JP3124655B2 - 超好熱性古細菌由来α−アミラーゼ - Google Patents
超好熱性古細菌由来α−アミラーゼInfo
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はα−アミラーゼ、特に超
好熱性古細菌由来の純品の形でのα−アミラーゼに関す
る。本発明または超好熱性α−アミラーゼの精製方法に
関する。
好熱性古細菌由来の純品の形でのα−アミラーゼに関す
る。本発明または超好熱性α−アミラーゼの精製方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】超好熱性古細菌が発見されたことによっ
て、商業用および研究用の貴重な手段が提供されてい
る。これらの供給源から単離された酵素がもっている固
有の熱安定性は好熱菌特有の成分なしで維持されている
が、このことは分子の安定性が好熱菌中の中温細菌に見
られるのと同じ立体化学的相互作用によって増大される
ことを示唆している。超好熱性の酵素に見られる特徴的
な活性領域は成長温度に一致する傾向があり、好熱菌中
の中温細菌にとって最適温度では活性がほとんどないか
全くない。
て、商業用および研究用の貴重な手段が提供されてい
る。これらの供給源から単離された酵素がもっている固
有の熱安定性は好熱菌特有の成分なしで維持されている
が、このことは分子の安定性が好熱菌中の中温細菌に見
られるのと同じ立体化学的相互作用によって増大される
ことを示唆している。超好熱性の酵素に見られる特徴的
な活性領域は成長温度に一致する傾向があり、好熱菌中
の中温細菌にとって最適温度では活性がほとんどないか
全くない。
【０００３】α−アミラーゼは工業上重要なので広く研
究されている対象である。α−アミラーゼは、中温菌
（ Takagi ら、Bacterial and Mold Amylases The
Enzymes、ニューヨーク、Academic Perss 社、１９７
１年）；中等度好熱菌（Antranikian , Applied Bio
chemistry and Biotechnology、２０／２１巻 ２６
７〜２７９頁、１９８９年； Glymph ら、Applied and
Environmental Microbiology 、３４（４）巻、３９
１頁、１９７７年； Hasegawa ら、J. Biochem.、７９
巻、３５〜４２頁、１９７６年）；および超好熱性菌
（ Koch ら、Arch.Microbiol.、１５５巻、５７２〜５
７８頁、１９９１年； Schumann ら、FEBSLetters 、２
８２（１）巻、１２２〜１２６頁、１９９１年）という
熱に対して安定な領域にある様々な種から精製されてい
る。
究されている対象である。α−アミラーゼは、中温菌
（ Takagi ら、Bacterial and Mold Amylases The
Enzymes、ニューヨーク、Academic Perss 社、１９７
１年）；中等度好熱菌（Antranikian , Applied Bio
chemistry and Biotechnology、２０／２１巻 ２６
７〜２７９頁、１９８９年； Glymph ら、Applied and
Environmental Microbiology 、３４（４）巻、３９
１頁、１９７７年； Hasegawa ら、J. Biochem.、７９
巻、３５〜４２頁、１９７６年）；および超好熱性菌
（ Koch ら、Arch.Microbiol.、１５５巻、５７２〜５
７８頁、１９９１年； Schumann ら、FEBSLetters 、２
８２（１）巻、１２２〜１２６頁、１９９１年）という
熱に対して安定な領域にある様々な種から精製されてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ピロコッカス・フリオ
サス（Pyrococcus furiosus）は、最適成長温度が１０
０℃の嫌気性海洋従属栄養細菌であり、Fiala とStette
r がイタリーのVulcanoIsland の沖合の硫気孔の泥から
単離したものである（Fiala ら、Arch. Microbiol. 、
１４５巻、５６〜６１頁、１９８６年）。ピロコッカス
・フリオサスの細胞ホモジネートと増殖培地中にα−ア
ミラーゼの活性が存在することが報告されている（Brow
n ら、Applied and Environmental Microbiology 、
５６（７）巻、１９８５〜１９９１頁、１９９０年； K
och ら、FEMS MicrobiologyLetters 、７１巻、２１〜
２６頁、１９９０年）。これらのα−アミラーゼの活性
の至適ｐＨは前者では５．６付近に、後者では４．５に
存在しているが、これのらの酵素の精製については報告
されていない。
サス（Pyrococcus furiosus）は、最適成長温度が１０
０℃の嫌気性海洋従属栄養細菌であり、Fiala とStette
r がイタリーのVulcanoIsland の沖合の硫気孔の泥から
単離したものである（Fiala ら、Arch. Microbiol. 、
１４５巻、５６〜６１頁、１９８６年）。ピロコッカス
・フリオサスの細胞ホモジネートと増殖培地中にα−ア
ミラーゼの活性が存在することが報告されている（Brow
n ら、Applied and Environmental Microbiology 、
５６（７）巻、１９８５〜１９９１頁、１９９０年； K
och ら、FEMS MicrobiologyLetters 、７１巻、２１〜
２６頁、１９９０年）。これらのα−アミラーゼの活性
の至適ｐＨは前者では５．６付近に、後者では４．５に
存在しているが、これのらの酵素の精製については報告
されていない。
【０００５】本発明は、精製された形態のピロコッカス
・フリオサス由来のα−アミラーゼおよびその精製方法
を提供するものである。
・フリオサス由来のα−アミラーゼおよびその精製方法
を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の全般的な目的
は、純品の形態の超好熱性α−アミラーゼを提供するこ
とである。具体的に述べれば、本発明は純品の形態のピ
ロコッカス・フリオサス由来のα−アミラーゼ、および
同アミラーゼを含有する組成物を提供するものである。
また本発明は、超好熱性α−アミラーゼの精製方法を提
供するものである。本発明のその他の目的と利点は以下
の説明から明らかになるであろう。
は、純品の形態の超好熱性α−アミラーゼを提供するこ
とである。具体的に述べれば、本発明は純品の形態のピ
ロコッカス・フリオサス由来のα−アミラーゼ、および
同アミラーゼを含有する組成物を提供するものである。
また本発明は、超好熱性α−アミラーゼの精製方法を提
供するものである。本発明のその他の目的と利点は以下
の説明から明らかになるであろう。
【０００７】本発明は、古細菌由来の超好熱性α−アミ
ラーゼを精製する方法、および純品の形態の上記α−ア
ミラーゼ、特にピロコッカス・フリオサス由来のα−ア
ミラーゼに関する。
ラーゼを精製する方法、および純品の形態の上記α−ア
ミラーゼ、特にピロコッカス・フリオサス由来のα−ア
ミラーゼに関する。
【０００８】本発明のα−アミラーゼは、酵素の活性を
得るのに必要な温度より低い温度では基質との有意な結
合が起らない点で、従来報告されている超好熱性α−ア
ミラーゼとは異なっている（一方、本発明のα−アミラ
ーゼは、約１００℃で最高の活性を示し、活性の開始は
約４０℃で観察され、活性の実質的喪失は１２０℃で観
察された）。また本発明のα−アミラーゼは、低重合度
の基質を認識する性質を示すという点でも独特なもので
ある。基質特異性を測定した結果は、マルトトリオース
と同程度に短いグルコース多量体が基質としての働きを
なすことができることを示している。
得るのに必要な温度より低い温度では基質との有意な結
合が起らない点で、従来報告されている超好熱性α−ア
ミラーゼとは異なっている（一方、本発明のα−アミラ
ーゼは、約１００℃で最高の活性を示し、活性の開始は
約４０℃で観察され、活性の実質的喪失は１２０℃で観
察された）。また本発明のα−アミラーゼは、低重合度
の基質を認識する性質を示すという点でも独特なもので
ある。基質特異性を測定した結果は、マルトトリオース
と同程度に短いグルコース多量体が基質としての働きを
なすことができることを示している。
【０００９】好ましい実施態様において、本発明のα−
アミラーゼは図１２乃至図１４に示すアミノ酸配列を有
するピロコッカス・フリオサス由来のα−アミラーゼで
ある。また本発明は、ピロコッカス・フリオサス由来の
α−アミラーゼの単サブユニットに関する。
アミラーゼは図１２乃至図１４に示すアミノ酸配列を有
するピロコッカス・フリオサス由来のα−アミラーゼで
ある。また本発明は、ピロコッカス・フリオサス由来の
α−アミラーゼの単サブユニットに関する。
【００１０】本発明のα−アミラーゼは、実施的に純品
の形態、すなわち通常付随するタンパク質および核酸を
実質的に含有しない形態で存在することができる。好ま
しい実施態様では、本発明のα−アミラーゼの純度は、
等電点電気泳動法で単一のバンドがみとめられ、かつ分
析用超遠心分離法で単一の分子量が測定可能なような純
度である。
の形態、すなわち通常付随するタンパク質および核酸を
実質的に含有しない形態で存在することができる。好ま
しい実施態様では、本発明のα−アミラーゼの純度は、
等電点電気泳動法で単一のバンドがみとめられ、かつ分
析用超遠心分離法で単一の分子量が測定可能なような純
度である。
【００１１】本発明のα−アミラーゼを精製するのに用
いられる方法の第一工程は、粗製の超好熱性古細菌細胞
の抽出物を製造することである。次にその抽出物のサイ
トソル画分（ Cytosolic fraction )をイオン交換クロ
マトグラフィーにかけ、次に電気溶出法に付す。イオン
交換クロマトグラフィーは、５〜１１のｐＨ領域にわた
って安定なアニオン交換樹脂を用いて実施できる。本発
明の方法によれば配列決定が可能な純度でα−アミラー
ゼが得られる。
いられる方法の第一工程は、粗製の超好熱性古細菌細胞
の抽出物を製造することである。次にその抽出物のサイ
トソル画分（ Cytosolic fraction )をイオン交換クロ
マトグラフィーにかけ、次に電気溶出法に付す。イオン
交換クロマトグラフィーは、５〜１１のｐＨ領域にわた
って安定なアニオン交換樹脂を用いて実施できる。本発
明の方法によれば配列決定が可能な純度でα−アミラー
ゼが得られる。
【００１２】本発明の精製α−アミラーゼにはいくつか
の工業的用途がある。各種の重合度を有するグルコポリ
マーは、製紙、布地製造、醸造および醗酵に利用されて
いる。これらのセッティングに精製された酵素を使え
ば、タンパク質製剤の使用量を少なくすることができる
であろう。添加する必要があるタンパク質の全量を減ら
すことは、安全面からみて著しく有利である。
の工業的用途がある。各種の重合度を有するグルコポリ
マーは、製紙、布地製造、醸造および醗酵に利用されて
いる。これらのセッティングに精製された酵素を使え
ば、タンパク質製剤の使用量を少なくすることができる
