JP2825867B2 - トリチウムで標識された新規化合物及びその製造方法 - Google Patents
トリチウムで標識された新規化合物及びその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はレチノイドに類似する、トリチウムで標識さ
れた親規化合物、その調製並びに、特にレチノイドの核
レセプタおよびその細胞質ゾル結合タンパクに対するレ
チノイドのアフィニティを測定しおよび／または該核レ
セプタおよび細胞質ゾル結合タンパクの細胞中の含有量
を測定するためのその利用に関するものである。
れた親規化合物、その調製並びに、特にレチノイドの核
レセプタおよびその細胞質ゾル結合タンパクに対するレ
チノイドのアフィニティを測定しおよび／または該核レ
セプタおよび細胞質ゾル結合タンパクの細胞中の含有量
を測定するためのその利用に関するものである。
（従来の技術） レチノイドは、特に多種の細胞の増殖および分化に作
用を及ぼす一群の公知の化合物からなることが知られて
いる。例えば、B.A.ポーソン（Powson）等のジャーナル
オブメディシナルケミストリー（Joural of Medicinal
Chemistry）,1982,25−11,pp.1269−1277を参照のこ
と。
用を及ぼす一群の公知の化合物からなることが知られて
いる。例えば、B.A.ポーソン（Powson）等のジャーナル
オブメディシナルケミストリー（Joural of Medicinal
Chemistry）,1982,25−11,pp.1269−1277を参照のこ
と。
レチノイドは、特に表皮細胞の増殖および分化の調節
機構失調が関与する様々な皮膚疾患の治療において使用
されていた。例えば、“アップディト：デルマトロジー
インジェネラルメディシン（Update:Dermatology in Ge
neral Medicine）",トーマス（Thomas）B.フィッツパト
リック（Fitzpatrick）等監修（マクグロウーヒルブッ
クカンパニー（MacGraw−Hill Book Campany））1983年
刊、特にD.B.ウィンドホースト（Windhorst）等の章
“ザレチノイズ（The Retinoids）,pp.226−237を参照
のこと。
機構失調が関与する様々な皮膚疾患の治療において使用
されていた。例えば、“アップディト：デルマトロジー
インジェネラルメディシン（Update:Dermatology in Ge
neral Medicine）",トーマス（Thomas）B.フィッツパト
リック（Fitzpatrick）等監修（マクグロウーヒルブッ
クカンパニー（MacGraw−Hill Book Campany））1983年
刊、特にD.B.ウィンドホースト（Windhorst）等の章
“ザレチノイズ（The Retinoids）,pp.226−237を参照
のこと。
このレチノイドの作用様式は、ステロイドおよび核レ
セプトと相互作用する他のエフェクタの作用様式と類似
している（チティル＆オング（Chgtil＆Ong）,1979）。
レチノイド酸の核レセプタ（RAR）は単離されており
（デイリー＆レッドファーン（Daly ＆ Redfern）,198
7）、また対応する相補的DNAはクローン化され、かつ配
列決定されている（ペトコビッチ（Petkovich）等、198
7;ブランド（Brand）等、1988）。現在まで、ヒトには
３種のレセプタ即ちRARa（462残基）、RARb（448残基）
およびγ−RAR（458残基）があることが報告されてい
る。また、細胞質ゾルにはCRABP（細胞レチノイン酸結
合タンパク）と呼ばれるタンパクがあることが示されて
いるが、その役割は良く知られていない。
セプトと相互作用する他のエフェクタの作用様式と類似
している（チティル＆オング（Chgtil＆Ong）,1979）。
レチノイド酸の核レセプタ（RAR）は単離されており
（デイリー＆レッドファーン（Daly ＆ Redfern）,198
7）、また対応する相補的DNAはクローン化され、かつ配
列決定されている（ペトコビッチ（Petkovich）等、198
7;ブランド（Brand）等、1988）。現在まで、ヒトには
３種のレセプタ即ちRARa（462残基）、RARb（448残基）
およびγ−RAR（458残基）があることが報告されてい
る。また、細胞質ゾルにはCRABP（細胞レチノイン酸結
合タンパク）と呼ばれるタンパクがあることが示されて
いるが、その役割は良く知られていない。
レチノイドのRARに対するアフィニティの測定は該レ
チノイドの生物学的能力を評価するための特に興味ある
手段を含んでいる。このもののCRABPに対するアフィニ
ティの測定は補助的評価のための基本的要素を与える。
チノイドの生物学的能力を評価するための特に興味ある
手段を含んでいる。このもののCRABPに対するアフィニ
ティの測定は補助的評価のための基本的要素を与える。
様々な実験法が該レセプタまたは結合タンパクに対す
るリガンドのアフィニティの測定を可能とする。特に、
この考えているリガンドが放射能で標識される場合には
直接的方法によって、あるいはまた該対象とするリガン
ドが放射能標識されない場合には放射性リガンドとの競
争によって操作し得る。
るリガンドのアフィニティの測定を可能とする。特に、
この考えているリガンドが放射能で標識される場合には
直接的方法によって、あるいはまた該対象とするリガン
ドが放射能標識されない場合には放射性リガンドとの競
争によって操作し得る。
良好な放射性リガンドはこれらのレセプタおよび結合
タンパクに対して高いアフィニティを示すばかりでな
く、あらゆる他の分子上での僅かな固定性を示すもので
なければならない。更に、該リガンドは有利に利用し得
るものであるためには十分に安定でなければならない。
タンパクに対して高いアフィニティを示すばかりでな
く、あらゆる他の分子上での僅かな固定性を示すもので
なければならない。更に、該リガンドは有利に利用し得
るものであるためには十分に安定でなければならない。
レチノイン酸の場合、この一般に使用される放射性リ
ガンドは、しばしば２−位（J.“ラベルドコンパウンズ
＆ラジオファーマシューティカルズ（Labelled Compoun
ds and Radiopharmaceuticals）,1980,XVIII,p.1099）
あるいは４−位（ドイツ特許第3,142,975号）において
トリチウム標識されたレチノイン酸である。
ガンドは、しばしば２−位（J.“ラベルドコンパウンズ
＆ラジオファーマシューティカルズ（Labelled Compoun
ds and Radiopharmaceuticals）,1980,XVIII,p.1099）
あるいは４−位（ドイツ特許第3,142,975号）において
トリチウム標識されたレチノイン酸である。
確かに、レチノイン酸は優れたRARおよびCRABPに対す
るアフィニティ並びに非特異的で僅かな固定性を有する
が、この分子は放射線分解、酸化および光分解により極
