JP3105494B2 - 蛋白質を安定化するための改良された方法 - Google Patents
蛋白質を安定化するための改良された方法Info
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、凍結もしくは凍結
乾燥の工程において、または低温での保存中に、蛋白質
を安定化するための改良された方法に関する。
乾燥の工程において、または低温での保存中に、蛋白質
を安定化するための改良された方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素または抗体ないしそれらの断片など
の蛋白質は不安定であり、水性溶液中および低温（0℃
未満）での保存時、特に凍結および解凍を反復する工程
において活性消失ならびに／または可溶性もしくは不溶
性の凝集体が形成されやすく、これらの凝集体は粒子を
形成して混濁を生じることによって明らかとなる。しか
し、蛋白質の薬学的組成物にとっては、このような凝集
体および／もしくは粒子形成は認容することができな
い、または少なくとも痕跡量のみである必要がある。薬
学的組成物は清澄な溶液である必要があり、それが凍結
乾燥物として存在する場合には、それを再構成した際に
も、可溶性の蛋白質凝集体を含まない清澄で粒子を含ま
ない溶液として得られる必要がある。
の蛋白質は不安定であり、水性溶液中および低温（0℃
未満）での保存時、特に凍結および解凍を反復する工程
において活性消失ならびに／または可溶性もしくは不溶
性の凝集体が形成されやすく、これらの凝集体は粒子を
形成して混濁を生じることによって明らかとなる。しか
し、蛋白質の薬学的組成物にとっては、このような凝集
体および／もしくは粒子形成は認容することができな
い、または少なくとも痕跡量のみである必要がある。薬
学的組成物は清澄な溶液である必要があり、それが凍結
乾燥物として存在する場合には、それを再構成した際に
も、可溶性の蛋白質凝集体を含まない清澄で粒子を含ま
ない溶液として得られる必要がある。
【０００３】溶液中の蛋白質を安定化するための方法お
よび添加物は数多く知られている。例えば、HSP25など
の熱ショック蛋白質の添加による蛋白質の安定化は、例
えばEP-A 0 599 344に記載されている。ポリオキシプロ
ピレンおよびポリオキシ-エチレンからなるブロックポ
リマー（block polymer）の添加、ならびにリン脂質に
よる抗体の安定化は、EP-A 0 318 081に記載されてい
る。EP-A 0 025 275には、アルギニン、グアニジンまた
はイミダゾールなどの窒素を含む塩基性物質の塩を添加
することによる免疫グロブリンの安定化が記載されてい
る。安定化のためのその他の適した添加物には、ポリエ
ーテル（EP-A 0 018 609）、グリセリン、アルブミンお
よび硫酸デキストラン（米国特許第4,808,705号）、Twe
en(登録商標)20（DE 26 52 636、GB 8514349）などの界
面活性剤、GroEl（Mendoza, J.A. Biotechnol. Tech. 1
0（1991）535〜540）などのシャペロン、クエン酸緩衝
液（国際公開公報第93／22335号）またはキレート剤
（国際公開公報第91／15509号）がある。これらの添加
物は、蛋白質を水性溶液中である程度安定化させること
ができる。しかし、先行技術において知られている方法
には、再解凍中、0℃未満の温度での保存中、または凍
結乾燥後の溶液の再構成時に、可溶性もしくは不溶性の
凝集体がまったく形成されないか、または治療的目的か
らみて無視しうる量のみが形成されるような、凍結およ
び解凍の反復工程の間に蛋白質を安定化するために適し
たものがまったくないことが明らかになった。
よび添加物は数多く知られている。例えば、HSP25など
の熱ショック蛋白質の添加による蛋白質の安定化は、例
えばEP-A 0 599 344に記載されている。ポリオキシプロ
ピレンおよびポリオキシ-エチレンからなるブロックポ
リマー（block polymer）の添加、ならびにリン脂質に
よる抗体の安定化は、EP-A 0 318 081に記載されてい
る。EP-A 0 025 275には、アルギニン、グアニジンまた
はイミダゾールなどの窒素を含む塩基性物質の塩を添加
することによる免疫グロブリンの安定化が記載されてい
る。安定化のためのその他の適した添加物には、ポリエ
ーテル（EP-A 0 018 609）、グリセリン、アルブミンお
よび硫酸デキストラン（米国特許第4,808,705号）、Twe
en(登録商標)20（DE 26 52 636、GB 8514349）などの界
面活性剤、GroEl（Mendoza, J.A. Biotechnol. Tech. 1
0（1991）535〜540）などのシャペロン、クエン酸緩衝
液（国際公開公報第93／22335号）またはキレート剤
（国際公開公報第91／15509号）がある。これらの添加
物は、蛋白質を水性溶液中である程度安定化させること
ができる。しかし、先行技術において知られている方法
には、再解凍中、0℃未満の温度での保存中、または凍
結乾燥後の溶液の再構成時に、可溶性もしくは不溶性の
凝集体がまったく形成されないか、または治療的目的か
らみて無視しうる量のみが形成されるような、凍結およ
び解凍の反復工程の間に蛋白質を安定化するために適し
たものがまったくないことが明らかになった。
【０００４】EP-A 0 314 095では、緩衝性物質としてヒ
スチジン緩衝液、添加物として塩化カルシウムを含み、
高いイオン強度（0.35〜1.2mmol／l NaCl）中に存在す
る、第VIII因子などの血漿蛋白の凍結乾燥物が記載され
ている。
スチジン緩衝液、添加物として塩化カルシウムを含み、
高いイオン強度（0.35〜1.2mmol／l NaCl）中に存在す
る、第VIII因子などの血漿蛋白の凍結乾燥物が記載され
ている。
【０００５】0.5〜15mmol／lの塩化ナトリウムまたは塩
化カリウム、0.01〜10mmol／lの塩化水素リジン、およ
び緩衝性イオンとして0.2〜5mmol／lのヒスチジンを含
む、第VIII因子などの血漿蛋白の凍結乾燥物は、EP-A 0
315 968に記載されている。しかし、ヒスチジン緩衝液
は、蛋白質の凍結乾燥物が再構成される場合には、蛋白
質の安定化ならびに凝集体および粒子の形成防止のため
には適していない。
化カリウム、0.01〜10mmol／lの塩化水素リジン、およ
び緩衝性イオンとして0.2〜5mmol／lのヒスチジンを含
