JP3102038B2 - 血小板粘着能測定法 - Google Patents
血小板粘着能測定法Info
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- JP3102038B2 JP3102038B2 JP03002033A JP203391A JP3102038B2 JP 3102038 B2 JP3102038 B2 JP 3102038B2 JP 03002033 A JP03002033 A JP 03002033A JP 203391 A JP203391 A JP 203391A JP 3102038 B2 JP3102038 B2 JP 3102038B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗ＧｐIIb/IIIa抗体で
処理することにより血小板の凝集反応を分離した血小板
粘着能測定法に関する。
処理することにより血小板の凝集反応を分離した血小板
粘着能測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血小板は赤血球、白血球とならぶ代表的
な血球細胞のひとつであり、生体においては主に出血部
位における血液凝固、止血機構に重要な役割を果してい
る。すなわち、血小板は血管内壁の障害部位へ粘着し、
これに引き続いて障害部位では凝集、放出といったいわ
ゆる血小板の活性化反応がおこり出血を食い止める。し
かしながら、一方で血小板の活性化反応により、形成さ
れた血小板塊はやがては血栓形成の引き金となることが
知られている。特に、血小板の粘着能亢進は血栓形成過
程の最も初期の反応であることから脳梗塞、心筋梗塞の
ような血栓症を伴う病態の原因の１つであるといわれて
おり、このような現象を血栓形成の抑制や血栓症の治療
といった観点からみると、とりわけ活性化の初期反応で
ある血小板の粘着の抑制が非常に重要である。すなわ
ち、血小板の粘着反応の解析は血栓症の根本的な予防、
治療および病態のメカニズムの解析に有用であるが、さ
らに先天的に粘着能・凝集能が欠如している血小板無力
症やBernard-Soulier 症候群のようないわゆる先天性血
小板異常症の解明、診断等にも有用である。
な血球細胞のひとつであり、生体においては主に出血部
位における血液凝固、止血機構に重要な役割を果してい
る。すなわち、血小板は血管内壁の障害部位へ粘着し、
これに引き続いて障害部位では凝集、放出といったいわ
ゆる血小板の活性化反応がおこり出血を食い止める。し
かしながら、一方で血小板の活性化反応により、形成さ
れた血小板塊はやがては血栓形成の引き金となることが
知られている。特に、血小板の粘着能亢進は血栓形成過
程の最も初期の反応であることから脳梗塞、心筋梗塞の
ような血栓症を伴う病態の原因の１つであるといわれて
おり、このような現象を血栓形成の抑制や血栓症の治療
といった観点からみると、とりわけ活性化の初期反応で
ある血小板の粘着の抑制が非常に重要である。すなわ
ち、血小板の粘着反応の解析は血栓症の根本的な予防、
治療および病態のメカニズムの解析に有用であるが、さ
らに先天的に粘着能・凝集能が欠如している血小板無力
症やBernard-Soulier 症候群のようないわゆる先天性血
小板異常症の解明、診断等にも有用である。
【０００３】血小板活性化反応のうち、血小板凝集反応
や放出物質のレベルの測定系はすでに確立され繁用され
ているが、血小板粘着反応については測定系はあるもの
の、厳密な意味で粘着反応だけを測定する系は確立され
ていない。
や放出物質のレベルの測定系はすでに確立され繁用され
ているが、血小板粘着反応については測定系はあるもの
の、厳密な意味で粘着反応だけを測定する系は確立され
ていない。
【０００４】これまでに用いられている血小板粘着能の
測定法には、ex vivo の試験としてはガラスビーズ管法
が、in vitroの試験としては放射能標識した洗浄血小板
を用いる方法がある。ガラスビーズ管法では、血小板の
粘着と凝集が、血小板が活性化されておこる一連の反応
であるため、粘着のみならず凝集も測定しており、粘着
のみを測定していないことが最大の問題点とされてい
る。
測定法には、ex vivo の試験としてはガラスビーズ管法
が、in vitroの試験としては放射能標識した洗浄血小板
を用いる方法がある。ガラスビーズ管法では、血小板の
粘着と凝集が、血小板が活性化されておこる一連の反応
であるため、粘着のみならず凝集も測定しており、粘着
のみを測定していないことが最大の問題点とされてい
る。
【０００５】また、洗浄血小板法は多血小板血漿を遠心
分離操作などにより洗浄、分離し調製する洗浄血小板を
用い、これをさらに［51Ｃｒ］や［ 3Ｈ］adenosine な
どで放射能標識し、コラーゲンやその他のextracellula
r matrix構成蛋白への結合を測定する方法であるが、放
射能標識が煩雑で時間を要するだけでなく、薬物評価の
際には、洗浄操作中に実際の薬物効果が減弱する恐れが
あることなどから、exvivo の試験には応用がほとんど
不可能である。さらにこの方法では洗浄血小板調製の際
に血小板活性化に必要なＣａイオンをキレートしたり血
小板活性化抑制剤であるプロスタグランジンＥ1 などを
添加して活性化を抑えるなど多段階の操作が必須とされ
ているため、操作中に血小板の性質が変化してしまう可
能性が高く、このとき血小板に対する薬物作用を正確に
評価しうるかどうかは多くの疑問が持たれている。
分離操作などにより洗浄、分離し調製する洗浄血小板を
用い、これをさらに［51Ｃｒ］や［ 3Ｈ］adenosine な
どで放射能標識し、コラーゲンやその他のextracellula
r matrix構成蛋白への結合を測定する方法であるが、放
射能標識が煩雑で時間を要するだけでなく、薬物評価の
際には、洗浄操作中に実際の薬物効果が減弱する恐れが
あることなどから、exvivo の試験には応用がほとんど
不可能である。さらにこの方法では洗浄血小板調製の際
に血小板活性化に必要なＣａイオンをキレートしたり血
小板活性化抑制剤であるプロスタグランジンＥ1 などを
添加して活性化を抑えるなど多段階の操作が必須とされ
ているため、操作中に血小板の性質が変化してしまう可
能性が高く、このとき血小板に対する薬物作用を正確に
評価しうるかどうかは多くの疑問が持たれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、血小板
の粘着反応を凝集反応より完全に分離し、粘着反応だけ
を測定することを目的として検討した結果、血小板膜糖
蛋白ＧｐIIb/IIIaの抗体で処理することにより凝集反応
を抑制することを見出し、本発明に到達した。
の粘着反応を凝集反応より完全に分離し、粘着反応だけ
を測定することを目的として検討した結果、血小板膜糖
蛋白ＧｐIIb/IIIaの抗体で処理することにより凝集反応
を抑制することを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、血小板粘着能
を測定する際に、多血小板血漿（以下、ＰＲＰと略す）
を抗ＧｐIIb/IIIa抗体で処理することを特徴とする血小
板粘着能測定法に関するものである。さらに、抗ＧｐII
b/IIIa抗体および血小板凝集惹起剤で処理することを特
徴とする血小板粘着能測定法に関するものである。ま
た、この血小板粘着量を画像解析装置またはコールター
カウンターを用いて測定することを特徴とする血小板粘
着能測定法に関するものである。
を測定する際に、多血小板血漿（以下、ＰＲＰと略す）
を抗ＧｐIIb/IIIa抗体で処理することを特徴とする血小
板粘着能測定法に関するものである。さらに、抗ＧｐII
b/IIIa抗体および血小板凝集惹起剤で処理することを特
徴とする血小板粘着能測定法に関するものである。ま
た、この血小板粘着量を画像解析装置またはコールター
カウンターを用いて測定することを特徴とする血小板粘
着能測定法に関するものである。
【０００８】以下、本発明を説明する。血小板膜には５
０−１００種類におよぶ分子量１万から２０万以上の糖
蛋白（glycoprotein、以下Ｇｐと略す）が存在してお
り、最近ではいくつかのＧｐが、血小板の粘着、凝集な
どの血小板活性化刺激に関与していることが明らかとな
り、Ｇｐの性状や機能の解析が進められている。ＧｐII
b/IIIaとは、先天性に凝集能を欠く血小板無力症血小板
にＧｐIIb/IIIaがないことから見出された血小板凝集に
関与するＧｐである。本発明で目的とする血小板の凝集
と粘着との分離は、このＧｐIIb/IIIaに対する抗体を血
小板浮遊液に添加し、ＧｐIIb/IIIa抗原を完全中和して
ＧｐIIb/IIIaの機能をブロックすることにより可能とな
る。即ち、クエン酸ナトリウムを最終濃度0.38％になる
ように加えて採血した血液を遠心分離操作することによ
り得られる多血小板血漿を採取し、Hepes bufferなどで
適宜希釈し、得られる血小板浮遊液を抗ＧｐIIb/IIIa抗
体を添加せず、コラーゲンコートしたプレート上にの
せ、一定時間静置すると血小板がコラーゲンに付着する
反応が観察される。この時、アデノシンジホスフェート
（ＡＤＰ）や１２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール
１３−アセテート（ＴＰＡ）などの凝集惹起剤を加える
と、撹拌操作がなくても凝集が惹起され、大小さまざま
な多数の凝集塊がコラーゲンに付着するのが観察され
る。しかし、血小板浮遊液に抗ＧｐIIb/IIIa抗体５〜１
０μｇ／ｍｌをあらかじめ添加すると、凝集をともなわ
ない血小板の粘着がＡＤＰやＴＰＡなどの凝集惹起剤を
加えることにより濃度依存的に増加するのが観察され
る。この抗ＧｐIIb/IIIa抗体存在下での血小板が、凝集
を分離した単一細胞の粘着を反映していることは光学式
の凝集計や走査電子顕微鏡観察により証明できる。
０−１００種類におよぶ分子量１万から２０万以上の糖
蛋白（glycoprotein、以下Ｇｐと略す）が存在してお
り、最近ではいくつかのＧｐが、血小板の粘着、凝集な
どの血小板活性化刺激に関与していることが明らかとな
り、Ｇｐの性状や機能の解析が進められている。ＧｐII
b/IIIaとは、先天性に凝集能を欠く血小板無力症血小板
にＧｐIIb/IIIaがないことから見出された血小板凝集に
関与するＧｐである。本発明で目的とする血小板の凝集
と粘着との分離は、このＧｐIIb/IIIaに対する抗体を血
小板浮遊液に添加し、ＧｐIIb/IIIa抗原を完全中和して
ＧｐIIb/IIIaの機能をブロックすることにより可能とな
る。即ち、クエン酸ナトリウムを最終濃度0.38％になる
ように加えて採血した血液を遠心分離操作することによ
り得られる多血小板血漿を採取し、Hepes bufferなどで
適宜希釈し、得られる血小板浮遊液を抗ＧｐIIb/IIIa抗
体を添加せず、コラーゲンコートしたプレート上にの
せ、一定時間静置すると血小板がコラーゲンに付着する
反応が観察される。この時、アデノシンジホスフェート
（ＡＤＰ）や１２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール
１３−アセテート（ＴＰＡ）などの凝集惹起剤を加える
と、撹拌操作がなくても凝集が惹起され、大小さまざま
な多数の凝集塊がコラーゲンに付着するのが観察され
る。しかし、血小板浮遊液に抗ＧｐIIb/IIIa抗体５〜１
０μｇ／ｍｌをあらかじめ添加すると、凝集をともなわ
ない血小板の粘着がＡＤＰやＴＰＡなどの凝集惹起剤を
加えることにより濃度依存的に増加するのが観察され
る。この抗ＧｐIIb/IIIa抗体存在下での血小板が、凝集
を分離した単一細胞の粘着を反映していることは光学式
の凝集計や走査電子顕微鏡観察により証明できる。
【０００９】本発明の抗ＧｐIIb/IIIa抗体は一般的な抗
体作成法に従って、ヒトの洗浄血小板をマウスに免疫し
その脾臓の細胞をマウスのミエローマ細胞とハイブリダ
イゼーションし、細胞が産生するイムノグロブリンから
抗体価を検定して得られるものを用いることができる。
ＧｐIIb/IIIaのポリクローナル抗体でも使用可能である
が、本発明ではモノクローナル抗体を使用するのが特に
好ましい。モノクローナル抗体としては、７Ｅ３（Coll
er, BS; J. Clin. Invest., 76, 101 (1985)）等が好ま
しく用いられるが、“Ｐ２”（ＩＭＴ社）のような市販
の抗体を使用することもできる。抗ＧｐIIb/IIIa抗体
は、血小板のＧｐIIb/IIIaを完全中和できる量をＰＲＰ
に添加する。血小板の抗体処理時間は、通常の抗原抗体
反応であるので、室温で５分以上が好ましい。
体作成法に従って、ヒトの洗浄血小板をマウスに免疫し
その脾臓の細胞をマウスのミエローマ細胞とハイブリダ
イゼーションし、細胞が産生するイムノグロブリンから
抗体価を検定して得られるものを用いることができる。
ＧｐIIb/IIIaのポリクローナル抗体でも使用可能である
が、本発明ではモノクローナル抗体を使用するのが特に
好ましい。モノクローナル抗体としては、７Ｅ３（Coll
er, BS; J. Clin. Invest., 76, 101 (1985)）等が好ま
しく用いられるが、“Ｐ２”（ＩＭＴ社）のような市販
の抗体を使用することもできる。抗ＧｐIIb/IIIa抗体
は、血小板のＧｐIIb/IIIaを完全中和できる量をＰＲＰ
に添加する。血小板の抗体処理時間は、通常の抗原抗体
反応であるので、室温で５分以上が好ましい。
【００１０】本発明では、血小板の粘着能を増加させる
ために、さらに凝集惹起剤で処理することが好ましい。
ここで用いる凝集惹起剤は、粘着した血小板の顕微鏡観
察、および以下の解析法にのべる画像解析のテレビカメ
ラでの観察が可能な範囲、すなわち、ＡＤＰならば０．
５〜３μＭ、ＴＰＡならば５〜５００ｎｇ／ｍｌを最終
濃度として添加するのが好ましく、凝集惹起剤の添加
は、抗体処理した血小板をコラーゲンプレート上に載せ
てから行ない、反応時間は室温で２０分以上が特に好ま
しい。
ために、さらに凝集惹起剤で処理することが好ましい。
ここで用いる凝集惹起剤は、粘着した血小板の顕微鏡観
察、および以下の解析法にのべる画像解析のテレビカメ
ラでの観察が可能な範囲、すなわち、ＡＤＰならば０．
５〜３μＭ、ＴＰＡならば５〜５００ｎｇ／ｍｌを最終
濃度として添加するのが好ましく、凝集惹起剤の添加
は、抗体処理した血小板をコラーゲンプレート上に載せ
てから行ない、反応時間は室温で２０分以上が特に好ま
しい。
【００１１】次に、血小板粘着能を測定するにはプレー
トに粘着した血小板数を測定する。血小板数を測定する
方法は特に限定されないが、本発明においては、多血小
板血漿をそのまま用いるので、画像解析装置またはコー
ルターカウンターが好ましく用いられる。本発明で用い