であろう。添加する必要があるタンパク質の全量を減ら
すことは、安全面からみて著しく有利である。
【００１３】エンド形のα−１，４グルコシド結合の加
水分解反応は液化反応として工業上知られている。高粘
度と物質移動の問題のために、工業的液化反応は可能な
最高温度で実施される。本発明のα−アミラーゼは耐熱
性なので、この酵素は耐熱性によって極めて高温におい
て一層効率的な加水分解反応がなされるという点で、工
業的液化反応に用いるのに理想的に適した酵素になる。
水分解反応は液化反応として工業上知られている。高粘
度と物質移動の問題のために、工業的液化反応は可能な
最高温度で実施される。本発明のα−アミラーゼは耐熱
性なので、この酵素は耐熱性によって極めて高温におい
て一層効率的な加水分解反応がなされるという点で、工
業的液化反応に用いるのに理想的に適した酵素になる。
【００１４】本発明の精製されたα−アミラーゼは、用
途によって処方することができるし、または精製粉末と
してバルク形で製造することができる。充填剤（例えば
スクロース、マンニトールまたはアルギニン）を上記粉
末に含有させてもよい。あるいは、α−アミラーゼに、
イオン強度が例えば５０ｍＭの中性緩衝剤を配合しても
よい。
途によって処方することができるし、または精製粉末と
してバルク形で製造することができる。充填剤（例えば
スクロース、マンニトールまたはアルギニン）を上記粉
末に含有させてもよい。あるいは、α−アミラーゼに、
イオン強度が例えば５０ｍＭの中性緩衝剤を配合しても
よい。
【００１５】以下の実施例によって、本発明のいくつか
の態様をより詳細に説明するが、これは本発明を限定す
るものではない。下記の実施例には、本発明のα−アミ
ラーゼに対するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の製造は含まれていないが、当業者であれば、こ
のような抗体またはその結合フラグメントは当該技術分
野で公知の方法を用いて製造できることは理解されるは
ずであろう。
の態様をより詳細に説明するが、これは本発明を限定す
るものではない。下記の実施例には、本発明のα−アミ
ラーゼに対するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の製造は含まれていないが、当業者であれば、こ
のような抗体またはその結合フラグメントは当該技術分
野で公知の方法を用いて製造できることは理解されるは
ずであろう。
【００１６】
【実施例】以下に、実験の詳細を、次のような具体的実
施例で説明する。
施例で説明する。
【００１７】菌株と培養条件 本明細書に記載の試験に用いたピロコッカス・フリオサ
スのすべての培養に、DSM ３６３８の菌株を用いたが、
これは当初ドイツ連邦共和国のDeutsch Sammlung von
Mikroorganismen Braunschweig から入手した。この
細菌は、Blumentalsらがすでに報告している培地（ Blu
mentals ら、Applied and Environmental Microbio
logy、５６（７）巻、１９９２〜１９９８頁、１９９０
年）を改変した複合培地の０．３％のトリプトン、０．
７％の酵母エキスおよび０．１％の可溶性ジャガイモデ
ンプンを補充した人工海水で構成された複合培地で増殖
させた。培地をつくり、２リットル瓶に入れ、次いでオ
ートクレーブ処理を行った。滅菌後、前記の補充した塩
に加えて、元素硫黄と亜硫酸ナトリウムをそれぞれ１５
６ｍＭと２ｍＭ添加した。９０℃より低い温度に冷却す
る前に、上記培地を窒素でパージし、予め培養した増殖
培養物からの接種物の１％容積を添加し、その瓶を密封
した。この培養物を、９８℃で恒温オーブン中１６時間
インキュベートし、続いて収穫した。各インキュベーシ
ョンに用いた増殖培地の一般的容積は２０リットルであ
ったが細胞収量は０．７〜１．０ｇ／ｌ（含水重量）で
あった。
スのすべての培養に、DSM ３６３８の菌株を用いたが、
これは当初ドイツ連邦共和国のDeutsch Sammlung von
Mikroorganismen Braunschweig から入手した。この
細菌は、Blumentalsらがすでに報告している培地（ Blu
mentals ら、Applied and Environmental Microbio
logy、５６（７）巻、１９９２〜１９９８頁、１９９０
年）を改変した複合培地の０．３％のトリプトン、０．
７％の酵母エキスおよび０．１％の可溶性ジャガイモデ
ンプンを補充した人工海水で構成された複合培地で増殖
させた。培地をつくり、２リットル瓶に入れ、次いでオ
ートクレーブ処理を行った。滅菌後、前記の補充した塩
に加えて、元素硫黄と亜硫酸ナトリウムをそれぞれ１５
６ｍＭと２ｍＭ添加した。９０℃より低い温度に冷却す
る前に、上記培地を窒素でパージし、予め培養した増殖
培養物からの接種物の１％容積を添加し、その瓶を密封
した。この培養物を、９８℃で恒温オーブン中１６時間
インキュベートし、続いて収穫した。各インキュベーシ
ョンに用いた増殖培地の一般的容積は２０リットルであ
ったが細胞収量は０．７〜１．０ｇ／ｌ（含水重量）で
あった。
【００１８】標準の酵素活性検定法 α−アミラーゼのデキストリン化活性を、Manning and
Campbellの検定法（Manning ら、J. Biological Ch
em. 、２３６（１１）巻、２９５２〜２９５７頁、１９
６１年）の改変法を用いて測定した。２０μｌの試料に
２０μｌの１％可溶性デンプンと２０μｌの１００ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。対
照は、酵素溶液の代わりに、等容積の適切な緩衝液を使
って製造した。試料を９２℃で１０分間インキュベート
し、次いで氷水中で冷却することによって反応を停止さ
せた。１５μl のヨウ素溶液（４％ＫＩ、１．２５％
Ｉ）を添加して発色させた。各試料にさらに蒸留水１ｍ
ｌを添加して試料の色を薄めて測定可能な範囲にした。
試料の吸光度を、Pharmacia 社のLB Ultraspec IIISp
ectrophotometer を用いて６００ｎｍの波長光で読取っ
た。α−アミラーゼの活性の１単位は、１分間当り１ｍ
ｇのデンプンを加水分解するタンパク質の量と定義し
た。
Campbellの検定法（Manning ら、J. Biological Ch
em. 、２３６（１１）巻、２９５２〜２９５７頁、１９
６１年）の改変法を用いて測定した。２０μｌの試料に
２０μｌの１％可溶性デンプンと２０μｌの１００ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。対
照は、酵素溶液の代わりに、等容積の適切な緩衝液を使
って製造した。試料を９２℃で１０分間インキュベート
し、次いで氷水中で冷却することによって反応を停止さ
せた。１５μl のヨウ素溶液（４％ＫＩ、１．２５％
Ｉ）を添加して発色させた。各試料にさらに蒸留水１ｍ
ｌを添加して試料の色を薄めて測定可能な範囲にした。
試料の吸光度を、Pharmacia 社のLB Ultraspec IIISp
ectrophotometer を用いて６００ｎｍの波長光で読取っ
た。α−アミラーゼの活性の１単位は、１分間当り１ｍ
ｇのデンプンを加水分解するタンパク質の量と定義し
た。
【００１９】SDS −PAGE 変性条件下の電気泳動を、予め作製した８〜２５％勾配
ゲル（ロット番号ＱＫ１２８９２）とSDS 緩衝溶離剤
（ロット番号ＱＬ１３０９０）を使い、Pharmacia Pha
st Systemで実施した。分離は、該システムのマニュア
ルに記載されているPhast System Separations Tec
hnique File No. １１０に詳細に述べられている最適
プログラムを用いて行った。
ゲル（ロット番号ＱＫ１２８９２）とSDS 緩衝溶離剤
（ロット番号ＱＬ１３０９０）を使い、Pharmacia Pha
st Systemで実施した。分離は、該システムのマニュア
ルに記載されているPhast System Separations Tec
hnique File No. １１０に詳細に述べられている最適
プログラムを用いて行った。
【００２０】未変性−PAGE SDS を使用せずにLaemmli の方法（Laemmli , Nature、
２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年）にしたがっ
て未変性ゲル電気泳動を実施した。ポリアクリルアミド
ゲルは、４％濃縮用ゲル含有の８％アクリルアミドで構
成され、厚みは０．７５ｍｍで作製した。ゲルは、ブロ
ムフェノールブルーの追跡用色素がゲルの底部に到達す
るまで、２５ｍＡの一定電流でBio −Rad Mini −prot
ean II装置で泳動を行わせた。
２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年）にしたがっ
て未変性ゲル電気泳動を実施した。ポリアクリルアミド
ゲルは、４％濃縮用ゲル含有の８％アクリルアミドで構
成され、厚みは０．７５ｍｍで作製した。ゲルは、ブロ
ムフェノールブルーの追跡用色素がゲルの底部に到達す
るまで、２５ｍＡの一定電流でBio −Rad Mini −prot
ean II装置で泳動を行わせた。
【００２１】クーマシーブルーで染色するため、０．１
％クーマーシーブルー、Ｒ−２５０、５０％メタノー
ル、１０％酢酸の溶液中に３０分間、上記のゲルを浸漬
し、次いで５０％メタノール、１０％酢酸の溶液中で脱
染色を行った。
％クーマーシーブルー、Ｒ−２５０、５０％メタノー
ル、１０％酢酸の溶液中に３０分間、上記のゲルを浸漬
し、次いで５０％メタノール、１０％酢酸の溶液中で脱
染色を行った。
【００２２】ゲルを、Morrissey の方法（Morrissey ，
Anal. Biochem.、１１７巻、３０７〜３１０頁、１９８
１年）の改変法を用いて銀染色を行った。得られたゲル
を、５０％メタノール、１０％酢酸の溶液中で３０分
間、次に１０％メタノール、１０％酢酸の溶液中で３０
分間プレフィックスを行った。すすぎを行わずに、ゲル
を０．５mg／mlジチオトレイトール中に５分間浸漬し次
に蒸留水中で１分間すすいだ。次に硝酸銀の０．５％溶
液を添加し、ゲルを１５分間浸漬した。次にゲルを水中
で１回迅速にすすぎ、次いで顕色液（３７％ホルムアル
デヒド１００μｌを含有する２５０ｍｌの２．５％炭酸
ナトリウム溶液）中で１回迅速にすすぎ、次いで所望の
レベルの染色が得られるまで顕色液中ですすいだ。反応
を５％酢酸溶液で停止させ、その酢酸溶液中にゲルを保
管した。
Anal. Biochem.、１１７巻、３０７〜３１０頁、１９８
１年）の改変法を用いて銀染色を行った。得られたゲル
を、５０％メタノール、１０％酢酸の溶液中で３０分
間、次に１０％メタノール、１０％酢酸の溶液中で３０
分間プレフィックスを行った。すすぎを行わずに、ゲル
を０．５mg／mlジチオトレイトール中に５分間浸漬し次
に蒸留水中で１分間すすいだ。次に硝酸銀の０．５％溶
液を添加し、ゲルを１５分間浸漬した。次にゲルを水中
で１回迅速にすすぎ、次いで顕色液（３７％ホルムアル
