JP2971537B2 - 抗体の検出方法及び試験片 - Google Patents
抗体の検出方法及び試験片Info
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- JP2971537B2 JP2971537B2 JP2201860A JP20186090A JP2971537B2 JP 2971537 B2 JP2971537 B2 JP 2971537B2 JP 2201860 A JP2201860 A JP 2201860A JP 20186090 A JP20186090 A JP 20186090A JP 2971537 B2 JP2971537 B2 JP 2971537B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- electrophoresis
- antibody
- component
- htlv
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、被検試料中の抗体を検出する方法及び該方
法に用いられる試験片に関する。
法に用いられる試験片に関する。
［従来の技術］ ウェスタンブロット法（以下WB法ということがある）
は、抗原であるタンパク質をゲル電気泳動で分画した
後、電気泳動パターンを維持したまま分画されたタンパ
ク質をニトロセルロース膜のような担体上に転写し、次
いで抗体を反応させて担体上の抗原と結合した抗体を検
出し、被検試料中の抗体がどの抗原に特異的に反応した
かを調べる方法であり、感度が高いので感染症の血清学
的診断、作製した抗体の特異性の決定あるいは遺伝子工
学的に生産した産物の同定等のために広く用いられてい
る技術である。
は、抗原であるタンパク質をゲル電気泳動で分画した
後、電気泳動パターンを維持したまま分画されたタンパ
ク質をニトロセルロース膜のような担体上に転写し、次
いで抗体を反応させて担体上の抗原と結合した抗体を検
出し、被検試料中の抗体がどの抗原に特異的に反応した
かを調べる方法であり、感度が高いので感染症の血清学
的診断、作製した抗体の特異性の決定あるいは遺伝子工
学的に生産した産物の同定等のために広く用いられてい
る技術である。
例えば、後天性免疫不全症候群ウイルス（HIV）やヒ
ト成人Ｔ細胞白血病ウイルスＩ型（HTLV−Ｉ）に感染し
ているか否かをWB法を用いて調べられている。これらの
方法では、先ず、ウイルスをイオン性あるいは非イオン
性界面活性剤等で部分分解したものを抗原としてゲル電
気泳動にかける。ウイルスはコアタンパク質やエンベロ
ープタンパク質のような複数のタンパク質を含んでいる
ので、上記抗原は混合抗原であり、それぞれの抗原はそ
の分子量や電荷に基づいて電気泳動により分画される。
次いで、抗原の電気泳動パターンを維持したまま抗原を
ニトロセルロースフィルターのような担体上に転写し、
これと被検試料中の抗体とを反応させ、抗原と結合した
抗体を検出し、それによって特定の抗原に結合する抗体
の存否を調べる。ウイルスのどの成分抗原と結合する抗
体が試料中に存在するかを知ることは、偽陽性を排除し
て的確な診断を行なうために重要である。
ト成人Ｔ細胞白血病ウイルスＩ型（HTLV−Ｉ）に感染し
ているか否かをWB法を用いて調べられている。これらの
方法では、先ず、ウイルスをイオン性あるいは非イオン
性界面活性剤等で部分分解したものを抗原としてゲル電
気泳動にかける。ウイルスはコアタンパク質やエンベロ
ープタンパク質のような複数のタンパク質を含んでいる
ので、上記抗原は混合抗原であり、それぞれの抗原はそ
の分子量や電荷に基づいて電気泳動により分画される。
次いで、抗原の電気泳動パターンを維持したまま抗原を
ニトロセルロースフィルターのような担体上に転写し、
これと被検試料中の抗体とを反応させ、抗原と結合した
抗体を検出し、それによって特定の抗原に結合する抗体
の存否を調べる。ウイルスのどの成分抗原と結合する抗
体が試料中に存在するかを知ることは、偽陽性を排除し
て的確な診断を行なうために重要である。
従来のこのようなWB法では、混合抗原が電気泳動によ
り明確に分離される場合はよいが、２種以上の抗原の移
動度が近接しているために電気泳動のバンドがほとんど
重なってしまうような場合には、抗体がどちらの抗原と
結合しているのか判定に苦しむことになる。混合抗原中
のある成分抗原の量が他の抗原に比べて少ない場合も同
様である。例えば、HTLV−Ｉウイルスに感染しているか
否かの診断において、エンベロープ（env）タンパク質
の１つであるgp46は、診断上重要な抗原であるが、その
電気泳動の移動度がコアタンパク質であるP53の移動度
と近接しているため、電気泳動によってはP53と明瞭に
分画されない。従って、従来のWB法によってHTLV−Ｉウ
イルスの感染を調べる場合に、抗gp46抗体の存否を明瞭
に判定することが困難であり、ひいてはHTLV−Ｉウイル
スに感染しているか否かの判定も困難になっている。
り明確に分離される場合はよいが、２種以上の抗原の移
動度が近接しているために電気泳動のバンドがほとんど
重なってしまうような場合には、抗体がどちらの抗原と
結合しているのか判定に苦しむことになる。混合抗原中
のある成分抗原の量が他の抗原に比べて少ない場合も同
様である。例えば、HTLV−Ｉウイルスに感染しているか
否かの診断において、エンベロープ（env）タンパク質
の１つであるgp46は、診断上重要な抗原であるが、その
電気泳動の移動度がコアタンパク質であるP53の移動度
と近接しているため、電気泳動によってはP53と明瞭に
分画されない。従って、従来のWB法によってHTLV−Ｉウ
イルスの感染を調べる場合に、抗gp46抗体の存否を明瞭
に判定することが困難であり、ひいてはHTLV−Ｉウイル
スに感染しているか否かの判定も困難になっている。
［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明の目的は、混合抗原中の２以上の成分
抗原の電気泳動移動度が近接している場合又は混合抗原
中の少なくとも１つの成分抗原の量が他の抗原に比べて
少ない場合等であっても、そのような成分抗原に対して
特異的な抗体が被検試料中に存在するか否かを明確に知
ることができる抗体の検出方法及びそのための試験片を
提供することである。
抗原の電気泳動移動度が近接している場合又は混合抗原
中の少なくとも１つの成分抗原の量が他の抗原に比べて
少ない場合等であっても、そのような成分抗原に対して
特異的な抗体が被検試料中に存在するか否かを明確に知
ることができる抗体の検出方法及びそのための試験片を
提供することである。
［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、このような他の成
分抗原と電気泳動移動度が近接している抗原（以下、移
動度近接抗原ということがある）や量の少ない抗原（以
下、少量抗原ということがある）を精製濃縮したもの
を、電気泳動の途中で加えることにより上記問題点を解
決することができることを見出し本発明を完成した。
分抗原と電気泳動移動度が近接している抗原（以下、移
動度近接抗原ということがある）や量の少ない抗原（以
下、少量抗原ということがある）を精製濃縮したもの
を、電気泳動の途中で加えることにより上記問題点を解
決することができることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、混合抗原をゲル電気泳動にかけ
る工程と、混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲル
に加え、さらに電気泳動を続ける工程と、電気泳動パタ
ーンを維持したまま、電気泳動により分離された抗原を
担体に転写する工程と、担体上に転写された抗原と被検
試料中に含まれる、前記混合抗原に対する抗体とを反応
させる工程と、抗原と結合した抗体を検出する工程とを
含む、被検試料中の抗体の検出方法を提供する。
る工程と、混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲル
に加え、さらに電気泳動を続ける工程と、電気泳動パタ
ーンを維持したまま、電気泳動により分離された抗原を
担体に転写する工程と、担体上に転写された抗原と被検
試料中に含まれる、前記混合抗原に対する抗体とを反応
させる工程と、抗原と結合した抗体を検出する工程とを
含む、被検試料中の抗体の検出方法を提供する。
さらにまた、本発明は、混合抗原をゲル電気泳動にか
け、次いで混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲル
に加えてさらに電気泳動を続け、電気泳動パターンを維
持したまま電気泳動により分離された抗原を担体に転写
したものから成る、被検試料中の前記混合抗原に対する
抗体を検出するための試験片を提供する。
け、次いで混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲル
に加えてさらに電気泳動を続け、電気泳動パターンを維
持したまま電気泳動により分離された抗原を担体に転写
したものから成る、被検試料中の前記混合抗原に対する
抗体を検出するための試験片を提供する。
［発明の効果］ 本発明により、混合抗原中の２種以上の成分抗原の電
気泳動移動度が近接している場合又は混合抗原中の少な
くとも１つの成分抗原の量が他の抗原に比べて小さい場
合等であっても、そのような成分抗原に対して特異的な
抗体が被検試料中に存在するか否かを明確に知ることが
できる抗体の検出方法及びそのための試験片が提供され
た。本発明の方法によると、精製した移動度近接抗原や
少量抗原を、電気泳動の途中で別途ゲルに加えるので、
本来のバンドとは異なった位置に抗原のバンドが形成さ
れるので、他の抗原のバンドとほとんど重なってしまう
ことを防止することができ、また、精製濃縮した成分抗
原を別途加えるので、少量抗原であっても明確なバンド
が形成される。従って、本発明の方法によると、移動度
近接抗原や少量抗原に特異的な抗体も明確に検出するこ
とができる。
気泳動移動度が近接している場合又は混合抗原中の少な
くとも１つの成分抗原の量が他の抗原に比べて小さい場
合等であっても、そのような成分抗原に対して特異的な
抗体が被検試料中に存在するか否かを明確に知ることが
できる抗体の検出方法及びそのための試験片が提供され
た。本発明の方法によると、精製した移動度近接抗原や
少量抗原を、電気泳動の途中で別途ゲルに加えるので、
本来のバンドとは異なった位置に抗原のバンドが形成さ
れるので、他の抗原のバンドとほとんど重なってしまう
ことを防止することができ、また、精製濃縮した成分抗
原を別途加えるので、少量抗原であっても明確なバンド
が形成される。従って、本発明の方法によると、移動度
近接抗原や少量抗原に特異的な抗体も明確に検出するこ
とができる。
［発明の具体的説明］ 本発明の方法に供される混合抗原は、複数の成分抗原
を含むものであればいかなるものでもよく、例えば、HI
VやHTLV−１のようなウイルスを陰イオン性界面活性剤
（例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）あるいは非イ
オン性界面活性剤（例えばノニデットＰ−40（商品名）
及びトライトンＸ−100（商品名））で常法に基づき処
理したもの等を挙げることができる。
を含むものであればいかなるものでもよく、例えば、HI
VやHTLV−１のようなウイルスを陰イオン性界面活性剤
（例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）あるいは非イ
オン性界面活性剤（例えばノニデットＰ−40（商品名）
及びトライトンＸ−100（商品名））で常法に基づき処
理したもの等を挙げることができる。
混合抗原のゲル電気泳動は、従来のWB法と全く同様に
して行なうことができる。例えば、ラエムリの方法に基
づき、SDSで処理した後にポリアクリルアミドゲル中で
電気泳動させる（SDS−PAGE）ことにより行なうことが
できる。
して行なうことができる。例えば、ラエムリの方法に基
づき、SDSで処理した後にポリアクリルアミドゲル中で
電気泳動させる（SDS−PAGE）ことにより行なうことが
できる。
次いで、電気泳動中に、上記混合抗原中に含まれる成
分抗原であって、他の成分抗原と電気泳動移動度が近接
している抗原（すなわち上記移動度近接抗原）又は抗原
量が少ないために対応抗体の検出が困難となる抗原（す
なわち上記少量抗原）をゲルに加え、さらに電気泳動を
続ける。これらの成分抗原は、通常のWB法によれば、他
の抗原のバンドとほとんど重なってしまうか又は量が少
ないためにその対応抗体の検出が困難又は不正確になる
おそれがある抗原である。これらの成分抗原を添加する
時期は特に限定されるものではないが、電気泳動後に成
分抗原のバンドが重なり合わない条件を選択する。この
ような条件は、ルーチンな予備実験により容易に選択す
ることができるが、通常、電気泳動の末期に添加すれ
ば、添加された成分抗原は、泳動時間が短いために移動
距離が少なく、他の成分抗原と容易かつ明瞭に分画され
ることが多い。また、必ずしも必要ではないが、添加さ
れる成分抗原は精製されていることが好ましい。もっと
も、成分抗原添加後の電気泳動により明確に分画される
のであれば、２種以上の成分抗原の混合物を添加するこ
とも可能である。後述の実施例においては、HTLV−１ウ
イルスに対する抗体の分析において、HTLV−１ウイルス
のenv抗原を添加している。
分抗原であって、他の成分抗原と電気泳動移動度が近接
している抗原（すなわち上記移動度近接抗原）又は抗原
量が少ないために対応抗体の検出が困難となる抗原（す
なわち上記少量抗原）をゲルに加え、さらに電気泳動を
続ける。これらの成分抗原は、通常のWB法によれば、他
の抗原のバンドとほとんど重なってしまうか又は量が少
ないためにその対応抗体の検出が困難又は不正確になる
おそれがある抗原である。これらの成分抗原を添加する
時期は特に限定されるものではないが、電気泳動後に成
分抗原のバンドが重なり合わない条件を選択する。この
ような条件は、ルーチンな予備実験により容易に選択す
ることができるが、通常、電気泳動の末期に添加すれ
ば、添加された成分抗原は、泳動時間が短いために移動
距離が少なく、他の成分抗原と容易かつ明瞭に分画され
ることが多い。また、必ずしも必要ではないが、添加さ
れる成分抗原は精製されていることが好ましい。もっと
も、成分抗原添加後の電気泳動により明確に分画される
のであれば、２種以上の成分抗原の混合物を添加するこ
とも可能である。後述の実施例においては、HTLV−１ウ
イルスに対する抗体の分析において、HTLV−１ウイルス
のenv抗原を添加している。
このように、移動度近接抗原又は少量抗原を電気泳動
の途中でゲルに添加してさらに電気泳動を続けると、添
加された成分抗原は、その後の電気泳動の時間が最初か
ら電気泳動されている他の成分抗原よりも短いので、移
動距離が短く、従って、電気泳動後、本来の位置とは異
なる位置にバンドが形成される。従って、本来のバンド
が他のバンドとほとんど重なるような場合でも、全く異
なる位置に明確なバンドを形成することができるので、
それに対応する抗体の検出も明瞭に行なうことができ
る。また、少量抗原の場合も、該抗原を後から別途加え
るのであるから、対応抗原の検出のために十分な量の抗
原を添加することができ、従って対応する抗体の検出も
明瞭に行なうことができる。
の途中でゲルに添加してさらに電気泳動を続けると、添
加された成分抗原は、その後の電気泳動の時間が最初か
ら電気泳動されている他の成分抗原よりも短いので、移
動距離が短く、従って、電気泳動後、本来の位置とは異
なる位置にバンドが形成される。従って、本来のバンド
が他のバンドとほとんど重なるような場合でも、全く異
なる位置に明確なバンドを形成することができるので、
それに対応する抗体の検出も明瞭に行なうことができ
る。また、少量抗原の場合も、該抗原を後から別途加え
るのであるから、対応抗原の検出のために十分な量の抗
原を添加することができ、従って対応する抗体の検出も
明瞭に行なうことができる。
次いで、上記電気泳動による泳動パターンを維持した
まま、電気泳動により分離された成分抗原を担体に転写
する。この工程は通常のWB法と全く同様に行なうことが
できる。すなわち、分画された成分抗原を、ニトロセル
ロースフィルターやナイロンメンブレンフィルターのよ
うな従来から常用されている担体に、従来法に従い電気
泳動的にゲル中の成分抗原を担体上に移行させることに
より行なうことができる。なお、このようにして担体上
に転写したものは本発明の試験片を構成する。
まま、電気泳動により分離された成分抗原を担体に転写
する。この工程は通常のWB法と全く同様に行なうことが
できる。すなわち、分画された成分抗原を、ニトロセル
ロースフィルターやナイロンメンブレンフィルターのよ
うな従来から常用されている担体に、従来法に従い電気
泳動的にゲル中の成分抗原を担体上に移行させることに
より行なうことができる。なお、このようにして担体上
に転写したものは本発明の試験片を構成する。
次いで、抗原が転写された担体と、被検試料中の抗体
を反応させる。被検試料としては、例えば、ウイルス等
の感染を調べる場合には血清等の体液を挙げることがで
き、その他、ハイブリドーマにより産生される抗体の対
応抗原を調べたり、遺伝子工学的に動物細胞等により生
産されるタンパク質の同定をするような場合にはハイブ
リドーマや動物細胞等の培養上清又は細胞破砕物等を挙
げることができる。もっとも、被検試料はこれらに限定
されるものではなく、成分抗原に対する抗体を検出しよ
うとするいかなる試料であってもよい。担体上の抗原と
抗体との反応は従来のWB法と全く同様にして行なうこと
ができる。
を反応させる。被検試料としては、例えば、ウイルス等
の感染を調べる場合には血清等の体液を挙げることがで
き、その他、ハイブリドーマにより産生される抗体の対
応抗原を調べたり、遺伝子工学的に動物細胞等により生
産されるタンパク質の同定をするような場合にはハイブ
リドーマや動物細胞等の培養上清又は細胞破砕物等を挙
げることができる。もっとも、被検試料はこれらに限定
されるものではなく、成分抗原に対する抗体を検出しよ
うとするいかなる試料であってもよい。担体上の抗原と
抗体との反応は従来のWB法と全く同様にして行なうこと
ができる。
次いで、成分抗原と特異的に結合した抗体を検出す
る。これも、従来のWB法と全く同様にして行なうことが
でき、例えば、非特異的に担体に吸着している抗体を洗
浄除去した後、ビオチン又はペルオキシダーゼ等の酵素
で標識した第２抗体を反応させ、通常のビオチン−アビ
ジン法又は酵素免疫分析法の手法により検出することが
できる。
る。これも、従来のWB法と全く同様にして行なうことが
でき、例えば、非特異的に担体に吸着している抗体を洗
浄除去した後、ビオチン又はペルオキシダーゼ等の酵素
で標識した第２抗体を反応させ、通常のビオチン−アビ
ジン法又は酵素免疫分析法の手法により検出することが
できる。
本発明の方法は、例えばHTLV−ＩやHIVのようなウイ
ルス等の感染症の診断のみならず、ハイブリドーマによ
り産生される抗体の対応抗原を調べたり、遺伝子工学的
に動物細胞等により生産されるタンパク質の同定をする
ような場合にも適用することができ、極めて応用範囲の
広い基本的な技術である。
ルス等の感染症の診断のみならず、ハイブリドーマによ
り産生される抗体の対応抗原を調べたり、遺伝子工学的
に動物細胞等により生産されるタンパク質の同定をする
ような場合にも適用することができ、極めて応用範囲の
広い基本的な技術である。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。
［実施例］ （１） HTLV−Ｉウイルス抗原の調製 HTLV−Ｉ産生株化細胞であるTCL−Kan細胞（M.Kannag
iら、J.Immunol.,130（６）2942−2946（1983）を、10
％のウシ胎児血清を含有するRPMI−1640培地に接種し、
５％炭酸ガスを含む空気中で37℃で培養した。この培養
液を連続ローターを用いて遠心して細胞を除去し、上清
液を得た。この上清液から連続ローラーを用いるショ糖
密度勾配超遠心法でウイルスを回収した。これに終濃度
0.5％の非イオン性界面活性剤（ノニデットＰ−40（商
品名）を加え、HTLV−Ｉウイルス抗原を得た。
iら、J.Immunol.,130（６）2942−2946（1983）を、10
％のウシ胎児血清を含有するRPMI−1640培地に接種し、
５％炭酸ガスを含む空気中で37℃で培養した。この培養
液を連続ローターを用いて遠心して細胞を除去し、上清
液を得た。この上清液から連続ローラーを用いるショ糖
密度勾配超遠心法でウイルスを回収した。これに終濃度
0.5％の非イオン性界面活性剤（ノニデットＰ−40（商
品名）を加え、HTLV−Ｉウイルス抗原を得た。
（２） アフィニティークロマトグラフィーによるHTLV
−I env抗原の精製 上記（１）で得たHTLV−Ｉウイルス抗原をマウスに免
疫し、ケーラーとミルシュタインの常法に従ってマウス
脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、HTLV−I env抗原
に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選択してク
ローン化し、該ハイブリドーマをマウス腹腔内に接種し
てマウス腹水より硫安分画法及びDEAEイオン交換クロマ
トグラフィー法により抗HTLV−I env抗原モノクローナ
ル抗体を得た。このモノクローナル抗体は、HTLV−Ｉ感
染細胞には反応するが、非感染細胞には反応しないこ
と、この対応する抗原の分子量が68000及び46000ダルト
ンであること、また、遺伝子工学的に作製したリコンビ
ナントHTLV−I envタンパク質と強く反応することを確
認済である。このモノクローナル抗体を臭化シアンで活
性化したセファロース4Bゲル（ファルマシア社製）に常
法通り2mg/mlゲルの割合で結合させてアフィニティ用カ
ラムを作製した。0.5M塩化ナトリウムを含むpH7.5の5mM
トリス塩酸緩衝液で平衡化したカラムに先の培養上清を
流し、十分にHTLV−I envを結合させた後、0.5M塩化ナ
トリウムを含む5mMトリス塩酸緩衝液で洗浄した。非結
合成分が認められなくなった後、pH2.5の0.1M乳酸緩衝
液を流し、結合している成分を回収し、直ちに0.15M塩
化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に対し
て透析した。得られた結合成分より精製HTLV−I env抗
原を得た。
−I env抗原の精製 上記（１）で得たHTLV−Ｉウイルス抗原をマウスに免
疫し、ケーラーとミルシュタインの常法に従ってマウス
脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、HTLV−I env抗原
に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選択してク
ローン化し、該ハイブリドーマをマウス腹腔内に接種し
てマウス腹水より硫安分画法及びDEAEイオン交換クロマ