めて急速に分解されるという欠点を有している。
るアフィニティ並びに非特異的で僅かな固定性を有する
が、この分子は放射線分解、酸化および光分解により極
めて急速に分解されるという欠点を有している。
（発明が解決しようとする課題およびこれを解決するた
めの手段） 今や、RARおよびCRABPに対して優れたアフィニティを
示し、かつ非特異的で低い固定性を示す新規な放射性リ
ガンドとして、トリチウム化した４−（5,6,7,8−テト
ラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニ
ル）安息香酸を見出した。その上、この新規リガンドは
極めて安定であり、しかも高い比活性をもつものとして
得ることができ、そのためにRARおよびCRABPに対するレ
チノイドのアフィニティの尺度として極めて有用であ
る。
めの手段） 今や、RARおよびCRABPに対して優れたアフィニティを
示し、かつ非特異的で低い固定性を示す新規な放射性リ
ガンドとして、トリチウム化した４−（5,6,7,8−テト
ラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニ
ル）安息香酸を見出した。その上、この新規リガンドは
極めて安定であり、しかも高い比活性をもつものとして
得ることができ、そのためにRARおよびCRABPに対するレ
チノイドのアフィニティの尺度として極めて有用であ
る。
従って、本発明の目的はトリチウムで標識された４−
（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２
−アンスラセニル）安息香酸を提供することにある。
（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２
−アンスラセニル）安息香酸を提供することにある。
本発明は、特に30Ci/mmolを越える、好ましくは少な
くとも50Ci/mmolに等しい、例えば少なくとも約1875GBq
/mmolの比活性を有する、上で規定したような新規な放
射性リガンドを提供することを目的とする。
くとも50Ci/mmolに等しい、例えば少なくとも約1875GBq
/mmolの比活性を有する、上で規定したような新規な放
射性リガンドを提供することを目的とする。
本発明は、また上記の如き新規な放射性リガンドの製
法を提供することをも目的とする。該方法は、原理的
に、４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメ
チル−２−アンスラセニル）安息香酸の多ハロゲン化ア
ルキルエステルを調製することにより特徴付けられる。
選ばれる多数の等価なハロゲン化剤に応じて、５原子ま
でのハロゲンを導入できる。次いで、このハロゲン化ア
ルキルエステルをトリチウム化された還元剤の作用に付
す。
法を提供することをも目的とする。該方法は、原理的
に、４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメ
チル−２−アンスラセニル）安息香酸の多ハロゲン化ア
ルキルエステルを調製することにより特徴付けられる。
選ばれる多数の等価なハロゲン化剤に応じて、５原子ま
でのハロゲンを導入できる。次いで、このハロゲン化ア
ルキルエステルをトリチウム化された還元剤の作用に付
す。
該還元剤は、例えば10％パラジウム担持炭素およびト
リエチルアミンの存在下で使用されるトリチウムであ
る。
リエチルアミンの存在下で使用されるトリチウムであ
る。
このハロゲン化誘導体の還元は周囲温度および周囲圧
力下、例えば15〜30℃にて１バール（約105Pa）なる圧
力の下で実施することが好ましい。
力下、例えば15〜30℃にて１バール（約105Pa）なる圧
力の下で実施することが好ましい。
このアルキルエステルは、次にソーダの存在下で、メ
タノール性媒質中にてけん化される。
タノール性媒質中にてけん化される。
出発物質として用いるこのハロゲン化誘導体は、好ま
しくは臭素化誘導体である。使用されるアルキルエステ
ルは、エチルエステルであることが好ましい。
しくは臭素化誘導体である。使用されるアルキルエステ
ルは、エチルエステルであることが好ましい。
４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチ
ル−２−アンスラセニル）−安息香酸のハロゲン化アル
キルエステルは、それ自体ハロゲン化剤（特に臭素化
剤）を作用させることにより、４−（5,6,7,8−テトラ
ヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニ
ル）安息香酸のアルキルエステルから調製できる。例え
ば、臭素化誘導体は周囲温度下で、窒素雰囲気の下で、
酢酸中で臭素を作用させることによって得ることができ
る。
ル−２−アンスラセニル）−安息香酸のハロゲン化アル
キルエステルは、それ自体ハロゲン化剤（特に臭素化
剤）を作用させることにより、４−（5,6,7,8−テトラ
ヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニ
ル）安息香酸のアルキルエステルから調製できる。例え
ば、臭素化誘導体は周囲温度下で、窒素雰囲気の下で、
酢酸中で臭素を作用させることによって得ることができ
る。
４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチ
ル−２−アンスラセニル）安息香酸は公知の物質（以下
化合物Ｉと呼ぶ）であり、例えば1986年７月25日出願の
欧州特許出願第86.401671（210,929）に記載の方法に従
って得ることができる。
ル−２−アンスラセニル）安息香酸は公知の物質（以下
化合物Ｉと呼ぶ）であり、例えば1986年７月25日出願の
欧州特許出願第86.401671（210,929）に記載の方法に従
って得ることができる。
本発明の放射性リガンドは、同様に４−（5,6,7,8−
テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラ
セニル）安息香酸のアルキルエステルから、好ましくは
60〜150℃の温度にてプラチナおよび酢酸の存在下でト
リチウム化した水との同位体交換によって得ることもで
きる。この場合、該同位体交換は該リガンドの芳香族性
プロトンについて優先的に起こる。
テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラ
セニル）安息香酸のアルキルエステルから、好ましくは
60〜150℃の温度にてプラチナおよび酢酸の存在下でト
リチウム化した水との同位体交換によって得ることもで
きる。この場合、該同位体交換は該リガンドの芳香族性
プロトンについて優先的に起こる。
本発明は、また特にレチノイドのアフィニティ、その
存在または含有率の測定および／または該レチノイドに
よるRARおよびCRABPの定量における放射性マーカーとし
ての、トリチウム化４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,
5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニル）安息香酸
の使用をも目的とする。
存在または含有率の測定および／または該レチノイドに
よるRARおよびCRABPの定量における放射性マーカーとし
ての、トリチウム化４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,
5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニル）安息香酸
の使用をも目的とする。
例えば、本発明の放射性マーカーは、高圧または低圧
下での排除クロマトグラフィーの古典的方法により、RA
RおよびCRABPの精製の際に使用できる。この精製は、出
発物質として用いられる細胞に（RARの場合）、あるい
は組織抽出物に（CARBPの場合）、予め決められた量の
放射性リガンドを加えることで十分である。かくして、
RARおよびCRABPは標識されることがわかり、かつ所定の
画分中でのこれらの有無を容易に知ることができる。
下での排除クロマトグラフィーの古典的方法により、RA
RおよびCRABPの精製の際に使用できる。この精製は、出
発物質として用いられる細胞に（RARの場合）、あるい
は組織抽出物に（CARBPの場合）、予め決められた量の
放射性リガンドを加えることで十分である。かくして、
RARおよびCRABPは標識されることがわかり、かつ所定の
画分中でのこれらの有無を容易に知ることができる。
同様に、RARまたはCRABP上での固定カーブに関する知
識は、内在性のもしくはトランスフェクション法で得ら
れるRARの定量またはCRABPの定量における本発明のマー
カーの利用を可能ならしめる。
識は、内在性のもしくはトランスフェクション法で得ら
れるRARの定量またはCRABPの定量における本発明のマー
カーの利用を可能ならしめる。
本発明は、またトリチウム化した化合物Ｉの以下の目
的での使用をも目的とする。
的での使用をも目的とする。
○ レチノイン酸の核レセプタを検知し、定量しもしく
は標識するための放射性マーカーとしての使用； ○ レチノイドのRARに対するアフィニティの測定（競
争実験）並びにかくしてその生物学的活性を評価するた
めの放射性マーカーとしての使用； ○ CRABPの検知、定量または標識のための、あるいはC
RABP上での固定化に対する競争によって知られるレチノ
イドの定量のための放射性マーカーとしての使用；およ
び ○ レチノイドのCRABPに対するアフィニティ測定のた
めの放射性マーカーとしての使用。
は標識するための放射性マーカーとしての使用； ○ レチノイドのRARに対するアフィニティの測定（競
争実験）並びにかくしてその生物学的活性を評価するた
めの放射性マーカーとしての使用； ○ CRABPの検知、定量または標識のための、あるいはC
RABP上での固定化に対する競争によって知られるレチノ
イドの定量のための放射性マーカーとしての使用；およ
び ○ レチノイドのCRABPに対するアフィニティ測定のた
めの放射性マーカーとしての使用。
この本発明の放射性マーカーは化合物Ｉに対して誘発
される抗体を特徴付けする際にも使用でき、これらの抗
体（抗−ハプテン抗体を得る古典的方法によって得られ
る）は、それ自体RARおよび／またはCRABP上に固定され
たもしくは固定されていない物質Ｉの量を測定する際に
使用できる。標識されたこれら抗体は放射性免疫検定の
ために使用される。
される抗体を特徴付けする際にも使用でき、これらの抗
体（抗−ハプテン抗体を得る古典的方法によって得られ
る）は、それ自体RARおよび／またはCRABP上に固定され
たもしくは固定されていない物質Ｉの量を測定する際に
使用できる。標識されたこれら抗体は放射性免疫検定の
ために使用される。
本発明の放射性マーカーは、化合物Ｉの生体内および
細胞内並びに細胞抽出物中での細胞間相互作用並びに一
般的代謝の研究および該化合物および一般的にはレチノ
イドの生体内、並びに細胞内および細胞下分布を研究す
るためにも使用できる。
細胞内並びに細胞抽出物中での細胞間相互作用並びに一
般的代謝の研究および該化合物および一般的にはレチノ
イドの生体内、並びに細胞内および細胞下分布を研究す
るためにも使用できる。
（実施例） 以下、実施例によって本発明を説明するが、これらは
本発明を例示するものであり、本発明を限定するもので
はないことに注意されたい。
本発明を例示するものであり、本発明を限定するもので
はないことに注意されたい。
実施例1:トリチウムで標識した４−（5,6,7,8−テトラ
ヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニ
ル）安息香酸 ａ） 標記酸に対応するエチルエステル（250mg;0.644
ミリモル）を、窒素雰囲気下で酢酸25mlに溶解する。臭
素を酢酸に溶解した溶液（1ml当たり臭素230mg;2.2当
量）1mlを加える。
ヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニ
ル）安息香酸 ａ） 標記酸に対応するエチルエステル（250mg;0.644
ミリモル）を、窒素雰囲気下で酢酸25mlに溶解する。臭
素を酢酸に溶解した溶液（1ml当たり臭素230mg;2.2当
量）1mlを加える。
この混合物を周囲温度下で４時間撹拌し、水100ml中
に注ぎ、次いでジクロロメタン（100ml）で抽出する。
に注ぎ、次いでジクロロメタン（100ml）で抽出する。
有機相を分離し、水、次いで炭酸水素ナトリウムの飽
和溶液および最後にチオ硫酸ナトリウムの飽和溶液で洗
浄する。
和溶液および最後にチオ硫酸ナトリウムの飽和溶液で洗
浄する。
無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、次に減圧下で溶媒
を蒸発させる。
を蒸発させる。
マススペクトルによれば臭素化された生成物に対応す
る鮮黄色固体350mgが得られる。
る鮮黄色固体350mgが得られる。
ｂ） かくして得られる臭素化化合物を次いでトリチウ
ム化する。19.3mgの臭素化先駆体を、2mlのエタノール
と1mlのTHFとの混合物中に溶解する。
ム化する。19.3mgの臭素化先駆体を、2mlのエタノール
と1mlのTHFとの混合物中に溶解する。
17μのトリエチルアミンと14mgの10％パラジウム担
持炭素を加える。
持炭素を加える。
この反応溶媒をトリチウム雰囲気（１気圧）の下で２
時間撹拌し、次いで該触媒を濾別し、不安定物質（les
labiles）を２度、10mlの50％エタノール−50％アセト
ニトリル混合物により除く。
時間撹拌し、次いで該触媒を濾別し、不安定物質（les
labiles）を２度、10mlの50％エタノール−50％アセト
ニトリル混合物により除く。
生成物は100mlのエタノールによって回収する。
