JP3046606B2 - Synthetic medium for animal cells - Google Patents
Synthetic medium for animal cellsInfo
- Publication number
- JP3046606B2 JP3046606B2 JP2064057A JP6405790A JP3046606B2 JP 3046606 B2 JP3046606 B2 JP 3046606B2 JP 2064057 A JP2064057 A JP 2064057A JP 6405790 A JP6405790 A JP 6405790A JP 3046606 B2 JP3046606 B2 JP 3046606B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- cells
- animal cells
- serum
- synthetic medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、動物細胞を用いた生理活性物質の生産に使
用される動物細胞用合成培地に関するものであり、詳し
くは基礎培地としてのアルファMEM培地に培養添加物を
加えることにより、動物血清の添加量を少なくし血清濃
度を低減することができる動物細胞用合成培地に関する
ものである。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a synthetic medium for animal cells used for the production of a physiologically active substance using animal cells, and more specifically, to alpha MEM as a basal medium. The present invention relates to a synthetic medium for animal cells that can reduce the amount of animal serum to be added and reduce the serum concentration by adding a culture additive to the medium.
（従来の技術） 近年、遺伝子工学の急速な進歩と普及により、種々の
生理活性物質を動物細胞を用いて生体外で大量に生産す
ることが可能となった。動物細胞を用いた生理活性物質
の生産を目的とする場合には、目的とする遺伝子を動物
細胞に導入し、増殖細胞として株化させるのが一般的で
ある。そしてこの細胞を用いて、経験上から適当な濃度
の血清、一般には成牛、牛新生児または牛胎児血清（FC
S:通常５〜10％濃度）を添加した合成培地、例えばアル
ファMEM培地、ダルベッコ変法イーグルMEM培地、ハムＦ
−12培地、或はこれらの混合物を基本としたものなどが
用いられる。そして既知の動物細胞としては、CHO-K1
（ATCC CCL61）、BHK21（ATCC CCL10）、HeLa（ATCC CC
L2）、COS−７（ATCC CRL1651）、Vero（ATCC CCL81）
などがある。(Prior Art) In recent years, rapid progress and spread of genetic engineering have made it possible to produce various physiologically active substances in large quantities in vitro using animal cells. When the purpose is to produce a physiologically active substance using animal cells, it is common to introduce the target gene into animal cells and establish them as proliferating cells. The cells are used to determine the appropriate concentration of serum from experience, typically adult, newborn, or fetal calf serum (FC
S: usually 5 to 10% concentration), for example, alpha MEM medium, Dulbecco's modified Eagle MEM medium, Ham F
A -12 medium or a mixture based on these media is used. And as a known animal cell, CHO-K1
(ATCC CCL61), BHK21 (ATCC CCL10), HeLa (ATCC CC
L2), COS-7 (ATCC CRL1651), Vero (ATCC CCL81)
and so on.
（発明が解決しようとする課題） 上記のような血清添加培地を用いて培養液を調製し、
この培地を用いて生理活性物質産生細胞を増殖させよう
とする場合には、細胞の増殖はもっぱら血清に依存して
いる。そして血清を添加し培養して得られた培養液か
ら、産生された生理活性物質を分離、精製する工程が繁
雑となり、多くの労力と経費が必要とされる。また血清
は、ロットごとに品質が異なり、メーカーによっても品
質にばらつきがある。そして高価でもあり、さらに目的
とする生理活性物質産生細胞に適したものを選択する必
要がある。(Problem to be Solved by the Invention) A culture solution is prepared using the serum-containing medium as described above,
When the physiologically active substance-producing cells are to be grown using this medium, the cell growth depends exclusively on serum. Then, the step of separating and purifying the produced physiologically active substance from a culture solution obtained by adding and culturing serum becomes complicated, and much labor and cost are required. In addition, the quality of serum varies from lot to lot, and quality varies from manufacturer to manufacturer. It is also expensive, and it is necessary to select a cell suitable for the target bioactive substance producing cell.
本発明は上記の問題に鑑みてなされたものであり、そ
の目的は１％前後の低濃度の血清添加でも、従来は５〜
10％の血清濃度を添加しなければならなかった培地と比
較したとき、細胞の増殖や細胞の産生する生理活性物質
量が、同等かそれ以上の成績をあげることができる合成
培地を提供することである。The present invention has been made in view of the above-mentioned problem, and the object thereof is to add a serum at a low concentration of about 1% to a conventional concentration of 5 to 5%.
To provide a synthetic medium in which the growth of cells and the amount of biologically active substances produced by cells can be equal to or better than that of a medium to which 10% serum concentration had to be added. It is.
（課題を解決するための手段および作用） 本発明者らが種々研究した結果、従来から使用されて
いるアルファMEM培地に種々の物質を添加したり強化す
ることにより、上記の課題を達成することができた。(Means and Actions for Solving the Problems) As a result of various studies by the present inventors, the above-mentioned problems have been achieved by adding or enhancing various substances to conventionally used alpha MEM medium. Was completed.
即ち、本発明の要旨は「アスコルビン酸を含有してい
ないアルファMEM培地を基礎培地とし、これに硫酸第一
鉄、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、コハク酸、グル
タチオン及びプトレッシンが配合されていることを特徴
とする、動物細胞用合成培地」に存する。That is, the gist of the present invention is that an alpha-MEM medium containing no ascorbic acid is used as a basal medium, and ferrous sulfate, N-acetyl-D-glucosamine, succinic acid, glutathione, and putrescine are added to this. Characterized by "a synthetic medium for animal cells".
本発明による合成培地において、上記の硫酸第一鉄、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グコサミン、コハク酸、グルタチオ
ン及びプトレッシンは下記の第１表に示されている濃度
範囲で配合されているのが本発明の目的を達成する上で
効果的である。In the synthetic medium according to the present invention, the above ferrous sulfate,
N-acetyl-D-gucosamine, succinic acid, glutathione and putrescine are effective in achieving the object of the present invention when they are blended in the concentration ranges shown in Table 1 below.
さらに、アルファMEM培地組成のうち、ビタミン類で
ある塩化コリン1.0mg/lを、１〜20mg/lの範囲で、ｉ−
イノシトール濃度2.0mg/lを２〜40mg/lの範囲で増強
し、一方アスコルビン酸濃度50mg/lは、0mg/lに近づけ
るほどより効果的である。また、アルファMEM培地組成
に含まれない核酸物質であるヒポキサンチン濃度は0.1
〜20mg/lの範囲で、チミジン濃度は0.1〜4mg/lの範囲で
添加することが効果的であるが、用いられる細胞の特性
や目的によってはこれらの核酸物質を添加しなくてもよ
い。 Further, in the alpha MEM medium composition, 1.0 mg / l of choline chloride, which is a vitamin, was added to i-
Inositol concentrations of 2.0 mg / l are enhanced in the range of 2-40 mg / l, while ascorbic acid concentrations of 50 mg / l are more effective as approaching 0 mg / l. The concentration of hypoxanthine, a nucleic acid substance not included in the composition of the alpha MEM medium, was 0.1%.
It is effective to add thymidine in the range of 0.1 to 4 mg / l in the range of -20 mg / l, but these nucleic acid substances may not be added depending on the characteristics and purpose of the cells used.
本発明の合成培地を用いて培養することのできる動物
細胞としては、CHO-K1、BHK、HeLa、COS−７、Veroなど
の細胞が挙げられ、さらにこれらの細胞に、生理活性物
質の遺伝子を導入した細胞を挙げることができるが、特
にCHO細胞が好ましい。Animal cells that can be cultured using the synthetic medium of the present invention include cells such as CHO-K1, BHK, HeLa, COS-7, and Vero. Although the introduced cells can be mentioned, CHO cells are particularly preferable.
