JP2561122B2 - Functional polypeptide - Google Patents

Functional polypeptide


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    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]


【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、機能性ポリペプチド、特にヒトフイプロネクチン(以下、FN)と略記する)の機能性ポリペプチド、並びにそれらをコードする遺伝子、及びその遺伝子を用いた遺伝子工学的な製造方法に関する。 BACKGROUND OF THE INVENTION [FIELD OF THE INVENTION The present invention is a functional polypeptide, in particular human Hui Pro vitronectin (hereinafter, FN) functional polypeptide with abbreviated), and genes encoding them, and a genetic engineering manufacturing method using the gene.

〔従来の技術〕 [Prior art]

フイプロネクチンは、ヒト及び動物の血液や組織に広く分布する多機能糖タンパク質であり、細胞の接着、伸展、移動、分化、増殖、貪食などの生理作用に関与し、 Fuipuronekuchin is a multifunctional glycoprotein widely distributed in human and animal blood or tissues, and involved in cell adhesion, spreading, migration, differentiation, proliferation, physiological effects such as phagocytosis,
組織の構築と修復、血液凝固、生体防御などに重要な役割を果していることが知られている。 Repair and construction of tissue, blood coagulation, have been known to play an important role in such as a biological defense.

最近の分子生物学の進歩により、FNの全アミノ酸配列及び遺伝子構造が解明された〔ジ エムボ ジヤーナル(The EMBO Journal)第4巻、第1755〜1759頁(198 Recent advances in molecular biology, the entire amino acid sequence and gene structure of FN has been elucidated [di Emubo journals (The EMBO Journal) vol. 4, pp. 1755-1759 (198
5)〕。 Five)〕.

FNは、最大2327アミノ酸から成る分子量約25万のポリペプチドがC末端付近で2つのS−S結合で2量体を形成している。 FN is a polypeptide of molecular weight of about 250,000 consisting of maximum 2327 amino acids forms a dimer with two S-S bond in the vicinity of the C-terminus. 分子内アミノ酸配列はI型、II型、III型の繰返し構造を有し、更に、細胞、コラーゲン、ヘパリン及びフイブリン等に対する結合領域(ドメイン)がそれぞれ独立に存在する。 Intramolecular amino acid sequence types I, II, has a type III repeat structure, further, cells, collagen, binding regions to heparin and fibrin, etc. (domains) are present independently.

FNのこれらの機能は、産業上有用であり、例えば細胞接着機能は細胞培養基質のコーテイング剤、あるいは創傷治療剤として利用できる。 These features of the FN is industrially useful, for example, cell adhesion function can be used as a coating agent or a wound treating agent for cell culture substrates. またフイブリン結合能は、 The fibrin binding capacity,
血小板とフイブリンの結合を阻止することによる血液凝固阻止剤としての用途が考えられる。 Applications are considered as an anticoagulant by preventing the binding of platelets and fibrin. 逆に、細胞接着活性とフイブリン結合活性の両方の機能を持つペプチドは、血小板とフイブリンの結合を促進し、創傷治療効果を高める。 Conversely, peptides with both functions of the cell adhesion activity and fibrin binding activity will promote the binding of platelets and fibrin, enhancing wound healing effect. 更に、最近の知見から、FNのフイブリン結合ドメインがインスリン結合活性を有することが明らかにされ(第46回日本癌学会総会記事、第181頁)、細胞接着活性とインスリン結合活性の両方の機能を有するポリペプチドは、ドラツグデリバリーシステムとしての用途も考えられる。 Furthermore, recent findings, fibrin binding domain of FN is found to have an insulin binding activity (46th Meeting of the Japanese Cancer Association Meeting Article, pages 181), the function of both cell adhesion activity and insulin binding activity polypeptide having the conceivable applications as Dora suspender delivery system.

〔発明が解決しようとする課題〕 [Problems that the Invention is to Solve]

このように、FNはそれ自体あるいはその機能的断片として有用であるが、血液から採取するために、高価で採取量にも限界がある。 Thus, FN but is useful in itself or a functional fragment thereof, to be collected from the blood, there is a limit to the amount collected in expensive. また、ウイルス感染等の問題もあることから、その利用は大幅に制限されていた。 In addition, from the fact that there is a problem such as virus infection, its use has been severely limited.

更にFNから特定の機能を有する領域を取出す方法としては、酵素による限定分解あるいは、プロモシアン等による限界分解等が知られているが、いずれも操作が煩雑で収率も非常に低く実用的とは言い難い。 As a further method of extracting a region having a specific function from the FN is limited proteolysis by the enzyme or it limits decomposition, etc. are known by Promo cyan, etc., both operations complicated and yield is very low practical it is hard to say.

本発明の目的は、細胞接着活性とフイブリン結合活性を合せ持つ新規な機能性ポリペプチドを構築し、その遺伝子工学的な製造方法を提供することにある。 An object of the present invention is to construct a novel functional polypeptide which has combined cell adhesion activity and fibrin binding activity, and to provide a genetically engineered production method.

〔課題を解決するための手段〕 [Means for Solving the Problems]

本発明を概説すれば、本発明の第1の発明は機能性ポリペプチドに関する発明であつて、下記一般式I: A−B ……〔I〕 〔式中Aは、フイブロネクチンの細胞接着活性を有するペプチド残基で、Ala 1235 −Gln 1516 (282アミノ酸残基)又はIle 1410 −Gln 1516 (107アミノ酸残基)を示し、Bはフイブロネクチンのフイブリン結合ドメインペプチド残基で、Asn 2133 −Glu 2324 (192アミノ酸残基) If outlined present invention, shall apply in the invention relating to the first invention functional polypeptide of the present invention, the following general formula I: A-B ...... [I] [wherein A is a cell adhesion activity of fibronectin peptide residue having, Ala 1235 -Gln 1516 indicates (282 amino acid residues) or Ile 1410 -Gln 1516 (107 amino acid residues), B is a fibrin binding domain peptide residue of fibronectin, Asn 2133 -Glu 2324 ( 192 amino acid residues)
を示す〕で表されることを特徴とする。 Characterized by being represented by the shown].