る画像解析装置とは、測定する検体サンプルを顕微鏡を
通じてテレビカメラに入力、テレビ画面に写された画像
の個数、面積の解析を解析ソフトを用いることで高速に
行なうことができる装置であり、たとえば粘着した血小
板像を実体顕微鏡下に倍率４０倍でテレビ画面に写すこ
とにより視野中の血小板数として、あるいは血小板の画
像を面積として積分計算し、血小板粘着／視野として表
示することが可能な装置である。この画像解析装置によ
る解析はプレート上の１つのｗｅｌｌあたりランダムに
３視野以上について行ない、その平均値を各ｗｅｌｌの
血小板粘着／視野として表わすことにより定量化でき
る。このとき、コラーゲンプレートに粘着した血小板
は、ホルマリン固定により時間経過に伴う標本の劣化を
防ぐことができる。さらに固定した血小板はギムザ染色
によりコントラストを強くテレビ画面に写すことができ
る。このような血小板の固定は、パラホルムアルデヒ
ド、グルタルアルデヒドなどでも可能であり、さらに染
色は通常の細胞染色法を用いてもよい。一方、画像解析
装置をもちいる代わりに粘着している血小板をコラーゲ
ンプレートから蛋白分解酵素や界面活性剤で処理するこ
とにより剥離、回収して、コールターカウンターのよう
な血球細胞の数を数える装置により血小板粘着能を血小
板数としてカウント、定量化することも可能である。
トに粘着した血小板数を測定する。血小板数を測定する
方法は特に限定されないが、本発明においては、多血小
板血漿をそのまま用いるので、画像解析装置またはコー
ルターカウンターが好ましく用いられる。本発明で用い
る画像解析装置とは、測定する検体サンプルを顕微鏡を
通じてテレビカメラに入力、テレビ画面に写された画像
の個数、面積の解析を解析ソフトを用いることで高速に
行なうことができる装置であり、たとえば粘着した血小
板像を実体顕微鏡下に倍率４０倍でテレビ画面に写すこ
とにより視野中の血小板数として、あるいは血小板の画
像を面積として積分計算し、血小板粘着／視野として表
示することが可能な装置である。この画像解析装置によ
る解析はプレート上の１つのｗｅｌｌあたりランダムに
３視野以上について行ない、その平均値を各ｗｅｌｌの
血小板粘着／視野として表わすことにより定量化でき
る。このとき、コラーゲンプレートに粘着した血小板
は、ホルマリン固定により時間経過に伴う標本の劣化を
防ぐことができる。さらに固定した血小板はギムザ染色
によりコントラストを強くテレビ画面に写すことができ
る。このような血小板の固定は、パラホルムアルデヒ
ド、グルタルアルデヒドなどでも可能であり、さらに染
色は通常の細胞染色法を用いてもよい。一方、画像解析
装置をもちいる代わりに粘着している血小板をコラーゲ
ンプレートから蛋白分解酵素や界面活性剤で処理するこ
とにより剥離、回収して、コールターカウンターのよう
な血球細胞の数を数える装置により血小板粘着能を血小
板数としてカウント、定量化することも可能である。
【００１２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。 実施例１ 抗ＧｐIIb/IIIa抗体存在下での血小板の粘着、およびＡ
ＤＰ添加による血小板粘着能の濃度依存性： 血液をクエン酸加血（0.38% ）として採血し、８００rp
m （７０g ）、１０分間の遠心操作により多血小板血漿
（ＰＲＰ）を採取し、ＰＲＰをＨｅｐｅｓ緩衝液にて
１：１に希釈し、血小板浮遊液とした。これを抗ＧｐII
b/IIIa抗体（７Ｅ３；Coller, BS; J. Clin. Invest.,
76, 101 (1985)）１０μg/mlと室温で１０分間反応させ
た後、コラ−ゲンコ−ティングした４８ｗｅｌｌプレ−
ト（Ｃｏａｓｔａｒ）に２００μｌ／ｍｌ入れ、凝集惹
起剤であるＡＤＰ（０、１、２、３μＭ）を血小板浮遊
液に添加し、穏やかに撹拌した後、室温で２０分間静置
した。静置後、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含む生理食塩水・リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））
を各ｗｅｌｌに４００μｌづつ加えて３回洗浄した。洗
浄後３７％ホルマリン２００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室
温で１０分間放置したのち、０．１％のＢＳＡを含むＰ
ＢＳ（−）を各ｗｅｌｌに４００μｌづつ加えて３回洗
浄した。洗浄後、ギムザ染色液を各ｗｅｌｌに２００μ
ｌずつ加え、室温で３０分間放置した後、イオン交換水
にて染色液を洗い出し、乾燥させた。乾燥したプレート
標本は画像解析装置（オリンパスＳＰ５００）にて各we
ll３視野ずつ面積値として解析し、その平均を求めた。
まず、上述の系で抗ＧｐIIb/IIIa抗体の添加濃度を変化
させた。その結果、血小板のコラ−ゲンプレ−トへの付
着（粘着＋凝集）は抗体濃度５−１０μｇ／ｍｌで抑制
が最大に達した。この抗体濃度依存性曲線を図１に示
す。
する。 実施例１ 抗ＧｐIIb/IIIa抗体存在下での血小板の粘着、およびＡ
ＤＰ添加による血小板粘着能の濃度依存性： 血液をクエン酸加血（0.38% ）として採血し、８００rp
m （７０g ）、１０分間の遠心操作により多血小板血漿
（ＰＲＰ）を採取し、ＰＲＰをＨｅｐｅｓ緩衝液にて
１：１に希釈し、血小板浮遊液とした。これを抗ＧｐII
b/IIIa抗体（７Ｅ３；Coller, BS; J. Clin. Invest.,
76, 101 (1985)）１０μg/mlと室温で１０分間反応させ
た後、コラ−ゲンコ−ティングした４８ｗｅｌｌプレ−
ト（Ｃｏａｓｔａｒ）に２００μｌ／ｍｌ入れ、凝集惹
起剤であるＡＤＰ（０、１、２、３μＭ）を血小板浮遊
液に添加し、穏やかに撹拌した後、室温で２０分間静置
した。静置後、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含む生理食塩水・リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））
を各ｗｅｌｌに４００μｌづつ加えて３回洗浄した。洗
浄後３７％ホルマリン２００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室
温で１０分間放置したのち、０．１％のＢＳＡを含むＰ
ＢＳ（−）を各ｗｅｌｌに４００μｌづつ加えて３回洗
浄した。洗浄後、ギムザ染色液を各ｗｅｌｌに２００μ
ｌずつ加え、室温で３０分間放置した後、イオン交換水
にて染色液を洗い出し、乾燥させた。乾燥したプレート
標本は画像解析装置（オリンパスＳＰ５００）にて各we
ll３視野ずつ面積値として解析し、その平均を求めた。
まず、上述の系で抗ＧｐIIb/IIIa抗体の添加濃度を変化
させた。その結果、血小板のコラ−ゲンプレ−トへの付
着（粘着＋凝集）は抗体濃度５−１０μｇ／ｍｌで抑制
が最大に達した。この抗体濃度依存性曲線を図１に示
す。
【００１３】抗体濃度５−１０μｇ／ｍｌを添加した場
合にプレートのコラーゲンに付着（粘着）した血小板を
光学顕微鏡で観察すると、抗体を入れない場合に見られ
る様な凝集塊の付着は全く観察されなかった。ここで観
察された血小板粘着が凝集を含んでいないことを、光学
式の凝集計（SIENCO社、モデルＤＰ−２４７Ｅ）によっ
ても確認した。その結果、１０μＭのＡＤＰで惹起され
る血小板凝集は抗ＧｐIIb/IIIa抗体１０μｇ／ｍｌで完
全に抑制された。この結果を図２に示す。図２におい
て、（Ａ）は抗体非存在下、（Ｂ）は抗体存在下でＡＤ
Ｐ１０μＭ添加によりおこる血小板凝集を示す。ここで
はＰＲＰ（多血小板血漿）を透過率０％、ＰＰＰ（乏血
小板血漿）を透過率１００％を示す試量として用いた。
図２から明らかな様に、１０μｇ／ｍｌ抗ＧｐIIb/IIIa
抗体処理した血小板は、凝集を抑制し、一方、図１の結
果よりわかるように、図２の様な凝集を完全に抑制した
系でも血小板はコラ−ゲンに粘着しうることが観察され
た。
合にプレートのコラーゲンに付着（粘着）した血小板を
光学顕微鏡で観察すると、抗体を入れない場合に見られ
る様な凝集塊の付着は全く観察されなかった。ここで観
察された血小板粘着が凝集を含んでいないことを、光学
式の凝集計（SIENCO社、モデルＤＰ−２４７Ｅ）によっ
ても確認した。その結果、１０μＭのＡＤＰで惹起され
る血小板凝集は抗ＧｐIIb/IIIa抗体１０μｇ／ｍｌで完
全に抑制された。この結果を図２に示す。図２におい
て、（Ａ）は抗体非存在下、（Ｂ）は抗体存在下でＡＤ
Ｐ１０μＭ添加によりおこる血小板凝集を示す。ここで
はＰＲＰ（多血小板血漿）を透過率０％、ＰＰＰ（乏血
小板血漿）を透過率１００％を示す試量として用いた。
図２から明らかな様に、１０μｇ／ｍｌ抗ＧｐIIb/IIIa
抗体処理した血小板は、凝集を抑制し、一方、図１の結
果よりわかるように、図２の様な凝集を完全に抑制した
系でも血小板はコラ−ゲンに粘着しうることが観察され
た。
【００１４】また、抗体処理した血小板の粘着について
種々の検討行なったところ、この粘着は図３に示すよう
にＡＤＰの濃度に依存して増加した。すなわち、抗Ｇｐ
IIb/IIIa抗体処理した血小板において、ＡＤＰの様な凝
集惹起物質により血小板が活性化された状態で血小板粘
着が増加することを証明することができた。さらに、こ
の粘着のタイムコ−スを調べるとほぼ２０分で粘着能が
最大となり、その後はプラト−に達した。この結果を図
４に示す。
種々の検討行なったところ、この粘着は図３に示すよう
にＡＤＰの濃度に依存して増加した。すなわち、抗Ｇｐ
IIb/IIIa抗体処理した血小板において、ＡＤＰの様な凝
集惹起物質により血小板が活性化された状態で血小板粘
着が増加することを証明することができた。さらに、こ
の粘着のタイムコ−スを調べるとほぼ２０分で粘着能が
最大となり、その後はプラト−に達した。この結果を図
４に示す。
【００１５】抗ＧｐIIb/IIIa抗体存在下および非存在下
での血小板のコラ−ゲンへの付着状態を走査電顕により
観察すると、抗ＧｐIIb/IIIa抗体の非存在下では、ＡＤ
Ｐのような凝集惹起剤を添加しない場合にもすでに血小
板は変形し偽足をのばし、スプレッディングして付着し
たが、抗ＧｐIIb/IIIa抗体の存在下では、この様な変形
が見られず血小板の元の形が保たれたまま付着していた
（粘着）。ＡＤＰを添加した場合、抗ＧｐIIb/IIIa抗体
の非存在下では凝集塊が観察されるが、抗ＧｐIIb/IIIa
抗体の存在下では凝集塊が全く観察されず、血小板同士
が互いにくっつくことなく、１個づつでコラ−ゲンプレ
−トに付着していた（粘着）。なお、ＡＤＰの添加によ
り抗ＧｐIIb/IIIa抗体の存在下でもわずかなスプレッデ
ィングなどの若干の形態の変化が見られるが、その変化
は抗ＧｐIIb/IIIa抗体の非存在下に比べて非常に小さい
ものであった。これらの走査電顕による結果から、抗Ｇ
ｐIIb/IIIa抗体存在下でみられるＡＤＰ濃度依存性の付
着は血小板粘着を反映することを再確認した。
での血小板のコラ−ゲンへの付着状態を走査電顕により
観察すると、抗ＧｐIIb/IIIa抗体の非存在下では、ＡＤ
Ｐのような凝集惹起剤を添加しない場合にもすでに血小
板は変形し偽足をのばし、スプレッディングして付着し
たが、抗ＧｐIIb/IIIa抗体の存在下では、この様な変形
が見られず血小板の元の形が保たれたまま付着していた
（粘着）。ＡＤＰを添加した場合、抗ＧｐIIb/IIIa抗体
の非存在下では凝集塊が観察されるが、抗ＧｐIIb/IIIa
抗体の存在下では凝集塊が全く観察されず、血小板同士
が互いにくっつくことなく、１個づつでコラ−ゲンプレ
−トに付着していた（粘着）。なお、ＡＤＰの添加によ
り抗ＧｐIIb/IIIa抗体の存在下でもわずかなスプレッデ
ィングなどの若干の形態の変化が見られるが、その変化
は抗ＧｐIIb/IIIa抗体の非存在下に比べて非常に小さい
ものであった。これらの走査電顕による結果から、抗Ｇ
ｐIIb/IIIa抗体存在下でみられるＡＤＰ濃度依存性の付
着は血小板粘着を反映することを再確認した。
【００１６】実施例２ 抗ＧｐIIb/IIIa抗体存在下でのＡＤＰ濃度依存性の血小
板粘着に対するプロスタグランジンＩ2 （ＰＧＩ2 ）お
よびベラプロストナトリウム（ベラプロスト）の抑制作
用： Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＧＩ2 およびベラプロスト（安定
化ＰＧＩ2 誘導体）の様な血小板凝集抑制剤のＡＤＰに
よる血小板粘着に対する効果を検討した。このとき、Ｐ
ＧＩ2 、およびベラプロストによる処理は、血小板浮遊
液に抗体添加５分後から１０分間とし、以下は実施例１
の方法に従った。その結果を図５に示す。図５において
（Ａ）はＰＧＩ2 を、（Ｂ）はベラプロストの効果をそ
れぞれ示し、各点は３回の実験の平均値を示す。統計処
理は分散分析、あるいはｐａｉｒｅｄ−ｔ検定により、
薬物処理しないＡＤＰ刺激のみの血小板粘着と比較して
有意差を求めた。図５から明らかなように、ＰＧＩ2 、
ベラプロストともに濃度依存性に血小板の粘着を抑制し
た。ゆえに、この粘着能測定系でＰＧＩ2 のような血小
板凝集抑制剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでの血小板粘着に対す
る効果が検討できることが明らかとなった。
板粘着に対するプロスタグランジンＩ2 （ＰＧＩ2 ）お
よびベラプロストナトリウム（ベラプロスト）の抑制作
用： Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＧＩ2 およびベラプロスト（安定
化ＰＧＩ2 誘導体）の様な血小板凝集抑制剤のＡＤＰに
よる血小板粘着に対する効果を検討した。このとき、Ｐ
ＧＩ2 、およびベラプロストによる処理は、血小板浮遊
液に抗体添加５分後から１０分間とし、以下は実施例１
の方法に従った。その結果を図５に示す。図５において
（Ａ）はＰＧＩ2 を、（Ｂ）はベラプロストの効果をそ
れぞれ示し、各点は３回の実験の平均値を示す。統計処
理は分散分析、あるいはｐａｉｒｅｄ−ｔ検定により、
薬物処理しないＡＤＰ刺激のみの血小板粘着と比較して
有意差を求めた。図５から明らかなように、ＰＧＩ2 、
ベラプロストともに濃度依存性に血小板の粘着を抑制し
た。ゆえに、この粘着能測定系でＰＧＩ2 のような血小
板凝集抑制剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでの血小板粘着に対す
る効果が検討できることが明らかとなった。
【００１７】実施例３ ヒトｅｘ ｖｉｖｏ試験への応用： ８人の健常人ボランティアにベラプロスト４０μｇを単
回投与し、投与前、投与１、３、６、および８時間後に
採血し、実施例１の方法に従って血小板粘着能の経時変
化を検討した。その結果を図６に示す。図６において
（Ａ）はベラプロスト投与群、（Ｂ）は偽薬投与群であ
り、各点はそれぞれ８例の平均値である。統計処理は分
散分析、あるいはｐａｉｒｅｄ−ｔ検定により、投与前
値と比較して有意差を求めた。図６に示すように、健常
人のベラプロスト投与群８例において投与前に比べ、有
意に粘着能が抑制された。同様に偽薬投与群について検
討したところ、投与前との有意な差は認められなかっ
た。また、ベラプロスト投与群と偽薬投与群の間にも有
意差が認められた。本測定系は多血小板血漿を用いてお
り、この様な臨床薬理試験にも応用可能であった。
回投与し、投与前、投与１、３、６、および８時間後に
採血し、実施例１の方法に従って血小板粘着能の経時変
化を検討した。その結果を図６に示す。図６において
（Ａ）はベラプロスト投与群、（Ｂ）は偽薬投与群であ
り、各点はそれぞれ８例の平均値である。統計処理は分
散分析、あるいはｐａｉｒｅｄ−ｔ検定により、投与前
値と比較して有意差を求めた。図６に示すように、健常
人のベラプロスト投与群８例において投与前に比べ、有
意に粘着能が抑制された。同様に偽薬投与群について検
討したところ、投与前との有意な差は認められなかっ
た。また、ベラプロスト投与群と偽薬投与群の間にも有
意差が認められた。本測定系は多血小板血漿を用いてお
り、この様な臨床薬理試験にも応用可能であった。
【００１８】実施例４ 血球計数装置により血小板粘着量を直接的に測定する方
法： これまでに述べたようなコラーゲンプレートへの粘着量
の測定は次のように行なうこともできる。すなわち、抗
体処理した血小板をコラーゲンコートプレート上に添加
し、２０分間静置後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ
（−）３回で洗浄する操作までは、実施例１と共通に行
うが、洗浄後、ＥＤＴＡやＥＧＴＡなどのＣａ2+キレ−
ト剤、トリプシンやコラゲナ−ゼなどの蛋白分解酵素、
またＳＤＳ、Tween 20、ジギトニンやトリトンなどの界
面活性剤と室温で反応させて反応を止め、希釈し血球計
数装置（コ−ルタ−カウンタ−など）により数を測定し
て血小板の回収効果について比較検討を行なった。これ
らのなかで０．０１％のＳＤＳを用いた時にほぼ定量的
に回収されることを見出した。また、この方法において
ＡＤＰ刺激による血小板粘着量の変化を検討した。その
結果を図７に示す。図７に示すようにＡＤＰの濃度依存
的に粘着量が増加した。
法： これまでに述べたようなコラーゲンプレートへの粘着量
の測定は次のように行なうこともできる。すなわち、抗
体処理した血小板をコラーゲンコートプレート上に添加
し、２０分間静置後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ
（−）３回で洗浄する操作までは、実施例１と共通に行
うが、洗浄後、ＥＤＴＡやＥＧＴＡなどのＣａ2+キレ−
ト剤、トリプシンやコラゲナ−ゼなどの蛋白分解酵素、
またＳＤＳ、Tween 20、ジギトニンやトリトンなどの界
面活性剤と室温で反応させて反応を止め、希釈し血球計
数装置（コ−ルタ−カウンタ−など）により数を測定し
て血小板の回収効果について比較検討を行なった。これ
らのなかで０．０１％のＳＤＳを用いた時にほぼ定量的
に回収されることを見出した。また、この方法において
ＡＤＰ刺激による血小板粘着量の変化を検討した。その
結果を図７に示す。図７に示すようにＡＤＰの濃度依存
的に粘着量が増加した。
【００１９】
【発明の効果】本発明の血小板粘着測定法は、多血小板
血漿を用いるので、in vitroのみならずex vivo での試
験を行なうことができる。さらには、臨床試験などにも
応用可能であるほか、厳密な意味での血小板粘着だけを
測定しているので、血小板粘着が関与するような病態の
解明や薬物の開発、評価に有用である。また、これまで
に行なわれてきた血小板粘着のメカニズムの解析は、洗
浄血小板を用いて行なわれており、生体とかけ離れたメ
カニズムを論じざるおえなかったが、本発明のように多
血小板血漿をもちいることで生体により近い粘着反応の
メカニズムの解析が期待できる。
血漿を用いるので、in vitroのみならずex vivo での試
験を行なうことができる。さらには、臨床試験などにも
応用可能であるほか、厳密な意味での血小板粘着だけを
測定しているので、血小板粘着が関与するような病態の
解明や薬物の開発、評価に有用である。また、これまで
に行なわれてきた血小板粘着のメカニズムの解析は、洗
浄血小板を用いて行なわれており、生体とかけ離れたメ
カニズムを論じざるおえなかったが、本発明のように多
血小板血漿をもちいることで生体により近い粘着反応の
メカニズムの解析が期待できる。
【図１】抗ＧｐIIb/IIIa抗体濃度の血小板付着に及ぼす
影響を示すものである。
影響を示すものである。
【図２】光学凝集計により測定した抗ＧｐIIb/IIIa抗体
（１０μｇ／ｍｌ）の血小板凝集抑制作用を示すもので
あり、（Ａ）は抗体非存在下、（Ｂ）は抗体存在下でＡ
ＤＰ１０μＭ添加によりおこる血小板凝集を示す。
（１０μｇ／ｍｌ）の血小板凝集抑制作用を示すもので
あり、（Ａ）は抗体非存在下、（Ｂ）は抗体存在下でＡ
ＤＰ１０μＭ添加によりおこる血小板凝集を示す。
【図３】抗ＧｐIIb/IIIa抗体処理血小板の粘着に対する
ＡＤＰ刺激の影響を示すものである。
ＡＤＰ刺激の影響を示すものである。
【図４】抗ＧｐIIb/IIIa抗体処理血小板の粘着の時間経
過を示すものである。
過を示すものである。
【図５】抗ＧｐIIb/IIIa抗体処理血小板のＡＤＰ刺激に
よる血小板粘着に対する血小板凝集抑制剤の効果を示す
ものであり、（Ａ）はＰＧＩ2を、（Ｂ）はベラプロス
トの効果をそれぞれ示す。
よる血小板粘着に対する血小板凝集抑制剤の効果を示す
ものであり、（Ａ）はＰＧＩ2を、（Ｂ）はベラプロス
トの効果をそれぞれ示す。
【図６】健常人でのベラプロスト（４０μｇ）単回投与
による血小板粘着能の経時変化（Ｅｘ ｖｉｖｏ）を示
すものであり、（Ａ）はベラプロスト投与群、（Ｂ）は
偽薬投与群である。
による血小板粘着能の経時変化（Ｅｘ ｖｉｖｏ）を示
すものであり、（Ａ）はベラプロスト投与群、（Ｂ）は
偽薬投与群である。
【図７】抗ＧｐIIb/IIIa抗体処理血小板粘着のＡＤＰ刺
激濃度による粘着血小板数の変化（コールターカウンタ
ーによる）を示すものである。
激濃度による粘着血小板数の変化（コールターカウンタ
ーによる）を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ (56)参考文献 特開 昭58−37536（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−131399（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／178（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/52 G01N 33/58 - 33/98 G01N 33/53
Claims (4)
- 【請求項１】 血小板粘着能を測定する際に、多血小板
血漿を抗ＧｐIIb/IIIa抗体で処理することを特徴とする
血小板粘着能測定法。 - 【請求項２】 抗ＧｐIIb/IIIa抗体および血小板凝集惹
起剤で処理することを特徴とする請求項１記載の血小板
粘着能測定法。 - 【請求項３】血小板凝集惹起剤がＡＤＰまたはＴＰＡで
あることを特徴とする請求項２記載の血小板粘着能測定
法。 - 【請求項４】抗GpIIb/IIIa抗体存在下で粘着した血小板
を染色し、血小板粘着量を画像解析装置を用いて定量化
することを特徴とする請求項１記載の血小板粘着能測定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03002033A JP3102038B2 (ja) | 1991-01-11 | 1991-01-11 | 血小板粘着能測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03002033A JP3102038B2 (ja) | 1991-01-11 | 1991-01-11 | 血小板粘着能測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04235348A JPH04235348A (ja) | 1992-08-24 |
| JP3102038B2 true JP3102038B2 (ja) | 2000-10-23 |
Family
ID=11518021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03002033A Expired - Fee Related JP3102038B2 (ja) | 1991-01-11 | 1991-01-11 | 血小板粘着能測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3102038B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10013377A1 (de) * | 2000-03-17 | 2001-09-20 | Dade Behring Marburg Gmbh | Induzierte Aggregation und Agglutination von Plättchen |
-
1991
- 1991-01-11 JP JP03002033A patent/JP3102038B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04235348A (ja) | 1992-08-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |