JP3149180B2

JP3149180B2 - 瘢痕治療のためのカルシウム拮抗薬の使用

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Publication number: JP3149180B2
Application number: JP51163690A
Authority: JP
Inventors: リー，ラフアエル・シー
Original assignee: マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー
Priority date: 1989-07-31
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 2001-03-26
Anticipated expiration: 2016-03-26
Also published as: DE69007486D1; EP0485470A1; CA2059558C; WO1991001624A2; WO1991001624A8; JPH05500045A; CA2059558A1; DE69007486T2; EP0485470B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景過形成性瘢痕は、定義において、製造な創傷治癒に必
要以上の大きさに成長する過剰な創傷瘢痕である。過形
成性瘢痕は、数多くの創傷の種類、例えば火傷もしくは
鋭利な切開から生じ得る。ケロイド、即ち過形成性創傷
瘢痕のよりひどい形態は、開始部位の外傷よりも通常先
にある瘢痕の堅い皮膚小節を形成する。これらは、通
常、過形成性瘢痕よりも大きく、そしてそれらがその創
傷に隣接している正常な皮膚をしばしば冒す点で異なっ
ている。

過形成性瘢痕およびケロイドは、細胞、コラーゲンお
よびプロテオグリカンの過生産から生じる［Linares,H.
A.およびLarson,D.L.、Plast.Reconst.surg.、62:589
（1978）;Linares,H.A.Plast.Reconst.Sung.、818−820
（1983）］。組織学的には、これらの外傷は、単軸方向
に配向した細胞外マトリックスおよび細胞から成るラン
ダムに分布した組織の束によって特徴づけられる。この
ような瘢痕では、コラーゲンおよびプロテオグリカンの
過生産および密集［Shetlar,M.R.他、Burns 4:14（197
7）］が細胞増殖を越えている。これらの組織学的観
察、創傷治癒中の細胞外マトリックス合成を調節してい
る正常な制御メカニズムの損失から上記病変が生じるこ
とを示唆している［Shetlar,M.R.他、Burns 4:14（197
7）］過形成性瘢痕およびケロイドのための、存在している
治療法には、外科手術、機械的圧力、ステロイド類、Ｘ
線照射および寒冷療法が含まれる。これらの方法の各々
に関連して数多くの欠点がある。瘢痕組織の外科的除去
は、しばしば不完全であり、そして切開および縫合点に
過形成性瘢痕およびケロイドの進行を生じさせ得る。ス
テロイド治療は予測不可能であり、そしてしばしば、皮
膚の色素脱失を生じさせる。Ｘ線治療は、今日でただ一
つの予測可能な有効治療であるが、しかしながら、癌を
生じさせる可能性のため、これは一般に、推奨もしくは
許容されるものではない。

トリペプチド類、テトラペプチド類およびペンタペプ
チド類から成る組成物がコラーゲンの生合成を抑制する
ことが示され、そしてこれは、コラーゲンの過剰蓄積に
よって引き起こされる病気を治療するために使用され得
る（三菱化成、日本特許番号52083545、1977年７月12
日、および52025768、1977年２月25日）。

最近、過形成性瘢痕の表面上にシラスティック（sila
stic）シートを塗布することに関する効果が研究され、
そして瘢痕組織を収縮させそして柔らげることが示され
た［Ohmori,S.Aesthetic Plastic Surgery 12:95−99
（1988）］。

現在種々の治療が利用できるにも拘らず、過形成性瘢
痕もしくはケロイドを予防するか或は治療するための、
幅広く許容されそして予測可能な効果を示す手段は存在
していない。

発明の要約本発明は、過形成性創傷治癒障害、例えば過形成性瘢
痕およびケロイド、を最小限にするための方法に関す
る。特に、本方法は、この創傷もしくは瘢痕を最小限に
するに充分な時間、過形成性瘢痕部位に有効量のカルシ
ウムチャンネル遮断剤（calcium channel blocking age
nt）（なお、本明細書において「チャンネル」を「経
路」という場合あり。）を投与することから成る。好適
には、このカルシウム経路遮断剤は、ベラパミル、生物
学的適合性を示すコバルト塩、例えば塩化コバルト、そ
してヒドロピリジン化合物、例えばニフェジピン（nife
dipine）、から選択される。このカルシウム経路遮断剤
を、例えばそれを直接瘢痕に注射するか、或はそれを創
傷部位中に局所塗布することによって、創傷部位に投与
する。どちらの場合も、このカルシウム経路遮断剤は、
この薬剤が創傷部位に局在化することを容易にする目的
で、薬学的に許容される賦形剤と一緒に混合することが
できる。全身的な副作用無しに治療的服用量で連続した
治療を与える目的で、この薬剤を徐放カプセルに入れて
もよい。