トグラフィー法により抗HTLV−I env抗原モノクローナ
ル抗体を得た。このモノクローナル抗体は、HTLV−Ｉ感
染細胞には反応するが、非感染細胞には反応しないこ
と、この対応する抗原の分子量が68000及び46000ダルト
ンであること、また、遺伝子工学的に作製したリコンビ
ナントHTLV−I envタンパク質と強く反応することを確
認済である。このモノクローナル抗体を臭化シアンで活
性化したセファロース4Bゲル（ファルマシア社製）に常
法通り2mg/mlゲルの割合で結合させてアフィニティ用カ
ラムを作製した。0.5M塩化ナトリウムを含むpH7.5の5mM
トリス塩酸緩衝液で平衡化したカラムに先の培養上清を
流し、十分にHTLV−I envを結合させた後、0.5M塩化ナ
トリウムを含む5mMトリス塩酸緩衝液で洗浄した。非結
合成分が認められなくなった後、pH2.5の0.1M乳酸緩衝
液を流し、結合している成分を回収し、直ちに0.15M塩
化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）に対し
て透析した。得られた結合成分より精製HTLV−I env抗
原を得た。
（３） 抗原転写ニトロセルロース膜（NC膜）の調製 （１）で得たHTLV−Ｉウイルス抗原を２−メルカプト
エタノール存在下で沸騰水中90秒間ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）処理した後に、ゲル濃度125％（濃縮ゲル1c
m、分離ゲル5.5cm）でSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS−PAGE）を、泳動の先端が上端より2/3に達
するまで（約２時間）行なった。次いで（２）で精製し
たHTLV−1env抗原を加えさらに泳動の先端が下端より1c
mに達するまで（１時間）電気泳動を続けた。泳動終了
後、ポリアクリルアミドゲルをトービンらの方法（特公
昭62−44612号）に従って電気的にNC膜に転写を行なっ
た後、３％ウシ血清アルブミン中、４℃で一晩ブロック
し、HTLV−Ｉ抗原転写NC膜（以下、本発明NC膜という）
を得た。一方、対照のため、精製したHTLV−I env抗原
を加えないことを除いて上記と同様に作製したNC膜（以
下、従来法NC膜と言う）を作製した。
エタノール存在下で沸騰水中90秒間ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）処理した後に、ゲル濃度125％（濃縮ゲル1c
m、分離ゲル5.5cm）でSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS−PAGE）を、泳動の先端が上端より2/3に達
するまで（約２時間）行なった。次いで（２）で精製し
たHTLV−1env抗原を加えさらに泳動の先端が下端より1c
mに達するまで（１時間）電気泳動を続けた。泳動終了
後、ポリアクリルアミドゲルをトービンらの方法（特公
昭62−44612号）に従って電気的にNC膜に転写を行なっ
た後、３％ウシ血清アルブミン中、４℃で一晩ブロック
し、HTLV−Ｉ抗原転写NC膜（以下、本発明NC膜という）
を得た。一方、対照のため、精製したHTLV−I env抗原
を加えないことを除いて上記と同様に作製したNC膜（以
下、従来法NC膜と言う）を作製した。
（４） 血清中のHTLV−Ｉ抗体の測定 上記（３）で作製した本発明NC膜と従来法NC膜との比
較を、HTLV−Ｉ抗体陽性血清及び陰性血清を用いHTLV−
Ｉ抗体の測定を行なった。測定は、30倍に希釈した各血
清を用い、室温で１時間反応させた後ビオチン標識抗ヒ
ト抗体を１時間、さらにペルオキシダーゼ標識アビジン
を１時間反応させ、４−クロロ−１−ナフトールを用い
発色させて行なった。洗浄液には0.05％ Tween−20を含
む0.01M PBS（pH7.4）を使用した。結果を第１図に示
す。
較を、HTLV−Ｉ抗体陽性血清及び陰性血清を用いHTLV−
Ｉ抗体の測定を行なった。測定は、30倍に希釈した各血
清を用い、室温で１時間反応させた後ビオチン標識抗ヒ
ト抗体を１時間、さらにペルオキシダーゼ標識アビジン
を１時間反応させ、４−クロロ−１−ナフトールを用い
発色させて行なった。洗浄液には0.05％ Tween−20を含
む0.01M PBS（pH7.4）を使用した。結果を第１図に示
す。
第１図から明らかなように、本発明NC膜を用いて分析
を行なった場合には、陽性血清の分析において、gp46抗
原に対応するバンドが移動度の小さな位置上端に対応す
る位置に明確に認められた。一方、従来法NC膜を用いた