1,500mCiのトリチウム化エチルエステルを得る。
ｃ） 上記のトリチウム化生成物（1.5Ci）を5mlのメタ
ノール中に溶解し、1mlの5Nソーダ溶液を加え、得られ
る混合物を２時間加熱還流し、冷却し、2mlの6N塩酸で
酸性にし、次いで50mlのエチルエーテルで抽出する。
ノール中に溶解し、1mlの5Nソーダ溶液を加え、得られ
る混合物を２時間加熱還流し、冷却し、2mlの6N塩酸で
酸性にし、次いで50mlのエチルエーテルで抽出する。
エーテル相をデカンテーションし、水洗し、無水硫酸
マグネシウム上で乾燥し、かつ溶媒を減圧下で蒸発させ
る。生成残渣を最少量のジクロロメタンに溶かし、高速
液体クロマトグラフィーで精製（溶離液：ジクロロメタ
ン／メタノール9:1溶液）する。
マグネシウム上で乾燥し、かつ溶媒を減圧下で蒸発させ
る。生成残渣を最少量のジクロロメタンに溶かし、高速
液体クロマトグラフィーで精製（溶離液：ジクロロメタ
ン／メタノール9:1溶液）する。
この最終生成物を100mlのメタノールに溶す。このも
のの純度を薄層クロマトグラフィーによって確認する
（シリカ；上記と同じ溶出液）。UV（254および366nm）
照射下で、かつβ−線カウンタで計数した場合、唯一の
班点が出現する。
のの純度を薄層クロマトグラフィーによって確認する
（シリカ；上記と同じ溶出液）。UV（254および366nm）
照射下で、かつβ−線カウンタで計数した場合、唯一の
班点が出現する。
HPLC（逆相；カラムZORBAX ODS;溶出液アセトニトリ
ル／水／トリフルオロ酢酸95:4.9:0.1）によれば、UV照
射（254nm）およびβ−線検出（連続液体シンチレーシ
ョン）により、唯一のピークが検出される。
ル／水／トリフルオロ酢酸95:4.9:0.1）によれば、UV照
射（254nm）およびβ−線検出（連続液体シンチレーシ
ョン）により、唯一のピークが検出される。
UV分光法、β−線計数により決定された比活性は52.8
Ci/mmolである。
Ci/mmolである。
得られた全活性（液体シンチレーション計数器で測
定）は1.35Ciである。
定）は1.35Ciである。
実施例１の化合物の、核レセプタRAR上への固定化の特
徴 ネズミ胎生期癌細胞F9の培養物（インキュベーション
条件毎に全体で２〜４×107細胞を含む90mmのカンで通
常は４個）を１度PBS（燐酸緩衝塩溶液）で洗浄し、補
充血清を含まない培地で、標識レチノイドと共に、相同
または非相同の冷レチノイドの存在下または不在下で３
時間インキュベートする（特異性を明らかにし、かつ競
争実験を行うため）。次いで、これら細胞をトリプシン
−EDTA混合物で分離し、バーカー（Burker）の血球計数
器で計数する。RARを含むヌクレオゾル（nuclosol）
を、デイリー＆レッドファーン（Daly et Redfern）に
より記載された方法（1987）に従って精製核から抽出し
（即ち、DNアーゼおよび0.6MNaClで処理した後）、高速
排除クロマトグラフィー（HPSEC）によって分析する。
標識した抽出物50μを９×250mmのカラムGF250（デュ
ポンドゥネモアズ（Dupont de Nemours））に注入す
る。溶出は流量1ml/minで、pH7.8の0.3MKH2PO4バッファ
ーで行う。タンパク含量は280nmでの光学密度で測定し
た。各0.3mlの28個の画分を集め、ピコフルオールシン
チレーションカウンタ（scintillant Picofluor:パッカ
ード（Packrd）製）で計数する。レチノイドの各濃度に
対して、結合した分子の数を放射能のピーク面積から求
め、半飽和濃度（C50）を計算する。競争実験におい
て、実施例１の放射性化合物を２×10-9Mの濃度で用い
て、50％阻害濃度（IC50）を計算する。カラム分子量の
検量はヒトアルブミン（65kDa）、オボアルブミン（45k
Da）およびミオグロビン（16.8kDa）によって行う。ド
ーズ応答カーブおよび競争カーブをクラーク（clark）
の式の種々の形を用いた非線形回帰による情報処理法で
解析する。
徴 ネズミ胎生期癌細胞F9の培養物（インキュベーション
条件毎に全体で２〜４×107細胞を含む90mmのカンで通
常は４個）を１度PBS（燐酸緩衝塩溶液）で洗浄し、補
充血清を含まない培地で、標識レチノイドと共に、相同
または非相同の冷レチノイドの存在下または不在下で３
時間インキュベートする（特異性を明らかにし、かつ競
争実験を行うため）。次いで、これら細胞をトリプシン
−EDTA混合物で分離し、バーカー（Burker）の血球計数
器で計数する。RARを含むヌクレオゾル（nuclosol）
を、デイリー＆レッドファーン（Daly et Redfern）に
より記載された方法（1987）に従って精製核から抽出し
（即ち、DNアーゼおよび0.6MNaClで処理した後）、高速
排除クロマトグラフィー（HPSEC）によって分析する。
標識した抽出物50μを９×250mmのカラムGF250（デュ
ポンドゥネモアズ（Dupont de Nemours））に注入す
る。溶出は流量1ml/minで、pH7.8の0.3MKH2PO4バッファ
ーで行う。タンパク含量は280nmでの光学密度で測定し
た。各0.3mlの28個の画分を集め、ピコフルオールシン
チレーションカウンタ（scintillant Picofluor:パッカ
ード（Packrd）製）で計数する。レチノイドの各濃度に
対して、結合した分子の数を放射能のピーク面積から求
め、半飽和濃度（C50）を計算する。競争実験におい
て、実施例１の放射性化合物を２×10-9Mの濃度で用い
て、50％阻害濃度（IC50）を計算する。カラム分子量の
検量はヒトアルブミン（65kDa）、オボアルブミン（45k
Da）およびミオグロビン（16.8kDa）によって行う。ド
ーズ応答カーブおよび競争カーブをクラーク（clark）
の式の種々の形を用いた非線形回帰による情報処理法で
解析する。
第１図は、細胞F9のヌクレオゾル中の約45kDaの画分
中のレチノイン酸の核レセプタ（RAR）の検出におけるH
PSECプロフィールを示すものであり、かつこの画分の特
異性を調べることを可能とする。
中のレチノイン酸の核レセプタ（RAR）の検出におけるH
PSECプロフィールを示すものであり、かつこの画分の特
異性を調べることを可能とする。
細胞F9は、200nMのトリチウム化したレチノイン酸
（Ａ）またはトリチウム化した実施例１の化合物（Ｂ）
と共に、不活性（froid:放射性標識されていない）相同
リガンド20,000nMの存在下（◆−◆）または不在下（□
−□）でインキュベートした。
（Ａ）またはトリチウム化した実施例１の化合物（Ｂ）
と共に、不活性（froid:放射性標識されていない）相同
リガンド20,000nMの存在下（◆−◆）または不在下（□
−□）でインキュベートした。
上記方法を用い、細胞F9が200nMの濃度の実施例１の
化合物と共にインキュベートした場合、放射能の只一つ