本発明は更に、線維芽細胞に関するエキソサイト−シ
スを調節および／または抑制するための方法に関する。
本方法は、エキソサイト−シスを減少させるか或はエキ
ソサイト−シスを抑制するに充分な有効濃度のカルシウ
ム経路遮断剤に線維芽細胞を接触させることから成る。

本発明の方法は、ヒトの過形成性創傷治癒障害を最小
限にするために使用できる。本方法はまた他の哺乳動物
を治癒するためにも使用できる。これはまた、過剰な組
織瘢痕形成を予防するためにも使用できる。二者択一的
に、カルシウム経路遮断剤は、現在存在している過形成
性瘢痕に投与して、この瘢痕形成過程を逆転させ、そし
て本質的にその瘢痕組織を消滅させることができる。本
発明はまた、過剰な線維芽細胞生合成に関連した病気、
例えば肝硬変、収縮性心膜炎、手のDuputryen病、足底
線維症、および他の種々の線維腫症、を制御するため、
治療学的に使用できる。

図の簡単な説明図1aは、DMEM/5.5mMのフルクトース中に入れた、線維
芽細胞居住（populated）コラーゲンマトリックス（FPC
M）へのプロリン取り込み率に対するヒドロキシ尿素
（7.9mM）、アンチマイシンＡ（1.0μＭ）およびニフェ
ジピン（100μＭ）の効果に関する図式的表示である。

図1bは、DMEM/5.5mMのフルクトース中に入れた、FPCM
への硫酸塩取り込み率に対するヒドロキシ尿素（7.9m
M）、アンチマイシンＡ（1.0μＭ）およびニフェジピン
（100μＭ）の効果に関する図式的表示である。

図2aおよび2bは、それぞれ、DMEM/5.5mMのグルコース
およびフルクトース中に入れた、FPCMにおけるプロリン
取り込み率に対するベラパミルの用量依存効果に関する
図式的表示である。V1は１μＭのベラパミルを表し、V2
は10μＭのベラパミルを表し、そしてV3は100μＭのベ
ラパミルを表す。

図3aおよび3bは、それぞれ、DMEM/5.5mMのグルコース
およびフルクトース中に入れた、FPCMにおけるグルコサ
ミノグリカン類への硫酸塩取り込み率に対するベラパミ
ルの効果に関する図式的表示である。V1は１μＭのベラ
パミルを表し、V2は10μＭのベラパミルを表し、そして
V3は100μＭのベラパミルを表す。

図４は、暴露時間に対する細胞性蛍光の関数として
の、単層培養のヒト皮膚線維芽細胞におけるエキソサイ
ト−シス率、に関する図式的表示である。線維芽細胞中
の分泌小疱から細胞外間隙へのLuciferイエローCHの放
出が、染料装填後の時間に対する細胞性蛍光によって示
されている。蛍光の損失がエキソサイト−シスを通して
生じる。６時間でこの染料の約55％が分泌される。

図５は、単層培養のヒト皮膚線維芽細胞からのLucife
rイエローCH放出に対するカルシウム拮抗薬ベラパミル
（50μＭ）の効果に関する図式的表示である。エキソサ
イト−シスの遅延が示されている。

発明の詳細な説明カルシウム経路は、流体および電解質、例えばカルシ
ウム、の輸送そして細胞への分泌を容易にする細胞膜の
領域である［Rasmussen,H.、N.E.J.Med.314:1094−1101
（1986）］。これらの経路は、カルシウム経路遮断剤、
カルシウム侵入遮断剤またはカルシウム拮抗薬、として
知られている種類の化合物を用いて遮断できる。この種
類に含まれる化合物は、ベラパミル、塩化コバルト、お
よび他の生物学的に許容されるコバルト塩、並びにヒド
ロピリジン化合物、例えばニフェジピン、である。

本発明は、細胞膜を横切るカルシウムの輸送を遮断す
るカルシウム経路遮断剤が、線維芽細胞におけるエキソ
サイト−シスを抑制し、コラーゲンおよび硫酸化グリコ
サミノグリカン類（GAG）の生合成を遅らせ、そして細
胞外マトリックスのコラーゲン含有量を減少させるため
に用いられ得る、ことを発見したことを基にしている。

エキソサイト−シスは、蛋白質の細胞性分泌を伴う過
程である。分泌中、選別されそして濃縮された蛋白質を
含有している小疱がGolgi装置から離れた後、この細胞
の先端に在る細胞膜に向かって移動し、そこでこれら
は、この細胞膜と融合して、蛋白質をその細胞外間隙に
放出する。この融合および放出過程はエキソサイト−シ
スとして知られており、そしてこれは、細胞外マトリッ
クス巨大分子（例えばグリコサミノグリカン類、コラー
ゲンおよびエラスチン）の分泌における必須段階であ
る。数多くの病気および障害は、過剰な生合成の結果と
して生じる。例えば、過形成性創傷治癒障害は、蛋白質
およびコラーゲンの過分泌によって特徴づけられる。こ
の過生産により、過剰な瘢痕形成もしくはケロイド形成
が生じる。

カルシウム経路遮断剤が線維芽細胞におけるエキソサ
イト−シスを抑制し得ることをここに発見した結果とし
て、本発明は、蛋白質およびグリコサミノグリカン類の
線維芽細胞分泌を減少させることにより、これらの過形
成性創傷治癒障害を、予防するか、最小限にするか、或
は無くさせる目的で使用できる。線維芽細胞分泌は、エ
キソサイト−シスが阻害されると遮断される。同様に、
細胞が過剰な線維芽細胞分泌を受ける他の病気も、本発
明の方法で治療学的に制御され得る。

好適な具体例において、創傷領域を最小限にするに充
分な時間、過形成性創傷部位に有効量のカルシウム経路
遮断剤を投与することによって、過形成性創傷を最小限
にすることができる。適切なカルシウム経路遮断剤に
は、これに限定されるものではないが、ベラパミル、生
物学的に許容されるコバルト塩、例えば塩化コバルト、
並びにヒドロピリジン化合物、例えばニフェジピン、が
含まれる。有効に投与され得るカルシウム経路遮断剤の
量は、使用するカルシウム経路遮断剤の種類に依存して
いる。ベラパミルおよびニフェジピンの有効閾値は、そ
れぞれ約10μＭおよび100μＭである。

ヒドロピリジン化合物、例えばニフェジピンは、水溶
液に比較的不溶である。それらの不溶性のため、処理す
べき障害の位置に応じて、この薬剤を非極性担体に可溶
化することも有利である。カルシウム経路遮断剤は、単
独で創傷部位に投与するか、或はこれらは、創傷部位へ
のそれらの拡散を容易にする目的で、薬学的に許容され
る賦形剤と一緒に混合してもよい。１つの適切な賦形剤
は、生理学的に許容される量のジメチルスルホキサイド
である。カルシウム経路遮断剤はリポソームに取り込ま
せることができる。

カルシウム経路遮断剤は、濃縮し、そしてこの薬剤に
関する代替投与様式（例えば経皮投与）として、徐放ポ
リマーに組み込ませることができる。徐放ポリマー類の
例は、1983年７月５日に発行されたFolkmenおよびLange
rの米国特許番号4,391,727;1975年４月29日に発行され
たYollesの米国特許番号3,880,991;および1975年６月３
日に発行された3,887,699そしてBoswellの米国特許番号
3,773,919（これらの教示事項は引用することにより本
明細書の内容となる）に記述されている。好適には、生
分解性ポリマー類が使用される。

瘢痕形成を最小限にするための、許容できる用量のカ
ルシウム経路遮断剤を投与する方法は、過形成性創傷の
場所そして瘢痕形成の度合に依存している。特に、この
カルシウム経路遮断剤は、単独か或は薬学的に許容され
る賦形剤との組み合わせで、創傷部位の表面に局所的に
投与でき、これをこの創傷部位に注射するか、或はこれ
を徐放ポリマーに組み込んだ後これを処理すべき領域に
外科移植することができる。肝硬変および収縮性心膜炎
の如き障害を治療するには、外科移植が有利である。こ
れにより、患者に副作用を与えるとか、循環系に過剰量
の薬剤を放出させるとか、することなく、このカルシウ
ム経路遮断剤を該障害部位に局在させることが可能にな
る。

