JP2686301B2 - 血管を冷凍保存する装置及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は血管を安定化させる装置に係わり、特に、長
期間にわたつて血管を保存できるような極低温に迄血管
を冷凍する際に使用する保存手順に関する。又、血管を
冷凍及び解凍するための装置を使用する方法が開示され
る。冷凍保存された血管は、自身の血管を移植すること
のできない患者に移植したり、新鮮な血管を利用できな
い場合に患者に移植するうえで有用である。

発明の背景 “冷凍保存”は、細胞や、静脈並びに動脈を含む血管
のような組織物質を極低温にて冷凍し、その組織の生育
性及び機能を保存した状態で保管する技術である。毎
年、米国だけでも360,000例もの小血管による冠動脈バ
イパスの“ジヤンプ”手術が実施されている。その他に
100,000例もの臍より下方に於ける末梢血管の手術が実
施されている。小さな血管手術の中の15％は、既に以前
に手術を受けたために利用可能な適当な組織がない患者
や、糖尿病を患つていたり組織が不適当となつてしまう
病気を患つている患者に対して施術されている。臨床的
には、唯一の代替方法は最適とはいえない組織を使用す
るか、或いは閉塞を生じ易い人工血管を使用することで
あり、従つて理想的とはいえない。心臓弁組織の冷凍保
存（1987年１月２日付出願の関連する米国特許願第000,
095号を参照されたい。この特許願は参照することでそ
の全てをここに組み入れられる）の成功によつて、又、
これ迄に3,000例を超える弁の冷凍保存並びに約2,200例
を超える移植の成功によつて、この技術を同様に静脈及
び動脈の組織に対して拡張させることが意図されてい
る。このようにして、臨床的な設定に於いて冷凍保存さ
れた組織が上述した特許に関しての必要性を満し、又、
患者に対する傷の形成を少なくして外科手術の時間及び
費用を低減するのである。

同種移植血管を使用するこれ迄の試みには多くの問題
点があつた。その方法に於ける主なる懸念は、使用され
る迄組織を冷凍し保管することができないことのため
に、組織を手に入れる時点が一致しないということであ
つた。更に、これ迄の研究ではこの分野の技術レベルを
利用して冷凍処理することに失敗してきており、この結
果として組織の生育力は低く不定となり、開在（patenc
y）が早期に失われる結果を生じていた。

静脈及び動脈に於ける冷凍学的な保存に関して発表さ
れた数例の報告書はあるが、その保存手順に伴う冷凍生
物学的な変化に関してのシステム的な試験結果は発表さ
れていない。殆ど全ての研究者は血管にジメチルスルホ
キシド（DMSO）を簡単に浸み込ませて、その組織を液体
窒素の中で急速冷凍していた。何人かのその他の研究者
は制御不能且つ測定不能な冷凍速度を使用していた。人
体から切り離されると、血管組織は収縮する自然の傾向
を見せる。これ迄の研究によれば、そのような状態に於
いて血管の内皮層は剥がれてしまい、それ故にこのよう
な血管が組織移植されたならば血栓症を生じ易くなると
いうことが示されている。

このような血管の内皮層を保存することは特に重要と
なる。何故ならば、血管内部のこの内皮層は積極的に血
栓の発生を防止するからである。伏在静脈の冷凍保存に
関するこれ迄の研究によれば、冷凍並びに解凍された組
織に於ける主なる異常はこの組織層の破壊並びに損失で
ある。この組織の冷凍保存に関する第１の目標は、氷結
晶の形成を防止することである。この氷結晶は細胞構造
を破壊し失わせる。別の冷凍方法が特定の組織に応用で
きる。全ての組織は冷凍保存並びに解凍に耐える能力に
於いて同じではなく、有効な生育力を維持する能力に於
いても同じではないのである。この技術を乳房内動脈や
その他の動脈の組織に対して成功裏に応用できることを
知る研究者はいなかつた。

発明の概要 本発明の装置は、血管を支持し且つ膨張させ、冷凍保
存を容易となすための液体を血管に浸み込ませることが
できる構造とされている。特に、血管を冷凍保存するの
に使用される血管支持台（stent）が開示される。この
血管支持台は、ドナーから取つた血管の一部に挿入でき
る端部をそれぞれ有している第１及び第２の細長い探り
針り即ちスタイレットと、スタイレットに取付けられて
血管内部に係合し、スタイレットの上での血管れ液密結
紮を容易となす手段と、選択的に調整可能な互いに直面
する関係状態でスタイレットを受け止め、血管をスタイ
レットの間で膨張させて血管が収縮するのを防止する支
持手段とを含んで構成されている。このようにしてこの
血管支持台は、血管の調達並びに冷凍保存の両段階を通
じて血管を支持するのである。この装置を使用した本発
明の方法は、血管の支持、取り外し、処理研究所への発
送、処理（冷凍処理を含む）解凍及び希釈に先行して行
われる血管の準備に関する技術を伴う。特に強調される
ことは、血管壁が無傷で元の一体状態に維持されること
に加えて、血管内皮（内面層）が保存されることであ
る。これは、血管拡張に係わる“非接触”外科技術、血
管支持台の使用、並びに、氷結晶の形成や浸透衝撃によ
る組織の損傷を最小限に抑えて液体窒素のほぼ−196℃
の温度に迄静脈や動脈を冷凍させる独特の冷凍過程の使
用、を伴うのである。本発明はまた、冷凍された組織が
その損傷を最小限に抑えて急速解凍されることのできる
解凍手順をも含んでいる。本発明によつて冷凍保存され
た血管は、解凍されると蘇生し、何等かの理由によつて
心臓血管或いは末梢血管を再形成するための適当な血管
を持たない患者に於ける病気に侵された血管や損傷され
た血管と交換するのに理想的に適当とされるのである。

従つて本発明の目的は、人間或いは動物の静脈及び静
脈の組織を修復したり取り扱うための装置及び方法を提
供することである。

本発明の他の目的は、生きている血管を長期間にわた
つて保存するための装置及び方法を提供することであ
る。

本発明の更に他の目的は、冷凍処理の前に行う化学処
理の独特な成分セツトを提供することである。

本発明の更に他の目的は、切り取られた血管を支持し
膨張させる装置を提供することである。

本発明の更に他の目的は、解凍された後も内皮を含め
て血管細胞が高い生育力を維持できるように血管を冷凍
する独特の冷凍手順を提供することである。

本発明の更に他の目的は、細胞の育成力を最大限に維
持できる血管の急速解凍を可能にする人間の血管の冷凍
保存方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、極低温にて長期間にわたつ
て保管された後で移植に適当な生きた血管を提供するこ
とである。

本発明の更に他の目的は、解凍するための特別且つ独
特な方法によつて生きた血管を提供することである。

本発明のこれらの及びその他の目的、特徴及び利点
は、開示した以下の実施例の詳細説明及び添付の請求の
範囲の記載を参照すれば、明白となろう。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の好ましい実施例による支持台装置
の概略斜視図。

第２図は、本発明の好ましい実施例による支持台装置
の分解斜視図。

第３図は、静脈を冷凍する冷凍過程を示す概略図。

第４図は、本発明の好ましい実施例によつて約80〜90
mlの溶液内に支持された静脈を解凍する解凍曲線を示す
グラフ。

好ましい実施例の詳細な説明 さて更に詳しく図面を参照すれば、これらの図面に於
いて同じ符号は全図を通じて同じ部分を示している。第
１図は血管支持台10を示しており、この血管支持台は３
つの主要部分、即ち支持トラツク14、スライドする基部
止め栓組立体18及び固定された先端止め栓組立体22、で
構成されている。これらの３つの部分の全ては、（ａ）
都合の悪い変形や亀裂を発生することなく極低温に迄冷
凍することができる、（ｂ）極低温にて柔軟性を有して
いる、（ｃ）化学的に不活性であり、可塑剤のような化
学成分を血管内部に浸出させて血管を汚すようなことの
ない、そして、（ｄ）冷凍保存の手順に於いて使用され
るジメチルスルホキシド（DMSO）、エチレン又はプロピ
レングリコール、グリセロール或いはその他の化学成分
もしくは溶液に耐えることができ且つ反応しない、よう
な何れかの適当な材料によつて製造することができる。
トラツク14は実質的に真つ直ぐで細長い部材であり、止
め栓組立体18及び22を取付けるのに使用される。このト
ラツクは何れかの好ましい形状とされることができる
が、平行管とされ、このトラツク14に止め栓組立体18及
び22が取付けられたときにそれらの止め栓組立体を安定
させる目的で、片側にはその長手部分の少なくとも一部
に沿つて走る溝26が備えられているのが好ましい。トラ
ツク14の基端側の面には、傾斜部30が位置決めされてお
り、この傾斜部は大部分が先端に向けられているフラン
ジを有している。この傾斜部30は、取付け部がトラツク
14に沿つてスライドされたときにそのトラツクの端部か
ら取付け部が滑り落ちないようにしているのである。

基端側のスライド可能な取付け部34は円筒形部材とさ
れ、一端に陥凹部とされた円筒形の軸線方向開口を有し
ており、その陥凹部は取付けピンを組部材として受け入
れることができるようになつている。取付け部34の他端
には前記円筒形に対して直角な開口が形成されており、
この開口がトラツク14を作動的に受け入れることができ
るようになつている。取付け部34はトラツク14に沿つて
スライドできるようになつており、血管部材の与えられ
た長さに調整することができるようになつている。

基端側の止め栓組立体18は円筒形の取付けピン38を含
む。この取付けピン38は基端側の取付け部34の軸線方向
の穴の中に同軸的に着脱自在に組み付けられ、又、円筒
形軸線の回りに回転できることが好ましい。基端側の取
付け部のピン38は本体42と直角に一体形成されている。
本体は中空円筒形とされ、穴46を有していて、この穴46
は円筒形の両側を通して延在され、ピンに対して直角方
向に配向されている。本体42の一端に沿つて、一対の突
起50が半径方向に互いに対置されて配置されており、こ
れらの突起は止め部として作用する。止め栓バレル54が
本体42の円筒形の内部に嵌合されており、この止め栓バ
レルは円筒形で、本体42の内部で内方に配向されて回転
可能に配置されている。バレル穴58がバレル54を通して
その軸線に直角に配置されており、本体42の穴46と選択
的に整合されて止め栓を通る流れを可能にすることがで
きるようになつている。レバー62は実質的に矩形の部材
であつて、一端にて止め栓バレル54に直角に一体構成さ
れている。レバーがトラツク14と平行になるように回転
されると、バレル穴58及び本体の穴46は整合されて止め
栓を通る通路を形成するが、トラツク54と直角な位置と
なる迄バレル54が時計方向に回転されると、穴の整合が
外れて止め栓を通る流体もしくは空気の流れを遮断する
ようになす。

探り張り即ちスタイレツト66は中空で実質的に真つ直
ぐな細長いチユーブとされ、トラツク14と平行に整列さ
れている。スタイレツトの自由端には孔70が形成され、
又、スタイレツトの他端は本体42に突当てられている。
スタイレツト66は本体42と一体構成され、ピン38に対し
ては直角に配向されている。スタイレツト66は穴46と整
合され対置されている。スタイレツト66の中空内部は止
め栓本体42の片側にて穴46と通じている。スタイレツト
66の表面には少なくとも１つ、好ましくは２つもしくは
それ以上の前方へ向けてテーパーを付された傾斜面70が
スタイレツト66と一体的に形成されている。スタイレツ
ト66は血管と連結できるように設計されており、血管は
スタイレツトの上に嵌め付けられ、本体42に当て付ける
ことができるようになされる。スタイレツトの孔68は血
管が連結されたときにその内部に流体や空気を流し込む
ことができるようになつている。スタイレツト管はその
内部の中空穴と基本的に平行であるように寸法形成され
ている。傾斜面70は肩部74にて終端しており、この肩部
は以下に更に詳しく説明するように圧密結紮できるよう
にしているのである。

固定された先端側の止め栓組立体22は基本的には基端
側のスライドする止め栓組立体18と同じであるが、次の
注目すべき変更点が相違している。軸線方向の取付け部
の穴が基端側の取付け部の穴と異なり、従つて取付けピ
ン78の直径は取付けピン38の直径と異なつていて、これ
らの２つの止め栓組立体を相互に交換出来ないようにな
されている。このことは止め栓組立体が先端側の組立体
か基端側の組立体かと混乱するのを回避している。先端
側の取付け部82はトラツク14の先端に永久固定されてい
るのが好ましい。

先端側の本体86もまたその表面に穴（46と同様の穴）
と整合させてルアーフイツテイング（商品名）を一体に
備えており、注射器を着脱自在に受け止めることができ
るようになされている。この代わりに、注射器のような
流体供給装置を着脱自在に受け止めるためのルアーフイ
ツテイングのない状態でボス90が使用できる。標準的な
ルアーフイツテイングは当業者には一般に知られてい
る。代替例に於いては、ボス90は同様に基端側の止め栓
組立体18と一体の構造とされ、トラツク14の上に取付け
られる前又は後で血管の逆フラツシユ洗浄を行なえるよ
うになつている。

先端側のレバー94は基端側のレバー62と同様ではある
が逆方向に回転する。即ち、トラツク14と平行な状態に
於いて先端側レバー94は“開”位置となり、トラツクに
対して直角となるように回転された状態で“閉”位置と
なる。この止め栓の両レバーは、両者がトラツク14に平
行とされているときに互いに向かつて方向決めされ、閉
じ動作に際して血管を引つ張ることがないようになつて
いる。このうにして、これらのレバーはその構造部の全
長を長くすることはなく、先端側レバー94が先端側のボ
ス90もしくはルアーフイツテイング86と干渉することも
ない。

この支持台は切り取られた血管を支持し膨張させる。
この切取り手順は以下に説明する例で詳細に説明する。
血管を滑らかにする適当な筋肉弛緩剤を含有する特別に
調合された灌流溶液が血管の長さ部分に沿つて付与され
る。或る時間、通常は約10分〜15分経過した後、血管が
注意深く切り離される。これには、一般に“非接触”と
称される技術が使用される。これにより、血管の先端側
と基端側との端部での切開が行われる。ドナーの心臓が
拍動しているならば、横断切断された血管のその部分は
結紮糸によつて結紮される。支持台装置10の取り外し可
能な止め栓組立体18及び22がその血管の各端に位置決め
され、その血管を通して或る量の洗浄／膨張溶液が灌流
される。しかる後に切り離しは完了する。この灌流媒体
は何れかの適当な媒体とされることができ、デルベコス
ミニマル エセンシヤル メデイア（DMEM）とされる
のが好ましい。その他の媒体には、それに限定すること
を意図するのでなくて、メデイアム199、イーグル メ
デイア、ハンクス メデイア、デルベコス モデイフア
イド イーグル メデイア、イスコブス モデイフアイ
ド デルベコス メデイア、デフアインド メデイアA
2、CMRL-1066、RPMI-1640（同様に1603、1630又は163
4）、F10、F12、アルフアメデイア、等がある。これら
の媒体に対して、限定するわけではないが人間の血清、
胎児の腓から得た血清（FCS）、血清基質等のような血
清、及び限定するわけではないがニトロプルシド、ダン
トロレーン、ニフエジピン、ベラパミル、フエントラミ
ン、トラゾリン、プロカルデイア等の血清拡張剤が添加
される。約１×10E ４〜約30×10E ４モル、好ましく
は約３×10E ４モル、の濃度のパパベリンを使用する
のが好ましい。この媒体溶液はまた或る種の添加剤、即
ち、バイカーボネート、HEPES或いは同様なバツフア
ー、グルタミン、Ｄ−グルコース及びナトリウムピルベ
ート、を有している。

血管が完全に取り外される前に、止め栓の端部が支持
台装置10の支持トラツク14に取付けられ、血管に収縮す
る機会を与えないようになす。血管の内面の内皮層に有
害となるのが血管のこの自然収縮であり、このためにこ
の支持台はこれを保護するように設計されているのであ
る。血管の残る部分が切り離されると、血管が取得けら
れた支持台10は外部容器に入れて搬送する準備が整うの
である。

支持台10は、この冷凍保存方法に於ける他の段階を通
じて血管を支持し保護し続ける。このように支持された
血管が冷凍保存の場に到着すると、この支持台は付帯的
な血管結紮を行うための一連の洗浄並びに検査を行うた
めの支持を行うのである。冷凍処理が行われる間この支
持台は、血管側壁が折れ曲がるのを防止するのに必要な
支持を行う。又、解凍に際しての最終段階及び希釈に於
いて、この支持台は血管が折れ曲がらないように再び保
持し、冷凍剤の添加及び除去を容易となす。

本発明は、静脈や動脈のような内皮層を有する組織を
冷凍し、保管し、そして解凍する方法を提供する。本発
明によつて冷凍されるこの組織は、細胞の生育力の低下
を最少限に抑えて極低温で長期間にわたつて保管するこ
とができるのである。本発明は、氷結晶の形成に起因す
る組織の損傷並びにゆつくりした冷却に起因する溶液作
用を最少限に抑えて、静脈や動脈のような組織を約−19
6℃の液体窒素の温度に迄冷凍できるようになす独特の
冷凍過程を含むのである。本発明はまた、解凍スケジユ
ールをも含んでいる。これによれば、冷凍された組織
は、組織の損傷を最少限に抑えて急速に解凍されること
ができる。本発明によつて冷凍保存された静脈及び動脈
は解凍されたときに生物学的に生育力を有し、又、病気
にかかつた或いは機械的に損傷された血管と交換するの
に理想的に適しているのである。

保存すべき組織は研究所に受理された組織と全く同様
である。考慮すべきことはドナーの年令、健康及び血管
の病歴である。その他の重要な考慮は、血管の入手迄の
死後の時間（温間虚血）及び血管の入手から研究所での
処理迄の時間（冷間虚血）である。調達の間の組織の取
り扱い並びに組織の発送に使用される媒体の取り扱い方
法には注意を払う必要がある。

本発明によつて冷凍される人間の血管の提供源となる
ことができるドナーは年令で約55才迄とされ、又、重症
のアテローム性動脈硬化症、糖尿病、循環器疾患、重症
の高血圧症、静脈瘤性の静脈、伝染病を患つていてはな
らない。

調達の全ては無菌状態の下で行われる。入手迄の死後
の経過時間は内皮層の細胞に重大な影響を及ぼす。それ
故に、調達はドナーからの死後直ぐに実施されるべきで
あるが、何れにしても死後約10分を超えてはならない。
例えば、冠動脈バイパス手術のためには理想的な長さは
約17cmで少なくとも4mm径の血管を得なければならな
い。これ以外の直径及び長さのものも使用でき、本発明
の範囲に含まれるということは理解されねばならない。

殺菌処理 多くの抗生物質は血管の内皮層に対して極端に有害で
あることが発見された。この有害性は、時間、温度、作
動態様を含めて多くの要因の結果として生じる。抗生物
質に加えて、抗真菌性薬物（抗真菌性）の薬剤が組織の
内皮に対して有害となるのである。細胞の生育力を向上
させ且つこれ迄の薬剤を抗する微生物を殺すためには、
細胞の有害性並びに無菌化効力に関して新しい抗生物質
及び殺菌剤のテストを続けることが必要である。

抗生物質及び抗真菌性薬物の混合物は適当な殺菌効果
のあることが見出された。イミペネム（Imipenem）及び
アンコバン（Ancoban）の混合物はとくに適当であるこ
とが見出された。第Ｉ表は試験管の中で内皮の生育力に
及ぼす抗生物質培養効果を示している。

冷凍媒体 組織をその中で冷凍させる媒体は釣合いのとれた細胞
の環境条件を維持する上で非常に重要である。時間及び
温度もまた特定の媒体が成功するか否かに関与してい
る。一般に、血液結晶や人工結晶のようなプロテイン懸
濁液が細胞の最大限の生育力を維持する上で与えられね
ばならない。

多くの冷凍媒体が本発明の実施に於いて成功裏に使用
できる。バランスのとれた組織培養媒体即ち単純な燐酸
緩衝食塩水のような媒体が殆どの種類の組織に対して使
用できる。この特定の種類の組織に対しては、先に説明
した添加剤と組み合わせたDMEMが好ましい媒体とされ
る。

冷凍媒体は、濃厚なDMEMに対して約１％〜30％、好ま
しくは10％、のFCM、即ち胎児腓血清を加え、上述した
範囲の、好ましくは約0.012％、のパパベリンを加え、
そして約１％〜10％、好ましくは2.5％〜５％、更に好
ましくは2.5％、の濃度のコンドロイチン硫酸を加え
て、構成される。

ジメチルスルホキシド（DMSO）もまた少なくとも１つ
の段階にて１モルを、或いは好ましくは３段階にて0.25
モル、0.5モル及び１モルを、４℃にて滴定によつて添
加される。DMSOの濃度は約0.5〜３モル濃度迄の範囲で
変化できる。DMSOのモル濃度の増加は血管に外傷を与え
ないように徐々になされるのが好ましい。DMSOは高い温
度にて添加することができるが、そのタイミングは非常
に重大であり、或る種の組織には有毒となる場合があ
る。

内皮の保護に於いてこれを更に洗練し且つ組織の一体
性を保存するのに使用される重要な技術革新は、コンド
ロイチン硫酸を使用する点である。このグリコスアミノ
グリカン（GAGS）は細胞外床の主成分である。コンドロ
イチン硫酸のモル重量は5,000〜50,000迄変化でき、
又、これはＤ−グルクロニツク酸及びＮ−アセチル−Ｄ
−ガラクトスアミンのリピートユニツトで構成された硫
酸塩デイスサツカリド（sulphated dissacharide）であ
る。一般に、この物質はＫゾルの添加剤であり、この溶
液は角膜の短期保存（４℃）に使用される。

その他の適当なグリコスアミノグリカンの例として
は、限定するわけではないがヒアルロン酸、デルマタン
硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、等が含まれる。他の冷
凍保護剤には、限定するわけではないがグリセロール、
ポリビニルピロリドン、ハイドロキシチルスターチ、及
び、ポリエチレングリコール、ジメチルホルムアミド、
エチルグリコール、等が含まれる。

第II表は冷凍溶液にこの添加剤を添加した一連の実験
を示している。グループ１〜６はグループ７及び８とは
異なるプロトコル即ち条件が使用され、グループ７及び
８では２時間の保温が行われた。この結果、冷凍混合物
にコンドロイチン硫酸を添加すると内皮の生育力を著し
く改善することが示された。

これらの物質は支持台10の使用もしくは不使用に関係
なく冷凍保存の処理に使用することができる。冷凍保護
剤としてコンドロイチン硫酸又はその代替剤（GAGS）が
血管に加えて細胞、組織、そして器官の冷凍保護のため
の処理に使用できるのである。

冷凍過程 冷凍過程は組織の冷凍保存に成功する上で非常に重大
である。組織の生育力を最大限にするために数多くの変
数が存在する。例えば、流体の体積、組織の寸法、パツ
ケージの幾何学的形状、並びに、冷凍保護剤、組織及び
冷凍媒体に関する特性の組み合わせ、の全てが最適な冷
凍過程に作用するのである。細胞懸濁液に関して利用で
きる従来技術の冷凍過程は血管の冷凍に適していないこ
と、及び、心臓弁組織に関する従来技術の冷凍過程も適
当でないこと、が理解されねばならない。それぞれの組
織はそれぞれに独特で最適な冷凍過程のあることが断定
された。或る組織の冷凍保存に成功するのに必要な冷凍
過程は他の組織の冷凍保存に成功するのに必要な冷凍過
程とは異なるのである。

組織の冷凍には多数の要素を考慮することが必要であ
る。これらの要素の中には、平衡点付近の温度（通常は
凝固点の温度に対して＋４℃）、凝固点に於いて発する
発熱の解放及び制御、水に対する細胞膜の浸透性で決定
されるような最適冷凍速度、細胞の表面−体積比、媒体
中の冷凍保護剤の種類及び濃度、これらの冷凍保護剤に
曝す温度及び時間、冷凍速度を制御される冷凍機から冷
凍保存された組織を取り出してそれを液体窒素の冷凍装
置に浸漬する冷凍速度、並びに温める速度、及び組織の
厚さ、がある。

冷凍過程の詳細 このように、ドナーから静脈を調達即ち切り取り、そ
の血管を移送のために適当な組織保存特性を有する媒体
中に置き、そして冷凍スケジユールに従つて血管を冷凍
する前に適当な冷凍保存剤を使用するというこの方法
が、適当な冷凍保存を行う上で望まれるのである。これ
を達成するために、室温並びに冷却速度はサンプルに対
して所望の効果を生じるように制御されるのである。血
管組織は僅かに異なる速度で冷却されるので、又、特定
の温度で相変化が生じるので、冷凍速度の注意深い制御
が続けられねばならない。

冷凍速度の範囲は血管を収容するパツケージ内の流体
の体積並びにそのパツケージの幾何学的形状の関数でも
ある。ここに説明する冷凍過程はパツケージの体積及び
幾何学的形状に関係するが、本発明は体積及び幾何学的
形状に変化をきたす、従つて冷凍速度に変化をきたすパ
ツケージ設計の変更を包含するものと理解されるべきで
ある。冷凍速度は与えられた温度にて或る程度変化でき
る。適当な範囲は約0.01-100℃／分、約0.1-30℃／分、
好ましくは約0.3-1℃／分、更に好ましくは約0.5-1℃／
分である。本発明の好ましい実施例に於いては、血管の
全体的な冷凍速度は約0.5℃／分に維持される。本発明
に於いて静脈及び動脈を冷凍保存するのに使用される好
ましい冷凍スケジユールは、約2.5cm×25cmの全体積を
有するパツケージ化した組織を冷凍装置の中に配置する
段階を含んでいる。75〜85mlの特定の流体体積に関する
典型的な冷凍過程は、室の初期温度が−10℃に設定され
ている。この室は、サンプル（単数又は複数）が＋４℃
に到達する迄は0.01℃／分の冷却速度に設定される。こ
の時点で、組織は0.5±0.2℃／分の速度で冷却されるよ
うになされ、サンプルが−２±0.5となる迄継続され
る。−２±0.5℃に達した時点で、相変化が始まる。こ
の時点で、融解熱の発生に備えて、冷却速度は室が−70
℃に達する迄−30℃に高められる。室が−70℃に到達し
た直後に、この室は−60℃になる迄20℃／分の速度で温
められ、−60℃になるとその温度が17分間にわたつて保
持される。この間、血管の実際の冷却速度は、約−0.5
±0.2℃／分である。この17分が経過した時点で、室は
再び−30℃のレベルに達する迄10℃／分の速度で温めら
れる。この−30℃のレベルが１分間持続され、しかる後
にサンプルが−20℃に達する迄室は0.01℃／分の冷却速
度で冷却を開始される。この間、サンプルの実際の冷却
速度は約0.5±0.2℃／分である。最終的な冷却速度の調
整段階はサンプルが−65℃又はそれ以下の温度に達する
迄0.5±0.2℃／分での冷却を持続させる。この冷却過程
の結果、その最初から最後迄の冷却速度は約0.5±0.2℃
／分となる。この冷却速度が静脈組織にとつて最適であ
つた。静脈を収容したパツケージが室から取り出され、
−196℃の保存用の液体窒素の冷凍装置の中に置かれ
る。第３図は本発明の典型的な冷却過程を示している。

血管が移植の施設から要請されたような場合には、そ
の組織は液体窒素の冷凍装置の中に収容されているので
ある。

発送 移植を行う病院からの要請を受けると、組織は米国特
許明細書第4,597,266号に開示された容器のような適当
に断熱された発送用容器の中に戻される。この特許は参
照することでその全部がここに組み入れられる。この特
許のものはボール紙製の容器であつて、厚さ10.16cm（4
in）の発泡物質を備えている。好ましい実施例は液体窒
素の中に保存されていたドライアイスを使用するのであ
り、液体窒素の浸み込んだドライアイスが血管を収容し
たパツケージの回りに置かれるのである。このパツケー
ジはしかる後に箱に詰められる。移植片の臨床上の書類
作りに必要な適当なプロトコル及びその他の文書は発素
体に含まれる。

病院に到着したならば、血管及びそれに係わるパツケ
ージが液体窒素の冷凍装置の中に置かれる。この組織は
130℃より高い温度での保存されるのを許すことはでき
ない。何故ならば、温度サイクルの繰返しは細胞の生育
力を失わせる傾向を示すからである。ドライアイスと等
しい温度（−78.6℃）での保存は組織内の酵素モル濃度
の低下を防止するほど十分に低温であるとは見られず、
従つて保存期間が大幅に短縮されてしまう。

解凍 同種移植片での解凍及び希釈は明確に定義される。何
故ならば、氷結晶の成長及び浸透衝撃が組織を傷つけて
しまうからである。静脈は温水浴の中に置くことで解凍
されるべきである。サンプルの体積に応じて、１℃〜10
00℃／分の解凍速度、好ましくは10℃〜50℃／分の解凍
速度がこれらの血管の解凍に適当である。一度解凍され
たならば、選択された冷凍保護剤を通常は段階的な方法
で除去して、細胞に対する浸透衝撃の影響を少なくし、
これにより周囲媒体との細胞の整然とした平衡が得られ
るようにすることが必要である。時間及び温度が主要な
考慮要素である。

血管が使用されるべき時の直前に、血管が解凍される
べきであり、又、段階的な希釈方法を使用して冷凍保存
添加剤が除去され、これにより浸透性の損傷を最少限に
抑えればならない。この解凍並びに希釈手順は実際の冷
凍手順と同様に重要であると見做される。何故ならば、
氷結晶の形成はこの手順の相間にも生じ得るからであ
る。更に、適当な温度並びにタイミングに関しての注意
を払わないと、冷凍保護剤の成分の有害性によつて生育
可能な細胞の数が低減してしまい、又、血管に亀裂を生
じて実際的に使用不能な部片にしてしまうことになる。

以下の特定の例は、本発明の方法を血管に関する調
達、極低温とする迄の冷凍、及び解凍に応用した場合と
して示している。この例は当業者には自明であり、本発
明がここに示した特定の例に限定されるものではないこ
とが認識されよう。

例１ 切開は無菌状態の「非接触」技術を採用して行われ
た。血管及び外膜は、手順の進行を通じて、灌流媒体
（DMEM、10％の胎児腓結晶及びパパベリン0.12mg/ml）
に液浴される。この媒体はまた、25ミリモルのヘペス緩
衝剤、グルタミン、1000mgのＤグルコース/L、及びpH7.
3±0.5のピルビン酸塩ナトリウム（GIBCO Lab.Cat.＃38
0-2320）の添加剤を有している。外膜の切除に続いて、
後側の静脈切開が行われ、止め栓組立体が挿入されて所
定位置に結紮される。この血管は灌流媒体によつて静か
に灌流処理された。その二枚的血管が確認され、主なる
血管から約１〜2mmにて結紮される。

血管が完全に切り取られる前に、支持台装置10の手術
トラツク14が先端側の止め栓組立体22及び基端側の止め
栓組立体18に取付けられる。切取りが完了されると、基
端側の止め栓は閉じられ、血管は約100mmHgとなる迄灌
流媒体によつて灌流処理される。この後、先端側の止め
栓が閉じられて血管を膨張状態に保持するようになす。
灌流溶液が残つている血管がプラスチツク筒及び２重の
殺菌包装のなされたような発送容器の中に置かれる。こ
の移送用箱は通常はスチロフオームで作られており、血
管を収容する筒は約４℃の氷水の中に置かれる。しかる
後、施設へ速く配送するために一般に特急便サービスが
利用される。何故ならば、活かしておくためには血管は
ドナーの心臓脈動停止から約24時間以内に到着しなけれ
ばならないからである。

手術を行う施設に到着したならば、血管は氷が今も存
在していることを確認するために適当なパツケージ包装
がなされていたかを検査される。清浄室内に滅菌場が形
成されて血管を検査され、処理段階が完了される。この
処理段階での最初は、検査をして無関係な組織を除去す
ることである。二次的な支脈の全ての検査が行われ、漏
れがなかつたならば、支持台に手術されたこの血管は抗
生物質による殺菌の準備が行われる。

殺菌 血管を予防的に殺菌するために、以下の重要な手順が
参照されるべきである。

1. イミペネム（12μg/ml）がDMEMの溶液中に与えられ
る。これは組織培養媒体である。

2. アンコバン（抗真菌性薬物）（50μm/ml）もその溶
液に添加される。

3. 血管はその溶液中で灌流され且つ液浴され、４時間
にわたつて37℃の保温器の中に置かれる。

冷凍保護剤の滴定に引き続いて、血管は極低温の冷凍
保存に於ける酷寒に耐えることのできる袋内に包装され
る。通常は、幾つかの連続した層による包装が使用さ
れ、血管を収容した内側パツケージの滅菌保存を行うよ
うになされる。最終的に、血管は冷凍保存の準備が達成
されるのである。

冷凍媒体は、濃いDMEM＋10％の胎児腓血清＋0.12mg/m
lのパパベリン＋2.5％のコンドロイチン硫酸＋１モルの
DMSO或いはその他の適当な保護剤によつて構成されてい
る。

冷凍過程の詳細 本発明に於いて静脈及び動脈の冷凍保存に使用される
冷凍スケジユールは、75〜85mlの流体体積とともに2.5c
m×25cmの円筒形の形状に包装した組織を適当な冷凍装
置（クリオメツド モデル＃1010（990C）のような装
置）の中に配置することを含んでいる。ここに与えられ
た温度は大体の値であり、或る程度の自由度が機械や機
器の相違を考慮して与えられるべきである。室の初期温
度は10℃に設定される。この室は、サンプルが＋４℃に
到達する迄は0.01℃／分の冷却速度で冷却されるように
設定される。この時点で、組織は0.3±0.2℃／分の速度
で冷却されるようになれ、サンプルが−２℃となる迄継
続される。−２℃に達した時点で、相変化が始まる。こ
の時点で、融解熱の発生に備えて、室が−70℃に達する
迄冷却速度は−30℃に高められる。室が−70℃に到達し
た直後に、この室は−60℃になる迄20℃／分の速度で温
められ、−60℃になるとその温度が17分間にわたつて保
持される。この間、血管の実際の冷却速度は約0.5±0.2
℃／分である。この17分が経過した時点で、室は再び−
30℃のレベルに達する迄10℃／分の速度で温められる。
この−30℃のレベルが１分間持続され、しかる後にこの
室はサンプルが−20℃に達する迄0.01℃／分の冷却速度
は約0.5±0.2℃／分である。最終的な冷却速度の調整段
階はサンプルが−65℃又はそれ以下の温度に達する迄0.
5±0.2℃／分での冷却を持続させる。この冷却過程の結
果、その最初から最後迄の冷却速度は約0.5±0.2℃／分
である。この冷却速度が静脈組織にとつて最適であつ
た。静脈を収容したパツケージが室から取り出され、−
196℃の保存用の液体窒素の冷凍装置の中に置かれる。

血管が移植の施設から要請される迄は、その組織は液
体窒素の冷凍装置の中に収容されているのである。

発送 冷凍された血管は上述したような方法で適当な容器に
入れて発送される。

解凍 解凍並びに希釈の手順は以下のようにして実施され
る。即ち、 1.滅菌場の中で且つ全て殺菌された部材を使用して、37
℃〜42℃に温められた少なくとも2lの滅菌水をトレー器
材或いはその他の容器に溜めて、支持されている組織の
全長部分を受け入れるようにする。

2.包装された血管を保護用の厚紙製の箱から取り出し、
その水浴槽の中に置く。この包装体は、約８分間にわた
つて手で或いは自動的に攪拌されるか、或いは包装体を
軽く触診してもはや氷結晶が存在しないような状態にな
る迄、その浴槽内に置いたままにすべきである。

3.氷結晶が存在しないと一度判定されたならば、この包
装体を浴槽から取り出し、２つのノツチの間の面積部分
に於いて外側の箔包装を注意深く拭いて乾燥状態とな
し、挾みを使用してそれらのノツチの間で箔包装を切断
する。箔の袋から内側の清潔な袋を取り出すには殺菌し
た鉗子が使用される。又、殺菌した挾みを使用して内側
の袋を切断する手順を繰り返す。

4.支持されている血管を注意深く取り出して清潔な殺菌
されているトレー器材或いはその他の適当な容器の中に
置き、そこでもつて希釈段階の最初の段階が行われる。
注射器を使用して50ccの溶液（壜Ａ）が血管に与えられ
た。

この溶液は、 0.5モルのマンニトール、 10％の胎児腓結晶、及び DMEM、 を含有している。血管はこの溶液によつて優しく灌流処
理され、洗い落とされた物質はトレー内に残され、これ
により血管が５分間にわたつて浸漬される。マンニトー
ルの代わりに、何れかの非浸透性の生体融和性の糖、例
えば限定するわけではないが蔗糖、ソルビトール、トレ
ハロース、グルコース等の糖で代用することができる。
DMSO濃度の希釈は段階的に行われ、先行する段階でのモ
ル濃度の半分以下の段階的減少としなければならない。
従つて、最初のDMSO濃度が１モルであるとするならば、
最初の希釈段階は1/2モル濃度の糖、次は1/2モル濃度の
糖、最終的に０モル濃度の糖となされるのである。

5.段階4.が完了した時点で、トレー内の溶液は他の適当
な容器内にあけられ、トレーの中に次の薬剤が添加され
て混合される。即ち、 段階4.で使用した壜Ａに残つている溶液50ccに、50cc
の溶液（壜Ｂ）を加えた溶液が添加されて混合される。
壜Ｂの溶液は、 10％の胎児腓結晶、及び DMED、 を含有している。この混合液はこの時点でマンニトール
が0.25モル濃度となる。注射器を使用してこの混合液で
血管を優しく灌流し、約５分間にわたつてその溶液中で
血管を液浴する。

6.段階5.の完了した時点で、トレー内の溶液が再び廃棄
され、壜Ｂ内に残つている溶液をトレーにあける。血管
を優しく灌流し、約５分間にわたつてその溶液中で揺す
られる。

7.このようにして血管は移植の容易がなされた。しかし
意図して使用される迄は、支持台から取り外してはなら
ない。

第４図は、85ml（１モルのDMSO＋DMEM）のサンプルに
基づいた典型的な解凍曲線を示しており、これは静脈の
20cm部片を42℃の5lの水の中に配置して収容しており、
パツケージはその血管が解凍する迄１分間につき２回程
各15秒間だけ攪拌された。この水浴槽は解凍手順の進行
にともなつて冷却されるがままにした。解凍速度は約25
℃／分であつた。典型的な解凍時間は約８分であつた。

組織移植 ここに説明した方法で保存された血管は冠動脈又は末
梢血管再構成のための動脈の代わりとして使用すること
が意図された。従つて、移植用組織は抗原性の組織であ
るので、幾つかの注意事項及び推奨事項が示唆される。
即ち、 1.ドナー／移植受け入れ人の血液群は相容性がなければ
ならない。

2.抗血小板療法の手術後の治療は限定するわけではない
がデイピリダモール又はアスピリンを含むことができ
る。

3.限定するわけではないがシクロスポリン、プレドニソ
ロン及びアザチオプリンを含む小用量で短期有効な免疫
抑制剤が移植部片に対する拒否反応を最少限に抑えるの
に使用される。

上述した技術を利用することによつて、血小板の沈着
が抑制され、これにより血栓発生の可能性が少なくな
り、結局のところ開在状態が少なくされるのである。免
疫抑制剤の保温のような免疫学的な作用を少なくするた
めにその他の方式の血管の下準備を行うことも考えられ
る。

血管内皮細胞が保護される主張を支持するための研究 内皮細胞層は牛の分枝糸内皮（BFA-1C）とされた。こ
れらの細胞は塑性組織の培養基質に取り付いた状態で本
来の状態で冷凍保存された。生育力はアクリジンオレン
ジ及びプロピジウム沃化物、染料封入／排除の効力検定
の組み合わせを使用して判定された。ジメチルスルホキ
シドがその他のテストされた冷凍保護剤よりも優れた効
力を有することが見出された。これらのテストされた冷
凍保護剤には、グリセロール、ヒドロキシエチルスター
チ及びポリビニルプロリドンが含まれる。ゆるやかな冷
却速度と組み合わせて使用される場合には、１モル濃度
のDMSOが最適であると判定された。第III表を参照され
たい。

0.5℃／分に於いては、内皮細胞の70％以上が生き残
る。これを10℃／分もしくはそれ以上の冷却速度の場合
と比較すると、20％以下の細胞しか生き残らないのであ
る。第IV表を参照されたい。

先の実験は、実際の伏在静脈を使用するとともに、既に
説明したDMSOの準備並びに滴定に関するプロトコルに沿
つて、繰り返して行われた。本質的には、DMSOはそれぞ
れ４℃にて10分間の３回の段階で添加され、濃度が1/4
モル濃度、1/2モル濃度そして１モル濃度となるように
なされた。このDMSOは、25ミリモルのHEPES緩衝剤と10
％の胎児腓血清とを含有するDMEMと混合された。冷凍速
度は0.5℃／分又は３℃／分から変化された。この実験
では0.5℃／分の冷却機速度の方が、それより速い３℃
／分の冷却速度の場合よりも内皮の一体性の比率が高く
なる結果を示している。第Ｖ表を参照されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マックナリイ，ロバート，ティー アメリカ合衆国30068 ジョージア州, マリエッタ，カールスゲイト ドライブ 4693 (72)発明者 ヒーコックス，アルバート アメリカ合衆国30066 ジョージア州, マリエッタ，アーバー リッジ ドライ ブ 4349 (72)発明者 ブロックバンク，ケルビン，ジー．，エ ム. アメリカ合衆国30064 ジョージア州, マリエッタ，ダブリュ．ハンプトン ド ライブ 3544 (72)発明者 マックア，キャメロン アメリカ合衆国30067 ジョージア州, マリエッタ，ナンバー 165，テレル ミル ロード 1550 (72)発明者 バンク，ハーベイ，エル. アメリカ合衆国29407 サウスカロライ ナ州，チャールストン，ウインチェスタ ー ドライブ 1315

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】冷凍保護に有効な濃度の細胞浸透冷凍保護
   剤と、冷凍保護に有効な濃度のグリコスアミノグリカン
   とを含む組織保護溶液と、組織保護溶液内に保存される
   血管部分とを備える、組織保護構造。
2. 【請求項２】冷凍保存中に血管内の内皮細胞を保護する
   方法であり、 冷凍保護に有効な濃度の細胞浸透冷凍保護剤と、冷凍保
   護に有効な濃度のグリコスアミノグリカンとを含む、組
   織保護溶液に、血管を接触させる段階と、 血管と接触する組織保護溶液の温度を、−100℃より低
   い温度に保持しておく段階と、を有する方法。
3. 【請求項３】グリコスアミノグリカンはコンドロイチン
   硫酸である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】細胞浸透冷凍保護剤はジメチルスルホキシ
   ドである、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】冷凍室内に血管を置く段階と、 約−２℃まで、血管を適当な速度で冷却する段階と、 適当な速度での相変化の後、血管を冷却する段階と、 冷凍室から血管を取り出す段階と、 約−196℃の温度の液体窒素冷凍機内に血管を収容する
   段階とを、冷凍経過として有する、請求項２に記載の方
   法。
6. 【請求項６】冷却速度は、約0.1〜100℃／分である、請
   求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】冷凍室内に血管を置く段階と、 冷凍室を、約−10℃の初期温度から、約0.01℃／分の速
   度で、血管が約＋４℃になるまで、冷却していく段階
   と、 その後、冷凍室を、約0.3℃／分の速度で、血管が約−
   ２℃にまるまで、冷却していく段階と、 その後、冷凍室を、約30℃／分の速度で、冷凍室が約−
   70℃になるまで、冷却していく段階と、 その後、冷凍室を、約20℃／分の速度で、冷凍室が約−
   60℃になるまで、温める段階と、 その後、冷凍室を、約−60℃で、17分間保持する段階
   と、 その後、冷凍室を、約10℃／分の速度で、冷凍室が約−
   30℃になるまで、温める段階と、 その後、冷凍室を、約−30℃で、１分間保持する段階
   と、 その後、冷凍室を、約0.01℃／分の速度で、血管が約−
   20℃になるまで、冷却する段階と、 その後、冷凍室を約0.5℃／分の速度で、血管が約−65
   ℃になるまで、冷却する段階と、 冷凍室から血管を取り出す段階と、 約−196℃の温度の液体窒素冷凍機内に血管を収容する
   段階とを、冷凍経過として有する、請求項５に記載の方
   法。
8. 【請求項８】ドナーから切り取られた血管部分内に挿入
   される端部をそれぞれ有する、第一と第二の細長いスタ
   イレットと、 スタイレットを血管内に係合させて、スタイレットと血
   管との間の液密な係合を形成させる装置と、 互いに対して調整可能に向き合った状態でスタイレット
   を収容し、血管をスタイレット間で膨張させて血管の収
   縮を防止しつつ、血管を支持する支持装置と、 冷凍保護に有効な濃度の細胞浸透冷凍保護剤と、冷凍保
   護に有効な濃度のグリコスアミノグリカンとを含む組織
   保護溶液と、を含む、血管保持装置。
9. 【請求項９】ドナーから切り取られた血管部分内に挿入
   される端部をそれぞれ有し、血管内に通じる流体通路を
   備える、第一と第二の細長いスタイレットと、 スタイレットを血管内に係合させて、スタイレットと血
   管との間の液密な係合を形成させる装置と、 互いに対して調整可能に向き合った状態でスタイレット
   を収容し、血管をスタイレット間で膨張させて血管の収
   縮を防止しつつ、血管を支持する支持装置とを有し、支
   持装置は、 細長いトラックと、 トラック上に配置される第一と第二のスタイレット支持
   部材であり、少なくても一つのスタイレット支持部材は
   トラックに移動可能に取り付けられ、スタイレット支持
   部材の間の間隔が調節される、スタイレット支持部材
   と、 対応するスタイレット支持部材上でスタイレットを着脱
   可能に受け止める装置と、 スタイレットに組付けられ、流体通路を開閉して、血管
   内への流体連通を制御する弁とを有する、冷凍保存用血
   管支持台。