JP2767551B2 - Method for producing bacterial cellulose using non-PQQ-producing strain - Google Patents

Method for producing bacterial cellulose using non-PQQ-producing strain

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JP2767551B2
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Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、アセトバクター属に属
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物(こ
の微生物を以後「セルロース生産性酢酸菌」と称する)
に属するPQQ非生成株及び該株を用いるセルロース性
物質(バクテリアセルロース:BC)の製造方法に関す
る。特に、PQQを添加した培地で該PQQ非生成株を
培養してセルロース性物質を製造する方法に関する。
The present invention relates to a microorganism belonging to the genus Acetobacter and having the ability to produce cellulosic substances (this microorganism is hereinafter referred to as "cellulose-producing acetic acid bacteria").
And a method for producing a cellulosic substance (bacterial cellulose: BC) using said strain. In particular, the present invention relates to a method for producing a cellulosic substance by culturing the non-PQQ-producing strain in a medium to which PQQ has been added.

【0002】[0002]

【従来の技術】セルロース性物質は可食性であり食品分
野で利用されるほか水系分散性に優れているので食品、
化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、
水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳
化安定化助剤としての産業上利用価値がある。また、該
セルロース性物質の離解物はミクロフィブリルの構造的
物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤と
して各種の産業用用途がある。このような離解物は高い
引張弾性率を示すので該セルロース性離解物を紙状また
は固型状に固化した物質はミクロフィブリルの構造的特
徴に基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素
材としての応用がある。
2. Description of the Related Art Cellulosic substances are edible, are used in the food field, and have excellent water-based dispersibility.
Retention of viscosity of cosmetics or paints, strengthening of food material dough,
It has industrial value in retaining moisture, improving food stability, as a low-calorie additive or as an emulsion stabilizing aid. In addition, the disintegrated product of the cellulosic substance has various industrial uses as a reinforcing agent for polymers, particularly aqueous polymers, based on the structural and physical characteristics of microfibrils. Since such a defibrated material has a high tensile modulus, a material obtained by solidifying the cellulosic deflated product into a paper or solid form is expected to have excellent mechanical properties based on the structural characteristics of microfibrils, and various industrial materials. As an application.

【0003】従来より、アセトバクター属に属する微生
物を培養して、セルロースを生産する方法は知られてい
る。例えば、特開昭62−265990号公報、特開昭
61−221201等に、その記載がある。セルロース
生産性酢酸菌の培養を行なう際に適当とされている栄養
培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、燐酸ナ
トリウム及びクエン酸からなる Schramm/Hestrin 培地
(Schramm ら、J. General Biology, ll, pp.123〜129,
l954 )が知られている。しかしながら、上記栄養培地
で振盪もしくは通気攪拌培養を行なった場合、得られる
セルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満足のい
くものではなかった。また、上記栄養培地の他に、コー
ンスチープリカー(CSL)や麦芽エキス等を加えた培
地が知られているが、これら天然栄養素(ペプトン、酵
母エキス、CSL、麦芽エキスなど)に含まれる特定成
分がセルロース生成促進に関与していることは知られて
いない。培地中の特定栄養素によるセルロース生成促進
因子として現在知られているものには、イノシトール、
フィチン酸及びピロロキノリンキノン(PQQ)(特公
平5−1718号公報;高井光男,紙パ技協誌,第42
巻,第3号,第237〜244頁)等があるが、セルロ
ース生成量はまだ不十分であり、またこれらの振盪もし
くは通気攪拌培養における効果も明確ではなかった。一
方、本出願人は、カルボン酸又はその塩(特願平5−1
91467号)、インベルターゼ(特願平5−3314
91号)及びメチオニン(特願平5−335764号)
を培地中に添加することによって、セルロース性物質の
生産性が向上することを見い出している。更には、培地
にPQQを適当量添加すると、酢酸菌の生育が促進され
ることも判っている(農芸化学会誌、第66巻、第11
号、第1665〜1669頁、1992年)。
[0003] Conventionally, a method for producing cellulose by culturing a microorganism belonging to the genus Acetobacter has been known. For example, JP-A-62-265990, JP-A-61-221201, and the like disclose such information. As a nutrient medium suitable for culturing cellulose-producing acetic acid bacteria, a Schramm / Hestrin medium comprising a carbon source, peptone, yeast extract, sodium phosphate and citric acid (Schramm et al., J. General Biology, ll. , pp.123-129,
l954) is known. However, when the nutrient medium was shaken or aerated with stirring, the resulting cellulose production was low and the production rate was not always satisfactory. In addition, a medium containing corn steep liquor (CSL), malt extract, or the like in addition to the above nutrient medium is known. Specific components contained in these natural nutrients (peptone, yeast extract, CSL, malt extract, and the like) are known. Is not known to be involved in promoting cellulose production. Inositol, currently known as a factor for promoting the production of cellulose by specific nutrients in the medium,
Phytic acid and pyrroloquinoline quinone (PQQ) (Japanese Patent Publication No. 5-1718); Mitsuo Takai, Journal of Paper Technology Association, No. 42
Vol. 3, No. 3, pp. 237-244), but the amount of cellulose produced is still insufficient, and the effect of these on shaking or aeration and stirring cultures was not clear. On the other hand, the applicant of the present invention has proposed a carboxylic acid or a salt thereof (Japanese Patent Application No. 5-1)
No. 91467), invertase (Japanese Patent Application No. Hei 5-3314).
No. 91) and methionine (Japanese Patent Application No. 5-335564).
Has been found to improve the productivity of cellulosic substances by adding the compound to the medium. Furthermore, it has been found that the addition of an appropriate amount of PQQ to the culture medium promotes the growth of acetic acid bacteria (Agricultural Chemistry Society, Vol. 66, No. 11).
1665-1669, 1992).

【0004】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、セル
ロース生産性酢酸菌を用いて、経済的かつ高収率でセル
ロース性物質を生産させる新たな方法を提供することに
ある。
SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a new method for producing a cellulosic substance economically and at a high yield using a cellulosic acetic acid bacterium.

【0005】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々の研究を行ない、セルロース生
産性酢酸菌に属するPQQ非生成株を新たに創製し、該
PQQ非生成株を培養することにより、セルロース性物
質の生産性が著しく向上することを見出した。即ち、本
発明は、セルロース生産性酢酸菌に属するPQQ非生成
株、該PQQ非生成株を培養し、培地中にセルロース、
セルロース性物質を生成蓄積せしめ該物質を採取するこ
とから成るセルロース性物質の製造方法、及び該培地中
にPQQを特定濃度添加することを特徴とする該製造方
法を提供する。更に本発明はかかる製造方法によって得
られるセルロース性物質を提供する。
Means for Solving the Problems The present inventors have conducted various studies in order to achieve the above object, and newly created a PQQ non-producing strain belonging to a cellulose-producing acetic acid bacterium. It has been found that by culturing the strain, the productivity of the cellulosic substance is significantly improved. That is, the present invention provides a non-PQQ-producing strain belonging to a cellulose-producing acetic acid bacterium, culturing the non-PQQ-producing strain, and adding cellulose,
Provided are a method for producing a cellulosic substance, which comprises producing and accumulating a cellulosic substance, and collecting the substance, and a method for adding PQQ to the medium at a specific concentration. Further, the present invention provides a cellulosic substance obtained by such a production method.

【0006】本発明において使用されるPQQ非生成株
は、セルロース生産性酢酸菌、例えば、アセトバクター
・スピーシーズ(Acetobacter sp. )BPR2001
株、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinu
m )ATCC23768、アセトバクター・キシリナム
ATCC23769、アセトバクターパスツリアヌス
A.pasteurianus)ATCC10245、アセトバクタ
ーキシリナムATCC14851、アセトバクターキシ
リナムATCC11142及びアセトバクター・キシリ
ナムATCC10821等にNTG(ニトロソグアニジ
ン)を用いて公知の方法によって化学的変異処理するこ
とにより創製することができる。この中でも、アセトバ
クター・スピーシーズBPR2001(Acetobacter s
p. BPR2001)株と命名された株の分類学的性質は、形態
は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は陰性、酸素
に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽性、オキシダ
ーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成は陽性、酢酸
塩の酸化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であり、本発明の
PQQ非生成株の創製に好適である。従って、アセトバ
クター・スピーシーズに属するPQQ非生成株が本発明
の好ましい態様の一つである。尚、アセトバクター・ス
ピーシーズBPR2001株は、平成5年2月24日に
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生
物寄託センターに寄託され(受託番号FERM P−1
3466)、その後1994年2月7日付で特許手続上
の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく寄
託(受託番号FERM BP−4545)に移管されて
いる。
The non-PQQ-producing strain used in the present invention is a cellulose-producing acetic acid bacterium, for example, Acetobacter sp. BPR2001.
Strain, Acetobacter xylinu
m ) ATCC 23768, Acetobacter xylinum ATCC 23768, Acetobacter pasturianus ( A. pasteurianus ) ATCC 10245, Acetobacter xylinum ATCC 14851, Acetobacter xylinum ATCC 11142, and Acetobacter xylinum ATCC 10821, etc. using NTG (nitrosoguanidine). Can be created by chemical mutation treatment according to the method of (1). Among these, Acetobacter species BPR2001 ( Acetobacter s
(p.BPR2001) The taxonomic properties of the strain named strain were bacillus in morphology, negative in Gram stain, negative in sporulation, aerobic in oxygen, positive in catalase, negative in oxidase, and ethanol. Is positive for acetic acid production, positive for acetate oxidation, and positive for lactate oxidation, and is suitable for creating a non-PQQ-producing strain of the present invention. Therefore, a PQQ non-producing strain belonging to Acetobacter species is one of the preferred embodiments of the present invention. The Acetobacter sp. BPR2001 strain was deposited on February 24, 1993 at the Patent Microorganisms Depositary Center, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Ministry of International Trade and Industry (accession number: FERM P-1).
3466) and subsequently transferred to a deposit under the Budapest Treaty on the International Recognition of Patent Deposits on February 7, 1994 (Accession No. FERM BP-4545).

【0007】NTG等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明のPQQ
非生成株を得ることができる。また、本発明のPQQ非
生成株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても
得ることができる。該PQQ非生成株の一例であるBP
R3001C株は1994年5月2日付で通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センタ
ーに寄託され、受託番号FERM P−14297を付
されている。尚、本発明の範囲が寄託されたこの菌株に
限定されないことは言うまでもない。BPR3001C
株は本発明の一具体例にすぎないものであり、セルロー
ス生産性酢酸菌に属し、PQQを実質的に生成しない株
であれば、本発明の「セルロース生産性酢酸菌のPQQ
非生成株」に包含されるものである。
[0007] Methods for chemical mutation treatment using a mutagen such as NTG include, for example, Bio Factors, Vol. 1, p. 297-302.
(1988) and J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p. 2917-2.
929 (1989). Therefore, those skilled in the art can use the PQQ of the present invention based on these known methods.
Non-producing strains can be obtained. The non-PQQ-producing strain of the present invention can also be obtained by other mutation methods, for example, irradiation. BP which is an example of the non-PQQ non-producing strain
The R3001C strain was deposited on May 2, 1994 at the Patent Microorganisms Depositary of the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry, and has been assigned the accession number FERM P-14297. It goes without saying that the scope of the present invention is not limited to this deposited strain. BPR3001C
The strain is only one specific example of the present invention. If the strain belongs to a cellulose-producing acetic acid bacterium and does not substantially produce PQQ, the “PQQ of a cellulose-producing acetic acid bacterium” of the present invention is used.
Non-producing strains ".

【0008】本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、ガドニット、グリセリン、
エチレングリコール、エタノール等を単独或いは併用し
て使用することができる。更にはこれらのものを含有す
る澱粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビ
ート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等
をシュークロスに加えて使用することもできる。また、
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或い
はBact−Peptone、Bact−Soyton
e、Yeast−Extract、豆濃などの含窒素天
然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、2,7,9−トリカル
ボキシ−1Hピロロ〔2,3−5〕−キノリン−4,5
−ジオンを添加してもよい。生育にアミノ酸等を要求す
る栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄
養素を補添することが必要である。無機塩類としてはリ
ン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガ
ン塩、コバルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート
金属類等が使用される。
[0008] In the composition of the medium used in the production method of the present invention, sucrose, glucose, fructose, mannitol, sorbitol, galactose,
Maltose, erythrit, gadnit, glycerin,
Ethylene glycol, ethanol and the like can be used alone or in combination. Furthermore, starch hydrolyzate, citrus molasses, beet molasses, beet juice, sugarcane juice, fruit juices including citrus fruits, etc. containing these can also be used in addition to shoe cloth. Also,
As a nitrogen source, ammonium sulfate, ammonium chloride,
An organic or inorganic nitrogen source such as ammonium salt such as ammonium phosphate, nitrate, and urea can be used, or Bact-Peptone, Bact-Soyton
e, Yeast-Extract, and soybeans may be used. Amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, 2,7,9-tricarboxy-1H pyrrolo [2,3-5] -quinoline-4,5 as organic micronutrients
-A dione may be added. When using an auxotrophic mutant that requires amino acids or the like for growth, it is necessary to supplement the required nutrients. As the inorganic salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, cobalt salts, molybdates, red blood salts, chelate metals and the like are used.

【0009】培養のpHは3ないし7に、好ましくは5
付近に制御する。培養温度は10〜40℃、好ましくは
25〜35℃の範囲で行う。培養槽に供給する酸素濃度
は1〜100%、望ましくは21〜80%であれば良
い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する
菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得
るものである。本発明の製造方法に於いてPQQ非生成
株を使用することにより、従来の方法と比較して数倍な
いし十数倍にもセルロース性物質の収率が向上すること
が判明した。更に、本発明の製造方法に於いて、その培
地中に特定濃度のPQQ、即ち約0.001ng/ml〜約
0.1ng/ml、特に約0.001ng/ml〜約0.01ng
/mlの濃度となるようにPQQを添加することによっ
て、セルロース性物質の生産性がより一段と向上すると
いう、予想外の驚くべき知見が得られた。本発明方法で
は、培養方法に制限を受けず、静置、振盪もしくは通気
攪拌培養のいずれでもよい。振盪もしくは通気攪拌下で
の培養であってもセルロース生産性に影響を及ぼさない
ことも本発明方法の特徴の1つである。また、いわゆる
回分発酵法、フィード回分発酵法、反復回分発酵法及び
連続発酵法のいずれも使用することができる。更に攪拌
手段としては従来公知の手段、例えばインペラー、エア
ーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこ
れら手段の組合せ等から任意に選択することができる。
The pH of the culture is between 3 and 7, preferably 5
Control near. The cultivation temperature is in the range of 10 to 40 ° C, preferably 25 to 35 ° C. The concentration of oxygen supplied to the culture tank may be 1 to 100%, preferably 21 to 80%. Those skilled in the art can appropriately select the composition ratio of each component in the medium, the inoculation of the cells into the medium, and the like, depending on the culture method. It has been found that the use of a non-PQQ-producing strain in the production method of the present invention improves the yield of cellulosic substance several to several tens of times as compared with the conventional method. Furthermore, in the production method of the present invention, a specific concentration of PQQ in the medium, that is, about 0.001 ng / ml to about 0.1 ng / ml, particularly about 0.001 ng / ml to about 0.01 ng.
An unexpected and surprising finding was that the addition of PQQ at a concentration of / ml further increased the productivity of the cellulosic material. In the method of the present invention, the culture method is not limited, and may be any of stationary, shaking, and aeration / agitation culture. One of the features of the method of the present invention is that the cellulosic productivity is not affected even by culturing under shaking or aeration and stirring. In addition, any of so-called batch fermentation, feed batch fermentation, repeated batch fermentation, and continuous fermentation can be used. Further, the stirring means can be arbitrarily selected from conventionally known means such as an impeller, an air-lift fermenter, a pump-driven circulation of fermentation broth, and a combination of these means.

【0010】本発明の方法によって生成されるセルロー
ス性物質はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。不純物を取り除く
ためには水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トル
エン及び酢酸エチルなどの極性有機溶媒による処理、次
亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処
理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリ
ル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤によ
る処理、常温から200℃の範囲の加熱洗浄などを単独
及び併用してほどこすことによりセルロース性物質から
不純物を除去することができる。このようにして得られ
た本発明でいうセルロース性物質とは、セルロース及
び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及び
β−1,3、β−1,2等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。なおこれ等の多糖が単一物
質である場合もあるし2種以上の多糖が水素結合等によ
り混在してもよい。
The cellulosic substance produced by the method of the present invention may be recovered as it is, or may be subjected to a treatment for removing substances other than cellulosic substances such as bacterial cells contained in the substance. To remove impurities, washing with water, dehydration under pressure, washing with diluted acid, washing with alkali, treatment with a polar organic solvent such as toluene and ethyl acetate, treatment with a bleach such as sodium hypochlorite and hydrogen peroxide, and bacteria such as lysozyme Removal of impurities from cellulosic substances by treatment with solubilizing enzymes, treatment with surfactants such as sodium lauryl sulfate and deoxycholic acid, and heating and washing in the range from room temperature to 200 ° C, alone or in combination Can be. The cellulosic material thus obtained in the present invention includes cellulose, a substance containing a heteropolysaccharide having cellulose as a main chain, and a substance containing glucan such as β-1,3, β-1,2. Components other than cellulose in the case of heteropolysaccharide are mannose, fructose, galactose, xylose,
Hexoses such as arabinose, rhamnose, glucuronic acid,
Pentose and organic acids. These polysaccharides may be a single substance, or two or more polysaccharides may be mixed by hydrogen bonding or the like.

【0011】[0011]

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。実施例1 以下に記載する方法で、本発明のPQQ非生成株である
BPR3001C株を創製した。 (1)NTGによる変異処理 BPR2001をグリセロールストックよりCSL−F
ru培地100mlを仕込んだ750ml容ルーフラスコに
植菌し28℃で3日間静置培養した。培養後ルーフラス
コをよく振って菌体をセルロース膜よりはがした後、無
菌的に培養液をガーゼろ過し、ろ液として菌液を得た。
得られた菌液2mlを0.2%セルラーゼ(メイセラーゼ
P1)を含む20mlCSL−Fru培地(100mlフラ
スコ)に植菌し28℃、24h、180rpm振とう培
養した。培養後、培養液10mlを0.2%セルラーゼを
含むCSL−Fru培地10ml(100mlフラスコ)に
植菌し、さらに3h同じ条件で振とう培養した。培養液
より遠心分離(5000rmp,5min)により集菌
し、さらに50mMリン酸緩衝液で(pH6.5)洗菌
した。洗菌後菌体を20mlリン酸緩衝液に再度懸濁し
た。菌体懸濁液4.5mlにNTG溶液(100μg/m
l)0.5mlを加え、20ml容アシストチューブ中で3
0℃、30min、振とうした。また、このときコント
ロールとして0.5mlの滅菌水を加えたものも用意し
た。振とうが終了した後、遠心分離にて集菌し、さらに
CSL−Fru培地で3回洗菌した。洗菌後、0.2%
セルラーゼを含んだCSL−Fru培地5mlに菌体を懸
濁し、その0.1mlを生菌数の測定のためCSL−Fr
uプレートにまき、残りは変異を固定するためそのまま
30℃で一夜振とう培養した。培養液に等量の30%グ
リセロールを加え1mlづつアシストチューブに分注し、
−80℃にて凍結保存した。上記の条件での生存率は約
1.4%であった。
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Example 1 A BPR3001C strain, which is a non-PQQ-producing strain of the present invention, was created by the method described below. (1) Mutation treatment with NTG BPR2001 was converted from Cglyc-F
The cells were inoculated into a 750 ml roux flask containing 100 ml of ru medium, and cultured at 28 ° C. for 3 days. After the culture, the roux flask was shaken well to remove the cells from the cellulose membrane, and then the culture solution was aseptically filtered with gauze to obtain a bacterial solution as a filtrate.
2 ml of the obtained bacterial solution was inoculated into a 20 ml CSL-Fru medium (100 ml flask) containing 0.2% cellulase (Meisserase P1), and cultured at 28 ° C. for 24 hours with shaking at 180 rpm. After the culture, 10 ml of the culture solution was inoculated into 10 ml (100 ml flask) of a CSL-Fru medium containing 0.2% cellulase, and further cultured under shaking under the same conditions for 3 hours. The cells were collected from the culture by centrifugation (5000 rpm, 5 min), and further washed with 50 mM phosphate buffer (pH 6.5). After washing, the cells were resuspended in 20 ml phosphate buffer. An NTG solution (100 μg / m 2) was added to 4.5 ml of the cell suspension.
l) Add 0.5 ml and add 3 ml in a 20 ml assist tube.
Shake at 0 ° C. for 30 minutes. At this time, a control to which 0.5 ml of sterilized water was added was also prepared as a control. After completion of the shaking, the cells were collected by centrifugation, and further washed three times with a CSL-Fru medium. 0.2% after washing
The cells were suspended in 5 ml of CSL-Fru medium containing cellulase, and 0.1 ml of the suspension was used for measurement of viable cell count.
The resultant was spread on a u-plate, and the rest was cultured with shaking at 30 ° C. overnight to fix the mutation. Add an equal volume of 30% glycerol to the culture solution and dispense 1 ml at a time into the assist tube.
Stored frozen at -80 ° C. The survival rate under the above conditions was about 1.4%.

【0012】(2)PQQ非生成株のスクリーニング NTG処理したBPR2001を100mg/l のブロモ
クレゾールグリーンを含むYPGプレートにプレーティ
ングし、28℃で3〜5日培養した。培養後、黄色いハ
ローを作らないコロニーを選択した。さらに、選択した
コロニーより、エタノールオキシダーゼ活性を持たない
株を選択することによりBPR3001C株及び他のP
QQ非生成株を得た。
(2) Screening for non-PQQ-producing strain NTG-treated BPR2001 was plated on a YPG plate containing 100 mg / l bromocresol green, and cultured at 28 ° C for 3 to 5 days. After the culture, a colony that did not produce a yellow halo was selected. Further, by selecting a strain having no ethanol oxidase activity from the selected colonies, the BPR3001C strain and other P
A QQ non-producing strain was obtained.

【0013】次にグリセロールストックより菌をCSL
−Fru培地100mlを仕込んだ750ml容ルーフラス
コに植菌し28℃で3日間静置培養した。培養後ルーフ
ラスコをよく振って菌体をセルロース膜よりはがした
後、菌液12.5mlを0.2%メイセラーゼを含むCS
L−Fru培地を112.5ml含むフラスコに植菌し、
28℃、180rpm、24時間振盪培養した。これら
の菌について M. Ameyama, M. Nonobe, E. Shinagawa,
K. Matsushita,and O. Adachi, Analytical Biochem.,
151, 263-267 (1985) 記載の方法によりPQQ濃度を測
定した。結果を表1に示す。
[0013] Next, the bacteria are separated from the glycerol stock by CSL.
-Inoculated in a 750 ml roux flask charged with 100 ml of Fru medium, and incubated at 28 ° C. for 3 days. After the culture, shake the roux flask well to remove the cells from the cellulose membrane, and then add 12.5 ml of the bacterial solution to CS containing 0.2% mecerase.
Inoculating a flask containing 112.5 ml of L-Fru medium,
Shaking culture was performed at 28 ° C. and 180 rpm for 24 hours. About these fungi, M. Ameyama, M. Nonobe, E. Shinagawa,
K. Matsushita, and O. Adachi, Analytical Biochem.,
151, 263-267 (1985). The PQQ concentration was measured. Table 1 shows the results.

【0014】[0014]

【表1】 表1からBPR3001C株が培地及び菌体中に実質的
にPQQを生成しないことが判る。
[Table 1] From Table 1, it can be seen that the BPR3001C strain does not substantially produce PQQ in the medium and the cells.

【0015】実施例2 実施例1で創製されたBPR3001C株を用いて本発
明の製造方法によって、セルロース性物質を製造した。
フラスコ培養による培養条件は以下のとおりである。 ・フラスコ培養 グリセロールストックより培地100mlを仕込んだ75
0ml容ルーフラスコに植菌し28℃で3日間静置培養し
た。培養後ルーフラスコをよく振って菌体をセルロース
膜よりはがした後、菌液12.5mlを112.5mlの培
地を含む500ml縦型バッフルフラスコに植菌し、28
℃、180rpm、4日間培養した。培地は、CSL−
Glcを用いた。また、ジャー培養による培養条件は以
下のとおりである。 ・1lジャー培養 グリセロールストックよりCSL−Fru培地100ml
を仕込んだ750ml容ルーフラスコに植菌し28℃で3
日間静置培養した。培養後ルーフラスコをよく振って菌
体をセルロース膜よりはがした後、菌液12.5mlを1
12.5mlの培地を含む500mlフラスコに植菌し、2
8℃、180rpm、3日間培養した。培養液をブレン
ダーにより無菌的に離解し、その60mlを540mlのC
SL−Glc培地を仕込んだ1lジャーに植菌し、pH
をNH3 ガスおよび1NH2 SO4 で4.9〜5.1に
制御しながら、溶存酸素量(DO)が3.0%以上にな
るように回転数を自動制御しながら、メイン培養を行っ
た。以上の結果を表2及び表3に示す。
Example 2 Using the BPR3001C strain created in Example 1, a cellulosic substance was produced by the production method of the present invention.
The culture conditions by flask culture are as follows. -Flask culture 75 containing 100 ml of medium from glycerol stock
The cells were inoculated in a 0-ml roux flask and cultured at 28 ° C. for 3 days. After the culture, the roux flask was shaken well to remove the cells from the cellulose membrane, and 12.5 ml of the bacterial solution was inoculated into a 500 ml vertical baffle flask containing 112.5 ml of a medium.
The cells were cultured at 180 ° C. for 4 days. The medium is CSL-
Glc was used. The culture conditions for the jar culture are as follows.・ 1l jar culture 100ml of CSL-Fru medium from glycerol stock
And inoculated in a 750 ml roux flask,
The culture was allowed to stand for a day. After the culture, shake the well flask to remove the cells from the cellulose membrane.
Inoculate a 500 ml flask containing 12.5 ml of medium,
The cells were cultured at 8 ° C. and 180 rpm for 3 days. The culture solution is aseptically disintegrated with a blender, and 60 ml of the mixture is mixed with 540 ml of C
Inoculate a 1-liter jar charged with SL-Glc medium,
Main culture is performed while controlling the rotation speed automatically so that the dissolved oxygen amount (DO) becomes 3.0% or more while controlling the pH to 4.9 to 5.1 with NH 3 gas and 1NH 2 SO 4. Was. The above results are shown in Tables 2 and 3.

【0016】[0016]

【表2】 炭素源 グルコース[Table 2] Carbon source glucose

【0017】[0017]

【表3】 炭素源 グルコース 培養時間 45時間[Table 3] Carbon source Glucose Incubation time 45 hours

【0018】実施例3 次に、本発明のPQQ非生成株BPR3001CをCS
L−Suc培地(但し、ショ糖 70g/l、CSL
10ml/l)を用い、さらにPQQを0.001〜10
ng/ml添加して、実施例2と同様の方法により1lのジ
ャーで培養した。得られた結果を以下の表4に示す。
Example 3 Next, the non-PQQ-producing strain BPR3001C of the present invention was
L-Suc medium (however, sucrose 70 g / l, CSL
10 ml / l), and PQQ was further reduced to 0.001 to 10
After adding ng / ml, the cells were cultured in a 1-liter jar in the same manner as in Example 2. The results obtained are shown in Table 4 below.

【0019】[0019]

【表4】 炭素源 ショ糖 この結果から、本発明のPQQ非生成株の培養に際し
て、PQQを適当量添加することにより、セルロース性
物質の生産が更に向上することが判る。また、この際
に、菌株の生育自体にはPQQ添加による影響は見られ
なかった。以上、本明細書中に記載されている培地の組
成は以下の通りである。
[Table 4] From these results, it can be seen that the production of cellulosic substances is further improved by adding an appropriate amount of PQQ during the cultivation of the non-PQQ-producing strain of the present invention. At this time, the growth itself of the strain was not affected by the addition of PQQ. The composition of the medium described in the present specification is as follows.

【0020】CSL−Fru培地CSL-Fru medium

【表5】 成分 最終濃度(mM) (NH4)2 SO4 25 KH2 PO4 7.3 MgSO4 1.0 FeSO4 0.013 CaCl2 0.10 Na2 MoO4 0.001 ZnSO4 0.006 MnSO4 0.006 CuSO4 0.0002 ビタミン混合物(下記) 10ml/1 炭素源 適量 CSL 適量 消泡剤 0.01v/v% 最終pH=5.0±0.2 (特に指定しない限り、フラクトース 40g/l、C
SL 20ml/l) CSL−Glc培地 CSL−Fru培地のフラクトースをグルコースに換え
たもの(特に指定しない限り、グルコース 40g/
l、CSL 20ml/l) CSL−Suc培地 CSL−Fru培地のフラクトースをショ糖に換えたも
の(特に指定しない限り、ショ糖 40g/l、CSL
20ml/l)
Table 5 Component final concentration (mM) (NH 4 ) 2 SO 4 25 KH 2 PO 4 7.3 MgSO 4 1.0 FeSO 4 0.013 CaCl 2 0.10 Na 2 MoO 4 0.001 ZnSO 40 0.006 MnSO 4 0.006 CuSO 4 0.0002 Vitamin mixture (described below) 10 ml / 1 carbon source qs CSL qs Defoamer 0.01 v / v% Final pH = 5.0 ± 0.2 (Unless otherwise specified, Fructose 40g / l, C
SL 20 ml / l) CSL-Glc medium The fructose of the CSL-Fru medium was replaced with glucose (unless otherwise specified, glucose 40 g / l).
l, CSL 20 ml / l) CSL-Suc medium The fructose of the CSL-Fru medium was changed to sucrose (unless otherwise specified, sucrose 40 g / l, CSL
20ml / l)

【0021】[0021]

【表6】 [Table 6]

【0022】YPF培地 酵母エキス(Difco) 5g/l バクトペプトン 5g/l フラクトース 40g/l YPG培地 酵母エキス(Difco) 5g/l バクトペプトン 5g/l グルコース 40g/l 寒天培地は2%の寒天を加える。YPF medium Yeast extract (Difco) 5 g / l Bacto peptone 5 g / l Fructose 40 g / l YPG medium Yeast extract (Difco) 5 g / l Bacto peptone 5 g / l Glucose 40 g / l Agar medium is added with 2% agar. .

【0023】尚、以上の表中、セルロース量(g/l)
は、培養終了後、ジャーファメンター内の固形物を集積
し、水洗して培地成分を除去した後、1%NaOH水溶
液中で110℃、20分間処理して菌体を除去した。さ
らに、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロースを水
洗した後、80℃で12時間真空乾燥して乾燥重量を測
定することで求めた。また収率(%)は以下のようにし
て求めた。 対消費糖収率(%)の計算 対消費糖収率は、対消費糖収率として以下のように計算
した。
In the above table, the amount of cellulose (g / l)
After the completion of the culture, the solid matter in the jar fermenter was accumulated, and the components were removed by washing with water. After that, the cells were treated in a 1% NaOH aqueous solution at 110 ° C. for 20 minutes to remove the cells. Further, the resulting cellulose was washed with water until the washing liquid became nearly neutral, and then vacuum-dried at 80 ° C. for 12 hours, and the dry weight was measured. The yield (%) was determined as follows. Calculation of yield to consumed sugar (%) The yield to consumed sugar was calculated as the yield to consumed sugar as follows.

【数1】YBC=BC/(RCMF−RCBF)*100 YBC :対消費糖収率(%) BC :BC蓄積量(g/l) RCMF:培地の糖濃度(g/l) RCBF:培養後の培地の糖濃度(g/l)[Number 1] Y BC = BC / (RC MF -RC BF) * 100 Y BC: vs. consumption sugar yield (%) BC: BC accumulation amount (g / l) RC MF: medium sugar concentration (g / l ) RC BF : Sugar concentration (g / l) of medium after culturing

【0024】[0024]

【発明の効果】本発明方法によるセルロース性物質の生
産において、セルロース生産性酢酸菌のPQQ非生成株
を用いることによって、セルロース性物質の生産性が従
来法と比べて著しく向上する。更に、培地中にPQQを
適当量添加することにより、セルロース性物質の生産が
一段と向上する。このことは、本発明方法がセルロース
を効率よくかつ安価に製造できることを示している。
According to the present invention, in the production of a cellulosic substance by the method of the present invention, by using a non-PQQ-producing strain of cellulosic acetic acid bacteria, the productivity of the cellulosic substance is remarkably improved as compared with the conventional method. Furthermore, by adding an appropriate amount of PQQ to the medium, the production of cellulosic substances is further improved. This indicates that the method of the present invention can produce cellulose efficiently and at low cost.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉永 文弘 神奈川県川崎市高津区坂戸3丁目2番1 号 株式会社バイオポリマー・リサーチ 内 (72)発明者 松岡 昌伸 神奈川県川崎市高津区坂戸3丁目2番1 号 株式会社バイオポリマー・リサーチ 内 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12P 19/04 CA(STN)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (72) Inventor Fumihiro Yoshinaga 3-2-1 Sakado, Takatsu-ku, Kawasaki City, Kanagawa Prefecture Within Biopolymer Research Inc. (72) Inventor Masanobu Matsuoka 3-chome Sakado, Takatsu-ku, Kawasaki City, Kanagawa Prefecture No. 2 No. 1 Biopolymer Research Inc. (58) Field surveyed (Int. Cl. 6 , DB name) C12P 19/04 CA (STN)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】 セルロース生産性酢酸菌に属するPQQ
非生成株。
1. A PQQ belonging to a cellulose-producing acetic acid bacterium.
Non-producing strain.
【請求項2】 請求項1に記載のPQQ非生成株を培養
し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積させ、該物質
を回収することから成る該セルロース性物質の製造方
法。
2. A method for producing a cellulosic substance, comprising culturing the non-PQQ-producing strain according to claim 1, producing and accumulating a cellulosic substance in a medium, and collecting the substance.
【請求項3】 培地中にPQQを約0.001〜約0.
1ng/ml添加することを特徴とする請求項2に記載の製
造方法。
3. The method according to claim 1, wherein PQQ is contained in the medium in an amount of about 0.001 to about 0.
The method according to claim 2, wherein 1 ng / ml is added.
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