本発明の合成培地は、動物細胞の増殖や生理活性物質
の産生を促進させるものであり、この合成培地を通常使
用されている５％透析牛胎児血清を加えたアルファMEM
培地と比較した場合に、１％透析牛胎児血清と同等か、
またはそれ以上の効果がある。従来５％濃度のものが必
要であった牛胎児血清が、１％濃度に減らすことができ
るのは、大幅なコスト低減をもたらすことを意味してい
る。The synthetic medium of the present invention promotes the growth of animal cells and the production of physiologically active substances. This synthetic medium is prepared by adding alpha-MEM containing commonly used 5% dialyzed fetal bovine serum.
Is it equivalent to 1% dialyzed fetal bovine serum when compared to the medium,
Or more. Fetal calf serum, which previously required a 5% concentration, can be reduced to a 1% concentration, meaning significant cost savings.
以下実施例に基づいてさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
（実施例） 培地を評価する細胞として、CHO細胞の標準株であるC
HO-K1細胞とそのデヒドロ葉酸リダクターゼ（dhfr）遺
伝子欠損株であるDXB11(1)、dhfr遺伝子とヒト成長ホル
モン（hGH）遺伝子(2)を導入した遺伝子導入細胞を用い
た。遺伝子導入細胞は、SV-40ウイルスのプロモーター
につないだヒト成長ホルモン遺伝子を、CHO細胞にエレ
クトロポレーション法(3)により導入し、クローニング
を行い、ヒト成長ホルモン産生細胞株を樹立した。(Example) As a cell for evaluating the medium, C, a standard strain of CHO cells, was used.
HO-K1 cells and their transfected cells into which DXB11 (1) , a dehydrofolate reductase (dhfr) gene-deficient strain, and dhfr gene and human growth hormone (hGH) gene (2) were introduced, were used. The transgenic cells were transfected with the human growth hormone gene linked to the SV-40 virus promoter into CHO cells by electroporation (3) and cloned to establish a human growth hormone-producing cell line.
培地は、アルファMEM培地(4)と本発明の培地を用い、
細胞の培養には、コーニング社製12Wellのマルチウェル
プレートを使用した。まず5.0％透析牛胎児血清を含む
アルファMEM培地と、1.0％透析牛胎児血清を含むアルフ
ァMEM培地および本発明の培地をマルチウェルプレート1
Wellあたり1.0ml分注し、CHO-K1細胞とヒト成長ホルモ
ン産生細胞を各々１×104個植え込んだ。そして炭酸ガ
スインキュベーター（フォマー社製、５％炭酸ガス＋95
％空気、水蒸気飽和）で４日間培養した。到達細胞数
は、タタイ式血球計算盤により計算し、産生したヒト成
長ホルモンの定量は、RIA法であるファルマシアGH（フ
ァルマシア社）キットを用いて測定した。その結果を第
３表に示す。なお、本実施例に用いた本発明の培地の組
成を第２表に示す。The medium uses an alpha MEM medium (4) and the medium of the present invention,
For the cell culture, a 12-well multiwell plate manufactured by Corning was used. First, an alpha MEM medium containing 5.0% dialyzed fetal calf serum, an alpha MEM medium containing 1.0% dialyzed fetal bovine serum, and the medium of the present invention were placed in a multiwell plate 1
1.0 ml was dispensed per well, and 1 × 10 4 CHO-K1 cells and human growth hormone-producing cells were implanted. And a carbon dioxide incubator (Fomer 5% carbon dioxide +95
% Air, water vapor saturation) for 4 days. The number of cells reached was calculated using a Tatay-type hemocytometer, and the amount of human growth hormone produced was measured using a Pharmacia GH (Pharmacia) kit, which is an RIA method. Table 3 shows the results. Table 2 shows the composition of the medium of the present invention used in this example.
