JP3057093B2 - 細胞傷害防御能測定法 - Google Patents
細胞傷害防御能測定法Info
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- JP3057093B2 JP3057093B2 JP02319704A JP31970490A JP3057093B2 JP 3057093 B2 JP3057093 B2 JP 3057093B2 JP 02319704 A JP02319704 A JP 02319704A JP 31970490 A JP31970490 A JP 31970490A JP 3057093 B2 JP3057093 B2 JP 3057093B2
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- Japan
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- thrombomodulin
- endothelial cells
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血管内皮細胞傷害時に損傷細胞から遊離す
るトロンボモジュリンを測定することによって血管内皮
細胞傷害に対する物質の防除能を試験管内にて測定する
方法に関する。
るトロンボモジュリンを測定することによって血管内皮
細胞傷害に対する物質の防除能を試験管内にて測定する
方法に関する。
（従来の技術） 高度経済社会において近年の食生活の変化、複雑な社
会変化に伴い心筋梗塞や動脈硬化等の血管系のいわるる
成人病疾患が増加の一途をたどっている。これらの疾患
は血管の病変を伴い、その病変は血管内皮細胞の傷害に
起因することが多い。
会変化に伴い心筋梗塞や動脈硬化等の血管系のいわるる
成人病疾患が増加の一途をたどっている。これらの疾患
は血管の病変を伴い、その病変は血管内皮細胞の傷害に
起因することが多い。
トロンボモジュリンは血管内皮細胞表面に分布する膜
蛋白質であるが、トロンビンと結合して複合体を形成す
ることによりプロテインＣを著しく活性化させて抗血栓
作用を発揮する。一方、トロンボモジュリンは血中にも
検出されるが、その由来は傷害を受けた血管内皮細胞で
あると考えられている。
蛋白質であるが、トロンビンと結合して複合体を形成す
ることによりプロテインＣを著しく活性化させて抗血栓
作用を発揮する。一方、トロンボモジュリンは血中にも
検出されるが、その由来は傷害を受けた血管内皮細胞で
あると考えられている。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、傷害された血管内皮細胞より遊離す
るトロンボモジュリンを測定することによって、心筋梗
塞や動脈硬化等の血管系疾患の予防、治療を目的とする
薬物の血管内皮細胞傷害防御能を試験管内にて測定する
簡便な方法を提供することにある。
るトロンボモジュリンを測定することによって、心筋梗
塞や動脈硬化等の血管系疾患の予防、治療を目的とする
薬物の血管内皮細胞傷害防御能を試験管内にて測定する
簡便な方法を提供することにある。
（問題点を解決するための手段） 細胞傷害防御活性を測定するための細胞傷害の検出系
としては、クロムリリース法、乳酸デヒドロゲナーゼ遊
離法、フラ２遊離法、プロスタサイクリン産生制御法等
があるが、短時間で多くの試料を処理でき、簡便で且つ
安全な方法は未だ確立されていない。
としては、クロムリリース法、乳酸デヒドロゲナーゼ遊
離法、フラ２遊離法、プロスタサイクリン産生制御法等
があるが、短時間で多くの試料を処理でき、簡便で且つ
安全な方法は未だ確立されていない。
本発明者は、試験管内の試験において、血管内皮細胞
が細胞傷害性物質によって傷害を受けた時、その傷害の
程度に対応してトロンボモジュリンが遊離されることを
明らかにし、このトロンボモジュリンを量的指標として
血管内皮細胞の傷害を防御する薬剤を簡便にスクリーニ
ングする新規な本発明測定法を見出した。以下に本発明
方法を詳細に説明する。
が細胞傷害性物質によって傷害を受けた時、その傷害の
程度に対応してトロンボモジュリンが遊離されることを
明らかにし、このトロンボモジュリンを量的指標として
血管内皮細胞の傷害を防御する薬剤を簡便にスクリーニ
ングする新規な本発明測定法を見出した。以下に本発明
方法を詳細に説明する。
本発明は、培養した動物由来の血管内皮細胞に細胞傷
害性物質を加え、傷害によって遊離してくるトロンボモ
ジュリンを測定する系において、被検薬を共存させるこ
とにより被検薬の細胞傷害防御能を試験管内にて測定す
る方法である。
害性物質を加え、傷害によって遊離してくるトロンボモ
ジュリンを測定する系において、被検薬を共存させるこ
とにより被検薬の細胞傷害防御能を試験管内にて測定す
る方法である。
本発明で用いる血管内皮細胞は、いかなる動物の血管
内皮細胞でも使用可能であり、例えばヒト、ウサギ、モ
ルモット、ラット、マウス、ハムスター、サル、ウシ、
ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ等の培養可能な
血管内皮細胞を用いることができる。血管内皮細胞の培
養については、例えば、不必須アミノ酸や塩類を加えた
イーグルの最少必須培地（MEM）にウシ胎児血清を添加
した培地を用いる培養法など当該分野で通常行われてい
る方法を利用できる。
内皮細胞でも使用可能であり、例えばヒト、ウサギ、モ
ルモット、ラット、マウス、ハムスター、サル、ウシ、
ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ等の培養可能な
血管内皮細胞を用いることができる。血管内皮細胞の培
養については、例えば、不必須アミノ酸や塩類を加えた
イーグルの最少必須培地（MEM）にウシ胎児血清を添加
した培地を用いる培養法など当該分野で通常行われてい
る方法を利用できる。
血管内皮細胞に対する細胞傷害性物質としては、過酸
化水素、ｔ−ブチルハイドロペルオキシド、クメンハイ
ドロペルオキシド等の過酸化物、アラキドン酸、プロス
タグランジンジンA2、PAF等の通常知られている細胞傷
害性物質を用いることができる。上記以外にも内皮細胞
傷害性を有する物質であればいかなる物質でも利用可能
である。
化水素、ｔ−ブチルハイドロペルオキシド、クメンハイ
ドロペルオキシド等の過酸化物、アラキドン酸、プロス
タグランジンジンA2、PAF等の通常知られている細胞傷
害性物質を用いることができる。上記以外にも内皮細胞
傷害性を有する物質であればいかなる物質でも利用可能
である。
傷害を受けた血管内皮細胞から遊離してくるトロンボ
モジュリン量の測定は、通常行われている一般的な方法
でよく、簡便でかつ定量的な測定法の一つとして、酵素
免疫法（EIA）が挙げられる。酵素免疫法とは、抗体に
標識として西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を結合
し、この標識抗体を利用してそれら抗原の検出を行う方
法であり、特異性が高く微量定量可能な方法である。
又、ラジオアイソトープ標識を用いる方法等も挙げられ
る。
モジュリン量の測定は、通常行われている一般的な方法
でよく、簡便でかつ定量的な測定法の一つとして、酵素
免疫法（EIA）が挙げられる。酵素免疫法とは、抗体に
標識として西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を結合
し、この標識抗体を利用してそれら抗原の検出を行う方
法であり、特異性が高く微量定量可能な方法である。
又、ラジオアイソトープ標識を用いる方法等も挙げられ
る。
（実施例） （１）血管内皮細胞の培養 常法に従ってウシ腹大動脈より酵素法にて血管内皮細
胞を得た。この細胞はフォンウィルブランド因子、アン
ジオテンシン変換酵素活性を有していることによって血
管内皮細胞であることを確認した。培養はウシ胎児血清
を含むMEM−Earleを用いて行った。
胞を得た。この細胞はフォンウィルブランド因子、アン
ジオテンシン変換酵素活性を有していることによって血
管内皮細胞であることを確認した。培養はウシ胎児血清
を含むMEM−Earleを用いて行った。
（２）細胞傷害の測定 飽和状態に達した血管内皮細胞を３回リン酸緩衝生理
食塩水（PBS）で洗浄し、細胞傷害性物質を含むメディ
ウム（ASF−301,25mMZnS4を含む）1mlを加え６時間培養
を行った。メディウムを回収し800×ｇで５分間遠心し
て上清を得、この試料中に含まれるトロンボモジュリン
抗原量を酵素免疫法で測定した。
食塩水（PBS）で洗浄し、細胞傷害性物質を含むメディ
ウム（ASF−301,25mMZnS4を含む）1mlを加え６時間培養
を行った。メディウムを回収し800×ｇで５分間遠心し
て上清を得、この試料中に含まれるトロンボモジュリン
抗原量を酵素免疫法で測定した。
（３）トロンボモジュリンの定量 ウシ肺よりトロンビンのアフィニティークロマトグラ
フィーにて精製したトロンボモジュリンをウサギにフロ
インドの完全アジュバントとともに用いて免疫し抗血清
を得た。抗体を精製し、これにヒンジ法にて西洋ワサビ
ペルオキシダーゼを結合させた。この酵素抗体複合体及
び抗体を用いたサンドイッチ法にて試料中のトロンボモ
ジュリンを定量した。尚、得られた抗体は免疫電気泳動
で精製トロンボモジュリンとのみを沈降線を示し、トロ
ンボモジュリンの活性抑制作用を有することを確認し
た。
フィーにて精製したトロンボモジュリンをウサギにフロ
インドの完全アジュバントとともに用いて免疫し抗血清
を得た。抗体を精製し、これにヒンジ法にて西洋ワサビ
ペルオキシダーゼを結合させた。この酵素抗体複合体及
び抗体を用いたサンドイッチ法にて試料中のトロンボモ
ジュリンを定量した。尚、得られた抗体は免疫電気泳動
で精製トロンボモジュリンとのみを沈降線を示し、トロ
ンボモジュリンの活性抑制作用を有することを確認し
た。
（作用） （１）細胞傷害性物質による血管内皮細胞からのトロン
ボモジュリンの遊離 細胞傷害性物質を加えずに血管内皮細胞のみを培養し
た場合（対照）と細胞傷害性物質として1mMの過酸化水
素を添加して培養した場合の結果を第１表に示す。
ボモジュリンの遊離 細胞傷害性物質を加えずに血管内皮細胞のみを培養し
た場合（対照）と細胞傷害性物質として1mMの過酸化水
素を添加して培養した場合の結果を第１表に示す。
尚、トロンボモジュリン遊離量は１×106細胞当りのn
gで示した。
gで示した。
第１表に示した結果及びこのアッセイ系の測定感度を
考えて、６時間後におけるトロンボモジュリン遊離量に
より被検薬の細胞傷害防御活性を測定することとした。
考えて、６時間後におけるトロンボモジュリン遊離量に
より被検薬の細胞傷害防御活性を測定することとした。
又、他の細胞傷害性物質を用いて行った結果の一例を
第２表に示す。尚、トロンボモジュリン遊離量は対照を
100％としたときのパーセンテージで表した。
第２表に示す。尚、トロンボモジュリン遊離量は対照を
100％としたときのパーセンテージで表した。
第２表に示したように、過酸化水素と同様にｔ−ブチ
ルハイドロペルオキシド、クメンハイドロペルオキシド
等の過酸化物、アラキドン酸、プロスタグランジンA2、
PAF等の通常知られている細胞傷害性物質によっても、
トロンボモジュリン遊離は増大することにより、本発明
方法における細胞傷害性物質として用いることができる
ことが明らかである。
ルハイドロペルオキシド、クメンハイドロペルオキシド
等の過酸化物、アラキドン酸、プロスタグランジンA2、
PAF等の通常知られている細胞傷害性物質によっても、
トロンボモジュリン遊離は増大することにより、本発明
方法における細胞傷害性物質として用いることができる
ことが明らかである。
また結果には示さなかったが、リポポリサッカライド
等のエンドトキシンは単独ではトロンボモジュリンを遊
離させなかったが、メディウム中にウシ、ウサギ等の血
漿を10％添加することにより、トロンボモジュリンの遊
離は促進された。
等のエンドトキシンは単独ではトロンボモジュリンを遊
離させなかったが、メディウム中にウシ、ウサギ等の血
漿を10％添加することにより、トロンボモジュリンの遊
離は促進された。
（２）細胞傷害防御活性の測定 前述の血管内皮細胞傷害の試験系を用いて、細胞傷害
に対する防御物質（被検薬）の活性測定を行った。細胞
傷害性物質として1mMの過酸化水素を用い、カタラーゼ
及びグルタチオンの細胞傷害防御活性を測定した。結果
の一例を第３表に示す。
に対する防御物質（被検薬）の活性測定を行った。細胞
傷害性物質として1mMの過酸化水素を用い、カタラーゼ
及びグルタチオンの細胞傷害防御活性を測定した。結果
の一例を第３表に示す。
（効果） 第３表の結果から明らかなように、本発明測定法によ
り被検薬の血管内皮細胞傷害防御活性を定量的に測定で
きる。血管内皮細胞傷害に対する防御物質をスクリーニ
ングするための細胞傷害試験系としては、クロムリリー
ス法、乳酸デヒドロゲナーゼ遊離法、フラ２遊離法、プ
ロスタサイクリン産生抑制法等が挙げられ、これらのう
ち最も広く用いられているのはクロムリリース法であ
る。細胞傷害における過酸化水素に対する感度を、本発
明測定法とクロムリリース法で比較した結果、両法は過
酸化水素に対してほぼ同等の感度を示した。クロムリリ
ース法は極めて危険な51Crを使用しなくてはならず特別
な施設を必要とするのに対し、本発明測定法は安全且つ
簡便であり、操作はほとんど機械化可能であるため多く
の検体が短時間で処理できる。
り被検薬の血管内皮細胞傷害防御活性を定量的に測定で
きる。血管内皮細胞傷害に対する防御物質をスクリーニ
ングするための細胞傷害試験系としては、クロムリリー
ス法、乳酸デヒドロゲナーゼ遊離法、フラ２遊離法、プ
ロスタサイクリン産生抑制法等が挙げられ、これらのう
ち最も広く用いられているのはクロムリリース法であ
る。細胞傷害における過酸化水素に対する感度を、本発
明測定法とクロムリリース法で比較した結果、両法は過
酸化水素に対してほぼ同等の感度を示した。クロムリリ
ース法は極めて危険な51Crを使用しなくてはならず特別
な施設を必要とするのに対し、本発明測定法は安全且つ
簡便であり、操作はほとんど機械化可能であるため多く
の検体が短時間で処理できる。
本発明測定法、即ち試験管内において血管内皮細胞傷
害性物質により血管内皮細胞から遊離するトロンボモジ
ュリンを測定することによって薬物の細胞傷害防御能を
測定する方法は、血管内皮の傷害による各種血管傷害、
例えば、動脈硬化症、脳動脈硬化症、虚血性心疾患、血
管炎並びに汎発性血管内凝固症候群（DIC）、脳血栓、
脳出血後遺症、頭部外傷後遺症、腎静脈血栓症、血栓性
静脈炎、閉塞性動脈硬化症等の血栓性疾患などの血管傷
害性の各種疾患を治療又は予防する薬物のスクリーニン
グ試験法等として有用である。
害性物質により血管内皮細胞から遊離するトロンボモジ
ュリンを測定することによって薬物の細胞傷害防御能を
測定する方法は、血管内皮の傷害による各種血管傷害、
例えば、動脈硬化症、脳動脈硬化症、虚血性心疾患、血
管炎並びに汎発性血管内凝固症候群（DIC）、脳血栓、
脳出血後遺症、頭部外傷後遺症、腎静脈血栓症、血栓性
静脈炎、閉塞性動脈硬化症等の血栓性疾患などの血管傷
害性の各種疾患を治療又は予防する薬物のスクリーニン
グ試験法等として有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 3/00 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (1)
- 【請求項１】培養した動物由来の血管内皮細胞に細胞傷
害物質を加え、傷害時に遊離するトロンボモジュリンを
測定する系において、被検物質を共存させることによっ
て該被検物質の血管内皮細胞傷害防御能を試験管内にて
測定する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26200790 | 1990-09-30 | ||
| JP2-262007 | 1990-09-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04218391A JPH04218391A (ja) | 1992-08-07 |
| JP3057093B2 true JP3057093B2 (ja) | 2000-06-26 |
Family
ID=17369720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02319704A Expired - Fee Related JP3057093B2 (ja) | 1990-09-30 | 1990-11-21 | 細胞傷害防御能測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3057093B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2263063C (en) * | 1999-02-26 | 2004-08-10 | Skye Pharmatech Incorporated | Method for diagnosing and distinguishing stroke and diagnostic devices for use therein |
-
1990
- 1990-11-21 JP JP02319704A patent/JP3057093B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 臨床病理，３７（３），２６６−２７１（１９８９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04218391A (ja) | 1992-08-07 |
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Legal Events
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