デヒド１００μｌを含有する２５０ｍｌの２．５％炭酸
ナトリウム溶液）中で１回迅速にすすぎ、次いで所望の
レベルの染色が得られるまで顕色液中ですすいだ。反応
を５％酢酸溶液で停止させ、その酢酸溶液中にゲルを保
管した。
【００２３】活性染色は、分離ゲルのアクリルアミドマ
トリックス中にデンプンを組込むことによって行った。
上記のゲルを作る場合、ゲルを流延したときの蒸留水の
代わりに０．０５％の可溶性デンプン溶液を使用した。
電気泳動を行ってから好熱性アミラーゼの活性を観察す
るために、ガラス板間に残したスペーサとゲルをサラン
ラップでシールして乾燥を防止した。ガラス板間の上記
ゲルを９８℃で３０分間インキュベートし、次いでヨウ
素溶液で染色した（前記事項参照）。α−アミラーゼを
含有するバンドが、ゲルの青色のバックグランド中に透
明な領域として現われた。この手順に続いて、ゲルをク
ーマシーブルーで染色して、ゲル内のタンパク質を目視
可能にすることができた。
トリックス中にデンプンを組込むことによって行った。
上記のゲルを作る場合、ゲルを流延したときの蒸留水の
代わりに０．０５％の可溶性デンプン溶液を使用した。
電気泳動を行ってから好熱性アミラーゼの活性を観察す
るために、ガラス板間に残したスペーサとゲルをサラン
ラップでシールして乾燥を防止した。ガラス板間の上記
ゲルを９８℃で３０分間インキュベートし、次いでヨウ
素溶液で染色した（前記事項参照）。α−アミラーゼを
含有するバンドが、ゲルの青色のバックグランド中に透
明な領域として現われた。この手順に続いて、ゲルをク
ーマシーブルーで染色して、ゲル内のタンパク質を目視
可能にすることができた。
【００２４】等電点電気泳動 Pharmacia Phast System電気泳動装置を使用して、等
電点電気泳動法によって、等電点を測定した。予め作製
したｐＨ３〜９の等電点電気泳動用ゲル（ロット番号Ｑ
Ｍ１３３０３）を用いた。校正はPharmacia Isoelectr
ic FocusingCalibration Kitを用いて行った。分離
は、上記システムのマニュアルに記載されているPhast
System Separation Technique File No. １００に
記載の最適化法を用いて実施した。
電点電気泳動法によって、等電点を測定した。予め作製
したｐＨ３〜９の等電点電気泳動用ゲル（ロット番号Ｑ
Ｍ１３３０３）を用いた。校正はPharmacia Isoelectr
ic FocusingCalibration Kitを用いて行った。分離
は、上記システムのマニュアルに記載されているPhast
System Separation Technique File No. １００に
記載の最適化法を用いて実施した。
【００２５】ピロコッカス・フリオサス由来のα−アミ
ラーゼの精製 （Ａ）粗抽出物 ７０００Ｘｇで１０分間遠心分離する
ことによって（Beckman ＪＡ１０ローターにて８００
０RPM ）、細胞を増殖培地から収穫した。上澄み液を傾
斜してペレットを収集した。２０リットルの増殖培地か
ら得た細胞を最終容積が１５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に再懸濁し、次にSonifi
er Cell Disrupter を５０％能力で、３分間、間欠的
に用いて音波処理よって破砕した。９５０００Ｘｇで１
時間超遠心分離を行った後（Beckman Ti ４５ローター
で３５０００RPM ）、溶菌液のサイトゾル画分（cytoso
lic fraction ）を収集した。続く精製工程はすべて室
温で実施し、タンパク質の溶液は４℃で保管した。
ラーゼの精製 （Ａ）粗抽出物 ７０００Ｘｇで１０分間遠心分離する
ことによって（Beckman ＪＡ１０ローターにて８００
０RPM ）、細胞を増殖培地から収穫した。上澄み液を傾
斜してペレットを収集した。２０リットルの増殖培地か
ら得た細胞を最終容積が１５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に再懸濁し、次にSonifi
er Cell Disrupter を５０％能力で、３分間、間欠的
に用いて音波処理よって破砕した。９５０００Ｘｇで１
時間超遠心分離を行った後（Beckman Ti ４５ローター
で３５０００RPM ）、溶菌液のサイトゾル画分（cytoso
lic fraction ）を収集した。続く精製工程はすべて室
温で実施し、タンパク質の溶液は４℃で保管した。
【００２６】（Ｂ）イオン交換＃１ 上記のサイトゾル
画分を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
（緩衝液Ａ）で予め平衡化させたＱ−セファロースカラ
ム（直径が１．５ｃｍでベッドの高さが４５．５ｃｍ）
に添加した。これらの条件下で、アミラーゼの活性をカ
ラムに結合させ、次いで１Ｍ NaClを含む５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）（緩衝液Ｂ）を使
い、２００分間、直線勾配液（１００％Ａ液から１００
％Ｂ液まで）で溶離した。画分を集め、アミラーゼが入
っている管を活性で固定してプールした。
画分を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）
（緩衝液Ａ）で予め平衡化させたＱ−セファロースカラ
ム（直径が１．５ｃｍでベッドの高さが４５．５ｃｍ）
に添加した。これらの条件下で、アミラーゼの活性をカ
ラムに結合させ、次いで１Ｍ NaClを含む５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）（緩衝液Ｂ）を使
い、２００分間、直線勾配液（１００％Ａ液から１００
％Ｂ液まで）で溶離した。画分を集め、アミラーゼが入
っている管を活性で固定してプールした。
【００２７】（Ｃ）イオン交換＃２ プールした試料を
同容積の緩衝液Ａで希釈し、次に、緩衝液Ａ８５％と緩
衝液Ｂ１５％の混合液で再度平衡化したカラムに再び添
加した。前記緩衝液を用い、１９５分間、直線勾配液で
（８５％Ａ、１５％Ｂから４０％Ａ、６０％Ｂまで）試
料を溶離した。得られた画分を活性に基づいて再びプー
ルし、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３）
（緩衝液Ａ′）に対して一夜透析した。
同容積の緩衝液Ａで希釈し、次に、緩衝液Ａ８５％と緩
衝液Ｂ１５％の混合液で再度平衡化したカラムに再び添
加した。前記緩衝液を用い、１９５分間、直線勾配液で
（８５％Ａ、１５％Ｂから４０％Ａ、６０％Ｂまで）試
料を溶離した。得られた画分を活性に基づいて再びプー
ルし、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３）
（緩衝液Ａ′）に対して一夜透析した。
【００２８】（Ｄ）イオン交換＃３ 上記の透析試料
を、緩衝液Ａ′で予め平衡化したＱ−セファロース（Ph
armacia 社）カラム（直径が１．５ｃｍでベッドの高さ
が４６．５ｃｍ）に添加し、１Ｍ NaClを含む５０ｍＭ
炭酸ナトリウム（ｐＨ５．５）（緩衝液Ｂ′）を用い、
２００分間、直線勾配液（１００％Ａ′から１００％
Ｂ′まで）で溶離した。アミラーゼ活性を有する画分を
集めてプールした。次に活性プールを３０２０Ｘｇ（ S
orvall SS３４ローターで５０００RPM ）で、Centrico
n ３０マイクロコンセントレーターを２０分間隔で用
い、全容積が２ｍｌより小さくなるまで濃縮した。
を、緩衝液Ａ′で予め平衡化したＱ−セファロース（Ph
armacia 社）カラム（直径が１．５ｃｍでベッドの高さ
が４６．５ｃｍ）に添加し、１Ｍ NaClを含む５０ｍＭ
炭酸ナトリウム（ｐＨ５．５）（緩衝液Ｂ′）を用い、
２００分間、直線勾配液（１００％Ａ′から１００％
Ｂ′まで）で溶離した。アミラーゼ活性を有する画分を
集めてプールした。次に活性プールを３０２０Ｘｇ（ S
orvall SS３４ローターで５０００RPM ）で、Centrico
n ３０マイクロコンセントレーターを２０分間隔で用
い、全容積が２ｍｌより小さくなるまで濃縮した。
【００２９】（Ｅ）電気溶出法 精製は、Bio −Rad m
odel ４９１ Prep Cellを用い未変性PAGEから電気溶
出することによって完了した。高さが６ｃｍの８％アク
リルアミドゲルと、前記したのと同様にして作った１ｃ
ｍの４％濃縮ゲルとが入っている内径が２８ｍｍのゲル
管を用いて装置を組立てた。冷却緩衝液の流量は１００
ｍｌ／分に維持したが連続溶離流量は約１ｍｌ／分であ
った。試料を２Ｘ未変性試料緩衝液で作製し、２．５ｍ
ｌ以下の容積で負荷した。電気泳動は４０ｍＶの一定電
流で行い、画分は２．５分間隔で収集した。タンパク質
の溶離は、Ｉsc o 流動吸光度検出器を２８０ｎｍで用い
て監視し、ゲル由来のタンパク質バンドの溶離で集めた
特定の画分の関連づけを行った。アミラーゼを含有する
画分を活性で検出し、次いで銀染色を行った未変性PAGE
を用いて純度についてスクリーニングした。活性画分
は、銀染色法の分離レベル内で純品であることを示した
ものを最終製品としてプールした。
odel ４９１ Prep Cellを用い未変性PAGEから電気溶
出することによって完了した。高さが６ｃｍの８％アク
リルアミドゲルと、前記したのと同様にして作った１ｃ
ｍの４％濃縮ゲルとが入っている内径が２８ｍｍのゲル
管を用いて装置を組立てた。冷却緩衝液の流量は１００
ｍｌ／分に維持したが連続溶離流量は約１ｍｌ／分であ
った。試料を２Ｘ未変性試料緩衝液で作製し、２．５ｍ
ｌ以下の容積で負荷した。電気泳動は４０ｍＶの一定電
流で行い、画分は２．５分間隔で収集した。タンパク質
の溶離は、Ｉsc o 流動吸光度検出器を２８０ｎｍで用い
て監視し、ゲル由来のタンパク質バンドの溶離で集めた
特定の画分の関連づけを行った。アミラーゼを含有する
画分を活性で検出し、次いで銀染色を行った未変性PAGE
を用いて純度についてスクリーニングした。活性画分
は、銀染色法の分離レベル内で純品であることを示した
ものを最終製品としてプールした。
【００３０】タンパク質の量子化 タンパク質の濃度を、メーカーの説明書にしたがい、標
準としてBSA を用いて、Bio −Rad 微量タンパク質測定
検定法で測定した。上記の方法で得た濃度のデータを用
い、吸光係数を２５４と２８０で計算した結果、それぞ
れ０．８８３と１．７１７の値を得た。
準としてBSA を用いて、Bio −Rad 微量タンパク質測定
検定法で測定した。上記の方法で得た濃度のデータを用
い、吸光係数を２５４と２８０で計算した結果、それぞ
れ０．８８３と１．７１７の値を得た。
【００３１】サイズ排除クロマトグラフィー 種々の条件下での精製酵素の見掛けの分子量は、Pharma
cia FPLC を用いて予め校正したSuperose１２のカラム
で測定した。タンパク質は、所望の種々の条件を与える
ために適切な緩衝液に対して透析し、０．５ｍｌ／分で
１ｍｌの容積にした。
cia FPLC を用いて予め校正したSuperose１２のカラム
で測定した。タンパク質は、所望の種々の条件を与える
ために適切な緩衝液に対して透析し、０．５ｍｌ／分で
１ｍｌの容積にした。
【００３２】２価カチオンのキレート化と、遊離Ｃａ++
の濃度の測定 電気溶出緩衝液中に精製ピロコッカス・フリオサス由来
のα−アミラーゼを３５μmg／mlを含有する溶液を、Bi
o −Rad Chelex ０．２５ｍｍイオン交換膜シリンジフ
ィルターを通過させることによって２価カチオンで劣化
させた。濾過試料の遊離Ｃａ++の濃度をGrynkiewicz ）
らの方法（Grynkiewicz ら、J. Chromatog.、１０５
巻、３８８〜３９０頁、１９８５年）にしたがって、fu
ra−２の蛍光によって測定した。金属イオン実験のため
に使用した試料中の遊離Ｃａ++の濃度を測定するため、
緩衝液のＫD は２００ｎＭで測定し、Rmaxは１mM Ca++
で測定しRminは５ｍＭ EGTA で測定した。
の濃度の測定 電気溶出緩衝液中に精製ピロコッカス・フリオサス由来
のα−アミラーゼを３５μmg／mlを含有する溶液を、Bi
o −Rad Chelex ０．２５ｍｍイオン交換膜シリンジフ
ィルターを通過させることによって２価カチオンで劣化
させた。濾過試料の遊離Ｃａ++の濃度をGrynkiewicz ）
らの方法（Grynkiewicz ら、J. Chromatog.、１０５
巻、３８８〜３９０頁、１９８５年）にしたがって、fu
ra−２の蛍光によって測定した。金属イオン実験のため
に使用した試料中の遊離Ｃａ++の濃度を測定するため、
緩衝液のＫD は２００ｎＭで測定し、Rmaxは１mM Ca++
で測定しRminは５ｍＭ EGTA で測定した。
【００３３】基質の結合性 基質の酵素結合性は、溶解しているタンパク質の不溶性
デンプンへの吸着によって定量した。５０ｍｇのデンプ
ンを精製したα−アミラーゼの１８０μg ／ml溶液の２
２０μｌ中に懸濁させ、所望の温度で１５分間インキュ
ベートした。基質を微量遠心分離機で遠心分離を行うこ
とによって沈降させ、上澄み液の活性を対照の値と比較
して捕捉されたタンパク質の量を測定した。
デンプンへの吸着によって定量した。５０ｍｇのデンプ
ンを精製したα−アミラーゼの１８０μg ／ml溶液の２
２０μｌ中に懸濁させ、所望の温度で１５分間インキュ
ベートした。基質を微量遠心分離機で遠心分離を行うこ
とによって沈降させ、上澄み液の活性を対照の値と比較
して捕捉されたタンパク質の量を測定した。
【００３４】基質特異性 酵素の基質特異性を３５０μg /ml の濃度の精製アミラ
ーゼを用い、前記の標準活性検定法で試験した。種々の
長さのデンプンなどの多糖類を酵素とともにインキュベ
ートして、基質として作用できる最小のグルコポリマー
の連鎖長と、切断による最終生成物を測定した。インキ
ュベーションは９２℃で１５分間行った。加水分解反応
のパターンを Hansen の方法（Hansen , J. Chromato
g.、１０５巻、３８８〜３９０頁、１９７５年）を用い
て薄層クロマトグラフィーで調べた。
ーゼを用い、前記の標準活性検定法で試験した。種々の
長さのデンプンなどの多糖類を酵素とともにインキュベ
ートして、基質として作用できる最小のグルコポリマー
の連鎖長と、切断による最終生成物を測定した。インキ
ュベーションは９２℃で１５分間行った。加水分解反応
のパターンを Hansen の方法（Hansen , J. Chromato
g.、１０５巻、３８８〜３９０頁、１９７５年）を用い
て薄層クロマトグラフィーで調べた。
【００３５】分析用超遠心分離 分析用超遠心分離は、Beckman Instruments Model E
分析用超遠心分離器を１２ビットMetrabyte DAS−８ア
ナログ／ディジタルボードによって収集コンピューター
にインタフェースされた走査形吸着光学装置とともに用
いて行った。走査は迅速走査モードで実施したが、走査
に要する１８秒間に９００００のデータが収集された。
これらのデータは１００のグループに均分し、その実際
のデータ密度は、遠心分離器のセルの半径の１ｃｍ当
り、これら均分した点について４２５であった（Lewis
）、Cambridge , Royal Society of Chemistry 、
１９９２年）。最初のデータ変換とデータ編集は、この
目的にために特に書込まれたソフトフエアを用いて達成
することができる。さらに、非線形最小二乗法による曲
線のあてはめ法を用い数学的モデリングによる編集とデ
ータ分析を収集コンピュータで作動するMLAB（Civilize
d Software ）社、米国、メリーランド州、ベテスダ）
を用いて行った。
分析用超遠心分離器を１２ビットMetrabyte DAS−８ア
ナログ／ディジタルボードによって収集コンピューター
にインタフェースされた走査形吸着光学装置とともに用
いて行った。走査は迅速走査モードで実施したが、走査
に要する１８秒間に９００００のデータが収集された。
これらのデータは１００のグループに均分し、その実際
のデータ密度は、遠心分離器のセルの半径の１ｃｍ当
り、これら均分した点について４２５であった（Lewis
）、Cambridge , Royal Society of Chemistry 、
１９９２年）。最初のデータ変換とデータ編集は、この
目的にために特に書込まれたソフトフエアを用いて達成
することができる。さらに、非線形最小二乗法による曲
線のあてはめ法を用い数学的モデリングによる編集とデ
ータ分析を収集コンピュータで作動するMLAB（Civilize
d Software ）社、米国、メリーランド州、ベテスダ）
を用いて行った。
【００３６】水素交換 非放射能が１mC/ml のトリチウム化水の原液をNew Eng
land Nuclear 社（米国、マサチューセッツ州、ボスト
ン）から入手した。５０μｌのトリチウム原液を５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）中１００μg/ml
の濃度で精製α−アミラーゼを含有する溶液の１００μ
ｌに添加した。試料を微量遠心分離管中に入れ、２４℃
と９５℃でインキュベートした。２時間と２４時間の時
点で、タンパク質をサイズ排除法でトリチウム化水から
分離した。この操作は、メーカーの推奨する条件下で、
使い捨てNAP −５カラム（Pharmacia 社）を使って実施
した。タンパク質からの水素交換の速度を測定するため
に、前記のようにしてサイズ排除法を実施してから、
０．５ｍｌのタンパク質を２時間、２４℃または９５℃
でインキュベートし、サイズ排除法を繰返した。試料
は、タンパク質への交換速度を分析する場合、空隙容積
で作製したが、タンパク質からの交換速度を分析する場
合は、空隙容積と封入容積の両方で作製した。適切な試
料を作るために、５０μｌの試料を３ｍｌのOpti−Fluo
r 液体シンチレーション流体（Packard Instrument C
o.）に添加した。計数は、LKB １２１２ Rackbeta Liq
uid Scintillation Counter 中で１分間隔で行った。
land Nuclear 社（米国、マサチューセッツ州、ボスト
ン）から入手した。５０μｌのトリチウム原液を５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）中１００μg/ml
の濃度で精製α−アミラーゼを含有する溶液の１００μ
ｌに添加した。試料を微量遠心分離管中に入れ、２４℃
と９５℃でインキュベートした。２時間と２４時間の時
点で、タンパク質をサイズ排除法でトリチウム化水から
分離した。この操作は、メーカーの推奨する条件下で、
使い捨てNAP −５カラム（Pharmacia 社）を使って実施
した。タンパク質からの水素交換の速度を測定するため
に、前記のようにしてサイズ排除法を実施してから、
０．５ｍｌのタンパク質を２時間、２４℃または９５℃
でインキュベートし、サイズ排除法を繰返した。試料
は、タンパク質への交換速度を分析する場合、空隙容積
で作製したが、タンパク質からの交換速度を分析する場
合は、空隙容積と封入容積の両方で作製した。適切な試
料を作るために、５０μｌの試料を３ｍｌのOpti−Fluo
r 液体シンチレーション流体（Packard Instrument C
o.）に添加した。計数は、LKB １２１２ Rackbeta Liq
uid Scintillation Counter 中で１分間隔で行った。
【００３７】４次微分ＵＶ分光側光 ４次微分ＵＶ分光スペクトルを熱ジャケットステージ付
きのBeckman DU−７０分光光度計を使用して得た。吸
光度は２４０ｎｍから３５０ｎｍまで０．５ｎｍごとに
読取った。４次微分値はΔλ＝１２で数学的に計算し、
結果は０．０１から−０．０１までの吸光度の単位の尺
度で解釈した。スペクトル作製に使用した試料は、５０
ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．０）中３５０μg/mlの精製
アミラーゼを含有していた。
きのBeckman DU−７０分光光度計を使用して得た。吸
光度は２４０ｎｍから３５０ｎｍまで０．５ｎｍごとに
読取った。４次微分値はΔλ＝１２で数学的に計算し、
結果は０．０１から−０．０１までの吸光度の単位の尺
度で解釈した。スペクトル作製に使用した試料は、５０
ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．０）中３５０μg/mlの精製
アミラーゼを含有していた。
【００３８】蛍光分光 蛍光強度と蛍光発光スペクトルに対する温度の影響をSL
M ８０００分光蛍光計で記録した。用いた励起波長は２
９０ｎｍで、蛍光強度は３５０ｎｍで測定した。バンド
の波長は８ｎｍであった。利用した試料は４次微分値を
測定したときに使用したのと同一であった。
M ８０００分光蛍光計で記録した。用いた励起波長は２
９０ｎｍで、蛍光強度は３５０ｎｍで測定した。バンド
の波長は８ｎｍであった。利用した試料は４次微分値を
測定したときに使用したのと同一であった。
【００３９】アミノ酸の分析 タンパク質の試料を０．１％フェノールを含有し常に沸
騰しているHCl （No.２４３０９、Pierce Chemical C
o. ）中、１１０℃で２４時間加水分解した。アミノ酸
は、３．９×３００ｍｍ Pico−Tag TM カラム（No.
１０９５０Waters , Division of Millipore）に対し
てWaters HPLC装置とPico−Tag 誘導体化を用いて分析
した。ポストカラム検出をModel ４４０ Waters dete
ctorで２５４ｎｍにて行った。システィンの含量は、過
ギ酸による酸化とシスティン酸の定量とによって測定し
た。精製酵素を１００μｌの８８％ギ酸溶液に溶解し０
℃まで冷却した。この試料に、１００μｌの過ギ酸試薬
（１０ｍｌのギ酸＋１ｍｌの新しい３０％H2O2＋０．１
ｍｌの９０％フェノール水溶液；室温で１時間静置し０
℃まで冷却する）を添加した。氷上で１時間インキュベ
ートした後、加水分解反応を前記のようにして完了させ
た。
騰しているHCl （No.２４３０９、Pierce Chemical C
o. ）中、１１０℃で２４時間加水分解した。アミノ酸
は、３．９×３００ｍｍ Pico−Tag TM カラム（No.
１０９５０Waters , Division of Millipore）に対し
てWaters HPLC装置とPico−Tag 誘導体化を用いて分析
した。ポストカラム検出をModel ４４０ Waters dete
ctorで２５４ｎｍにて行った。システィンの含量は、過
ギ酸による酸化とシスティン酸の定量とによって測定し
た。精製酵素を１００μｌの８８％ギ酸溶液に溶解し０
℃まで冷却した。この試料に、１００μｌの過ギ酸試薬
（１０ｍｌのギ酸＋１ｍｌの新しい３０％H2O2＋０．１
ｍｌの９０％フェノール水溶液；室温で１時間静置し０
℃まで冷却する）を添加した。氷上で１時間インキュベ
ートした後、加水分解反応を前記のようにして完了させ
た。
【００４０】タンパク質配列の分析 精製された酵素を臭化シアンで消化し、次いで還元しピ
リジルエチル化した後、Stone らの方法の改変法（Ston
e ら、Academic Press 社、米国ニューヨーク、３３〜
４７頁、１９８９年）を用い、トリプシンで消化した。
得られたフラグメントをDionex Al−４５０ BioLc sy
sytem を利用し、Aquapore RP−３００逆相小径カラム
（０．２ｃｍ×２５ｃｍ）上で、０．１％（ｖ／ｖ）の
トリフルオロ酢酸（TFA ）含有の１００％水から０．１
％（ｖ／ｖ）のTFA を含有する７０％アセトニトリルま
での勾配溶離法で分離した。アミノ酸配列分析は、標準
プログラム＃１を用い、Porton Instruments Model２
０２０オフラインシークエンサーで行った。PTH アミノ
酸分析は、改変酢酸ナトリウム勾配プログラムとlett−
Packard 小径Ｃ−１８カラムを用い、Beckman Gold s
ystem で実施した。
リジルエチル化した後、Stone らの方法の改変法（Ston
e ら、Academic Press 社、米国ニューヨーク、３３〜
４７頁、１９８９年）を用い、トリプシンで消化した。
得られたフラグメントをDionex Al−４５０ BioLc sy
sytem を利用し、Aquapore RP−３００逆相小径カラム
（０．２ｃｍ×２５ｃｍ）上で、０．１％（ｖ／ｖ）の
トリフルオロ酢酸（TFA ）含有の１００％水から０．１
％（ｖ／ｖ）のTFA を含有する７０％アセトニトリルま
での勾配溶離法で分離した。アミノ酸配列分析は、標準
プログラム＃１を用い、Porton Instruments Model２
０２０オフラインシークエンサーで行った。PTH アミノ
酸分析は、改変酢酸ナトリウム勾配プログラムとlett−
Packard 小径Ｃ−１８カラムを用い、Beckman Gold s
ystem で実施した。
【００４１】緩衝液のｐＨに対する温度の影響 使用した緩衝液のｐＨは、それぞれの測定に利用した温
度で正確さについて校正した。
度で正確さについて校正した。
【００４２】実施例 １ α−アミラーゼの精製 α−アミラーゼを精製するために、粗製細胞上澄み液を
前記の三つの一連のイオン交換カラムに添加し溶出させ
た。得られるタンパク質の見掛けの分子量と相対純度
は、クーマシー染色法とともに活性染色を用い、精製工
程全体を通じて監視した。第３のイオン交換カラムによ
る処理を終ってから、溶解状態で残っているタンパク質
を未変性PAGE上で分離できるので、電気溶出法は、精製
タンパク質を製造するのに実行可能な方法として選択で
きるようになった。精製工程の要約を表１と図１に示
す。
前記の三つの一連のイオン交換カラムに添加し溶出させ
た。得られるタンパク質の見掛けの分子量と相対純度
は、クーマシー染色法とともに活性染色を用い、精製工
程全体を通じて監視した。第３のイオン交換カラムによ
る処理を終ってから、溶解状態で残っているタンパク質
を未変性PAGE上で分離できるので、電気溶出法は、精製
タンパク質を製造するのに実行可能な方法として選択で
きるようになった。精製工程の要約を表１と図１に示
す。
【００４３】 表１：ピロコッカス・フリオサスからのアミラーゼの精製の概要 工 程 容積 総活性 総タンパク量 比活性 精製倍率 収率 (ml) (U) (mg) (%) 粗抽出物 11.0 35.288 1100.94 0.032 1.0 100 イオン交換#1 40.0 76.000 99.90 0.761 23.8 100 イオン交換#2 42.5 49.717 21.83 2.334 72.9 65 イオン交換#3 15.0 19.758 6.11 3.234 101.1 26 電気溶出 10.0 4.802 0.43 11.299 353.1 6.3
【００４４】本発明の酵素の等電点は、等電点電気泳動
法で測定したが、約ｐＨ４．３であることが分かった
（図１のＢ）。
法で測定したが、約ｐＨ４．３であることが分かった
（図１のＢ）。
【００４５】実施例 ２ 生理化学的特性 本発明による精製された酵素は、１００℃で最高の活性
を示し、約４０℃で活性が始まり、１２０℃で活性は実
質的に失われる。ピロコッカス・フリオサスが増殖する
温度範囲内では、精製されたアミラーゼは最高の８０％
以上のレベルの活性を示す（図２）。最高活性の温度
（１００℃）での活性の熱安定性は、間隔を置いて行っ
た試験を通じて比較的一定であることが分かった（図
３）。最適温度で測定した最適ｐＨは、６．５〜７．５
のｐＨ範囲にあり、ｐＨがどちらの極値に移動しても活
性が急速に低下することが分かった（図４）。
を示し、約４０℃で活性が始まり、１２０℃で活性は実
質的に失われる。ピロコッカス・フリオサスが増殖する
温度範囲内では、精製されたアミラーゼは最高の８０％
以上のレベルの活性を示す（図２）。最高活性の温度
（１００℃）での活性の熱安定性は、間隔を置いて行っ
た試験を通じて比較的一定であることが分かった（図
３）。最適温度で測定した最適ｐＨは、６．５〜７．５
のｐＨ範囲にあり、ｐＨがどちらの極値に移動しても活
性が急速に低下することが分かった（図４）。
【００４６】精製酵素の分子量とサブユニットの組成と
を種々の条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー、分
析用超遠心分離法、および未変性ポリアクリルアミドゲ
ルとSDS −ポリアクリルアミドゲルの両者の電気泳動法
で測定した。７．０〜１０．３のｐＨの範囲内で測定し
た場合、ゲル濾過法で測定したタンパク質の見掛けの分
子量は、１５７±１５kDa であることが分かった。イオ
ン強度を１Ｍまで増大させても、サイズ排除法で測定し
た見掛けの分子量に対して有意な影響はなかった。電気
泳動法による分析結果の要約を図５に示す。未変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法を用いて分析した場合、
見掛けの分子量は、試料を加熱しているにもかかわら
ず、β−アミラーゼ、ウシ血清アルブミンおよびカルボ
ニックアンヒドラーゼの移動度との比較に基づいて１２
９kDa であった。８Ｍの尿素の存在下で電気泳動を行う
と、試料が加熱される場合の変性に関連する分子量のわ
ずかなシフトによって、６６kDa の分子量にシフトす
る。このことは、このタンパク質が、８Ｍの尿素の存在
下で解離する均一な二量体であり、その個々のサブユニ
ットは加熱されるまで完全には変性されないことを示唆
している。SDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を
試料を負荷する前に加熱せずに行うと、未変性条件下で
観察されたのと同じ結果が得られる。試料をSDS の存在
下で加熱した場合、熱分解が観察されたが、その分解の
程度は沸騰時間に依存していた。SDS の存在下でこのよ
うに熱に対して不安定なのは超好熱性古細菌由来の他の
好熱性酵素についてすでに観察されている（Pihl ，J.
Bacteriology、１７３（６）巻、１８３９〜１８４４
頁、１９９１年）のと類似している。
を種々の条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー、分
析用超遠心分離法、および未変性ポリアクリルアミドゲ
ルとSDS −ポリアクリルアミドゲルの両者の電気泳動法
で測定した。７．０〜１０．３のｐＨの範囲内で測定し
た場合、ゲル濾過法で測定したタンパク質の見掛けの分
子量は、１５７±１５kDa であることが分かった。イオ
ン強度を１Ｍまで増大させても、サイズ排除法で測定し
た見掛けの分子量に対して有意な影響はなかった。電気
泳動法による分析結果の要約を図５に示す。未変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法を用いて分析した場合、
見掛けの分子量は、試料を加熱しているにもかかわら
ず、β−アミラーゼ、ウシ血清アルブミンおよびカルボ
ニックアンヒドラーゼの移動度との比較に基づいて１２
９kDa であった。８Ｍの尿素の存在下で電気泳動を行う
と、試料が加熱される場合の変性に関連する分子量のわ
ずかなシフトによって、６６kDa の分子量にシフトす
る。このことは、このタンパク質が、８Ｍの尿素の存在
下で解離する均一な二量体であり、その個々のサブユニ
ットは加熱されるまで完全には変性されないことを示唆
している。SDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を
試料を負荷する前に加熱せずに行うと、未変性条件下で
観察されたのと同じ結果が得られる。試料をSDS の存在
下で加熱した場合、熱分解が観察されたが、その分解の
程度は沸騰時間に依存していた。SDS の存在下でこのよ
うに熱に対して不安定なのは超好熱性古細菌由来の他の
好熱性酵素についてすでに観察されている（Pihl ，J.
Bacteriology、１７３（６）巻、１８３９〜１８４４
頁、１９９１年）のと類似している。
【００４７】２０℃において１００００rpm で超遠心分
離平衡状態が１１３時間で得られることが証明された。
組成の部分の見掛けの比体積の値φ′は、Zamyatnin の
値（Zamyatnin ，Palo Alto ，Annual Reviews ，In
c.１９８４年）を用いてアミノ酸分析のデータから計算
した。溶媒の密度の値ρは、ハンドブックのデータから
計算した。Ｃγ′で示すデータ、すなわち超遠心分離器
セル内の半径方向の位置の関数として、２８０ｎｍの吸
光度で表される濃度は、非線形最小二乗曲線あてはめ法
を用い、単一一量体の熱力学的に理想的な種に対する数
学モデルとしての下記式に対して当てはめた。 Ｃγ＝Ｃb exp（ＡＭ（γ2 −γb 2））＋ｅ ここで、Ｃb はセルの底部γb における濃度；Ｍは分子
量；Ａ＝（１−φ′ρ）Ｗ2 ／２ＲＴ〔この式中Ｗはロ
ーターの角速度（ラジアン／秒）、Ｒはガス定数；およ
びＴは絶対温度〕；ならびにｅはベースライン誤差の補
正項である。当てはめパラメータはＭ，Ｃb およびｅで
ある。
離平衡状態が１１３時間で得られることが証明された。
組成の部分の見掛けの比体積の値φ′は、Zamyatnin の
値（Zamyatnin ，Palo Alto ，Annual Reviews ，In
c.１９８４年）を用いてアミノ酸分析のデータから計算
した。溶媒の密度の値ρは、ハンドブックのデータから
計算した。Ｃγ′で示すデータ、すなわち超遠心分離器
セル内の半径方向の位置の関数として、２８０ｎｍの吸
光度で表される濃度は、非線形最小二乗曲線あてはめ法
を用い、単一一量体の熱力学的に理想的な種に対する数
学モデルとしての下記式に対して当てはめた。 Ｃγ＝Ｃb exp（ＡＭ（γ2 −γb 2））＋ｅ ここで、Ｃb はセルの底部γb における濃度；Ｍは分子
量；Ａ＝（１−φ′ρ）Ｗ2 ／２ＲＴ〔この式中Ｗはロ
ーターの角速度（ラジアン／秒）、Ｒはガス定数；およ
びＴは絶対温度〕；ならびにｅはベースライン誤差の補
正項である。当てはめパラメータはＭ，Ｃb およびｅで
ある。
【００４８】上記の式を数学モデルとして使って加重非
線形最小二乗曲線当てはめ法を行うと、１３０５００と
いう分子量の値が得られた。不均一性または非理想性の
証拠は全くなかった。上記当てはめ法に戻された標準誤
差の推定値、およびブートストラップ法（Efron , Soc.
for Ind. and App. Math.、１９８２年）を用いて
標準誤差を予め検討した結果からみて、誤差の推定値は
恐らく±５５０であろうと考えられる。当てはめの結果
を図６に示す。
線形最小二乗曲線当てはめ法を行うと、１３０５００と
いう分子量の値が得られた。不均一性または非理想性の
証拠は全くなかった。上記当てはめ法に戻された標準誤
差の推定値、およびブートストラップ法（Efron , Soc.
for Ind. and App. Math.、１９８２年）を用いて
標準誤差を予め検討した結果からみて、誤差の推定値は
恐らく±５５０であろうと考えられる。当てはめの結果
を図６に示す。
【００４９】ピロコッカス・フリオサス由来のα−アミ
ラーゼ活性に対する変性剤と金属イオンの影響を測定す
るために、染色未変性PAGE法または生体外の活性検定法
を利用した。試料を５ｍＭ EDTA、２％β−メルカプト
エタノール、または１％SDSの存在下で１５分間加熱し
た、未変性−PAGEによる分析は、EDTAとβ−メルカプト
エタノールはこれらの濃度では活性に対し有意な影響を
与えないが、一方１％SDS によって活性はほとんど完全
に失われることを示した（図７）。これらの結果は、上
記化合物によって妨害が起こるため、標準の活性検定法
を用いて繰返すことができなかった。
ラーゼ活性に対する変性剤と金属イオンの影響を測定す
るために、染色未変性PAGE法または生体外の活性検定法
を利用した。試料を５ｍＭ EDTA、２％β−メルカプト
エタノール、または１％SDSの存在下で１５分間加熱し
た、未変性−PAGEによる分析は、EDTAとβ−メルカプト
エタノールはこれらの濃度では活性に対し有意な影響を
与えないが、一方１％SDS によって活性はほとんど完全
に失われることを示した（図７）。これらの結果は、上
記化合物によって妨害が起こるため、標準の活性検定法
を用いて繰返すことができなかった。
【００５０】変性体の尿素とグアニジン塩酸塩によって
誘発される活性喪失の程度を上記試薬が１Ｍの濃度で存
在している標準活性検定法で測定した。これらの変性剤
の存在下での残留活性は、９８℃にて、尿素とグアニジ
ン塩酸塩に対してそれぞれ８６．５％と７３％であっ
た。
誘発される活性喪失の程度を上記試薬が１Ｍの濃度で存
在している標準活性検定法で測定した。これらの変性剤
の存在下での残留活性は、９８℃にて、尿素とグアニジ
ン塩酸塩に対してそれぞれ８６．５％と７３％であっ
た。
【００５１】アミラーゼの活性に対する遊離のＣａ++な
どの金属イオンの影響を遊離カルシウムなどの二原子価
のカチオンで劣化させた酵素溶液を使って測定した。精
製試料中の遊離カルシウムの測定濃度は１００ｍＭより
低いことが見出された。次に、各種の二価のカチオンの
異なる濃度での存在下で活性測定した。Ｃａ++を除い
て、試験した金属イオンは添加するとすべて酵素を阻害
した（表２）。遊離のカルシウムを添加すると酵素を僅
かに安定化させたが、その程度は試験した濃度範囲を通
じて一定であった。
どの金属イオンの影響を遊離カルシウムなどの二原子価
のカチオンで劣化させた酵素溶液を使って測定した。精
製試料中の遊離カルシウムの測定濃度は１００ｍＭより
低いことが見出された。次に、各種の二価のカチオンの
異なる濃度での存在下で活性測定した。Ｃａ++を除い
て、試験した金属イオンは添加するとすべて酵素を阻害
した（表２）。遊離のカルシウムを添加すると酵素を僅
かに安定化させたが、その程度は試験した濃度範囲を通
じて一定であった。
【００５２】 表 ２ ピロコッカス・フリオサスのアミラーゼの活性％に対する 金属イオンの影響 ──────────────────────────── 金属イオン 濃度（ｍＭ） ０ １ ２ ３ ──────────────────────────── Ｃａ １００ １０８ １０９ １０８ Ｃｏ １００ ４８ ６ ６ Ｃｒ １００ ２７ ０ ０ Ｃｕ １００ ５６ ６ ６ Ｆｅ １００ ７ ０ ０ Ｍｇ １００ ４５ ４６ ４５ Ｚｎ １００ ３９ ３ ３ ──────────────────────────── 活性％は、金属カチオン溶液を上記の最終濃度になるよ
うに添加して、標準の活性検定法を用いて測定し、金属
カチオンは１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて調製した。
うに添加して、標準の活性検定法を用いて測定し、金属
カチオンは１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて調製した。
【００５３】精製アミラーゼが基質を捕捉する性能を酵
素活性の範囲より低いいくつかの温度で評価した不溶性
基質に結合する活性の関数として測定したところ、全酵
素活性の４％より少ない喪失が４℃、２１℃および３７
℃でみとめられた。
素活性の範囲より低いいくつかの温度で評価した不溶性
基質に結合する活性の関数として測定したところ、全酵
素活性の４％より少ない喪失が４℃、２１℃および３７
℃でみとめられた。
【００５４】各種の温度で、標準の活性化検定法を用い
て速度論的実験を行った。ｐＨは、酵素活性が最大にな
る７．０に保持した。ＫｍとVmaxの値を Lineweaver −
Burkのプロットから得て表３に要約した。６５℃と７５
℃でもＫｍについて類似の結果が得られた。温度を９１
℃に上げるとＫｍはほぼ５０％減少した。
て速度論的実験を行った。ｐＨは、酵素活性が最大にな
る７．０に保持した。ＫｍとVmaxの値を Lineweaver −
Burkのプロットから得て表３に要約した。６５℃と７５
℃でもＫｍについて類似の結果が得られた。温度を９１
℃に上げるとＫｍはほぼ５０％減少した。
【００５５】 表 ３ ピロコッカス・フリオサス由来のアミラーゼの 速度論的パラメータの温度依存性 温度（℃） Km（mg/ml ） Vmax(mg/ 分/mg 酵素) ─────────────────────────── ６５ ６．８４ ３４．２４ ７５ ６．８５ ３７．４５ ９１ ３．６９ ２０．００ ───────────────────────────
【００５６】実施例 ３ 基質特異性 精製アミラーゼのデンプンと各種の多糖類に対する作用
を図８に示す。デンプンは、多糖類の混合物に加えてグ
ルコースとマルトースのレベルまで消化されるが、その
多糖類の大部分はマルトテトラオース（Ｇ４）、マルト
ペンタオース（Ｇ５）およびマルトヘキサオース（Ｇ
６）であった。より短い多糖類の存在下では、該酵素は
先に列挙した多糖類（Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６）にとって有利
な平衡依存性生成物の生成を示す。基質としてのマルト
ースに対しては無視できる酵素活性があるだけであり、
少量のマルトテトラオースとマルトヘキサオースの生成
に限られる。本発明のアミラーゼは、Ｇ４、Ｇ５および
Ｇ６の生成に加えて、マルトトリオースを切断してグル
コースとマルトースを生成する。マルトトリオースが得
られたのと類似のパターンが、マルトヘキサオースとマ
ルトヘプタオース（Ｇ７）を基質として用いた場合に得
られた。該酵素はマルトトリオース（Ｇ３）を切断する
ことができるが、最終平衡が逆反応を反映してより長い
多糖類を生成する。
を図８に示す。デンプンは、多糖類の混合物に加えてグ
ルコースとマルトースのレベルまで消化されるが、その
多糖類の大部分はマルトテトラオース（Ｇ４）、マルト
ペンタオース（Ｇ５）およびマルトヘキサオース（Ｇ
６）であった。より短い多糖類の存在下では、該酵素は
先に列挙した多糖類（Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６）にとって有利
な平衡依存性生成物の生成を示す。基質としてのマルト
ースに対しては無視できる酵素活性があるだけであり、
少量のマルトテトラオースとマルトヘキサオースの生成
に限られる。本発明のアミラーゼは、Ｇ４、Ｇ５および
Ｇ６の生成に加えて、マルトトリオースを切断してグル
コースとマルトースを生成する。マルトトリオースが得
られたのと類似のパターンが、マルトヘキサオースとマ
ルトヘプタオース（Ｇ７）を基質として用いた場合に得
られた。該酵素はマルトトリオース（Ｇ３）を切断する
ことができるが、最終平衡が逆反応を反映してより長い
多糖類を生成する。
【００５７】実施例 ４ アミノ酸の組成とタンパク質配列の分析 アミノ酸分析から得た結果は、著しく異なる安定性を有
する他の種の酵素の組成と有意な差を示さなかった〔Ih
ara ら、J. Biochem.、９８巻、９５〜１０３頁、１９
８５年の；Kochら、Arch. Microbiol.，１５５巻、５７
２〜５７８頁、１９９１年；Melasniemi， Biochem.
J. 、２５０巻、８１３〜８１８頁、１９８８年；Yang
ら、Nucleic Acids Res.，１１巻、２３７〜２４９
頁、１９８３年；Yuuki ら、J. Biochem.、９８巻、１
１４７〜１１５６頁、１９８５年〕（表４）。
する他の種の酵素の組成と有意な差を示さなかった〔Ih
ara ら、J. Biochem.、９８巻、９５〜１０３頁、１９
８５年の；Kochら、Arch. Microbiol.，１５５巻、５７
２〜５７８頁、１９９１年；Melasniemi， Biochem.
J. 、２５０巻、８１３〜８１８頁、１９８８年；Yang
ら、Nucleic Acids Res.，１１巻、２３７〜２４９
頁、１９８３年；Yuuki ら、J. Biochem.、９８巻、１
１４７〜１１５６頁、１９８５年〕（表４）。
【００５８】
【表１】
【００５９】精製タンパク質のＮ−末端の配列決定を行
った結果、１８のアミノ酸残基が得られた。すなわちG/
M-D-K-I-N-F-I-F-G-I-H-N-H-Q-P-L-G-N （配列表の配列
番号３）である。消化した後、内部タンパク質の配列の
セグメントを精製した。このフラグメントは、Ｎ末端配
列：T-L-N-D-M-R-Q-E-Y-Y-F-K （配列表の配列番号２）
をもっていた。
った結果、１８のアミノ酸残基が得られた。すなわちG/
M-D-K-I-N-F-I-F-G-I-H-N-H-Q-P-L-G-N （配列表の配列
番号３）である。消化した後、内部タンパク質の配列の
セグメントを精製した。このフラグメントは、Ｎ末端配
列：T-L-N-D-M-R-Q-E-Y-Y-F-K （配列表の配列番号２）
をもっていた。
【００６０】実施例 ５ 水素交換反応 水素交換反応のデータの要約を表５に列挙してある。使
用されるゲル濾過カラムの種類によって、“速い”、
“中間の”、および“遅い”交換速度で取込まれるカウ
ントが、タンパク質によって捕捉される画分に含まれて
いた。未変性のタンパク質は、常温および活性温度の２
４℃と９４℃においてそれぞれ、尿素で変性された試料
で観察されるよりも取込みのレベルがはるかに低いこと
を示した。このことは、未変性タンパク質の折りたたみ
コンホメーション中では交換する水素原子の利用可能性
（availability）が低いことを示している。温度を９４
℃に維持した場合捕捉されるトリチウムが僅かに増加す
るのがみとめられた。アウト交換の速度を常温と９４℃
で分析したところ、この交換は、結局２時間後に完了す
ることが見出された。９４℃において交換されたトリチ
ウムは、次いで常温でアウト交換がなされ、捕捉が全カ
ウントの１３％になった。またこれは、交換可能な水素
の接近し易さが温度に依存して増大することが原因であ
ると考えられる。
用されるゲル濾過カラムの種類によって、“速い”、
“中間の”、および“遅い”交換速度で取込まれるカウ
ントが、タンパク質によって捕捉される画分に含まれて
いた。未変性のタンパク質は、常温および活性温度の２
４℃と９４℃においてそれぞれ、尿素で変性された試料
で観察されるよりも取込みのレベルがはるかに低いこと
を示した。このことは、未変性タンパク質の折りたたみ
コンホメーション中では交換する水素原子の利用可能性
（availability）が低いことを示している。温度を９４
℃に維持した場合捕捉されるトリチウムが僅かに増加す
るのがみとめられた。アウト交換の速度を常温と９４℃
で分析したところ、この交換は、結局２時間後に完了す
ることが見出された。９４℃において交換されたトリチ
ウムは、次いで常温でアウト交換がなされ、捕捉が全カ
ウントの１３％になった。またこれは、交換可能な水素
の接近し易さが温度に依存して増大することが原因であ
ると考えられる。
【００６１】 表 ５ ピロコッカス・フリオサス由来のアミラーゼにおける トリチウムの交換反応 タンパク質への交換 取り込み 取り込み 温度（℃） ２時間(CPM/ml) ２４時間(CPM/ml) ２４ 7526.6 8040 ９４ 9580.0 10360 タンパク質からの交換 タンパク質への タンパク質からの 取り込まれた残留 交換の温度（℃） 交換温度（℃） カウント(CPM/ml) ２４ ２４ １３ ９４ ９４ ０ ９４ ２４ ２００
【００６２】実施例 ６ ４次微分ＵＶ分光側光と固有の蛍光の測定 一連の４次微分スペクトルを２６℃〜８５℃の温度範囲
で作成した。この温度範囲以上になると、徐々に可逆的
な赤移動を起こした。この赤移動は温度依存性であっ
た。この赤移動はその程度がわずかであり、温度の関数
で直線関係にある（図９）。スペクトルのこの変化は、
タンパク質中の構成芳香族アミノ酸による環境の変化で
はなく、溶媒効果であると考えられる。
で作成した。この温度範囲以上になると、徐々に可逆的
な赤移動を起こした。この赤移動は温度依存性であっ
た。この赤移動はその程度がわずかであり、温度の関数
で直線関係にある（図９）。スペクトルのこの変化は、
タンパク質中の構成芳香族アミノ酸による環境の変化で
はなく、溶媒効果であると考えられる。
【００６３】ピロコッカス・フリオサス由来のα−アミ
ラーゼの２０℃での蛍光発光は、３４５ｎＭで最高を示
す。これは、この温度におけるトリプトファンの環境が
比較的極性であることを示している（Teale ），Bioche
m. J.，７６巻、３８１〜３８８頁、１９６０年）。ス
ペクトルを温度範囲にわたって監視していたとき、最大
発光の波長に移動は全くなかった（図１０）。一定の最
大発光が維持されているのは、トリプトファン残基が、
温度に対して無関係な極性環境中に残留していることを
示唆している。蛍光強度は、温度の関数として試験した
ところ、約６５℃において小さな転移を示して徐々に減
少している（図１１）。この転移は、一つ以上のトリプ
トファン残基がより極性の高い環境へわずかに移動した
ことを示している（Inghamら、J. Biol. Chem.、２５
９巻、１１９０１〜１１９０７頁、１９８４年）。蛍光
強度が温度が上昇するにつれてなめらかに減少している
のは、より大きな熱運動のために消光が増大しているこ
とを反映している（Galleyら、Biopolymers Symp.、１
巻、３６７〜３８１頁、１９６４年）。これら固有の蛍
光の特性が同時に起こっていると考えられる場合、酵素
中のトリプトファン残基は極性環境内に保持され、温度
が高くなるとより極性の高い環境にわずかに移動する
が、この移動は最大発光の移動として検出するには不十
分のようである。さきに本願で引用した全文献の内容
は、本願に援用するものとする。当業者は、本願の開示
を読めば、本発明の真の適用範囲から逸脱することな
く、形態と詳細事項に種々の変更を行うことができるこ
とは分かるであろう。
ラーゼの２０℃での蛍光発光は、３４５ｎＭで最高を示
す。これは、この温度におけるトリプトファンの環境が
比較的極性であることを示している（Teale ），Bioche
m. J.，７６巻、３８１〜３８８頁、１９６０年）。ス
ペクトルを温度範囲にわたって監視していたとき、最大
発光の波長に移動は全くなかった（図１０）。一定の最
大発光が維持されているのは、トリプトファン残基が、
温度に対して無関係な極性環境中に残留していることを
示唆している。蛍光強度は、温度の関数として試験した
ところ、約６５℃において小さな転移を示して徐々に減
少している（図１１）。この転移は、一つ以上のトリプ
トファン残基がより極性の高い環境へわずかに移動した
ことを示している（Inghamら、J. Biol. Chem.、２５
９巻、１１９０１〜１１９０７頁、１９８４年）。蛍光
強度が温度が上昇するにつれてなめらかに減少している
のは、より大きな熱運動のために消光が増大しているこ
とを反映している（Galleyら、Biopolymers Symp.、１
巻、３６７〜３８１頁、１９６４年）。これら固有の蛍
光の特性が同時に起こっていると考えられる場合、酵素
中のトリプトファン残基は極性環境内に保持され、温度
が高くなるとより極性の高い環境にわずかに移動する
が、この移動は最大発光の移動として検出するには不十
分のようである。さきに本願で引用した全文献の内容
は、本願に援用するものとする。当業者は、本願の開示
を読めば、本発明の真の適用範囲から逸脱することな
く、形態と詳細事項に種々の変更を行うことができるこ
とは分かるであろう。
配列番号：1 配列の長さ：650 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： Met Gly Asp Lys Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Glu Lys 20 25 30 Cys Tyr Trp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Glu Glu Tyr Pro Asn Met 35 40 45 Lys Val Ala Ile His Thr Ser Gly Pro Leu Ile Glu Trp Leu Gln 50 55 60 Asp Asn Arg Pro Glu Tyr Ile Asp Leu Leu Arg Ser Leu Val Lys 65 70 75 Arg Gly Gln Val Glu Ile Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val 80 85 90 Leu Ala Ser Ile Pro Lys Glu Asp Arg Ile Glu Gln Ile Arg Leu 95 100 105 Met Lys Glu Trp Ala Lys Ser Ile Gly Phe Asp Ala Arg Gly Val 110 115 120 Trp Leu Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro Glu Leu Val Lys Thr Leu 125 130 135 Lys Glu Ser Gly Ile Asp Tyr Val Ile Val Asp Asp Tyr His Phe 140 145 150 Met Ser Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Tyr Trp Pro Tyr Tyr 155 160 165 Thr Glu Asp Gly Gly Glu Val Ile Ala Val Phe Pro Ile Asp Glu 170 175 180 Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Asp Lys Val Leu 185 190 195 Glu Tyr Leu His Ser Leu Ile Asp Gly Asp Glu Ser Lys Val Ala 200 205 210 Val Phe His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Ile Trp Pro Gly Thr 215 220 225 Tyr Glu Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp 230 235 240 Arg Ile Ser Ser Asp Glu Lys Ile Asn Leu Met Leu Tyr Thr Glu 245 250 255 Tyr Leu Glu Lys Tyr Lys Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile 260 265 270 Ala Ser Tyr Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln 275 280 285 Ala Arg Leu Phe Val Glu Phe Val Asn Glu Leu Lys Val Lys Gly 290 295 300 Ile Phe Glu Lys Tyr Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys 305 310 315 Asn Phe Phe Tyr Lys Tyr Pro Glu Ser Asn Tyr Met His Lys Arg 320 325 330 Met Leu Met Val Ser Lys Leu Val Arg Asn Asn Pro Glu Ala Arg 335 340 345 Lys Tyr Leu Leu Arg Ala Gln Cys Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly 350 355 360 Leu Phe Gly Gly Val Tyr Leu Pro His Leu Arg Arg Ala Ile Trp 365 370 375 Asn Asn Leu Ile Lys Ala Asn Ser Tyr Val Ser Leu Gly Lys Val 380 385 390 Ile Arg Asp Ile Asp Tyr Asp Gly Phe Glu Glu Val Leu Ile Glu 395 400 405 Asn Asp Asn Phe Tyr Ala Val Phe Lys Pro Ser Tyr Gly Gly Ser 410 415 420 Leu Val Glu Phe Ser Ser Lys Asn Arg Leu Val Asn Tyr Val Asp 425 430 435 Val Leu Ala Arg Arg Trp Glu His Tyr His Gly Tyr Val Glu Ser 440 445 450 Gln Phe Asp Gly Val Ala Ser Ile His Glu Leu Glu Lys Lys Ile 455 460 465 Pro Asp Glu Ile Arg Lys Glu Val Ala Tyr Asp Lys Tyr Arg Arg 470 475 480 Phe Met Leu Gln Asp His Val Val Pro Leu Gly Thr Thr Leu Glu 485 490 495 Asp Phe Met Phe Ser Arg Gln Gln Glu Ile Gly Glu Phe Pro Arg 500 505 510 Val Pro Tyr Ser Tyr Glu Leu Leu Asp Gly Gly Ile Arg Leu Lys 515 520 525 Arg Glu His Leu Gly Ile Glu Val Glu Lys Thr Val Lys Leu Val 530 535 540 Asn Asp Gly Phe Glu Val Glu Tyr Ile Val Asn Asn Lys Thr Gly 545 550 555 Asn Pro Val Leu Phe Ala Val Glu Leu Asn Val Ala Val Gln Ser 560 565 570 Ile Met Glu Ser Pro Gly Val Leu Arg Gly Lys Glu Ile Val Val 575 580 585 Asp Asp Lys Tyr Ala Val Gly Lys Phe Ala Leu Lys Phe Glu Asp 590 595 600 Glu Met Glu Val Trp Lys Tyr Pro Val Lys Thr Leu Ser Gln Ser 605 610 615 Glu Ser Gly Trp Asp Leu Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr Ile Val 620 625 630 Pro Ile Arg Leu Glu Asp Lys Ile Arg Phe Lys Leu Lys Phe Glu 635 640 645 Glu Ala Ser Gly Xaa 650 配列番号：2 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：3 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Xaa Asp Lys Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro 1 5 10 15 Leu Gly Asn
【図１】ピロコッカス・フリオサス由来のアミラーゼの
精製の電気泳動法による特性結果を示す。図中（Ａ）は
未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８％アクリル
アミド）の写真。レーン１：イオン交換＃１を行った後
の活性画分；レーン２，３および４：それぞれイオン交
換＃２、イオン交換＃３および電気溶出を行った後の活
性画分を示す。（Ｂ）はｐＨが３〜９の勾配を有するPh
ast −System IEF ゲル上の精製アミラーゼの等電点電
気泳動の写真。
精製の電気泳動法による特性結果を示す。図中（Ａ）は
未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８％アクリル
アミド）の写真。レーン１：イオン交換＃１を行った後
の活性画分；レーン２，３および４：それぞれイオン交
換＃２、イオン交換＃３および電気溶出を行った後の活
性画分を示す。（Ｂ）はｐＨが３〜９の勾配を有するPh
ast −System IEF ゲル上の精製アミラーゼの等電点電
気泳動の写真。
【図２】温度のピロコッカス・フリオサス由来のアミラ
ーゼ活性に対する影響を示すグラフである。活性は標準
活性検定法を用いて、異なる温度で検定した。インキュ
ベーションはｐＨ７．０で１０分間行った。
ーゼ活性に対する影響を示すグラフである。活性は標準
活性検定法を用いて、異なる温度で検定した。インキュ
ベーションはｐＨ７．０で１０分間行った。
【図３】該酵素活性の熱安定性を示すグラフである。ア
ミラーゼの試料を１００℃にて各種の時間インキュベー
トし、次に標準の活性検定法を用い、インキュベートし
ない試料と比較して相対活性を測定した。
ミラーゼの試料を１００℃にて各種の時間インキュベー
トし、次に標準の活性検定法を用い、インキュベートし
ない試料と比較して相対活性を測定した。
【図４】該アミラーゼの活性に対するｐＨの影響を示す
グラフである。標準活性検定法を用い、ｐＨを変えて、
相対酵素活性を測定した（ｐＨは適切なｐＨ値に調節し
た１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液を使って維持し
た）。
グラフである。標準活性検定法を用い、ｐＨを変えて、
相対酵素活性を測定した（ｐＨは適切なｐＨ値に調節し
た１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液を使って維持し
た）。
【図５】ピロコッカス・フリオサス由来のアミラーゼの
電気泳動法による特性決定の結果を示す写真。レーン
１：未変性ポリアクリルアミド電気泳動；レーン２と
３：それぞれ試料を加熱した場合と加熱しなかった場合
の８Ｍ尿素の存在下での電気泳動の結果を示す；レーン
４と５：それぞれ試料を加熱した場合と加熱しなかった
場合のSDS ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す。
電気泳動法による特性決定の結果を示す写真。レーン
１：未変性ポリアクリルアミド電気泳動；レーン２と
３：それぞれ試料を加熱した場合と加熱しなかった場合
の８Ｍ尿素の存在下での電気泳動の結果を示す；レーン
４と５：それぞれ試料を加熱した場合と加熱しなかった
場合のSDS ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す。
【図６】５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
中、１０００rpm で２０℃にて１１３時間超遠心分離し
た後の超遠心分離平衡状態にあるα−アミラーゼを示
す。下のパネル：超遠心分離セルの半径方向の位置の関
数としての濃度分布。上のパネル：フィリングラインに
ついての残留物の分布。見掛けの系統偏差は全くなく、
適合性は実に良好である。RMS 誤差の値は、２８０ｎｍ
において２．３４×１０-3吸光度単位である。
中、１０００rpm で２０℃にて１１３時間超遠心分離し
た後の超遠心分離平衡状態にあるα−アミラーゼを示
す。下のパネル：超遠心分離セルの半径方向の位置の関
数としての濃度分布。上のパネル：フィリングラインに
ついての残留物の分布。見掛けの系統偏差は全くなく、
適合性は実に良好である。RMS 誤差の値は、２８０ｎｍ
において２．３４×１０-3吸光度単位である。
【図７】活性染色を行った未変性ポリアクリルアミド電
気泳動に対する変性剤と金属イオンの影響を示す写真。
試料は以下の条件下で１５分間ずつ加熱した。レーン
１：１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０；レーン
２：５ｍＭ EDTA；レーン３：１％SDS ；レーン４：１
２％β−メルカプトエタノール。試料は、０．０２％の
デンプンを含有する未変性ゲル（８％アクリルアミド）
中を泳動させ、次いで実施例に示すようにして染色し
た。
気泳動に対する変性剤と金属イオンの影響を示す写真。
試料は以下の条件下で１５分間ずつ加熱した。レーン
１：１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０；レーン
２：５ｍＭ EDTA；レーン３：１％SDS ；レーン４：１
２％β−メルカプトエタノール。試料は、０．０２％の
デンプンを含有する未変性ゲル（８％アクリルアミド）
中を泳動させ、次いで実施例に示すようにして染色し
た。
【図８】ピロコッカス・フリオサス由来の精製アミラー
ゼの基質特異性を示す写真。基質としてのデンプンおよ
び種々の多糖類との標準活性検定反応によって生成する
生成物を示している。初期の基質濃度は１％（ｗ／ｖ）
であった。９２℃で１５分間インキュベートすることに
よって反応を行った。レーン１と２：基質がデンプン
（それぞれ酵素がない場合とある場合）；レーン３と
４：基質がマルトース；レーン５と６：基質がマルトト
リオース；レーン７と８：マルトヘキサオース；レーン
９と１０：マルトヘプタオース。
ゼの基質特異性を示す写真。基質としてのデンプンおよ
び種々の多糖類との標準活性検定反応によって生成する
生成物を示している。初期の基質濃度は１％（ｗ／ｖ）
であった。９２℃で１５分間インキュベートすることに
よって反応を行った。レーン１と２：基質がデンプン
（それぞれ酵素がない場合とある場合）；レーン３と
４：基質がマルトース；レーン５と６：基質がマルトト
リオース；レーン７と８：マルトヘキサオース；レーン
９と１０：マルトヘプタオース。
【図９】精製アミラーゼの４次微分ＵＶ分光側光分析の
結果を示す。スペクトル獲得のパラメータは実施例に記
載してある。Ａ：８５℃におけるスペクトル；Ｂ：２６
℃におけるスペクトル。
結果を示す。スペクトル獲得のパラメータは実施例に記
載してある。Ａ：８５℃におけるスペクトル；Ｂ：２６
℃におけるスペクトル。
【図１０】精製アミラーゼの固有の蛍光に対する温度の
影響を示す為に各種の温度における発光スペクトルを比
較して示すグラフである。励起波長は２９０ｎｍでバン
ド波長は８ｎｍであった。
影響を示す為に各種の温度における発光スペクトルを比
較して示すグラフである。励起波長は２９０ｎｍでバン
ド波長は８ｎｍであった。
【図１１】温度の関数としての蛍光強度を示すグラフで
ある。２９０ｎｍの励起波長、８ｎｍのバンド幅を有す
る３５０ｎｍの発光。
ある。２９０ｎｍの励起波長、８ｎｍのバンド幅を有す
る３５０ｎｍの発光。
【図１２】ピロコッカス・フリオサス由来のα−アミラ
ーゼのアミノ酸配列の最初の部分を示す。
ーゼのアミノ酸配列の最初の部分を示す。
【図１３】図１２に示した部分に続くアミノ酸配列の部
分を示す。
分を示す。
【図１４】図１３に示した部分に続くアミノ酸配列の部
分を示す。なお、図１２乃至図１４の配列は配列表の配
列番号１として示されているものである。
分を示す。なお、図１２乃至図１４の配列は配列表の配
列番号１として示されているものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ケネス・レーダーマン アメリカ合衆国カリフォルニア州90025、 ウエスト、ロス、アンジェルス、ナンバ ー 215、ベロイト、アヴェニュー 1745 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/90 C12N 1/00 - 1/38 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 図１２乃至図１４に示すアミノ酸配列
（配列表の配列番号１）を有するピロコッカス・フリオ
サス（Pyrococcus furiosus）の精製されたα−アミラ
ーゼ。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
配列中の１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又
は付加のうちの少なくとも一つから生ずるアミノ酸配列
を持つ請求項１記載の精製されたα−アミラーゼであっ
て、前記α−アミラーゼが超好熱性α−アミラーゼ活性
を持つ精製されたα−アミラーゼ。 - 【請求項３】 (i) 約１００℃で至適活性を示し；(ii)
マルトトリオースを加水分解し；(iii) 活性を発するの
に必要な温度より低い温度では有意に基質を捕捉せず；
(iv)等電点が約ｐＨ４．３であり；(v) 超遠心分離平衡
法によって推定される分子量が１３０５００±５５０で
あり；(vi)最適ｐＨが６．５〜７．５である；超好熱性
の精製されたα−アミラーゼ。 - 【請求項４】 超好熱性古細菌由来のα−アミラーゼの
精製方法において、 (i) 前記古細菌の細胞を溶解し、次いで該細胞からのサ
イトソル画分（Cytosolic fraction ）を単離し； (ii)前記α−アミラーゼがイオン交換樹脂に結合する条
件下で、前記画分を該イオン交換樹脂に添加し； (iii) 前記の捕捉されたα−アミラーゼを、前記画分中
に存在する捕捉されない物質から分離し； (iv)前記α−アミラーゼを前記樹脂から溶離し、かくし
て最初の部分的に精製されたα−アミラーゼ調製物を
得、次いで (v) 前記の最初の部分的に精製された調製物中に存在す
るα−アミラーゼを、前記の最初の部分的に精製された
調製物中に存在する他のタンパク質物質から、電気溶出
法で分離し、かくして、精製されたα−アミラーゼを得
る； 諸工程を特徴とする精製方法。 - 【請求項５】 さらに、(iva) 工程(iv)から得られる前
記の最初の部分的に精製された調製物を、前記α−アミ
ラーゼが前記樹脂に結合するような条件下でイオン交換
樹脂に添加し；(ivb) 前記の捕捉されたα−アミラーゼ
を、前記の最初に部分的に精製された調製物中に存在す
る捕捉されない物質から分離し；次いで(ivc) 前記α−
アミラーゼを前記樹脂から溶離し、かくして第２の部分
的に精製されたα−アミラーゼ調製物を得るようにし
た；工程を有する請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記の(iva) 〜(ivc) の工程を工程(v)
の前で繰返す請求項５記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/893,928 US5578479A (en) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | Alpha-amylase from hyperthermophilic archaebacterium |
| US893928 | 1992-06-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662853A JPH0662853A (ja) | 1994-03-08 |
| JP3124655B2 true JP3124655B2 (ja) | 2001-01-15 |
Family
ID=25402355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05163986A Expired - Fee Related JP3124655B2 (ja) | 1992-06-09 | 1993-06-08 | 超好熱性古細菌由来α−アミラーゼ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5578479A (ja) |
| EP (1) | EP0577257B1 (ja) |
| JP (1) | JP3124655B2 (ja) |
| DE (1) | DE69320269T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US6770468B1 (en) | 1999-09-14 | 2004-08-03 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway |
| US6534300B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-03-18 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Methods for producing highly phosphorylated lysosomal hydrolases |
| RS18304A (en) * | 2001-08-27 | 2006-10-27 | Syngenta Participations Ag. | Self processing plants and plant parts |
| US6800472B2 (en) | 2001-12-21 | 2004-10-05 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase |
| US6905856B2 (en) | 2001-12-21 | 2005-06-14 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Soluble GlcNAc phosphotransferase |
| WO2003068948A1 (en) | 2002-02-13 | 2003-08-21 | Dow Global Technologies Inc. | Over-expression of extremozyme genes in pseudomonads and closely related bacteria |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4600693A (en) * | 1984-02-13 | 1986-07-15 | Corning Glass Works | Thermostable alpha amylase having a low requirement for calcium ions, derived from a bacillus microorganism |
| DK141785A (da) * | 1984-04-03 | 1985-10-04 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af high conversion sirupper |
| EP0184019B1 (en) * | 1984-11-09 | 1991-03-06 | Hitachi, Ltd. | Thermostable alpha-amylase-producing, thermophilic anaerobic bacteria, thermostable alpha-amylase and process for producing the same |
| DE3712051A1 (de) * | 1987-04-09 | 1988-10-27 | Antranikian Garabed | Thermostabile amylasen und pullulanasen aus 2 anaeroben mikroorganismen |
| US5188956A (en) * | 1988-07-01 | 1993-02-23 | Showa Denka K.K. | Thermostable amylase |
| DE3909096A1 (de) * | 1989-03-20 | 1990-09-27 | Garabed Antranikian | Alpha-amylase |
| US5366883A (en) * | 1992-06-09 | 1994-11-22 | Takara Shuzo Co., Ltd. | α-amylase gene |
-
1992
- 1992-06-09 US US07/893,928 patent/US5578479A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-05-17 DE DE69320269T patent/DE69320269T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-17 EP EP93303801A patent/EP0577257B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-08 JP JP05163986A patent/JP3124655B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| EP0577257B1 (en) | 1998-08-12 |
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| US5578479A (en) | 1996-11-26 |
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| DE69320269D1 (de) | 1998-09-17 |
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