のピークが核抽出物中にみられる（第1B図）。ピークの
平均的画分に対応する分子量はヒトRARの分子量に近い
数値である約45kDaであり、またこれはそのDNAの配列か
ら推定され〔ペトコビッチ（Petkovich）等,1987;ブラ
ンド（Brand）等,1988〕、かつネズミのレセプタの4Sと
いう沈降係数と相容性である（デイリー＆レッドファー
ン（Daly ＆ Redfern）,1987）。この固定は特異的であ
る。というのは、該固定は細胞を化合物Ｉの100倍過剰
で同時にインキュベートすると消失するからである（第
1B図）。既にデイリー＆レッドファーン（Daly et Redf
ern;1987）によって強調されていたように、F9のヌクレ
オゾル抽出物中にはCRABPは見出されない。
化合物と共にインキュベートした場合、放射能の只一つ
のピークが核抽出物中にみられる（第1B図）。ピークの
平均的画分に対応する分子量はヒトRARの分子量に近い
数値である約45kDaであり、またこれはそのDNAの配列か
ら推定され〔ペトコビッチ（Petkovich）等,1987;ブラ
ンド（Brand）等,1988〕、かつネズミのレセプタの4Sと
いう沈降係数と相容性である（デイリー＆レッドファー
ン（Daly ＆ Redfern）,1987）。この固定は特異的であ
る。というのは、該固定は細胞を化合物Ｉの100倍過剰
で同時にインキュベートすると消失するからである（第
1B図）。既にデイリー＆レッドファーン（Daly et Redf
ern;1987）によって強調されていたように、F9のヌクレ
オゾル抽出物中にはCRABPは見出されない。
また、レチノイドのレセプタを含まないセルライン
を、レチノイドの各レセプタを個別的にコードする表現
ベクタでトランスフェクションすることにより、各レセ
プタを含む細胞抽出物を単離し、かつ上記プロトコール
に従って結合テストを行うことが可能となる。かくし
て、レチノイドの各レセプタに対する実施例１の化合物
のアフィニティを測定することができる。
を、レチノイドの各レセプタを個別的にコードする表現
ベクタでトランスフェクションすることにより、各レセ
プタを含む細胞抽出物を単離し、かつ上記プロトコール
に従って結合テストを行うことが可能となる。かくし
て、レチノイドの各レセプタに対する実施例１の化合物
のアフィニティを測定することができる。
核レセプタRAR上へのトリチウム化レチノイン酸の固定
との比較 第1A図は200nMのトリチウム化レチノイン酸（比活性
＝52.5Ci/mmol）で細胞を処理した後に得られたHPSECプ
ロフィールを示すものである。放射能ピークが実施例１
の化合物と同じ位置で溶出されることに気付く。また、
このピークは、細胞が20,000nMの不活性レチノイド酸と
共に同時インキュベートされた場合には観測されない。
との比較 第1A図は200nMのトリチウム化レチノイン酸（比活性
＝52.5Ci/mmol）で細胞を処理した後に得られたHPSECプ
ロフィールを示すものである。放射能ピークが実施例１
の化合物と同じ位置で溶出されることに気付く。また、
このピークは、細胞が20,000nMの不活性レチノイド酸と
共に同時インキュベートされた場合には観測されない。
第２図はRAR上へのレチノイン酸および実施例１の化
合物の固定に関する結果を与えている。これら２種の化
合物は200nMの濃度で使用された。RARに結合したリガン
ドの量は細胞当たりの分子数で表してある。
合物の固定に関する結果を与えている。これら２種の化
合物は200nMの濃度で使用された。RARに結合したリガン
ドの量は細胞当たりの分子数で表してある。
HPSECの結果をこの細胞の数の関数として規格化する
と、即ち細胞当たりRARに固定されたリガンド分子数で
表すと、実施例１の化合物およびレチノイン酸は細胞当
たり約4,000分子に相当する同じ表面積のピークを与え
る（第２図）。
と、即ち細胞当たりRARに固定されたリガンド分子数で
表すと、実施例１の化合物およびレチノイン酸は細胞当
たり約4,000分子に相当する同じ表面積のピークを与え
る（第２図）。
RARの50％飽和を与える実施例１の化合物の濃度（C5
0）を測定するために、飽和カーブを、実施例１の化合
物の変化する濃度の関数として該放射能ピーク表面積を
表示して追跡した。C50は0.5〜2nMの範囲内にある。
0）を測定するために、飽和カーブを、実施例１の化合
物の変化する濃度の関数として該放射能ピーク表面積を
表示して追跡した。C50は0.5〜2nMの範囲内にある。
実施例１の化合物との競争による、RARに対するレチノ
イドのアフィニティの測定 安定性およびRARに対する優れたアフィニティを考慮
すれば、実施例１の化合物は、原理的には、RARに対す
る任意のレチノイドのアフィニティを競争により測定で
きる。第３図は、実施例１の化合物の濃度を2nMに固定
し、かつ他のレチノイドの濃度を変化させて（10-6M〜1
0-10M）行った競争実験を示す。例示のレチノイドは何
等本発明を限定するものではない。
イドのアフィニティの測定 安定性およびRARに対する優れたアフィニティを考慮
すれば、実施例１の化合物は、原理的には、RARに対す
る任意のレチノイドのアフィニティを競争により測定で
きる。第３図は、実施例１の化合物の濃度を2nMに固定
し、かつ他のレチノイドの濃度を変化させて（10-6M〜1
0-10M）行った競争実験を示す。例示のレチノイドは何
等本発明を限定するものではない。
HPSECのプロフィールは、細胞F9と２×10-9Mと実施例
１の化合物とを不活性競合体の不在下（◆−◆）、10-9
M（□−□）、10-8M（■−■）、10-7M（△−△）およ
び10-6M（▲−▲）なる濃度での存在下でインキュベー
ションした後得られたものである。図において、Ｉ＝標
識してない実施例１の化合物;RA＝レチノイン酸であ
る。差込み図として与えられた阻害Ｓ字状カーブは第Ｉ
表に与えられたIC50の測定を可能とした。競合体の各濃
度に対して、ピークの表面積は競合体なしに実施例１の
化合物について得られた表面に対する百分率で表してあ
る。不活性競合体の各濃度に対する放射能ピークの表面
を測定しつつ、競争のＳ字状カーブを追跡することが可
能である。このカーブの情報処理により、各レチノイド
のIC50（50％阻害濃度）を決定できる。コントロールと
して、化合物ＩのIC50を測定し、かつ生物学的に不活性
なレチノイド（化合物VIII）をも用いた。第１表に、か
くして得たIC50の値を示す。化合物Ｉはレチノイン酸自
体よりも６倍も優れたRARに対するアフィニティを有す
ることがわかる。
１の化合物とを不活性競合体の不在下（◆−◆）、10-9
M（□−□）、10-8M（■−■）、10-7M（△−△）およ
び10-6M（▲−▲）なる濃度での存在下でインキュベー
ションした後得られたものである。図において、Ｉ＝標
識してない実施例１の化合物;RA＝レチノイン酸であ
る。差込み図として与えられた阻害Ｓ字状カーブは第Ｉ
表に与えられたIC50の測定を可能とした。競合体の各濃
度に対して、ピークの表面積は競合体なしに実施例１の
化合物について得られた表面に対する百分率で表してあ
る。不活性競合体の各濃度に対する放射能ピークの表面
を測定しつつ、競争のＳ字状カーブを追跡することが可
能である。このカーブの情報処理により、各レチノイド
のIC50（50％阻害濃度）を決定できる。コントロールと
して、化合物ＩのIC50を測定し、かつ生物学的に不活性
なレチノイド（化合物VIII）をも用いた。第１表に、か
くして得たIC50の値を示す。化合物Ｉはレチノイン酸自
体よりも６倍も優れたRARに対するアフィニティを有す
ることがわかる。
レチノイドの生物学的活性と、実施例１の化合物による
競合により測定されたようなRARに対するそのアフィニ
ティとの間の相関 レチノイドの生物学的活性は、F9細胞の分化の結果と
して分泌され、レチノイドにより誘起されるプラスミノ
ーゲンの活性化因子の生産量を定量することにより、該
細胞につき測定できる。CPA50は分泌されるプラスミノ
ーゲンの活性因子の最大値の50％を誘発するレチノイド
の濃度である。第１表のIC50とCPA50とを比較すると、R
ARに対するレチノイドのアフィニティとその生物学的活
性との間に優れた相関関係があることがわかる（第４図
の回帰カーブの直線性をも参照のこと）。唯一の例外は
レチノイン酸自体である。この事実は該物質の著しい不
安定性によって説明できる。実際のところ、IC50の測定
は３時間のインキュベーション後に行われるのに対し
て、CPA50の測定は３日間のインキュベーション後に行
われる。
競合により測定されたようなRARに対するそのアフィニ
ティとの間の相関 レチノイドの生物学的活性は、F9細胞の分化の結果と
して分泌され、レチノイドにより誘起されるプラスミノ
ーゲンの活性化因子の生産量を定量することにより、該
細胞につき測定できる。CPA50は分泌されるプラスミノ
ーゲンの活性因子の最大値の50％を誘発するレチノイド
の濃度である。第１表のIC50とCPA50とを比較すると、R
ARに対するレチノイドのアフィニティとその生物学的活
性との間に優れた相関関係があることがわかる（第４図
の回帰カーブの直線性をも参照のこと）。唯一の例外は
レチノイン酸自体である。この事実は該物質の著しい不
安定性によって説明できる。実際のところ、IC50の測定
は３時間のインキュベーション後に行われるのに対し
て、CPA50の測定は３日間のインキュベーション後に行
われる。
第４図には、レチノイドの生物学的活性（CPA50）と
そのRARに対するアフィニティとの間の優れた相関関係
を示す線形回帰カーブを示す。レチノイン酸に対応する
値（RA＝□）は使用されていない。化合物VIIIのRARに
対するアフィニティおよび生物学的活性は検出限界以下
である。
そのRARに対するアフィニティとの間の優れた相関関係
を示す線形回帰カーブを示す。レチノイン酸に対応する
値（RA＝□）は使用されていない。化合物VIIIのRARに
対するアフィニティおよび生物学的活性は検出限界以下
である。
実施例１の化合物の結合タンパクCRABP上への固定の特
徴 CRABP上への化合物Ｉおよびレチノイン酸の固定に関
する結果は第５図に示してある。CRABPを含有するラッ
ト睾丸の細胞質ゾルに対する漸増濃度の実施例１の化合
物（ｂ）およびレチノイン酸（ａ）の直接的固定を、10
00nMの相同不活性リガンドの不在下（●−●）または存
在下（□−□）で調べた。これらの差（■−■）は特異
的結合を表す。
徴 CRABP上への化合物Ｉおよびレチノイン酸の固定に関
する結果は第５図に示してある。CRABPを含有するラッ
ト睾丸の細胞質ゾルに対する漸増濃度の実施例１の化合
物（ｂ）およびレチノイン酸（ａ）の直接的固定を、10
00nMの相同不活性リガンドの不在下（●−●）または存
在下（□−□）で調べた。これらの差（■−■）は特異
的結合を表す。
CRABP上への請求している化合物の固定は飽和実験に
より特徴付けられる（第5b図参照）。全固定（非特異的
＋特異的（１−１））はラット睾丸（CRABPに富む器
官）のホモジネートの一定量（0.3ml）と共に特許請求
している化合物を漸増濃度（最大125nMまで）でインキ
ュベートすることによって得られる。トリチウム化化合
物の非特異的固定は、平行して、大過剰（１μＭ）の相
同不活性リガンドの存在下（□−□）で、放射性リガン
ドの漸増濃度での固定を測定することにより測定され
る。平衡状態に達するまでには２時間のインキュベーシ
ョン時間が必要とされる。
より特徴付けられる（第5b図参照）。全固定（非特異的
＋特異的（１−１））はラット睾丸（CRABPに富む器
官）のホモジネートの一定量（0.3ml）と共に特許請求
している化合物を漸増濃度（最大125nMまで）でインキ
ュベートすることによって得られる。トリチウム化化合
物の非特異的固定は、平行して、大過剰（１μＭ）の相
同不活性リガンドの存在下（□−□）で、放射性リガン
ドの漸増濃度での固定を測定することにより測定され
る。平衡状態に達するまでには２時間のインキュベーシ
ョン時間が必要とされる。
一旦平衡状態が達成されると、CRABP−トリチウム化
リガンド複合体はセファデックス（Sephadex）G25排除
ゲルカラム（カラム：バイオラドエコノ（BIO−Rad eco
no;0.5×20cm）上で濾過することによって未結合リガン
ドから分離され、該複合体は溶出（溶出ピークは2.5ml
にある）され、一方で未結合リガンドは全体としてカラ
ム上に残される。こうして、結合および未結合生成物は
完全に分離される。溶出をシンチレーションカウンタを
備えた管で直接実施して、放射能を計数器によって測定
する。
リガンド複合体はセファデックス（Sephadex）G25排除
ゲルカラム（カラム：バイオラドエコノ（BIO−Rad eco
no;0.5×20cm）上で濾過することによって未結合リガン
ドから分離され、該複合体は溶出（溶出ピークは2.5ml
にある）され、一方で未結合リガンドは全体としてカラ
ム上に残される。こうして、結合および未結合生成物は
完全に分離される。溶出をシンチレーションカウンタを
備えた管で直接実施して、放射能を計数器によって測定
する。
こうして得た結果を、モデルとしてクラーク（Clar
k）〔A.T.Clark,ザモードオブアクションオブドラッグ
ズオンセルズ（The mode of action of drugs on cull
s）,A.アーノルド＆コ（A.Arnold and Co.），ロンドン
1933〕の式を用いて、非線形回帰により解析する。
k）〔A.T.Clark,ザモードオブアクションオブドラッグ
ズオンセルズ（The mode of action of drugs on cull
s）,A.アーノルド＆コ（A.Arnold and Co.），ロンドン
1933〕の式を用いて、非線形回帰により解析する。
第１図では、目的のリガンドの初期濃度を横軸に、か
つリガンド−結合タンパク複合体の平衡濃度を縦軸にと
ってある。
つリガンド−結合タンパク複合体の平衡濃度を縦軸にと
ってある。
全固定カーブ（●−●）と非特異的固定カーブ（□−
□）との間の差は特異的固定カーブ（■−■）に与えら
れている。このカーブを分析することにより、CRABPの5
0％飽和に要する物質の濃度に対応する平衡解離定数（K
d）を得ることができる。この定数は結合タンパクに対
するリガンドのアフィニティの尺度であり、Kdはアフィ
ニティに反比例する（即ち、Kdが小さいとアフィニティ
は大きい）。
□）との間の差は特異的固定カーブ（■−■）に与えら
れている。このカーブを分析することにより、CRABPの5
0％飽和に要する物質の濃度に対応する平衡解離定数（K
d）を得ることができる。この定数は結合タンパクに対
するリガンドのアフィニティの尺度であり、Kdはアフィ
ニティに反比例する（即ち、Kdが小さいとアフィニティ
は大きい）。
この分析は4nMなるKdの値を与える。特異的固定は飽
和性かつ可逆的である。非特異的固定は使用した濃度範
囲では不飽和性であり、かつ全固定の10％以下である。
この実験に用いたラットの睾丸の細胞質ゾル中のCRABP
の濃度は結合実験（ここでは、標識されたレチノイドが
飽和濃度で用いられる）において測定される。特許請求
している化合物、およびレチノイン酸につき10〜12pmol
/mgタンパクなる値が得られる。更に、これら２つのリ
ガンドが分子量15kDa（CRABPの分子量）の分子上に、HP
SECによれば同一の溶出プロフィールで固定されること
がわかる。
和性かつ可逆的である。非特異的固定は使用した濃度範
囲では不飽和性であり、かつ全固定の10％以下である。
この実験に用いたラットの睾丸の細胞質ゾル中のCRABP
の濃度は結合実験（ここでは、標識されたレチノイドが
飽和濃度で用いられる）において測定される。特許請求
している化合物、およびレチノイン酸につき10〜12pmol
/mgタンパクなる値が得られる。更に、これら２つのリ
ガンドが分子量15kDa（CRABPの分子量）の分子上に、HP
SECによれば同一の溶出プロフィールで固定されること
がわかる。
トリチウム化レチノイン酸との比較 同一の条件下で、CRABP上へのレチノイン酸の固定を
調べることができる（第5a図）。レチノイン酸のKdの値
は2nMであり、非特異的固定は全固定の約25％を占め
る。
調べることができる（第5a図）。レチノイン酸のKdの値
は2nMであり、非特異的固定は全固定の約25％を占め
る。
トリチウム化した特許請求している化合物との競争によ
るCRABPに対するレチノイドのアフィニティの測定 これら競争実験は以下のように実施する。即ち、ある
一定量の放射性リガンド（ほぼ半−飽和に対応、本例の
場合は4nM）を増加する濃度の不活性リガンド（非放射
性）と混合する。次いで、結合タンパクを加えて、平衡
における固定放射性リガンドの量を測定する（考えてい
るCRABPの量に対する、不活性リガンドのない状態で
の、初期固定の％で表示）。
るCRABPに対するレチノイドのアフィニティの測定 これら競争実験は以下のように実施する。即ち、ある
一定量の放射性リガンド（ほぼ半−飽和に対応、本例の
場合は4nM）を増加する濃度の不活性リガンド（非放射
性）と混合する。次いで、結合タンパクを加えて、平衡
における固定放射性リガンドの量を測定する（考えてい
るCRABPの量に対する、不活性リガンドのない状態で
の、初期固定の％で表示）。
競争カーブから、各場合におけるIC50（50％のトリチ
ウム化リガンドの付着を減ずる不活性リガンドの濃度）
を測定する。このIC50の値は、各場合における、不活性
リガンドに対する平衡解離定数（Kd）を求めることを可
能とする。
ウム化リガンドの付着を減ずる不活性リガンドの濃度）
を測定する。このIC50の値は、各場合における、不活性
リガンドに対する平衡解離定数（Kd）を求めることを可
能とする。
第１表は調べた様々な化合物に対して測定された値を
示す。特許請求している化合物の代りに、標識したレチ
ノイン酸自体を競合実験で用いた場合にも同じ値を測定
した。
示す。特許請求している化合物の代りに、標識したレチ
ノイン酸自体を競合実験で用いた場合にも同じ値を測定
した。
注：化合物I:不活性（非標識の）実施例１の化合物 化合物IV:2−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テト
ラメチル−２ナフチル）−６ベンゾ（ｂ）チオフェンカ
ルボン酸 化合物V:6−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テト
ラメチル−２−ナフチル）−２−ナフトエ酸 化合物VI:2−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テト
ラメチル−２−ナフチル）−６ベンゾ（ｂ）フランカル
ボン酸 化合物VII:4−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テ
トラメチル−２−ナフトアミド）安息香酸 化合物VIII:1−メチル−４−チオール−６−（5,6,7,8
−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−ナフチ
ル）−２−ナフトエ酸
ラメチル−２ナフチル）−６ベンゾ（ｂ）チオフェンカ
ルボン酸 化合物V:6−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テト
ラメチル−２−ナフチル）−２−ナフトエ酸 化合物VI:2−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テト
ラメチル−２−ナフチル）−６ベンゾ（ｂ）フランカル
ボン酸 化合物VII:4−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テ
トラメチル−２−ナフトアミド）安息香酸 化合物VIII:1−メチル−４−チオール−６−（5,6,7,8
−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−ナフチ
ル）−２−ナフトエ酸
第１図は、細胞F9のヌクレオゾル中の約45kDaの画分中
のレチノイン酸の核レセプタ（RAR）の検出の際のHPSEC
プロフィールを示し、第1A図はトリチウム化したレチノ
イン酸に関するものであり、第1B図はトリチウム化した
実施例１の化合物に関するものであり、 第２図はRAR上へのレチノイン酸（RA）および実施例１
の化合物の固定に係る結果を示す図であり、 第３図は実施例１の化合物（Ｉ）の濃度を固定（2nM）
し、他のレチノイド（RA、および化合物VI、VIII）の濃
度を変化（10-6M〜10-10M）させて行った競争実験結果
を示す図であり、 第４図は、レチノイドの生物学的活性（CPA50）とそのR
ARに対するアフィニティとの間の相関関係を示す線形回
帰曲線であり、および 第５図はCRABP上への化合物Ｉおよびレチノイン酸の固
定に関する結果をプロットしたグラフである。
のレチノイン酸の核レセプタ（RAR）の検出の際のHPSEC
プロフィールを示し、第1A図はトリチウム化したレチノ
イン酸に関するものであり、第1B図はトリチウム化した
実施例１の化合物に関するものであり、 第２図はRAR上へのレチノイン酸（RA）および実施例１
の化合物の固定に係る結果を示す図であり、 第３図は実施例１の化合物（Ｉ）の濃度を固定（2nM）
し、他のレチノイド（RA、および化合物VI、VIII）の濃
度を変化（10-6M〜10-10M）させて行った競争実験結果
を示す図であり、 第４図は、レチノイドの生物学的活性（CPA50）とそのR
ARに対するアフィニティとの間の相関関係を示す線形回
帰曲線であり、および 第５図はCRABP上への化合物Ｉおよびレチノイン酸の固
定に関する結果をプロットしたグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｂ０１Ｊ 23/44 Ｃ０７Ｂ 59/00 Ｃ０７Ｂ 59/00 61/00 ３００ 61/00 ３００ Ａ６１Ｋ 49/02 Ｃ０７Ｍ 5:00 (72)発明者 フィリップ ヌードンセル フランス国 06130 グラース ブール ヴァール エミール ゾラ 10 (72)発明者 クロード マルタン フランス国 06330 グラース ル プ ラン ド グラース レジダンス ル シャルミーユ 16 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07C 63/49 G01N 33/534 G01N 33/60 A61K 51/04 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (19)
- 【請求項１】トリチウムで標識した４−（5,6,7,8−テ
トラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−アンスラセニ
ル）安息香酸。 - 【請求項２】少なくとも1875GBq/mmoleの比活性を有す
ることを特徴とする請求項１に規定したようなトリチウ
ム化４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメ
チル−２−アンスラセニル）安息香酸。 - 【請求項３】４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−
テトラメチル−２−アンスラセニル）安息香酸の多ハロ
ゲン化アルキルエステルをハロゲン化剤の作用により調
製し、該エステルを、触媒の存在下でトリチウム化還元
剤又はトリチウムで還元し、次いでけん化することを特
徴とする、請求項１又は２に記載のトリチウム化生成物
の製造方法。 - 【請求項４】４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−
テトラメチル−２−アンスラセニル）安息香酸のアルキ
ルエステルを、60〜150℃の温度にて白金及び酢酸の存
在下でトリチウム化した水との同位体交換反応に付すこ
とを特徴とする、請求項１又は２に記載のトリチウム化
生成物の製造方法。 - 【請求項５】該還元剤がトリチウムである請求項３記載
の方法。 - 【請求項６】該ハロゲン化アルキルエステルが４−（5,
6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−２−ア
ンスラセニル）安息香酸のアルキルエステルをハロゲン
化剤の作用にかけることにより得られる、請求項３記載
の方法。 - 【請求項７】該ハロゲン化剤が臭素化剤である、請求項
３記載の方法。 - 【請求項８】該使用するアルキルエステルがエチルエス
テルである、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項９】試料中のレチノイン酸の核レセプタを検出
又は定量する方法であって、該試料を請求項１の化合物
の所定量と接触させ、該請求項１の化合物と結合した該
核レセプタを検出又は定量する方法。 - 【請求項１０】該請求項１の化合物に結合した該レセプ
タの検出又は定量を、該請求項１の化合物に対する抗体
で行う、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】試料中のレチノイン酸の核レセプタを標
識する方法であって、該試料を請求項１の化合物と接触
させる方法。 - 【請求項１２】請求項１の化合物のアフィニティと比
べ、レチノイン酸の核レセプターに対するアフィニティ
を測定する方法であって、既知量の該レチノイン酸及び
結合のために競争させる請求項１の化合物を含む試料
を、該レセプタと接触させ、請求項１の化合物の該核レ
セプタへの結合の阻害を検出する方法。 - 【請求項１３】試料中の細胞レチノイン酸結合タンパク
を検出又は定量する方法であって、該試料を請求項１の
化合物と接触させ、請求項１の化合物と結合した該細胞
レチノイン酸結合タンパクを検出又は定量する方法。 - 【請求項１４】該請求項１の化合物に結合したタンパク
の検出又は定量を、該請求項１の化合物に対する抗体で
行う、請求項13記載の方法。 - 【請求項１５】試料中の細胞レチノイン酸結合タンパク
を標識する方法であって、該試料を請求項１の化合物と
接触させる方法。 - 【請求項１６】請求項１の化合物のアフィニティと比
べ、細胞レチノイン酸結合タンパクのアフィニティを測
定する方法であって、該タンパクを含む試料を、既知量
の該レチノイド及び該細胞レチノイン酸結合タンパクと
結合するための競争のための請求項１の化合物と接触さ
せ、請求項１の化合物の該細胞レチノイン酸結合タンパ
クへの結合の阻害を検出する方法。 - 【請求項１７】請求項１の化合物に対する抗体の存在を
検出する方法であって、該抗体を含む試料を請求項１の
化合物と接触させる方法。 - 【請求項１８】４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8
−テトラメチル−２−アンスラセニル）安息香酸および
レチノイドの生体内並びに細胞および細胞下分布を研究
するためのトリチウム化４−（5,6,7,8−テトラヒドロ
−5,5,8,8−テトラメチル−２−アンスラセニル）安息
香酸を有する放射性マーカー。 - 【請求項１９】４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8
−テトラメチル−２−アンスラセニル）安息香酸の生体
内、細胞内および細胞抽出物における代謝を研究するた
めのトリチウム化４−（5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,
8,8−テトラメチル−２−アンスラセニル）安息香酸を
有する放射性マーカー。
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