JP3172917B2 - 細菌検出方法 - Google Patents
細菌検出方法Info
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- JP3172917B2 JP3172917B2 JP20864799A JP20864799A JP3172917B2 JP 3172917 B2 JP3172917 B2 JP 3172917B2 JP 20864799 A JP20864799 A JP 20864799A JP 20864799 A JP20864799 A JP 20864799A JP 3172917 B2 JP3172917 B2 JP 3172917B2
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- achromopeptidase
- cfu
- bacteria
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子増幅技術
（ＰＣＲ）を用いて食品等に存在する微量の細菌を簡
単、迅速、高感度に検出する細菌検出方法に関するもの
である。
（ＰＣＲ）を用いて食品等に存在する微量の細菌を簡
単、迅速、高感度に検出する細菌検出方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】近年、ＰＣＲによる遺伝子検出技術は迅
速、高感度であることから、医療分野での遺伝子診断や
細菌検査、食品分野での食中毒菌などの検査などに広く
利用されている。このような、ルーチンの検査の場合、
操作は簡単且つ迅速であることが要求されるので、試薬
類のキット化や操作の自動化が進められている。
速、高感度であることから、医療分野での遺伝子診断や
細菌検査、食品分野での食中毒菌などの検査などに広く
利用されている。このような、ルーチンの検査の場合、
操作は簡単且つ迅速であることが要求されるので、試薬
類のキット化や操作の自動化が進められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この中で簡便な細菌か
らのＤＮＡ抽出方法として、キレックス試薬を用いる方
法があり、この方法では、細菌ペレットをキレックス溶
液に懸濁後、加熱、攪拌を繰り返し、その後、遠心分離
して上澄みをＰＣＲ反応に使用している。この方法で
は、確かに、グラム陰性菌のＤＮＡは効率良く調製でき
るが、細胞壁が硬いグラム陽性菌の場合は、キレックス
溶液での処理前に、細胞壁分解酵素処理、界面活性剤存
在下での蛋白分解酵素処理が必要である。この場合、処
理に時間がかかり、又、界面活性剤が存在するため、Ｐ
ＣＲ反応に供することができる量は僅かであり、そのた
め、絶対的検出感度は悪い。
らのＤＮＡ抽出方法として、キレックス試薬を用いる方
法があり、この方法では、細菌ペレットをキレックス溶
液に懸濁後、加熱、攪拌を繰り返し、その後、遠心分離
して上澄みをＰＣＲ反応に使用している。この方法で
は、確かに、グラム陰性菌のＤＮＡは効率良く調製でき
るが、細胞壁が硬いグラム陽性菌の場合は、キレックス
溶液での処理前に、細胞壁分解酵素処理、界面活性剤存
在下での蛋白分解酵素処理が必要である。この場合、処
理に時間がかかり、又、界面活性剤が存在するため、Ｐ
ＣＲ反応に供することができる量は僅かであり、そのた
め、絶対的検出感度は悪い。
【０００４】また、キレックス試薬を用いることなく、
細菌ＤＮＡを抽出する方法として、界面活性剤を用いる
方法があるが、エタノール等によるＤＮＡの沈殿精製操
作が必要で、その操作は煩雑で、その上、抽出効率も良
くなかった。更に、アクロモペプチターゼを使用して、
グラム陽性菌からの鋳型ＤＮＡ調製法があるが、これも
界面活性剤と有機溶媒による抽出、エタノール等による
沈殿精製操作などが必要で、やはり、その操作は煩雑で
ある。このように、グラム陽性菌の検出方法は、ＤＮＡ
抽出操作が煩雑で、簡単且つ迅速に検出ができなかっ
た。本発明は、簡単且つ迅速に高感度で細菌が検出でき
る細菌検出方法を提供することを目的とする。
細菌ＤＮＡを抽出する方法として、界面活性剤を用いる
方法があるが、エタノール等によるＤＮＡの沈殿精製操
作が必要で、その操作は煩雑で、その上、抽出効率も良
くなかった。更に、アクロモペプチターゼを使用して、
グラム陽性菌からの鋳型ＤＮＡ調製法があるが、これも
界面活性剤と有機溶媒による抽出、エタノール等による
沈殿精製操作などが必要で、やはり、その操作は煩雑で
ある。このように、グラム陽性菌の検出方法は、ＤＮＡ
抽出操作が煩雑で、簡単且つ迅速に検出ができなかっ
た。本発明は、簡単且つ迅速に高感度で細菌が検出でき
る細菌検出方法を提供することを目的とする。
【０００５】上記目的を達成ずべく、本願発明にかかる
細菌検出方法は、細菌ペレットを、アクロモペプチダー
ゼ単独の緩衝液あるいは他の細菌細胞壁分解酵素との混
合緩衝液に懸濁し、加熱後、キレックス溶液で懸濁し、
加熱、攪拌後、遠心分離し、上澄みをＰＣＲ反応してな
るものである。
細菌検出方法は、細菌ペレットを、アクロモペプチダー
ゼ単独の緩衝液あるいは他の細菌細胞壁分解酵素との混
合緩衝液に懸濁し、加熱後、キレックス溶液で懸濁し、
加熱、攪拌後、遠心分離し、上澄みをＰＣＲ反応してな
るものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の実施例につき説明する。
本発明に用いた菌株および培養は次のとおりである。使
用した細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ
ＦＯ３８０６、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓＡＴＣＣ２５９３およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅ
ｒｅｕｓ ｅｍｅｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄおよびＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｂｒ
ｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（食中毒患者
から単離された菌株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.、Ｌｅｕ
ｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ.（食品からの分離株）であ
る。
本発明に用いた菌株および培養は次のとおりである。使
用した細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ
ＦＯ３８０６、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓＡＴＣＣ２５９３およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅ
ｒｅｕｓ ｅｍｅｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄおよびＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｂｒ
ｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（食中毒患者
から単離された菌株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.、Ｌｅｕ
ｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ.（食品からの分離株）であ
る。
【０００７】乳酸菌以外の菌はトリプトソーヤ液体培地
中、３７℃で一夜静置培養されたあと、鋳型ＤＮＡ調整
に供された。二種類の乳酸菌はＧＡＭ液体培地で３０℃
で一夜静置培養された。
中、３７℃で一夜静置培養されたあと、鋳型ＤＮＡ調整
に供された。二種類の乳酸菌はＧＡＭ液体培地で３０℃
で一夜静置培養された。
【０００８】ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ
（ＣＦＵ）の計測は次の通りである。菌の一夜培養液
は、生理食塩水により１０倍段階に希釈した。この各段
階の菌希釈液を寒天平板培地２枚に０．１ｍｌずつ塗抹
し、３５℃で２４時間乃至４８時間培用後、コロニー数
を計測した。
（ＣＦＵ）の計測は次の通りである。菌の一夜培養液
は、生理食塩水により１０倍段階に希釈した。この各段
階の菌希釈液を寒天平板培地２枚に０．１ｍｌずつ塗抹
し、３５℃で２４時間乃至４８時間培用後、コロニー数
を計測した。
【０００９】使用した平板培地はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉとＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓでは
標準寒天培地（以下ＳＰＣと略す）、Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓではＳＰＣあるいはマンニ
ット食塩寒天培地（以下ＭＳと略す）、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｅｒｅｕｓ ｅｍｅｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄで
はＳＰＣあるいはＮＧＫＧ寒天培地、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓではＤＨＬ寒天培地、Ｖ
ｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓではビ
ブリオ寒天培地、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.
とＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ.ではＳＰＣあるいは
ＢＬ寒天培地であった。これらの培地は日水製薬（株）
製である。
ａ ｃｏｌｉとＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓでは
標準寒天培地（以下ＳＰＣと略す）、Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓではＳＰＣあるいはマンニ
ット食塩寒天培地（以下ＭＳと略す）、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｅｒｅｕｓ ｅｍｅｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄで
はＳＰＣあるいはＮＧＫＧ寒天培地、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓではＤＨＬ寒天培地、Ｖ
ｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓではビ
ブリオ寒天培地、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.
とＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ.ではＳＰＣあるいは
ＢＬ寒天培地であった。これらの培地は日水製薬（株）
製である。
【００１０】二種類の培地を使った菌の場合、ＣＦＵは
ＳＰＣで若干多めであったが、基本的にほとんど変化が
ないので、以後はＳＰＣを用いた。
ＳＰＣで若干多めであったが、基本的にほとんど変化が
ないので、以後はＳＰＣを用いた。
【００１１】上記菌により、本発明の細菌検出方法を行
う。最初に、菌の１０倍段階希釈液を２本の１.５ｍｌ
マイクロ遠心チューブに１.０ｍｌずつ取る。そして、
１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。上澄みを除
き、菌ペレットを５００Ｕ/ｍｌのアクロモペプチダー
ゼ（和光純薬工業）を含む緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ
Ｎａｃｌ）０.１ｍｌに懸濁する。
う。最初に、菌の１０倍段階希釈液を２本の１.５ｍｌ
マイクロ遠心チューブに１.０ｍｌずつ取る。そして、
１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。上澄みを除
き、菌ペレットを５００Ｕ/ｍｌのアクロモペプチダー
ゼ（和光純薬工業）を含む緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ
Ｎａｃｌ）０.１ｍｌに懸濁する。
【００１２】これを５５℃で１０分間加熱し、０.１ｍ
ｌのＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（６％キレック
ス溶液、ＢｉｏＲａｄ社）を加える。そして、５６℃で
１５分間加熱後、１０秒間攪拌する。その後、８分間ボ
イルし、１０秒間攪拌する。そして、１００００ｒｐｍ
で３分間遠心分離を行う。上澄みを新しい１.５ｍｌマ
イクロ遠心チューブに移す。
ｌのＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（６％キレック
ス溶液、ＢｉｏＲａｄ社）を加える。そして、５６℃で
１５分間加熱後、１０秒間攪拌する。その後、８分間ボ
イルし、１０秒間攪拌する。そして、１００００ｒｐｍ
で３分間遠心分離を行う。上澄みを新しい１.５ｍｌマ
イクロ遠心チューブに移す。
【００１３】最終的に、鋳型ＤＮＡ溶液の液量は、約
０.２ｍｌとなり、菌希釈液である生理食塩水も同様な
操作を行い、陰性対照とした。アクロモペプチダーゼ処
理を省く場合には、前記における１２０００ｒｐｍで３
分間遠心分離後、菌ペレットに０.１ｍｌのＩｎｓｔａ
Ｇｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（６％キレックス溶液、Ｂｉｏ
Ｒａｄ社）を加え、前述したと同様な操作を行う。
０.２ｍｌとなり、菌希釈液である生理食塩水も同様な
操作を行い、陰性対照とした。アクロモペプチダーゼ処
理を省く場合には、前記における１２０００ｒｐｍで３
分間遠心分離後、菌ペレットに０.１ｍｌのＩｎｓｔａ
Ｇｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（６％キレックス溶液、Ｂｉｏ
Ｒａｄ社）を加え、前述したと同様な操作を行う。
【００１４】この場合、最終的な鋳型ＤＮＡ溶液の液量
は、約０.１ｍｌとなり、ＰＣＲ反応に使用する量は、
５０μｌのＰＣＲ反応液当たり、アクロモペプチダーゼ
処理の場合は２０μｌ、アクロモペプチダーゼ無処理の
場合は１０μｌである。
は、約０.１ｍｌとなり、ＰＣＲ反応に使用する量は、
５０μｌのＰＣＲ反応液当たり、アクロモペプチダーゼ
処理の場合は２０μｌ、アクロモペプチダーゼ無処理の
場合は１０μｌである。
【００１５】鋳型ＤＮＡ溶液をすぐに使用しない場合に
は、−２０℃で保存し、使用時には解凍後、１０秒間攪
拌し、１００００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上澄
みをＰＣＲ反応に用いる。
は、−２０℃で保存し、使用時には解凍後、１０秒間攪
拌し、１００００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上澄
みをＰＣＲ反応に用いる。
【００１６】反応液（全量５０μｌ）は、ＴａｑＢｅａ
ｄ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＢｅａ
ｄ(Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１粒、１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ ｗ/ｏ ＭｇＣｌ2（Ｐｒｏｍｅｇａ
社、酵素に添加されているもの）、１.５ｍＭ（１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子検出用プライマーを使用する場合）ある
いは２.５ｍＭ（それ以外のプライマーを使用する場
合）ＭｇＣｌ2、各０.２ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０.２５μＭ（１６
ＳｒＲＮＡ遺伝子検出用プライマーを使用する場合）あ
るいは０.４μＭ（それ以外のプライマーを使用する場
合）の５’プライマーおよび３’プライマー、０.２μ
ｇ/ｍｌのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅＤＮＡから成る。
ｄ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＢｅａ
ｄ(Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１粒、１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ ｗ/ｏ ＭｇＣｌ2（Ｐｒｏｍｅｇａ
社、酵素に添加されているもの）、１.５ｍＭ（１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子検出用プライマーを使用する場合）ある
いは２.５ｍＭ（それ以外のプライマーを使用する場
合）ＭｇＣｌ2、各０.２ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０.２５μＭ（１６
ＳｒＲＮＡ遺伝子検出用プライマーを使用する場合）あ
るいは０.４μＭ（それ以外のプライマーを使用する場
合）の５’プライマーおよび３’プライマー、０.２μ
ｇ/ｍｌのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅＤＮＡから成る。
【００１７】ＰＣＲ反応は、９４℃で３分加熱後、９４
℃で３０秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒のサイク
ルを３６回行い、反応終了後に７２℃で７分加温した。
使用したＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓ
ｔｅｍ ２４００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で
ある。
℃で３０秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒のサイク
ルを３６回行い、反応終了後に７２℃で７分加温した。
使用したＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓ
ｔｅｍ ２４００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で
ある。
【００１８】ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は
以下に示す。 一般細菌用検出用プライマー：対象遺伝子、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ １６ＳｒＤＮＡ、増幅されるＤＮＡのサイズは６０４ｂｐ） ５’プライマー：ＡＡＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＣＧ ＧＧ ３’プライマー：ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ
以下に示す。 一般細菌用検出用プライマー：対象遺伝子、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ １６ＳｒＤＮＡ、増幅されるＤＮＡのサイズは６０４ｂｐ） ５’プライマー：ＡＡＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＣＧ ＧＧ ３’プライマー：ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ
【００１９】 大腸菌群（ｃｏｌｉ ｆｏｒｍ）検出用プライマー：対象遺伝子、β−Ｄ−ｇ ａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子（ｌａｃＺ、２６４ｂｐ） ５’プライマー：ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＣＣ ３’プライマー：ＧＧＴ ＴＴＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＡＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＴＣ Ａ
【００２０】 Ｅ.ｃｏｌｉ検出用プライマー：対象遺伝子、β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄ ａｓｅ遺伝子（ｕｉｄＡ、１４７ｂｐ） ５’プライマー：ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＡＧ ＡＡＡ ＧＣＣ Ｃ ３’プライマー：ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＡＴ Ｔ
【００２１】 Ｓ.ａｕｒｅｕｓ検出用プライマー：対象遺伝子、耐熱性ｎｕｃｌｅａｓｅ遺 伝子（ｎｕｃ、２８０ｂｐ） ５’プライマー：ＧＣＧ ＡＴＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＴＴ ３’プライマー：ＡＧＣ ＣＡＡ ＧＣＣ ＴＴＧ ＡＣＧ ＡＡＣ ＴＡＡ ＡＧＣ
【００２２】 Ｂ.ｃｅｒｅｕｓ検出用プライマー：対象遺伝子、ｐｈｏｓｏｈｐｏｌｉｐａ ｓｅ Ｃ遺伝子（ｃｅｒＡ、３９６ｂｐ） ５’プライマー：ＧＡＧ ＴＴＡ ＧＡＧ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＣ ３’プライマー：ＣＴＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＣＣ
【００２３】Ｓ.ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ検出用プライ
マー：対象遺伝子、エンテロトキシン遺伝子（ｓｔｎ、
２６０ｂｐ）本プライマーは宝酒造（株）製である。
マー：対象遺伝子、エンテロトキシン遺伝子（ｓｔｎ、
２６０ｂｐ）本プライマーは宝酒造（株）製である。
【００２４】 Ｖ.ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ検出用プライマー：対象遺伝子、ｐＲ ７２Ｈ遺伝子（３８７ｂｐ） ５’プライマー：ＴＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＴＧ ＴＴＡ ＡＣＣ ３’プライマー：ＣＧＡ ＡＴＣ ＣＴＴ ＧＡＡ ＣＡＴ ＡＣＧ ＣＡＧ Ｃ
【００２５】次に、増幅産物の検出につき説明する。１
０μｌの反応液に１μｌの１０×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆ
ｆｅｒを加え、２％アガロース・ゲル電気泳導を行う。
１００ｖ３０分電気泳導後、０.５μｇ/ｍｌのエチヂウ
ムブロマイドを含む溶液にゲルを２０分間浸積する。こ
のゲルに紫外線を照射して増幅産物（ＤＮＡ）を可視化
し、写真撮影する。
０μｌの反応液に１μｌの１０×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆ
ｆｅｒを加え、２％アガロース・ゲル電気泳導を行う。
１００ｖ３０分電気泳導後、０.５μｇ/ｍｌのエチヂウ
ムブロマイドを含む溶液にゲルを２０分間浸積する。こ
のゲルに紫外線を照射して増幅産物（ＤＮＡ）を可視化
し、写真撮影する。
【００２６】あるいは、１０μｌの反応液に、１μｌの
１０×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒとジメチルスロホキ
シドで１００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎｓ（ＦＭＣ
ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＳＡ）１μｌを加え、２％
アガロース・ゲル電気泳導を行う。１００ｖ３０分電気
泳導後、このゲルに紫外線を照射して増幅産物（ＤＮ
Ａ）を可視化し、写真撮影する。
１０×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒとジメチルスロホキ
シドで１００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎｓ（ＦＭＣ
ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＳＡ）１μｌを加え、２％
アガロース・ゲル電気泳導を行う。１００ｖ３０分電気
泳導後、このゲルに紫外線を照射して増幅産物（ＤＮ
Ａ）を可視化し、写真撮影する。
【００２７】５種類のグラム陽性菌と１種類のグラム陰
性菌で比較する。図１は、Ｓ.ａｕｒｅｕｓの一夜培養
液（約１×１０9ＣＦＵ/ｍｌ）を１０倍段階希釈し、ア
クロモペプチダーゼ処理と無処理で鋳型ＤＮＡを調製し
た。これを用いてＰＣＲ反応を行い、検出感度を比較し
たもので、図２は、Ｂ.ｃｅｒｅｕｓの一夜培養液（約
２×１０7ＣＦＵ/ｍｌ）、図３は、Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓの一夜培養液（約１×１０8ＣＦＵ/ｍｌ）、図４は、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.の一夜培養液（約
６×１０8ＣＦＵ/ｍｌ）、図５は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｓｐ.の一夜培養液（約１×１０8ＣＦＵ/ｍ
ｌ）、図６は、グラム陰性菌であるＥｃｏｌｉの一夜培
養液（約２×１０9ＣＦＵ/ｍｌ）でそれぞれ行った検出
感度を比較したものである。
性菌で比較する。図１は、Ｓ.ａｕｒｅｕｓの一夜培養
液（約１×１０9ＣＦＵ/ｍｌ）を１０倍段階希釈し、ア
クロモペプチダーゼ処理と無処理で鋳型ＤＮＡを調製し
た。これを用いてＰＣＲ反応を行い、検出感度を比較し
たもので、図２は、Ｂ.ｃｅｒｅｕｓの一夜培養液（約
２×１０7ＣＦＵ/ｍｌ）、図３は、Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓの一夜培養液（約１×１０8ＣＦＵ/ｍｌ）、図４は、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.の一夜培養液（約
６×１０8ＣＦＵ/ｍｌ）、図５は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｓｐ.の一夜培養液（約１×１０8ＣＦＵ/ｍ
ｌ）、図６は、グラム陰性菌であるＥｃｏｌｉの一夜培
養液（約２×１０9ＣＦＵ/ｍｌ）でそれぞれ行った検出
感度を比較したものである。
【００２８】図１（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｎｕｃ
で、アクロモペプチダーゼ無処理のもの、（Ｄ）はｎｕ
ｃで、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図１
中、Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は１×１０0ＣＦＵ、３
は１×１０1ＣＦＵ、４は１×１０2ＣＦＵ、５は１×１
０3ＣＦＵ、Ｍは分子量マーカーである。（Ｃ）と
（Ｄ）の下のパネルはＳＹＢＲグリーンによる染色、他
はエチヂウムブロマイドによる染色である。
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｎｕｃ
で、アクロモペプチダーゼ無処理のもの、（Ｄ）はｎｕ
ｃで、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図１
中、Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は１×１０0ＣＦＵ、３
は１×１０1ＣＦＵ、４は１×１０2ＣＦＵ、５は１×１
０3ＣＦＵ、Ｍは分子量マーカーである。（Ｃ）と
（Ｄ）の下のパネルはＳＹＢＲグリーンによる染色、他
はエチヂウムブロマイドによる染色である。
【００２９】図２（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｃｅｒ
Ａで、アクロモペプチダーゼ無処理のもの、（Ｄ）はｃ
ｅｒＡで、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図
２中、Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は２×１０0ＣＦＵ、
３は２×１０1ＣＦＵ、４は２×１０2ＣＦＵ、Ｍは分子
量マーカーである。エチヂウムブロマイドによる染色で
ある。
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｃｅｒ
Ａで、アクロモペプチダーゼ無処理のもの、（Ｄ）はｃ
ｅｒＡで、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図
２中、Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は２×１０0ＣＦＵ、
３は２×１０1ＣＦＵ、４は２×１０2ＣＦＵ、Ｍは分子
量マーカーである。エチヂウムブロマイドによる染色で
ある。
【００３０】図３（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図３中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は８×１０-1ＣＦＵ、３は８
×１０0ＣＦＵ、４は８×１０1ＣＦＵ、５は８×１０2
ＣＦＵ、Ｍは分子量マーカー。エチヂウムブロマイドに
よる染色である。
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図３中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は８×１０-1ＣＦＵ、３は８
×１０0ＣＦＵ、４は８×１０1ＣＦＵ、５は８×１０2
ＣＦＵ、Ｍは分子量マーカー。エチヂウムブロマイドに
よる染色である。
【００３１】図４（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図４中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は８×１０-1ＣＦＵ、３は８
×１０0ＣＦＵ、４は８×１０1ＣＦＵ、５は８×１０2
ＣＦＵ、Ｍは分子量マーカー。エチヂウムブロマイドに
よる染色である。
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図４中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は８×１０-1ＣＦＵ、３は８
×１０0ＣＦＵ、４は８×１０1ＣＦＵ、５は８×１０2
ＣＦＵ、Ｍは分子量マーカー。エチヂウムブロマイドに
よる染色である。
【００３２】図５（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図５中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は２×１０1ＣＦＵ、３は２
×１０2ＣＦＵ、４は２×１０3ＣＦＵ、Ｍは分子量マー
カーである。エチヂウムブロマイドによる染色である。
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図５中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は２×１０1ＣＦＵ、３は２
×１０2ＣＦＵ、４は２×１０3ＣＦＵ、Ｍは分子量マー
カーである。エチヂウムブロマイドによる染色である。
【００３３】図６（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｌａｃ
Ｚで、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｄ）はｕｉ
ｄＡで、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図６
中、Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は１×１０0ＣＦＵ、３
は１×１０1ＣＦＵ、４は１×１０2ＣＦＵ、Ｍは分子量
マーカー。（Ｃ）と（Ｄ）の下のパネルはＳＹＢＲグリ
ーンによる染色、他はエチヂウムブロマイドによる染色
である。
ペプチダーゼ無処理のもの、（Ｂ）は１６ＳｒＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｌａｃ
Ｚで、アクロモペプチダーゼ処理のもの、（Ｄ）はｕｉ
ｄＡで、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図６
中、Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は１×１０0ＣＦＵ、３
は１×１０1ＣＦＵ、４は１×１０2ＣＦＵ、Ｍは分子量
マーカー。（Ｃ）と（Ｄ）の下のパネルはＳＹＢＲグリ
ーンによる染色、他はエチヂウムブロマイドによる染色
である。
【００３４】アクロモペプチダーゼ処理とキレックスを
併用した調製法により、グラム陽性菌から効率良く鋳型
ＤＮＡを抽出することができ、ＰＣＲにより１０0ある
いはそれ以下のＣＦＵを検出することができる。グラム
陰性菌であるＥ.ｃｏｌｉからはアクロモペプチダーゼ
処理あるいは無処理でほぼ同程度の感度（１０0ＣＦ
Ｕ）が示されているが、アクロモペプチダーゼ処理によ
り感度が低下しない。グラム陰性菌である２種の食中毒
菌について、一夜培養液を１０倍段階希釈し、アクロモ
ペプチダーゼ処理により調製した鋳型ＤＮＡを用いてＰ
ＣＲ反応を行い、検出感度を観た。
併用した調製法により、グラム陽性菌から効率良く鋳型
ＤＮＡを抽出することができ、ＰＣＲにより１０0ある
いはそれ以下のＣＦＵを検出することができる。グラム
陰性菌であるＥ.ｃｏｌｉからはアクロモペプチダーゼ
処理あるいは無処理でほぼ同程度の感度（１０0ＣＦ
Ｕ）が示されているが、アクロモペプチダーゼ処理によ
り感度が低下しない。グラム陰性菌である２種の食中毒
菌について、一夜培養液を１０倍段階希釈し、アクロモ
ペプチダーゼ処理により調製した鋳型ＤＮＡを用いてＰ
ＣＲ反応を行い、検出感度を観た。
【００３５】図７はＳ.ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの一夜
培養液（約２×１０9ＣＦＵ/ｍｌ）、図８はＶ.ｐａｒ
ａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの一夜培養液（約１×１０
8ＣＦＵ/ｍｌ）でそれぞれ行ったものである。グラム陰
性菌食中毒菌であるＳ.ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよび
Ｖ.ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓもアクロモペプ
チダーゼ処理で１０0のＣＦＵを検出することができ
る。
培養液（約２×１０9ＣＦＵ/ｍｌ）、図８はＶ.ｐａｒ
ａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの一夜培養液（約１×１０
8ＣＦＵ/ｍｌ）でそれぞれ行ったものである。グラム陰
性菌食中毒菌であるＳ.ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよび
Ｖ.ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓもアクロモペプ
チダーゼ処理で１０0のＣＦＵを検出することができ
る。
【００３６】図７（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ処理のもの、（Ｂ）はｓｔｎで、アクロモ
ペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｓｔｎで、アクロモ
ペプチダーゼ処理のものを示す。図７中、Ｌａｎｅ１は
陰性対照、２は２×１０0ＣＦＵ、３は２×１０1ＣＦ
Ｕ、４は２×１０2ＣＦＵ、５は２×１０3ＣＦＵ、Ｍは
分子量マーカーである。（Ａ）（Ｃ）はエチヂウムブロ
マイドによる染色で、（Ｂ）はＳＹＢＲグリーンによる
染色である。
ペプチダーゼ処理のもの、（Ｂ）はｓｔｎで、アクロモ
ペプチダーゼ処理のもの、（Ｃ）はｓｔｎで、アクロモ
ペプチダーゼ処理のものを示す。図７中、Ｌａｎｅ１は
陰性対照、２は２×１０0ＣＦＵ、３は２×１０1ＣＦ
Ｕ、４は２×１０2ＣＦＵ、５は２×１０3ＣＦＵ、Ｍは
分子量マーカーである。（Ａ）（Ｃ）はエチヂウムブロ
マイドによる染色で、（Ｂ）はＳＹＢＲグリーンによる
染色である。
【００３７】図８（Ａ）は１６ＳｒＤＮＡで、アクロモ
ペプチダーゼ処理のもの、（Ｂ）はｐＲ７２Ｈ ＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図８中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は１×１０0ＣＦＵ、３は１
×１０1ＣＦＵ、４は１×１０2ＣＦＵ、Ｍは分子量マー
カーである。エチヂウムブロマイドによる染色である。
ペプチダーゼ処理のもの、（Ｂ）はｐＲ７２Ｈ ＤＮＡ
で、アクロモペプチダーゼ処理のものを示す。図８中、
Ｌａｎｅ１は陰性対照、２は１×１０0ＣＦＵ、３は１
×１０1ＣＦＵ、４は１×１０2ＣＦＵ、Ｍは分子量マー
カーである。エチヂウムブロマイドによる染色である。
【００３８】このように、本実施例ではグラム陽性菌、
グラム陰性菌が高感度に検出することができる。つま
り、自然界にはグラム陽性菌とグラム陰性菌とが混在し
ており、この２種類の菌を異なる方法により検出するこ
とは煩雑であるが、一の抽出試料でグラム陽性菌とグラ
ム陰性菌とが検出することができ、非常に便利である。
グラム陰性菌が高感度に検出することができる。つま
り、自然界にはグラム陽性菌とグラム陰性菌とが混在し
ており、この２種類の菌を異なる方法により検出するこ
とは煩雑であるが、一の抽出試料でグラム陽性菌とグラ
ム陰性菌とが検出することができ、非常に便利である。
【００３９】上記説明では、アクロモペプチダーゼ単独
の緩衝液に懸濁した場合につき記載したが、アクロモペ
プチダーゼ緩衝液と他の細菌細胞壁分解酵素との混合緩
衝液に懸濁してもよい。細菌細胞壁分解酵素としては、
例えば、リゾチーム、リゾスタフィン、Ｎ−アセチルム
ラミダーゼ等を使用する。かかる場合であっても、アク
ロモペプチダーゼ単独の緩衝液に懸濁した場合と同様
に、一の抽出試料でグラム陽性菌とグラム陰性菌とが高
感度に検出することができ、非常に便利である。
の緩衝液に懸濁した場合につき記載したが、アクロモペ
プチダーゼ緩衝液と他の細菌細胞壁分解酵素との混合緩
衝液に懸濁してもよい。細菌細胞壁分解酵素としては、
例えば、リゾチーム、リゾスタフィン、Ｎ−アセチルム
ラミダーゼ等を使用する。かかる場合であっても、アク
ロモペプチダーゼ単独の緩衝液に懸濁した場合と同様
に、一の抽出試料でグラム陽性菌とグラム陰性菌とが高
感度に検出することができ、非常に便利である。
【００４０】本願発明にかかる細菌検出方法によれば、
細菌ペレットを、アクロモペプチダーゼ単独の緩衝液あ
るいは他の細菌細胞壁分解酵素との混合緩衝液に懸濁
し、加熱後、キレックス溶液で懸濁し、加熱、攪拌後、
遠心分離し、上澄みをＰＣＲ反応してなるものであるの
で、簡単且つ迅速に高感度で細菌が検出できる。
細菌ペレットを、アクロモペプチダーゼ単独の緩衝液あ
るいは他の細菌細胞壁分解酵素との混合緩衝液に懸濁
し、加熱後、キレックス溶液で懸濁し、加熱、攪拌後、
遠心分離し、上澄みをＰＣＲ反応してなるものであるの
で、簡単且つ迅速に高感度で細菌が検出できる。
【図1】ＰＣＲによるＳ.ａｕｒｅｕｓの１６ＳｒＤＮＡ
及びｎｕｃの電気泳導写真。
及びｎｕｃの電気泳導写真。
【図２】ＰＣＲによるＢ.ｃｅｒｅｕｓの１６ＳｒＤＮ
Ａ及びｃｅｒＡの電気泳導写真。
Ａ及びｃｅｒＡの電気泳導写真。
【図３】ＰＣＲによるＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓの１６Ｓｒ
ＤＮＡの電気泳導写真。
ＤＮＡの電気泳導写真。
【図４】ＰＣＲによるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ.の１６ＳｒＤＮＡの電気泳導写真。
ｐ.の１６ＳｒＤＮＡの電気泳導写真。
【図５】ＰＣＲによるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ.
の１６ＳｒＤＮＡの電気泳導写真。
の１６ＳｒＤＮＡの電気泳導写真。
【図６】ＰＣＲによるＥ.ｃｏｌｉの１６ＳｒＤＮＡ、
ｌａｃＺ及びｕｉｄＡの電気泳導写真。
ｌａｃＺ及びｕｉｄＡの電気泳導写真。
【図７】ＰＣＲによるＳ.ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの１
６ＳｒＤＮＡ及びｓｔｎの電気泳導写真。
６ＳｒＤＮＡ及びｓｔｎの電気泳導写真。
【図８】ＰＣＲによるＶ.ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉ
ｃｕｓの１６ＳｒＤＮＡ及びｐＲ７２Ｈ ＤＮＡの電気
泳導写真。
ｃｕｓの１６ＳｒＤＮＡ及びｐＲ７２Ｈ ＤＮＡの電気
泳導写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 内田 俊生 (56)参考文献 感染症学雑誌，68（10），1203−1210 （1994) 感染症学雑誌，67（２），178（1993) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ
Claims (1)
- 【請求項１】 細菌ペレットを、アクロモペプチダーゼ
単独の緩衝液あるいは他の細菌細胞壁分解酵素との混合
緩衝液に懸濁し、加熱後、キレックス溶液で懸濁し、加
熱、攪拌後、遠心分離し、上澄みをＰＣＲ反応してなる
細菌検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20864799A JP3172917B2 (ja) | 1999-07-23 | 1999-07-23 | 細菌検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20864799A JP3172917B2 (ja) | 1999-07-23 | 1999-07-23 | 細菌検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001029100A JP2001029100A (ja) | 2001-02-06 |
| JP3172917B2 true JP3172917B2 (ja) | 2001-06-04 |
Family
ID=16559721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20864799A Expired - Fee Related JP3172917B2 (ja) | 1999-07-23 | 1999-07-23 | 細菌検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3172917B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8123130B2 (en) | 1998-04-17 | 2012-02-28 | Remote Inc. | Remote ordering device |
| CN102869773A (zh) * | 2010-03-16 | 2013-01-09 | 贝克顿·迪金森公司 | 无色肽酶用于室温下裂解的用途 |
-
1999
- 1999-07-23 JP JP20864799A patent/JP3172917B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 感染症学雑誌，６７（２），１７８（１９９３） |
| 感染症学雑誌，６８（１０），１２０３−１２１０（１９９４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001029100A (ja) | 2001-02-06 |
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| Date | Code | Title | Description |
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| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |