JP2736502B2 - 共形質転換された真核細胞 - Google Patents
共形質転換された真核細胞Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝情報物質、即ち蛋
白質様物質に関するコードを行う遺伝子および／または
該蛋白質様物質の製造を調節するかさもなければそれに
影響する遺伝子を含むDNA を導入された植物界および動
物界の生物を含む超動植物真核生物として分類された生
物の細胞に関するものである。かゝる遺伝的干渉は一般
に遺伝子工学と呼ばれ、そしてある面では組換え体DNA
技術の用途を含むものである。開示される本発明は特に
DNA を導入されたバクテリアを含む超動植物原核生物の
細胞とは区別されるべきである。この区別は真核細胞と
原核細胞との基本的な相違による面に基づくもので、前
者は外被および減数分裂によって形成された真核によっ
て特徴づけられ、後者は輪郭の明瞭な核の不在および減
数分裂の不在によって特徴づけられる。更に遺伝レベル
では真核生物の多くの遺伝子は連続した同一線状でない
コードしていない連鎖によって分裂せられ、一方原核生
物においては遺伝子は連続した同一線状である。 【０００２】 【従来の技術】殆どの部分に関連する原核生物、特にバ
クテリアについての理解は真核生物の理解における進歩
とは独立して進歩したけれども、原核生物を含むある種
の発展を述べることは本発明の評価にとって助けになる
ことであろう。１９４４年に、Avery は細胞遺伝子のDN
A 仲介転移を用いた原核細胞の形質転換を報告した（Av
ery, O.T. 等、J. Exp. Med. 79: 137〜158 (1944)）。
その後、文献において形質転換された原核細胞の報告が
現れた。１９７５年に、Cohen等は原核生物エシェリチ
ア コリの第１形質転換、次いで共形質転換を含む結果
を報告した（Kretschmer, P. J. 等、J. Bacteriology
124:225 〜231(1955) ）。その中に報告された実験にお
いて、著者等は腸内バクテリアの多くの種類のものにお
いて自然に生じるプラスミドDNA 、即ち染色体外DNA を
用いた原核細胞の共形質転換を開示した。これらの実験
においては、CaCl2 −処理のバクテリア集団における特
殊な細胞は優先的に形質転換を起こすことが見出され
た。 【０００３】またその間に原核細胞による実験とは実質
的に独立して真核細胞による実験が進められた。１９６
２年に（Szybalska, E. H.とSzybalski, W. PNAS 48:20
26 (1962）) は形質転換された哺乳動物細胞の、しかし
ながら自然的な隔世遺伝を単に受けただけの細胞と形質
転換とを区別することが不可能な程度の低い頻度で形質
転換された細胞を報告した。再び原核細胞によるのであ
るが、真核形質転換の報告が更に文献に現れた。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、原核細
胞に付いての形質転換では、プラスミドは染色体DNA の
中に取り入れられない公算が大きいために形質転換の頻
度および得られた形質転換の安定性は低い。結果とし
て、数世代の後には共形質転換体は獲得した形質を失っ
た。加うるに、バクテリアによるこれら実験は表現を得
るためには形質転換DNA に対する遺伝子プロモーターの
添加を必要とする。 【０００５】また形質転換された真核細胞に付いての報
告の結果は、屡々他の人々によって再現せられ得なかっ
た。加うるに、形質転換の低頻度、遺伝表現に対する分
子的基礎の理解の不足、そして分子雑種形成プローブの
不足はこの領域における進歩の不足の因をなすものであ
る。結果として形質転換された真核細胞についての研究
は本質的にウイルス遺伝子に限られていた（Graham, F.
L.等、Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 39:637
〜650(1975) および McCutchen, J. H. およびPagano,
J. S., Jounal National Cancer Institute, 41:351〜3
57(1968) ）。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は上記従来の問題
点を解決するための手段として、外来DNA(A)分子と、真
核細胞に対してメトトレキセイト耐性を与えるジハイド
ロフォレイト リダクターゼをコードしている増幅可能
な遺伝子であるDNA(B)分子との結合によって形成された
一つの分子によって共形質転換された真核細胞を提供す
るものであり、該外来DNA(A)は主として選択可能な表現
型に関連しない蛋白質物質例えばインターフェロン蛋白
質、インシュリン、成長ホルモン、凝固因子、ウイルス
抗原または抗体、一つの酵素等をコードしている。 【０００７】［術語の説明］本発明を説明するに先立
ち、以後に用いられるべき幾つかの術語の定義を述べる
ことは本発明の理解を助けるものであろう。形質転換と
は精製されたDNA の導入によって仲介される受理細胞の
遺伝型の変換のための方法を意味する。形質転換は典型
的には該受理細胞の生化学的または形態学的性質のいず
れかにおける変更が結果として起こる受理細胞の表現型
における安定な遺伝性の変化によって検知される。共形
質転換とは一つ以上の異なった遺伝子によって受理細胞
の形質転換を行うための方法を意味する。共形質転換は
化学的に結合されていない遺伝子かまたは化学的に結合
されている遺伝子のいずれかに相当するDNA の導入によ
って仲介される受理細胞の遺伝型における同時的な変化
および連続的な変化の双方を含む。蛋白質様物質はアミ
ノ酸から形成される如何なる生体高分子をも意味する。
遺伝型とはその物理的外観から区別されるようなある生
物の遺伝的構成を意味する。表現型とは環境と同時に遺
伝型によって造られるようなある生物の観察し得る性質
を意味する。選択可能な表現型とは該表現型を所有しな
いすべての生物を絶滅させる条件下で生物に生存する能
力を与える耐性を獲得する表現型である。例としては医
薬品耐性、または与えられた成長培地において細胞代謝
に必要ないくつかの分子を合成する能力を含む。ここに
用いられるように、選択可能な表現型はまた、例えば細
胞を通過するかまたは細胞によって分泌せられる、そし
て官能性の検定免疫学的な検定または生化学的な検定の
いずれかによって新しい表現型として検知されることが
出来る物質の製造のような識別し得る表現型を含む。イ
ンターフェロン蛋白質とはグリコプロティンインターフ
ェロンの蛋白質様部分、即ち糖部分の除去の後に残った
部分を意味する。それは人間の白血球、フィブロブラス
ト、またはリンパ胞胚細胞から誘導されるインターフェ
ロンの蛋白質部分を含む。染色体DNA とは真核細胞の核
の中に存する染色体の形状において正常にヒストンと結
合されたDNA を意味する。転写とはDNA の中に含まれる
遺伝情報によるRNA 鎖の形成を意味する。翻訳とはm-RN
A 分子のなかの遺伝情報がそれによって蛋白質合成の間
に特定のアミノ酸の順序を指示する過程を意味する。 【０００８】［真核細胞の共形質転換］より最近、しか
しながら、特に哺乳動物細胞で選択可能な表現型をコー
ドしている外来DNA により形質転換された真核細胞が報
告された（Wigler, M.等、Ｃell 11: 223 〜232 (197
7)）。この仕事は拡張され真核細胞が共形質転換される
ことが出来、真核細胞の核の染色体DNA の中に集積され
る外来DNA を得るインターアリアが表現されるという本
発明の真核細胞が結果として生じた。更に予期せざるこ
とであるがこのような外来DNA は共形質転換体によって
表現されることが出来、官能性の蛋白質を生ずることが
発見された。加うるに原核生物と対照してみると、外来
DNA は数百の世代にわたって着実に表現せられ、その結
果は外来DNAを染色体DNA の中に集積することによるも
のと考えることが出来る。 【０００９】［原核細胞における真核遺伝子による蛋白
質様物質の生合成］本発明の真核細胞は蛋白質様物質、
特に例えばインターフェロン蛋白質、抗体、インシュリ
ンのような真核原質の蛋白質の商業的調製におけるバク
テリアシステムを包括する大いなる進歩を提供する。こ
のような利点はこのような蛋白質様物質の前駆物質をコ
ードしている不変遺伝子を使用する能力を含む。細胞の
合成の後、該前駆物質は真核細胞の中において処理せら
れ、または転換せられて生物学的有効体の所望の分子を
生成する。この現象は細胞の中において適当なペプタイ
ド開裂によって活性インシュリンに転換するプレピロイ
ンシュリンとして真核細胞において最初に造られるイン
シュリンに対してよく知られている。原核細胞はプレプ
ロインシュリンをインシュリンに転換するための必須細
胞機構が不足しているので、インシュリンに取り込まれ
た真核遺伝子の原核細胞中への挿入は結果としてインシ
ュリンではなくプレプロインシュリンの製造をきたすで
あろう。比較的小さくそしてよく特徴づけられた蛋白質
であるインシュリンの場合、この困難性は適当な遺伝子
の化学的合成によって打ち勝つことが出来るけれども、
このようなアプローチは所望の蛋白質のアミノ酸連鎖の
理解の水準によって本質的に制限される。かくして正確
なアミノ酸連鎖がまだ知られていないインターフェロン
蛋白質、凝固因子、抗体およびよく特徴づけられていな
い蛋白質に対しては、原核システムは多分満足に証明さ
れてはいないであろう。 【００１０】［真核細胞における真核遺伝子による蛋白
質様物質の生合成］対比すれば、真核システムは真核細
胞が必要な処理機構を有しているので、このような障害
は伴わない。かくして本発明はアミノ酸系列の詳細な分
子の理解を必要とせずに、例えばインターフェロン蛋白
質、インシュリン、抗体等のような所望の蛋白質様物質
を製造する共形質転換された真核細胞を提供する。 【００１１】活性蛋白質を製造するためには取り除かれ
ねばならない余分のアミノ酸を有する前駆物質の問題に
加えて、重要な生物学的物質が合成および開裂の後の化
学的付加によって変性されるであろう。かくして例えば
人間において造られるインターフェロンは蛋白質に加え
て糖分子を含むグリコプロティンである。もしバクテリ
ア細胞において製造されるならば、インターフェロンは
人間細胞においてインターフェロンが造られる場合に付
加される糖分子は欠如している。更にバクテリアの中に
おいて造られる蛋白質様物質はもし該蛋白質様物質が有
意な精製なくして哺乳動物に与えられるならば炎症を起
こし得るであろう内毒素を含む。対比すれば、真核細胞
において造られるインターフェロンは内毒素を含んでい
ないであろう。それ故に本発明はまたバクテリア細胞で
は造られることの出来ない、例えばグリコプロティンの
ような非蛋白質様物質および蛋白質様物質を含む化合物
を製造する共形質転換された真核細胞を提供する。 【００１２】 【作用】本発明の真核細胞は該真核細胞に由来しない優
性の選択可能な表現型に対する増幅可能な遺伝子に関連
しているDNA(B)分子と目的とする蛋白質様物質をコード
している外来DNA(A)分子とによって共形質転換される。
そしてこのように形質転換された真核細胞は、該増幅可
能な遺伝子が増幅された真核細胞の生存または識別を可
能ならしめる試薬であるメトトレキセイト( 以下mtx と
略称する）の連続的に高められる濃度の存在下において
培養される。該DNA(A)分子は予じめ該DNA(B)分子と化学
的に結合されてから該真核細胞に挿入されるか、あるい
は該DNA(A)分子は該真核細胞内で該DNA(B)分子と化学的
に結合し、該真核細胞において、増幅可能なDNA(B)分子
の増幅に伴って、外来DNA(A)分子が増幅される。本発明
の該真核細胞中に挿入されるDNA(A)としては特に例えば
インターフェロン蛋白質、インシュリン、成長ホルモ
ン、凝固因子、ウイルス抗原、抗体および幾つかの酵素
のような選択可能な表現型とは関連を持たない蛋白質様
物質をコードしているDNA が適している。本発明の真核
細胞は、従来の手法によって得ることの出来ない量の所
望の蛋白質様および他の物質を合成することが可能であ
る。 【００１３】［詳細な説明］本発明によれば、外来DNA
(A)は形質転換によって獲得されることなくして細胞に
よって表現せられない選択可能な表現型を遺伝的にコー
ドしていることを含むDNA(A)で、そして化学的に結合さ
れていない外来DNA(B)で細胞を共形質転換することによ
っていかなる真核細胞の中へも外来DNA(A)が挿入され得
る。該共形質転換は適当な成長培地において、そして生
き残るかさもなければ改変される細胞のみが選択可能な
表現型を獲得した細胞であるような選択された条件の存
在において行われる（図１参照）。 【００１４】以後に検討される実施は例えば人間血液細
胞、マウス フィブロブラスト、チャイニズハムスター
卵巣細胞、およびマウス奇形がん腫細胞のような哺乳動
物系統の培養された真核細胞に関するものであるけれど
も、一般に例えば鶏のような鳥類からの細胞、イースト
および菌の細胞、穀物や花を含む植物からの細胞のよう
なすべての真核細胞に対して適用できることが明らかで
ある。それ故に本発明の真核細胞は終局的には哺乳動物
の細胞がもっとも適しているが、本発明の真核細胞はす
べての真核生物の細胞で適用が可能であると理解される
べきである。 【００１５】本発明の真核細胞は選択可能な表現型に結
合していない蛋白質様物質をコードしている遺伝子を含
む外来DNA を該真核細胞の中への挿入にされている場合
に特に有用である。このような蛋白質様物質はこれらが
選択可能な表現型と結合されていないという事実によっ
て特徴づけられているので、コードしているDNA を含む
細胞はそれ故に形質転換された細胞の破壊とその含有量
の測定による以外には識別されることは出来ない。 【００１６】蛋白質様物質の例としては共形質転換方法
を用いて真核細胞の中へ挿入せられそして表現せられる
遺伝子はインターフェロン蛋白質、インシュリン、成長
ホルモン、凝固因子、ウイルス抗原、酵素および抗体を
含む。 【００１７】ある場合にはDNA(A)とDNA(B)は集積と表現
とを得るために精製せられる必要はないけれども、該DN
A が共形質転換細胞において用いられるに先立って精製
せられることは屡々好ましい。このような精製は不純物
の存在のために不正の結果の可能性を制限し、そして共
形質転換細胞が識別されそして安定に培養され得る確率
を増加する。また本質的ではないけれども、DNA(A)およ
び／またはDNA(B)が例えば真核染色体DNA のエンドヌク
レアーゼ切断の制限のように染色体供与DNA のエンドヌ
クレアーゼ切断によって得られていることは時には望ま
しいことである。加うるに、共形質転換真核細胞におい
て用いられるに先立ってDNA(A)とDNA(B)が燐酸カルシウ
ムで処理されることは望ましい。DNA を燐酸カルシウム
でこのように処理するための方法は以下により完全に記
述される。最後に、外来DNA(A)はDNA(A)の超過量を構成
する選択可能な表現型をコードしているDNA(B)と比例し
た量、例えば約１：１から約100,000 ：１の範囲の量で
存在することが望ましい。 【００１８】本発明の好ましい実施例において、外来DN
A(A)および／または外来DNA(B)は共形質転換真核細胞に
おいて使用するに先立ちバクテリアのプラスミドまたは
ファージDNA と接触させられる。特に前途有望な実施例
においては、外来DNA(A)および／またはDNA(B)はファー
ジDNA と接触せられ、そしてそれから共形質転換に先立
ってファージ粒子の中へ包含される。 【００１９】選択可能な表現型をコードしているいかな
るDNA(B)も本発明の形質転換された真核細胞においては
有用であろうけれども、記述される実験の詳細は特にヘ
ルペス単純ウイルスから得られたチミジン キナーゼ
（以下tkと略称する）に対する遺伝子の使用とアデニン
ホスホリボシル トランスフェラーゼ（以下aprtと略
称する）に対する遺伝子の使用とに関する。加うるに医
薬品耐性に結合された選択可能な表現型をコードしてい
る遺伝子、例えば細胞にメトトレキセイトに対する耐性
を与える突然変異種のジハイドロフォレイト リダクタ
ーゼ（以下dhfrと略称する）遺伝子を含むDNA(B)は該形
質転換された真核細胞の適用可能性を拡張する。 【００２０】好ましい実施例によれば、共形質転換は物
理的にそして化学的にDNA(B)に結合されていないDNA(A)
を含み、そして該DNA(A)は共形質転換された真核細胞の
核の中において染色体DNA の中へ安定に集積される。 【００２１】本発明の真核細胞は培地において共形質転
換された該真核細胞が生き残ることが出来、そして／ま
たは識別され得ることが出来ることにおいてのみ制限さ
れるいかなる適当な培地においても獲得される。単に例
のためだけによれば、tk遺伝子を獲得したマウス フィ
ブロブラストに対する適用な培地は以後により完全に記
述されるHAT である。また、共形質転換は選択可能な表
現型を獲得したこれら細胞の生き残ることの出来る、そ
して／または識別され得る選択された条件の存在下にお
いて行われる。このような条件は養分、医薬、または他
の化学的拮抗剤、温度等の存在を含むであろう。 【００２２】本発明の真核細胞は該技術においてよく知
られた手法を用いて該細胞から回収せられることが出来
る所望の物質をコードしている外来DNA(A)を含む。加う
るに、該細胞はDNA(A)を転写して再びよく知られた手法
を用いて回収せられる蛋白質または他の所望の物質を形
成することを可能にし得る。最後に、該細胞は培地にお
いて成長せられ、そしてそれから蛋白質や他の所望の物
質を回収して得ることが出来る。 【００２３】以上に識別された所望の蛋白質様物質は天
然物質であるけれども、合成遺伝子が組み立てられる合
成生体高分子の製造においても共形質転換された該真核
細胞は等しく有用であり得る。かくして本発明の真核細
胞はまだ存在していない新規な蛋白質を製造する。加う
るに、本発明の真核細胞はそれらが現在存在しているけ
れどもそれらの単離および／または識別が特別に成就さ
れることが出来ないかのような極めて僅かの量または不
純な形状において行なう蛋白質の製造を可能にする。最
後に本発明の真核細胞は例えばグリコプロティンおよび
他の産物のような部分的に蛋白質様の物質の製造を可能
とし、この物質の合成は遺伝的に指示される。 【００２４】細胞の中において形成される遺伝子産物の
量を増加するために、真核細胞に転移遺伝子の増幅の挿
入が行われる。外来DNA(A)分子の増幅を真核細胞の中へ
挿入するため、増幅DNA(A)分子でおよび別段細胞によっ
て表現せられない優性の選択可能な表現型に対して増幅
可能な遺伝子の増幅に相当する化学的に結合していない
増幅外来DNA(B)分子で細胞を共形質転換する。この共形
質転換過程は適当な培地において、そして優性の選択可
能な表現型を獲得する細胞が生き残ること、そして／ま
たは該細胞を識別することが出来るmtx の存在において
行われる。望ましくは、増幅し得る優性遺伝子（DNA
(B)）の最高の数を獲得したこれら細胞がただ生き残り
そして／または識別されるが故に、これはこのようなmt
x の連続してより高濃度の存在下になされる。これら細
胞はそれからまたDNA(A)の増幅を含む。このアプローチ
は例えばmtx に対する耐性を細胞に与える突然変異種dh
fr遺伝子のように細胞に医薬品耐性を与える増幅し得る
遺伝子の増幅挿入に対して特に適している。DNA(A)が増
幅され形質転換された真核細胞はそれからDNA(A)がコー
ドしている遺伝子産物の増大された量の製造に用いられ
る。 【００２５】これに代えて、外来遺伝子が増幅せられ
得、そして終局的にはDNA 分子で真核細胞を形質転換す
ることによって真核細胞によって表現され、そして各々
のDNA分子は外来DNA(A)を真核細胞によって普通は表現
せられない優性の選択可能な表現型に対する増幅し得る
遺伝子に相当する外来DNA(B)に化学的に結合することに
よって形成せられている。DNA(A)とDNA(B)との化学的な
結合は、特にリガーゼによる酵素処理の結果として形成
せられる結合の形状である。このように形成される雑種
DNA 分子による形質転換はそれから適当な成長培地にお
いて、そして例えば増幅し得る遺伝子のコピーが充分大
きく増幅されこれら真核細胞が生き残ることの出来る、
そして／または該細胞を識別することが出来るmtk のモ
ルを基準として１：１から10,000：１の範囲の量の連続
的に上昇する濃度の存在において行われる。このアプロ
ーチを用いて、別段細胞によって表現せられない優性の
選択可能な表現型に対して増幅可能な遺伝子が増幅され
真核細胞はそうでもなければ細胞を識別するために死亡
または無能が結果として生じる増幅可能な遺伝子を補足
し得るmtx の上昇せられた濃度の存在下において生存し
そして／または識別することが出来る。優性の選択可能
な表現型に対する種々の増幅可能な遺伝子は本発明の真
核細胞において有用であるけれども、例えばmtx に対す
る耐性を細胞に与えるdhfrに対する遺伝子のような医薬
品耐性を有する遺伝子は特に適している。 【００２６】 【発明の効果】共形質転換された真核細胞を用いること
によって蛋白質様または他の所望の分子の増幅が真核細
胞の中において造られることが出来る。例えばインター
フェロン蛋白質、インシュリン、成長ホルモン、凝固因
子、ウイルス抗原、または抗体、またはインターフェロ
ンそれ自体の増幅分子が雑種DNA を用いて共形質転換さ
れた真核細胞の中において造られることが出来る。かく
して、または以下に述べる方法で燐酸カルシウムで処理
されている精製されたDNA を用いて共形質転換せられて
いる真核細胞、特に哺乳動物の細胞によって上記所望の
物質が製造せられ得る。かくして本発明の真核細胞は従
来の手法を用いては得られないような濃度において高度
に望まれている、稀な、そして高価な蛋白質様および他
の生物学的物質を製造することが可能である。 【００２７】本発明の真核細胞は更に例えば部分的に蛋
白質で、しかし糖、リボ核酸、ヒストン等のような他の
化学種を更に含んでいるインターフェロンを含むグリコ
プロティンのような正常に真核細胞の中においてごく僅
かな量製造せられている物質の製造が可能である。例え
ばグリコプロティンのような細胞質物質によって細胞内
で合成が複雑に行われている生物学的物質の製造方につ
いては、僅かしか理解されていないけれども、本発明の
真核細胞を用いることによって、商業的に有用な量でこ
のような物質を合成することが可能になるであろうこと
は予期されることである。特に、例えばグリコプロティ
ンのような非蛋白質部分を含む細胞質物質の蛋白質部分
をコードしている一つの遺伝子または複数個の遺伝子
を、正常にこのような物質を造る真核細胞の中へ挿入す
れば、該真核細胞は相当する蛋白質様物質を製造するだ
けでなく、もし必要性が拡がったら既に存在する細胞機
構を有用化して蛋白質様物質を処理するであろうし、ま
た適した非蛋白質様物質を添加して完全に生物学的に活
性の物質を形成するであろう。同様にして該真核細胞は
インターフェロン、インシュリン等の非蛋白質部分を含
む生物学的物質を生物学的に完全に活性を有する構造で
製造することが出来る。 【００２８】 【実施例】本発明における、そして以下により完全に記
述されるが、真核細胞は選択基準が存在しない正確に定
義された原核遺伝子および真核遺伝子によって安定に形
質転換されている。精製されたウイルスのtk遺伝子をこ
の遺伝子が欠如しているマウスの細胞へ添加すること
は、HAT 培地において成長するそれらの能力によって選
ばれることが出来る安定な形質転換されたマウスの細胞
の出現を結果として生ずる。これら生化学的形質転換は
一般的な集団よりも高い頻度で他の結合されていない遺
伝子を多分集積するであろう十分な能力を有する細胞の
従属集団に相当するので、共形質転換実験はウイルスtk
遺伝子、およびバクテリオファージΦX174、プラスミド
pBR322 、または人間またはラビットのβーグロビン遺
伝子連鎖をもったクローニングされた染色体によって行
われた。 【００２９】Tk形質転換は汚染雑種交配によって更なる
DNA 連鎖の共形質転換に対してクローニングされそして
分析される。マウス細胞系統はΦX 、pBR322、または人
間およびラビットβーグロビン連鎖の増幅とを含んでい
るものとして識別された。１回から50回以上共形質転換
された連鎖は独立なクローンから単離された高分子量DN
A の中へ集積される。従属クローンの分析は共形質転換
されたDNA が培地における多くの世代にわたって安定で
あることを実証する。この共形質転換システムは事実上
いかなる定義された遺伝子をも培養された真核細胞の中
へ導入しそして安定に集積することを可能ならしめる。
ウイルスベクターまたは選択可能な生化学的マーカーの
いずれかに対する結紮も必要とされない。優性に働くマ
ーカーによる共形質転換は原則として事実上いかなるク
ローニングされた遺伝的要素を野生型の培養された真核
細胞に導入することを可能ならしめる。 【００３０】この終わりに、CHO A29 細胞からの優性に
働く、mtx 耐性の、dhfr遺伝子が野生型の培養されたマ
ウス細胞に形質転換された。形質転換体においてCHO dh
fr連鎖の存在を実証することにより、遺伝子形質転換に
対する決定的な証拠が証明せられた。mtx の上昇せられ
たレベルに対してこれら細胞を曝露することは結果とし
てこの医薬品に対する高められた耐性を新規に形質転換
された遺伝子の増幅を伴って生ずる。突然変異種dhfr遺
伝子は、それ故に、形質転換に先立つてCHO A29 細胞DN
A をpBR322連鎖へ結紮することによって、真核ベクター
として用いられている。該dhfr連鎖の増幅は該pBR322連
鎖の増幅を結果として生ずる。真核細胞における優性に
働くベクターとしてのこの遺伝子の使用はもはや研究に
利用できる突然変異種に対するこれら種族を制限するこ
となしに、潜在的に形質転換可能な細胞のレパートリー
を拡大するであろう。 【００３１】記述された手法を用いて、クローニングさ
れた染色体のラビットのβーグロビン遺伝子はDNA −仲
介遺伝子形質転換によってマウス フィブロブラストの
中へ導入されている。この遺伝子を含む共形質転換され
たマウス フィブロブラストは異種構造の宿主において
表現と、これら連鎖の後処理を研究するための特有な機
会を提供する。RNA 汚染( 感染）手法に協調する溶液雑
種交配実験は少なくとも１回形質転換された細胞系統に
おいてラビットグロビン連鎖がポリアデニン化された９
Ｓ種としてチトプラズム中に表現されることを示す。こ
れら９Ｓ連鎖は結果として完全な継ぎ合わせおよび該二
個の移転から生じる。しかしながらこれらの結果は異種
構造の種族からのフィブロブラストはそれらの表現がエ
リストブラストに限定せられているラビット遺伝子の間
に入っている連鎖を正確に処理するために必要な酵素を
含んでいるということを暗示する。驚くべきことには、
しかしながら、成熟したラビットのm-RNA の５’末端に
存在する４５のヌクレオチドは該形質転換試験のチトプ
ラズム中に検出される該グロビンm-RNA 連鎖には存在し
ない。これらの研究は真核遺伝子の表現の分析において
共形質転換システムのポテンシャル値を示す。野生型遺
伝子を固有の、そして試験管内で組み立てられた突然変
異種遺伝子と一緒に培養された細胞中に導入することは
連鎖組織の官能的有意性のための一つの検定を提供す
る。 【００３２】［遺伝子の増幅］組換え体DNA 手法は雑種
交配プローブが用いられ得る幾つかのより高度な真核細
胞の単離を容易にする。例えば基礎代謝機能をコードし
ているような細胞のこれらの遺伝子に対して１個から20
個のコピーとして存在するm-RNA 転写によって異常に低
いレベルで表現せられる遺伝子はｃDNA クローンの組み
立てを含む従来の手法および組換えライブラリーの終局
的なスクリーニングによっては単純には、単離されるこ
とができない。このようなまれにしか表現されない遺伝
子の単離に対する改良されたアプローチはそれ故にプラ
スミド救出として知られている処置と協調して形質転換
を利用することを開発した。研究室において現在進行中
であるこの概要は以下にあらまし述べられる。 【００３３】鶏のaprt遺伝子は酵素、Hin III またはXb
a によっては開裂されず、そしてこれら酵素で消化され
る細胞質DNA でaprt- マウス細胞を形質転換することは
鶏のaprt遺伝子を表現するaprt+ クローンを結果として
発生させる。Hin III で開裂された鶏のDNA をHin III
で開裂されたプラスミドpBR322に結紮することはaprt遺
伝子が今やプラスミド連鎖に隣接している雑種DNA 分子
の形成を結果として生じる。arpt- 細胞の形質転換は今
やこのDNA によって行われる。形質転換はマウス細胞に
おいて高分子量のDNA の中に集積されているこの完全な
複合体とともにpBR322に共有的に結合している該aprt遺
伝子を含むべきである。この最初の細胞形質転換は他の
雛の連鎖の非常に多数のものから鶏aprt遺伝子を除去す
る役目をする。この形質転換せられた細胞DNA は今やpB
R322または該aprt遺伝子のいずれをも開裂しない酵素、
Xba １DNA で処理される。結果として得られた断片はそ
れから結紮によって回送される。このような断片の一つ
は模写の原型およびアンピシリン耐性マーカーをコード
しているpBR322連鎖と共有的に結合された該aprt遺伝子
を含むべきである。 【００３４】例えばエシェリチア コリのようなバクテ
リアをこれら回送マーカーで形質転換することは今や鶏
のaprt連鎖に結合されている真核DNA からプラスミド連
鎖を選択する。この二重選択手法は雑種交配プローブが
容易に得られない真核細胞において低いレベルで表現す
る遺伝子の単離を可能ならしめる。 【００３５】［実験］本発明の真核細胞のよりよい理解
を助けるために、種々の実験の結果がここに記載され
る。培養された細胞の中へ精製された遺伝子を転移する
能力は形質転換された宿主における外来遺伝子の官能性
および物理的状態を研究するための独特な機会を提供す
る。 【００３６】［tk 遺伝子をマーカーとした形質転換］
HSV tk突然変異種マウス細胞へ転移するためのシステム
の開発は（Wigler, M.等、Cell 11: 223〜232 (197
7)）、これらの研究が独特な細胞遺伝子に拡張されるこ
とを可能にした（Wigler, M.等、Cell 14:725 〜731 (1
979)）。tk+ 組織から得られそして真核組織の変種から
の細胞によって培養された高分子量DNA はこの酵素にお
いて欠けている突然変異種マウス細胞にtk活性を転移す
るために用いられることが出来る。形質転換過程の一般
化は細胞aprt遺伝子とヒポキサンチンホスホリボシル
トランスフェラーゼ( 以下hprtと略称する）遺伝子の連
続的な転移によって実証された（Wigler, M.等、Proc.
Nat. Acad. Sci USA 76:1373〜1376 (1979);Willicke,
K.等、Molec. Gen. Genet. 170:179〜185 (1979); Gra
f, L.Y.等、Somatic Cell Genetics,印刷中 (1979)
）。より最近、選択可能な生化学的マーカーをコード
している遺伝子で形質転換された細胞はまた高頻度で他
の物理的に結合されていないDNA 断片を集積することが
実証された。ここではtk遺伝子は定義された原核および
真核遺伝子によって、培養された哺乳動物細胞の中へ共
形質転換せられ、該哺乳動物細胞を識別するためのマー
カーとして用いられた（Wigler, M.等、Cell 16:777 〜
785 (1979)）。 【００３７】［dhfr遺伝子をマーカーとした形質転換］
遺伝子転換の検出は過去には広範囲にわたって適当な突
然変異種細胞系統の供用にたよっていた。ある場合には
代謝阻害物に対する細胞耐性が優性に作用する突然変異
種遺伝子を含む。優性に作用するマーカーによる共形質
転換は原則としていかなるクローニングされた遺伝的要
素をも野生型培養された細胞の中へ導入することを実質
的に可能ならしめる。この研究においては、細胞は細胞
耐性にmtx の高濃度を与える突然変異種dhfr遺伝子をコ
ードしている遺伝子によって形質転換される（Flintof
f, W.F.等、Cell 2:245〜262 (1976)）。 【００３８】培養された哺乳動物細胞はフォレイト拮抗
体であるmtx に対して非常に鋭敏である。mtx 耐性細胞
系統は識別せられ三つのカテゴリーに入れられた：(1)
この医薬品の減少された移送を伴う細胞（Fischer, G.
A., Biochem. Pharmacol. 11:1233〜1237 (1962); Siro
tuak, F. M.等、Cancer Res. 28:75 〜80 (1968) ）：
(2) mtx に対するdhfrの親和性を低下せしめる構造的突
然変異を伴う細胞（Flintoff, W. F. 等、Cell 2:245〜
262 (1976)）：および(3) 異常に高いレベルのdhfrを生
産する細胞（Biedler, J. L.等、Cancer Res. 32:153〜
161 (1972)； Cha 【００３９】興味あるmtx 耐性変種細胞系統A29 はmtx
に対する減少させられた親和力により突然変異種dhfrの
上昇されたレベルを合成することを確認された（Wigle
r, M.等、Cell 16:777 〜785 (1979)）。この細胞系統
からのゲノムDNA は実験においては突然変異種dhfr遺伝
子をmtx 感受性細胞に転移するための供与体として用い
られた。mtx 耐性形質転換細胞をmtx の増大せられたレ
ベルに曝露することは転移された遺伝子を増幅した細胞
を選択する。この方法で転移せられた真核細胞では、実
質的に培養された哺乳動物細胞中のいかなる遺伝的要素
をも転換しそして増幅することを可能ならしめる。 【００４０】［マウス細胞への突然変異種ハムスター
dhfr遺伝子の転移］高分子量細胞DNA は野生型mtx 感受
性CHO 細胞およびA29 細胞、突然変異種dhfrの増大され
たレベルを合成するmtx 耐性CHO 誘導体から調製された
（Flintoff, W. F. 等、Cell 2:245〜262 (1976)）。dh
fr遺伝子またはtk遺伝子のいづれかをtk- マウスＬ細胞
(Ltk- aprt- ) に転移することに対するこれらDNA 調製
物の能力が燐酸カルシウム共沈澱法の変型を用いてテス
トされた（Wigler, M.等、Proc. Nat. Acad. Sci. USA
76:1373 〜1376 (1979) ）。突然変異種A29 および野生
型CHO 細胞の双方からのDNA はtk遺伝子を Ltk- aprt-
細胞に転移することにおいて有能であった。mtx 耐性集
団はA29 からのDNA による細胞の以下に示す処理のみに
よって観察された。得られたデーターはA29 でのmtx 感
受性細胞の処理は突然変異種dhfr遺伝子の転移と表現を
結果として起こす。 【００４１】この仮説を直接的にテストするために、分
子異種交配研究が行われ、推定せられた形質転換からの
DNA 中にハムスターdhfr遺伝子の存在することが実証さ
れた。ハムスターdhfr遺伝子の構造的遺伝子連鎖と相同
性を有するマウスdhfr cDNAクローン(pdfr-21) （Chan
g, A. C. Y. 等、Nature275:617 〜624 (1978)）は我々
の形質転換においてこの遺伝子の存在を検知するために
用いられた。 【００４２】A29 からの、推定せられた形質転換から
の、そして増幅されたマウス細胞からのdhfr遺伝子の限
定分析は汚染異種交配によって行われた（Southern, E.
M., J. Mol. Biol. 98:503 〜517 (1975)）。DNA は制
限エンドヌクレアーゼHindIIIによって開裂せられ、ア
ガローズ ゲルによって電気泳動せられ、そしてニトロ
セルロース フィルターに移転せられた。これらのフィ
ルターはそれから32Ｐーラベルされたニックー転換され
たpdhfr-21の高い特定活性によって異種交配せしめら
れ、そして自動放射線写真術によって現像せられる：こ
の方法はdhfrプローブに相同するゲノムDNA の限定断片
を視覚化せしめる。顕著なバンドはマウスDNA に対して
15kb、3.5kb、および3kb 、ハムスターDNA に対して7.9
kb、3.7kbおよび1.4kb に観察される。これら二つの種
の間の限定プロフィールは充分大きく相違しており内生
マウス遺伝子の存在下でハムスター遺伝子を区別するこ
とを可能ならしめる。mtx に対する５つのＬ細胞形質転
換体耐性はそれ故に汚染異種交配によって試験される。
各々の形質転換された細胞系列において、内生マウスdh
fr遺伝子の開裂から得られるバンドと分子量がハムスタ
ーDNA の開裂に基づいて観察せられるそれらと同一であ
る更なるバンドの一連との予期されるプロフィールが観
察された。ハムスターDNA において観察された17.9kb、
7.9kb および1.4kb バンドはハムスターdhfr遺伝子の存
在の診断に役立ち、そしてすべての形質転換に存在す
る。 【００４３】最初の実験において、mtx の最低濃度(0.1
μg/ml) が選ばれ、それはLtk - aprt- 細胞の生存を10
-7以下に減少する。先の研究（Flintoff, W. F. 等、Ce
ll 2:245〜262 (1976)）は単一突然変異種dhfr遺伝子の
存在はmtx のこの濃度に対する細胞耐性を与えることが
出来ることを暗示した。形質転換された細胞DNA のハム
スターdhfr遺伝子断片の強度と野生型ハムスターDNA の
強度との比較は我々の形質転換がmtx 耐性ハムスター遺
伝子の一つかせいぜい数個を含むことを示唆する。比較
により、突然変異種dhfrの上昇されたレベルを生ずるこ
とが示された供与A29 細胞（Flintoff, W.F.等、Cell
2:245〜262 (1976)）はこの遺伝子の増幅を含んでいる
ように思われる。 【００４４】［転移せられたdhfr遺伝子の増幅］最初の
形質転換は比較的低いレベルのmtx(0.1 μg/ml) に対す
る耐性に対して選択された。すべてのクローンに対し
て、しかしながらこの医薬品の連続的に増加せられてい
る濃度に対してマス培地を曝露することによってmtx の
上昇せられたレベルに対して細胞耐性を選択することは
可能である。この方法において、我々は最初0.1 μg/ml
に対する耐性体であったクローンからスタートしてmtx
の40μg/mlまでに対する培養耐性体を単離した。我々は
次いで、これら形質転換体におけるmtx に対する増加さ
れた耐性体がdhfr遺伝子の増幅に関係しているかどう
か、そしてもしそうであれば、内生マウスまたは新しく
転移されたハムスター遺伝子が増幅されたかどうかを調
べた。４つの独立した単離からのDNA およびそれらの耐
性誘導体が汚染異種交配によって試された。各々の例の
おいて、mtx に対する高められた耐性はハムスター遺伝
子のコピー数における増加によって伴われた。これは1.
5kb バンドの強度を比較することによってもっとも容易
に見られる。いずれの例においても、我々は内生マウス
dhfr遺伝子の増幅を検出しなかった。最後に、mtx 当量
濃度で選択されたすべての系統が同じdhfr遺伝子コピー
数を持つとはいえないことに注意するべきである。 【００４５】「一般化形質転換ベクターとしてのdhfr遺
伝子」選択可能な遺伝子は他の遺伝的要素を培養された
細胞の中へ導入するためのベクターとして用いることが
出来る。以前の研究において、tk遺伝子で形質転換され
た細胞が恐らく他の化学結合されていない遺伝子と併合
するであろうことが実証された（Wigler, M.等、Cell 1
6:777 〜785 (1979)）。このアプローチの一般化は選択
可能なマーカー、突然変異種dhfr遺伝子に対してテスト
された。A29 からの全細胞DNA の20μg がHindIII で線
状化せられたpBR322DNA の１μg と混合された。受入れ
細胞はこのDNA 混合物に曝露され、そして二週間後にmt
x 耐性体集団が摘出された。形質転換体からのゲノムDN
A が単離せられ、HindIII で開裂せられ、pBR322連鎖の
存在に対して分析せられた。２つの独立した単離体はこ
の方法で試験され、そして両方共の場合において、pBR3
22連鎖の増幅はこれらmtx形質転換体の中に存在した。 【００４６】一般化された形質転換に対する改良したア
プローチは選択可能でないDNA 連鎖の結紮を含む。突然
変異種dhfr遺伝子は医薬品耐性因子に作用する優性であ
るから、この遺伝子は一つの理想的なベクターである。
更に、上昇せられたレベルのmtx に対して細胞耐性を選
択することによってこのベクターを結紮されたいかなる
遺伝要素をも増幅することは可能である。この可能性を
調べるために、A29 のdhfr遺伝子を破壊しない制限エン
ドヌクレアーゼが形質転換検定によって識別された。一
つのこのような制限エンドヌクレアーゼ、Sal ＩはA29
DNA の形質転換能力を破壊しない。Sal Ｉで開裂された
A29 DNA はそれ故にSal Ｉで線状化されたpBR322の等し
い量と結紮された。この結紮生成物は次いで形質転換実
験に用いられた。mtx 耐性集団は摘出され、そして0.1
μg mtx ／mlでマス培地の中で成長された。マス培養物
は次いで増加された濃度のmtx に曝露された。DNA は0.
1 、2 、10および40μg/mlmtx に対するマス培養物耐性
体から得られ、pBR322およびdhfr連鎖のコピー数が汚染
異種交配によって測定された。６つの独立した形質転換
された系統がこのやり方で試験された。５つのこれら系
統はpBR322連鎖と相同な増幅バンドを現した。これら形
質転換されたクローンの４つにおいて、少なくとも一つ
のpBR322の特定バンドがdhfrの増幅において強度を増大
した。SS-1において、二つのpBR322の特定バンドが0.1
μg/mlmtx に対して細胞耐性体からのDNA において観察
された。これらのバンドは2 μg/mlに対する細胞耐性に
おける強度において数倍増加する。しかしながら40μg/
mlに対する耐性に対して選ばれた細胞においてはいかな
る強度の増加も観察されなかった。第２の系統では0.1
μg/mlに存在するSS-6、すべてのpBR322のバンドは細胞
がまずmtxの2 μｇ/ml で選択され、次いで40μg/mlで
選択されるにつれて強度を増加し続ける。奇妙なことに
は、新しいpBR322の特定バンドは高いmtx 濃度での選択
の後に現れる。この細胞の系統ではpBR322連鎖に対する
コピー数においては少なくとも50倍の増加があることが
評価せられた。第３の細胞系統においては、HH-1、二つ
のpBR322の特定バンドが増幅にもとづいて強度を増加
し、その他は一定に残るかまたは強度を減少する。かく
してこれらの細胞において観察されるpBR322連鎖の増幅
のパターンは全く変化することが出来る。けれども、突
然変異種dhfr遺伝子は培養された動物細胞の中へ限定さ
れたDNA 連鎖を導入しそして増幅するためのベクターと
して用いることが出来る。 【００４７】［考察］真核遺伝子表現の研究におけるDN
A に仲介された形質転換の可能性のある有用性はその一
般化にもとづく大きな広がりに依存する。選択可能な生
化学的官能性をコードしている細胞遺伝子は予め突然変
異種の培養された細胞の中へ導入せられる（Wigler,
M., 等、Cell 14:725 〜731 (1979); Wigler, M., 等、
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76:1373 〜1376 (1979); W
illecke, K.,等、Molec. Gen. Genet. 170:179〜185 (1
979); Graf. L.H., 等、Somatic Cell. Genetics, 印刷
中(1979) ）。最近の研究では、優性に作用するmtx 耐
性dhfr遺伝子は野生型の培養された細胞に転移された。
共形質転換システムにおけるベクターとしてのこの遺伝
子の使用は今やいかなる遺伝的要素を新しい細胞環境の
宿主の中へ実質的に導入することを可能ならしめるであ
ろう。 【００４８】最初の実験では、A29 細胞からのDNA 、突
然変異種dhfrを合成するmtx 耐性CHO 誘導体がマウスＬ
細胞の培養物に対して添加せられた。mtx 耐性集団は1
から10集団／5 ×105 細胞／20μg 細胞DNA の頻度で現
れた。いかなる集団も野生型mtx 感受性細胞から得られ
たDNA による形質転換にもとづいて観察されないけれど
も、このDNA はtk遺伝子の有能な供与体であった。我々
が突然変異種ハムスタのdhfr遺伝子の転移をもたらした
決定的な証拠はマウス形質転換体の中のハムスター遺伝
子の存在を実証したことによって得られた。マウスとハ
ムスターのdhfr遺伝子の限定地図は顕著に相違しそして
汚染異種交配実験においてこれら遺伝子を区別すること
を可能ならしめる。試験されたすべての形質転換におい
て、マウスdhfr cDNA クローンと相同な限定断片の二つ
の組、内生マウス遺伝子の特徴を有する一連のバンド、
および供与体ハムスター遺伝子の特徴を有する第二の一
連のバンドが観察される。 【００４９】dhfrの所在する場所の形質転換の有用性は
形質転換の、およびmtx に対する自然の耐性の双方の相
対頻度の関数である。摘出されたすべてのmtx 耐性Ｌ細
胞は内生遺伝子の増幅よりもむしろ形質転換から結果と
して生じることの実証はdhfrの増幅がこの細胞系におい
ては稀な出来事であることを示唆する。マウス テラト
ーマとラット肝臓細胞を含む他の細胞系統を形質転換さ
せるための試みがなされ、そしてこの例においては異種
交配研究がmtx 耐性の獲得は内生dhfr遺伝子の増幅から
結果として生じることが明らかとなる。精製せられたdh
fr遺伝子の使用は多分形質転換の頻度を著しく増大する
ことによるこれら困難性に打ち克つことにある。 【００５０】最初の形質転換体において観察せられるdh
frのコピー数は低い。この観察は単一突然変異dhfr遺伝
子が選択された基準(0.1μg /ml mtx)の下で細胞mtx 耐
性の与えることが出来ることを示唆する以前の研究（Fl
intoff, W. F.,等、Cell 2:245〜262 (1976)）と一致す
る。これら最初の耐性形質転換体の医薬品濃度を段階的
に増すことに対して曝露することは、新しく転移された
突然変異種ハムスターdhfr遺伝子の増幅から生ずる高め
られたmtx 耐性による細胞の選択を結果として起こす。
いかなる形質転換体においても、内生マウス遺伝子の増
幅は選択された圧力に応じて観察されなかった。単一の
突然変異種遺伝子は多分単一野生型遺伝子よりも与えら
れた濃度のmtx に対する顕著に大きな耐性を与える。も
し増幅の頻度が低ければ単に増幅という出来事の最少数
を有する耐性変種を選択することになる。新しく転移さ
れた遺伝子は内生遺伝子よりも容易に増幅されるであろ
う。 【００５１】突然変異種dhfr遺伝子は選択可能でない遺
伝的要素を、培養された細胞へ導入するための優性転移
ベクターとして用いられた。一つの実験的アプローチは
有能な細胞が高頻度で他の物理的に結合されていない遺
伝子を集積するという以前になされた観察（Wigler, M.
等、Cell 16:777 〜785 (1979)）を開発する。pBR322DN
A に曝露された培養物は突然変異種dhfr遺伝子を含む遺
伝性DNA と共にバクテリアのプラスミドの複合コピーを
含むmtx 耐性細胞系統の因となる。 【００５２】遺伝的ベクター付けに対する改変されたア
プローチはpBR322連鎖を形質転換に先だって選択可能な
dhfr遺伝子に結紮することを含む。この産物はまた複合
pBR322連鎖を含む形質転換を生ずる。dhfrの増幅はpBR3
22連鎖の増幅を結果として生ずるが、しかし増幅のパタ
ーンは細胞系統によって異なる。一つの例においてはす
べてのpBR322連鎖はmtx 濃度の増加によって増幅する。
他の系統では、連鎖のサブセットが増幅する。また他の
系統では連鎖は失われたかもしくは再配列されたように
思われる。いくらかの系統では、増幅は40μg/mlまでの
mtx 濃度を増加することにともなって進行するが、一方
他のものでは、増幅は2 μg/mlで中止する。現在、増幅
過程は理解されてもいないし、また増幅単位が定義され
てもいない。これら複雑な出来事に対する原因となるい
かなる機構も、それらが培養された細胞の中へ導かれる
いかなる遺伝子の投与を実質的に調節するために開発さ
れ得ることは明らかである。 【００５３】［材料及び方法］当該実験を行うための材
料及び方法は以下のとおりである。 細胞培養 Ltk クローンＤの誘導体（Ltk aprt, Kit, S. 等., Es
p. Cell Res. 31:291〜312(1963) ）は10％仔牛血清
（フローラボラトリーズ，ロックビル，メリーランド）
と50μg/mlのジアミノブリン(DAP) を含むズルベッコの
変性イーグルの培地(DME) の中に養われた。形質転換に
先立って、細胞は洗浄され、DAP の存在しない状態で３
世代にわたって成長せられた。形質転換されたdhfr（mt
x に対する耐性を与えられた）A29mtxRiiiを含むチャイ
ニーズハムスター細胞系（Flintoff,W.F., 等., Somati
c Cell Genetics 2:245〜261(1976) ）は３Ｘー非選択
性アミノ酸，10％仔牛血清、および１μg/mlアミトブテ
リンを補充されたDME で繁殖せられた。増幅実験のため
に、培地は更に20μg/mlのメトトレキセイトを補充され
た。ねずみ類 Ltk- aprt細胞は Ltk- クローンＤ細胞の
aprt陰性誘導体である。細胞は成長培地中で養われ、Wi
gler, M., 等、PNAS76:1373 〜1376(1979)に記述された
ように形質転換に対して準備された。Hep-2 （人間），
HeLa（人間），CHO （チャイニーズ ハムスター卵
巣），および Ltk- 細胞は成長培地の中で成長された。
LH2b，ヘルペス単純ウイルス tkDNA で形質転換された
Ltk- の誘導体は15μg/mlでヒポキサンチン、0.2 μg/m
lでアミノブテリン，そして5.0 μg/mlでチミジンを含
む成長培地(HAT) （Wigler, M., 等、 Cell 1:223 〜23
2(1977) ）中にて養われた。すべての培地皿はヌンクロ
ン（バンガード インターナショナル，ネプチューン，
N.J.）プラスチックであった。OTT 6050移植系統の腫瘍
から得られた供給体独立マウス テトラトカルシーノー
マ細胞培養物系統6050P （Watanabe, T., 等、 PNAS 7
5:5113 〜5117(1978)）は野生型，またはtk+ 親として
用いられ、そしてここにTCC wt. と命名される。この系
統はＸ／Ｏ性染色体型の、Watanabe, T., 等、(1978)に
記述される特性を有する39染色体の様式番号を持つ。該
細胞は10％の胎児仔牛血清の入ったズルベッコの変性イ
ーグルの培地中で成長せられた。 3μg/mlの突然変異を
起こすＮーメチルーＮ’ーニトローＮーニトロソグアニ
ジンに対して３時間の曝露の後、細胞は２週間回復せら
れそしてそれから80μg/mlのBrdUrdの入った培地に移さ
れた、一連の耐性クローンが単離され、本形質転換実験
において用いられるクローン系統（TCC tk- ）が供給さ
れた。この系統は10-8以下の野生型への隔世遺伝頻度を
有する。形質転換に先立って、細胞はBrdUrdの30μg/ml
の入った培地中で養われ、洗浄せられ、そして該医薬の
存在しない状態において三世代にわたって成長せられ
た。形質転換効率はマウスＬー細胞(Ltk- ) のtk- 欠如
系統のそれ（Kit,S.,等、Exp. Cell.Res. 331:297〜312
(1963) ）と比較された。 【００５４】［ゲノムDNA の抽出と制限エンドヌクレア
ーゼ切断］高分子量のDNA は培養された細胞（CHO, LH2
b,およびHeLa）から、または先に述べたように（Wigle
r, M., 等、 Cell 14:725〜731(1978) ）、凍結された
ラビット肝臓から得られた。高分子量鮭精子DNA はウォ
ーシントンから得られた。制限エンドヌクレアーゼ切断
(BamＩ，HindIII ，Kpn Ｉ，および XbaＩ) は50mM Nac
l, 10mM トリス・Hcl,5mM MgCl2, 7mMメルカプトエタノ
ール，および牛の血清アルブミンを100 μg/mlで含むバ
ッファー(pH7.9) において行われた。酵素対DNA 比率は
少なくともDNA の２単位／μg であり、反応混合物は37
℃で少なくとも２時間熟成せられた。消化の完了をモニ
ターするために、１μl のニック・形質転換されたアデ
ノウイルスー２〔32Ｐ〕DNA が反応体積の５μl で少な
くとも２時間熟成され、切断生成物は１％アガローズゲ
ル中での電気泳動によって分離され、そして消化はクロ
ネックス２DCX 線フィルムに乾燥ゲルを感光されること
によってモニターされた。CVー１ー感染された細胞か
ら、先に述べたように損傷していないヘルペス シンプ
レックス ウイルス（HSV ）DNA が単離された（Pellic
er, A., 等、 Cell14:133〜141(1978) ）。DNA は6mM
トリス(pH7.9), 6mM MgCl2, 6mM ２ーメルカプトエタノ
ール、6mMNaClおよび200 μg/ml牛の血清アルブミンを
含むバッファーにおいて KpnＩ（ニューイングランド、
バイオラボ）によって消化された。限定されたDNA は0.
5 ％アガローズゲル(17 ×20×0.5cm)を介して24時間、
70Ｖで電気泳動によって分別され、そして5.1kb のtk-
含有断片が Maxam, A. M. およびGilbert,M. PNAS 74:5
60〜564(1977), およびWigler, M., 等、 Cell 14:725
〜731(1978) ）によって述べられているようにゲルから
抽出された。φX １７４am３RFIDNAはベテスダ リサー
チ ラボラトリーズから購入された。プラスミド pBR32
2 DNA はE. Coli HB 101中で成長せられ、Clewell, D.
B., J.Bacteriol. 110:667 〜676(1972) の方法によっ
て精製せられた。λシャロン４Ａ誘導体(RβG)中のクロ
ーニングされたラビットβ巨大グロビン遺伝子は識別さ
れ、先に述べたようにして単離された（Maniatis, T.,
等、Cell 15:687 〜701(1978) ）。増幅実験において、
高分子量DNA の寸法はヘルペス シンプレックス ウイ
ルスDNA とマーカーとしてその XbaＩ断片を用いて0.3
％アガロースゲル中で電気泳動によって測定された。平
均寸法が75kbよりも大きなDNA のみが増幅実験において
形質転換能力を持っていることが見出された。この実験
において、プラスミドDNA は300 μg/mlエチジウム プ
ロマイドを含むCsClこう配において同比重的遠心分離に
よってクロラムフェニコール増幅された培養物から単離
された。 【００５５】［形質転換および選択］形質転換調書はGr
aham, F. L. およびVander Eb, A. J., Virology, 52:4
56〜457(1973) において述べられたように、以下の改変
をともなう。形質転換の１日前に、細胞は皿あたり0.7
×106 細胞で植え付けられた。形質転換の４時間前に培
地は変更された。１mMトリス(pH7.9)/0.1mM EDTAにおい
て溶解された無菌の、エタノール沈澱された高分子量ま
たは制限エンドヌクレアーゼー切断された真核DNA は40
μg/mlでDNA 、および250mM CaCl2 を含むDNA ／CaCl2
（マリンクロト）を調整するために用いられた。２倍に
濃縮されたヘペス緩衝化された含塩物(2XHBS) が調整さ
れた。それは280mM NaCl, 50mMヘペス，および1.5mM 燐
酸ソーダ、を含むpH7.10±0.05に調節された。DNA ／ C
aCl2溶液は無菌2XHBS の同量に滴加された。綿栓のつい
た１ーmlの無菌プラスチック ピペットが2XHBS を含む
混合管の中へ挿入され、DNA が添加されている間吹込み
によって気泡が導入された。燐酸カルシウム／DNA 沈澱
物は室温で30〜45分で攪拌なしで形成せしめられる。沈
澱物はそれからプラスチック ピペットにそっととられ
ることによって混合され、そして皿あたり１mlの沈澱物
が直接に受入細胞を覆っている成長培地の10mlに添加さ
れた。37℃で４時間熟成の後、培地は置き換えられ、そ
して該細胞は更に20時間、熟成される。その時、選択性
圧力が及ぼされる。tk+ 選択に対しては、培地はHAT を
含む成長培地に変えられる。aprt+ 選択に対しては、細
胞はトリプシン化され、低密度で（10ーcm皿あたり約0.
5 ×106 細胞）0.05mMアザセリンと0.1mM アデニンを含
む培地中に置換せられた。tk+ およびaprt+ 選択の両方
に対しては、選択性培地はその次の日，２日後、そして
次いで形質転換体クローンが生じている２〜３週間にわ
たって３日毎に変えられた。集団はクローニングシリン
ダーを用いて摘出され、そして集団の残りはホルムアル
デハイド固定とジエムサでの染色の後記録された。特徴
づけに対しては、クローンは続いて選択性圧力下にマス
培地の中で成長させられた。記録は単離された各々のク
ローンに対して２倍になった細胞のみかけの数について
保持された。 【００５６】Ltk- aprt+ 細胞のmtx 耐性形質転換体はA
29mtxRiii細胞からの高分子量DNAによる形質転換および
10％仔牛血清と0.2 μg/mlアメトプテリンを含むDME に
おける選択の後に得られた。tk+ 選択に対しては、細胞
はメトトレキセイトに対する耐性のために、HAT 培地中
で成長せられ、細胞はメトトレキセイトの0.1 μg/mlを
補充された培地中で選択された。集団は各々形質転換体
が独立の出来事から起こることを確信するため個別の皿
からクローニングされた。A29 DNA と線状化pBR322DNA
との結紮体は供給者によって推められた条件の下にSal
Ｉー切断されたDNA とＴ4 リガーゼ（ベセスダ リサー
チ ラボラトリーズ）との１：１比（ W／W ）を熟成す
ることによって調整された。燐酸カルシウム沈澱は 2μ
g の結紮体と18μg の担体／mlを用いて調整せられ、そ
して受入体細胞に添加された（結紮体の量はプラスミド
が形質転換を阻害するという観察のために限定され
る）。該DNA は該細胞と4 〜12時間接続を保たれ、そし
て培地はそれから吸入せられそして新しいDME に置き換
えられた。選択性圧力は24時間及ぼされ、次いでDNAに
対して曝露された。2 〜3 週間後に、集団はクローニン
グシリンダーを用いて単離された。 【００５７】マウステトラトカルシノーマ細胞実験にお
いて、形質転換はTCC tk- 細胞が形質転換１日前に 3×
105 細胞／皿で接種されたことを除いては前に述べたと
同様に形質転換が行われた。付着細胞の各々の皿に対し
て、4 μg の組換えプラスミドで調整せられた燐酸カル
シウム／DNA 沈殿物，Ltk - aprt- 細胞から得られた高
分子量DNA の20μg の存在下Bam H1で消化されたPtk-1
が添加された。加うるに、いくらかの細胞はサンペンシ
ョンで処理された（Willecke, K., 等、 Molec. Genet.
170:179 〜185(1979) ）7 ×106 の新しくトリプシン化
されたTCC tk- 細胞はBam H1ー開裂されたプラスミドPt
k-1 からのDNA10 μg および鮭精子からの高分子量DNA
の150 μg で調整された燐酸カルシウム／DNA 沈澱物と
混合された。Willecke, K., 等(1977)において述べられ
たように遠心分離、再懸濁、そして振盪の後に細胞は成
長培地中に再び薄く覆われた。３日後に、培地はHAT 培
地に置き換えられ、形質転換体の集団は２週間後に単離
された。 【００５８】共形質転換実験は染色体成人βーグロビン
遺伝子を含むHindIII ー開裂されたプラスミドpHβ-8の
4 μg と共にBam H1ー消化されたPtk-1 DNA の4 μg で
行われた（Lawn,R.M.,等、 Cell 15:1157 〜1174(197
8)）。Tk+ 形質転換体は0.1mMヒポキサンチン／o.4 μM
アミノブテリン／16μM チミジン(HAT) を含む成長培
地の中で選択された。集団はクローニングシリンダーで
摘出され、マス培地の中で成長された。 【００５９】［定義されたDNA 連鎖とHSVtk 遺伝子の共
形質転換］Ltk- aprt- マウス細胞は1 〜10μg のΦ17
4,1 μg pBR322または1 μg の RβG ー１DNA のいずれ
かによって1 μg のHSV ー１遺伝子と10〜20μg の鮭精
子担体DNA との存在下で先に述べたように（Wigler,
M., 等、PNAS 76:1373〜1376(1979)）形質転換された。
Tk+ 形質転換はヒポキサンチン、アミノブテリン、およ
びチミジン(HAT) と10％の仔牛血清を含むDME において
選択された。単離された集団はクローニングシリンダー
を用いて摘出されそしてマス培地の中で成長された。 【００６０】［酵素検定］抽出物は0.5 ％トライトンＸ
ー100 を含む0.1ml の0.02M 燐酸カリウム，pH7,の中に
洗滌した細胞粒（約107 細胞）を再懸濁することによっ
て得られた。700Xg遠心分離の25分後に得られた上澄液
（チトプラズム）は酵素活性の定量と電気泳動のために
用いられた。aprtおよび蛋白質は先に述べられたように
検定された（Chasin, L. A., Cell 2:37〜41(1974)）。
該反応混合物中における3mM チミジン トリホスフェイ
ト，5'ーヌクレオチダーゼの阻害物質（Murray, A. W.
およびFriedrichs, B., Biochem, J. 111:83〜89(196
9)）の含有はAMP 回復を増加せず、そしてそれはヌクレ
オチダーゼがaprt活性の測定を妨害していないことを示
す。aprtの導電収束は本質的にhprtに対して述べられた
（Chasin, L. A. およびUrlaub, G. Somat. Cell Gene
t. 2:453 〜467(1976) ）ように次の例外とともに行わ
れた。アムホリン(LKB) 混合液の0.8% pH2.5〜4, 0.8%
pH4 〜6, および0.4% pH5〜7 を含むポリアクリルアマ
イドゲル酵素活性を検定するために、[2-3H]アデニン
[0.04mM, 1Ci/mmd, ニューイングランド核(1Ci=3.7×10
10ベクレム)]がヒポキサンチンに対して置換された。 【００６１】［th活性の検定］特定活性測定のために、
単層培養物からの細胞は燐酸バッファー血清の中へ削落
され洗浄せられた。細胞粒は５容量の抽出バッファー
（0.01M トリス・HCl, pH7.5, 0.01M KCl, 1mM MgCl2,
1mM 2 ・メルカプトエタノール、および50μM チミジ
ン) の中へ懸濁された。該細胞サスペンションは３回凍
結および溶解せられそしてKCl 濃度はそれから0.15M に
調節された。音波をかけた後、チトプラズム抽出物は3
0,000Xg 30 分の遠心分離によって得られ、そして上澄
液はWigler, M.等、Cell16:777〜785(1979) において述
べられたようにtk検定のために用いられた。腫瘍からの
チトプラズム抽出物はポッター−エルベジェーム ホモ
ジナイザー中で細胞の崩壊の後に得られた。それらはそ
れから培養された細胞に対して上に述べたように処理さ
れた。tkの一単位は分あたり１ナノモルのチミジンをチ
ミジンモノホスフェイトに転換する酵素の量として定義
される。 酵素無効化研究において、抗ーHSV ー１tk抗
ー血清または前免疫血清がチトプラズム抽出物の等量と
混合され、そしてATP とマグネシウムが6.7mM に添加さ
れた。該酵素抗体混合物は室温で30分熟成され、2000X
g、10分遠心分離され、その上澄液はtk活性のために検
定せられた。更なる生化学的検定において、細胞培養物
から、および固形腫瘍からの相同体の30,000Xg上澄液が
1.6mm 薄に裁断した5%ポリアクリルアマイド ゲル上で
電気泳動され、そしてLee, L. S. およびCheng, Y.
C., J. Biol. Chem., 251:2600〜2604(1976)に述べられ
たようにしてtk活性に対して検定された。 【００６２】［RNA 単離］全RNA はpH5.1 のフェノー
ル, フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（25:24:1, vol/vol), およびクロロホルム／イソアミ
ルアルコール（24:1, vol/vol)によって連続的に抽出を
行なうことによって形質転換されたＬ細胞の対数的な相
培養物から単離された。エタノール沈澱の後、該RNA は
DNアーゼで消化された（Maxwell, I. H.,等、Nucleic
Acids Res. 4:241〜246(1977) ）そしてエタノールで沈
澱された。核とチトプラズムブラクションはWigler,
M., 等、PNAS 76:1373〜1376(1979)に述べられたと同様
に単離され、そしてRNA が上記のようにして抽出され
た。チトプラズム ポリアデニル化RNA がオリゴ(dT)ー
セルローズ クロマトグラフィーによって単離された
（Axel, R., 等、Cell 7:247〜254(1976) ）。 【００６３】［ cDNA 合成］ラビットとマウスの cDNA
がMyers, J. C. およびSpiegelman, S., PNAS 75:5329
〜5333(1978)に記載のようにしてアビアン ミエロブラ
ストシス ウイルスリバース トランスプリプターセ(R
NAー依存 DNA ポリメラーゼ) を用いて得られた。 【００６４】［形質転換細胞DNA の単離］細胞はPBS 中
に剥脱されて収穫せられそして1000Xg10分間遠心分離す
る。粒子はTNE[10mMトリス-HCl(pH8.0), 150mM NaCl, 1
0mM EDTA],の40容量に再懸濁され、そしてSDS およびプ
ロティナーゼＫが夫々0.2%および100 μg/ml添加され
た。該リセイトは37℃, 5 〜10時間熟成され、そしてそ
れからバッファー飽和フェノールとCHCl3 で連続的に抽
出される。高分子量DNA が該水性相と2 容量の冷エタノ
ールとを混合し、そして直ちに形成された沈澱を取出す
ことによって単離された。該DNA は70% エタノールで洗
浄されそして1mM トリス, 0.1 EDTAに溶解せられた。ク
ローンΦX4とΦX5からの該チトプラズムが Rigold, G.
M.,等、Cell 10:19〜26(1977)に述べられていると同様
に得られた。該フラクションは更にHirt, B., J. Mol.
Biol. 25:365〜369(1967) に述べられたと同様に高分子
量と低分子量のDNA に分別された。 【００６５】［DNA フィルター異種交配］細胞DNA は制
限エンドヌクレアーゼで処理せられ、アガローズ スラ
ブゲルで電気泳動せられ、ニトロセルロース フィルタ
ーシート上に移され、そしてWigler, M., 等、 PNAS 7
6:1373 〜1376にに述べられたと同様に32ＰーラベルDNA
プローブで異種交配せられた。形質転換細胞からのDNA
は供給者( ニューイングランド バイオラボ または
ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ) によって特定せ
られた条件を用いて種々な制限エンドヌクレアーゼによ
って分解せられた。分解は1.5U／μg の酵素対DNA 比で
37℃2 時間行われた。反応はEDTAの添加によって終結せ
られ、そして生成物は36mMトリス，30mM NaHPO4, 1mM E
DTA(pH7.7)中で水平アガロース スラブゲル上で電気泳
動された。DNA 断片はニトロセルロース シートに移さ
れ、異種交配せられそして前に述べた方法と二つの改変
された方法によって洗浄された（Weinstock, R.,等、PN
AS 75:1299〜1303(1978)）。二つのニトロセルロース
フィルターが転移の間用いられた（Jeffreys,A.J. およ
びFlavell, R.A., Cell 12:1097 〜1108(1977)）。低位
フィルターは捨てられ、次いで異種交配され、該フィル
ターは2XSSC, 25mM 燐酸ソーダ、1.5mM Na4P2O7, 0.05%
SDSにおいて4 回20分間洗浄せられ、そしてそれから1:
1 および1:5 に希釈したこのバッファーにおいて連続的
に洗浄せられた（Jeffreys, A. J. およびFlavell,R.
A., Cell 12:429〜439(1977) ）。増幅実験において、
プローブは32Ｐーニック転換されたpBR322またはpdhfr-
21, マウスdhfr m-RNAの cDNA コピーのいずれかであっ
た（Chang, A. C. Y., 等、Nature 275:617〜624(197
8) ）。 【００６６】［溶液異種交配］32Ｐーラベルされたグロ
ビン cDNA(2.9 ×108 cpm/μg の特定活性) が0.4M NaC
l/25mM 1.4ーピペラジンジェタンスルホニックアシド(P
ipes), pH6.5/5mM EDTA 中で75℃において過剰のRNA と
異種交配された。熟成時間は70時間を超えない。Rotsが
RNA ヌクレオチドのモル／リッター／時間。時間は秒，
として計算された。異種交配において単一糸状ヌクレア
ーゼＳ１に対する耐性が与えられた。 cDNA のフラクシ
ョンは記載されたと同様に測定された（Axell, R. 等、
Cell 7:247〜254(1976) ）。 【００６７】［RNA フィルター異種交配]RNAは（Baile
y, J. およびDabidson, N., Anal. Biochem 70:75 〜8
5(1976)）によって記載されたと同様に5mM メチル水銀
ハイドロオキサイドを含む1%アガローズ ゲル(17 ×20
×0.4cm)を通して電気泳動された。各々の溝におけるRN
A の濃度は0.5 μg/μl であった。電気泳動は室温で11
0V, 12時間であった。Alwine., J.C.等、PNAS 74:5350
〜5354(1979)に述べられたと同様にしてRNA はpH4.0 ク
エン酸塩転移バッファーを用いてジアゾ化セルロース
ペーパーに該ゲルから移された。転移の後、該RNA フィ
ルターは担体RNA を500 μg/ml含む転移バッファーで1
時間熟成された。フィルター上のRNA は32Ｐーニックー
転換によって特定活性の 2ー8 ×108cpm/ μg にラベル
されたクローニングDNA プローブの50μg /ml 異種交配
され（Weinstock, R.,等、PNAS 75:1299〜1303(197
8)）、反応容量はフィルターの25μl/cm2 であった。異
種交配は4X標準血清クエン酸塩(0.15M Nacl/0.015M ク
エン酸ソーダ) /50%ホルムアミド中で57℃, 36〜46時間
であった。異種交配の後、フィルターは2 種類の2X標準
血清クエン酸塩/25mM 燐酸ソーダ/1.5mMピロ燐酸ソーダ
/0.1% ドデシルスルホン酸ソーダ/5mM EDTA 中に37℃30
分間振盪しつつ浸漬してフォルムアミドを除去した。連
続的な洗浄は1Xと5mM EDTAと0.1 % ドデシルスルホン酸
ソーダを含む0.1X標準血清クエン酸塩にて68℃, 各々30
分間であった。 【００６８】［形質転換されたマウスＬ細胞におけるラ
ビットβーグロビンのバーク シャープ分析］異種交配
は80%(vol/vol)ホルムアミド( イーストマン) /0.4MPip
es, pH6.5/0.1mM EDTA/0.4M Nacl中で（Casey, J. およ
びDavidson, N., Nucleic AcidRes 、4:1539〜1552(197
7)）; （Berk, A. J. およびSharp, P. A 、Cell 12:72
1 〜732(1977) ）、18時間, 1.8Kbp Hha I断片に対して
は51℃、Psi 1 断片に対しては49℃で行われた。該異種
交配はＳ１ヌクレアーゼで処理され、そして本質的に
（Berk, A. J. 及びSharp, P. A.(1977)）に述べられた
方法によって分析された。 【００６９】本開示は本発明に関してすべての本質的な
情報話を記載するものではあるけれども、ここに引用さ
れる多くの刊行物は本発明および技術の様相の背景を理
解することにおいて助けとなるであろう。したがって引
用された刊行物のすべてはここに本開示の中に参照とし
て編入される。
白質様物質に関するコードを行う遺伝子および／または
該蛋白質様物質の製造を調節するかさもなければそれに
影響する遺伝子を含むDNA を導入された植物界および動
物界の生物を含む超動植物真核生物として分類された生
物の細胞に関するものである。かゝる遺伝的干渉は一般
に遺伝子工学と呼ばれ、そしてある面では組換え体DNA
技術の用途を含むものである。開示される本発明は特に
DNA を導入されたバクテリアを含む超動植物原核生物の
細胞とは区別されるべきである。この区別は真核細胞と
原核細胞との基本的な相違による面に基づくもので、前
者は外被および減数分裂によって形成された真核によっ
て特徴づけられ、後者は輪郭の明瞭な核の不在および減
数分裂の不在によって特徴づけられる。更に遺伝レベル
では真核生物の多くの遺伝子は連続した同一線状でない
コードしていない連鎖によって分裂せられ、一方原核生
物においては遺伝子は連続した同一線状である。 【０００２】 【従来の技術】殆どの部分に関連する原核生物、特にバ
クテリアについての理解は真核生物の理解における進歩
とは独立して進歩したけれども、原核生物を含むある種
の発展を述べることは本発明の評価にとって助けになる
ことであろう。１９４４年に、Avery は細胞遺伝子のDN
A 仲介転移を用いた原核細胞の形質転換を報告した（Av
ery, O.T. 等、J. Exp. Med. 79: 137〜158 (1944)）。
その後、文献において形質転換された原核細胞の報告が
現れた。１９７５年に、Cohen等は原核生物エシェリチ
ア コリの第１形質転換、次いで共形質転換を含む結果
を報告した（Kretschmer, P. J. 等、J. Bacteriology
124:225 〜231(1955) ）。その中に報告された実験にお
いて、著者等は腸内バクテリアの多くの種類のものにお
いて自然に生じるプラスミドDNA 、即ち染色体外DNA を
用いた原核細胞の共形質転換を開示した。これらの実験
においては、CaCl2 −処理のバクテリア集団における特
殊な細胞は優先的に形質転換を起こすことが見出され
た。 【０００３】またその間に原核細胞による実験とは実質
的に独立して真核細胞による実験が進められた。１９６
２年に（Szybalska, E. H.とSzybalski, W. PNAS 48:20
26 (1962）) は形質転換された哺乳動物細胞の、しかし
ながら自然的な隔世遺伝を単に受けただけの細胞と形質
転換とを区別することが不可能な程度の低い頻度で形質
転換された細胞を報告した。再び原核細胞によるのであ
るが、真核形質転換の報告が更に文献に現れた。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、原核細
胞に付いての形質転換では、プラスミドは染色体DNA の
中に取り入れられない公算が大きいために形質転換の頻
度および得られた形質転換の安定性は低い。結果とし
て、数世代の後には共形質転換体は獲得した形質を失っ
た。加うるに、バクテリアによるこれら実験は表現を得
るためには形質転換DNA に対する遺伝子プロモーターの
添加を必要とする。 【０００５】また形質転換された真核細胞に付いての報
告の結果は、屡々他の人々によって再現せられ得なかっ
た。加うるに、形質転換の低頻度、遺伝表現に対する分
子的基礎の理解の不足、そして分子雑種形成プローブの
不足はこの領域における進歩の不足の因をなすものであ
る。結果として形質転換された真核細胞についての研究
は本質的にウイルス遺伝子に限られていた（Graham, F.
L.等、Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 39:637
〜650(1975) および McCutchen, J. H. およびPagano,
J. S., Jounal National Cancer Institute, 41:351〜3
57(1968) ）。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は上記従来の問題
点を解決するための手段として、外来DNA(A)分子と、真
核細胞に対してメトトレキセイト耐性を与えるジハイド
ロフォレイト リダクターゼをコードしている増幅可能
な遺伝子であるDNA(B)分子との結合によって形成された
一つの分子によって共形質転換された真核細胞を提供す
るものであり、該外来DNA(A)は主として選択可能な表現
型に関連しない蛋白質物質例えばインターフェロン蛋白
質、インシュリン、成長ホルモン、凝固因子、ウイルス
抗原または抗体、一つの酵素等をコードしている。 【０００７】［術語の説明］本発明を説明するに先立
ち、以後に用いられるべき幾つかの術語の定義を述べる
ことは本発明の理解を助けるものであろう。形質転換と
は精製されたDNA の導入によって仲介される受理細胞の
遺伝型の変換のための方法を意味する。形質転換は典型
的には該受理細胞の生化学的または形態学的性質のいず
れかにおける変更が結果として起こる受理細胞の表現型
における安定な遺伝性の変化によって検知される。共形
質転換とは一つ以上の異なった遺伝子によって受理細胞
の形質転換を行うための方法を意味する。共形質転換は
化学的に結合されていない遺伝子かまたは化学的に結合
されている遺伝子のいずれかに相当するDNA の導入によ
って仲介される受理細胞の遺伝型における同時的な変化
および連続的な変化の双方を含む。蛋白質様物質はアミ
ノ酸から形成される如何なる生体高分子をも意味する。
遺伝型とはその物理的外観から区別されるようなある生
物の遺伝的構成を意味する。表現型とは環境と同時に遺
伝型によって造られるようなある生物の観察し得る性質
を意味する。選択可能な表現型とは該表現型を所有しな
いすべての生物を絶滅させる条件下で生物に生存する能
力を与える耐性を獲得する表現型である。例としては医
薬品耐性、または与えられた成長培地において細胞代謝
に必要ないくつかの分子を合成する能力を含む。ここに
用いられるように、選択可能な表現型はまた、例えば細
胞を通過するかまたは細胞によって分泌せられる、そし
て官能性の検定免疫学的な検定または生化学的な検定の
いずれかによって新しい表現型として検知されることが
出来る物質の製造のような識別し得る表現型を含む。イ
ンターフェロン蛋白質とはグリコプロティンインターフ
ェロンの蛋白質様部分、即ち糖部分の除去の後に残った
部分を意味する。それは人間の白血球、フィブロブラス
ト、またはリンパ胞胚細胞から誘導されるインターフェ
ロンの蛋白質部分を含む。染色体DNA とは真核細胞の核
の中に存する染色体の形状において正常にヒストンと結
合されたDNA を意味する。転写とはDNA の中に含まれる
遺伝情報によるRNA 鎖の形成を意味する。翻訳とはm-RN
A 分子のなかの遺伝情報がそれによって蛋白質合成の間
に特定のアミノ酸の順序を指示する過程を意味する。 【０００８】［真核細胞の共形質転換］より最近、しか
しながら、特に哺乳動物細胞で選択可能な表現型をコー
ドしている外来DNA により形質転換された真核細胞が報
告された（Wigler, M.等、Ｃell 11: 223 〜232 (197
7)）。この仕事は拡張され真核細胞が共形質転換される
ことが出来、真核細胞の核の染色体DNA の中に集積され
る外来DNA を得るインターアリアが表現されるという本
発明の真核細胞が結果として生じた。更に予期せざるこ
とであるがこのような外来DNA は共形質転換体によって
表現されることが出来、官能性の蛋白質を生ずることが
発見された。加うるに原核生物と対照してみると、外来
DNA は数百の世代にわたって着実に表現せられ、その結
果は外来DNAを染色体DNA の中に集積することによるも
のと考えることが出来る。 【０００９】［原核細胞における真核遺伝子による蛋白
質様物質の生合成］本発明の真核細胞は蛋白質様物質、
特に例えばインターフェロン蛋白質、抗体、インシュリ
ンのような真核原質の蛋白質の商業的調製におけるバク
テリアシステムを包括する大いなる進歩を提供する。こ
のような利点はこのような蛋白質様物質の前駆物質をコ
ードしている不変遺伝子を使用する能力を含む。細胞の
合成の後、該前駆物質は真核細胞の中において処理せら
れ、または転換せられて生物学的有効体の所望の分子を
生成する。この現象は細胞の中において適当なペプタイ
ド開裂によって活性インシュリンに転換するプレピロイ
ンシュリンとして真核細胞において最初に造られるイン
シュリンに対してよく知られている。原核細胞はプレプ
ロインシュリンをインシュリンに転換するための必須細
胞機構が不足しているので、インシュリンに取り込まれ
た真核遺伝子の原核細胞中への挿入は結果としてインシ
ュリンではなくプレプロインシュリンの製造をきたすで
あろう。比較的小さくそしてよく特徴づけられた蛋白質
であるインシュリンの場合、この困難性は適当な遺伝子
の化学的合成によって打ち勝つことが出来るけれども、
このようなアプローチは所望の蛋白質のアミノ酸連鎖の
理解の水準によって本質的に制限される。かくして正確
なアミノ酸連鎖がまだ知られていないインターフェロン
蛋白質、凝固因子、抗体およびよく特徴づけられていな
い蛋白質に対しては、原核システムは多分満足に証明さ
れてはいないであろう。 【００１０】［真核細胞における真核遺伝子による蛋白
質様物質の生合成］対比すれば、真核システムは真核細
胞が必要な処理機構を有しているので、このような障害
は伴わない。かくして本発明はアミノ酸系列の詳細な分
子の理解を必要とせずに、例えばインターフェロン蛋白
質、インシュリン、抗体等のような所望の蛋白質様物質
を製造する共形質転換された真核細胞を提供する。 【００１１】活性蛋白質を製造するためには取り除かれ
ねばならない余分のアミノ酸を有する前駆物質の問題に
加えて、重要な生物学的物質が合成および開裂の後の化
学的付加によって変性されるであろう。かくして例えば
人間において造られるインターフェロンは蛋白質に加え
て糖分子を含むグリコプロティンである。もしバクテリ
ア細胞において製造されるならば、インターフェロンは
人間細胞においてインターフェロンが造られる場合に付
加される糖分子は欠如している。更にバクテリアの中に
おいて造られる蛋白質様物質はもし該蛋白質様物質が有
意な精製なくして哺乳動物に与えられるならば炎症を起
こし得るであろう内毒素を含む。対比すれば、真核細胞
において造られるインターフェロンは内毒素を含んでい
ないであろう。それ故に本発明はまたバクテリア細胞で
は造られることの出来ない、例えばグリコプロティンの
ような非蛋白質様物質および蛋白質様物質を含む化合物
を製造する共形質転換された真核細胞を提供する。 【００１２】 【作用】本発明の真核細胞は該真核細胞に由来しない優
性の選択可能な表現型に対する増幅可能な遺伝子に関連
しているDNA(B)分子と目的とする蛋白質様物質をコード
している外来DNA(A)分子とによって共形質転換される。
そしてこのように形質転換された真核細胞は、該増幅可
能な遺伝子が増幅された真核細胞の生存または識別を可
能ならしめる試薬であるメトトレキセイト( 以下mtx と
略称する）の連続的に高められる濃度の存在下において
培養される。該DNA(A)分子は予じめ該DNA(B)分子と化学
的に結合されてから該真核細胞に挿入されるか、あるい
は該DNA(A)分子は該真核細胞内で該DNA(B)分子と化学的
に結合し、該真核細胞において、増幅可能なDNA(B)分子
の増幅に伴って、外来DNA(A)分子が増幅される。本発明
の該真核細胞中に挿入されるDNA(A)としては特に例えば
インターフェロン蛋白質、インシュリン、成長ホルモ
ン、凝固因子、ウイルス抗原、抗体および幾つかの酵素
のような選択可能な表現型とは関連を持たない蛋白質様
物質をコードしているDNA が適している。本発明の真核
細胞は、従来の手法によって得ることの出来ない量の所
望の蛋白質様および他の物質を合成することが可能であ
る。 【００１３】［詳細な説明］本発明によれば、外来DNA
(A)は形質転換によって獲得されることなくして細胞に
よって表現せられない選択可能な表現型を遺伝的にコー
ドしていることを含むDNA(A)で、そして化学的に結合さ
れていない外来DNA(B)で細胞を共形質転換することによ
っていかなる真核細胞の中へも外来DNA(A)が挿入され得
る。該共形質転換は適当な成長培地において、そして生
き残るかさもなければ改変される細胞のみが選択可能な
表現型を獲得した細胞であるような選択された条件の存
在において行われる（図１参照）。 【００１４】以後に検討される実施は例えば人間血液細
胞、マウス フィブロブラスト、チャイニズハムスター
卵巣細胞、およびマウス奇形がん腫細胞のような哺乳動
物系統の培養された真核細胞に関するものであるけれど
も、一般に例えば鶏のような鳥類からの細胞、イースト
および菌の細胞、穀物や花を含む植物からの細胞のよう
なすべての真核細胞に対して適用できることが明らかで
ある。それ故に本発明の真核細胞は終局的には哺乳動物
の細胞がもっとも適しているが、本発明の真核細胞はす
べての真核生物の細胞で適用が可能であると理解される
べきである。 【００１５】本発明の真核細胞は選択可能な表現型に結
合していない蛋白質様物質をコードしている遺伝子を含
む外来DNA を該真核細胞の中への挿入にされている場合
に特に有用である。このような蛋白質様物質はこれらが
選択可能な表現型と結合されていないという事実によっ
て特徴づけられているので、コードしているDNA を含む
細胞はそれ故に形質転換された細胞の破壊とその含有量
の測定による以外には識別されることは出来ない。 【００１６】蛋白質様物質の例としては共形質転換方法
を用いて真核細胞の中へ挿入せられそして表現せられる
遺伝子はインターフェロン蛋白質、インシュリン、成長
ホルモン、凝固因子、ウイルス抗原、酵素および抗体を
含む。 【００１７】ある場合にはDNA(A)とDNA(B)は集積と表現
とを得るために精製せられる必要はないけれども、該DN
A が共形質転換細胞において用いられるに先立って精製
せられることは屡々好ましい。このような精製は不純物
の存在のために不正の結果の可能性を制限し、そして共
形質転換細胞が識別されそして安定に培養され得る確率
を増加する。また本質的ではないけれども、DNA(A)およ
び／またはDNA(B)が例えば真核染色体DNA のエンドヌク
レアーゼ切断の制限のように染色体供与DNA のエンドヌ
クレアーゼ切断によって得られていることは時には望ま
しいことである。加うるに、共形質転換真核細胞におい
て用いられるに先立ってDNA(A)とDNA(B)が燐酸カルシウ
ムで処理されることは望ましい。DNA を燐酸カルシウム
でこのように処理するための方法は以下により完全に記
述される。最後に、外来DNA(A)はDNA(A)の超過量を構成
する選択可能な表現型をコードしているDNA(B)と比例し
た量、例えば約１：１から約100,000 ：１の範囲の量で
存在することが望ましい。 【００１８】本発明の好ましい実施例において、外来DN
A(A)および／または外来DNA(B)は共形質転換真核細胞に
おいて使用するに先立ちバクテリアのプラスミドまたは
ファージDNA と接触させられる。特に前途有望な実施例
においては、外来DNA(A)および／またはDNA(B)はファー
ジDNA と接触せられ、そしてそれから共形質転換に先立
ってファージ粒子の中へ包含される。 【００１９】選択可能な表現型をコードしているいかな
るDNA(B)も本発明の形質転換された真核細胞においては
有用であろうけれども、記述される実験の詳細は特にヘ
ルペス単純ウイルスから得られたチミジン キナーゼ
（以下tkと略称する）に対する遺伝子の使用とアデニン
ホスホリボシル トランスフェラーゼ（以下aprtと略
称する）に対する遺伝子の使用とに関する。加うるに医
薬品耐性に結合された選択可能な表現型をコードしてい
る遺伝子、例えば細胞にメトトレキセイトに対する耐性
を与える突然変異種のジハイドロフォレイト リダクタ
ーゼ（以下dhfrと略称する）遺伝子を含むDNA(B)は該形
質転換された真核細胞の適用可能性を拡張する。 【００２０】好ましい実施例によれば、共形質転換は物
理的にそして化学的にDNA(B)に結合されていないDNA(A)
を含み、そして該DNA(A)は共形質転換された真核細胞の
核の中において染色体DNA の中へ安定に集積される。 【００２１】本発明の真核細胞は培地において共形質転
換された該真核細胞が生き残ることが出来、そして／ま
たは識別され得ることが出来ることにおいてのみ制限さ
れるいかなる適当な培地においても獲得される。単に例
のためだけによれば、tk遺伝子を獲得したマウス フィ
ブロブラストに対する適用な培地は以後により完全に記
述されるHAT である。また、共形質転換は選択可能な表
現型を獲得したこれら細胞の生き残ることの出来る、そ
して／または識別され得る選択された条件の存在下にお
いて行われる。このような条件は養分、医薬、または他
の化学的拮抗剤、温度等の存在を含むであろう。 【００２２】本発明の真核細胞は該技術においてよく知
られた手法を用いて該細胞から回収せられることが出来
る所望の物質をコードしている外来DNA(A)を含む。加う
るに、該細胞はDNA(A)を転写して再びよく知られた手法
を用いて回収せられる蛋白質または他の所望の物質を形
成することを可能にし得る。最後に、該細胞は培地にお
いて成長せられ、そしてそれから蛋白質や他の所望の物
質を回収して得ることが出来る。 【００２３】以上に識別された所望の蛋白質様物質は天
然物質であるけれども、合成遺伝子が組み立てられる合
成生体高分子の製造においても共形質転換された該真核
細胞は等しく有用であり得る。かくして本発明の真核細
胞はまだ存在していない新規な蛋白質を製造する。加う
るに、本発明の真核細胞はそれらが現在存在しているけ
れどもそれらの単離および／または識別が特別に成就さ
れることが出来ないかのような極めて僅かの量または不
純な形状において行なう蛋白質の製造を可能にする。最
後に本発明の真核細胞は例えばグリコプロティンおよび
他の産物のような部分的に蛋白質様の物質の製造を可能
とし、この物質の合成は遺伝的に指示される。 【００２４】細胞の中において形成される遺伝子産物の
量を増加するために、真核細胞に転移遺伝子の増幅の挿
入が行われる。外来DNA(A)分子の増幅を真核細胞の中へ
挿入するため、増幅DNA(A)分子でおよび別段細胞によっ
て表現せられない優性の選択可能な表現型に対して増幅
可能な遺伝子の増幅に相当する化学的に結合していない
増幅外来DNA(B)分子で細胞を共形質転換する。この共形
質転換過程は適当な培地において、そして優性の選択可
能な表現型を獲得する細胞が生き残ること、そして／ま
たは該細胞を識別することが出来るmtx の存在において
行われる。望ましくは、増幅し得る優性遺伝子（DNA
(B)）の最高の数を獲得したこれら細胞がただ生き残り
そして／または識別されるが故に、これはこのようなmt
x の連続してより高濃度の存在下になされる。これら細
胞はそれからまたDNA(A)の増幅を含む。このアプローチ
は例えばmtx に対する耐性を細胞に与える突然変異種dh
fr遺伝子のように細胞に医薬品耐性を与える増幅し得る
遺伝子の増幅挿入に対して特に適している。DNA(A)が増
幅され形質転換された真核細胞はそれからDNA(A)がコー
ドしている遺伝子産物の増大された量の製造に用いられ
る。 【００２５】これに代えて、外来遺伝子が増幅せられ
得、そして終局的にはDNA 分子で真核細胞を形質転換す
ることによって真核細胞によって表現され、そして各々
のDNA分子は外来DNA(A)を真核細胞によって普通は表現
せられない優性の選択可能な表現型に対する増幅し得る
遺伝子に相当する外来DNA(B)に化学的に結合することに
よって形成せられている。DNA(A)とDNA(B)との化学的な
結合は、特にリガーゼによる酵素処理の結果として形成
せられる結合の形状である。このように形成される雑種
DNA 分子による形質転換はそれから適当な成長培地にお
いて、そして例えば増幅し得る遺伝子のコピーが充分大
きく増幅されこれら真核細胞が生き残ることの出来る、
そして／または該細胞を識別することが出来るmtk のモ
ルを基準として１：１から10,000：１の範囲の量の連続
的に上昇する濃度の存在において行われる。このアプロ
ーチを用いて、別段細胞によって表現せられない優性の
選択可能な表現型に対して増幅可能な遺伝子が増幅され
真核細胞はそうでもなければ細胞を識別するために死亡
または無能が結果として生じる増幅可能な遺伝子を補足
し得るmtx の上昇せられた濃度の存在下において生存し
そして／または識別することが出来る。優性の選択可能
な表現型に対する種々の増幅可能な遺伝子は本発明の真
核細胞において有用であるけれども、例えばmtx に対す
る耐性を細胞に与えるdhfrに対する遺伝子のような医薬
品耐性を有する遺伝子は特に適している。 【００２６】 【発明の効果】共形質転換された真核細胞を用いること
によって蛋白質様または他の所望の分子の増幅が真核細
胞の中において造られることが出来る。例えばインター
フェロン蛋白質、インシュリン、成長ホルモン、凝固因
子、ウイルス抗原、または抗体、またはインターフェロ
ンそれ自体の増幅分子が雑種DNA を用いて共形質転換さ
れた真核細胞の中において造られることが出来る。かく
して、または以下に述べる方法で燐酸カルシウムで処理
されている精製されたDNA を用いて共形質転換せられて
いる真核細胞、特に哺乳動物の細胞によって上記所望の
物質が製造せられ得る。かくして本発明の真核細胞は従
来の手法を用いては得られないような濃度において高度
に望まれている、稀な、そして高価な蛋白質様および他
の生物学的物質を製造することが可能である。 【００２７】本発明の真核細胞は更に例えば部分的に蛋
白質で、しかし糖、リボ核酸、ヒストン等のような他の
化学種を更に含んでいるインターフェロンを含むグリコ
プロティンのような正常に真核細胞の中においてごく僅
かな量製造せられている物質の製造が可能である。例え
ばグリコプロティンのような細胞質物質によって細胞内
で合成が複雑に行われている生物学的物質の製造方につ
いては、僅かしか理解されていないけれども、本発明の
真核細胞を用いることによって、商業的に有用な量でこ
のような物質を合成することが可能になるであろうこと
は予期されることである。特に、例えばグリコプロティ
ンのような非蛋白質部分を含む細胞質物質の蛋白質部分
をコードしている一つの遺伝子または複数個の遺伝子
を、正常にこのような物質を造る真核細胞の中へ挿入す
れば、該真核細胞は相当する蛋白質様物質を製造するだ
けでなく、もし必要性が拡がったら既に存在する細胞機
構を有用化して蛋白質様物質を処理するであろうし、ま
た適した非蛋白質様物質を添加して完全に生物学的に活
性の物質を形成するであろう。同様にして該真核細胞は
インターフェロン、インシュリン等の非蛋白質部分を含
む生物学的物質を生物学的に完全に活性を有する構造で
製造することが出来る。 【００２８】 【実施例】本発明における、そして以下により完全に記
述されるが、真核細胞は選択基準が存在しない正確に定
義された原核遺伝子および真核遺伝子によって安定に形
質転換されている。精製されたウイルスのtk遺伝子をこ
の遺伝子が欠如しているマウスの細胞へ添加すること
は、HAT 培地において成長するそれらの能力によって選
ばれることが出来る安定な形質転換されたマウスの細胞
の出現を結果として生ずる。これら生化学的形質転換は
一般的な集団よりも高い頻度で他の結合されていない遺
伝子を多分集積するであろう十分な能力を有する細胞の
従属集団に相当するので、共形質転換実験はウイルスtk
遺伝子、およびバクテリオファージΦX174、プラスミド
pBR322 、または人間またはラビットのβーグロビン遺
伝子連鎖をもったクローニングされた染色体によって行
われた。 【００２９】Tk形質転換は汚染雑種交配によって更なる
DNA 連鎖の共形質転換に対してクローニングされそして
分析される。マウス細胞系統はΦX 、pBR322、または人
間およびラビットβーグロビン連鎖の増幅とを含んでい
るものとして識別された。１回から50回以上共形質転換
された連鎖は独立なクローンから単離された高分子量DN
A の中へ集積される。従属クローンの分析は共形質転換
されたDNA が培地における多くの世代にわたって安定で
あることを実証する。この共形質転換システムは事実上
いかなる定義された遺伝子をも培養された真核細胞の中
へ導入しそして安定に集積することを可能ならしめる。
ウイルスベクターまたは選択可能な生化学的マーカーの
いずれかに対する結紮も必要とされない。優性に働くマ
ーカーによる共形質転換は原則として事実上いかなるク
ローニングされた遺伝的要素を野生型の培養された真核
細胞に導入することを可能ならしめる。 【００３０】この終わりに、CHO A29 細胞からの優性に
働く、mtx 耐性の、dhfr遺伝子が野生型の培養されたマ
ウス細胞に形質転換された。形質転換体においてCHO dh
fr連鎖の存在を実証することにより、遺伝子形質転換に
対する決定的な証拠が証明せられた。mtx の上昇せられ
たレベルに対してこれら細胞を曝露することは結果とし
てこの医薬品に対する高められた耐性を新規に形質転換
された遺伝子の増幅を伴って生ずる。突然変異種dhfr遺
伝子は、それ故に、形質転換に先立つてCHO A29 細胞DN
A をpBR322連鎖へ結紮することによって、真核ベクター
として用いられている。該dhfr連鎖の増幅は該pBR322連
鎖の増幅を結果として生ずる。真核細胞における優性に
働くベクターとしてのこの遺伝子の使用はもはや研究に
利用できる突然変異種に対するこれら種族を制限するこ
となしに、潜在的に形質転換可能な細胞のレパートリー
を拡大するであろう。 【００３１】記述された手法を用いて、クローニングさ
れた染色体のラビットのβーグロビン遺伝子はDNA −仲
介遺伝子形質転換によってマウス フィブロブラストの
中へ導入されている。この遺伝子を含む共形質転換され
たマウス フィブロブラストは異種構造の宿主において
表現と、これら連鎖の後処理を研究するための特有な機
会を提供する。RNA 汚染( 感染）手法に協調する溶液雑
種交配実験は少なくとも１回形質転換された細胞系統に
おいてラビットグロビン連鎖がポリアデニン化された９
Ｓ種としてチトプラズム中に表現されることを示す。こ
れら９Ｓ連鎖は結果として完全な継ぎ合わせおよび該二
個の移転から生じる。しかしながらこれらの結果は異種
構造の種族からのフィブロブラストはそれらの表現がエ
リストブラストに限定せられているラビット遺伝子の間
に入っている連鎖を正確に処理するために必要な酵素を
含んでいるということを暗示する。驚くべきことには、
しかしながら、成熟したラビットのm-RNA の５’末端に
存在する４５のヌクレオチドは該形質転換試験のチトプ
ラズム中に検出される該グロビンm-RNA 連鎖には存在し
ない。これらの研究は真核遺伝子の表現の分析において
共形質転換システムのポテンシャル値を示す。野生型遺
伝子を固有の、そして試験管内で組み立てられた突然変
異種遺伝子と一緒に培養された細胞中に導入することは
連鎖組織の官能的有意性のための一つの検定を提供す
る。 【００３２】［遺伝子の増幅］組換え体DNA 手法は雑種
交配プローブが用いられ得る幾つかのより高度な真核細
胞の単離を容易にする。例えば基礎代謝機能をコードし
ているような細胞のこれらの遺伝子に対して１個から20
個のコピーとして存在するm-RNA 転写によって異常に低
いレベルで表現せられる遺伝子はｃDNA クローンの組み
立てを含む従来の手法および組換えライブラリーの終局
的なスクリーニングによっては単純には、単離されるこ
とができない。このようなまれにしか表現されない遺伝
子の単離に対する改良されたアプローチはそれ故にプラ
スミド救出として知られている処置と協調して形質転換
を利用することを開発した。研究室において現在進行中
であるこの概要は以下にあらまし述べられる。 【００３３】鶏のaprt遺伝子は酵素、Hin III またはXb
a によっては開裂されず、そしてこれら酵素で消化され
る細胞質DNA でaprt- マウス細胞を形質転換することは
鶏のaprt遺伝子を表現するaprt+ クローンを結果として
発生させる。Hin III で開裂された鶏のDNA をHin III
で開裂されたプラスミドpBR322に結紮することはaprt遺
伝子が今やプラスミド連鎖に隣接している雑種DNA 分子
の形成を結果として生じる。arpt- 細胞の形質転換は今
やこのDNA によって行われる。形質転換はマウス細胞に
おいて高分子量のDNA の中に集積されているこの完全な
複合体とともにpBR322に共有的に結合している該aprt遺
伝子を含むべきである。この最初の細胞形質転換は他の
雛の連鎖の非常に多数のものから鶏aprt遺伝子を除去す
る役目をする。この形質転換せられた細胞DNA は今やpB
R322または該aprt遺伝子のいずれをも開裂しない酵素、
Xba １DNA で処理される。結果として得られた断片はそ
れから結紮によって回送される。このような断片の一つ
は模写の原型およびアンピシリン耐性マーカーをコード
しているpBR322連鎖と共有的に結合された該aprt遺伝子
を含むべきである。 【００３４】例えばエシェリチア コリのようなバクテ
リアをこれら回送マーカーで形質転換することは今や鶏
のaprt連鎖に結合されている真核DNA からプラスミド連
鎖を選択する。この二重選択手法は雑種交配プローブが
容易に得られない真核細胞において低いレベルで表現す
る遺伝子の単離を可能ならしめる。 【００３５】［実験］本発明の真核細胞のよりよい理解
を助けるために、種々の実験の結果がここに記載され
る。培養された細胞の中へ精製された遺伝子を転移する
能力は形質転換された宿主における外来遺伝子の官能性
および物理的状態を研究するための独特な機会を提供す
る。 【００３６】［tk 遺伝子をマーカーとした形質転換］
HSV tk突然変異種マウス細胞へ転移するためのシステム
の開発は（Wigler, M.等、Cell 11: 223〜232 (197
7)）、これらの研究が独特な細胞遺伝子に拡張されるこ
とを可能にした（Wigler, M.等、Cell 14:725 〜731 (1
979)）。tk+ 組織から得られそして真核組織の変種から
の細胞によって培養された高分子量DNA はこの酵素にお
いて欠けている突然変異種マウス細胞にtk活性を転移す
るために用いられることが出来る。形質転換過程の一般
化は細胞aprt遺伝子とヒポキサンチンホスホリボシル
トランスフェラーゼ( 以下hprtと略称する）遺伝子の連
続的な転移によって実証された（Wigler, M.等、Proc.
Nat. Acad. Sci USA 76:1373〜1376 (1979);Willicke,
K.等、Molec. Gen. Genet. 170:179〜185 (1979); Gra
f, L.Y.等、Somatic Cell Genetics,印刷中 (1979)
）。より最近、選択可能な生化学的マーカーをコード
している遺伝子で形質転換された細胞はまた高頻度で他
の物理的に結合されていないDNA 断片を集積することが
実証された。ここではtk遺伝子は定義された原核および
真核遺伝子によって、培養された哺乳動物細胞の中へ共
形質転換せられ、該哺乳動物細胞を識別するためのマー
カーとして用いられた（Wigler, M.等、Cell 16:777 〜
785 (1979)）。 【００３７】［dhfr遺伝子をマーカーとした形質転換］
遺伝子転換の検出は過去には広範囲にわたって適当な突
然変異種細胞系統の供用にたよっていた。ある場合には
代謝阻害物に対する細胞耐性が優性に作用する突然変異
種遺伝子を含む。優性に作用するマーカーによる共形質
転換は原則としていかなるクローニングされた遺伝的要
素をも野生型培養された細胞の中へ導入することを実質
的に可能ならしめる。この研究においては、細胞は細胞
耐性にmtx の高濃度を与える突然変異種dhfr遺伝子をコ
ードしている遺伝子によって形質転換される（Flintof
f, W.F.等、Cell 2:245〜262 (1976)）。 【００３８】培養された哺乳動物細胞はフォレイト拮抗
体であるmtx に対して非常に鋭敏である。mtx 耐性細胞
系統は識別せられ三つのカテゴリーに入れられた：(1)
この医薬品の減少された移送を伴う細胞（Fischer, G.
A., Biochem. Pharmacol. 11:1233〜1237 (1962); Siro
tuak, F. M.等、Cancer Res. 28:75 〜80 (1968) ）：
(2) mtx に対するdhfrの親和性を低下せしめる構造的突
然変異を伴う細胞（Flintoff, W. F. 等、Cell 2:245〜
262 (1976)）：および(3) 異常に高いレベルのdhfrを生
産する細胞（Biedler, J. L.等、Cancer Res. 32:153〜
161 (1972)； Cha 【００３９】興味あるmtx 耐性変種細胞系統A29 はmtx
に対する減少させられた親和力により突然変異種dhfrの
上昇されたレベルを合成することを確認された（Wigle
r, M.等、Cell 16:777 〜785 (1979)）。この細胞系統
からのゲノムDNA は実験においては突然変異種dhfr遺伝
子をmtx 感受性細胞に転移するための供与体として用い
られた。mtx 耐性形質転換細胞をmtx の増大せられたレ
ベルに曝露することは転移された遺伝子を増幅した細胞
を選択する。この方法で転移せられた真核細胞では、実
質的に培養された哺乳動物細胞中のいかなる遺伝的要素
をも転換しそして増幅することを可能ならしめる。 【００４０】［マウス細胞への突然変異種ハムスター
dhfr遺伝子の転移］高分子量細胞DNA は野生型mtx 感受
性CHO 細胞およびA29 細胞、突然変異種dhfrの増大され
たレベルを合成するmtx 耐性CHO 誘導体から調製された
（Flintoff, W. F. 等、Cell 2:245〜262 (1976)）。dh
fr遺伝子またはtk遺伝子のいづれかをtk- マウスＬ細胞
(Ltk- aprt- ) に転移することに対するこれらDNA 調製
物の能力が燐酸カルシウム共沈澱法の変型を用いてテス
トされた（Wigler, M.等、Proc. Nat. Acad. Sci. USA
76:1373 〜1376 (1979) ）。突然変異種A29 および野生
型CHO 細胞の双方からのDNA はtk遺伝子を Ltk- aprt-
細胞に転移することにおいて有能であった。mtx 耐性集
団はA29 からのDNA による細胞の以下に示す処理のみに
よって観察された。得られたデーターはA29 でのmtx 感
受性細胞の処理は突然変異種dhfr遺伝子の転移と表現を
結果として起こす。 【００４１】この仮説を直接的にテストするために、分
子異種交配研究が行われ、推定せられた形質転換からの
DNA 中にハムスターdhfr遺伝子の存在することが実証さ
れた。ハムスターdhfr遺伝子の構造的遺伝子連鎖と相同
性を有するマウスdhfr cDNAクローン(pdfr-21) （Chan
g, A. C. Y. 等、Nature275:617 〜624 (1978)）は我々
の形質転換においてこの遺伝子の存在を検知するために
用いられた。 【００４２】A29 からの、推定せられた形質転換から
の、そして増幅されたマウス細胞からのdhfr遺伝子の限
定分析は汚染異種交配によって行われた（Southern, E.
M., J. Mol. Biol. 98:503 〜517 (1975)）。DNA は制
限エンドヌクレアーゼHindIIIによって開裂せられ、ア
ガローズ ゲルによって電気泳動せられ、そしてニトロ
セルロース フィルターに移転せられた。これらのフィ
ルターはそれから32Ｐーラベルされたニックー転換され
たpdhfr-21の高い特定活性によって異種交配せしめら
れ、そして自動放射線写真術によって現像せられる：こ
の方法はdhfrプローブに相同するゲノムDNA の限定断片
を視覚化せしめる。顕著なバンドはマウスDNA に対して
15kb、3.5kb、および3kb 、ハムスターDNA に対して7.9
kb、3.7kbおよび1.4kb に観察される。これら二つの種
の間の限定プロフィールは充分大きく相違しており内生
マウス遺伝子の存在下でハムスター遺伝子を区別するこ
とを可能ならしめる。mtx に対する５つのＬ細胞形質転
換体耐性はそれ故に汚染異種交配によって試験される。
各々の形質転換された細胞系列において、内生マウスdh
fr遺伝子の開裂から得られるバンドと分子量がハムスタ
ーDNA の開裂に基づいて観察せられるそれらと同一であ
る更なるバンドの一連との予期されるプロフィールが観
察された。ハムスターDNA において観察された17.9kb、
7.9kb および1.4kb バンドはハムスターdhfr遺伝子の存
在の診断に役立ち、そしてすべての形質転換に存在す
る。 【００４３】最初の実験において、mtx の最低濃度(0.1
μg/ml) が選ばれ、それはLtk - aprt- 細胞の生存を10
-7以下に減少する。先の研究（Flintoff, W. F. 等、Ce
ll 2:245〜262 (1976)）は単一突然変異種dhfr遺伝子の
存在はmtx のこの濃度に対する細胞耐性を与えることが
出来ることを暗示した。形質転換された細胞DNA のハム
スターdhfr遺伝子断片の強度と野生型ハムスターDNA の
強度との比較は我々の形質転換がmtx 耐性ハムスター遺
伝子の一つかせいぜい数個を含むことを示唆する。比較
により、突然変異種dhfrの上昇されたレベルを生ずるこ
とが示された供与A29 細胞（Flintoff, W.F.等、Cell
2:245〜262 (1976)）はこの遺伝子の増幅を含んでいる
ように思われる。 【００４４】［転移せられたdhfr遺伝子の増幅］最初の
形質転換は比較的低いレベルのmtx(0.1 μg/ml) に対す
る耐性に対して選択された。すべてのクローンに対し
て、しかしながらこの医薬品の連続的に増加せられてい
る濃度に対してマス培地を曝露することによってmtx の
上昇せられたレベルに対して細胞耐性を選択することは
可能である。この方法において、我々は最初0.1 μg/ml
に対する耐性体であったクローンからスタートしてmtx
の40μg/mlまでに対する培養耐性体を単離した。我々は
次いで、これら形質転換体におけるmtx に対する増加さ
れた耐性体がdhfr遺伝子の増幅に関係しているかどう
か、そしてもしそうであれば、内生マウスまたは新しく
転移されたハムスター遺伝子が増幅されたかどうかを調
べた。４つの独立した単離からのDNA およびそれらの耐
性誘導体が汚染異種交配によって試された。各々の例の
おいて、mtx に対する高められた耐性はハムスター遺伝
子のコピー数における増加によって伴われた。これは1.
5kb バンドの強度を比較することによってもっとも容易
に見られる。いずれの例においても、我々は内生マウス
dhfr遺伝子の増幅を検出しなかった。最後に、mtx 当量
濃度で選択されたすべての系統が同じdhfr遺伝子コピー
数を持つとはいえないことに注意するべきである。 【００４５】「一般化形質転換ベクターとしてのdhfr遺
伝子」選択可能な遺伝子は他の遺伝的要素を培養された
細胞の中へ導入するためのベクターとして用いることが
出来る。以前の研究において、tk遺伝子で形質転換され
た細胞が恐らく他の化学結合されていない遺伝子と併合
するであろうことが実証された（Wigler, M.等、Cell 1
6:777 〜785 (1979)）。このアプローチの一般化は選択
可能なマーカー、突然変異種dhfr遺伝子に対してテスト
された。A29 からの全細胞DNA の20μg がHindIII で線
状化せられたpBR322DNA の１μg と混合された。受入れ
細胞はこのDNA 混合物に曝露され、そして二週間後にmt
x 耐性体集団が摘出された。形質転換体からのゲノムDN
A が単離せられ、HindIII で開裂せられ、pBR322連鎖の
存在に対して分析せられた。２つの独立した単離体はこ
の方法で試験され、そして両方共の場合において、pBR3
22連鎖の増幅はこれらmtx形質転換体の中に存在した。 【００４６】一般化された形質転換に対する改良したア
プローチは選択可能でないDNA 連鎖の結紮を含む。突然
変異種dhfr遺伝子は医薬品耐性因子に作用する優性であ
るから、この遺伝子は一つの理想的なベクターである。
更に、上昇せられたレベルのmtx に対して細胞耐性を選
択することによってこのベクターを結紮されたいかなる
遺伝要素をも増幅することは可能である。この可能性を
調べるために、A29 のdhfr遺伝子を破壊しない制限エン
ドヌクレアーゼが形質転換検定によって識別された。一
つのこのような制限エンドヌクレアーゼ、Sal ＩはA29
DNA の形質転換能力を破壊しない。Sal Ｉで開裂された
A29 DNA はそれ故にSal Ｉで線状化されたpBR322の等し
い量と結紮された。この結紮生成物は次いで形質転換実
験に用いられた。mtx 耐性集団は摘出され、そして0.1
μg mtx ／mlでマス培地の中で成長された。マス培養物
は次いで増加された濃度のmtx に曝露された。DNA は0.
1 、2 、10および40μg/mlmtx に対するマス培養物耐性
体から得られ、pBR322およびdhfr連鎖のコピー数が汚染
異種交配によって測定された。６つの独立した形質転換
された系統がこのやり方で試験された。５つのこれら系
統はpBR322連鎖と相同な増幅バンドを現した。これら形
質転換されたクローンの４つにおいて、少なくとも一つ
のpBR322の特定バンドがdhfrの増幅において強度を増大
した。SS-1において、二つのpBR322の特定バンドが0.1
μg/mlmtx に対して細胞耐性体からのDNA において観察
された。これらのバンドは2 μg/mlに対する細胞耐性に
おける強度において数倍増加する。しかしながら40μg/
mlに対する耐性に対して選ばれた細胞においてはいかな
る強度の増加も観察されなかった。第２の系統では0.1
μg/mlに存在するSS-6、すべてのpBR322のバンドは細胞
がまずmtxの2 μｇ/ml で選択され、次いで40μg/mlで
選択されるにつれて強度を増加し続ける。奇妙なことに
は、新しいpBR322の特定バンドは高いmtx 濃度での選択
の後に現れる。この細胞の系統ではpBR322連鎖に対する
コピー数においては少なくとも50倍の増加があることが
評価せられた。第３の細胞系統においては、HH-1、二つ
のpBR322の特定バンドが増幅にもとづいて強度を増加
し、その他は一定に残るかまたは強度を減少する。かく
してこれらの細胞において観察されるpBR322連鎖の増幅
のパターンは全く変化することが出来る。けれども、突
然変異種dhfr遺伝子は培養された動物細胞の中へ限定さ
れたDNA 連鎖を導入しそして増幅するためのベクターと
して用いることが出来る。 【００４７】［考察］真核遺伝子表現の研究におけるDN
A に仲介された形質転換の可能性のある有用性はその一
般化にもとづく大きな広がりに依存する。選択可能な生
化学的官能性をコードしている細胞遺伝子は予め突然変
異種の培養された細胞の中へ導入せられる（Wigler,
M., 等、Cell 14:725 〜731 (1979); Wigler, M., 等、
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76:1373 〜1376 (1979); W
illecke, K.,等、Molec. Gen. Genet. 170:179〜185 (1
979); Graf. L.H., 等、Somatic Cell. Genetics, 印刷
中(1979) ）。最近の研究では、優性に作用するmtx 耐
性dhfr遺伝子は野生型の培養された細胞に転移された。
共形質転換システムにおけるベクターとしてのこの遺伝
子の使用は今やいかなる遺伝的要素を新しい細胞環境の
宿主の中へ実質的に導入することを可能ならしめるであ
ろう。 【００４８】最初の実験では、A29 細胞からのDNA 、突
然変異種dhfrを合成するmtx 耐性CHO 誘導体がマウスＬ
細胞の培養物に対して添加せられた。mtx 耐性集団は1
から10集団／5 ×105 細胞／20μg 細胞DNA の頻度で現
れた。いかなる集団も野生型mtx 感受性細胞から得られ
たDNA による形質転換にもとづいて観察されないけれど
も、このDNA はtk遺伝子の有能な供与体であった。我々
が突然変異種ハムスタのdhfr遺伝子の転移をもたらした
決定的な証拠はマウス形質転換体の中のハムスター遺伝
子の存在を実証したことによって得られた。マウスとハ
ムスターのdhfr遺伝子の限定地図は顕著に相違しそして
汚染異種交配実験においてこれら遺伝子を区別すること
を可能ならしめる。試験されたすべての形質転換におい
て、マウスdhfr cDNA クローンと相同な限定断片の二つ
の組、内生マウス遺伝子の特徴を有する一連のバンド、
および供与体ハムスター遺伝子の特徴を有する第二の一
連のバンドが観察される。 【００４９】dhfrの所在する場所の形質転換の有用性は
形質転換の、およびmtx に対する自然の耐性の双方の相
対頻度の関数である。摘出されたすべてのmtx 耐性Ｌ細
胞は内生遺伝子の増幅よりもむしろ形質転換から結果と
して生じることの実証はdhfrの増幅がこの細胞系におい
ては稀な出来事であることを示唆する。マウス テラト
ーマとラット肝臓細胞を含む他の細胞系統を形質転換さ
せるための試みがなされ、そしてこの例においては異種
交配研究がmtx 耐性の獲得は内生dhfr遺伝子の増幅から
結果として生じることが明らかとなる。精製せられたdh
fr遺伝子の使用は多分形質転換の頻度を著しく増大する
ことによるこれら困難性に打ち克つことにある。 【００５０】最初の形質転換体において観察せられるdh
frのコピー数は低い。この観察は単一突然変異dhfr遺伝
子が選択された基準(0.1μg /ml mtx)の下で細胞mtx 耐
性の与えることが出来ることを示唆する以前の研究（Fl
intoff, W. F.,等、Cell 2:245〜262 (1976)）と一致す
る。これら最初の耐性形質転換体の医薬品濃度を段階的
に増すことに対して曝露することは、新しく転移された
突然変異種ハムスターdhfr遺伝子の増幅から生ずる高め
られたmtx 耐性による細胞の選択を結果として起こす。
いかなる形質転換体においても、内生マウス遺伝子の増
幅は選択された圧力に応じて観察されなかった。単一の
突然変異種遺伝子は多分単一野生型遺伝子よりも与えら
れた濃度のmtx に対する顕著に大きな耐性を与える。も
し増幅の頻度が低ければ単に増幅という出来事の最少数
を有する耐性変種を選択することになる。新しく転移さ
れた遺伝子は内生遺伝子よりも容易に増幅されるであろ
う。 【００５１】突然変異種dhfr遺伝子は選択可能でない遺
伝的要素を、培養された細胞へ導入するための優性転移
ベクターとして用いられた。一つの実験的アプローチは
有能な細胞が高頻度で他の物理的に結合されていない遺
伝子を集積するという以前になされた観察（Wigler, M.
等、Cell 16:777 〜785 (1979)）を開発する。pBR322DN
A に曝露された培養物は突然変異種dhfr遺伝子を含む遺
伝性DNA と共にバクテリアのプラスミドの複合コピーを
含むmtx 耐性細胞系統の因となる。 【００５２】遺伝的ベクター付けに対する改変されたア
プローチはpBR322連鎖を形質転換に先だって選択可能な
dhfr遺伝子に結紮することを含む。この産物はまた複合
pBR322連鎖を含む形質転換を生ずる。dhfrの増幅はpBR3
22連鎖の増幅を結果として生ずるが、しかし増幅のパタ
ーンは細胞系統によって異なる。一つの例においてはす
べてのpBR322連鎖はmtx 濃度の増加によって増幅する。
他の系統では、連鎖のサブセットが増幅する。また他の
系統では連鎖は失われたかもしくは再配列されたように
思われる。いくらかの系統では、増幅は40μg/mlまでの
mtx 濃度を増加することにともなって進行するが、一方
他のものでは、増幅は2 μg/mlで中止する。現在、増幅
過程は理解されてもいないし、また増幅単位が定義され
てもいない。これら複雑な出来事に対する原因となるい
かなる機構も、それらが培養された細胞の中へ導かれる
いかなる遺伝子の投与を実質的に調節するために開発さ
れ得ることは明らかである。 【００５３】［材料及び方法］当該実験を行うための材
料及び方法は以下のとおりである。 細胞培養 Ltk クローンＤの誘導体（Ltk aprt, Kit, S. 等., Es
p. Cell Res. 31:291〜312(1963) ）は10％仔牛血清
（フローラボラトリーズ，ロックビル，メリーランド）
と50μg/mlのジアミノブリン(DAP) を含むズルベッコの
変性イーグルの培地(DME) の中に養われた。形質転換に
先立って、細胞は洗浄され、DAP の存在しない状態で３
世代にわたって成長せられた。形質転換されたdhfr（mt
x に対する耐性を与えられた）A29mtxRiiiを含むチャイ
ニーズハムスター細胞系（Flintoff,W.F., 等., Somati
c Cell Genetics 2:245〜261(1976) ）は３Ｘー非選択
性アミノ酸，10％仔牛血清、および１μg/mlアミトブテ
リンを補充されたDME で繁殖せられた。増幅実験のため
に、培地は更に20μg/mlのメトトレキセイトを補充され
た。ねずみ類 Ltk- aprt細胞は Ltk- クローンＤ細胞の
aprt陰性誘導体である。細胞は成長培地中で養われ、Wi
gler, M., 等、PNAS76:1373 〜1376(1979)に記述された
ように形質転換に対して準備された。Hep-2 （人間），
HeLa（人間），CHO （チャイニーズ ハムスター卵
巣），および Ltk- 細胞は成長培地の中で成長された。
LH2b，ヘルペス単純ウイルス tkDNA で形質転換された
Ltk- の誘導体は15μg/mlでヒポキサンチン、0.2 μg/m
lでアミノブテリン，そして5.0 μg/mlでチミジンを含
む成長培地(HAT) （Wigler, M., 等、 Cell 1:223 〜23
2(1977) ）中にて養われた。すべての培地皿はヌンクロ
ン（バンガード インターナショナル，ネプチューン，
N.J.）プラスチックであった。OTT 6050移植系統の腫瘍
から得られた供給体独立マウス テトラトカルシーノー
マ細胞培養物系統6050P （Watanabe, T., 等、 PNAS 7
5:5113 〜5117(1978)）は野生型，またはtk+ 親として
用いられ、そしてここにTCC wt. と命名される。この系
統はＸ／Ｏ性染色体型の、Watanabe, T., 等、(1978)に
記述される特性を有する39染色体の様式番号を持つ。該
細胞は10％の胎児仔牛血清の入ったズルベッコの変性イ
ーグルの培地中で成長せられた。 3μg/mlの突然変異を
起こすＮーメチルーＮ’ーニトローＮーニトロソグアニ
ジンに対して３時間の曝露の後、細胞は２週間回復せら
れそしてそれから80μg/mlのBrdUrdの入った培地に移さ
れた、一連の耐性クローンが単離され、本形質転換実験
において用いられるクローン系統（TCC tk- ）が供給さ
れた。この系統は10-8以下の野生型への隔世遺伝頻度を
有する。形質転換に先立って、細胞はBrdUrdの30μg/ml
の入った培地中で養われ、洗浄せられ、そして該医薬の
存在しない状態において三世代にわたって成長せられ
た。形質転換効率はマウスＬー細胞(Ltk- ) のtk- 欠如
系統のそれ（Kit,S.,等、Exp. Cell.Res. 331:297〜312
(1963) ）と比較された。 【００５４】［ゲノムDNA の抽出と制限エンドヌクレア
ーゼ切断］高分子量のDNA は培養された細胞（CHO, LH2
b,およびHeLa）から、または先に述べたように（Wigle
r, M., 等、 Cell 14:725〜731(1978) ）、凍結された
ラビット肝臓から得られた。高分子量鮭精子DNA はウォ
ーシントンから得られた。制限エンドヌクレアーゼ切断
(BamＩ，HindIII ，Kpn Ｉ，および XbaＩ) は50mM Nac
l, 10mM トリス・Hcl,5mM MgCl2, 7mMメルカプトエタノ
ール，および牛の血清アルブミンを100 μg/mlで含むバ
ッファー(pH7.9) において行われた。酵素対DNA 比率は
少なくともDNA の２単位／μg であり、反応混合物は37
℃で少なくとも２時間熟成せられた。消化の完了をモニ
ターするために、１μl のニック・形質転換されたアデ
ノウイルスー２〔32Ｐ〕DNA が反応体積の５μl で少な
くとも２時間熟成され、切断生成物は１％アガローズゲ
ル中での電気泳動によって分離され、そして消化はクロ
ネックス２DCX 線フィルムに乾燥ゲルを感光されること
によってモニターされた。CVー１ー感染された細胞か
ら、先に述べたように損傷していないヘルペス シンプ
レックス ウイルス（HSV ）DNA が単離された（Pellic
er, A., 等、 Cell14:133〜141(1978) ）。DNA は6mM
トリス(pH7.9), 6mM MgCl2, 6mM ２ーメルカプトエタノ
ール、6mMNaClおよび200 μg/ml牛の血清アルブミンを
含むバッファーにおいて KpnＩ（ニューイングランド、
バイオラボ）によって消化された。限定されたDNA は0.
5 ％アガローズゲル(17 ×20×0.5cm)を介して24時間、
70Ｖで電気泳動によって分別され、そして5.1kb のtk-
含有断片が Maxam, A. M. およびGilbert,M. PNAS 74:5
60〜564(1977), およびWigler, M., 等、 Cell 14:725
〜731(1978) ）によって述べられているようにゲルから
抽出された。φX １７４am３RFIDNAはベテスダ リサー
チ ラボラトリーズから購入された。プラスミド pBR32
2 DNA はE. Coli HB 101中で成長せられ、Clewell, D.
B., J.Bacteriol. 110:667 〜676(1972) の方法によっ
て精製せられた。λシャロン４Ａ誘導体(RβG)中のクロ
ーニングされたラビットβ巨大グロビン遺伝子は識別さ
れ、先に述べたようにして単離された（Maniatis, T.,
等、Cell 15:687 〜701(1978) ）。増幅実験において、
高分子量DNA の寸法はヘルペス シンプレックス ウイ
ルスDNA とマーカーとしてその XbaＩ断片を用いて0.3
％アガロースゲル中で電気泳動によって測定された。平
均寸法が75kbよりも大きなDNA のみが増幅実験において
形質転換能力を持っていることが見出された。この実験
において、プラスミドDNA は300 μg/mlエチジウム プ
ロマイドを含むCsClこう配において同比重的遠心分離に
よってクロラムフェニコール増幅された培養物から単離
された。 【００５５】［形質転換および選択］形質転換調書はGr
aham, F. L. およびVander Eb, A. J., Virology, 52:4
56〜457(1973) において述べられたように、以下の改変
をともなう。形質転換の１日前に、細胞は皿あたり0.7
×106 細胞で植え付けられた。形質転換の４時間前に培
地は変更された。１mMトリス(pH7.9)/0.1mM EDTAにおい
て溶解された無菌の、エタノール沈澱された高分子量ま
たは制限エンドヌクレアーゼー切断された真核DNA は40
μg/mlでDNA 、および250mM CaCl2 を含むDNA ／CaCl2
（マリンクロト）を調整するために用いられた。２倍に
濃縮されたヘペス緩衝化された含塩物(2XHBS) が調整さ
れた。それは280mM NaCl, 50mMヘペス，および1.5mM 燐
酸ソーダ、を含むpH7.10±0.05に調節された。DNA ／ C
aCl2溶液は無菌2XHBS の同量に滴加された。綿栓のつい
た１ーmlの無菌プラスチック ピペットが2XHBS を含む
混合管の中へ挿入され、DNA が添加されている間吹込み
によって気泡が導入された。燐酸カルシウム／DNA 沈澱
物は室温で30〜45分で攪拌なしで形成せしめられる。沈
澱物はそれからプラスチック ピペットにそっととられ
ることによって混合され、そして皿あたり１mlの沈澱物
が直接に受入細胞を覆っている成長培地の10mlに添加さ
れた。37℃で４時間熟成の後、培地は置き換えられ、そ
して該細胞は更に20時間、熟成される。その時、選択性
圧力が及ぼされる。tk+ 選択に対しては、培地はHAT を
含む成長培地に変えられる。aprt+ 選択に対しては、細
胞はトリプシン化され、低密度で（10ーcm皿あたり約0.
5 ×106 細胞）0.05mMアザセリンと0.1mM アデニンを含
む培地中に置換せられた。tk+ およびaprt+ 選択の両方
に対しては、選択性培地はその次の日，２日後、そして
次いで形質転換体クローンが生じている２〜３週間にわ
たって３日毎に変えられた。集団はクローニングシリン
ダーを用いて摘出され、そして集団の残りはホルムアル
デハイド固定とジエムサでの染色の後記録された。特徴
づけに対しては、クローンは続いて選択性圧力下にマス
培地の中で成長させられた。記録は単離された各々のク
ローンに対して２倍になった細胞のみかけの数について
保持された。 【００５６】Ltk- aprt+ 細胞のmtx 耐性形質転換体はA
29mtxRiii細胞からの高分子量DNAによる形質転換および
10％仔牛血清と0.2 μg/mlアメトプテリンを含むDME に
おける選択の後に得られた。tk+ 選択に対しては、細胞
はメトトレキセイトに対する耐性のために、HAT 培地中
で成長せられ、細胞はメトトレキセイトの0.1 μg/mlを
補充された培地中で選択された。集団は各々形質転換体
が独立の出来事から起こることを確信するため個別の皿
からクローニングされた。A29 DNA と線状化pBR322DNA
との結紮体は供給者によって推められた条件の下にSal
Ｉー切断されたDNA とＴ4 リガーゼ（ベセスダ リサー
チ ラボラトリーズ）との１：１比（ W／W ）を熟成す
ることによって調整された。燐酸カルシウム沈澱は 2μ
g の結紮体と18μg の担体／mlを用いて調整せられ、そ
して受入体細胞に添加された（結紮体の量はプラスミド
が形質転換を阻害するという観察のために限定され
る）。該DNA は該細胞と4 〜12時間接続を保たれ、そし
て培地はそれから吸入せられそして新しいDME に置き換
えられた。選択性圧力は24時間及ぼされ、次いでDNAに
対して曝露された。2 〜3 週間後に、集団はクローニン
グシリンダーを用いて単離された。 【００５７】マウステトラトカルシノーマ細胞実験にお
いて、形質転換はTCC tk- 細胞が形質転換１日前に 3×
105 細胞／皿で接種されたことを除いては前に述べたと
同様に形質転換が行われた。付着細胞の各々の皿に対し
て、4 μg の組換えプラスミドで調整せられた燐酸カル
シウム／DNA 沈殿物，Ltk - aprt- 細胞から得られた高
分子量DNA の20μg の存在下Bam H1で消化されたPtk-1
が添加された。加うるに、いくらかの細胞はサンペンシ
ョンで処理された（Willecke, K., 等、 Molec. Genet.
170:179 〜185(1979) ）7 ×106 の新しくトリプシン化
されたTCC tk- 細胞はBam H1ー開裂されたプラスミドPt
k-1 からのDNA10 μg および鮭精子からの高分子量DNA
の150 μg で調整された燐酸カルシウム／DNA 沈澱物と
混合された。Willecke, K., 等(1977)において述べられ
たように遠心分離、再懸濁、そして振盪の後に細胞は成
長培地中に再び薄く覆われた。３日後に、培地はHAT 培
地に置き換えられ、形質転換体の集団は２週間後に単離
された。 【００５８】共形質転換実験は染色体成人βーグロビン
遺伝子を含むHindIII ー開裂されたプラスミドpHβ-8の
4 μg と共にBam H1ー消化されたPtk-1 DNA の4 μg で
行われた（Lawn,R.M.,等、 Cell 15:1157 〜1174(197
8)）。Tk+ 形質転換体は0.1mMヒポキサンチン／o.4 μM
アミノブテリン／16μM チミジン(HAT) を含む成長培
地の中で選択された。集団はクローニングシリンダーで
摘出され、マス培地の中で成長された。 【００５９】［定義されたDNA 連鎖とHSVtk 遺伝子の共
形質転換］Ltk- aprt- マウス細胞は1 〜10μg のΦ17
4,1 μg pBR322または1 μg の RβG ー１DNA のいずれ
かによって1 μg のHSV ー１遺伝子と10〜20μg の鮭精
子担体DNA との存在下で先に述べたように（Wigler,
M., 等、PNAS 76:1373〜1376(1979)）形質転換された。
Tk+ 形質転換はヒポキサンチン、アミノブテリン、およ
びチミジン(HAT) と10％の仔牛血清を含むDME において
選択された。単離された集団はクローニングシリンダー
を用いて摘出されそしてマス培地の中で成長された。 【００６０】［酵素検定］抽出物は0.5 ％トライトンＸ
ー100 を含む0.1ml の0.02M 燐酸カリウム，pH7,の中に
洗滌した細胞粒（約107 細胞）を再懸濁することによっ
て得られた。700Xg遠心分離の25分後に得られた上澄液
（チトプラズム）は酵素活性の定量と電気泳動のために
用いられた。aprtおよび蛋白質は先に述べられたように
検定された（Chasin, L. A., Cell 2:37〜41(1974)）。
該反応混合物中における3mM チミジン トリホスフェイ
ト，5'ーヌクレオチダーゼの阻害物質（Murray, A. W.
およびFriedrichs, B., Biochem, J. 111:83〜89(196
9)）の含有はAMP 回復を増加せず、そしてそれはヌクレ
オチダーゼがaprt活性の測定を妨害していないことを示
す。aprtの導電収束は本質的にhprtに対して述べられた
（Chasin, L. A. およびUrlaub, G. Somat. Cell Gene
t. 2:453 〜467(1976) ）ように次の例外とともに行わ
れた。アムホリン(LKB) 混合液の0.8% pH2.5〜4, 0.8%
pH4 〜6, および0.4% pH5〜7 を含むポリアクリルアマ
イドゲル酵素活性を検定するために、[2-3H]アデニン
[0.04mM, 1Ci/mmd, ニューイングランド核(1Ci=3.7×10
10ベクレム)]がヒポキサンチンに対して置換された。 【００６１】［th活性の検定］特定活性測定のために、
単層培養物からの細胞は燐酸バッファー血清の中へ削落
され洗浄せられた。細胞粒は５容量の抽出バッファー
（0.01M トリス・HCl, pH7.5, 0.01M KCl, 1mM MgCl2,
1mM 2 ・メルカプトエタノール、および50μM チミジ
ン) の中へ懸濁された。該細胞サスペンションは３回凍
結および溶解せられそしてKCl 濃度はそれから0.15M に
調節された。音波をかけた後、チトプラズム抽出物は3
0,000Xg 30 分の遠心分離によって得られ、そして上澄
液はWigler, M.等、Cell16:777〜785(1979) において述
べられたようにtk検定のために用いられた。腫瘍からの
チトプラズム抽出物はポッター−エルベジェーム ホモ
ジナイザー中で細胞の崩壊の後に得られた。それらはそ
れから培養された細胞に対して上に述べたように処理さ
れた。tkの一単位は分あたり１ナノモルのチミジンをチ
ミジンモノホスフェイトに転換する酵素の量として定義
される。 酵素無効化研究において、抗ーHSV ー１tk抗
ー血清または前免疫血清がチトプラズム抽出物の等量と
混合され、そしてATP とマグネシウムが6.7mM に添加さ
れた。該酵素抗体混合物は室温で30分熟成され、2000X
g、10分遠心分離され、その上澄液はtk活性のために検
定せられた。更なる生化学的検定において、細胞培養物
から、および固形腫瘍からの相同体の30,000Xg上澄液が
1.6mm 薄に裁断した5%ポリアクリルアマイド ゲル上で
電気泳動され、そしてLee, L. S. およびCheng, Y.
C., J. Biol. Chem., 251:2600〜2604(1976)に述べられ
たようにしてtk活性に対して検定された。 【００６２】［RNA 単離］全RNA はpH5.1 のフェノー
ル, フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（25:24:1, vol/vol), およびクロロホルム／イソアミ
ルアルコール（24:1, vol/vol)によって連続的に抽出を
行なうことによって形質転換されたＬ細胞の対数的な相
培養物から単離された。エタノール沈澱の後、該RNA は
DNアーゼで消化された（Maxwell, I. H.,等、Nucleic
Acids Res. 4:241〜246(1977) ）そしてエタノールで沈
澱された。核とチトプラズムブラクションはWigler,
M., 等、PNAS 76:1373〜1376(1979)に述べられたと同様
に単離され、そしてRNA が上記のようにして抽出され
た。チトプラズム ポリアデニル化RNA がオリゴ(dT)ー
セルローズ クロマトグラフィーによって単離された
（Axel, R., 等、Cell 7:247〜254(1976) ）。 【００６３】［ cDNA 合成］ラビットとマウスの cDNA
がMyers, J. C. およびSpiegelman, S., PNAS 75:5329
〜5333(1978)に記載のようにしてアビアン ミエロブラ
ストシス ウイルスリバース トランスプリプターセ(R
NAー依存 DNA ポリメラーゼ) を用いて得られた。 【００６４】［形質転換細胞DNA の単離］細胞はPBS 中
に剥脱されて収穫せられそして1000Xg10分間遠心分離す
る。粒子はTNE[10mMトリス-HCl(pH8.0), 150mM NaCl, 1
0mM EDTA],の40容量に再懸濁され、そしてSDS およびプ
ロティナーゼＫが夫々0.2%および100 μg/ml添加され
た。該リセイトは37℃, 5 〜10時間熟成され、そしてそ
れからバッファー飽和フェノールとCHCl3 で連続的に抽
出される。高分子量DNA が該水性相と2 容量の冷エタノ
ールとを混合し、そして直ちに形成された沈澱を取出す
ことによって単離された。該DNA は70% エタノールで洗
浄されそして1mM トリス, 0.1 EDTAに溶解せられた。ク
ローンΦX4とΦX5からの該チトプラズムが Rigold, G.
M.,等、Cell 10:19〜26(1977)に述べられていると同様
に得られた。該フラクションは更にHirt, B., J. Mol.
Biol. 25:365〜369(1967) に述べられたと同様に高分子
量と低分子量のDNA に分別された。 【００６５】［DNA フィルター異種交配］細胞DNA は制
限エンドヌクレアーゼで処理せられ、アガローズ スラ
ブゲルで電気泳動せられ、ニトロセルロース フィルタ
ーシート上に移され、そしてWigler, M., 等、 PNAS 7
6:1373 〜1376にに述べられたと同様に32ＰーラベルDNA
プローブで異種交配せられた。形質転換細胞からのDNA
は供給者( ニューイングランド バイオラボ または
ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ) によって特定せ
られた条件を用いて種々な制限エンドヌクレアーゼによ
って分解せられた。分解は1.5U／μg の酵素対DNA 比で
37℃2 時間行われた。反応はEDTAの添加によって終結せ
られ、そして生成物は36mMトリス，30mM NaHPO4, 1mM E
DTA(pH7.7)中で水平アガロース スラブゲル上で電気泳
動された。DNA 断片はニトロセルロース シートに移さ
れ、異種交配せられそして前に述べた方法と二つの改変
された方法によって洗浄された（Weinstock, R.,等、PN
AS 75:1299〜1303(1978)）。二つのニトロセルロース
フィルターが転移の間用いられた（Jeffreys,A.J. およ
びFlavell, R.A., Cell 12:1097 〜1108(1977)）。低位
フィルターは捨てられ、次いで異種交配され、該フィル
ターは2XSSC, 25mM 燐酸ソーダ、1.5mM Na4P2O7, 0.05%
SDSにおいて4 回20分間洗浄せられ、そしてそれから1:
1 および1:5 に希釈したこのバッファーにおいて連続的
に洗浄せられた（Jeffreys, A. J. およびFlavell,R.
A., Cell 12:429〜439(1977) ）。増幅実験において、
プローブは32Ｐーニック転換されたpBR322またはpdhfr-
21, マウスdhfr m-RNAの cDNA コピーのいずれかであっ
た（Chang, A. C. Y., 等、Nature 275:617〜624(197
8) ）。 【００６６】［溶液異種交配］32Ｐーラベルされたグロ
ビン cDNA(2.9 ×108 cpm/μg の特定活性) が0.4M NaC
l/25mM 1.4ーピペラジンジェタンスルホニックアシド(P
ipes), pH6.5/5mM EDTA 中で75℃において過剰のRNA と
異種交配された。熟成時間は70時間を超えない。Rotsが
RNA ヌクレオチドのモル／リッター／時間。時間は秒，
として計算された。異種交配において単一糸状ヌクレア
ーゼＳ１に対する耐性が与えられた。 cDNA のフラクシ
ョンは記載されたと同様に測定された（Axell, R. 等、
Cell 7:247〜254(1976) ）。 【００６７】［RNA フィルター異種交配]RNAは（Baile
y, J. およびDabidson, N., Anal. Biochem 70:75 〜8
5(1976)）によって記載されたと同様に5mM メチル水銀
ハイドロオキサイドを含む1%アガローズ ゲル(17 ×20
×0.4cm)を通して電気泳動された。各々の溝におけるRN
A の濃度は0.5 μg/μl であった。電気泳動は室温で11
0V, 12時間であった。Alwine., J.C.等、PNAS 74:5350
〜5354(1979)に述べられたと同様にしてRNA はpH4.0 ク
エン酸塩転移バッファーを用いてジアゾ化セルロース
ペーパーに該ゲルから移された。転移の後、該RNA フィ
ルターは担体RNA を500 μg/ml含む転移バッファーで1
時間熟成された。フィルター上のRNA は32Ｐーニックー
転換によって特定活性の 2ー8 ×108cpm/ μg にラベル
されたクローニングDNA プローブの50μg /ml 異種交配
され（Weinstock, R.,等、PNAS 75:1299〜1303(197
8)）、反応容量はフィルターの25μl/cm2 であった。異
種交配は4X標準血清クエン酸塩(0.15M Nacl/0.015M ク
エン酸ソーダ) /50%ホルムアミド中で57℃, 36〜46時間
であった。異種交配の後、フィルターは2 種類の2X標準
血清クエン酸塩/25mM 燐酸ソーダ/1.5mMピロ燐酸ソーダ
/0.1% ドデシルスルホン酸ソーダ/5mM EDTA 中に37℃30
分間振盪しつつ浸漬してフォルムアミドを除去した。連
続的な洗浄は1Xと5mM EDTAと0.1 % ドデシルスルホン酸
ソーダを含む0.1X標準血清クエン酸塩にて68℃, 各々30
分間であった。 【００６８】［形質転換されたマウスＬ細胞におけるラ
ビットβーグロビンのバーク シャープ分析］異種交配
は80%(vol/vol)ホルムアミド( イーストマン) /0.4MPip
es, pH6.5/0.1mM EDTA/0.4M Nacl中で（Casey, J. およ
びDavidson, N., Nucleic AcidRes 、4:1539〜1552(197
7)）; （Berk, A. J. およびSharp, P. A 、Cell 12:72
1 〜732(1977) ）、18時間, 1.8Kbp Hha I断片に対して
は51℃、Psi 1 断片に対しては49℃で行われた。該異種
交配はＳ１ヌクレアーゼで処理され、そして本質的に
（Berk, A. J. 及びSharp, P. A.(1977)）に述べられた
方法によって分析された。 【００６９】本開示は本発明に関してすべての本質的な
情報話を記載するものではあるけれども、ここに引用さ
れる多くの刊行物は本発明および技術の様相の背景を理
解することにおいて助けとなるであろう。したがって引
用された刊行物のすべてはここに本開示の中に参照とし
て編入される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における共形質転換過程を説明する略式
過程図である。 【図２】二重選択技法を用いて共形質転換され培養され
ている細胞から外来ＤＮＡを回収する方法を説明する略
式過程図である。
過程図である。 【図２】二重選択技法を用いて共形質転換され培養され
ている細胞から外来ＤＮＡを回収する方法を説明する略
式過程図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 リチャード アクセル
アメリカ合衆国 10025 ニューヨーク,
ニューヨーク，リバーサイド ドライブ
410
(72)発明者 マイケル エイチ．ウィグラー
アメリカ合衆国 11724 ニューヨーク,
コールド スプリング ハーバー 私書
箱100 コールド スプリング ハーバ
ー ラボラトリー内
(72)発明者 ソール ジェイ．シルバスタイン
アメリカ合衆国 10533 ニューヨーク,
アービントン，バーチ レイン 260
(56)参考文献 ＮＡＴＵＲＥ 281（1979）ＰＰ．46
−60
ＣＥＬＬ 16（1979）ＰＰ．777−785
ＲＩＣＨＡＲＤ ＡＸＥＬ ＥＴ Ａ
Ｌ．”ＥＵＣＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥ
ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ：ＩＣＮ−ＵＣ
ＬＡ ＳＹＭＰＯＳＩＡ ＯＮ ＭＯＬ
ＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡ
Ｒ ＢＩＯＬＯＧＹ ＶＯＬＵＭＥ Ｘ
ＩＶ，1979”ＰＰ．473
ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ
Ｉ．ＵＳＡ 75，〜11！（1978）ＰＰ.
5553−5556
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．外来DNA(A)分子と、真核細胞に対してメトトレキセ
イト耐性を与えるジハイドロフォレイト リダクターゼ
をコードしている増幅可能な遺伝子であるDNA(B)分子と
によって共形質転換された真核細胞 ２．該外来DNA(A)は該外来DNA(B)と予じめ結合された状
態で該真核細胞に挿入される請求項１に記載の真核細胞 ３．該外来DNA(A)と該外来DNA(B)とは別個に該真核細胞
に挿入される請求項１に記載の真核細胞 ４．該外来DNA(A)は選択可能な表現型に関連しない蛋白
質物質をコードしている請求項１に記載の真核細胞 ５．該外来DNA(A)はインターフェロン蛋白質をコードし
ている請求項４に記載の真核細胞 ６．該外来DNA(A)はインシュリンをコードしているDNA
である請求項４に記載の真核細胞 ７．該外来DNA(A)は成長ホルモンをコードしているDNA
である請求項４に記載の真核細胞 ８．該外来DNA(A)が凝固因子をコードしているDNA であ
る請求項４に記載の真核細胞 ９．該外来DNA(A)はウイルス抗原または抗体をコードし
ているDNAである請求項４に記載の真核細胞 １０．該外来DNA(A)は一つの酵素をコードしているDNA
である請求項４に記載の真核細胞 １１．該外来DNA(A)は実質的に精製されているDNA であ
る請求項１に記載の真核細胞 １２．該外来DNA(A)は真核染色体DNA の制限エンドヌク
レアーゼ分解から得られたDNA である請求項１に記載の
真核細胞 １３．該外来DNA(A)および／または該DNA(B)はバクテリ
アまたはファージDNA に結合している請求項１に記載の
真核細胞 １４．該外来DNA(A)および／または該DNA(B)はファージ
粒子中に内包されるファージDNA に結合している請求項
１に記載の真核細胞 １５．該外来DNA(A)および／または該DNA(B)は燐酸カル
シウムで処理されている請求項１に記載の真核細胞 １６．該真核細胞は哺乳動物細胞である請求項１に記載
の真核細胞 １７．該哺乳動物細胞はエリスロブラストである請求項
１６に記載の真核細胞 １８．該哺乳動物細胞はフィブロブラストである請求項
１６に記載の真核細胞 １９．該外来DNA(A)は選択可能な表現型と関連する蛋白
質様物質をコードするDNA(B)に対して１：１からおよそ
100,000：１の範囲の量で存在する請求項１に記載の真
核細胞 ２０．該外来DNA(B)は医薬品または化学的拮抗剤に対す
る耐性に関連する遺伝子からなる選択可能な表現型と関
連する蛋白質様物質をコードする請求項１に記載の真核
細胞 ２１．医薬品または化学的拮抗剤に対する耐性に関連す
る該遺伝子はメトトレキセイト耐性に細胞を変化させる
突然変異ジヒドロフォレイト リダクターゼをコードす
る遺伝子である請求項２０に記載の真核細胞 ２２．該外来DNA(A)は該真核細胞の染色体DNA の中へ取
り入れられる請求項１に記載の真核細胞
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5306019A JP2736502B2 (ja) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | 共形質転換された真核細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5306019A JP2736502B2 (ja) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | 共形質転換された真核細胞 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56501133A Division JPH0630588B2 (ja) | 1980-02-25 | 1981-02-23 | 外来ｄｎａ分子の増幅を惹き起こす方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0795880A JPH0795880A (ja) | 1995-04-11 |
| JP2736502B2 true JP2736502B2 (ja) | 1998-04-02 |
Family
ID=17952104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5306019A Expired - Lifetime JP2736502B2 (ja) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | 共形質転換された真核細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2736502B2 (ja) |
-
1993
- 1993-11-12 JP JP5306019A patent/JP2736502B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＣＥＬＬ １６（１９７９）ＰＰ．７７７−７８５ |
| ＮＡＴＵＲＥ ２８１（１９７９）ＰＰ．４６−６０ |
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ７５，〜１１！（１９７８）ＰＰ．５５５３−５５５６ |
| ＲＩＣＨＡＲＤ ＡＸＥＬ ＥＴ ＡＬ．"ＥＵＣＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥ ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ：ＩＣＮ−ＵＣＬＡ ＳＹＭＰＯＳＩＡ ＯＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＶＯＬＵＭＥ ＸＩＶ，１９７９"ＰＰ．４７３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0795880A (ja) | 1995-04-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19971104 |