本発明の方法を用いて、線維芽細胞のエキソサイト−
シスが調節もしくは阻害され得る。詳細には、エキソサ
イト−シスを所望される度合にまで遅らせるに充分な有
効量のカルシウム経路遮断剤に線維芽細胞を接触させ
る。興味の持たれている線維芽細胞に対する該カルシウ
ム経路遮断剤の接触方法およびこれらの薬剤の有効量は
上述されている。

過形成性創傷治癒障害の治療に加えて、カルシウム経
路遮断剤は、過剰な線維芽細胞生合成によって引き起こ
される病気を治療学的に制御するために使用できる。線
維芽細胞の過生産によって特徴づけられる病気には、肝
硬変、収縮性心膜炎、手のDupuytren病、並びに他の線
維腫症が含まれる。二三の病気を除いてこれらは本発明
の方法を用いて治療できるが、過剰な線維芽細胞生合成
によって特徴づけられるいかなる病気もカルシウム経路
遮断剤を用いて治療できると理解すべきである。

本発明を更に下記の実施例により説明する。

実施例１蛋白質およびGAG分泌に対する試験組織調製単軸に配向した細胞および細胞外マトリックスの連結
組織モデルを、ウシの線維芽細胞、ラット尾腱コラーゲ
ンおよび栄養培地を用いて製造した。Dulbecco修飾Eagl
e培地（DMEM;Gibco、Grand Island、NY）中37℃で４時
間、0.1％ライプIIコラゲナーゼ（Worthington Biochem
ical Inc.、Freehold、NJ）消化を用いた酵素消化によ
り、新しくと殺した２週間歳の子ウシ（Trelegan's Cam
bridge、MA）の大腿から、ウシ筋膜線維芽細胞を収穫し
た。10％のNuSerum（Collaborative Research、Bedfor
d、MA）を補ったDMEMが入っている組織培養皿上に、上
記放出細胞を接種した。この培地を48時間毎に変えた。
これらの細胞を一度継代させた後、直ちに用いるか、或
は50％子ウシ血清/45％DMEM/5％DMSO中、−100℃で冷凍
保存した。冷凍細胞を使用する場合、これらを迅速に解
凍し、３分間、185gの50％血清/50％DMEMカラムを通し
て沈降させた後、カバーガラス上に播いた。細胞付着後
（〜４時間）、この培地を交換した。

天然型Ｉコラーゲンを、ラット尾腱から抽出した後、
Chandrakasan,G他、J.Biol.Chem.251:6062−6067（197
6）の方法の修飾を用いて精製した。詳細には、成熟し
たSprague−Dawleyラットの尾からラット尾の腱を取り
出し、PBSそして蒸留水中で洗浄した。次に、これらを
腱を0.05M（３％）酢酸溶液に、尾当たり200mLの比率で
入れた。この混合物を８℃で96時間撹拌した。

24時間撹拌後、この混合物を、数層のチーズクロスを
通して濾過した後、12000g（Sorval GS−３ローター中9
000rpm）で２時間遠心分離した。上澄み液を沈澱させた
後、数回、冷酸に再溶解することで、非コラーゲン蛋白
質を除去した。このコラーゲン溶液を1/1000v/vクロロ
ホルム中で滅菌した。この操作は、このコラーゲン分子
の天然構造を保持させる。

前記DMEM中の0.2％コラーゲン溶液、20％子ウシ血
清、10mg/mLのゲンタマイシン溶液、5mg/mLのアスコル
ビン酸塩と一緒にウシの線維芽細胞を混合することによ
って、配向させた組織同等物を製造した［McLeod,K.J.
「生理学的に関係した電場による生合成の調節」“Modu
lation of Biosynthesis by Physiologically Relevant
Electric Fields"博士論文、M.I.T.1986］。2cm離して
保持されている２つの無菌多孔質ポリエチレン製合釘が
入っている無菌培養皿に、上記懸濁液を注いだ。99％の
湿度で５％のCO₂の気体が入っている細胞培養保温器中
に、これらの皿を入れた。この懸濁液は37℃でゲル化し
た。

数日間かけて、線維芽細胞を作り直し、そしてその固
定した合釘の回りにコラーゲンゲルを硬化させた。この
得られるところの、配向した線維芽細胞居住コラーゲン
マトリックス（FPCM）が、組織学的にじん帯に類似して
いる構造に相当する組織を形成した。配向した組織同等
物は更に、1989年５月10日出願したR.C.LeeおよびD.Hua
ngの米国特許出願連続番号07/349,855（この教示事項は
引用することにより本明細書の内容となる）中に記述さ
れている。

生合成活性の測定方法蛋白質および硫酸化GAGの放射能標識した前駆体を用
いて、蛋白質およびグリコサミノグリカン（GAG）生合
成を測定した。該FPCMをキャスティングして４日後、こ
のじん帯同等物を入れる培地を、0.5mMのＬ−プロリン
が入っている血清無しのDMEM（Sigma、St.Louis、MO）
に変えた。12時間後、この培地を再び、10μCi/mLのNa₂
³⁵SO₄（NEX−041、New England Nuclear、Boston、M
A）、10μCi/mLのＬ−［５−³H］プロリン（NET−573、
New England Nuclear、Boston、MA）および0.5mMのＬ−
プロリンを補った新鮮な血清無し培地に変えた。これら
のサンプルを、放射能標識した培地に12時間入れた。こ
の放射能標識した硫酸塩をGAGに取り込ませ、そして放
射能標識したプロリンを蛋白質に取り込ませ、このよう
にして、それぞれ、硫酸化GAG合成と蛋白質合成のマー
カーが得られた。DMEMにはプロリンが入っていないた
め、放射能活性が無いプロリンを添加することで、この
培地中で、比較的一定した比放射能を確保した。

生合成に対するカルシウム経路遮断剤の効果蛋白質およびグリコサミノグリカン（GAG）生合成に
対するカルシウム経路遮断剤の効果を、いくつかの条件
下のFPCM中で測定した。5mMのグルコースまたは5mMのフ
ルクトースのどちらかを補ったDMEM中で培養したFPCM
で、カルシウム経路遮断剤に対する生合成応答を試験し
た。炭水化物エネルギー源がグルコースである場合の培
養線維芽細胞のエネルギー代謝は主に嫌気性であり、そ
して炭水化物源がフルクトースである場合は主に好気性
であるため［Thilly,W.G.、Mammalian Cell Technolog
y、５章、Butterworth Publushers、Boston、（198
6）］、両方を試験した。しかしながら、インビボの線
維芽細胞は主に好気性解糖によってそれらのエネルギー
を誘導すると考えられている。

カルシウム経路を遮断するために用いた薬剤は、ベラ
パミル、ニフェジピンおよび塩化コバルトである。この
FPCM中の細胞代謝状態を試験するための対照実験を行っ
た。フルクトースまたはグルコース中で培養したFPCMに
関して、生合成に対するアンチマイシンＡ、即ち酸化的
燐酸化を阻害する薬剤、の効果を測定した。

結果エネルギー代謝前に報告［Thilly,W.G.、Mammalian Cell Technolog
y、５章、Butterworth Publushers、Boston、（198
6）］したように、エネルギー基質としてグルコースも
しくはフルクトースを供給した線維芽細胞間の細胞性エ
ネルギー代謝の相違を観察した。細胞外マトリックス蛋
白質へのプロリンの取り込みそして細胞外マトリックス
グリコサミノグリカン類への硫酸塩の取り込みの両方に
対するアンチマイシンＡの効果を、DMEM/5.5mMフルクト
ース中に入れたFPCMで、12時間かけて測定し、そしてこ
れらの結果をそれぞれ図1aおよび1bに示す。グルコース
を供給したFPCMを用いたプロリン取り込みに対して、ア
ンチマイシンＡはほとんど効果を示さなかった。逆に、
アンチマイシンＡは、フルクトースを供給したFPCMで、
この細胞外マトリックスへのプロリン取り込み率を本質
的に減少させた。

蛋白質およびグリコサミノグリカン生合成 DMEM/0.5mMの冷プロリン中に入れたFPCMにおける、蛋
白質およびグリコサミノグリカン生合成率に対する炭水
化物源の効果を試験したとき、グルコースもしくはフル
クトース中の対照FPCM間ではいかなる差異も観察されな
かった（図２）。蛋白質取り込みに対するベラパミルの
用量依存効果が存在していた。しかしながら、カルシウ
ム経路遮断に対する生合成応答は、使用したカルシウム
経路遮断剤の種類、並びにこの炭水化物源がグルコース
であるかフルクトースであるか、に依存していることが
観察された。

グルコースもしくはフルクトースのどちらかが存在し
ている場合、ベラパミルは、細胞外マトリックスへのプ
ロリンの取り込みを遅らせた（図２）。しかしながら、
線維芽細胞は、代謝エネルギー源としてグルコースを用
いた場合明らかに、ベラパミルに対して、より高い感受
性を示した。100μＭ濃度のベラパミルは、グルコース
またはフルクトースのどちらかを供給したFPCM中で、約
50％にまで取り込みを減少させた。100μＭの濃度でさ
えも、ベラパミルは、硫酸化グリコサミノグリカン生合
成に対していかなる有意な効果も示さなかった（図
３）。GAG生合成取り込みに対する効果が不足している
ことにより、このベラパミルは細胞生活能力を低下させ
ないことが示された。

等モル濃度において、ニフェジピンは、ベラパミルよ
りも大きなプロリン取り込み低下をもたらした。ベラパ
ミルと同様、100μＭ濃度のニフェジピンはGAG生合成に
対していかなる効果も示さなかった。

DMEM/5.5mMのグリコースもしくはフルクトースにカル
シウム経路遮断剤を加えた中に入れた線維芽細胞居住コ
ラーゲンマトリックスに関する。プロリンおよび硫酸化
グリコサミノグリカンの取り込り率を表Ｉに示す。50mg
/mLの塩化コバルトは、蛋白質生合成率を低下させそし
て硫酸化グリコサミノグリカンの分泌率を増大させる点
で、ベラパミルの効果に比べて著しい効果を示してい
た。

実施例２エキソサイト−シスに対する試験ヒト線維芽細胞培養ヒト新生児包皮線維芽細胞を、Brigham and Woman's
Hospitalで環状切除した新生児から収穫した。これらの
サンプルを、最初に、抗生物質を補ったDulbecco修飾Ea
gle培地（DMEM）中に入れた後、20分間トリプシン中で
培養して、表面の上皮層を除去した。次に、この組織を
燐酸緩衝食塩水（PBS）溶液中で洗浄した後、180gで５
分間遠心分離して、表皮細胞を分離した。この真皮を細
断した後、これに、0.1％タイプIIコラゲナーゼ（Worth
ington Biochemical Inc.、Freehold、NJ）消化をDMEM
中で４時間受けさせた。この放出細胞を、10％のNuSeru
m（Collaborative Research、Bedford、MA）を補ったDM
EMが入っている組織培養皿上に接種した。この培地を48
時間毎に交換した。これらの細胞を一度継代させた後、
直ちに使用するか、或は50％血清/45％DMSO中、−100℃
で冷凍保存した。冷凍細胞を使用する場合、これらを迅
速に解凍し、３分間、185gの50％血清/50％DMEMカラム
を通して沈降させた後、カバーガラス上に播いた。細胞
付着後（〜４時間）、この培地を交換した。

染料放出の定量液相エキソサイト−シス率がカルシウム経路遮断剤で
調節されるかどうかを測定する目的で、ヒト包皮線維芽
細胞の細胞質中の小疱からの、Luciferイエロー標識し
たデキストラン（LYD、M.W.10,000）（Molecular Probe
s Inc.、Portland、Oregon）の放出速度を用いて、ヒト
線維芽細胞中のエキソサイト−シス率を測定した。血清
無しで、液相の飲作用（エンドサイト−シス）により、
このLYDを細胞に装填した。この染料の細胞内位置およ
び輸送を、ビデオ画像分析を用いて、制御および実験条
件下で監視した。

短期間の1xトリプシンおよびエチレンジアミンテトラ
酢酸（EDTA）消化により、単層からP₂−P₅線維芽細胞を
収穫し、カバーガラス上に播いた後、50％の融合性を示
すようにさせた。細胞を播いたカバーガラス（CLCS）
を、標準条件下で12時間、5mg/mLのLuciferイエローCH
デキストラン（LYD）を補ったDMEMに入れた。次に、こ
のCLCSを37℃のPBS中で５回洗浄して細胞外LYDを除去し
た後、60mmの無菌細胞培養皿に入れた。これらの皿に、
ベラパミル（10μＭ）を補うか、或は薬剤無し（対照）
の、血清が入っていない37℃のDMEMを入れた。これらの
皿を、５％CO₂の気体が入っている培養器に戻した。
０、２、４および６時間後、これらの皿の各々から２つ
のCLCSを取り出した。これらを即座に、８℃の中性緩衝
ホルマリン中に浸漬し、20分間固定した後、このCLCSを
顕微鏡用ガラス製スライド上に置いた。ここに置いた溶
液は、50％のグリセロール、NaFフェニルアミンジアミ
ンであった。

分析すべき各々の細胞を、見える範囲内の中心位置に
置いた。フィルターをかけた100ワットの水銀アークラ
ンプ照明により、該LY蛍光を励起させた。460〜485nmの
帯を通過させる干渉フィルターを用いて、この励起をフ
ィルターにかけた。4x対物レンズを用いてこの発光を集
めた後、515nmのバリヤーフィルターを通過させた。こ
の発光を、チャルニコン（chalnicon）チューブが備わ
ったビデオカメラヘッドで記録し、デジタル化した後、
VaxStation IIコンピューター制御下のHamamatsuビデオ
画像プロセッサーを用いて保存した。この細胞の境界が
正確に位相差で同定できるように、位相照明下でこの操
作を繰り返した。マニュアルに従って選択した背景領域
中、平均背景ピクセル強度以下の２つの標準偏差以上の
強度値を有するピクセルを同定することにより、ソフト
ウエアプログラムがこの細胞の境界を満つけ出した。

細胞質中の平均強度を定量する目的で、この細胞中の
ピクセル値（P_i）を含むこの全体画像から、この平均背
景値（B_m）を差し引いた。この背景強度は励起強度の尺
度として使用できるため、この細胞の境界内の正味ピク
セル値をB_mに対して正規化した。その後、この正規化し
たピクセル値を合計し、そしてその合計値を、この細胞
の面積（Ａ）に対して正規化した。この結果を、次のよ
うにこの細胞の強度I_cで表した： I_c＝Σ_ｉ（P_i−B_m）/B_mA これらの50個の細胞（同時に取り出した２つのカバー
ガラスから各々25個）の各々に関してI_cを測定した。次
に、この標準偏差および平均値を計算した。各々の時点
（２、４および６時間）で、２つのカバーガラスに関す
る平均をプロットした。各々の時点の実験および対照の
両方に対して、この方法を行った。

結果エキソサイト−シス単層培養におけるヒト皮膚線維芽細胞において、観察
の６時間に渡りおおよそ一定比率でエキソサイト−シス
が進行することが観察された（図４）。Luciferイエロ
ーデキストランのエキソサイト−シス率は血漿膜カルシ
ウム経路機能に対して敏感であることが見いだされた。
ベラパミル（10μＭ）およびニフェジピン（100μＭ）
の両方共、これらの細胞において６時間に渡りエキソサ
イト−シスを有意に遅らせることが見いだされた（図５
および表IIおよびIII）。これらの結果は明らかに、ヒ
ト線維芽細胞におけるエキソサイト−シスが調節され得
ることを示している。図５中、対照は黒丸で表されてお
り、そしてベラパミルは四角で表されている。表IIおよ
びIIIは、カルシウム経路遮断剤、即ちそれぞれベラパ
ミル（50μＭ）およびニフェジピン（１μＭ）で、ヒト
皮膚線維芽細胞におけるエキソサイト−シスの遅延を示
している。

同等物常規以下の実験を用いて、本分野の技術者は、ここに
詳細に記述した本発明の特定具体例に対する数多くの同
等物を認識するか或は確かめることができるであろう。
上記同等物を以下に示す請求の範囲内に包含させること
を意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 17/02 17/02 43/00 43/00 １０５１０５ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 45/00 A61K 31/277 A61K 31/44 A61K 33/24 A61P 1/16 A61P 9/00 A61P 17/02 A61P 43/00 A61P 43/00 105 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】カルシウムチャンネル遮断剤を有効成分と
して含有する過形成性創傷を最小限にするか或は本質的
に減少させるための製薬学的組成物。
【請求項２】カルシウムチャンネル遮断剤を有効成分と
して含有する線維腫症を治療するための製薬学的組成
物。
【請求項３】該カルシウムチャンネル遮断剤がベラパミ
ル、ニフェジピン、および生物学的に許容されるコバル
ト塩、から成る群から選択される請求項１または請求項
２記載の組成物。
【請求項４】該カルシウムチャンネル遮断剤を組み込ん
だ徐放ポリマーから成る請求項１および請求項２記載の
組成物。