JP2639221B2 - Sugar production method - Google Patents
Sugar production methodInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖
等の定まった糖鎖長の糖類を単品で高純度に得る製造法
に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing saccharides having a fixed sugar chain length such as glucose, maltose, maltooligosaccharide and the like in a single product with high purity.
背景技術 特定糖鎖長の糖類を単品で高純度に得る方法として
は、これまで、澱粉等のグルカンを単独又は2種以上の
適当なアミラーゼ類で分解し、これを公知の様々なカラ
ムクロマトグラフィー等によって他の目的としないオリ
ゴ糖や単糖から分離するか(例えば、澱粉科学ハンドブ
ック,p452,1987、特開昭57−209000号公報、特開昭62−
19210号公報、特公平2−17158号公報)、又はそれを更
に結晶化に導いて、他の微量に混在している目的としな
いオリゴ糖や単糖から分離する方法(例えば、澱粉科学
ハンドブック,p456,1987)等が知られている。BACKGROUND ART As a method for obtaining a saccharide having a specific sugar chain length in a single product with high purity, a glucan such as starch is decomposed with a single or two or more kinds of appropriate amylases, and this is decomposed into various known column chromatography. For example, by separating them from oligosaccharides and monosaccharides not intended for other purposes (eg, Starch Science Handbook, p452, 1987, JP-A-57-209000, JP-A-62-9
No. 19210, Japanese Patent Publication No. 2-17158) or a method of further leading it to crystallization and separating it from other oligosaccharides or monosaccharides which are not contained in a trace amount and which are not intended (for example, Handbook of Starch Science, p456, 1987).
しかしながら、上記いずれの方法もグルコースや未切
断のデキストリン、その他目的としないオリゴ糖の副生
を本質的に伴い、これら目的としない糖類を、反応系か
ら除くことは実質的にできなかった。However, any of the above methods essentially involves the production of glucose, uncleaved dextrin, and other undesired oligosaccharides, and it has been virtually impossible to remove these undesired saccharides from the reaction system.
また、微量の目的としない糖類を共存は、目的とする
特定糖鎖長の糖類の結晶化を著しく妨げることが判って
いた。It has also been found that the coexistence of a trace amount of a non-target saccharide significantly prevents crystallization of the target saccharide having a specific sugar chain length.
更に、上記公知の方法によって、できる限り高純度の
オリゴ糖を得ようとすると、製造工程が複雑になり、収
率面やコスト面で問題があった。Furthermore, if an attempt is made to obtain an oligosaccharide having as high a purity as possible by the above-mentioned known method, the production process becomes complicated, and there are problems in terms of yield and cost.
発明の開示 従って、本発明者らは、糖類の公知製造法には改善の
余地が多分にあると考え、特に医薬用に適した目的とし
ない糖類を実質的に含まないグルコース、マルトース、
マルトオリゴ糖等の特定糖鎖長の糖類のみを単品で製造
する方法の構築を試みた。DISCLOSURE OF THE INVENTION Accordingly, the present inventors believe that there is likely to be room for improvement in known methods for producing saccharides, particularly glucose, maltose, substantially free of unintended saccharides that are not suitable for pharmaceutical use.
An attempt was made to construct a method for producing only a saccharide having a specific sugar chain length, such as maltooligosaccharide, as a single product.
本発明の要旨は、以下の一連の操作を連続して行うこ
とにある。The gist of the present invention is to continuously perform the following series of operations.
即ち、目的とする特定糖鎖長の糖類に対し実質的に分
離可能な物質(以下「分離可能物質」という)に、糖鎖
転移酵素により直接又は中間体を介して他の糖鎖供給源
から糖鎖を転移させ、得られたオリゴ糖に、オリゴ糖に
対して特定の長さの糖鎖をエキソ型に切り出す酵素(以
下「エキソ型切断酵素」という)を作用させて目的とす
る特定の糖鎖長の糖類を単離するという方法である。That is, a substance capable of being substantially separated from a target saccharide having a specific sugar chain length (hereinafter, referred to as a “separable substance”) is directly or via an intermediate from another sugar chain source by a glycosyltransferase. The sugar chain is transferred, and the resulting oligosaccharide is subjected to an enzyme (hereinafter referred to as "exo-type cleavage enzyme") that cuts a sugar chain of a specific length into an exo-type with respect to the oligosaccharide, thereby causing a specific specific target to be obtained. This is a method of isolating a sugar having a sugar chain length.
本発明を以下に詳述する。 The present invention is described in detail below.
本発明で用いる分離可能物質は、キトサンビーズ、イ
オン交換樹脂、合成高分子樹脂、若しくはその他固定化
担体として用いられている担体又は次の一般式〔I〕 (式中Rは、水素、低級アルキル、ヒドロキシアルキ
ル、フェニルアルキル、フェニルアルケニル、フェニル
アルキニル、フェノキシアルキル、フェノキシアルケニ
ル又はフェノキシアルキニルを示す。ここにおけるフェ
ニルには、置換されているものも含む。)で表される化
合物(以下「モラノリン類」という)、ノジリマイシ
ン、アミノシクリトール、アミノシクリトール誘導体若
しくはグルクロン酸又はこれらのグルコシル若しくはオ
リゴグリコシル体等のイオン交換樹脂に吸着可能な極性
を有する糖類(以下「極性糖」という)等である。担体
は、ビーズ状、膜状、繊維状等を問わない。モラノリン
類は、桑白皮や放線菌等より得ることができる(例え
ば、特願昭54−159417号、特願昭55−76838号、特公昭5
6−9919号公報、特願昭57−93997号、特公昭59−27337
号公報)。モラノリン類のグルコシル及びオリゴグルコ
シル体は、既に開示されている方法によって製造するこ
とができる(例えば、アグリカルチュラル アンド バ
イオロジカル ケミストリー、49,2159(1985))。ア
ミノシクリトールは、バリダマイシン類等から得る方法
が開示されており(例えば、特願昭55−128157号)、ま
た、市販のバリダマイシン製剤から調製できる。The separable substance used in the present invention is chitosan beads, an ion exchange resin, a synthetic polymer resin, or a carrier used as an immobilized carrier or the following general formula [I] (Wherein R represents hydrogen, lower alkyl, hydroxyalkyl, phenylalkyl, phenylalkenyl, phenylalkynyl, phenoxyalkyl, phenoxyalkenyl, or phenoxyalkynyl, where phenyl includes substituted ones). The compounds represented by the formula (hereinafter referred to as "moranolines"), nojirimycin, aminocyclitol, aminocyclitol derivative or glucuronic acid, or saccharides having polarities which can be adsorbed to ion exchange resins such as glucosyl or oligoglycosyl (hereinafter referred to as "moranolines") "Polar sugar"). The carrier may be in the form of beads, a film, a fiber, or the like. Moranolins can be obtained from mulberry bark, actinomycetes, and the like (for example, Japanese Patent Application Nos. 54-159417, 55-76838, and 5-5).
No. 6-9919, Japanese Patent Application No. 57-93997, Japanese Patent Publication No. 59-27337
No.). Glucosyl and oligoglucosyl forms of moranolines can be produced by the methods already disclosed (eg, Agricultural and Biological Chemistry, 49 , 2159 (1985)). A method for obtaining aminocyclitol from validamycins is disclosed (for example, Japanese Patent Application No. 55-128157), and aminocyclitol can be prepared from a commercially available validamycin preparation.
末端にグルコシル又は極性糖等、糖鎖転移酵素により
糖鎖を転移されうる残基を有しない担体に糖鎖を転移さ
せるためには、前もって担体に、糖鎖転移酵素により糖
鎖を転移されうる残基を有する中間体を、直接又はスペ
ーサーを介して結合させておく必要がある。ここに、中
間体としては、極性糖、グルコース等の単糖、マルトー
ス、マルトトリオース等のオリゴ糖等を挙げることがで
きる。担体に中間体を結合させるためには、例えば、ア
ミノ基を末端に持つスペーサーを結合させたキトサンビ
ーズの担体に、中間体としてのマルトースを水素化シア
ノホウ素ナトリウム(NaBH3CN)のような還元剤で結合
させる方法等を挙げることができる。ここに、スペーサ
ーとしては、オキシラン、グルタルアルデヒド(GLA)
等、固定化技術に用いられるモノファンクショナル及び
バイファンクショナルな物質を挙げることができる。In order to transfer a sugar chain to a carrier having no residue capable of transferring a sugar chain by a sugar chain transferase such as glucosyl or a polar sugar at the terminal, the sugar chain can be transferred to the carrier in advance by a sugar chain transferase. It is necessary that the intermediate having the residue is bound directly or via a spacer. Here, examples of the intermediate include polar sugars, monosaccharides such as glucose, and oligosaccharides such as maltose and maltotriose. In order to bind the intermediate to the carrier, for example, maltose as an intermediate is reduced to a carrier such as sodium cyanoborohydride (NaBH 3 CN) on a chitosan bead carrier to which a spacer having an amino group at the terminal is bound. And the like. Here, as the spacer, oxirane, glutaraldehyde (GLA)
And monofunctional and bifunctional substances used in the immobilization technique.
他の糖鎖供給源から糖鎖を転移させるために用いる糖
鎖転移酵素としては、例えば、サイクロデキストリング
リコシルトランスフェラーゼ(CGTase)、α−アミラー
ゼ等を挙げることができる。Glycosyltransferases used to transfer sugar chains from other sugar chain sources include, for example, cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase), α-amylase and the like.
CGTaseは、これまでいくつかの種類の菌株からの生産
が報告されており、例えば、バチルス・マセランス、バ
チルス・メガテリウム、バチリス・サーキュランス、好
アルカリバチルス、耐熱性バチルス等からの生産が報告
されている。それぞれ生産されるサイクロデキストリン
類は各々特徴を持っているが、本発明に用いるCGTase
は、これらどの型のCGTaseであっても充分にその目的を
果たすことができる。また、酵素以外にもある種の菌株
は、直接糖転移生成物を形成することが知られているが
(例えば、日本農芸化学会大会講演要旨集,4N−2,昭和5
6年3月10日発行)、そのようなものでも本発明に係る
糖鎖転移酵素としての目的を果たすことができる。CGTase has been reported to be produced from several strains, for example, Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus circulans, alkalophilic Bacillus, production from heat-resistant Bacillus, etc. I have. Each cyclodextrin produced has its own characteristics, but the CGTase used in the present invention
Can adequately serve its purpose with any of these types of CGTases. It is also known that some strains other than enzymes directly form glycosyltransfer products (for example, Japanese Society of Agricultural Chemistry, 4N-2, Showa 5).
(Issued March 10, 2006), which can also serve the purpose of the glycosyltransferase of the present invention.
糖鎖転移反応におけるpH、反応温度は、用いる糖鎖転
移酵素によってそれぞれ若干異なるが、例えば、CGTase
を用いる場合、pHは4.0〜11.5の範囲、好ましくはpH5.5
〜10.5の範囲が適当であり、反応温度は、20〜85℃の範
囲、好ましくは45〜65℃の範囲が適当である。糖鎖転移
反応に要する時間は、CGTaseを転移酵素として用いた場
合、pH、反応温度、酵素濃度、糖鎖供給源の濃度によっ
てもかなり異なるが、通常、数時間〜4日間である。CG
Taseの使用量は、糖鎖転移酵素により糖鎖を転移されう
る残基にできる限り多くの糖鎖を転移させることが好ま
しいので、糖鎖供給源の澱粉系多糖に対して酵素の割合
は多い程良好な結果が得られる。具体的には、用いる糖
鎖供給源の澱粉系多糖、pH、反応時間により異なるが、
およそ澱粉系多糖1g当たり500〜5000単位(B.V法)、好
ましくは1000〜2000単位が適当である。The pH and reaction temperature in the transglycosylation reaction are slightly different depending on the glycosyltransferase used, for example, CGTase
Is used, the pH is in the range of 4.0 to 11.5, preferably pH 5.5.
The reaction temperature is suitably in the range of 20 to 85 ° C, preferably in the range of 45 to 65 ° C. When CGTase is used as a transferase, the time required for the sugar chain transfer reaction varies considerably depending on the pH, the reaction temperature, the enzyme concentration, and the concentration of the sugar chain source, but is usually several hours to 4 days. CG
It is preferable that the amount of Tase used is to transfer as many sugar chains as possible to the residues to which sugar chains can be transferred by the sugar chain transferase, so that the ratio of the enzyme to the starch-based polysaccharide of the sugar chain source is large. Better results are obtained. Specifically, it depends on the starch polysaccharide of the sugar chain source used, pH, and reaction time,
A suitable amount is about 500 to 5,000 units (BV method), preferably 1,000 to 2,000 units, per gram of the starch-based polysaccharide.
ここに、糖鎖供給源としては、澱粉、澱粉系糖質又は
サイクロデキストリン等を挙げることができる。澱粉
は、市場に流通している商業用澱粉のいずれでも用いる
ことができる。また、澱粉系糖質としては、各種デキス
トリン、アミロース、アミロペクチンのような中間加水
分解物又は高重合度、中程度若しくは低重合度のものい
ずれでも用いることができる。澱粉系多糖の濃度は、製
造上の要請に応じた作用時間、転移酵素量によって異な
るが、5〜60%、好ましくは10〜20%が適当である。デ
キストリンであれば30〜50%までが実用的である。ただ
し、澱粉を糖鎖供給源として高濃度で用いる場合、その
粘度は著しく高くなるので、糖鎖転移反応を行う前に、
澱粉をCGTaseやα−アミラーゼ等で液化しておくのが一
般的である。また、添加する澱粉系多糖の利用率を高め
るためには、転移酵素量に対して澱粉系多糖の相対的添
加量を少し低い濃度にすることが好ましく、例えば、澱
粉系多糖1g当たり糖鎖転移酵素量2000〜3000単位が好ま
しい。Here, examples of the sugar chain supply source include starch, starch-based saccharide, cyclodextrin, and the like. As the starch, any commercial starch that is commercially available can be used. As the starch-based saccharide, any of various intermediate hydrolysates such as dextrin, amylose and amylopectin, or those having a high, medium or low degree of polymerization can be used. The concentration of the starch-based polysaccharide varies depending on the action time and the amount of transferase according to the requirements in production, but is suitably 5 to 60%, preferably 10 to 20%. For dextrins, up to 30-50% is practical. However, when starch is used at a high concentration as a sugar chain source, its viscosity becomes extremely high.
Generally, starch is liquefied with CGTase, α-amylase or the like. Further, in order to increase the utilization rate of the starch-based polysaccharide to be added, it is preferable that the relative amount of the starch-based polysaccharide is slightly lower than the amount of the transferase, for example, the sugar chain transfer per 1 g of the starch-based polysaccharide. An enzyme amount of 2000-3000 units is preferred.
分離可能物質として極性糖を用いる場合、その濃度
は、例えば、モラノリンの場合、15%程度まで上げるこ
とができる。しかし、糖鎖供給源のモラノリンに対する
重量比は、2〜20倍程度が効果的である。When a polar sugar is used as the separable substance, its concentration can be increased to, for example, about 15% in the case of moranoline. However, it is effective that the weight ratio of the sugar chain source to moranolin is about 2 to 20 times.
分離可能物質として担体を用いた場合は、糖鎖転移反
応終了後、通常、糖鎖が延長された担体を充分に洗浄す
る。また、洗浄後、例えば、100℃、5分間加熱して残
存の糖鎖転移酵素を失活させ、更に充分に洗浄すること
もできる。用いた糖鎖転移酵素は、限界濾過(以下「U
F」という)法等で容易に回収することができる。When a carrier is used as a separable substance, the sugar chain-extended carrier is usually sufficiently washed after the completion of the sugar chain transfer reaction. Further, after washing, for example, heating at 100 ° C. for 5 minutes to inactivate the remaining glycosyltransferases, and further sufficient washing can be performed. The glycosyltransferase used was ultrafiltration (hereinafter "U
F ”)) method.
分離可能物質として極性糖を用いた場合は、糖鎖転移
反応終了後、極性糖及びその糖にグルコースオリゴマー
が転移したものをイオン交換樹脂に吸着させる。この場
合も用いた糖鎖転移酵素は、UF法等によって容易に回収
することができるので、糖鎖転移酵素を回収しない場合
は反応液をそのまま、回収する場合はUF膜処理後、濾過
液を適当なイオン交換樹脂にかける。ここに、イオン交
換樹脂としては、ダウエックス50W−X2(登録商標)、
ダイヤイオンSA−11A(登録商標)、アンバーライトIR
−120(登録商標)等を挙げることができ、極性糖の極
性によって適宜選択する。イオン交換樹脂の量は、反応
に用いる極性糖の量により増減しなければならないこと
は言うまでもない。また、極性糖及びその糖にグルコー
スオリゴマーが転移したものをイオン交換樹脂に吸着
後、通常、充分に洗浄する。そして、洗浄後、これらを
イオン交換樹脂から溶出させるのが一般的であり、例え
ば、1Nのアンモニア水等で溶出させる。When a polar sugar is used as the separable substance, after the sugar chain transfer reaction is completed, the polar sugar and the glucose oligomer transferred to the sugar are adsorbed to the ion exchange resin. In this case as well, the glycosyltransferase used can be easily recovered by the UF method or the like.If the glycosyltransferase is not recovered, the reaction solution is directly used. Apply to a suitable ion exchange resin. Here, as the ion exchange resin, Dowex 50W-X2 (registered trademark),
Diaion SA-11A (registered trademark), Amberlite IR
-120 (registered trademark) and the like, which are appropriately selected depending on the polarity of the polar sugar. It goes without saying that the amount of the ion exchange resin must be increased or decreased depending on the amount of the polar sugar used in the reaction. In addition, after the polar saccharide and the glucose oligomer transferred to the saccharide are adsorbed on the ion exchange resin, they are usually sufficiently washed. After washing, these are generally eluted from the ion-exchange resin, for example, eluted with 1N ammonia water or the like.
続いて、エキソ型切断酵素に適したpHにおいて、エキ
ソ型切断酵素を、通常、反応温度30〜55℃で数時間〜2
日間作用させるが、エキソ型切断酵素としては、グルコ
アミラーゼ、β−アミラーゼ、マルトオリゴ糖生成酵素
等を挙げることができる。例えば、マルトースを製造す
る場合、β−アミラーゼを用いることができるが、用い
るβ−アミラーゼに適したpH4.5〜6.0、例えば、pH4.8
に反応液を調整し、β−アミラーゼを反応液に入れ、反
応温度30〜60℃の間で1〜2日間反応させるのが適当で
ある。エキソ型切断酵素の添加量は、用いるエキソ型切
断酵素や分離可能物質の種類にもよるが、分離可能物質
が担体の場合、担体1ml当たり20〜100単位を加えれば、
工業上1日の作業時間内に切断を終えることができる。Subsequently, at a pH suitable for the exo-type cleavage enzyme, the exo-type cleavage enzyme is usually treated at a reaction temperature of 30 to 55 ° C. for several hours to 2 hours.
The exo-type cleavage enzyme includes glucoamylase, β-amylase, maltooligosaccharide-forming enzyme and the like. For example, when producing maltose, β-amylase can be used, but pH 4.5 to 6.0 suitable for the β-amylase to be used, for example, pH 4.8
It is appropriate to adjust the reaction solution, add β-amylase to the reaction solution, and react at a reaction temperature of 30 to 60 ° C. for 1 to 2 days. The amount of the exo-type cleavage enzyme to be added depends on the type of the exo-type cleavage enzyme and the separable substance to be used, but when the separable substance is a carrier, if 20 to 100 units are added per 1 ml of the carrier,
Cutting can be completed within one working day of industry.
分離可能物質として極性糖を用い、先の操作でイオン
交換樹脂から溶出させた場合、エキソ型切断酵素を作用
後、そのまま、又は適当なUF膜法等の分離方法によりエ
キソ型切断酵素を分離し、再度、用いた極性糖を吸着す
るイオン交換樹脂にかけることによって、実質的に目的
とする特定糖鎖長の糖類のみを単離することができる。
樹脂量は、主として仕込んだ極性糖の量により増減する
必要がある。When polar sugar is used as the separable substance and eluted from the ion-exchange resin in the previous operation, the exo-type cleavage enzyme is separated as it is after the action of the exo-type cleavage enzyme or by a separation method such as an appropriate UF membrane method. By applying the polar sugar again to an ion-exchange resin that adsorbs the used polar sugar, it is possible to substantially isolate only the target saccharide having a specific sugar chain length.
The amount of resin needs to be increased or decreased mainly depending on the amount of polar sugar charged.
分離可能物質として極性糖を用い、先の操作でイオン
交換樹脂から溶出させないままエキソ型切断酵素を作用
させた場合、又は分離可能物質として担体を用いた場合
は、エキソ型切断酵素を作用後、濾過やUF膜法等の適当
な分離方法により、エキソ型切断酵素を分離することに
よって、実質的に目的とする特定糖鎖長の糖類のみを単
離することができる。When a polar saccharide is used as the separable substance and the exo-type cleavage enzyme is allowed to act without being eluted from the ion exchange resin in the previous operation, or when a carrier is used as the separable substance, after the exo-type cleavage enzyme is acted on, By separating the exo-type cleavage enzyme by a suitable separation method such as filtration or a UF membrane method, it is possible to substantially isolate only the target saccharide having a specific sugar chain length.
上記のようにして分離されたエキソ型切断酵素は、再
利用することもできる。The exo-type cleavage enzyme isolated as described above can be reused.
最終的に得られた液を濃縮するには、ロータリーエバ
ポレーターによる減圧濃縮法、逆浸透圧(RO)膜法等、
汎用されている濃縮手段により行うことができる。Concentration of the final solution can be achieved by vacuum evaporation using a rotary evaporator, reverse osmosis (RO) membrane method, etc.
It can be carried out by a commonly used concentration means.
分離可能物質として極性糖を用いた場合、糖鎖転移酵
素及びエキソ型切断酵素は、溶液状で用いることもきる
が、汎用されている公知の固定化酵素を製造する方法で
調製した固定化酵素の型で反応させることもできる。特
に、粗酵素を用いる場合には、固定化酵素を用いること
は夾雑物を少なくでき、精製工程上有利である。When a polar sugar is used as the separable substance, the glycosyltransferase and the exo-type cleavage enzyme can be used in the form of a solution, but the immobilized enzyme prepared by a method for producing a widely used known immobilized enzyme is used. The reaction can also be carried out in the form of In particular, when a crude enzyme is used, using an immobilized enzyme can reduce impurities and is advantageous in the purification step.
本発明に係る製造法によって製造されるマルトースの
反応を図式化すると次のようになる。The reaction of maltose produced by the production method according to the present invention is schematically shown as follows.
(式中、Aは分離可能物質を、Gはグルコースを、Bは
β−アミラーゼを、それぞれ表す。ただし、すべてのA
は、同一とは限らない。▼は、β−アミラーゼの切断箇
所を示す。) 上式のように、β−アミラーゼは、その性質上、二糖
又は三糖を切断せずに残す(上式の場合、G−G、A−
G及びA−G−G)。従って、溶液状であり中性糖であ
るマルトース(G−G)のみを、固形状又は極性糖であ
るその他(A、A−G及びA−G−G)のものから、濾
過又はイオン交換樹脂等により、容易に単離することが
できる。 (In the formula, A represents a separable substance, G represents glucose, and B represents β-amylase.
Are not necessarily the same. ▼ indicates a cleavage site of β-amylase. ) As in the above formula, β-amylase leaves a disaccharide or trisaccharide without cleavage due to its properties (in the case of the above formula, GG, A-
G and AGG). Therefore, only maltose (GG), which is a solution and a neutral sugar, is separated from solid or polar sugars (A, AG and AGG) by filtration or ion exchange resin. Can be easily isolated.
そして、マルトースを分離後、糖鎖転移酵素は、再び
その他の残渣の上に糖鎖を延長でき、結局、糖鎖転移反
応、切断反応、分離を繰り返すことにより、連続的なマ
ルトースの生産が可能となる。Then, after separating maltose, glycosyltransferase can extend sugar chains on other residues again, and ultimately, continuous maltose production can be achieved by repeating transglycosylation, cleavage, and separation. Becomes
以上より、本発明に係る製造法は、連続性を兼ね備え
た、実質的に目的とする特定糖鎖長の糖類のみを単品で
得ることができる新規且つ画期的な製造法であるという
ことができる。また、本発明によれば、特定糖鎖長の糖
類のみが得られるという利点だけでなく、従来法と比較
して製造工程が非常に簡易的であり、経費、労力等を大
幅に節減することができ、収率も充分に高め得る。From the above, it can be said that the production method according to the present invention is a novel and revolutionary production method having continuity and capable of substantially obtaining only a saccharide having a specific target sugar chain length as a single product. it can. Further, according to the present invention, not only the advantage that only a saccharide having a specific sugar chain length can be obtained, but also the production process is extremely simple as compared with the conventional method, and the cost, labor, and the like are significantly reduced. And the yield can be sufficiently increased.
本発明の製造法で得られる糖類、例えば、マルトース
は、特に高純度が要求される医薬用に有用であり、その
使用形態としては、点滴剤等を挙げることができる。ま
た、当然に食品用としても用いることができる。マルト
トリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオース等は、診断薬等として用いるこ
とができる。更に、マルトースを還元して製造される甘
味剤のマルチトールの結晶化は、原料のマルトースが純
粋なもの程良好であるので、本発明の製造法で製造され
るマルトースは、この点に対しても非常に有効である。The saccharides obtained by the production method of the present invention, for example, maltose are particularly useful for pharmaceuticals requiring high purity, and examples of the form of use include instillation. It can also be used for food. Maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose and the like can be used as diagnostic agents and the like. Further, the crystallization of maltitol, which is a sweetener produced by reducing maltose, is better as the raw material maltose is pure, so that maltose produced by the production method of the present invention has the following disadvantages. Is also very effective.
本発明に係る糖類を医薬用として適用する例として
は、例えば、輸液等を挙げることができる。輸液に適用
する場合に、例えばマルトースはその10%溶液が等張で
あり、等量のグルコースの2倍のエネルギー価を有する
こと等から、グルコース等よりも有益であることが知ら
れており(「麻酔と蘇生」20巻 3号 163頁。1984
年)、同様に等張のマルトトリオース15%溶液はグルコ
ースの3倍のエネルギー価を有して有効性が更に高い。
本発明に係る糖類を医薬用に適用する場合には、例え
ば、以下の組成のものを適用することができるが、一般
的には、糖(マルトトリオース、マルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース等)を単独
で、又はグルコース若しくはマルトースと同時に含有さ
せ、適宜塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウ
ム等の無機塩を含有させることができる。Examples of applying the saccharide according to the present invention for medical use include, for example, infusion. When applied to infusion, for example, maltose is known to be more beneficial than glucose or the like because its 10% solution is isotonic and has twice the energy value of an equivalent amount of glucose ( "Anesthesia and Resuscitation," Vol. 20, No. 3, page 163. 1984
Similarly, a 15% solution of isotonic maltotriose is also more effective, having an energy value three times that of glucose.
When the saccharide according to the present invention is applied for medical use, for example, those having the following composition can be applied, but generally, saccharides (maltotriose, maltotetraose,
Maltopentaose, maltohexaose, etc.) alone or simultaneously with glucose or maltose, and may appropriately contain an inorganic salt such as sodium chloride, potassium chloride or sodium acetate.
(輸液組成例) マルトトリオース 15g、塩化カリウム 0.03g、塩化
カルシウム 0.02g、塩化ナトリウム 0.6g、乳酸ナト
リウム 0.31gを混合し、輸液 100mlの組成とする。(Example of infusion composition) 15 g of maltotriose, 0.03 g of potassium chloride, 0.02 g of calcium chloride, 0.6 g of sodium chloride and 0.31 g of sodium lactate are mixed to make a composition of 100 ml of infusion.
発明を実施するための最良の形態 次に、本発明を参考例及び実施例により、更に詳細且
つ具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
ない。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference examples and examples, but the present invention is not limited to these examples.
参考例1 固定化CGTaseビーズの調製 まず、バチルス・マセランスCGTase(コンチザイム、
天野製薬社製)200mlを0.01M酢酸緩衝液(pH6.0)に対
して透析した。別に、キトパール BCW−3010(登録商
標、富士紡績社製、以下同じ。)50mlを2.5%グルタル
アルデヒドを含む0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)で24時間室
温で穏やかに振盪した後、充分に水洗した。そして、こ
の活性化されたキトパールに上記の透析内液を遠心分離
した上清を加えて4℃で16時間穏やかに振盪しながら酵
素の結合をさせた後、充分に水洗した。これによって、
23.8mg蛋白質/mlビーズの本固定化酵素を得た。Reference Example 1 Preparation of immobilized CGTase beads First, Bacillus macerans CGTase (Contizyme,
200 ml (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) was dialyzed against a 0.01 M acetate buffer (pH 6.0). Separately, 50 ml of Chitopearl BCW-3010 (registered trademark, manufactured by Fuji Spinning Co., Ltd., the same applies hereinafter) was gently shaken at room temperature for 24 hours in 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) containing 2.5% glutaraldehyde, and then sufficiently shaken. Washed with water. Then, the supernatant obtained by centrifuging the above inner solution of dialysis was added to the activated chitopearl, and after binding the enzyme while gently shaking at 4 ° C. for 16 hours, the plate was thoroughly washed with water. by this,
The immobilized enzyme of 23.8 mg protein / ml beads was obtained.
参考例2 固定化β−アミラーゼの調製 まず、さつまいも由来のβ−アミラーゼ(シグマ社
製、硫安懸濁液)4,8mlを0.01M酢酸緩衝液(pH5.0)に
対して透析した。別に、キトパールBCW−3010 10mlを2.
5%グルタルアルデヒドを含む0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)
で24時間室温で穏やかに振盪した後、充分に水洗した。
そして、この活性化されたキトパールに上記の透析内液
を遠心分離した上清を加えて4℃で16時間穏やかに振盪
しながら酵素の結合をさせた後、充分に水洗した。これ
によって、6.44mg蛋白質/mlビーズの本固定化酵素を得
た。Reference Example 2 Preparation of Immobilized β-Amylase First, 4.8 ml of sweet potato-derived β-amylase (manufactured by Sigma, ammonium sulfate suspension) was dialyzed against 0.01 M acetate buffer (pH 5.0). Separately, 10 ml of Chitopearl BCW-3010 2.
0.1M acetate buffer (pH 5.0) containing 5% glutaraldehyde
Gently at room temperature for 24 hours, followed by thorough washing with water.
Then, the supernatant obtained by centrifuging the above inner solution of dialysis was added to the activated chitopearl, and after binding the enzyme while gently shaking at 4 ° C. for 16 hours, the plate was thoroughly washed with water. This yielded 6.44 mg protein / ml beads of the immobilized enzyme.
参考例3 キトサンビーズにマルトースを結合させた担
体の調製 キトサンビーズとしてキトパールBCW−3010 5mlとマ
ルトース1.8gをメタノール/水=1/1の混合溶媒20mlに
加え、マルトースを溶解した後、水素化シアノホウ素ナ
トリウムを加えて酢酸にてpHを3〜4に合わせ、3日間
反応させた。そして、ビーズを濾過した後、充分水洗し
て本担体を得た。Reference Example 3 Preparation of carrier having maltose bound to chitosan beads 5 ml of chitopearl BCW-3010 and 1.8 g of maltose as chitosan beads were added to 20 ml of a mixed solvent of methanol / water = 1/1, and maltose was dissolved. Sodium boron was added, the pH was adjusted to 3 to 4 with acetic acid, and the mixture was reacted for 3 days. After filtering the beads, the beads were sufficiently washed with water to obtain the present carrier.
参考例4 固定化グルコアミラーゼの調製 グルコアミラーゼ「グルクザイムNL−3」(天野製薬
社製)35lにイオン交換水35lを加え希釈し、UF法で精製
して得られた酵素濃縮液をカラムに充填したキトパール
BCW−3010 33lに導入し、吸着させた。即ち、この酵素
液が、最終的に0.05M酢酸緩衝液(pH5.0)56lに含まれ
るようにした液を8℃で24時間循環させることにより吸
着させ、その後、0.05M酢酸緩衝液(pH5.0)15lで洗浄
し、2.5%グルタルアルデヒドを含む0.05M酢酸緩衝液
(pH5.0)120lをカラムに循環させて固定化を完了し
た。余分のグルタルアルデヒドは、550lの水を通すこと
により除去した。これによって、24.4mg蛋白質/mlビー
ズの本固定化酵素を得た。Reference Example 4 Preparation of immobilized glucoamylase 35 g of glucoamylase "Gluczyme NL-3" (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) was diluted with 35 l of ion-exchanged water, and the column was filled with an enzyme concentrate obtained by purification by the UF method. Quito Pearl
It was introduced into 33 l of BCW-3010 and adsorbed. That is, this enzyme solution was adsorbed by circulating a solution finally contained in 56 liters of 0.05 M acetate buffer (pH 5.0) at 8 ° C. for 24 hours, and then a 0.05 M acetate buffer (pH 5) was added. .0) was washed with 15 l, and immobilization was completed by circulating 120 l of 0.05 M acetate buffer (pH 5.0) containing 2.5% glutaraldehyde through the column. Excess glutaraldehyde was removed by passing 550 l of water. This yielded 24.4 mg protein / ml beads of the present immobilized enzyme.
実施例1 50ml三角フラスコにモラノリン、N−メチルモラノリ
ン、N−ベンジルモラノリン、N−ヒドロキシエチルモ
ラノリン、N−ブチルモラノリン及びグルコシルモラノ
リンをそれぞれ300mgとり、これらに各々可溶性澱粉120
0mgを加え、水10mlに加温溶解させ、参考例1の方法で
調製した固定化CGTaseビーズ5mlを加え、40℃で3日間
振盪し転移反応を行わせた。そして、これら各々の反応
液から3mlとり、10mlの強酸性イオン交換樹脂ダウエッ
クス50W−X2にかけ、充分水洗して1Nアンモニア水60ml
で溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。
この糖鎖転移物の重量を表1に示し、それぞれのTLC
(キーゼルゲル60F254、メルク社製;展開溶媒:n−プロ
パノール/アンモニア水/水=6/2/1、発色剤:10%硫酸
のエタノール溶液を噴霧後、火炎上で加熱、以下同
じ。)を図1に示した。Example 1 A 50 ml Erlenmeyer flask was charged with 300 mg each of moranolin, N-methyl moranoline, N-benzyl moranoline, N-hydroxyethyl moranoline, N-butyl moranoline, and glucosyl moranoline, each of which contained soluble starch 120 mg.
0 mg was added, and the mixture was heated and dissolved in 10 ml of water, and 5 ml of the immobilized CGTase beads prepared by the method of Reference Example 1 was added. The mixture was shaken at 40 ° C. for 3 days to perform a transfer reaction. Then, 3 ml of each of these reaction solutions was taken, applied to 10 ml of strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2, washed sufficiently with water and 60 ml of 1N aqueous ammonia.
And concentrated to dryness with a rotary evaporator.
The weight of this transglycosylation is shown in Table 1, and the TLC
(Kieselgel 60F 254, Merck; eluent: n-propanol / aqueous ammonia / water = 6/2/1, coloring agent: After spraying 10% ethanol solution of sulfuric acid, heated on a flame, the same hereinafter.) The As shown in FIG.
次に、糖鎖転移物を50mg/mlになるように水に溶解さ
せ、2N塩酸でpHを5〜6に合わせ、これに参考例2の方
法で調製した固定化β−アミラーゼを200粒加え、37℃
で5時間反応させた。このβ−アミラーゼ反応液のTLC
を図2に示した。Next, the transglycosylated product was dissolved in water so as to have a concentration of 50 mg / ml, the pH was adjusted to 5 to 6 with 2N hydrochloric acid, and 200 particles of the immobilized β-amylase prepared by the method of Reference Example 2 were added thereto. , 37 ℃
For 5 hours. TLC of this β-amylase reaction solution
Is shown in FIG.
図2からそれぞれマルトースを生成していることは明
らかである。It is clear from FIG. 2 that maltose was generated.
続いて、それぞれのβ−アミラーゼ反応液を10mlの強
酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W−X2にかけ、通過
液を2Nカセイソーダで中和後、ロータリーエバポレータ
ーで濃縮乾固した。得られたそれぞれのマルトース重量
は、表1に示した。Subsequently, each of the β-amylase reaction solutions was applied to 10 ml of strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2, and the passed solution was neutralized with 2N sodium hydroxide solution and concentrated to dryness with a rotary evaporator. The obtained maltose weights are shown in Table 1.
また、これらのマルトース画分のTLCは、図3に示し
た。 The TLC of these maltose fractions is shown in FIG.
図3からマルトースのみ生産されていることが明らか
である。It is apparent from FIG. 3 that only maltose is produced.
実施例2 50ml三角フラスコにバリダミン60mgと可溶性澱粉1200
mgを入れ、10mlの水を加え加温溶解させ、これに参考例
1の方法で調製した固定化CGTaseビーズ5mlを加え、40
℃で3日間振盪し転移反応を行わせた。そして、この反
応液から3mlとり、10mlの強酸性イオン交換樹脂ダウエ
ックス50W−X2にかけ、充分水洗して1Nアンモニア水60m
lで溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し
た。この糖鎖転移物の重量は、274mgであり、糖鎖転移
物のTLCは図4に示した。Example 2 In a 50 ml Erlenmeyer flask, 60 mg validinamine and 1200 soluble starch were used.
of the CGTase beads prepared by the method of Reference Example 1 and added thereto.
The mixture was shaken at 3 ° C. for 3 days to carry out a transfer reaction. Then, take 3 ml from this reaction solution, apply to 10 ml of strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2, wash thoroughly with 1N ammonia water 60m
The mixture was eluted with l and concentrated to dryness on a rotary evaporator. The weight of the transglycosylated product was 274 mg, and the TLC of the transglycosylated product is shown in FIG.
次に、この糖鎖転移物に水5.5mlを加え、2N塩酸でpH
を5〜6に合わせ、これに参考例2の方法で調製した固
定化β−アミラーゼを200粒加え、37℃で5時間反応さ
せた。このβ−アミラーゼ反応液のTLCを図5に示し
た。Next, 5.5 ml of water was added to the transglycosylated product, and the pH was adjusted with 2N hydrochloric acid.
Was adjusted to 5 to 6, and 200 particles of the immobilized β-amylase prepared by the method of Reference Example 2 were added thereto and reacted at 37 ° C. for 5 hours. The TLC of this β-amylase reaction solution is shown in FIG.
図5からマルトースを生成していることは明らかであ
る。It is clear from FIG. 5 that maltose was generated.
続いて、このβ−アミラーゼ反応液を10mlの強酸性イ
オン交換樹脂ダウエックス50W−X2にかけ、通過液を2N
カセイソーダで中和後、ロータリーエバポレーターで濃
縮乾固した。得られたマルトース重量は、113mgであっ
た。また、このマルトース画分のTLCは、図6に示し
た。Subsequently, the β-amylase reaction solution was applied to 10 ml of strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2, and the passing solution was 2N.
After neutralization with caustic soda, the mixture was concentrated to dryness using a rotary evaporator. The resulting maltose weight was 113 mg. The TLC of this maltose fraction is shown in FIG.
図6からマルトースのみ生産されていることが明らか
である。It is apparent from FIG. 6 that only maltose is produced.
実施例3 ねじ口試験官にN−(1,3−ジヒドロキシ−2−プロ
ピル)バリオールアミン60mgと酵素デキストリン「アミ
コール」(登録商標、日本澱粉社製)240mg、更に、CGT
ase「コンチザイム」(天野製薬社製)1mgを加え、計2m
lになるように水を加えて50℃で48時間振盪しながら転
移反応させた。反応液全体を約10mlの強酸性イオン交換
樹脂ダウエックス50W−X2に通して充分水洗し、1Nアン
モニア水60mlで溶出し、画分をロータリーエバポレータ
ーで濃縮乾固した。得られた糖鎖転移物の重量は、118.
6mgであった。Example 3 N- (1,3-dihydroxy-2-propyl) valiolamine 60 mg, enzyme dextrin "Amicol" (registered trademark, manufactured by Nippon Starch) 240 mg, and CGT
Add 1mg of ase “Contizyme” (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), and add 2m
Then, water was added to the mixture, and the mixture was subjected to a transfer reaction while shaking at 50 ° C. for 48 hours. The whole reaction solution was thoroughly washed with water through about 10 ml of strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2, eluted with 60 ml of 1N aqueous ammonia, and the fraction was concentrated to dryness with a rotary evaporator. The weight of the obtained transglycosylation product was 118.
It was 6 mg.
この糖鎖転移物に0.1M酢酸緩衝液(pH4.8)10mlを加
えて溶解させ、続いてβ−アミラーゼ(サツマイモ由
来、硫安懸濁液、生化学工業社製)100μlを加えて37
℃で16時間反応した。そして、このβ−アミラーゼ反応
液を10mlの強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W−X2
にかけ、素通り区分を洗液と共に2N水酸化ナトリウムで
中和し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固して129.
8mgのマルトースを得た。To this transglycosylation product, 10 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 4.8) was added to dissolve, followed by addition of 100 μl of β-amylase (derived from sweet potato, ammonium sulfate suspension, manufactured by Seikagaku Corporation), followed by addition of 37 μl.
The reaction was carried out at 16 ° C for 16 hours. Then, the β-amylase reaction solution was added to 10 ml of strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2.
Then, the flow-through section was neutralized with 2N sodium hydroxide together with the washing solution, and concentrated to dryness with a rotary evaporator to obtain 129.
8 mg of maltose were obtained.
実施例4 オリゴグルコシルモラノリン4.7gを水170mlに溶解
し、pH4.9に1N塩酸で調整した後、β−アミラーゼ(セ
ルバ(SERVA)社製、甘藷由来、848U/mg蛋白、3回再結
晶品、5mg/1ml)1mlを加え、37℃で20時間反応した。反
応液を強塩基性イオン交換樹脂ダイヤイオンSA−11A 30
mlを通過させ、充分イオン交換水で洗浄した。そして、
通過液と洗液を合わせて強酸性イオン交換樹脂ダウエッ
クス50W−X2 50mlを通過させ、充分イオン交換水で洗浄
した。続いて、通過液と洗液を合わせ濃縮乾固し粉末1.
4gを得た。Example 4 4.7 g of oligoglucosyl moranoline was dissolved in 170 ml of water, adjusted to pH 4.9 with 1N hydrochloric acid, and then β-amylase (manufactured by SERVA, derived from sweet potato, 848 U / mg protein, recrystallized three times) Product, 5 mg / 1 ml), and reacted at 37 ° C. for 20 hours. The reaction solution was treated with a strong basic ion exchange resin Diaion SA-11A 30.
Then, the mixture was passed through the plate and washed sufficiently with ion-exchanged water. And
The passing solution and the washing solution were combined, passed through 50 ml of strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2, and sufficiently washed with ion exchange water. Subsequently, the flow-through liquid and the washing liquid are combined and concentrated to dryness.
4 g were obtained.
これのマルトース含量は、高速液体クロマトグラフィ
ー(カラム:Nucleosil 5NH2、5μm、4mm i.d.×25;移
動層:アセトニトリル/水=70/30;検出:示差屈折計)
で分析した結果、98.3%であった。The maltose content was determined by high performance liquid chromatography (column: Nucleosil 5NH 2 , 5 μm, 4 mm id × 25; mobile phase: acetonitrile / water = 70/30; detection: differential refractometer)
As a result of the analysis, it was 98.3%.
実施例5 可溶性澱粉15gを水100mlに加温溶解した後、モラノリ
ン5gを溶解した。そして、水を加えて全容積を170mlと
して後、参考例1の方法で調製した固定化CGTaseビーズ
20mlを加えて55℃で42時間反応した。次いで、濾過して
固定化CGTaseビーズを除去し、水洗後、濾液と洗液を合
わせ、強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W−X2の50m
lを通過させた。これを充分水洗後、1Nアンモニア水で
溶出し、溶出液を凍結乾燥して粉末11.3gを得た。Example 5 15 g of soluble starch was dissolved in 100 ml of water by heating, and 5 g of moranoline was dissolved. Then, after adding water to make the total volume 170 ml, the immobilized CGTase beads prepared by the method of Reference Example 1 were used.
20 ml was added and reacted at 55 ° C. for 42 hours. Then, the immobilized CGTase beads were removed by filtration, and after washing with water, the filtrate and the washing liquid were combined, and 50 m of strong acid ion exchange resin Dowex 50W-X2 was used.
l passed. After washing with water, this was eluted with 1N aqueous ammonia, and the eluate was freeze-dried to obtain 11.3 g of a powder.
この粉末を水250mlに溶解し、2N塩酸でpHを5.0に調整
した後、参考例2の方法で調製した固定化β−アミラー
ゼ10mlを加えて37℃で3時間反応した。そして、この反
応液を濾過して固定化β−アミラーゼを除去し、水洗
後、濾液と洗液を合わせて強塩基性イオン交換樹脂ダイ
ヤイオンSA−11Aの30mlを通過させ、充分水洗した。続
いて、通過液と洗液を合わせ約20mlまで減圧下で濃縮
し、強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W−X2の100ml
を通過させた。軽く水洗後、通過液と洗液を合わせて凍
結乾燥し、マルトース粉末800mgを得た。This powder was dissolved in 250 ml of water, the pH was adjusted to 5.0 with 2N hydrochloric acid, and 10 ml of immobilized β-amylase prepared by the method of Reference Example 2 was added, followed by reaction at 37 ° C. for 3 hours. The reaction solution was filtered to remove the immobilized β-amylase. After washing with water, the filtrate and the washing solution were combined, passed through 30 ml of a strongly basic ion exchange resin DIAION SA-11A, and sufficiently washed with water. Subsequently, the combined passing solution and washing solution were concentrated under reduced pressure to about 20 ml, and 100 ml of the strongly acidic ion exchange resin Dowex 50W-X2 was added.
Passed through. After gently washing with water, the passing solution and the washing solution were combined and freeze-dried to obtain 800 mg of maltose powder.
本品のマルトース85mg/ml濃度のもの10μlを実施例
4と同様の高速液体クロマトグラフィー条件で分析した
結果、本品は、図7に示すように100%のマルトースで
あった。As a result of analyzing 10 μl of this product having a maltose concentration of 85 mg / ml under the same high performance liquid chromatography conditions as in Example 4, as shown in FIG. 7, this product was 100% maltose.
実施例6 参考例3で調製したマルトース結合キトパール5mlに
酵素デキストリン「アミコール」(登録商標、日澱化学
社製)3g、水10mlを加え、2N塩酸でpH6.0に調整した
後、CGTase(コンチザイム、天野製薬社製)5mlを加
え、50℃で24時間穏やかに振盪した。そして、担体ビー
ズを濾過した後、充分水洗し、100℃で5分間沸騰水中
で加温し、更に充分水洗した。Example 6 To 5 ml of maltose-bound chitopearl prepared in Reference Example 3 was added 3 g of the enzyme dextrin "Amicol" (registered trademark, manufactured by Nisse Chemical Co., Ltd.) and 10 ml of water. The mixture was adjusted to pH 6.0 with 2N hydrochloric acid, and then CGTase (contizyme) was added. (Manufactured by Amano Pharmaceutical Co.) was added, and the mixture was gently shaken at 50 ° C. for 24 hours. Then, the carrier beads were filtered, washed sufficiently with water, heated in boiling water at 100 ° C. for 5 minutes, and further thoroughly washed with water.
別に、コントロールとして、マルトース結合キトパー
ルの代わりに無処理のキトパールを同様に反応させた。Separately, as a control, untreated chitopearl was reacted similarly in place of maltose-bound chitopearl.
このようにして得られた担体ビーズ5mlに0.2M酢酸緩
衝液10mlを加え、これに、β−アミラーゼ(セルバ(SB
RVA)社製)50μlを加えて37℃で穏やかに振盪した。10 ml of 0.2 M acetate buffer was added to 5 ml of the carrier beads thus obtained, and β-amylase (Selva (SB)
RVA) (50 μl) and gently shaken at 37 ° C.
経時的に反応液を500μlサンプリングし、3,5−ジニ
トロサリチル酸試薬1mlを加え、100℃で10分間沸騰水中
で加熱した後、水冷し、5mlの水を加えて535nmの吸光度
で遊離したマルトースを測定した。その結果を図8−A
に示した。Sample 500 μl of the reaction solution over time, add 1 ml of 3,5-dinitrosalicylic acid reagent, heat in boiling water at 100 ° C. for 10 minutes, cool with water, add 5 ml of water and remove maltose released at 535 nm absorbance. It was measured. The result is shown in FIG.
It was shown to.
無処理のキトパールと比較して、マルトース結合処理
したキトパールの方が明らかにマルトースの遊離を示し
た。このβ−アミラーゼ処理後の上清を濃縮し、TLCで
確認したところ、マルトースのみ検出され、他の小糖類
の混在は認めなかった。Compared with untreated chitopearl, maltose-bound chitopearl clearly showed maltose release. The supernatant after the β-amylase treatment was concentrated and confirmed by TLC. As a result, only maltose was detected, and no other small sugars were mixed.
実施例7 50mlの三角フラスコに実施例6で用いたβ−アミラー
ゼ切断後のマルトース結合キトパールとコントロールの
キトパールを100℃で5分間加熱処理して充分に水洗し
たもの5mlと酵素デキストリン「アミコール」(登録商
標、日本澱粉社製)3g、水10ml、CGTase「コンチザイ
ム」(天野製薬社製)5mlを加えて、50℃で24時間振盪
しながら再度反応させた。そして、ビーズを濾過洗浄し
た後、100℃で5分間加熱処理して更に充分水洗した。Example 7 In a 50 ml Erlenmeyer flask, the maltose-bound chitopearl used in Example 6 after cleavage with β-amylase and the control chitopearl were heat-treated at 100 ° C for 5 minutes, washed thoroughly with 5 ml, and the enzyme dextrin “Amicol” ( 3 g of registered trademark (manufactured by Nippon Starch Co., Ltd.), 10 ml of water, and 5 ml of CGTase “Contizyme” (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) were added, and the reaction was performed again while shaking at 50 ° C. for 24 hours. Then, after the beads were filtered and washed, they were heated at 100 ° C. for 5 minutes and further sufficiently washed with water.
このビーズ5mlを0.2M酢酸緩衝液(pH4.8)10mlに加
え、更に、β−アミラーゼ(サツマイモ由来、硫安懸濁
液、生化学工業社製)50μlを加えて37℃でインキュベ
ートし、経時的に0.5mlをサンプリングして3,5−ジニト
ロサリチル酸試薬1mlを加え、100℃で5分間沸騰水中で
加熱した後、水冷し、5mlの水を加えて535mlの吸光度で
遊離したマルトースを測定し、吸光度の変化を図8−B
に示した。5 ml of these beads was added to 10 ml of 0.2 M acetate buffer (pH 4.8), and 50 μl of β-amylase (derived from sweet potato, ammonium sulfate suspension, manufactured by Seikagaku Corporation) was added and incubated at 37 ° C. 0.5 ml was sampled and added with 1,5-dinitrosalicylic acid reagent 1 ml, heated in boiling water at 100 ° C. for 5 minutes, cooled with water, added 5 ml of water and measured the released maltose at an absorbance of 535 ml, Fig. 8-B shows the change in absorbance.
It was shown to.
図8−Bから明らかなように、実施例6の第1回目の
反応と同様、コントロールと比較してマルトースの生成
が充分に認められた。As is clear from FIG. 8-B, similarly to the first reaction of Example 6, the formation of maltose was sufficiently recognized as compared with the control.
これにより、マルトース結合ビーズを用いても、マル
トースの製造が繰り返し行なえる。即ち、連続生産の可
能性が示唆された。Thus, the production of maltose can be repeated even when maltose-bound beads are used. That is, the possibility of continuous production was suggested.
実施例8 実施例1と同様にして得られたモラノリンの糖鎖転移
物149mgを3mlの水に溶解し、2N塩酸でpH5.0に合わせ、
参考例4により調製した固定化グルコアミラーゼビーズ
を200粒加え、40℃で4時間振盪してグルコースを遊離
させた。この反応液をダウエックス50W−X2 10mlにか
け、吸着されずに出てくる画分を2.5Nのカセイソーダで
中和した後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固する
ことによって、純粋なグルコース58.3mgを得た。Example 8 149 mg of a glycosyl transfer product of moranoline obtained in the same manner as in Example 1 was dissolved in 3 ml of water, and adjusted to pH 5.0 with 2N hydrochloric acid.
200 immobilized glucoamylase beads prepared in Reference Example 4 were added, and the mixture was shaken at 40 ° C. for 4 hours to release glucose. This reaction solution was applied to 10 ml of Dowex 50W-X2, and the fraction that appeared without being adsorbed was neutralized with 2.5N sodium hydroxide solution, and then concentrated and dried with a rotary evaporator to obtain 58.3 mg of pure glucose. .
図9にそのTLCを示した。 FIG. 9 shows the TLC.
実施例9 実施例1と同様にして得られたN−プロピルモラノリ
ンとN−ベンジルモラノリンの糖鎖転移物のそれぞれ1
2.5mgを250μlの水に溶解させ、2N塩酸でpH6.0に調製
し、これにストレプトミセス グリセウスNA−468(FER
M P−2227)より調製したマルトトリオース生成アミラ
ーゼ溶液250μl(95ユニット/0.25mgプロテイン;1ユニ
ットは1時間に1mgのマルトトリオースに相当する還元
糖を生成する酵素量)を加えて、40℃で2時間緩く振盪
してマルトトリオースを生成した。図10にこの反応液の
TLCを示した。Example 9 Each of N-propylmoranoline and a transglycosylation product of N-benzylmoranoline obtained in the same manner as in Example 1 was prepared.
2.5 mg was dissolved in 250 μl of water, adjusted to pH 6.0 with 2N hydrochloric acid, and added to Streptomyces griseus NA-468 (FER
250 μl of a maltotriose-forming amylase solution prepared from MP-2227) (95 units / 0.25 mg protein; 1 unit is an amount of an enzyme that produces a reducing sugar corresponding to 1 mg of maltotriose per hour), and then added at 40 ° C. For 2 hours to produce maltotriose. FIG. 10 shows the reaction mixture.
TLC was indicated.
更に、この反応液をダウエックス50W−X2にかけ、吸
着されずに出てくる画分を2.5Nのカセイソーダで中和し
た。図11にこのマルトトリオース画分のTLCを示した。Further, the reaction solution was applied to Dowex 50W-X2, and the fraction that appeared without being adsorbed was neutralized with 2.5N sodium hydroxide. FIG. 11 shows the TLC of this maltotriose fraction.
図11からマルトトリオースのみ生産されていることが
明らかである。From FIG. 11, it is clear that only maltotriose is produced.
なお、3,5−ジニトロサリチル酸法でマルトトリオー
スの標品を基準に定量したところ、それぞれ5.2mg、5.7
mgのマルトトリオースを確認した。In addition, when quantified based on the maltotriose standard by the 3,5-dinitrosalicylic acid method, 5.2 mg and 5.7 mg, respectively, were obtained.
mg of maltotriose was confirmed.
実施例10 実施例1と同様にして得られたN−プロピルモラノリ
ンとN−ベンジルモラノリンの糖鎖転移物のそれぞれ1
2.5mgにシュードモナス スタッツエリィ(Pseudomonas
stutzeri)IFO−3773株より調製したマルトテトラオー
ス生成アミラーゼ溶液250μl(26.25ユニット/0.24mg
プロテイン;1ユニットは1時間に1mgのマルトテトラオ
ースに相当する還元糖を生成する酵素量)を加えて、40
℃で2時間緩く振盪してマルトテトラオースを生成し
た。Example 10 N-propylmoranoline and N-benzylmolanoline glycosyl transfer product obtained in the same manner as in Example 1
2.5mg Pseudomonas Stats
stutzeri) 250 μl of a maltotetraose-forming amylase solution prepared from IFO-3773 strain (26.25 units / 0.24 mg)
Protein; 1 unit is an amount of an enzyme that produces a reducing sugar equivalent to 1 mg of maltotetraose per hour).
Shake gently at 2 ° C. for 2 hours to produce maltotetraose.
更に、この反応液をダウエックス50W−X2にかけ、吸
着されずに出てくる画分を得、このマルトテトラオース
画分の反応20分目のTLCを図12に示した。Further, this reaction solution was applied to Dowex 50W-X2 to obtain a fraction that was not adsorbed, and the TLC of the maltotetraose fraction at the 20th minute of the reaction is shown in FIG.
図12からマルトテトラオースのみ生産されていること
が明らかである。From FIG. 12, it is clear that only maltotetraose is produced.
なお、3,5−ジニトロサリチル酸法でマルトテトラオ
ースの標品を基準に定量したところ、それぞれ2.0mg、
1.6mgのマルトテトラオースを確認した。In addition, when quantified based on a maltotetraose standard by the 3,5-dinitrosalicylic acid method, 2.0 mg each,
1.6 mg of maltotetraose was confirmed.
実施例11 実施例1と同様にして得られたN−プロピルモラノリ
ンとN−ベンジルモラノリンの糖鎖転移物のそれぞれ1
2.5mgにシュードモナス エスピー(Pseudomonas sp.)
KO−8940(FERM P−7456)より調製したマルトペンタオ
ース生成アミラーゼ溶液250μl(10.13ユニット/1.85m
gプロテイン;1ユニットは1時間に1mgのマルトペンタオ
ースに相当する還元糖を生成する酵素量)を加えて、40
℃で2時間緩く振盪してマルトペンタオースを生成し
た。Example 11 N-propylmoranoline and N-benzylmolanoline glycosyl transfer product obtained in the same manner as in Example 1
2.5mg Pseudomonas sp.
250 μl of maltopentaose-forming amylase solution prepared from KO-8940 (FERM P-7456) (10.13 units / 1.85 m)
g protein; 1 unit is an amount of an enzyme that produces a reducing sugar equivalent to 1 mg of maltopentaose per hour).
Shake gently at 2 ° C. for 2 hours to produce maltopentaose.
更に、この反応液をダウエックス50W−X2にかけ、吸
着されずに出てくる画分を得、N−ベンジルモラノリン
からのマルトペンタオース画分の反応90分目のTLCを図1
3に示した。Further, this reaction solution was applied to Dowex 50W-X2 to obtain a fraction that was not adsorbed, and a TLC at the 90th minute of the reaction of the maltopentaose fraction from N-benzylmolanoline was shown in FIG.
3 is shown.
図13からマルトペンタオースのみ生産されていること
が明らかである。From FIG. 13, it is clear that only maltopentaose is produced.
なお、3,5−ジニトロサリチル酸法でマルトペンタオ
ースの標品を基準に定量したところ、それぞれ0.6mg、
0.8mgのマルトペンタオースを確認した。When quantified by the 3,5-dinitrosalicylic acid method based on a maltopentaose standard, 0.6 mg,
0.8 mg of maltopentaose was confirmed.
図面の簡単な説明 図1は、実施例1における糖鎖転移物のTLCである。
図中1はモラノリンの、2はN−メチルモラノリンの、
3はN−ベンジルモラノリンの、4はN−ヒドロキシエ
チルモラノリンの、5はN−ブチルモラノリンの、6は
グルコシルモラノリンの各糖鎖転移物を示し、a、b、
c、d、e、fはスタンダードとしての上記各モラノリ
ン類を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a TLC of a transglycosylated product in Example 1.
In the figure, 1 is for molanolin, 2 is for N-methylmoranoline,
3 is N-benzylmoranoline, 4 is N-hydroxyethylmoranoline, 5 is N-butylmoranoline, 6 is glucosylmoranoline, each of which is a sugar chain transfer product, and a, b,
c, d, e, and f represent the above moranolines as standards.
図2は、実施例1におけるβ−アミラーゼ反応液のTL
Cである。図中1、2、3、4、5、6は図1で説明し
ているものと同じである。Mはマルトースを示す。FIG. 2 shows the TL of the β-amylase reaction solution in Example 1.
C. 1, 2, 3, 4, 5, and 6 are the same as those described in FIG. M represents maltose.
図3は、実施例1におけるマルトース画分のTLCであ
る。図中1、2、3、4、5、6は図1で説明している
ものと同じである。Mはマルトースを示す。FIG. 3 is a TLC of the maltose fraction in Example 1. 1, 2, 3, 4, 5, and 6 are the same as those described in FIG. M represents maltose.
図4は、実施例2における糖鎖転移物のTLCである。
7はバリダミンの糖鎖転移物を、Baはバリダミンを、そ
れぞれ示す。FIG. 4 is a TLC of the transglycosylated product in Example 2.
7 indicates a transglycosylation product of validamin, and Ba indicates validamin.
図5は、実施例2におけるβ−アミラーゼ反応液のTL
Cである。FIG. 5 shows the TL of the β-amylase reaction solution in Example 2.
C.
7はバリダミンの糖鎖転移物を、Mはマルトースを、そ
れぞれ示す。7 indicates a glycosyl transfer product of validinamine, and M indicates maltose.
図6は、実施例2におけるマルトース画分のTLCであ
る。7はバリダミンの糖鎖転移物を、Mはマルトース
を、それぞれ示す。FIG. 6 is a TLC of the maltose fraction in Example 2. 7 indicates a glycosyl transfer product of validinamine, and M indicates maltose.
図7は、実施例5において得られたマルトース粉末の
高速液体クロマトグラムである。図中Aは溶媒のピーク
を、Bはマルトースのピークを、それぞれ示す。FIG. 7 is a high performance liquid chromatogram of the maltose powder obtained in Example 5. In the figure, A indicates the peak of the solvent, and B indicates the peak of maltose.
図8−Aは、実施例6における結果である。●は、マ
ルトース結合キトパールを用いた場合、○は、無処理の
キトパールを用いた場合を、それぞれ表す。縦軸は溶液
の吸光度を、横軸は時間(時間)を、それぞれ表す。FIG. 8-A shows the result in Example 6. ● indicates the case where maltose-bound chitopearl was used, and ○ indicates the case where untreated chitopearl was used. The vertical axis represents the absorbance of the solution, and the horizontal axis represents time (hour).
図8−Bは、実施例7における結果である。●は、マ
ルトース結合キトパールを用いた場合、○は、無処理の
キトパールを用いた場合を、それぞれ表す。縦軸は溶液
の吸光度を、横軸は時間(時間)を、それぞれ表す。FIG. 8-B shows the result in Example 7. ● indicates the case where maltose-bound chitopearl was used, and ○ indicates the case where untreated chitopearl was used. The vertical axis represents the absorbance of the solution, and the horizontal axis represents time (hour).
図9は、実施例8におけるグルコース画分のTLCであ
る。図中8は、グルコース画分を、Gはグルコースを、
それぞれ示す。FIG. 9 is a TLC of the glucose fraction in Example 8. In the figure, 8 is a glucose fraction, G is glucose,
Shown respectively.
図10は、実施例9におけるマルトトリオース生成アミ
ラーゼ反応液のTLCである。図中9はN−プロピルモラ
ノリンの、10はN−ベンジルモラノリンの各糖鎖転移物
を、Tはマルトトリオースを、それぞれ示す。FIG. 10 is a TLC of a maltotriose-forming amylase reaction solution in Example 9. In the figure, 9 indicates N-propylmoranoline, 10 indicates N-benzylmolanoline transfer product, and T indicates maltotriose.
図11は、実施例9におけるマルトトリオース画分のTL
Cである。図中9はN−プロピルモラノリンからのマル
トトリオース画分を、図中10はN−ベンジルモラノリン
からのマルトトリオース画分を、Tはマルトトリオース
を、それぞれ示す。FIG. 11 shows the TL of the maltotriose fraction in Example 9.
C. In the figure, 9 indicates a maltotriose fraction from N-propylmoranoline, 10 in the figure indicates a maltotriose fraction from N-benzylmoranoline, and T indicates maltotriose.
図12は、実施例10におけるマルトテトラオース画分の
TLCである。図中11はN−プロピルモラノリンからのマ
ルトテトラオース画分を、図中12はN−ベンジルモラノ
リンからのマルトテトラオース画分を、Teはマルトテト
ラオースを、それぞれ示す。FIG. 12 shows the maltotetraose fraction in Example 10.
TLC. In the figure, 11 indicates the maltotetraose fraction from N-propylmoranoline, 12 in the figure indicates the maltotetraose fraction from N-benzylmoranoline, and Te indicates maltotetraose.
図13は、実施例11におけるマルトペンタオース画分の
TLCである。図中13はN−ベンジルモラノリンからのマ
ルトペンタオース画分を、Peはマルトペンタオースを、
それぞれ示す。FIG. 13 shows the maltopentaose fraction in Example 11.
TLC. In the figure, 13 is a maltopentaose fraction from N-benzylmoranoline, Pe is maltopentaose,
Shown respectively.
Claims (2)
に分離可能な物質に、糖鎖転移酵素により直接又は中間
体を介して他の糖鎖供給源から糖鎖を転移させ、得られ
たオリゴ糖に、オリゴ糖に対して特定の長さの糖鎖をエ
キソ型に切り出す酵素を作用させて目的とする特定の糖
鎖長の糖類を単離することを特徴とする糖類の製造法。Claims: 1. A sugar chain is transferred from a different sugar chain source to a substance which can be substantially separated from a target sugar having a specific sugar chain length, directly or via an intermediate, by a sugar chain transferase; The obtained oligosaccharide is subjected to an enzyme that cuts a sugar chain of a specific length into an exo-form on the oligosaccharide to isolate a saccharide of a specific sugar chain length of interest. Manufacturing method.
に分離可能な物質が、担体又は次の一般式〔I〕 (式中Rは、水素、低級アルキル、ヒドロキシアルキ
ル、フェニルアルキル、フェニルアルケニル、フェニル
アルキニル、フェノキシアルキル、フェノキシアルケニ
ル又はフェノキシアルキニルを示す。ここにおけるフェ
ニルには、置換されているものも含む。) で表される化合物、ノジリマイシン、アミノシクリトー
ル、アミノシクリトール誘導体若しくはグルクロン酸又
はこれらのグルコシル若しくはオリゴグルコシル体であ
る請求項1記載の糖類の製造法。2. A substance which can be substantially separated from a target saccharide having a specific sugar chain length is a carrier or the following general formula [I]: (Wherein R represents hydrogen, lower alkyl, hydroxyalkyl, phenylalkyl, phenylalkenyl, phenylalkynyl, phenoxyalkyl, phenoxyalkenyl, or phenoxyalkynyl, where phenyl includes substituted ones). The method for producing a saccharide according to claim 1, which is a compound represented by the formula, nojirimycin, aminocyclitol, an aminocyclitol derivative, glucuronic acid, or a glucosyl or oligoglucosyl derivative thereof.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP51237791A JP2639221B2 (en) | 1990-07-26 | 1991-07-24 | Sugar production method |
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