む、第VIII因子などの血漿蛋白の凍結乾燥物は、EP-A 0
315 968に記載されている。しかし、ヒスチジン緩衝液
は、蛋白質の凍結乾燥物が再構成される場合には、蛋白
質の安定化ならびに凝集体および粒子の形成防止のため
には適していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、蛋白質の薬学的組成物の凍結乾燥物が再構成さ
れる際に凝集体および粒子の形成を実質的に防止するこ
とができる方法を提供することである。
目的は、蛋白質の薬学的組成物の凍結乾燥物が再構成さ
れる際に凝集体および粒子の形成を実質的に防止するこ
とができる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このため、本発明は、蛋
白質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注射可能な
量の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される
ような、凍結乾燥物から再構成される蛋白質、好ましく
は抗体の、薬学的組成物の溶液中での蛋白質凝集体の形
成を防止するための改良された方法であって、その蛋白
質の水性緩衝液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝
液を含み、溶液中でのカリウムおよびナトリウムのイオ
ンの比が10：1またはそれ以上であるような方法に関す
る。この水性緩衝溶液は、好ましくはナトリウムイオン
を本質的にまったく含まない。
白質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注射可能な
量の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される
ような、凍結乾燥物から再構成される蛋白質、好ましく
は抗体の、薬学的組成物の溶液中での蛋白質凝集体の形
成を防止するための改良された方法であって、その蛋白
質の水性緩衝液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝
液を含み、溶液中でのカリウムおよびナトリウムのイオ
ンの比が10：1またはそれ以上であるような方法に関す
る。この水性緩衝溶液は、好ましくはナトリウムイオン
を本質的にまったく含まない。
【０００８】本発明により、蛋白質、特に抗体などの二
量体化または多量体化しようとする傾向のある蛋白質の
薬学的組成物を、中性pHの範囲（pH 6〜8、好ましくは
6.5〜7.5）において安定な薬学的組成物に処方すること
が可能となる。抗体などの蛋白質は、特に、溶液が1回
またはそれ以上の回数にわたって凍結され（選択的には
凍結乾燥され）、再び解凍されると、中性pHの範囲では
凝集する傾向がある。
量体化または多量体化しようとする傾向のある蛋白質の
薬学的組成物を、中性pHの範囲（pH 6〜8、好ましくは
6.5〜7.5）において安定な薬学的組成物に処方すること
が可能となる。抗体などの蛋白質は、特に、溶液が1回
またはそれ以上の回数にわたって凍結され（選択的には
凍結乾燥され）、再び解凍されると、中性pHの範囲では
凝集する傾向がある。
【０００９】薬学的組成物は、pHが6から8までの範囲に
あって、緩衝液濃度が10から300mmol／lまでの間、好ま
しくは50から250mmol／lまでの間であり、その薬学的組
成物の中に可能な限り少ない数のナトリウムイオンしか
存在せずに、リン酸カリウム緩衝液中にあることが特に
有利である。カリウムおよびナトリウムのイオンの好適
な比は10：1またはそれ以上である。リン酸カリウム緩
衝液が薬学的組成物における緩衝性物質として単独で用
いられ、ナトリウム塩（塩化ナトリウムなど）はまった
く添加されないことが特に好ましい。このような場合に
は、薬学的組成物中にはナトリウムイオンはほとんど存
在しないか、または反復性の凍結もしくは解凍の間に蛋
白質の凝集体の形成を引き起こさないような少量のみが
含まれる。
あって、緩衝液濃度が10から300mmol／lまでの間、好ま
しくは50から250mmol／lまでの間であり、その薬学的組
成物の中に可能な限り少ない数のナトリウムイオンしか
存在せずに、リン酸カリウム緩衝液中にあることが特に
有利である。カリウムおよびナトリウムのイオンの好適
な比は10：1またはそれ以上である。リン酸カリウム緩
衝液が薬学的組成物における緩衝性物質として単独で用
いられ、ナトリウム塩（塩化ナトリウムなど）はまった
く添加されないことが特に好ましい。このような場合に
は、薬学的組成物中にはナトリウムイオンはほとんど存
在しないか、または反復性の凍結もしくは解凍の間に蛋
白質の凝集体の形成を引き起こさないような少量のみが
含まれる。
【００１０】リン酸カリウム緩衝液を緩衝性物質として
用いた場合には、製造方法において少なくとも1回凍結
された蛋白質溶液の凍結乾燥物を、混濁を実質的に形成
することなく後に再構成できることが判明した。リン酸
ナトリウム緩衝液、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩
衝液などの一般的な緩衝液は、このような方法において
主に蛋白質からなる凝集体の形成をもたらし、このため
にかなりの程度の混濁をももたらす。凍結された蛋白質
溶液の共融点は約-15℃よりも高いため、約-15℃よりも
低温ではすでに完全に凍結しており、このためすでにこ
の温度でも、またはより低い温度、好ましくは例えば-2
0℃での保存が可能である。溶液は共融点よりも低温に
なってはじめて完全に凍結するため、このことは、ナト
リウムイオンを含むリン酸緩衝液中の蛋白質は、凍結保
存中（通常は-20℃）および凍結／解凍工程の間に、ナ
トリウムイオンを含まない緩衝液中またはナトリウムイ
オン濃度が非常に低い緩衝液中にある場合よりも高いス
トレスを受けることを意味する。本発明によれば、この
ストレスは上記の製剤形態では回避され、その結果、凝
集体および粒子の形成が抑制される。この製剤形態は、
蛋白質溶液を-20℃で安定的に保存することを可能に
し、これはコスト削減につながる。リン酸カリウム緩衝
液は、リン酸ナトリウム緩衝液とは対照的に、凍結工程
の間のpH変化（pH shift）が極めてわずかである（好ま
しくは最大で±1pH単位、特に好ましくは最大で±0.5pH
単位）。
用いた場合には、製造方法において少なくとも1回凍結
された蛋白質溶液の凍結乾燥物を、混濁を実質的に形成
することなく後に再構成できることが判明した。リン酸
ナトリウム緩衝液、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩
衝液などの一般的な緩衝液は、このような方法において
主に蛋白質からなる凝集体の形成をもたらし、このため
にかなりの程度の混濁をももたらす。凍結された蛋白質
溶液の共融点は約-15℃よりも高いため、約-15℃よりも
低温ではすでに完全に凍結しており、このためすでにこ
の温度でも、またはより低い温度、好ましくは例えば-2
0℃での保存が可能である。溶液は共融点よりも低温に
なってはじめて完全に凍結するため、このことは、ナト
リウムイオンを含むリン酸緩衝液中の蛋白質は、凍結保
存中（通常は-20℃）および凍結／解凍工程の間に、ナ
トリウムイオンを含まない緩衝液中またはナトリウムイ
オン濃度が非常に低い緩衝液中にある場合よりも高いス
トレスを受けることを意味する。本発明によれば、この
ストレスは上記の製剤形態では回避され、その結果、凝
集体および粒子の形成が抑制される。この製剤形態は、
蛋白質溶液を-20℃で安定的に保存することを可能に
し、これはコスト削減につながる。リン酸カリウム緩衝
液は、リン酸ナトリウム緩衝液とは対照的に、凍結工程
の間のpH変化（pH shift）が極めてわずかである（好ま
しくは最大で±1pH単位、特に好ましくは最大で±0.5pH
単位）。
【００１１】粒子形成を効果的に防止するためには、リ
ン酸緩衝液の濃度は少なくとも10mmol／l、好ましくは
約50mmol／lまたはそれ以上である必要があることが判
明した。薬学的組成物（すなわち、好ましくは再構成さ
れた溶液）における浸透圧は過度に高くない必要がある
ため（これは生理的範囲、好ましくは再構成後に約300m
Osm（±20mOsm、100mOsm〜500mOsmの範囲も適してい
る）であることが有利である）、緩衝性物質、または選
択的には緩衝性物質および塩の合計の濃度は、250〜300
mmol／lを上回るべきではない。緩衝液の濃度は、好ま
しくは区画中で50から250mmol／lまでの間である。しか
し、区画を作成するために用いられる溶液（バルク）の
生産には、より高い濃度の緩衝性物質および／または塩
も認容されうる。
ン酸緩衝液の濃度は少なくとも10mmol／l、好ましくは
約50mmol／lまたはそれ以上である必要があることが判
明した。薬学的組成物（すなわち、好ましくは再構成さ
れた溶液）における浸透圧は過度に高くない必要がある
ため（これは生理的範囲、好ましくは再構成後に約300m
Osm（±20mOsm、100mOsm〜500mOsmの範囲も適してい
る）であることが有利である）、緩衝性物質、または選
択的には緩衝性物質および塩の合計の濃度は、250〜300
mmol／lを上回るべきではない。緩衝液の濃度は、好ま
しくは区画中で50から250mmol／lまでの間である。しか
し、区画を作成するために用いられる溶液（バルク）の
生産には、より高い濃度の緩衝性物質および／または塩
も認容されうる。
【００１２】特にイオン強度を調整するために、薬学的
組成物中に塩添加物があることが望ましい場合には、本
発明によれば、同じくナトリウム塩を用いないこと、ま
たはカリウムイオンの濃度よりもかなり低いナトリウム
イオン濃度を選択することが有利である。したがって、
通常は一般的である塩化ナトリウムの代わりに、塩化カ
リウムなどのカリウム塩を添加することが好都合であ
る。しかし、カリウムイオンとナトリウムイオンとの比
が10：1またはそれ以上であれば、少量のナトリウム塩
（例えば約10mmol／lまたはそれ未満）は妨げにならな
いことが判明している。リン酸カルシウムはそのような
添加によって沈殿し、このために望ましくない混濁が形
成されることに加えて、本発明によるリン酸カルシウム
の緩衝効果も消失するため、例えば塩化カルシウムなど
のカルシウム塩を添加することはできない。
組成物中に塩添加物があることが望ましい場合には、本
発明によれば、同じくナトリウム塩を用いないこと、ま
たはカリウムイオンの濃度よりもかなり低いナトリウム
イオン濃度を選択することが有利である。したがって、
通常は一般的である塩化ナトリウムの代わりに、塩化カ
リウムなどのカリウム塩を添加することが好都合であ
る。しかし、カリウムイオンとナトリウムイオンとの比
が10：1またはそれ以上であれば、少量のナトリウム塩
（例えば約10mmol／lまたはそれ未満）は妨げにならな
いことが判明している。リン酸カルシウムはそのような
添加によって沈殿し、このために望ましくない混濁が形
成されることに加えて、本発明によるリン酸カルシウム
の緩衝効果も消失するため、例えば塩化カルシウムなど
のカルシウム塩を添加することはできない。
【００１３】本発明に係る方法においてその形成を防止
する必要のある不溶性凝集体は、そのサイズが通常は少
なくとも1μmである蛋白質凝集体と本質的には理解され
ているが、10μmを上回る範囲でもありうる。粒子は、
例えばPSS（Particle SizingSystems, USA）社の粒子算
定装置AccuSizer 700などの市販の粒子算定装置を用い
る適切な粒子算定法によって計測することができる。本
発明によれば、方法の改良は、2〜400μm／mlの粒子の
数が3000個未満であるか、または10〜400μm／mlの粒子
の数が2000個またはそれ未満である場合に達成される。
USP（米国薬局方）によれば、薬学的製剤の1回の注入量
当たりで、10μmを上回る範囲では最大6000個の粒子、2
5μmを上回る範囲では最大600個の粒子が許容される。
これは、本発明によれば、蛋白質の治療的組成物に関す
る単純な様式において達成されうる。
する必要のある不溶性凝集体は、そのサイズが通常は少
なくとも1μmである蛋白質凝集体と本質的には理解され
ているが、10μmを上回る範囲でもありうる。粒子は、
例えばPSS（Particle SizingSystems, USA）社の粒子算
定装置AccuSizer 700などの市販の粒子算定装置を用い
る適切な粒子算定法によって計測することができる。本
発明によれば、方法の改良は、2〜400μm／mlの粒子の
数が3000個未満であるか、または10〜400μm／mlの粒子
の数が2000個またはそれ未満である場合に達成される。
USP（米国薬局方）によれば、薬学的製剤の1回の注入量
当たりで、10μmを上回る範囲では最大6000個の粒子、2
5μmを上回る範囲では最大600個の粒子が許容される。
これは、本発明によれば、蛋白質の治療的組成物に関す
る単純な様式において達成されうる。
【００１４】蛋白質（ポリペプチド）は、本発明の認識
においては、蛋白質または蛋白質の断片ないしは化学的
修飾を受けた蛋白質と理解される。薬学的組成物に関し
て望ましい安定化がなされた蛋白質は、好ましくは抗
体、免疫毒素などの抗体融合蛋白質、酵素、およびエリ
スロポエチン、ソマトスタチン、インスリン、サイトカ
イン類、インターフェロン類またはプラスミノーゲン活
性化因子などの蛋白質ホルモンである。
においては、蛋白質または蛋白質の断片ないしは化学的
修飾を受けた蛋白質と理解される。薬学的組成物に関し
て望ましい安定化がなされた蛋白質は、好ましくは抗
体、免疫毒素などの抗体融合蛋白質、酵素、およびエリ
スロポエチン、ソマトスタチン、インスリン、サイトカ
イン類、インターフェロン類またはプラスミノーゲン活
性化因子などの蛋白質ホルモンである。
【００１５】本発明の概念に含まれる区画は、選択的に
さらなる加工（薬学的に許容されうる物質のさらなる添
加）を経た後に、好ましくは患者に注射するための、薬
学的組成物として適した蛋白質水溶液のアリコートであ
ると理解される。
さらなる加工（薬学的に許容されうる物質のさらなる添
加）を経た後に、好ましくは患者に注射するための、薬
学的組成物として適した蛋白質水溶液のアリコートであ
ると理解される。
【００１６】薬学的組成物がリン酸カリウム緩衝液によ
って安定化されるpHの範囲は、好ましくは弱酸性、中性
または弱アルカリ性の範囲（約pH6〜8、好ましくは約pH
7）である。
って安定化されるpHの範囲は、好ましくは弱酸性、中性
または弱アルカリ性の範囲（約pH6〜8、好ましくは約pH
7）である。
【００１７】本発明によれば、ポリソルベート（例えば
Tween(登録商標) 80など）などの非イオン性界面活性剤
を、好ましくは重量にして最大0.1％、少なくとも重量
にして0.01％の濃度で添加することが好ましい。
Tween(登録商標) 80など）などの非イオン性界面活性剤
を、好ましくは重量にして最大0.1％、少なくとも重量
にして0.01％の濃度で添加することが好ましい。
【００１８】さらに、非還元糖（好ましくはショ糖また
はトレハロース）などの凍結保護剤またはガラス質形成
剤（glass former）を、有利には少なくとも10mg／ml、
好ましくは約30〜100mg／mlの濃度で添加することが好
ましい。
はトレハロース）などの凍結保護剤またはガラス質形成
剤（glass former）を、有利には少なくとも10mg／ml、
好ましくは約30〜100mg／mlの濃度で添加することが好
ましい。
【００１９】したがって、本発明のさらなる主題事項
は、本質的に非晶質性であって蛋白質および主要な緩衝
性物質としてのリン酸カリウム緩衝液の凍結溶液からな
り、溶液中のカリウムイオンとナトリウムイオンとの比
が少なくとも10：1である、蛋白質の低凝集性で融解可
能な固形保存形態である。
は、本質的に非晶質性であって蛋白質および主要な緩衝
性物質としてのリン酸カリウム緩衝液の凍結溶液からな
り、溶液中のカリウムイオンとナトリウムイオンとの比
が少なくとも10：1である、蛋白質の低凝集性で融解可
能な固形保存形態である。
【００２０】カリウムイオンの濃度およびナトリウムイ
オンの残留量とは無関係に、カリウムとナトリウムイオ
ンの比は少なくとも10：1、好ましくは少なくとも50：1
である。本質的にナトリウムイオンを含まないカリウム
緩衝液を用いることが特に好ましい。
オンの残留量とは無関係に、カリウムとナトリウムイオ
ンの比は少なくとも10：1、好ましくは少なくとも50：1
である。本質的にナトリウムイオンを含まないカリウム
緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００２１】本発明のさらに好ましい態様において、薬
学的組成物は、インビトロ細胞培養物（例えば、モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の組換え
生産または培養）によって生産された蛋白質を含む。こ
の場合には、カリウム塩および／またはリン酸カリウム
緩衝液を第1の塩および／または緩衝液の添加とともに
添加するか、または後の単離および精製方法において再
緩衝することが適切である。これによって、ポリペプチ
ド製剤を0℃未満で暫定的に安定的に保存することが可
能となる。再緩衝とは、例えば透析などによるイオンの
交換として理解される。これらの組成物は治療的には用
いられないため、蛋白質の精製および単離の方法におけ
る緩衝液または塩の濃度は、実際には区画化の前では50
〜100mmol／lより高くてもよい。しかし、区画化の前に
は注入可能な組成物に適した浸透圧に調整されることが
不可欠である。
学的組成物は、インビトロ細胞培養物（例えば、モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の組換え
生産または培養）によって生産された蛋白質を含む。こ
の場合には、カリウム塩および／またはリン酸カリウム
緩衝液を第1の塩および／または緩衝液の添加とともに
添加するか、または後の単離および精製方法において再
緩衝することが適切である。これによって、ポリペプチ
ド製剤を0℃未満で暫定的に安定的に保存することが可
能となる。再緩衝とは、例えば透析などによるイオンの
交換として理解される。これらの組成物は治療的には用
いられないため、蛋白質の精製および単離の方法におけ
る緩衝液または塩の濃度は、実際には区画化の前では50
〜100mmol／lより高くてもよい。しかし、区画化の前に
は注入可能な組成物に適した浸透圧に調整されることが
不可欠である。
【００２２】本発明に係る方法においては、（１）蛋白
質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注入可能な量
の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される、
蛋白質の薬学的組成物の再構成された凍結乾燥物におけ
る蛋白質凝集体の形成を防止するための改良された方法
であって、蛋白質の水性緩衝溶液が緩衝性物質としてリ
ン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムとナト
リウムとの比が10：1またはそれ以上であるような方法
であることを特徴とする。
質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注入可能な量
の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される、
蛋白質の薬学的組成物の再構成された凍結乾燥物におけ
る蛋白質凝集体の形成を防止するための改良された方法
であって、蛋白質の水性緩衝溶液が緩衝性物質としてリ
ン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムとナト
リウムとの比が10：1またはそれ以上であるような方法
であることを特徴とする。
【００２３】また、本発明に係る方法においては、
（２）区画中での緩衝液の濃度が10mmol／l〜300mmol／
lの間である、上記[1]記載の方法であることを特徴とす
る。
（２）区画中での緩衝液の濃度が10mmol／l〜300mmol／
lの間である、上記[1]記載の方法であることを特徴とす
る。
【００２４】また、本発明に係る方法においては、
（３）区画が再構成された溶液の浸透圧が好ましくは10
0〜500mOsmの間、好ましくは300±50mOsmの範囲にあ
る、上記[1]〜[2]記載の方法であることを特徴とする。
（３）区画が再構成された溶液の浸透圧が好ましくは10
0〜500mOsmの間、好ましくは300±50mOsmの範囲にあ
る、上記[1]〜[2]記載の方法であることを特徴とする。
【００２５】また、本発明に係る方法においては、
（４）水性緩衝液がpH6〜8の範囲に緩衝される、上記
[1]〜[3]記載の方法であることを特徴とする。
（４）水性緩衝液がpH6〜8の範囲に緩衝される、上記
[1]〜[3]記載の方法であることを特徴とする。
【００２６】また、本発明に係る方法においては、
（５）水性緩衝液が非イオン性界面活性剤を含む、上記
[1]〜[4]記載の方法であることを特徴とする。
（５）水性緩衝液が非イオン性界面活性剤を含む、上記
[1]〜[4]記載の方法であることを特徴とする。
【００２７】また、本発明に係る方法においては、
（６）水性緩衝液が糖を10〜100mg／mlの濃度で含む、
上記[1]〜[5]記載の方法であることを特徴とする。
（６）水性緩衝液が糖を10〜100mg／mlの濃度で含む、
上記[1]〜[5]記載の方法であることを特徴とする。
【００２８】また、本発明に係る方法においては、
（７）蛋白質が抗体である、上記[1]〜[6]記載の方法で
あることを特徴とする。
（７）蛋白質が抗体である、上記[1]〜[6]記載の方法で
あることを特徴とする。
【００２９】また、本発明に係る形態においては、
（８）本質的に非晶質であり、蛋白質の凍結された溶液
を緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液とともに含
み、カリウムイオンとナトリウムイオンとの比が少なく
とも10：1である、蛋白質の低凝集性で融解可能な固形
保存形態であることを特徴とする。
（８）本質的に非晶質であり、蛋白質の凍結された溶液
を緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液とともに含
み、カリウムイオンとナトリウムイオンとの比が少なく
とも10：1である、蛋白質の低凝集性で融解可能な固形
保存形態であることを特徴とする。
【００３０】また、本発明に係る形態においては、
（９）凍結乾燥の手段によってその保存形態が調製され
る、上記[8]記載の蛋白質の固形保存形態であることを
特徴とする。
（９）凍結乾燥の手段によってその保存形態が調製され
る、上記[8]記載の蛋白質の固形保存形態であることを
特徴とする。
【００３１】また、本発明に係る形態においては、（１
０）蛋白質が抗体である、上記[8]または[9]記載の蛋白
質の保存形態であることを特徴とする。
０）蛋白質が抗体である、上記[8]または[9]記載の蛋白
質の保存形態であることを特徴とする。
【００３２】また、本発明に係る組成物においては、
（１１）pHが6〜8の間の範囲にある水性緩衝液中の蛋白
質の薬学的組成物であって、その溶液が緩衝性物質とし
てリン酸カリウム緩衝液を含み、かつ
（１１）pHが6〜8の間の範囲にある水性緩衝液中の蛋白
質の薬学的組成物であって、その溶液が緩衝性物質とし
てリン酸カリウム緩衝液を含み、かつ
【００３３】a）溶液中のカリウムとナトリウムイオン
との比が10：1またはそれ以上であり、
との比が10：1またはそれ以上であり、
【００３４】b）緩衝液の濃度が10〜300mmol／lの間に
ある、薬学的組成物であることを特徴とする。
ある、薬学的組成物であることを特徴とする。
【００３５】また、本発明に係る組成物においては、
（１２）蛋白質が抗体である、上記[11]記載の薬学的組
成物であることを特徴とする。
（１２）蛋白質が抗体である、上記[11]記載の薬学的組
成物であることを特徴とする。
【００３６】
【発明の実施の形態】以下の実施例、刊行物および図面
は、本発明と、特許請求の範囲に基づいて保護される範
囲をさらに説明するものである。記載された方法は、変
更が加えられた後も本発明の主題に依然として含まれる
記載例であると理解される必要がある。
は、本発明と、特許請求の範囲に基づいて保護される範
囲をさらに説明するものである。記載された方法は、変
更が加えられた後も本発明の主題に依然として含まれる
記載例であると理解される必要がある。
【００３７】
【実施例】実施例１． 種々の緩衝液および塩溶液の共融温度
【００３８】図1からは、NaClを含む緩衝液の共融温度
が、NaClを含まない緩衝液またはNaClの代わりにKClを
含む溶液のそれよりも約10℃低いことが明らかである。
溶液は共融温度よりも低温ではじめて完全に凍結するた
め、このことは凍結保存の間（通常は-20℃）および凍
結／解凍工程の間に、NaClを含むリン酸緩衝液はNaClを
含まない緩衝液よりも高度のストレスを受けることを意
味する。本発明によれば、このストレスは、凝集体およ
び粒子の形成を抑制する上記の製剤形態では回避され
る。この製剤形態は、コスト削減が達成されるような手
段によって-20℃で蛋白質溶液を安定的に保存すること
を可能とする。
が、NaClを含まない緩衝液またはNaClの代わりにKClを
含む溶液のそれよりも約10℃低いことが明らかである。
溶液は共融温度よりも低温ではじめて完全に凍結するた
め、このことは凍結保存の間（通常は-20℃）および凍
結／解凍工程の間に、NaClを含むリン酸緩衝液はNaClを
含まない緩衝液よりも高度のストレスを受けることを意
味する。本発明によれば、このストレスは、凝集体およ
び粒子の形成を抑制する上記の製剤形態では回避され
る。この製剤形態は、コスト削減が達成されるような手
段によって-20℃で蛋白質溶液を安定的に保存すること
を可能とする。
【００３９】実施例２． リン酸緩衝液の凍結の間のpH値の変化
【００４０】図2からは、NaClを含むリン酸緩衝液にお
けるpH値が、リン酸水素二ナトリウムの沈殿によって凍
結工程の間に大きく低下することが明らかである。NaCl
を含まないリン酸カリウム緩衝液中では、pH値はほとん
ど一定に保たれる。
けるpH値が、リン酸水素二ナトリウムの沈殿によって凍
結工程の間に大きく低下することが明らかである。NaCl
を含まないリン酸カリウム緩衝液中では、pH値はほとん
ど一定に保たれる。
【００４１】実施例３． 剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた後の蛋白質
溶液における粒子形成 種々の緩衝液（A、B、C）中でのヒト化IgG（L-セレクチ
ンに対する抗体）の溶液に対して粒子含有量に関する分
析を行った（Accu Sizer、Particle Sizing Systems、U
SA）： A）10mmol／l KP、150mmol／l NaCl、pH7におけるAB B）100mmol／l KP、pH7.2におけるAB C）100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。 a）遠心処理したもの（開始材料） b）剪断応力を加えた後（30秒間のボルテックス処理） c）6時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（-20℃）。 図3におけるデータはそれぞれ試料0.7mlに関するもので
ある。図3から、本発明に従い、ナトリウムを含まない
リン酸カリウム緩衝液を用いることにより、粒子形成が
抑制されることがわかる。この効果は、非イオン性界面
活性剤（Tween(登録商標)80、重量にして0.01％）の添
加によって増強することができる。
溶液における粒子形成 種々の緩衝液（A、B、C）中でのヒト化IgG（L-セレクチ
ンに対する抗体）の溶液に対して粒子含有量に関する分
析を行った（Accu Sizer、Particle Sizing Systems、U
SA）： A）10mmol／l KP、150mmol／l NaCl、pH7におけるAB B）100mmol／l KP、pH7.2におけるAB C）100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。 a）遠心処理したもの（開始材料） b）剪断応力を加えた後（30秒間のボルテックス処理） c）6時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（-20℃）。 図3におけるデータはそれぞれ試料0.7mlに関するもので
ある。図3から、本発明に従い、ナトリウムを含まない
リン酸カリウム緩衝液を用いることにより、粒子形成が
抑制されることがわかる。この効果は、非イオン性界面
活性剤（Tween(登録商標)80、重量にして0.01％）の添
加によって増強することができる。
【００４２】実施例４． 剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた後の蛋白質
溶液における粒子形成 種々の緩衝液（A、B、C）中でHBVに対する抗体の溶液に
対して粒子含有量に関する分析を行った（Accu Sizer、
Particle Sizing Systems、USA）： A）10mmol／l KP、30mmol／l NaCl、pH6.5におけるAB B）100mmol／l KP、pH7.2におけるAB C）100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。 a）遠心処理したもの（開始材料） b）剪断応力を加えた後（30秒間のボルテックス処理） c）6時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（-20℃）。 図4におけるデータはそれぞれ試料0.7mlに関するもので
ある。図4から、本発明に従い、ナトリウムを含まない
リン酸カリウム緩衝液を用いることにより、粒子形成が
抑制されることがわかる。この効果は、非イオン性界面
活性剤の添加によって増強することができる。
溶液における粒子形成 種々の緩衝液（A、B、C）中でHBVに対する抗体の溶液に
対して粒子含有量に関する分析を行った（Accu Sizer、
Particle Sizing Systems、USA）： A）10mmol／l KP、30mmol／l NaCl、pH6.5におけるAB B）100mmol／l KP、pH7.2におけるAB C）100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。 a）遠心処理したもの（開始材料） b）剪断応力を加えた後（30秒間のボルテックス処理） c）6時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（-20℃）。 図4におけるデータはそれぞれ試料0.7mlに関するもので
ある。図4から、本発明に従い、ナトリウムを含まない
リン酸カリウム緩衝液を用いることにより、粒子形成が
抑制されることがわかる。この効果は、非イオン性界面
活性剤の添加によって増強することができる。
【００４３】実施例５． 0℃未満の温度での蛋白質溶液（実施例3によるヒト化Ig
G）の保存中の、可溶性凝集体の形成防止
G）の保存中の、可溶性凝集体の形成防止
【００４４】蛋白質溶液を、A）10mMリン酸カリウム、1
50mM NaCl、pH7.0、およびB）100mMリン酸カリウム、pH
7.2において、数週間にわたって-20℃で保存した。サイ
ズ排除HPLCによって、可溶性凝集体および天然型蛋白質
に関する分析を行った（図5）。本発明に係るNaClを含
まない緩衝液中の蛋白質凝集体は、NaClを含む緩衝液に
おけるものと比べて大幅に少なかった。これは特に、Na
Clを含まない緩衝液中ではpHの変化が実質的に防止さ
れ、保存温度が共融温度よりもかなり低いという上記事
実による。（実施例1および2も参照されたい）
50mM NaCl、pH7.0、およびB）100mMリン酸カリウム、pH
7.2において、数週間にわたって-20℃で保存した。サイ
ズ排除HPLCによって、可溶性凝集体および天然型蛋白質
に関する分析を行った（図5）。本発明に係るNaClを含
まない緩衝液中の蛋白質凝集体は、NaClを含む緩衝液に
おけるものと比べて大幅に少なかった。これは特に、Na
Clを含まない緩衝液中ではpHの変化が実質的に防止さ
れ、保存温度が共融温度よりもかなり低いという上記事
実による。（実施例1および2も参照されたい）
【００４５】実施例６． 凍結／解凍ストレスを加えた後の蛋白質溶液における粒
子形成
子形成
【００４６】種々の緩衝液中でのMAB L-セレクチン、MA
B HBV、MAB PDGF-RおよびMAB LNGF-Rの各抗体につい
て、凍結／解凍ストレス（6×凍結／解凍）を加える前
後で、粒子含有量に関して分析した（Accu Sizer, Part
icle Sizing Systems）（結果は表1参照、Cprot：蛋白
質濃度）。1ml当たりの2〜400μmのサイズの粒子数を明
記している。
B HBV、MAB PDGF-RおよびMAB LNGF-Rの各抗体につい
て、凍結／解凍ストレス（6×凍結／解凍）を加える前
後で、粒子含有量に関して分析した（Accu Sizer, Part
icle Sizing Systems）（結果は表1参照、Cprot：蛋白
質濃度）。1ml当たりの2〜400μmのサイズの粒子数を明
記している。
【００４７】ナトリウムを含まないリン酸カリウム緩衝
液（KP）を用いることにより、本発明に従い、粒子形成
が抑制されたことが明らかである。この効果は非イオン
性界面活性剤を添加することによって増強することがで
きる。
液（KP）を用いることにより、本発明に従い、粒子形成
が抑制されたことが明らかである。この効果は非イオン
性界面活性剤を添加することによって増強することがで
きる。
【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 緩衝液中のMAB Cprot ストレス非添加時 6回の凍結／解凍後 L-セレクチン [mg／ml] の2〜400μmの の2〜400μmの 粒子数／ml 粒子数／ml ─────────────────────────────────── 10mM KP、150mM 21.40 875 6245 NaCl、pH7.2 100mM KP、重量 18.50 276 332 にして0.01％の Tween80、pH7.2 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 緩衝液中のMAB Cprot ストレス非添加時 6回の凍結／解凍後 HBV [mg／ml] の2〜400μmの の2〜400μmの 粒子数／ml 粒子数／ml ─────────────────────────────────── 10mM KP、30mM 17.85 544 19085 NaCl、pH6.6 100mM KP、重量 18.30 740 695 にして0.01％の Tween80、pH7.2 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 緩衝液中のMAB Cprot ストレス非添加時 6回の凍結／解凍後 PDGF-R [mg／ml] の2〜400μmの の2〜400μmの 粒子数／ml 粒子数／ml ─────────────────────────────────── 10mM KP、150mM 1.70 130 33795 NaCl、pH7.2 50mM KP、重量 1.70 691 677 にして0.01％の Tween80、pH7.2 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 緩衝液中のMAB Cprot ストレス非添加時 6回の凍結／解凍後 LNGF-R [mg／ml] の2〜400μmの の2〜400μmの 粒子数／ml 粒子数／ml ─────────────────────────────────── 10mM KP、150mM 1.70 690 28915 NaCl、pH7.2 50mM KP、重量 1.70 1164 1257 にして0.01％の Tween80、pH7.2 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４８】
【発明の効果】蛋白質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍
され、注入可能な量の区画に分けられて、これらの区画
が凍結乾燥される、蛋白質の薬学的組成物の再構成され
た凍結乾燥物における蛋白質凝集体の形成を防止するた
めの改良された方法であって、蛋白質の水性緩衝溶液が
緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中
でのカリウムイオンとナトリウムイオンとの比が少なく
とも10：1であることを特徴とする方法を、薬学的組成
物の安定な凍結乾燥物を製造するために有利に用いるこ
とができる。
され、注入可能な量の区画に分けられて、これらの区画
が凍結乾燥される、蛋白質の薬学的組成物の再構成され
た凍結乾燥物における蛋白質凝集体の形成を防止するた
めの改良された方法であって、蛋白質の水性緩衝溶液が
緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中
でのカリウムイオンとナトリウムイオンとの比が少なく
とも10：1であることを特徴とする方法を、薬学的組成
物の安定な凍結乾燥物を製造するために有利に用いるこ
とができる。
DE 26 52 636 EP-A 0 018 609号 EP-A 0 025 275号 EP-A 0 314 095号 EP-A 0 315 968号 EP-A 0 318 081号 EP-A 0 599 344号 GB 8514349 Mendoza, J.A. Biotechnol. Tech. 10 (1991) 535〜540 米国特許第4,808,705号 国際公開公報第91／15509号 国際公開公報第93／22335号
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々の緩衝液および塩溶液の共融点の決定を
示す図である。
示す図である。
【図２】 リン酸緩衝液の凍結中のpH値の変化を示す図
である。
である。
【図３】 剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた
後の、種々の緩衝液（A、B、C）中での抗体（L-セレク
チンに対するもの）溶液の粒子形成を示す図である。 A：10mmol／l KP、150mmol／l NaCl、pH7におけるAB； B：100mmol／l KP、pH7.2におけるAB； C：100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。 a：遠心処理したもの（開始材料）； b：剪断応力を加えた後（30秒間のボルテックス処
理）； c：6時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（-20℃）。
後の、種々の緩衝液（A、B、C）中での抗体（L-セレク
チンに対するもの）溶液の粒子形成を示す図である。 A：10mmol／l KP、150mmol／l NaCl、pH7におけるAB； B：100mmol／l KP、pH7.2におけるAB； C：100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。 a：遠心処理したもの（開始材料）； b：剪断応力を加えた後（30秒間のボルテックス処
理）； c：6時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（-20℃）。
【図４】 剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた
後の、種々の緩衝液（A、B、C）中でのHBVに対する抗体
の溶液の粒子形成を示す図である。 A：10mmol／l KP、30mmol／l NaCl、pH6.5におけるAB； B：100mmol／l KP、pH7.2におけるAB； C：100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。
後の、種々の緩衝液（A、B、C）中でのHBVに対する抗体
の溶液の粒子形成を示す図である。 A：10mmol／l KP、30mmol／l NaCl、pH6.5におけるAB； B：100mmol／l KP、pH7.2におけるAB； C：100mmol／l KP、重量にして0.01％のTween(登録商
標)80、pH7.2におけるAB。
【図５】 0℃未満の温度で保存した後の蛋白質溶液
（実施例3によるヒト化IgG）における可溶性凝集体のサ
イズ排除HPLC分析を示す図である。 A：10mmol／l KP、150mmol／l NaCl、pH7.0におけるA
B； B：100mmol／l KP、pH7.2におけるAB。
（実施例3によるヒト化IgG）における可溶性凝集体のサ
イズ排除HPLC分析を示す図である。 A：10mmol／l KP、150mmol／l NaCl、pH7.0におけるA
B； B：100mmol／l KP、pH7.2におけるAB。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/00 Ａ６１Ｋ 37/48 (72)発明者 ゲルハード ウィンター ドイツ ドッセンハイム ジャンストラ ッセ 20イー (56)参考文献 国際公開95／20399（ＷＯ，Ａ１) 独国特許出願公開2652636（ＤＥ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】 蛋白質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍
され、注入可能な量の区画に分けられて、これらの区画
が凍結乾燥される、蛋白質の薬学的組成物の再構成され
た凍結乾燥物における蛋白質凝集体の形成を防止するた
めの改良された方法であって、蛋白質の水性緩衝溶液が
緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中
でのカリウムとナトリウムとの比が10：1またはそれ以
上であるような方法。 - 【請求項２】 区画中での緩衝液の濃度が10mmol／l〜3
00mmol／lの間である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 区画が再構成された溶液の浸透圧が100
〜500mOsmの間である、請求項１〜２記載の方法。 - 【請求項４】 区画が再構成された溶液の浸透圧が300
±50mOsmの範囲にある、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 水性緩衝液がpH6〜8の範囲に緩衝され
る、請求項１〜４記載の方法。 - 【請求項６】 水性緩衝液が非イオン性界面活性剤を含
む、請求項１〜５記載の方法。 - 【請求項７】 水性緩衝液が糖を10〜100mg／mlの濃度
で含む、請求項１〜６記載の方法。 - 【請求項８】 蛋白質が抗体である、請求項１〜７記載
の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97120528.1 | 1997-11-22 | ||
| EP97120528 | 1997-11-22 | ||
| EP98102846 | 1998-02-19 | ||
| EP98102846.7 | 1998-02-19 |
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|---|---|
| JPH11240895A JPH11240895A (ja) | 1999-09-07 |
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|---|---|---|---|
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| AT (1) | ATE220558T1 (ja) |
| AU (1) | AU714264B2 (ja) |
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| ES (1) | ES2179414T3 (ja) |
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| TR (1) | TR199802394A3 (ja) |
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