶液内に容れて懸濁液
としたものである。測定開始後の１５０秒の時点で１μ
ＭのｆＭＬＰで被測定試料を刺激した。FIG. 2 is a graph showing the results of the measurement of changes over time in chemiluminescence and fluorescence. This graph shows the chemiluminescence intensity (superoxide production amount) and the fluorescence intensity (intracellular calcium concentration). The sample to be measured is the calcium fluorescent indicator fluo-3 as described above.
The neutrophil-like cells to which the chemiluminescent reagent CLA was added and which had been treated as described above were placed in a 1 mM extracellular calcium solution to form a suspension. 1μ at 150 seconds after the start of measurement
The sample to be measured was stimulated with M fMLP.
【００２９】このグラフから判るように、ｆＭＬＰで被
測定試料が刺激されると、直ちに蛍光強度が上昇し、そ
の後に数秒遅れて、化学発光強度が上昇している。この
ことから、ｆＭＬＰ刺激により、細胞内カルシウム濃度
が直ちに上昇し、その後に数秒遅れてスーパーオキサイ
ドが産生されることが確認された。As can be seen from this graph, when the sample to be measured is stimulated with fMLP, the fluorescence intensity increases immediately, and after a few seconds, the chemiluminescence intensity increases. From this, it was confirmed that the intracellular calcium concentration was immediately increased by fMLP stimulation, and thereafter, superoxide was produced several seconds later.
【００３０】図３は、化学発光および蛍光それぞれを単
独で測定した結果を示すグラフである。同図（ａ）は、
カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３で負荷をかけない好
中球様細胞を１ｍＭの細胞外カルシウム存在下で１μＭ
のｆＭＬＰで刺激して、本実施形態に係る測定装置およ
び測定方法により測定した結果を示す。このグラフから
判るように、ｆＭＬＰ刺激が与えられたときに、蛍光強
度（すなわち、細胞内カルシウム濃度）の変化は無い
が、化学発光強度（すなわち、スーパーオキサイド産生
量）の変化は図２と同様の変化を示した。FIG. 3 is a graph showing the results of measurement of chemiluminescence and fluorescence alone. FIG.
Neutrophil-like cells not loaded with the calcium fluorescent indicator fluo-3 were incubated at 1 μM in the presence of 1 mM extracellular calcium.
2 shows the results measured by the measurement apparatus and the measurement method according to the present embodiment when stimulated with fMLP. As can be seen from this graph, when fMLP stimulation was given, there was no change in fluorescence intensity (ie, intracellular calcium concentration), but the change in chemiluminescence intensity (ie, superoxide production) was the same as in FIG. Showed a change.
【００３１】一方、同図（ｂ）は、カルシウム蛍光指示
薬ｆｌｕｏ−３で負荷をかけた好中球様細胞を化学発光
試薬ＣＬＡ非存在下で１μＭのｆＭＬＰで刺激して、本
実施形態に係る測定装置および測定方法により測定した
結果を示す。このグラフから判るように、ｆＭＬＰ刺激
が与えられたときに、化学発光強度（すなわち、スーパ
ーオキサイド産生量）の変化は無いが、蛍光強度（すな
わち、細胞内カルシウム濃度）の変化は図２と同様の変
化を示した。On the other hand, FIG. 2B shows that the neutrophil-like cells loaded with the calcium fluorescent indicator fluo-3 were stimulated with 1 μM fMLP in the absence of the chemiluminescent reagent CLA, according to the present embodiment. The result measured by the measuring device and the measuring method is shown. As can be seen from this graph, when fMLP stimulation was given, there was no change in the chemiluminescence intensity (ie, the amount of superoxide production), but the change in the fluorescence intensity (ie, the intracellular calcium concentration) was the same as in FIG. Showed a change.
【００３２】これらの図より、本実施形態に係る測定装
置および測定方法は、蛍光強度（すなわち、細胞内カル
シウム濃度）の変化および化学発光強度（すなわち、ス
ーパーオキサイド産生量）の変化それぞれを忠実に且つ
同時に検出することができることが確認された。From these figures, it can be seen that the measuring apparatus and the measuring method according to the present embodiment faithfully recognize the change in the fluorescence intensity (ie, the intracellular calcium concentration) and the change in the chemiluminescence intensity (ie, the amount of superoxide production). And it was confirmed that it can be detected simultaneously.
【００３３】なお、図３に示すように化学発光および蛍
光それぞれを単独で測定する場合には、化学発光強度
（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞内
カルシウム濃度）の間の微妙な因果関係や時間的関係を
解析することは非常に困難である。しかし、図２に示す
ように化学発光および蛍光を同時測定する場合には、同
一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれを略同時
に実時間で検出することができるので、両者間の微妙な
因果関係や時間的関係を解析することができる。As shown in FIG. 3, when chemiluminescence and fluorescence are measured independently, a subtle causal relationship between the chemiluminescence intensity (superoxide production amount) and the fluorescence intensity (intracellular calcium concentration) is obtained. It is very difficult to analyze temporal relationships. However, when chemiluminescence and fluorescence are measured simultaneously as shown in FIG. 2, the chemiluminescence and fluorescence generated in the same sample can be detected almost simultaneously in real time, so that a delicate causal relationship between the two can be detected. And time relationships can be analyzed.
【００３４】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。上記実施形態では、
ヒト好中球様細胞を被測定対象として、励起光が被測定
試料に照射されていないときに被測定試料においてスー
パーオキサイド産生に伴い発生した化学発光を検出し、
励起光が被測定試料に照射されているときに被測定試料
においてカルシウム濃度変化に伴い発生した蛍光を検出
する場合について説明したが、これに限られるものでは
ない。The present invention is not limited to the above embodiment, but can be variously modified. In the above embodiment,
Assuming that human neutrophil-like cells are to be measured, the chemiluminescence generated with superoxide production in the sample to be measured is detected when the sample to be measured is not irradiated with excitation light,
Although the case where the fluorescence generated due to the calcium concentration change in the sample to be measured when the sample to be measured is irradiated with the excitation light has been described, the invention is not limited to this.
【００３５】[0035]
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、被測定試料に励起光を繰り返しパルス的に照射
して、励起光が被測定試料に照射されていないときに被
測定試料で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定
試料に照射されているときに被測定試料で発生した蛍光
を検出するので、同一試料で発生した化学発光および蛍
光それぞれの経時変化を実時間で検出することができ
る。As described above in detail, according to the present invention, the sample to be measured is irradiated with the excitation light repeatedly in a pulsed manner, and the sample to be measured is not irradiated when the sample is not irradiated with the excitation light. Detects the chemiluminescence generated in the sample and detects the fluorescence generated in the sample when the excitation light is irradiated on the sample. Can be detected.
【００３６】特に、被測定試料がヒト好中球であって、
励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試
料においてスーパーオキサイド産生に伴い発生した化学
発光を検出し、励起光が被測定試料に照射されていると
きに被測定試料においてカルシウム濃度変化に伴い発生
した蛍光を検出することにより、スーパーオキサイド産
生を担う細胞内カルシウム濃度上昇の実体の解明に貢献
することができ、慢性肉芽腫症患者の治療につながる新
たな細胞機能診断法が確立されるものと期待される。In particular, when the sample to be measured is human neutrophils,
Detects chemiluminescence generated by superoxide production in the sample when the excitation light is not irradiated on the sample, and changes the calcium concentration in the sample when the excitation light is irradiated on the sample. By detecting the fluorescence generated along with this, it is possible to contribute to elucidation of the substance of the increase in intracellular calcium concentration responsible for superoxide production, and a new method for diagnosing cell function leading to treatment of patients with chronic granulomatosis has been established Expected.
【図１】本実施形態に係る化学発光および蛍光の経時変
化測定装置の構成図である。FIG. 1 is a configuration diagram of an apparatus for measuring a change with time of chemiluminescence and fluorescence according to an embodiment.
【図２】化学発光および蛍光の経時変化測定の結果を示
すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the change over time of chemiluminescence and fluorescence.
【図３】化学発光および蛍光それぞれを単独で測定した
結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the results of independently measuring chemiluminescence and fluorescence.
１…サンプルホルダ、２…サーモバス、３，４…配管、
５…マグネティックスターラコントローラ、６…サンプ
ルディスペンサ、１１…励起光源、１２…光ファイバ、
１３…ＮＤフィルタ、１４…チョッパ、１５…シャッ
タ、１６…チョッパコントローラ、１７…シャッタコン
トローラ、２１…レンズ、２２…ダイクロイックミラ
ー、２３…フィルタ、２４…レンズ、２５…シャッタ、
２６…光電子増倍管、２７…シャッタコントローラ、２
８…高電圧電源、３１…レンズ、３２…フィルタ、３３
…モノクロメータ、３４…光電子増倍管、３５…高電圧
電源、４１…アンプ、４２…フォトンカウンタ、４３…
コンピュータ、５１…暗箱。1: Sample holder, 2: Thermo bath, 3, 4: Piping,
5 magnetic stirrer controller 6 sample dispenser 11 excitation light source 12 optical fiber
13 ND filter, 14 chopper, 15 shutter, 16 chopper controller, 17 shutter controller, 21 lens, 22 dichroic mirror, 23 filter, 24 lens, 25 shutter,
26 photomultiplier tube, 27 shutter controller, 2
8 ... High voltage power supply, 31 ... Lens, 32 ... Filter, 33
... monochromator, 34 ... photomultiplier tube, 35 ... high voltage power supply, 41 ... amplifier, 42 ... photon counter, 43 ...
Computer, 51 ... dark box.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平10−132744（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−334466（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−205545（ＪＰ，Ａ) 升島努、「Ｘ線、化学発光ビデオ顕微 鏡の開発と生体微少域動態分析」、平成 ５年度科学研究費補助金（一般研究 （Ｂ））研究成果報告書、84頁 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 21/62 - 21/83 G01N 33/483 G01N 33/84 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-10-132744 (JP, A) JP-A-8-334466 (JP, A) JP-A-63-205545 (JP, A) Tsutomu Masushima, “ Development of X-ray and Chemiluminescence Video Microscope and Analysis of Microscopic Dynamic Behavior in the Living Body ”, 1993 Grant-in-Aid for Scientific Research (General Research (B)) Research Report, 84 pages (58) Fields surveyed (Int. . 7, DB name) G01N 21/62 - 21/83 G01N 33/483 G01N 33/84 JICST file (JOIS)
Claims (4)
し照射する励起手段と、 前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射
されていないときに前記被測定試料で発生した化学発光
を検出する化学発光検出手段と、 前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射
されているときに前記被測定試料で発生した蛍光を検出
する蛍光検出手段と、 を備え、 前記化学発光検出手段および前記蛍光検出手段により前
記化学発光および前記蛍光それぞれの経時変化を測定す
る、 ことを特徴とする化学発光および蛍光の経時変化測定装
置。An excitation means for repeatedly irradiating a sample to be measured with excitation light in a pulsed manner, and a chemiluminescence generated in the sample to be measured when the excitation means is not irradiating the sample to be measured with the excitation light. And a fluorescence detecting means for detecting fluorescence generated in the sample to be measured when the excitation light is irradiated on the sample to be measured by the excitation means. An apparatus for measuring a change with time of chemiluminescence and fluorescence with the detection means and the fluorescence detection means.
御手段を更に備えることを特徴とする請求項１記載の化
学発光および蛍光の経時変化測定装置。2. The apparatus according to claim 1, further comprising temperature control means for controlling the temperature of the sample to be measured.
定試料を攪拌する攪拌手段を更に備えることを特徴とす
る請求項１記載の化学発光および蛍光の経時変化測定装
置。3. The apparatus according to claim 1, wherein the sample to be measured is a liquid, and further comprises a stirring means for stirring the sample to be measured.
し照射して、 前記励起光が前記被測定試料に照射されていないときに
前記被測定試料で発生した化学発光を検出し、 前記励起光が前記被測定試料に照射されているときに前
記被測定試料で発生した蛍光を検出して、 前記化学発光および前記蛍光それぞれの経時変化を測定
する、 ことを特徴とする化学発光および蛍光の経時変化測定方
法。4. A sample to be measured is irradiated with excitation light repeatedly in a pulsed manner, and a chemiluminescence generated in the sample to be measured is detected when the sample is not irradiated with the excitation light. Detecting fluorescence generated in the sample when the sample is irradiated with light, and measuring a change with time of the chemiluminescence and the fluorescence, respectively, Method for measuring change over time.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11604146B2 (en) | 2017-09-19 | 2023-03-14 | Beckman Coulter, Inc. | Analog light measuring and photon counting with a luminometer system for assay reactions in chemiluminescence measurements |
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-
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- 1998-10-29 JP JP30868898A patent/JP3183863B2/en not_active Expired - Fee Related
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| 升島努、「Ｘ線、化学発光ビデオ顕微鏡の開発と生体微少域動態分析」、平成５年度科学研究費補助金（一般研究（Ｂ））研究成果報告書、８４頁 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11604146B2 (en) | 2017-09-19 | 2023-03-14 | Beckman Coulter, Inc. | Analog light measuring and photon counting with a luminometer system for assay reactions in chemiluminescence measurements |
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