場合には、陽性血清の分析において、gp46抗原に対応す
るバンドがp53抗原に対応するバンドとほとんど重なっ
てしまい、抗gp46抗体が血清中に存在するのか否かが明
確に判定できなかった。
を行なった場合には、陽性血清の分析において、gp46抗
原に対応するバンドが移動度の小さな位置上端に対応す
る位置に明確に認められた。一方、従来法NC膜を用いた
場合には、陽性血清の分析において、gp46抗原に対応す
るバンドがp53抗原に対応するバンドとほとんど重なっ
てしまい、抗gp46抗体が血清中に存在するのか否かが明
確に判定できなかった。
第１図は、本発明NC膜及び従来法NC膜を用いてHTLV−Ｉ
抗体陽性血清を用いて抗体の検出を行なった結果を示す
図である。
抗体陽性血清を用いて抗体の検出を行なった結果を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/447 G01N 33/561
Claims (4)
- 【請求項１】混合抗原をゲル電気泳動にかける工程と、
混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲルに加え、さ
らに電気泳動を続ける工程と、電気泳動パターンを維持
したまま、電気泳動により分離された抗原を担体に転写
する工程と、担体上に転写された抗原と被検試料中に含
まれる、前記混合抗原に対する抗体とを反応させる工程
と、抗原と結合した抗体を検出する工程とを含む、被検
試料中の抗体の検出方法。 - 【請求項２】前記混合抗原はHTLV−Ｉウイルス抗原であ
り、ゲルに添加される前記成分抗原はHTLV−I env抗原
である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】混合抗原をゲル電気泳動にかけ、次いで混
合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲルに加えてさら
に電気泳動を続け、電気泳動パターンを維持したまま電
気泳動により分離された抗原を担体に転写したものから
成る、被検試料中の前記混合抗原に対する抗体を検出す
るための試験片。 - 【請求項４】前記混合抗原はHTLV−Ｉウイルス抗原であ
り、ゲルに添加される前記成分抗原はHTLV−I env抗原
である請求項３記載の試験片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2201860A JP2971537B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 抗体の検出方法及び試験片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2201860A JP2971537B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 抗体の検出方法及び試験片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0486558A JPH0486558A (ja) | 1992-03-19 |
| JP2971537B2 true JP2971537B2 (ja) | 1999-11-08 |
Family
ID=16448089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2201860A Expired - Lifetime JP2971537B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 抗体の検出方法及び試験片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2971537B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2345754B (en) * | 1998-03-31 | 2001-02-07 | Zetatronics Ltd | Rapid method for detecting micro-organisms and evaluating antimicrobial activity |
-
1990
- 1990-07-30 JP JP2201860A patent/JP2971537B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0486558A (ja) | 1992-03-19 |
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