本発明の第2の発明は、第1の発明の機能性ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。 The second aspect of the present invention relates to a gene encoding a functional polypeptide of the first invention.

また本発明の第3の発明は、上記第1の発明の機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を組込んだプラスミドに関する。 The third invention of the present invention relates to functional polypeptides plasmids incorporating a gene encoding the above first invention.

更に、本発明の第4の発明は、上記第1の発明の機能性ポリペプチドの製造方法に関する発明であつて、上記第3の発明のプラスミドを導入した宿主細胞を培養し、 Furthermore, a fourth aspect of the present invention, shall apply in the invention relates to a method for producing a functional polypeptide of the first aspect of the present invention, culturing the host cells transfected with the plasmid of the third aspect,
該培養物より目的とする機能性ポリペプチドを採取することを特徴とする。 And collecting the functional polypeptide of interest from the culture.

本発明者らは、FNの細胞接着活性ポリペプチドに関し、実質的にFNと同等の活性を有するポリペプチドの配列を明らかにし、その遺伝子工学的製造方法を開発して特許出願した(特願昭63−148号、及び同63−31820 The present inventors relates to cell adhesion active polypeptide of FN, revealed the sequence of a polypeptide having substantially the FN activity equivalent was patent to develop the genetic engineering manufacturing method (Japanese Patent Application No. Sho Nos. 63-148, and the same 63-31820
号)。 issue).

その後、更に研究を進め、細胞接着活性と他の機能を合せ持つ機能性ポリペプチドについて研究を重ねた結果、細胞接着活性ポリペプチドとフイブリン結合ドメインペプチドとのハイブリツドポリペプチドを遺伝子工学的に製造することに成功した。 Then, further researching, the results of extensive research for functional polypeptide having combined cell adhesion activity and other functions, to produce a hybrid every time polypeptide genetically engineered with cell adhesion active polypeptide and fibrin binding domain peptides in particular it was successful. このハイブリツドポリペプチドを単離して、その生物活性を調べた結果、細胞接着活性とフイブリン結合活性を合せ持つ多機能性ポリペプチドとしての生物活性を有することがわかつた。 The hybrid every time polypeptide isolated, as a result of investigating the biological activity, have a biological activity as multifunctional polypeptide having combined cell adhesion activity and fibrin binding activity divide. 本発明は以上の知見に基づいて完成された。 The present invention has been completed based on the above findings.

以下、本発明を具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described.

FNの細胞接着活性ポリペプチドとフイブリン結合ドメインペプチドとのハイブリツドペプチドを遺伝子工学的に調製する手段としては、細胞接着活性ポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミド及びフイブリン結合ドメインペプチドをコードするDNAを含むプラスミドから、それぞれ必要な断片を取出し、両DNA断片をつなぎ合せた後、適当な発現ベクターに読取りフレームが合うように接続することによつて達成される。 The hybrid each time the peptide with FN of cell adhesion active polypeptide and fibrin binding domain peptides as a means to prepare genetic engineering includes DNA encoding plasmids and fibrin-binding domain peptide comprising a DNA encoding a cell adhesion active polypeptide from a plasmid, taken out the necessary fragments respectively, after joining the two DNA fragments are by connexion achieved by connecting to read frame fits into an appropriate expression vector. 細胞接着活性ポリペプチドをコードするDNA断片は、既に種々の断片がクローン化されている(特願昭63−148号、及び同63 DNA fragment encoding the cell adhesion activity polypeptide is already cloned various fragments (Japanese Patent Application No. Sho 63-148, and the 63
−31820号)。 No. -31,820). これらのプラスミドから、必要な部分を切出すことができる。 From these plasmids, it can be cut out a necessary portion.

一方、フイブリンドメインをコードするDNA断片は、p On the other hand, DNA fragments coding for the fibrin domain, p
LF5、pLF3、pLF4及びpLF2のFNcDNA部分をつなぎ合せて構築されたpLF2435〔バイオケミストリー(Biochemistr LF5, pLF3, pLF4 and pLF2435 [Biochemistry constructed by joining the FNcDNA portion pLF2 (Biochemistr
y)第25巻、第4936−4941頁(1986)〕から必要な断片を切出すことによつて調製することができる。 y) Vol. 25, may be due connexion prepared to cut the required fragment from pp 4936-4941 (1986)].

細胞接着活性ポリペプチドとフイブリンドメインポリペプチドのハイブリツドペプチドをコードするDNA断片を適当な発現ペクターに接続し、大腸菌に導入することにより、ハイブリツドペプチドを大腸菌で発現させることができる。 Connect the DNA fragment encoding the hybrid each time the peptide of cell adhesion active polypeptide and fibrin domain polypeptide in a suitable expression Pekuta, by introducing into E. coli, can be expressed hybrid whenever peptide in E. coli. 発現ベクターとしては、既存のすべてのベクターを使用することができる。 Expression vectors, it is possible to use all of the existing vectors.

大腸菌によるハイブリツドペプチドの確認はイムノプロツテイングによつて調べられる。 Confirmation of hybrid each time the peptide by E. coli is examined Te cowpea in immuno-professional go-between queuing. 全菌体タンパク質を The whole-cell protein
SDS−PAGE(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分離した後、泳動パターンをニトロセルロースフイルターに移し取り、FNの細胞接着ダメインを認識するモノクローナル抗体とフイブリンドメインを認識するモノクローナル抗体の両方に反応するバンドを検出することができる。 After separation by SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) takes transferred electrophoresis pattern to a nitrocellulose filter, responsive to both the monoclonal antibody recognizing monoclonal antibody and fibrin domains recognizing cell adhesion Damein of FN it is possible to detect the band.

発現されたペプチドの精製には通常のクロマトグラフイーの技術が用いられる。 Typical chromatography technique is used for the purification of the expressed peptides. 例えば菌体ペレツトをバツフアーに懸濁し、超音波処理により可溶性画分を得る。 For example The cells were suspended Peretsuto the buffer were, obtain the soluble fraction by sonication. これを、イムノブロツテイングに用いた抗体を結合させたセフアロース4Bのカラムにかけ、アフイニテイ精製を行う。 This is applied to a column of Sepharose 4B conjugated with antibodies used for immunoblotting connexion queuing performs Afuinitei purification. イムノブロツテイングにより目的画分を集めることによつて、細胞接着活性とフイブリン結合活性の両方の機能を持つ機能性ポリペプチドを得ることができる。 It can be obtained Yotsute to collect the desired fraction by immunoblotting connexion queuing, a functional polypeptide having the function of both cell adhesion activity and fibrin binding activity. 必要とあれば、FPLC又はHPLCで更に精製することができる。 If necessary, it can be further purified by FPLC or HPLC.

このようにして得られた機能性ポリペプチドは、細胞接着活性、フイブリン結合活性及びインスリン結合活性等の生物活性の測定に用いる。 The thus obtained functional polypeptide is used to measure cell adhesion activity, fibrin binding activity and insulin binding activity, etc. of the biological activity.

細胞接着活性の測定には、NRK細胞を用い、例えば、 The measurement of cell adhesion activity using NRK cells, for example,
試料をバツフアーに溶かして、マイクロプレートに吸着させた後、NRK細胞を添加して37℃で一定時間インキユベートする。 By dissolving the samples in buffer were, after adsorption to microplates, a certain time Inkiyubeto by the addition of NRK cells 37 ° C.. 顕微鏡下で細胞の伸展を観察し、伸展の発現に必要な最少量を天然のFNと比較することにより細胞接着活性の強さを表わすことができる。 Observing the cell spreading under a microscope, the minimum amount necessary for the expression of extension can represent the intensity of the cell adhesion activity by comparing the native FN. フイブリン結合活性の測定にはフイブリンを結合させたセフアロース4B Sepharose 4B conjugated with fibrin to measure the fibrin binding activity
〔文献 トロムボシス リサーチ(Thrombosis Researc [Literature Toromuboshisu research (Thrombosis Researc
h)第2巻、第137−154頁(1973)〕を用いることができる。 h) Volume 2, it can be used pp 137-154 (1973)]. すなわち試料をフイブリン結合カラムに通した後、通過液のSDS−PAGEを行うことにより、フイブリン結合活性の有無を判定する。 That is, after passing through the sample to fibrin binding column by performing a SDS-PAGE of effluent, it determines the presence or absence of fibrin binding activity. インスリン結合活性は、イムノブロツテイングの手法に準拠して行うことができる。 Insulin binding activity can be performed in conformity with Method immunoblotting connexion Ing. すなわち、試料をSDS−PAGEで分離した後、ニトロセルロースフイルターに移し取り、酵素標識したインスリンを作用させる。 That is, after the samples were separated by SDS-PAGE, and taken up and transferred to nitrocellulose filters, the action of the enzyme-labeled insulin. フイルターを洗浄後、結合したインスリンを酵素活性により判定することができる。 After washing the filter, the bound insulin can be determined by enzyme activity.

このようにして、得られるペプチドの好適な例としては、FNの細胞接着活性を有するAla 1235 −Gln 1516 (282 In this way, suitable examples of the resulting peptide, Ala 1235 -Gln 1516 (282 having a cell adhesion activity of FN
アミノ酸残基ペプチド)又は、Ile 1410 −Gln 1516 (107 Amino acid residue peptides) or, Ile 1410 -Gln 1516 (107
アミノ酸残基ペプチド)と、フイブリン結合ドメインペプチドAsn 2133 −Glu 2324 (192アミノ酸残基)の結合したハイブリツドポリペプチドが挙げられる。 The amino acid residue peptide), and a bound hybrid each time polypeptide of fibrin binding domain peptides Asn 2133 -Glu 2324 (192 amino acid residues).

上記FNの細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は下記のとおりである: The amino acid sequence of a polypeptide having a cell adhesion activity of the FN are as follows: また、上記したFNのフイブリン結合ドメインペプチドのアミノ酸配列は下記のとおりである: The amino acid sequence of fibrin-binding domain peptide FN described above are as follows: 〔実例例〕 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。 [Illustrative Examples] Hereinafter, more specifically describes the invention based on examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例1 FNの細胞接着ドメインIle 1410 −Met 1517 (108アミノ酸残基)及びフイブリン結合ドメインAsn 2133 −Glu 2324 Example 1 FN cell binding domain Ile 1410 -Met 1517 (108 amino acid residues) and of fibrin binding domain Asn 2133 -Glu 2324
(192アミノ酸残基)をコードするcDNA断片のクローニング(第1図参照) 第1図は、本発明によるpTF1301構築の工程図である。 Cloning of cDNA fragment encoding (192 amino acid residues) (first see figure) Figure 1 is a process diagram of pTF1301 construction according to the invention.

(1−1)cDNA断片の調製 FNの細胞接着ドレインIle 1410 −Met 1517 (108アミノ酸残基)をコードするcDNA断片を含む7.8kbのブラスミドpTF201(特願昭63−148号)100μgを制限酵素XbaI用バツフアー、100ユニツトのXba I及び100ユニットのEco (1-1) Cell adhesion drain Ile 1410 -Met Preparation FN cDNA fragments 1517 of 7.8kb including cDNA fragment encoding (108 amino acid residues) Burasumido PTF201 (Japanese Patent Application Sho 63-148) limit 100μg enzyme XbaI for buffer were, of 100 Yunitsuto Xba I and 100 units of Eco
RIを含む100μlの反応液中、37℃、2時間インキユベートした。 The reaction solution of 100μl containing RI, 37 ° C., for 2 hours Inkiyubeto. 反応液をダイアジエン(DIAGEN)社製HPLCカラム、ニユクレオジエン(Nucleogen)DEAE−4000(6 The reaction Daiajien (DIAGEN) manufactured by HPLC column, Niyukureojien (Nucleogen) DEAE-4000 (6
×125mm)にかけ、0.41kb断片2μgを得た。 Subjected to × 125mm), to obtain a 0.41kb fragment 2μg. 次に、この断片を20ユニツトのFckIで37℃、1時間処理し、同様の精製法でXba I−Fck I断片(180bp)、Fok I−Fok I Next, 37 ° C. in FckI of this fragment 20 Yunitsuto, 1 hour and, Xba I-Fck I fragment in the same purification method (180bp), Fok I-Fok I
断片(203bp)をそれぞれ250ngずつ得た。 Fragment (203 bp), respectively were obtained by 250 ng.

一方、フイブリン配合ドメインAsn 2133 −Glu 2324 (19 On the other hand, fibrin formulation domain Asn 2133 -Glu 2324 (19
2アミノ酸残基)をコードするcDNA断片を含む5.9kbのプラスミドpLF2435〔バイオケミストリー第25巻、第4936 Plasmid pLF2435 [Biochemistry Vol. 25 of 5.9kb including cDNA fragment encoding the 2 amino acid residues), the 4936
〜4941頁(1986)〕100μgをHind III用バツフアー、1 Pp. ~4941 (1986)] 100μg the Hind III for the buffer were, 1
00ユニツトのHind III及び100ユニツトのHinc IIを含む Including the Hinc II of 00 Yunitsuto of Hind III and 100 Yunitsuto
100μlの反応液中、37℃、2時間インキユベートした。 The reaction solution of 100 [mu] l, 37 ° C., for 2 hours Inkiyubeto. これをアガロース電気泳動にかけ、1.2kbの断片を切出した(収量2μg)。 This was subjected to agarose electrophoresis, excised fragment of 1.2 kb (yield 2 [mu] g). この断片1μgをSau3A Iで3 This fragment 1μg in Sau3A I 3
7℃、1時間処理し、ニユクレオジエンDEAE−4000カラムにかけ、Hinc II−Sau3A I断片(621bp)を200ng得た。 7 ° C., for one hour, subjected to Niyukureojien DEAE-4000 column, Hinc II-Sau3A I fragment (621bp) was obtained 200 ng.

(1−2)合成DNAアダプターの調製 細胞接着ドメインとフイブリン結合ドメインのcDNA断片を接続するためのアダプター(鎖長24及び20、第1図参照)をアプライドバイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合成し、それぞれ2.7μg、2.3μg得た。 (1-2) Synthesis DNA Adapter Adapter for connecting a cDNA fragment prepared cell adhesion domain and the fibrin binding domain of (chain length 24 and 20, see FIG. 1) using the Applied Biosystems DNA Synthesizer synthesized to obtain respectively 2.7μg, 2.3μg. それぞれ100ngをアニーリング操作により2重鎖とした。 And a double stranded by annealing manipulate 100ng, respectively.

(1−3)cDNA断片とベクターの結合 (1−1)で得たcDNA断片を分泌型発現ベクターpIN (1-3) cDNA fragment and secretory expression vector the cDNA fragment obtained by coupling (1-1) of the vector pIN
III−omp AI〔ジ エムボ ジヤーナル、第3巻、第243 III-omp AI [di Emubo journal, Vol. 3, # 243
7〜2442頁(1984)〕と結合させた。 Pp. 7-2442 (1984)] and was bound.

すなわち、Xba I−Fok I断片(180bp)10ng、Fok I− That, Xba I-Fok I fragment (180bp) 10ng, Fok I-
Fok I断片(203bp)10ng、Hinc II−Sau3A I断片(621b Fok I fragment (203bp) 10ng, Hinc II-Sau3A I fragment (621b
p)30ng、(1−2)で得た合成DNAアダプター10ng、あらかじめXba I−BamH I挿入断片を除去したpIN III−om p) 30 ng, (synthetic DNA adapter 10ng obtained in 1-2), pIN III-om the previously removed Xba I-BamH I insert
pA Iベクター50ngをT 4 DNAリガーゼ用バツフアー0.5mMAT the pA I vector 50ng T 4 DNA ligase buffer were 0.5mMAT
P、10mM DTT及び2.8ユニツトのT 4 DNAリガーゼを含む20 P, 20 including the T 4 DNA ligase 10 mM DTT and 2.8 Yunitsuto
μlの反応液中、16℃、一夜インキユベートした。 The reaction solution of [mu] l, 16 ° C., overnight Inkiyubeto. この反応液を大腸菌の形質転換に使用した。 The reaction was used to transform E. coli.

(1−4)大腸菌の形質転換とプラシミドの確認 (1−3)で得た反応液20μlを用いて大腸菌HB101 (1-4) E. coli HB101 using the reaction solution 20μl obtained in the confirmation of transformation and Purashimido E. coli (1-3)
を形質転換させた。 The was transformed. 得られた形質転換体21クローンについてプラスミドの分析を行つた。 KoTsuta the analysis of the plasmid for the obtained transformant 21 clones. すなわち、各クローンについて50μg/mlアンピシリンを含む1.5mlのL−ブロスで一夜振とう培養し、ラピツド法によりプラスミドを調製し、その一部をXba IとSal Iで2重消化した。 That is, each clone was cultured with shaking overnight at L- broth 1.5ml containing 50 [mu] g / ml ampicillin for the plasmid was prepared by Rapitsudo method, a part of the double-digested with Xba I and Sal I. これをアガロース電気泳動で分離し、予想されるXba I−Xba This was separated by agarose electrophoresis, the expected Xba I-Xba
I断片(0.56kb)及びXba I−Sal I断片(1.5kb)のバンドの生成を調べた。 We investigated the generation of bands I fragment (0.56kb) and Xba I-Sal I fragment (1.5 kb). その結果、12クローンに目的のバンドが認められた。 As a result, the purpose of the band was observed in 12 clones. 更に、その塩基配列をダイデオキシ法で決定したところ、細胞接着ドメインの108アミノ酸のc末端のメチオニンのコドンが欠落している以外は正しい塩基配列を持つことを確認した。 Furthermore, the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method, except that methionine codon of c-terminal 108 amino acids of the cell adhesion domain is missing was confirmed to have the correct nucleotide sequence.

この組換え体プラスミドをpTF1301と命名した。 The recombinant plasmid was named PTF1301. またこのプラスミドを保持する大腸菌HB101をEscherichia c The E. coli HB101 holding this plasmid Escherichia c
oli HB101/pTF1301と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第9947号(FERM P−99 Displays and oli HB101 / pTF1301, Agency Fermentation Research was deposited with the Institute [FERM No. 9947 (FERM P-99
47)〕。 47)].

実施例2 FMの細胞接着ドメインAla 1235 −Gln 1516 (282アミノ酸残基)及びフイブリン結合ドメインAsn 2133 −Glu Example 2 Cell adhesion domain Ala 1235 -Gln 1516 (282 amino acid residues) of the FM and fibrin binding domain Asn 2133 -Glu
2324 (192アミノ酸残基)をコードするcDNA断片のクローニング(第2図参照) 第2図は、本発明によるpTF1801構築の工程図である。 2324 Cloning (see FIG. 2) Figure 2 of the cDNA fragment encoding (192 amino acid residues) is a process diagram of pTF1801 construction according to the invention.

(2−1)pTF901のXba I−Pvu II断片の調製 細胞接着ドメインAla 1235 −Met 1517をコードするcDNA (2-1) pTF901 cDNA encoding prepare cell adhesion domain Ala 1235 -Met 1517 in the Xba I-Pvu II fragment of
断片を含むプラスミドpTF901(特願昭63−148号)20μ The plasmid containing the fragment pTF901 (Japanese Patent Application No. Sho 63-148) 20μ
gを50ユニツトのXba I及び50ユニツトのPvu IIを含む2 The g 2 containing Xba I and 50 Yunitsuto Pvu II in 50 Yunitsuto
00μlの反応液中、37℃、1時間インキユベートした。 The reaction solution of 00μl, 37 ℃, and 1 hour Inkiyubeto.
この反応液をアガロース電気泳動にかけ、Xba I−Pvu I The reaction mixture was subjected to agarose electrophoresis, Xba I-Pvu I
I挿入断片(0.61kb)を切出した(収量400ng)。 It was cut out I insert (0.61kb) (yield 400 ng).

(2−2)pTF1301のXba I−Pvu II断片の調製 実施例1で得たプラスミドpTF1301 25μgを50ユニツトのXba I及び50ユニツトのPvu IIを含む200μlの反応液中、37℃、1時間インキユベートした。 (2-2) reaction solution 200μl containing Xba I-Pvu II fragment Pvu II of Xba I and 50 Yunitsuto 50 Yunitsuto plasmid PTF1301 25 [mu] g obtained in Preparation Example 1 of pTF1301, 37 ℃, 1 hour Inkiyubeto did. この反応液をアガロース電気泳動にかけ、Xba I−Pvu II挿入断片(0.40kb)を切出した(収量400ng)。 The reaction mixture was subjected to agarose electrophoresis, were cut Xba I-Pvu II insert (0.40kb) (yield 400 ng).

また、Xba I−Xba I挿入断片を欠く8.0kbのペクターを同時に切出し(収量2μg)、脱リン酸後、クローニングに使用した。 Further, Xba I-Xba simultaneously cut Pekuta of 8.0kb lacking I insert (yield 2 [mu] g), after dephosphorylation, it was used for cloning.

(2−3)Xba I−Pvu II断片(0.61kb及び0.40kb)の結合 (2−1)で得た0.61kb断片400ngと(2−2)で得た0.40kb断片400ngをT 4 DNAリガーゼ用バツフアー、0.5m (2-3) Xba I-Pvu II fragment (0.61Kb and 0.40kb) 0.61kb fragment 400ng and T 4 DNA ligase 0.40Kb fragment 400ng obtained in (2-2) obtained in binding (2-1) of use buffer were, 0.5m
M ATP、10mM DTT及び2.8ユニツトのT 4 DNAリガーゼを含む20μlの反応液中16℃、3時間インキユベートした。 M ATP, 20 [mu] l of the reaction solution 16 ° C. containing T 4 DNA ligase 10 mM DTT and 2.8 Yunitsuto was 3 hours Inkiyubeto.
65℃、10分間の処理で反応を止め、バツフアーをXba I 65 ° C., quenched with treatment for 10 minutes, Xba the buffer were I
至適条件にし、10ユニツトのXba Iを加えて、37℃、2 The optimal conditions, the addition of Xba I in 10 Yunitsuto, 37 ° C., 2
時間反応させた。 It was time reaction. 反応液をアガロース電気泳動にかけ、 The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis,
Xba I−Xba I断片(1.01kb)を切出した(収量20ng)。 Xba was cut I-Xba I fragment (1.01kb) (yield 20 ng).

(2−4)Xba I−Xba I断片(1.01kb)とベクターの結合 (2−3)で得たXba I−Xba I断片(1.01kb)20ngと(2−2)で得た8.0kbのベクター20ngをT 4 DNAリガーゼ用バツフアー、0.5mM ATP、10mM DTT及び2.8ユニツトの (2-4) Xba I-Xba I fragment (1.01Kb) and the Xba I-Xba I fragment was obtained by coupling (2-3) vector (1.01Kb) 20 ng and 8.0kb obtained in (2-2) the vector 20 ng T 4 DNA ligase buffer were, 0.5 mM ATP, in 10 mM DTT and 2.8 Yunitsuto
T 4 DNAリガーゼを含む20μlの反応液中、16℃、3時間インキユベートした。 T 4 reaction solution 20μl containing DNA ligase, 16 ° C., for 3 hours Inkiyubeto. この反応液を大腸菌の形質転換に使用した。 The reaction was used to transform E. coli.

(2−5)大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 (2−4)で得た反応液20μlを用いて大腸菌HB101 (2-5) E. coli HB101 using the reaction solution 20μl obtained in the confirmation of transformation with the plasmid of E. coli (2-4)
を形質転換させた。 The was transformed. 得られた形質転換体中12クローンについてプラスミドの確認を行つた。 KoTsuta confirmation plasmid for the obtained transformant in 12 clones. ラピツド法で調製したプラズミドをXba I−Pvu IIの2重消化を行い、アガロース電気泳動にかけ、予想される挿入断片(0.61kb及び0.40kb)の生成を調べた。 The Purazumido prepared by Rapitsudo method performs double digestion Xba I-Pvu II, subjected to agarose electrophoresis to examine the formation of the expected insert (0.61Kb and 0.40kb). その結果1クローンに目的のバンドが認められた。 As a result the purpose of the band was observed in 1 clone. このクローンについて、更にEc This clone, further Ec
oR I消化を行い、挿入断片の方向性を調べたところ、正しい方向に挿入されていることを確認した。 Performs a oR I digestion, was examined the direction of the insert, it was confirmed that have been inserted in the correct direction. また、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを確認した。 Further, the nucleotide sequence was determined by dideoxy method, it was confirmed to contain the desired sequence.

この組換え体プラスミドをpTF1801と命名した。 The recombinant plasmid was named PTF1801. また、このプラスミドを保持する大腸菌HB101をEscherich Further, Escherich E. coli HB101 holding this plasmid
ia coli HB101/pTF1801と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第9948号(FERM P Displays and ia coli HB101 / pTF1801, Agency Fermentation Research was deposited with the Institute [FERM No. 9948 (FERM P
−9948)〕。 -9948)].

実施例3 FNのキメラポリペプチドIle 1410 −Gln 1516 /Asn 2133 −Gl Example 3 FN chimeric polypeptide Ile 1410 -Gln 1516 / Asn 2133 -Gl
u 2324 (299アミノ酸残基)の生産と精製 実施例1で得たHB101/pTF1301を50μg/mlのアンピシリンを添加した5mlのL−ブロスを含む試験管2本に接種し、37℃、一夜振とう培養した。 The u 2324 HB101 / pTF1301 to that obtained in purified Example 1 Production of (299 amino acid residues) was inoculated into two tubes containing L- broth 5ml supplemented with 50 [mu] g / ml ampicillin, 37 ° C., overnight shaking It was shaken culture. これを500mlの同培地を含む2lの三角フラスコにそれぞれ接種して培養を続け、660nmの吸光度が0.3となつたところで2mMのIPTG This continued for the culture was inoculated each in 2l Erlenmeyer flask containing the same medium of 500ml, 2mM of IPTG at absorbance at 660nm was summer and 0.3
(イソプロピルβ−チオガラクトシド)を添加し、20時間後に集菌した。 It was added (isopropyl β- thiogalactoside), and harvested after 20 hours. 全菌体ペレツトを10mMトリス−HCl(p The whole-cell Peretsuto 10mM Tris -HCl (p
H7.5)、5mM EDTAを含む溶液に懸濁して、超音波処理を行い、12000rpm、30分間遠心して上済40mlを得た。 H7.5), it was suspended in a solution containing 5 mM EDTA, subjected to ultrasonic treatment to obtain on completion 40ml by centrifugation 12000 rpm, 30 min. これを抗FNモノクローナル抗体(FN−12、宝酒造)を結合させたセフアロース4Bカラム(8ml)に通した。 This anti-FN monoclonal antibody (FN-12, Takara Shuzo) was passed through a Sepharose 4B column bound with (8 ml). カラムを洗浄ハツフアーA(20mMトリスHCl、pH 7.5)で洗浄し、更に洗浄ハツフアーB(20mMトリスHCl、pH8.0、0. The column was washed with the washing Hatsufua A (20 mM Tris HCl, pH 7.5), further washed Hatsufua B (20 mM Tris-HCl, pH8.0,0.
1MKSl)で洗浄した。 It was washed with 1MKSl). 最後に溶出バツフアー(50mMグリシンHCl、pH2.3、0.2M KCl)で溶出した。 Finally elution buffer were (50 mM glycine HCl, pH2.3,0.2M KCl) and eluted with. 溶出画分を集め、電気泳動的にほぼ単一な34kdポリペプチド500μg Collected elution fractions electrophoretically almost single 34kd polypeptide 500μg
を得た。 It was obtained.

実施例4 FNのキメラポリペプチドAls 1235 −Gln 1516 /Asn 2133 −Gl Example 4 FN chimeric polypeptide Als 1235 -Gln 1516 / Asn 2133 -Gl
u 2324 (474アミノ酸残基)の生産と精製 実施例2で得たHB101/pTF1801を実施例3と同様の方法で2l培養し、抗FNモノクローナル抗体(FN−12)セフアロース4Bカラムにより精製した。 u 2324 The HB101 / pTF1801 obtained in Production and Purification Example 2 of (474 amino acid residues) and 2l cultured in the same manner as in Example 3, was purified by anti-FN monoclonal antibody (FN-12) Sepharose 4B column. この抗体カラム溶出画分には55kdの目的のポリペプチドのほかに、その分解物である35kdのポリペプチドを含んでいた。 In addition to the polypeptide of interest of 55kd for this antibody column elution fraction contained 35kd polypeptides is a degradation product thereof. そこで続いてフイブリン−セフアロース4Bカラムにより精製した。 Therefore subsequently fibrin - it was purified by Sepharose 4B column.
すなわちDLヘーン(DLHeene)らの方法〔トロムボシスリサーチ、第2巻、第137〜154頁(1973)〕により作製したフイブリン−セフアロース4Bカラム(10ml)に抗体カラム溶出画分を通した。 That DL Hen (DLHeene)'s method fibrin was produced by [Toro Mubo cis Research, Vol. 2, pp. 137-154 (1973)] - through antibody column elution fraction Sepharose 4B column (10 ml). カラムを洗浄バツフアー(10mMトリスHCl、pH7.6、50mM NaCl、0.5mM EDTA)で洗浄後、溶出バツフアー(25mMトリスHCl、pH7.6、6M尿素)で溶出した。 After washing the column wash buffer were (10 mM Tris-HCl, pH 7.6 NaCl, 0.5 mM EDTA) with and eluted with elution buffer were (25 mM Tris-HCl, PH7.6,6M urea). 溶出画分を集め、電気泳動的に単一な Collected elution fractions electrophoretically single
55kdのポリペプチド100μgを得た。 To obtain a polypeptide 100μg of 55 kd.

実施例5 生物活性の測定 実施例3,4で得られたキメラポリペプチドIle 1410 −Gl EXAMPLE 5 Chimeric polypeptides Ile 1410 obtained in the measurement examples 3 and 4 of bioactive -Gl
n 1516 /Asn 2133 −Glu 2324 (107CBP/192FBP、299アミノ酸残基)、 Ala 1235 −Gln 1516 /Asn 2133 −Glu 2324 (282CBP/192FBP、 n 1516 / Asn 2133 -Glu 2324 ( 107CBP / 192FBP, 299 amino acid residues), Ala 1235 -Gln 1516 / Asn 2133 -Glu 2324 (282CBP / 192FBP,
474アミノ酸残基)を用いて以下の生物活性を測定した。 474 amino acid residues) was used to measure the following biological activities.

(5−1)細胞接着活性 ルオスラーテイー(Ruoslahti)らの方法〔メンツズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzymology) (5-1) Cell adhesion activity Le Osler tee (Ruoslahti)'s method [Mentsuzu in Enzymology (Methods in Enzymology)
第82巻、第803〜831頁(1981)〕に準じて細胞接着活性を測定した。 82 vol, was in accordance with pp 803-831 (1981)] to determine cell adhesion activity. すなわち試料を生理食塩水又は蒸留水で段階的に希釈し、その50μlを96穴マイクロプレートに分注し、4℃、一夜インキユベートして試料をプレートに付着させた。 That sample was serially diluted with physiological saline or distilled water, aliquoted its 50μl in a 96-well microtiter plate, 4 ° C., was then overnight Inkiyubeto to adhere the sample to the plate. 次にPBSバツフアーでプレートを2回洗浄し、3%BSAを100μl加え37℃、1時間インキユベートしてプレートをフロツクした。 Plates were then washed twice with PBS buffer were, a 3% BSA 100 [mu] l was added 37 ° C., was Furotsuku the plates for 1 hour Inkiyubeto. プレートをPBSバツフアーで2回洗浄した後、あらかじめ、イーグルの最小培地(MEM)に10 6細胞/mlとなるように懸濁させたラツト腎細胞(NRK−49F)を100μl/ウエルの割合で分注し、37 The plates were washed twice with PBS buffer were, in advance, partial rat kidney cells suspended so as to be 10 6 cells / ml in minimal medium (MEM) of Eagle (NRK-49F) at a rate of 100 [mu] l / well dispensed, 37
℃、2〜3時間インキユベートした。 ℃, was 2-3 hours Inkiyubeto.

なお、使用したNRK−49F細胞は凍結保存した株を前培養した後、トリプシン処理したものを用いた。 Incidentally, NRK-49F cells were used after pre-cultured strain was stored frozen, it was used trypsinized.

顕微鏡下で細胞の伸展を観察し、伸展に必要な最少量を最少細胞接着活性として示す。 Observing the spreading of cells under a microscope, shows the minimum amount necessary to stretch as minimum cell adhesion activity. 結果を他の活性と共に、後記第1表に示す。 The results with other active, shown in the following Table 1.

108アミノ酸残基及び283アミノ酸残基の細胞接着ドメインのみを有するポリペプチド〔108CBP及び283CBP(Il 108 amino acid residues and 283 polypeptides having only cell adhesion domain of amino acid residues [108CBP and 283CBP (Il
e 1410 −Met 1517及びAle 1235 −Met 1517 )特願昭63−148 e 1410 -Met 1517 and Ale 1235 -Met 1517) Japanese Patent Application No. Sho 63-148
号〕を同時に測定し、キメラポリペプチドと比較検討した。 No.] was measured simultaneously, it was compared to the chimeric polypeptide.

その結果、107CBP/192FBPは、108CBPに比し、約52倍以上の活性が認められた。 As a result, 107CBP / 192FBP is compared to 108CBP, it was observed approximately 52-fold more active. 282CBP/192FBPは283CBPと同等の活性が認められた。 282CBP / 192FBP was found comparable activity and 283CBP.

(5−2)フイブリン結合活性 関口らの方法〔ジヤーナル オブ バイオロジカル (5-2) fibrin binding activity Sekiguchi et al's method [journal of Biological
ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)第2 Chemistry (Journal of Biological Chemistry) second
56巻、第6452〜6462頁(1981)〕に従い、フイブリン− Vol. 56, according to pp. 6452 to 6462 (1981)], fibrin -
セフアロース4Bカラムへの吸着によりフイブリン結合活性を調べた。 It was examined fibrin binding activity by adsorption to Sepharose 4B column. 前記DLヘーンらの方法〔トロムボシス The DL Hen et al's method [Toromuboshisu
リサーチ、第2巻、第137〜154頁(1973)〕により作製したフイブリン−セフアロース4Bカラム(1.4ml)にキメラポリペプチドIle 1410 −Gln 1516 /Asn 2133 −Glu 2324 Research, Volume 2, fibrin was prepared by pp 137-154 (1973)] - Sepharose 4B column (1.4 ml) in a chimeric polypeptide Ile 1410 -Gln 1516 / Asn 2133 -Glu 2324
(107CBP/192FBP、299アミノ酸残基)5μgを通した。 Through the (107CBP / 192FBP, 299 amino acid residues) 5μg.
7.5mlの洗浄バツフアー(10mMトリスHCl、pH7.6、50mM 7.5ml of wash buffer were (10 mM Tris-HCl, pH 7.6
NaCl、0.5mM EDTA)で非吸着画分を除いた後、溶出バツフアー(25mMトリスHCl、pH7.6、6M尿素)で吸着画分を溶出させた。 NaCl, after removing the non-adsorbed fraction with 0.5 mM EDTA), elution buffer were (25 mM Tris-HCl, and eluted adsorbed fraction pH7.6,6M urea). 各画分を0.5mlずつ分画し、107CBP/192FBP Fractionated each fraction by 0.5ml, 107CBP / 192FBP
の溶出位置を抗FNモノクローナル抗体(FN−12、宝酒造)を用いたELISA法により調べた。 The elution positions anti FN monoclonal antibody (FN-12, Takara Shuzo) was determined by ELISA using. その結果、107CBP/ As a result, 107CBP /
192FBPは吸着画分に認められ、フイブリン結合活性を有することが確認された。 192FBP is observed in the adsorbed fraction was confirmed to have a fibrin binding activity. 同様の結果はAla 1235 −Gln 1516 Similar results Ala 1235 -Gln 1516
/Asn 2133 /Glu 2324 (282CBP/192FBP、474アミノ酸残基) / Asn 2133 / Glu 2324 (282CBP / 192FBP, 474 amino acid residues)
でも確認された。 But it has been confirmed. また、フイブリン結合ドメインを有しないIle 1410 −Met 1516 (108CBP)及びAla 1235 −Met 1516 Further, Ile 1410 -Met 1516 (108CBP) having no fibrin binding domain and Ala 1235 -Met 1516
(283CBP)は、フイブリン−セフアロース4Bへの吸着は認められなかつた。 (283CBP) is fibrin - adsorption on Sepharose 4B is has failed observed. (第1表参照) (5−3)インスリン結合活性 FNのフイブリン結合ドメインにはインスリンの結合活性があることが知られている(第46回日本癌学会総会記事、第181頁)。 (See Table 1) (5-3) in the fibrin binding domain of insulin binding activity FN is known to have binding activity of insulin (46th Meeting of the Japanese Cancer Association Meeting Article, pages 181).

そこでキメラポリペプチドのインスリン結合活性を調べた。 So it was examined insulin binding activity of the chimeric polypeptide. 107CBP/192FBP、282CBP/192FBP、108CBP、283CBP 107CBP / 192FBP, 282CBP / 192FBP, 108CBP, 283CBP
を20μgより順次1/2希釈したものをバイオラツド社製B Baioratsudo manufactured by B to the things that were successively 1/2 dilution than 20μg
IO−DOT TMを用いてニトロセルロース膜に吸着させた。 It was adsorbed onto a nitrocellulose membrane using a IO-DOT TM.
このニトロセルロース膜を3%BSAを含むPBSバツフアーでプロツキング操作を行つた後、50μg/mlのパーオキシダーゼ標識したインスリン(シズマ社)を含むPBSバツフアー中室温、2時間放置した。 After having conducted the Purotsukingu operation with PBS buffer were the nitrocellulose membrane containing 3% BSA, at room temperature in PBS buffer were containing 50 [mu] g / ml of peroxidase-labeled insulin (Shizuma Co.), and left for 2 hours. 次にこのニトロセルロース膜をPBSで5分間、2回洗浄した後、結合したパーオキシダーゼ−インスリンを4−クロロ−1−ナフトール及び過酸化水素を基質として検出した。 Then 5 minutes the nitrocellulose membranes with PBS, and after washing twice, the bound peroxidase - insulin chloro-1-naphthol and hydrogen peroxide was detected as a substrate. その結果108C As a result 108C
BP及び283CBPでは全く発色がみられないのに対して、10 In BP and 283CBP against not seen at all color, 10
7CBP/192FBP及び282CBP/192FBPでは濃度に対応した発色がみられた。 7CBP / 192FBP and color that corresponds to the concentration in 282CBP / 192FBP was observed. したがつて、107CBP/192FBP及び282CBP/19 Was but connexion, 107CBP / 192FBP and 282CBP / 19
2FBPにはインスリン結合活性があることが確認された(第1表参照)。 The 2FBP that there is insulin binding activity was confirmed (see Table 1).

〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明により、少なくとも細胞接着活性とフイブリン結合活性とを合せ持つ機能性ポリペプチド、並びにそれらをコードする遺伝子、及びその遺伝子を用いて、該機能性ポリペプチドの大量生産を可能とする遺伝子工学的な製造方法が提供された。 As described above in detail [Effect of the Invention By the present invention, by using a functional polypeptide having combined with at least cell adhesion activity and fibrin binding activity, and genes encoding them and the gene, said functional genetic engineering manufacturing method which allows mass production of sex polypeptide is provided.

上記ポリペプチドは、創傷治療、ドラツグデリバリーシステムとしてなど各種の用途に有用である。 It said polypeptide wound treatment, is useful in various applications such as Dora suspender delivery system.


第1図及び第2図は本発明のプラスミド構築の工程図である。 FIGS. 1 and 2 is a process diagram of a plasmid construction of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (72)発明者 菅原 由起 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−89699(JP,A) 特開 昭62−272975(JP,A) 特開 昭62−282593(JP,A) 特開 昭62−236485(JP,A) 特開 昭62−82197(JP,A) ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 6 identification symbol Agency in the docket number FI technology display place C12R 1:19) (72) inventor Sugawara Otsu, Shiga Prefecture Yuki Seta 3 chome fourth No. 1 Takara sake Concrete Co., Ltd. center within the Institute (72) inventor Kato YunoSusumu Otsu, Shiga Prefecture Seta 3-chome fourth No. 1 Takarasake Concrete Co., Ltd. center within the Institute (56) reference Patent Sho 62-89699 (JP, a ) Patent Akira 62-272975 (JP, A) JP Akira 62-282593 (JP, A) JP Akira 62-236485 (JP, A) JP Akira 62-82197 (JP, A)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】下記一般式I: A−B ……〔I〕 〔式中Aは、フイブロネクチンの細胞接着活性を有するペプチド残基で、Ala 1235 −Gln 1516 (282アミノ酸残基)又はIle 1410 −Gln 1516 (107アミノ酸残基)を示し、Bはフイブロネクチンのフイブリン結合ドメインペプチド残基で、Asn 2133 −Glu 2324 (192アミノ酸残基) 1. A following general formula I: A-B ...... [I] [wherein A is a peptide residue having cell adhesion activity of fibronectin, Ala 1235 -Gln 1516 (282 amino acid residues), or Ile 1410 -Gln 1516 (107 amino acid residues) indicates, B is a fibrin binding domain peptide residue of fibronectin, Asn 2133 -Glu 2324 (192 amino acid residues)
    を示す〕で表されることを特徴とする機能性ポリペプチド。 Functional polypeptide, characterized by being represented by the shown].
  2. 【請求項2】請求項1記載の機能性ポリペプチドをコードする遺伝子。 2. A gene encoding a functional polypeptide of claim 1.
  3. 【請求項3】請求項2記載の機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を組込んだプラスミド。 3. A plasmid incorporating a gene encoding a functional polypeptide as claimed in claim 2, wherein.
  4. 【請求項4】請求項3記載のプラスミドを導入した宿主細胞を培養し、該培養物より請求項1記載の機能性ポリペプチドを採取することを特徴とする請求項1記載の機能性ポリペプチドの製造方法。 4. culturing the host cells transfected with claim 3, wherein the plasmid, functional polypeptide of claim 1, wherein the collecting the functional polypeptide of claim 1, wherein from the culture the method of production.
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