第３表に示すとおり1.0％透析牛胎児血清を含む本発
明の合成培地でのCHO-K1細胞においては、5.0％透析牛
胎児血清を含むアルファMEM培地での到達細胞数との比
較では、同等の成績が得られた。そしてヒト成長ホルモ
ン遺伝子を導入したヒト成長ホルモン産生形質転換株に
おいても、1.0％透析牛胎児血清を含む本発明の培地
は、到達細胞数、ヒト成長ホルモン（hGH）産生量とも
5.0％透析牛胎児血清を含むアルファMEM培地のそれを上
回る成績が得られた。 As shown in Table 3, in the CHO-K1 cells in the synthetic medium of the present invention containing 1.0% dialyzed fetal bovine serum, when compared to the number of cells reached in the alpha MEM medium containing 5.0% dialyzed fetal bovine serum, the results were equivalent. Was obtained. Even in a human growth hormone-producing transformant into which the human growth hormone gene has been introduced, the medium of the present invention containing 1.0% dialyzed fetal bovine serum can achieve both the number of cells reached and the amount of human growth hormone (hGH) produced.
The results were superior to those of alpha MEM medium containing 5.0% fetal calf serum.
（発明の効果） 本発明によれば、従来使用されている５〜10％の血清
濃度を添加したアルファMEM培地に比較して、わずか１
％前後の低濃度の血清添加でも、細胞の増殖や細胞の産
生する生理活性物質量が、同等かそれ以上の成績をあげ
ることができる。(Effects of the Invention) According to the present invention, compared to the conventionally used alpha MEM medium supplemented with a serum concentration of 5 to 10%, only 1
%, The cell proliferation and the amount of physiologically active substance produced by the cells can be equal or better.
従って産生された生理活性物質の分離、精製が容易と
なり、高価な血清を大量に添加する必要もなくなるので
実用上の価値は大なるものがある。Therefore, the produced physiologically active substance can be easily separated and purified, and there is no need to add a large amount of expensive serum.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横島 聡二 東京都豊島区巣鴨２丁目11番１号 日水 製薬株式会社内 (72)発明者 秦 淳一郎 東京都千代田区大手町２丁目６番２号 日本水産株式会社内 (72)発明者 可部野 昌子 東京都千代田区大手町２丁目６番２号 日本水産株式会社内 (72)発明者 山下 伸也 東京都千代田区大手町２丁目６番２号 日本水産株式会社内 (56)参考文献 バイオテクノロジー事典編集委員会編 「バイオテクノロジー事典（第１版第２ 刷）」（昭62−５−５）、シーエムシ ー、第1047−1049頁「無血清培地」の項 三井洋司監訳「動物細胞培養の実際」 （平２−２−28）、丸善、第15−39頁 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/10 C12N 5/06 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Soji Yokoshima 2-1-1-1, Sugamo, Toshima-ku, Tokyo Inside Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. (72) Inventor Junichiro Hata 2-6-1, Otemachi, Chiyoda-ku, Tokyo No. Nippon Fisheries Co., Ltd. (72) Inventor Masako Kabeno 2-62-2 Otemachi, Chiyoda-ku, Tokyo Nippon Fisheries Co., Ltd. No. Nihon Suisan Co., Ltd. (56) References Biotechnology Encyclopedia Editorial Board, “Biotechnology Encyclopedia (1st edition, 2nd printing)” (Showa 62-5-5), CMC, pp. 1047-1049, “None Serum culture, edited by Yoji Mitsui, "The Practice of Animal Cell Culture" (Hei 2-2-28), Maruzen, pp. 15-39 (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) C12N5 / 10 C12N 5/06 JICST file (JOIS)
Claims (2)
MEM培地を基礎培地とし、これに硫酸第一鉄、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン、コハク酸、グルタチオン及び
プトレッシンが配合されていることを特徴とする、動物
細胞用合成培地。(1) Alpha containing no ascorbic acid
A synthetic medium for animal cells, comprising a MEM medium as a basic medium, and ferrous sulfate, N-acetyl-D-glucosamine, succinic acid, glutathione, and putrescine.
れていることを特徴とする、請求項（１）に記載の動物
細胞用合成培地。2. The synthetic medium for animal cells according to claim 1, further comprising hypoxanthine and thymidine.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064057A JP3046606B2 (en) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | Synthetic medium for animal cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2064057A JP3046606B2 (en) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | Synthetic medium for animal cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03266981A JPH03266981A (en) | 1991-11-27 |
| JP3046606B2 true JP3046606B2 (en) | 2000-05-29 |
Family
ID=13247085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2064057A Expired - Fee Related JP3046606B2 (en) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | Synthetic medium for animal cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3046606B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105176916A (en) * | 2015-10-15 | 2015-12-23 | 南京三生生物技术有限公司 | Low-serum protein-free culture medium applicable to Vero cell growth and preparation method thereof |
| CN109988741B (en) * | 2019-04-10 | 2021-08-24 | 河南普诺易生物制品研究院有限公司 | Serum substitute for cell culture, preparation method thereof, serum substitute composition for cell culture and cell culture medium |
-
1990
- 1990-03-16 JP JP2064057A patent/JP3046606B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| バイオテクノロジー事典編集委員会編「バイオテクノロジー事典（第１版第２刷）」（昭６２−５−５）、シーエムシー、第１０４７−１０４９頁「無血清培地」の項 |
| 三井洋司監訳「動物細胞培養の実際」（平２−２−２８）、丸善、第１５−３９頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03266981A (en) | 1991-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5122469A (en) | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins | |
| Ebner et al. | Cultivation and properties of bovine mammary cell cultures | |
| US7759118B2 (en) | Proliferation of hepatocyte precursors | |
| US5063157A (en) | Serum-free culture medium for mammalian cells | |
| US5945337A (en) | Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium | |
| US5766951A (en) | Serum-free medium supporting growth and proliferation of normal bone marrow cells | |
| JPH08508891A (en) | Medium for long-term growth and development of cells | |
| US20080286862A1 (en) | Physiochemical Culture Conditions for Embryonic Stem Cells | |
| JPS60188062A (en) | Production of protein improved by using isotropic culture medium | |
| CN102317440A (en) | Improved culture medium additive and application method thereof | |
| Higgins et al. | Tungstate antagonism of molybdate in Aspergillus niger. | |
| CN105838675A (en) | Hematopoietic stem cell serum-free culture medium | |
| JP3046606B2 (en) | Synthetic medium for animal cells | |
| Eisenbarth et al. | Prostaglandin A1 inhibition of chondrosarcoma growth | |
| DE3711699C2 (en) | ||
| Shirai et al. | Continuous production of erythropoietin with immobilized animal cells | |
| Sun et al. | Selective growth of some rodent epithelial cells in a medium containing citrulline. | |
| Colucci-D'Amato et al. | Thyrotropin stimulates transcription from the ferritin heavy chain promoter | |
| Pessano et al. | Growth and differentiation of human and murine erythroleukemia cell lines in serum-free synthetic medium | |
| Lescoat et al. | Influence of ornithine on albumin synthesis by fetal and neonatal hepatocytes maintained in culture | |
| US4124448A (en) | Process for the large scale production of human growth hormone by serial secondary suspension culture | |
| Shiozaki et al. | Proliferation and differentiation of erythroleukemia cell line (ELM-I-1) in response to erythropoietin and interleukin 3 | |
| JP2749011B2 (en) | Cells that can be subcultured in serum-free medium and method for obtaining the same | |
| JP2990805B2 (en) | Serum-free medium, method for culturing animal cells, and method for producing heterologous protein | |
| JP3239446B2 (en) | Serum-free or low serum medium for cell culture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |