JP2026032010A

JP2026032010A - 二重特異性抗体及びその応用

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Publication number: JP2026032010A
Application number: JP2025189232A
Authority: JP
Inventors: 棟李; 健民房; 梅袁; 珊珊陳; 斯斯王; 英豪辛; 元浩李; 国鋭趙; 新▲テイ▼ 馬
Original assignee: Remegen Shanghai Co Ltd; Remegen Co Ltd
Current assignee: Remegen Shanghai Co Ltd; Remegen Co Ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2025-11-10
Publication date: 2026-02-25
Also published as: IL324586A; AU2023387779A1; CN121517560A; EP4534562A1; EP4682258A2; TW202432589A; KR20250167678A; US20250145701A1; MX2025003797A; EP4682258A3; CA3243312A1; WO2024141027A1; IL319909A; MX2025013475A; CN118591562A; AU2025267317A1; JP2025525408A; KR20250054821A; US20260055173A1

Abstract

【課題】血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）／ＶＥＧＦ受容体及び免疫チェックポイント阻害剤を標的とする二重特異性抗体を提供する。【解決手段】ＶＥＧＦを標的とするＶＨＨ、このＶＨＨを基に開発したＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体並びにその応用が提供される。前記ＶＨＨは安定性が高く、発現及び精製が容易であるなどの様々な良好な効果を有する。構築されたＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体は、安定性が高く、ＶＥＧＦ高発現腫瘍の領域を標的として濃縮されることが可能であり、良好な薬効及び安全性を有し、治療効果に優れている。【選択図】なし

Description

本発明は、抗体分野に関し、具体的にはＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性
抗体及びその応用に関する。

プログラム細胞死受容体１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈｒｅｃｅｐｔｏｒ－１
、ＰＤ－１）は免疫グロブリンＣＤ２８／Ｂ７スーパーファミリーに属する免疫抑制性受
容体である。ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１と結合すると、ホスファチジルイノシトール－３－キ
ナーゼのリン酸化、プロテインキナーゼＢの更なる活性化、刺激性Ｔ細胞信号経路の活性
化、グルコース代謝及びインターフェロンの分泌などが起こるので、Ｔ細胞活性化の下流
シグナル伝達が阻害され、さらにＴ細胞の転写が効果的に抑制され、最終的にＴ細胞の免
疫反応が抑制され、このように、免疫応答の抑制的制御において重要な役割を果たしてい
る。ＰＤ－１抗体は広域スペクトルの抗腫瘍効果を持っているため、現在、いくつかの画
期的薬剤（ブロックバスター）、例えば、２０１４年１２月２２日に米国で承認されたオ
プジーボ（商品名：Ｏｐｄｉｖｏ；通用名：ニボルマブ）が上場され、最初に許可された
適応症が悪性黒色腫（メラノーマ）であるが、次に、非小細胞肺癌、腎細胞癌、ホジキン
リンパ腫、頭頚部扁平細胞癌、結腸・直腸癌、肝細胞癌、尿路上皮癌、結腸・直腸癌、肝
細胞癌、食道癌、食道扁平細胞癌、胸膜間皮腫、食道腺癌、食道胃接合部腺癌、胃癌など
の適応症が相次いで米国で承認されるようになった。しかし、既存の臨床データ（１６０
個の臨床試験からの２８３０４例の患者データを含む）の分析（参考文献１：Ｅｆｆｉｃ
ａｃｙｏｆＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ｂｌｏｃｋａｄｅｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙｉｎｃ
ｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ，ＢｉｎＺｈａｏ，ＨｏｎｇＺｈａｏ，ｅｔａｌ．，Ｔ
ｈｅｒＡｄｖＭｅｄＯｎｃｏｌ．２０２０，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１－２２）による
と、全般的に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の単剤投与治療を受けた２２１６５例の患者のうち
、計４７４７例の患者が治療効果を示した（客観的奏効率（ＯＲＲ），２０．２１％；９
５％信頼区間（ＣＩ），１８．３４～２２．１５％）。１９４１８例の癌患者のうち、８
６２例の完全奏功（ＣＲ）が観察された。ＣＲの全発生率が３．８５％（９５％ＣＩ，３
．０６～４．７３％）であった。また、ＯＲＲは異なる種類の癌及びＰＤ－Ｌ１発現状態
で有意差が認められた。つまり、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の単剤治療に関連する治療効果は
異なる種類の癌及びＰＤ－Ｌ１発現レベルにおいて有意差が見られ、満たされていない臨
床ニーズがまだ多く存在している。

血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃ
ｔｏｒ、ＶＥＧＦ）は、血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ
ｆａｃｔｏｒ、ＶＰＦ）とも呼ばれ、血管透過性の増加、細胞外基質の変性、血管内皮細
胞の遊走、増殖及び血管形成を促進する作用がある、高特異性を有する血管内皮細胞増殖
促進因子である。資料によると、ＶＥＧＦは病理性血管生成において重要な役割を果たし
、腫瘍の増殖及び転移、黄斑変性、糖尿病性網膜病変、炎症過程（例えば、関節リウマチ
）、虚血過程（心筋虚血）、妊娠高血圧腎症などの疾患の発症及び進展を誘発する可能性
がある（参考文献２：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓ
ｉｔｙｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ
．ＹａｍａｚａｋｉＹ．，ＭｏｒｉｔａＴ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．Ｎｏｖｅｍｂ
ｅｒ２００６，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．４，ｐｐ．５１５－５２７）。血管内皮増殖因子
と特異的に結合する高親和性受容体は、血管内皮増殖因子受容体（ＶａｓｃｕｌａｒＥ
ｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＥＧＦＲ）と
呼ばれ、受容体型チロシンキナーゼであり、血管生成及び細胞遊走に必要な多くのシグナ
ル伝達経路において重要な役割を果たし、ＶＥＧＦと結合するとシグナル伝達カスケード
を開始させて血管の生成を刺激する。従って、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲは、殆ど内皮細胞で
しか発現せず、かつ多くの腫瘍内皮細胞において高度にアップレギュレートされるから、
非常に重要な標的部位である。現在、癌または他の病理過程において、抗ＶＥＧＦ／ＶＥ
ＧＦＲ療法を用いて血管新生を阻止することは極めて重要になると考えられている。血管
内皮増殖因子／血管内皮増殖因子受容体の阻害は、腎臓細胞癌、肝細胞癌などの一部の癌
を治療する主要な治療方法とされている。

現在、血管内皮増殖因子／血管内皮増殖因子受容体と免疫チェックポイント阻害剤とを
併用して癌を阻止するための治療中の安全性及び有効性を検討するための様々な臨床試験
が行われている。いくつかの早期研究によると、単一のＶＥＧＦＲ阻害剤または免疫阻害
剤と比較して、免疫チェックポイント阻害剤とＶＥＧＦＲ阻害剤との併用は良好な治療効
果を示す可能性がある（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｂｒｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ／ａ
ｒｔｉｃｌｅ／ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ－ｉｍｍｕｎｅ－ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ－ａｎｄ－ｖ
ｅｇｆ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ－ｉｍｐｒｏｖｅｓ－ｓｕｒｖｉｖａｌ－ｉｎ－ｐｒｅｔ
ｒｅａｔｅｄ－ｎｓｃｌｃ）。しかし、この有利な結果に関連するリスクはまだ不明であ
る（参考文献３：ＣｏｍｂｉｎｉｎｇＩｍｍｕｎｅＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔａｎｄＶＥ
ＧＦＲＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎＦａｖｏｒａｂｌｅＲｉｓｋａｎｄＥｌｄｅｒｌ
ｙＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＭｅｔａｓｔａｔｉｃＲｅｎａｌＣｅｌｌＣａｒｃｉ
ｎｏｍａ．ＶａｒｋａｒｉｓＡ，ＸｕＷ，ＤａｖｉｓＲＢ，ＨｅａｌｙＢ，ＭｃＤ
ｅｒｍｏｔｔＤＦ．ＣｌｉｎＧｅｎｉｔｏｕｒｉｎＣａｎｃｅｒ．Ｊｕｎｅ２０２０
，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３，ｐｐ．１７９－１８４）。ＶＥＧＦＲ／ＩＣＩの二重阻害
に関するいくつかの臨床試験（例えば、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ
）／パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）併用薬群、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）／
スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）併用薬群、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）／パゾ
パニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）併用薬群など）では、初期臨床研究段階で良好な治療効果
を示したが（参考文献４：ＡＰｈａｓｅＩ／ＩＩＳｔｕｄｙｔｏＡｓｓｅｓｓｔｈ
ｅＳａｆｅｔｙａｎｄＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＰａｚｏｐａｎｉｂａｎｄＰｅｍｂ
ｒｏｌｉｚｕｍａｂＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＴｈｅｒａｐｙｉｎＰａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｎａｌＣｅｌｌＣａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｈｏｗｄｈｕ
ｒｙＳ，ＩｎｆａｎｔｅＪＲ，ｅｔａｌ．ＣｌｉｎＧｅｎｉｔｏｕｒｉｎＣａｎｃ
ｅｒ．２０２１ｒｈＯｃｔｏｂｅｒ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５，ｐｐ．４３４－４４６
；参考文献５：Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（ａｎｔｉ－ＰＤ－１；ＢＭＳ－９３６５５８，ＯＮ
Ｏ－４５３８）ｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｕｎｉｔｉｎｉｂｏｒｐａ
ｚｏｐａｎｉｂｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ（ｐｔｓ）ｗｉｔｈｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒ
ｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ｍＲＣＣ）．Ａｍｉｎ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ．３２，（ｓｕｐｐｌ．），Ｍ
ａｙ２０，２０１４，Ａｂｓｔｒａｃｔ５０１０）、その後の高用量群では重篤な毒性
作用が観察された。ニボルマブ／スニチニブ併用薬群、及びニボルマブ／パゾパニブ併用
薬群では、それぞれ７３％及び６０％の患者にグレード３以上の治療関連毒性が発見され
た。また、ニボルマブ／スニチニブ併用薬群では、２３％の有害事象がさらに発生したた
め治療中止となった。ニボルマブ／パゾパニブ併用薬群でも、２０％の有害事象が発生し
たため治療中止となった。同様に、ペムブロリズマブ／パゾパニブ併用薬群でも、高用量
に関連する肝毒性が発生した。これらの併用は臨床第ＩＩＩ相試験において不適合と判断
されたため中止となってしまった。また、ＶＥＧＦＲ／ＩＣＩの二重阻害に関する別のい
くつかの臨床試験（例えば、ベバシズマブクローナル抗体（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）と
アテゾリズマブクローナル抗体（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）の併用）の臨床第ＩＩＩ相
試験（参考文献６：ＩＭｍｏｔｉｏｎ１５１：ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｈａｓｅＩ
ＩＩｓｔｕｄｙｏｆａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂｐｌｕｓｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂｖ
ｓｓｕｎｉｔｉｎｉｂｉｎｕｎｔｒｅａｔｅｄｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒｅｎａｌｃ
ｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ｍＲＣＣ），Ｍｏｔｚｅｒ，ＲＪｅｔａｌ．Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ．３６，ａｂｓｔｒ．５７８（２０１８
）．）において、積極的な治療効果データも報告された。この試験では、患者の奏効率が
ある程度に上昇したが、併用療法による治療に伴う副作用も増えたので、ＭＳＫＣＣ基準
により、この臨床試験では２０％の治療意図患者だけに適切なリスクがある。

併用療法の検討に加えて、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体及びＰＤ－１を標的とするいくつ
の二重特異性抗体は、まだ検討されており、例として、中山康方生物医薬有限公司が開発
したＡＫ１１２（中国特許出願ＣＮ１０９０５３８９５）がある。しかし、これまで、全
世界で血管内皮増殖因子／血管内皮増殖因子受容体及び免疫チェックポイント阻害剤を標
的とする二重特異性抗体は、まだ承認発売を取得せず、依然として大きな臨床ニーズ及び
開発課題が存在している。

発明者らは鋭意研究を行い、複数ラウンドのスクリーニング及び最適化を行うことでＶ
ＥＧＦを標的とするＶＨＨを得るとともに、ＶＨＨを結合機能領域モジュールコンポネン
トとしてＰＤ－１抗体と結合させることによって、ＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二
重特異性抗体を開発することに至った。係る二重特異性抗体は、
（ａ）ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域と、
（ｂ）ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域と、を含み、
ここで、
前記ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域が抗ＰＤ－１抗体（Ａｂ）または抗原結
合断片(Ａｂ’)であり、
前記ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域が以下のアミノ酸配列で特定されるＣＤ
Ｒ１～３のＶＨＨドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｏｆｈｅａｖｙｃｈａｉ
ｎｏｆｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む。

さらに、前記ＣＤＲ２における変異の部位が５８位および／または６５位にある。

さらに、前記ＣＤＲ２における変異がＮ５８Ｙ変異および／またはＤ６５Ｇ変異である
。

好ましくは、前記ＣＤＲ２における変異がＮ５８Ｙ及びＤ６５Ｇ変異である。

好ましくは、前記ＣＤＲ２の変異発生後のアミノ酸配列は配列番号２４で示されるアミ
ノ酸配列と一致している。

好ましくは、前記ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域のＶＨＨドメインのＣＤＲ
１～３の組み合わせは、以下の通りである。

さらに、前記ＶＨＨドメインはヒト化ＶＨＨドメインである。

さらに、前記ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域は、
１）配列番号４で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号４で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１個または２個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ド
メインＦＲ１、および／または
２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号５で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ
２、および／または
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号６で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１～５個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメイン
ＦＲ３、および／または
４）配列番号７で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号７で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ
４をさらに含む。

またさらに、ＦＲ１ドメインにおける前記１個または２個のアミノ酸変異は、１位およ
び／または５位にあり、さらに好ましくはＱ１Ｅおよび／またはＱ５Ｌ変異である。

またさらに、ＦＲ２ドメインにおける前記１個のアミノ酸変異は、４９位にあり、さら
に好ましくはＡ４９Ｓ変異である。

またさらに、ＦＲ３ドメインにおける前記１～５個のアミノ酸変異は、７４位、８２Ｂ
位、８３位、８４位及び８９位から選ばれる１または２または３または４または５個であ
り、さらに好ましくはＤ７４Ｓ、Ｖ（８２Ｂ）Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｐ８４Ａ及びＭ８９Ｖから
選ばれる１位または２位または３位または４位または５位にある。

またさらに、ＦＲ４ドメインにおける前記１個のアミノ酸変異は、１０８位にあり、さ
らに好ましくはＱ１０８Ｌである。

またさらに、前記ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域は、
１）配列番号４または配列番号９で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワー
ク領域ドメインＦＲ１、および／または
２）配列番号５または配列番号１０で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワ
ーク領域ドメインＦＲ２、および／または
３）配列番号６または配列番号１１で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワ
ーク領域ドメインＦＲ３、および／または
４）配列番号７または配列番号１２で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワ
ーク領域ドメインＦＲ４をさらに含む。

さらに、前記ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域は、以下のアミノ酸で特定され
るフレームワーク領域の組み合わせを含む。

さらに、前記ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域は、配列番号８で示されるアミ
ノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号８で示されるアミノ酸配列と比べて１～１
１個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個）
のアミノ酸変異を有する。さらに、前記変異の部位は、１位、５位、４９位、５８位、６
５位、７４位、８２Ｂ位、８３位、８４位、８９位及び１０８位から選ばれることが好ま
しい。さらに、前記変異は、Ｑ１Ｅ、Ｑ５Ｌ、Ａ４９Ｓ、Ｎ５８Ｙ、Ｄ６５Ｇ、Ｄ７４Ｓ
、Ｖ（８２Ｂ）Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｐ８４Ａ、Ｍ８９Ｖ、Ｑ１０８Ｌから選ばれる１～１１個
（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個）であ
ることが好ましい。

さらに好ましくは、前記ＶＥＧＦを標的とする第２の結合機能領域のアミノ酸配列は、
配列番号８、配列番号１３または配列番号１４で示されるアミノ酸配列と一致している。

さらに、前記抗ＰＤ－１抗体(Ａｂ)またはその抗原結合断片(Ａｂ')は、ヒト化抗体ま
たはその抗原結合断片、キメラ抗体またはその抗原結合断片、ヒト抗体またはその抗原結
合断片である。

さらに、前記抗ＰＤ－１抗体(Ａｂ)またはその抗原結合断片(Ａｂ')はＩｇＧ型抗体で
ある。

またさらに、前記抗ＰＤ－１抗体(Ａｂ)またはその抗原結合断片(Ａｂ')は、ＩｇＧ１
型、ＩｇＧ２型、またはＩｇＧ４型である。

さらに、前記ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域は、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕ
ｍａｂ、Ｏｐｄｉｖｏ）抗体またはペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｋ
ｅｙｔｒｕｄａ）抗体と同一の軽鎖及び重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を有する。

さらに、前記ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域は、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕ
ｍａｂ、Ｏｐｄｉｖｏ）抗体またはペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｋ
ｅｙｔｒｕｄａ）抗体と同一の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する。

前記ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域は、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、
Ｏｐｄｉｖｏ）抗体またはペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｋｅｙｔｒ
ｕｄａ）抗体と同一の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する。

さらに、前記ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域の重鎖部分は、さらに、重鎖定
常領域ＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメ
イン（ＣＨ２）、重鎖定常領域ＣＨ３ドメイン（ＣＨ３）から選ばれる１つ以上を含む。

前記ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域は、軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）をさ
らに含む。

さらに、前記抗ＰＤ－１抗体は、Ｎ端からＣ端に向かって重鎖可変領域ドメイン（ＶＨ
）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）、重鎖定常領域
ＣＨ２ドメイン（ＣＨ２）、重鎖定常領域ＣＨ３ドメイン（ＣＨ３）を順次に含む重鎖部
分と、Ｎ端からＣ端に向かって軽鎖可変領域ドメイン（ＶＨ）、軽鎖定常領域ドメイン（
ＣＨ）を順次に含む軽鎖部分とを含む。

さらに、前記抗ＰＤ－１抗体のＦｃドメイン（すなわちヒンジ領域、重鎖定常領域ＣＨ
２ドメイン、重鎖定常領域ＣＨ３ドメイン）はＩｇＧ１Ｆｃドメインまたはそのサイレ
ントＩｇＧ１変異である。

さらに、前記Ｆｃドメインは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と一致しているか、
あるいは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の相同性を有
するアミノ酸配列である。

さらに、前記ＰＤ－１を標的とする第１の結合機能領域は、以下のアミノ酸配列からな
る軽鎖と重鎖の組み合わせを含む。
１）配列番号１６で示されるアミノ酸配列と一致している重鎖、および／または
配列番号１７で示されるアミノ酸配列と一致している軽鎖；あるいは
２）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と一致している重鎖、および／または
配列番号１９で示されるアミノ酸配列と一致している軽鎖。

さらに、前記第２の結合機能領域は、前記第１の結合機能領域のＣ端またはＮ端にある
。
さらに、前記ＶＨＨドメインは、前記抗体(Ａｂ)またはその抗原結合断片(Ａｂ')の重
鎖部分のＣ端またはＮ端に直接的に連結されているか、あるいはペプチドリンカーを介し
て連結されている。

さらに、前記ペプチドリンカーは可撓性ペプチドリンカーである。
さらに、前記ペプチドリンカーは１つ以上のアミノ酸を含む。
さらに、前記ペプチドリンカーは少なくとも５つのアミノ酸を含む。

好ましくは、前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＳ）_nで表される（た
だし、前記ｎは１、２、３または４である）。
さらに、前記二重特異性抗体は二価、三価または四価の二重特異性抗体である。

さらに、前記二重特異性抗体は、配列番号２０で示される重鎖と配列番号２１で示され
る軽鎖との組み合わせを含むか、あるいは配列番号２２で示される重鎖と配列番号２３で
示される軽鎖との組み合わせを含む。

本発明は、さらにＶＥＧＦを標的とするＶＨＨドメインに関する。前記ＶＨＨドメイン
は、以下のアミノ酸配列で特定されるＣＤＲ１～３を含む。

さらに、前記ＣＤＲ２における変異の部位は５８位および／または６５位にある。
またさらに、前記ＣＤＲ２における変異はＮ５８Ｙ変異および／またはＤ６５Ｇ変異で
ある。
さらに、前記ＶＨＨドメインはヒト化ＶＨＨドメインである。

さらに、前記ＶＨＨドメインは、
１）配列番号４で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号４で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１個または２個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ド
メインＦＲ１、および／または
２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号５で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ
２、および／または
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号６で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１～５個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメイン
ＦＲ３、および／または
４）配列番号７で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号７で示さ
れるアミノ酸配列と比べて１個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ
４をさらに含む。

またさらに、ＦＲ１ドメインにおける前記１個または２個のアミノ酸変異は１位および
／または５位にあり、さらに好ましくはＱ１Ｅおよび／またはＱ５Ｌ変異である。
またさらに、ＦＲ２ドメインにおける前記１個のアミノ酸変異は４９位にあり、さらに
好ましくはＡ４９Ｓ変異である。

またさらに、ＦＲ３ドメインにおける前記１～５個のアミノ酸変異は、７４位、８２Ｂ
位、８３位、８４位及び８９位から選ばれる１または２または３または４または５個であ
り、さらに好ましくはＤ７４Ｓ、Ｖ（８２Ｂ）Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｐ８４Ａ及びＭ８９Ｖから
選ばれる１位または２位または３位または４位または５位にある。
またさらに、ＦＲ４ドメインにおける前記１個のアミノ酸変異は、１０８位にあり、Ｑ
１０８Ｌであることがさらに好ましい。

またさらに、前記ＶＥＧＦを標的とするＶＨＨドメインは、
１）配列番号４または配列番号９で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワー
ク領域ドメインＦＲ１、および／または
２）配列番号５または配列番号１０で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワ
ーク領域ドメインＦＲ２、および／または
３）配列番号６または配列番号１１で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワ
ーク領域ドメインＦＲ３、および／または
４）配列番号７または配列番号１２で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワ
ーク領域ドメインＦＲ４をさらに含む。

さらに、前記ＶＨＨドメインは、以下のアミノ酸で特定されるフレームワーク領域の組
み合わせを含む。

さらに、前記ＶＨＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列と
一致しているか、あるいは配列番号８で示されるアミノ酸配列と比べて１～１１個（１個
、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個）のアミノ酸部位
の変異を有する。さらに、前記アミノ酸変異の部位は１位、５位、４９位、５８位、６５
位、７４位、８２Ｂ位、８３位、８４位、８９位及び１０８位から選ばれることが好まし
い。さらに、前記変異はＱ１Ｅ、Ｑ５Ｌ、Ａ４９Ｓ、Ｎ５８Ｙ、Ｄ６５Ｇ、Ｄ７４Ｓ、Ｖ
（８２Ｂ）Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｐ８４Ａ、Ｍ８９Ｖ、Ｑ１０８Ｌから選ばれる１～１１個（１
個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個）であることが
好ましい。

さらに好ましくは、前記ＶＨＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１３
または配列番号１４で示されるアミノ酸配列と一致している。
本発明は、さらに、組換えタンパク質の構築における前記ＶＨＨドメインの使用に関す
る。
本発明は、さらに、前記ＶＥＧＦを標的とするＶＨＨドメインを含む組換えタンパク質
に関する。

さらに、前記組換えタンパク質には、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体薬物コン
ジュゲートが含まれる。
本発明は、さらに、前記何れか１項に記載の二重特異性抗体、多重特異性抗体、組換え
タンパク質、またはＶＨＨドメインをコードする、ポリヌクレオチドに関する。
本発明は、さらに、前記何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターに
関する。

本発明は、さらに、前記何れか１項に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノム
上に前記何れか１項に記載のポリヌクレオチドが統合された、宿主細胞に関する。
本発明は、さらに、前記何れか１項に記載のＶＨＨドメイン、二重特異性抗体、多重特
異性抗体または組換えタンパク質及びその薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に
関する。

本発明は、さらに、癌治療薬の調製における、前記何れか１項に記載の二重特異性抗体
、多重特異性抗体、組換えタンパク質またはＶＨＨドメインの使用に関する。
本発明は、さらに、必要とする被験者に、前記何れか１項に記載のＶＨＨドメイン、二
重特異性抗体、多重特異性抗体または組換えタンパク質を有効量で投与することを含む、
癌の治療方法に関する。
さらに、前記何れか１項に記載の使用または治療方法においては、前記癌が結腸・直腸
癌である。

本発明による有益な効果は以下の通りである。すなわち、本発明においてスクリーニン
グ及び最適化されたＶＥＧＦを標的とするＶＨＨドメインは構造が安定で、熱安定性が高
く、ヒトＶＥＧＦ－ＡともマウスＶＥＧＦ－Ａとも高い結合活性を示し、動物モデルにお
いて同時に検証するのに有利であるため、薬物開発の成功率が高められ、またタンパク質
の高発現及び精製に有利な特徴を持っている。また、本発明においてこのＶＨＨドメイン
をもとに開発された二重特異性抗体は独特な二重特異性抗体構造形態を有し、高度にヒト
化され、人工的に添加された冗長配列を含まず、かつＶＥＧＦ高発現腫瘍中で局所的に濃
縮する可能性があるため、より選択的な腫瘍抑制作用を発揮し、より有効な腫瘍抑制効果
を発揮し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤の薬効が不十分であったという問題を解決するこ
とができる。

複数ラウンドの変異改造が行われた抗体とＶＥＧＦとの結合状況を示す。二重特異性抗体の構造概略図を示す。ＭＬＲ反応における被験抗体によるインターロイキン２（ＩＬ－２）の放出量を示す。ＭＬＲ反応における被験抗体によるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の放出量を示す。被験抗体によるＨＵＶＥＣ細胞増殖の相対阻害率を示す。被験抗体によるＨＵＶＥＣ細胞遊走の阻害作用を示す。ＶＥＧＦ磁気ビーズに結合させた抗体の残余量のＥＬＩＳＡ法による定量化を示す。被験抗体で処置した担癌マウスモデル中の腫瘍体積を示す。

定義
特に反対の説明がない限り、本発明の用語は当分野の技術範囲内のウイルス学、免疫学
、微生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いるか、又は当業者に一般
的に理解される意味と同じである。これらの多くは説明のために以下に記述されているが
、このような技術は文献においても十分に説明されている。

本明細書で使用される用語「抗体」とは、抗体断片ではなく、実質的に完全な形を持つ
抗体のことを指す。具体的には、本明細書における「抗体」は、好ましくは完全な形の抗
体であり、それぞれの２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）とからなり、これらの鎖
同士がジスルフィド結合及び非共有結合を介して連結されて４本のポリペプチド鎖からな
るモノマー分子が形成されるような、４本のポリペプチド鎖からなる対称構造を有する。

本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、完全な形の抗体の一部を含み、好まし
くは完全な形の抗体の抗原結合領域および/または可変領域である。抗体断片の例として
は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖ断片などが挙げられる。

本明細書で使用される用語「ヒト化抗体またはその抗原結合断片」とは、ヒト免疫グロ
ブリン（受容体抗体）を指し、その中で受容体由来ＨＶＲの残基は、マウス、ラット、ウ
サギまたは非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性、および／または能力を有する非
ヒト種（ドナー抗体）由来のＨＶＲの残基によって置換される。場合によっては、ヒト免
疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基によって置換さ
れる。また、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、受容体抗体またはドナー抗体に存在
しない残基を含むことができる。結合親和性などの抗体特性をさらに改善するために、こ
れらの修正を行うことができる。一般的に言えば、ヒト化抗体または抗原結合断片は、典
型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、少なくとも１つを含む。ここで、す
べてまたは実質的にすべての超可変ループは非ヒト免疫グロブリン配列のそれらに対応し
、かつすべてまたは実質的にすべてのＦＲドメインはヒト免疫グロブリン配列のそれらで
あるが、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性などの抗体性能を改善する１つまた
は複数の単独のＦＲ残基置換基を含むことができる。ヒト化抗体は、任意選択的に、典型
的にヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むこと
もできる。他の詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２
－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９
（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５
９３－５９６（１９９２）を参照されたい。さらに、例えば、ＶａｓｗａｎｉとＨａｍｉ
ｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１
５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ
２３：１０３５－１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅとＧｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）、および米国特許第６，９８２，３２１
号並びに米国特許第７，０８７，４０９号を参照されたい。

本明細書で使用される用語「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体に対応する
アミノ酸配列を有し、かつ／あるいはヒト抗体を製造するための技術のいずれかを用いて
調製される抗体である。ヒト抗体のこの定義からは、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗
体が明確に除外されている。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当
分野で知られている様々な技術を用いて作成することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍと
Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）。さらにヒトモノクローナル抗体の
作成に使用できるのは、Ｃｏｌｅら、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎ
ｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，７７ページ（１９８５）、
Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．,１４７（１）：８６－９５（１９９１）など
の文献に記載されている方法である。また、ｖａｎＤｉｊｋおよびｖａｎｄｅＷｉｎ
ｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．,５：３６８－７４（２００１）を
参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答するそのような抗体を産生するために修飾さ
れたが内在性遺伝子座が禁用されたトランスジェニック動物（例えば、免疫異種マウス）
に抗原を投与することによって調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ
技術に関する米国特許第６０７５１８１号および第６１５０５８４号を参照）。また、Ｌ
ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７－３５６２（
２００６）に開示されたヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって産生されたヒト抗体に関
する内容も参照されたい。

本明細書で使用される用語「ＣＤＲ」（すなわち相補性決定領域）は、カバットシステ
ムによって定義されるように、超可変領域のことを指すために使用される。Ｋａｂａｔら
、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎ
ｔｅｒｅｓｔ、バージョン５、ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉ
ｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９
９１）を参照されたい。またＣＤＲについては、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃ
ｏｎｔａｃｔなどの他の定義形式も存在する。

特に説明しない限り、本発明における免疫グロブリン残基の番号はカバット番号付けシ
ステムに従って番号付けたものである。

本明細書で使用される用語「Ｆｃドメイン」は一般にヒンジ領域、重鎖定常領域ＣＨ２
ドメイン、重鎖定常領域ＣＨ３ドメイン（すなわちヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を含む。Ｆ
ｃドメインは常にジスルフィド結合の形態として二量体を形成する。現在最も一般的に使
用されている融合パートナーは免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ断片であり、ただし、抗体Ｆ
ｃは抗体定常領域の一部である（ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、抗体定常領域のＣ
Ｈ１を含まない）。Ｆｃ断片と融合した後、分子量の増加、ＦｃＲｎ媒介の再循環メカニ
ズムにより融合分子の安定性が増加し、体内半減期が延長されるとともに、Ｆｃ断片を利
用してＡＤＣＣ、ＣＤＣなどの各種生物学的機能を媒介することができるが、このような
融合タンパク質は抗体の可変領域がなく、その薬理及び薬効が主にＦｃと融合した機能分
子に依存する。ヒト免疫グロブリンＧには４つの亜型があり、異なる免疫グロブリンＧ亜
型の生物学的活性が異なる。現在最も多く応用されているのはＩｇＧ１型抗体であり、近
年、新適応症の開拓、新作用機序抗体薬物の出現に伴い、細胞毒性の低いＩｇＧ２、Ｉｇ
Ｇ４亜型が重視されるようになっている。本発明において、前記「Ｆｃドメイン」は、Ｉ
ｇＧ１型抗体のＦｃドメインまたはＩｇＧ４型抗体のＦｃドメインであることが好まし
い。

本明細書で使用される用語「特異性」とは、抗原特定エピトープを選択的に識別する抗
原結合タンパク質または抗体を意味する。例えば、天然抗体は単特異的である。本明細書
で使用される用語「二重特異性」または「多重特異性」は、抗原結合タンパク質または抗
体が２つ以上の抗原結合部位を有することを意味し、その中の少なくとも２つの部位が異
なる抗原または同一抗原の異なるエピトープと結合する。

本明細書で使用される用語「二価」、「三価」、「四価」とは、「原子価」のことを指
し、すなわち抗原結合タンパク質または抗体分子中に存在する結合部位の所定数のことを
表す。従って、用語「二価」、「三価」、「四価」とは、抗原結合タンパク質または抗体
分子中にそれぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位が存在することを意
味する。

「ＶＨＨドメイン」（ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｏｆｈｅａｖｙｃｈａｉｎ
ｏｆｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＶＨＨ、ＶＨＨ抗体断片とも呼ば
れ、最初には「重鎖抗体」（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ、ｈｃＡｂ、す
なわち「軽鎖が欠損した抗体」）の抗原結合免疫グロブリン可変ドメインに由来した（Ｃ
．Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ、Ｔ．Ａｔａｒｈｏｕｃｈ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕ
ｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｄｅｖｏｉｄｏｆｌｉｇｈ
ｔｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ、１９９３年６月３日、Ｖｏｌ．３６３，ｐｐ．４４６
－４４８）。用語「ＶＨＨドメイン」は、このような可変ドメインを、２本の軽鎖および
２本の重鎖からなる従来の抗体（以下、「従来の抗体」と略称する）に存在する重鎖可変
ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と称する）と、従来の
抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン
」と称する）から区別することに用いられる。ＶＨＨドメインは、他の抗原結合ドメイン
をいらずに、特異的にエピトープと結合する（これは、従来の抗体においてＶＬドメイン
とＶＨドメインとの組み合わせによりエピトープを識別するという従来の抗体中のＶＨま
たはＶＬドメインとは逆である）。ＶＨＨドメインは単一免疫グロブリンドメインから形
成される抗原識別ユニットである。

本明細書では、用語「重鎖シングルドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎａｎｔ
ｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ」、「ＶＨＨ抗体断片」、「
ＶＨＨ抗体」、「ナノボディ」及び「ナノボディドメイン」を互換的に使用することがで
きる。

本明細書で使用される用語「相同性」は、シーケンスの最大相同性パーセントを達成す
るために配列アライメント、（必要であれば）ギャップ導入が行われた後、特定のペプチ
ドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基に対する候補配列中の同じアミノ酸残基のパ
ーセントを意味するが、シーケンス相同性の一部として保存的置換は考慮されない。アミ
ノ酸配列の相同性パーセントを決定するためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｂ
ＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ－（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア
のような、一般的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当分野の技術範囲
内で様々な方法で実行することができる。アライメントの測定に用いられる適切なパラメ
ータ、例えば比較シーケンスの全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な
任意のアルゴリズムなどは、当業者であれば決定することができる。

本明細書で使用される用語「治療」とは、臨床病理学的過程において治療される個体ま
たは細胞の自然プロセスを変更するように設計された臨床介入を指す。所望の治療効果と
しては、疾患の進行速度の低減、疾患状態の改善または緩和、および予後の緩和または改
善が挙げられる。例えば、治療される疾患または病症（例えば、癌、炎症または自己免疫
疾患など）に関連する１つまたは複数の症状の軽減または除去が挙げられる。

本明細書で使用される用語「有効量」とは、被験者の疾患または病症を治療するのに有
効な薬剤または薬物の量を意味する。癌の場合は、本出願による抗ＶＥＧＦシングルドメ
イン抗原結合断片、二重特異性抗体、多重特異性抗原結合構築体、医薬組成物、免疫コン
ジュゲートの有効量によれば、癌細胞の数を減らし、腫瘍のサイズを小さくし、癌細胞の
周辺器官への浸潤を抑制（すなわちある程度遅延、好ましくは阻害）し、腫瘍癌細胞の転
移を抑制（すなわちある程度遅延、好ましくは阻止）、ある程度で腫瘍の増殖を抑制し、
かつ／あるいは癌に関連する１つまたは複数の症状をある程度で緩和することができる。
臨床環境で理解されるように、医薬品、化合物または医薬組成物の有効量は他の医薬品、
化合物または医薬組成物と併用することにより実現されるか、実現されなくてもよい。し
たがって、１つ以上の治療剤を投与する場合には「有効量」を考慮することができ、かつ
１つ以上の他の薬剤と併用する場合には、有効量で単一の薬剤を提供することで所望の結
果を実現または達成することができると考えられる。

本明細書で使用される用語「被験者」は哺乳動物であることが好ましく、ヒト、ウシ、
ウマ、ネコ科動物、イヌ科動物、げっ歯動物、または霊長類が挙げられるが、これらに限
定されない。いくつかの実施形態では、前記個体はヒトである。

以下、実施例を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明するが、以下の実
施例が本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものとして解釈さ
れるべきではないことは、当業者に理解されるであろう。

［実施例１］
ＶＥＧＦを標的とするＶＨＨのスクリーニング及び開発
それぞれ５００μｇのヒト、マウスＶＥＧＦ－Ａタンパク質を等体積アジュバントと混
合して免疫原を調製し、２歳雌アルパカに２週間隔で４ラウンドの免疫接種を行った。免
疫後、高免疫血清を収集し、末梢血単核細胞を分離し、ＲＮＡを抽出した。ＲＴ－ＰＣＲ
によりナノボディの可変領域遺伝子を増幅した。次に、制限酵素で切断し、ライゲーショ
ン、エレクトロポレーションを行い、ＶＥＧＦ－Ａ免疫抗体ライブラリーを得た。

調製したＶＥＧＦ－Ａ免疫抗体ライブラリーについて、それぞれイムノチューブ固相パ
ンニングと磁気ビーズ液相スクリーニングとを用いてそれぞれ２ラウンドのパンニングを
行い、単一クローンを選択してＥＬＩＳＡ検出を行った。陽性クローンを配列決定し、最
終的に８１株の異なる抗体遺伝子を得た。こうして得られたすべての８１株の菌株に対し
てＶＨＨ－ＦｃのＤＮＡ断片を構築し、配列決定した後、２９３Ｔ細胞をトランスフェク
ションして真核発現を行い発現上清を収集して、ＥＬＩＳＡ特異性検出を行った。検出の
結果、（＃６）６号株はヒト及びマウスＶＥＧＦ－Ａの両方に対して優れた結合能を示す
唯一の抗体であることが分かった（下記表７及び表８を参照）。

菌株６（＃６）を配列決定した結果、そのアミノ酸配列は以下の通りである。
配列番号８［ＣＤＲ１－３を太字及び下線部で表示している（カバット番号）］
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTSTMSWYRQAPGKERELVAFITSAGATTNYADSVKDRFTMSRDNDKNT
VYLQMNVLKPEDTAMYYCRALVTLWNVYWGQGTQVTVSS

［実施例２］
ＶＥＧＦＶＨＨ初期シーケンスのヒト化及び安定性の最適化
６号株のＶＨＨの熱安定性及びヒト化程度をさらに高めるために、構造生物学に基づく
タンパク質構造シミュレーションと組み合わせて、５ラウンドの配列最適化及び修飾を行
い、良好な熱安定性及び高度なヒト化を有する２つのＶＨＨ配列を得た。
#6 (配列番号8):
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTSTMSWYRQAPGKERELVAFITSAGATTNYADSVKDRFTMSRDNDKNT
VYLQMNVLKPEDTAMYYCRALVTLWNVYWGQGTQVTVSS
#48 (配列番号13):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTSTMSWYRQAPGKERELVSFITSAGATTYYADSVKGRFTMSRDNSKNT
VYLQMNSLRAEDTAVYYCRALVTLWNVYWGQGTLVTVSS
#49 (配列番号14):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTSTMSWYRQAPGKERELVAFITSAGATTYYADSVKGRFTMSRDNSKNT
VYLQMNSLRAEDTAVYYCRALVTLWNVYWGQGTLVTVSS

＃４８シーケンスの場合、Ｑ１Ｅ＋Ｑ５ＬはＦＲ１領域に位置し、Ａ４９ＳはＦＲ２領
域に位置し、Ｎ５８Ｙ＋Ｄ６５ＧはＣＤＲ２領域に位置し、Ｄ７４Ｓ＋Ｖ（８２Ｂ）Ｓ＋
Ｋ８３Ｒ＋Ｐ８４Ａ＋Ｍ８９ＶはＦＲ３領域に位置し、Ｑ１０８ＬはＦＲ４領域に位置す
る。

＃４９シーケンスの場合、Ｑ１Ｅ＋Ｑ５ＬはＦＲ１領域に位置し、Ｎ５８Ｙ＋Ｄ６５Ｇ
はＣＤＲ２領域に位置し、Ｄ７４Ｓ＋Ｖ（８２Ｂ）Ｓ＋Ｋ８３Ｒ＋Ｐ８４Ａ＋Ｍ８９Ｖは
ＦＲ３領域に位置し、Ｑ１０８ＬはＦＲ４領域に位置する。

ＶＥＧＦ結合能及び熱安定性を測定した結果、＃４８、＃４９はいずれも＃６に匹敵す
る良好なＶＥＧＦ結合能を示した（図１を参照）。熱安定性を測定した結果、組み合わせ
変異配列は、熱安定性が１０℃程度向上し、Ｔｍ値がそれぞれ６４．１℃、６４．７°Ｃ
であった。

［実施例３］
候補二重特異性抗体分子構造のスクリーニング及び対照物質の構築
＃４８ＶＨＨ及び抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）またはペムブロ
リズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）の抗原結合領域断片をもとに、様々な二重特異性抗体構造
形式に対して評価及びスクリーニングを行った。活性化、発現量及び安定性などを総合的
に評価した後、図２に示す二重特異性抗体構造を用いることを決定した。また、＃１０、
＃１６の二重特異性抗体分子をさらに構築し評価した。原子価がいずれも二価＋二価（２
＋２）であり、Ｆｃが機能サイレントＩｇＧ１変異（ＡＥＡＳＳ）であった。構築された
分子のアミノ酸配列を下記表１８に示す。

対照として、ＰＤ－１及びＶＥＧＦを標的とする二重特異性抗体ＡＫ１１２アナログを
用いた（配列番号２５の重鎖アミノ酸配列及び配列番号２６の軽鎖アミノ酸配列から自社
で発現・調製したもの）。
配列番号25:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAY
LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEA
AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG
GGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRA
EDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDIN
TYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK
配列番号26:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP
EDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

［実施例４］
ヒトＰＤ－１とヒトＶＥＧＦとの結合
ＥＬＩＳＡ法により抗体とヒトＰＤ－１との結合を検出した。具体的には、１μｇ／ｍ
ＬのヒトＰＤ－１（アクロ社製、Ｈｉｓタグ）をＥＬＩＳＡプレートに一晩被覆しブロッ
キングし、二重特異性抗体サンプル及び対照抗体の段階希釈液を加えてインキュベートし
洗浄した。次に、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧＦｃ二次抗体を加えてインキュベートしてか
ら洗浄した。ＴＭＢ発色液を加えて発色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５
０吸光度を測定した（下記表１９を参照）。ＥＬＩＳＡ法により抗体とヒトＶＥＧＦとの
結合を検出するために、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ（アクロ社製、Ｈｉｓタグ）でＥ
ＬＩＳＡプレートを一晩被覆しブロッキングし、被験サンプルと対照抗体との段階希釈液
を加えてインキュベートし洗浄した。次に、プレートにＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧＦｃ二
重特異性抗体を加えてインキュベートし洗浄した。最後に、ＴＭＢ発色液を加えて発色さ
せた後、マイクロアプレートリーダーでＯＤ４５０吸光度を測定した（下記表２０を参
照）。ＥＬＩＳＡ検出の結果から明らかなように、＃１０、＃１６とヒトＰＤ－１との結
合能はオプジーボ及びキイトルーダに匹敵するが、更に高いＴｏｐシグナル及び対照ＡＫ
１１２アナログよりも更に強い結合能を示した。＃１０、＃１６とＶＥＧＦとの結合パタ
ーンは非常にユニークで、＃４８とＶＥＧＦとの結合能と比べて、＃１０、＃１６とＶＥ
ＧＦとの結合能がやや低下し、Ｔｏｐ吸光度が約＃４８の半分であったことから、構造生
物学に基づく最適化により＃１０、＃１６とＶＥＧＦとの結合状態が変化したので、より
多くの薬物濃縮を実現できたことが判明した。一方、ＡＫ１１２アナログの抗ＶＥＧＦ部
分にベバシズマブ抗体断片が使用され、ＶＥＧＦとの結合においてベバシズマブと類似す
る特徴が示された。（対照物質はすべて自社で発現・精製したもの）

［実施例５］
ヒトＶＥＧＦとヒトＰＤ－１との二重結合能
＃１０、＃１６及びＡＫ１１２アナログがヒトＶＥＧＦともヒトＰＤ－１とも結合する
二重結合能をさらに検証した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを５０ｎｇ／ｍＬのヒトＶ
ＥＧＦ（シノバイオロジカル社製、タグなし）で一晩被覆し、洗浄し、１時間ブロッキン
グした後、被験抗体の段階希釈液を加えて２時間インキュベートし続けた。次に、１μｇ
／ｍＬのヒトＰＤ－１（アクロ社製、Ｈｉｓタグ）を加えて２時間インキュベートし洗浄
した後、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体を加えて１時間インキュベートした。最後に、ＴＭＢ発
色液を加えて発色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍ吸光度を測定
した。その結果、下記表２１に示すように、単一標的抗体は２つの標的分子に同時に結合
できなかったが、＃１０、＃１６及びＡＫ１１２アナログはいずれもヒトＶＥＧＦ及びヒ
トＰＤ－１との二重結合能を有し、ＥＣ５０値がそれぞれ０．２７９ｎＭ、０．３２６ｎ
Ｍ、０．２５４ｎＭであった。

ＶＥＧＦ及びＰＤ－１結合の順序を変更してＥＬＩＳＡ二重検出を行った。９６ウェル
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１（アクロ社製、Ｈｉｓタグ）で一晩被
覆し、洗浄し、１時間ブロッキングした後、特異性抗体の段階希釈液を加えて２時間イン
キュベートした。次に、５０ｎｇ／ｍＬのビオチン標識ヒトＶＥＧＦ（アクロ社製、ビオ
チン化タンパク質）を加えて２時間インキュベートし、洗浄した後、ＨＲＰ標識ストレプ
トアビジンを加えて１時間インキュベートした。最後に、ＴＭＢ発色液を加えて発色させ
、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍ吸光度を測定した。その結果、下記表２
１に示すように、単一標的抗体は２つの標的分子に同時に結合できなかったが、＃１０、
＃１６及びＡＫ１１２アナログはいずれもヒトＰＤ－１及びヒトＶＥＧＦとの二重結合能
を有し、ＥＣ５０値がそれぞれ０．１１４ｎＭ、０．１１７ｎＭ、０．６３４ｎＭであっ
た。ＥＣ５０値の比較から、＃１０、＃１６はヒトＰＤ－１及びヒトＶＥＧＦとの二重結
合能力が、競合品ＡＫ１１２アナログよりも５～６倍優れていることが分かった。

［実施例６］
異種抗原との結合
ＥＬＩＳＡ法を用いて候補分子と異なる菌種の競合品抗原との結合を検出した。サル由
来のＶＥＧＦシーケンスはヒト化ＶＥＧＦシーケンスと全く一致し、候補抗体はサルＶＥ
ＧＦとの結合能がヒトＶＥＧＦとの結合能と同等であった。ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体と
サルＰＤ－１との結合を検出した。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍＬのサルＰＤ－１（
アクロ社製、Ｈｉｓタグ）で一晩被覆しブロッキングした後、被験サンプル及び対照抗体
の段階希釈液を加えてインキュベートし洗浄した。次に、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧＦｃ
の二重特異性抗体を加えてインキュベートし洗浄した。最後に、ＴＭＢ発色液を加えて発
色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０吸光度を測定した（下記表２２を
参照）。ヒトＰＤ－１との結合結果と一致しているように、＃１０、＃１６はサルＰＤ－
１との結合能がオプジーボ及びキイトルーダに匹敵し、競合品ＡＫ１１２アナログよりも
強かったことが示された。

［実施例７］
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合ブロック能力
被験抗体がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合をブロックする能力をさらに検証した。ＥＬ
ＩＳＡプレートを１μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１（アクロ社製、Ｆｃタグ）で一晩被覆し、
洗浄し、ブロッキングした後、段階希釈済みの抗体及びヒトＰＤ－Ｌ１（シノバイオロジ
カル社製、Ｈｉｓタグ）の混合液を加えて２時間インキュベートした。次に、ＨＲＰ標識
抗Ｈｉｓ抗体を加えて１時間インキュベートした。最後に、ＴＭＢ発色液を加えて発色さ
せた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０吸光度を測定した（下記表２３を参照
）。結果に示すように、ＶＥＧＦのみに結合した＃４８を除き、残りの抗体はいずれもＰ
Ｄ－１とＰＤ－Ｌ１との結合をブロックすることができ、かつブロック活性が同等であっ
た。

［実施例８］
ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２との結合のブロック能力
被験抗体がＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２との結合をブロックする能力を検
証した。ＥＬＩＳＡプレートをそれぞれ２μｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦＲ１と５μｇ／ｍＬ
のヒトＥＧＦＲ２（自社で構築・発現したもの、Ｆｃタグ）で一晩被覆した後、洗浄し、
ブロッキングした後、それぞれ段階希釈済みの抗体とヒトＶＥＧＦ（アクロ社製、ビオチ
ン化タンパク質）との混合液を加えて２時間インキュベートし洗浄した。次に、それぞれ
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加えて１時間インキュベートした。最後に、ＴＭＢ発色
液を加えて発色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍ吸光度を測定し
た。その結果、♯１０、♯１６はＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ１との結合をブロックする能力が
さらに強く、ＩＣ５０値がそれぞれ０．４９１ｎＭ、０．５０７ｎＭで、♯４８のブロッ
ク能力より優れていることから、構築された二重特異性抗体の空間構造変化による優位性
が示された。競合品ＡＫ１１２アナログはブロック能力がベバシズマブのブロック能力に
匹敵し、ＩＣ５０値がそれぞれ４．６１０ｎＭ、５．６４７ｎＭであった。また、検出の
結果、♯１０、♯１６はＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ２との結合をブロックする能力がさらに強
く、ＩＣ５０値がそれぞれ３．６４３ｎＭ、３．２４９ｎＭで、＃４８のブロック能力（
ＩＣ５０値が５．８４１ｎＭ）より優れていることから、二重特異性抗体の空間構造変化
による優位性が示された。一方、競合品ＡＫ１１２アナログはブロック能力がベバシズマ
ブのブロック能力に匹敵し、ＩＣ５０値がそれぞれ６．４８１ｎＭ、６．６３７ｎＭであ
った。

［実施例９］
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）法を用いたＰＤ－１ブロック後のＴ細胞の反応の検証
被験候補分子及び競合品ＡＫ１１２アナログの機能を細胞レベルでさらに比較した。Ｐ
Ｄ－１ブロック後のＴ細胞の反応を混合リンパ球反応（ＭＬＲ）法により検証した。１つ
のドナー由来の２×１０⁴個のＤＣ細胞と別のドナー由来の２×１０⁵個のＣＤ４＋Ｔ細胞
を等体積で混合し、段階希釈済みの被験抗体を加えて７２時間培養した後、細胞培養上清
を収集し、ＥＬＩＳＡ定量キットを用いて細胞上清中から放出されたＩＬ－２（図３）及
びＩＦＮγ（図４）の含有量を測定した。その結果、＃１０、＃１６によって促進された
ＭＬＲ反応におけるＣＤ４＋Ｔ細胞放出のＩＬ－２及びＩＦＮγの含有量が競合品ＡＫ１
１２アナログによる量より高かったから、＃１０、＃１６はＴ細胞に与える影響がより強
いことが示された。

［実施例１０］
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖抑制試験を用いた、被験抗体がＶＥＧＦによるＨＵＶ
ＥＣ細胞増殖への刺激を阻害する能力の検証
９６ウェル細胞プレートの上で１％ＦＢＳを含有する培地中に５×１０³個のＨＵＶＥ
Ｃ細胞／ウェルを加え、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベータで一晩培養した。翌日
、培地を除去し、７０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ及び段階希釈済みの被験抗体並びに競合品Ａ
Ｋ１１２アナログを加えた。反応プレートを３７℃、５％二酸化炭素のインキュベータに
入れて４日間培養した後、ＣＴＧ試薬を加えてマイクロプレートリーダーで相対蛍光信号
値を測定した。１％ＦＢＳを含有するＥＣＭ培地及びＶＥＧＦ刺激を加えた細胞群（無抗
体）の蛍光値は阻害率０に対応することとして定義し、ＰＢＳのみ加えた群（１％ＦＢＳ
を含有するＥＣＭ培地がなく、ＶＥＧＦ刺激及び抗体も添加しなかった）の蛍光値は１０
０％阻害率と定義した。そして、相対阻害率を曲線としてフィッティングした。図５に示
すように、＃１０、＃１６の最大阻害率は約６０％であったのに対して、競合品ＡＫ１１
２アナログの最大阻害率は約４０％であったから、＃１０、＃１６の阻害率が競合品ＡＫ
１１２アナログよりも高かった。

［実施例１１］
ＨＵＶＥＣ細胞遊走への阻害能力
ポアサイズが８μｍのトランスウェルチャンバを使用して、抗体がＨＵＶＥＣ細胞遊走
を阻害する能力を検出した。トランスウェルは上側チャンバと下側チャンバとからなる。
５×１０³個のＨＵＶＥＣ細胞／ウェルを上側チャンバに加えて、３７℃、５％二酸化炭
素のインキュベータで３０分間培養した。次に、２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと異なる濃
度の被験抗体及び競合品ＡＫ１１２アナログを下側チャンバに加え、各群に３レプリケー
トウェルを設け、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベータで２４時間培養した。次に、
４％パラホルムアルデヒドで固定化した後、クリスタルバイオレットで染色した。写真撮
影後、上側チャンバの裏面に遊走した細胞数をカウントした。細胞数が少ないほど阻害率
が高いということで、図６の結果は、＃１０、＃１６は競合品ＡＫ１１２アナログよりも
阻害率が高いことを示した。

［実施例１２］
抗体濃縮増加の特性
構造生物学的シミュレーションから、＃１０の立体配座により抗ＶＥＧＦナノ抗体とＶ
ＥＧＦとの結合パターンが変化する可能性があり、二量体ＶＥＧＦタンパク質によって抗
体の濃縮を行うことができることが明らかになった。＃１０による抗体濃縮増加の特性を
検証するために、ヒトＶＥＧＦタンパク質にカップリングされた磁気ビーズ（アクロ社製
）をＰＢＳでそれぞれ２５０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬまで希釈
し、それぞれ１０ｎＭの＃１０、＃１６及び競合品ＡＫ１１２アナログを加えて１時間イ
ンキュベートした後、磁石上にセットし２分間吸着させ、上清を吸引し、ＥＬＩＳＡ法に
よるタンパク質の定量化を行った。その結果、図７に示すように、＃１０、＃１６の残留
抗体量が競合品ＡＫ１１２アナログの量よりも少なかったことから、ＶＥＧＦを含有する
磁気ビーズによって濃縮された二重特異性抗体がより多かったことが明らかになった。ま
た、抗体とＶＥＧＦとの架橋の程度を検証するためにＥＬＩＳＡ定量化試験を行い、まず
抗体をＶＥＧＦ磁気ビーズに架橋させ、次に、ＥＬＩＳＡ法により架橋されていない残留
抗体量を検出した。その結果、＃１０、＃１６は競合品ＡＫ１１２アナログと比べて、Ｖ
ＥＧＦとの架橋度がより高かったことが示された。構造生物学的シミュレーションの結果
と互いに裏付けられるように、腫瘍局所におけるＶＥＧＦの高発現によって腫瘍局所にお
ける濃縮を図すことができ、＃１０、＃１６二重特異性抗体の差異化特徴及び治療潜在力
も示された。

［実施例１３］
動物モデルにおける薬効評価
マウスモデルにおける被験抗体の薬効を評価するために、ヒトＰＤ－１を導入したＢａ
ｌｂ／ｃマウスを選択し、野生型ＣＴ２６腫瘍細胞（結腸癌細胞）を接種した。ベバシズ
マブ及びＡＫ１１２アナログはいずれもマウスＶＥＧＦに結合しないため、この２群を除
外とし、ヒトＶＥＧＦ及びマウスＶＥＧＦに結合できるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（ＶＥＧＦＲ
１の第２のドメイン、ＶＥＧＦＲ２の第３のドメイン、およびヒトＩｇＧＦｃからなる融
合タンパク質）を対照群として、計６群を設計した。実験設計、投与量及び投与経路など
を下記表２４に示す。

図８に示すように、＃１０、＃１６による担癌マウスの腫瘍阻害率はそれぞれ５７％、
６２％であり、オプジーボ単剤治療群（２０％）及びＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ単剤治療群（４
５％）の腫瘍阻害率より高く、オプジーボとＶＥＧＦ－Ｔｒａｐとの併用治療群（５６％
）の腫瘍阻害率と同等であった。１４日目には、＃１０、＃１６治療群の平均腫瘍体積が
併用治療群よりわずかに小さかった。また、マウスの体重変化が腫瘍増殖の傾向と一致し
た。１４日目には、＃１０、＃１６治療群の体重変化が１０％以内であったことから、＃
１０、＃１６は良好な薬効作用及び安全性を有することが明らかになった。

［実施例１４］
免疫再構築したヒト悪性黒色腫皮下移植モデルにおける＃１０分子の相乗作用研究
免疫再構築したヒト悪性黒色腫モデルにおける＃１０の相乗作用研究を評価するために
、免疫不全マウスＢ－ＮＤＧを選択し、ヒトＰＤ－Ｌ１を導入したＡ３７５腫瘍細胞（悪
性黒色腫細胞）を接種し、ヒト末梢血単核細胞（ｈｕＰＢＭＣ）を接種して担癌マウスの
免疫系を再構築した。抗ＰＤ－１薬であるオプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）、抗ＶＥＧＦ薬で
あるベバシズマブ、＃４８を単一標的対照群として、ＡＫ１１２アナログ（ＡＫ１１２
ａｎａｌｏｇ、自社で発現・調製したもの）を＃１０の対照薬として、計８群を設計した
。実験設計、投与量及び投与経路を下記表２５に示す。

２１日目に検出したところ、この実験システムにおいて、オプジーボ単剤治療群は抗腫
瘍作用を示さなかったこと、＃１０は腫瘍阻害率ＴＧＩ＝７３％であり、腫瘍抑制レベル
がベバシズマブ単剤治療群（ＴＧＩ＝５３％）、＃４８単剤治療群（ＴＧＩ＝５７％）、
オプジーボと＃４８との併用治療群（ＴＧＩ＝５０％）より有意に高く、またオプジーボ
とベバシズマブとの併用治療群（ＴＧＩ＝６８％の腫瘍阻害率を基準としたとき、＃１０
分子による腫瘍相対阻害率が７％向上した）、およびＡＫ１１２アナログ（ＴＧＩ＝６４
％の腫瘍阻害率を基準としたとき、＃１０分子による腫瘍相対阻害率が１４％向上した）
よりも優れたことが明らかになった。その結果、本発明の二重特異性抗体は相乗作用が生
じ、対照分子より顕著な優位性を有することが明らかになった。

なお、以上に開示されたのは、本発明のいくつかの実施例に過ぎず、いかなる形で本発
明を限定するものではない。本発明は各実施形態に限定されないことは当業者であれば理
解されるであろう。当業者にとって本発明の原理から逸脱せずにいくつかの改良および修
正を行う可能性があるが、これらの改良および修正も本発明の請求項の保護範囲内に収ま
る。

Claims

以下のアミノ酸配列で特定されるＣＤＲ１～３を含む、ＶＥＧＦを標的とするＶＨＨドメインであって、
前記ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列と一致しており、
前記ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号２で示されるアミノ酸配列と比べて１個または２個のアミノ酸変異を有し、
前記ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３で示されるアミノ酸配列と一致しており、
好ましくは、前記ＣＤＲ２における変異の部位が５８位および／または６５位にあり、
好ましくは、前記ＣＤＲ２における変異がＮ５８Ｙ変異および／またはＤ６５Ｇ変異であり、
好ましくは、前記ＶＨＨドメインがヒト化ＶＨＨドメインであり、
好ましくは、前記ＶＨＨドメインが、
１）配列番号４で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号４で示されるアミノ酸配列と比べて１個または２個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ１、および／または
２）配列番号５で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号５で示されるアミノ酸配列と比べて１個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ２、および／または
３）配列番号６で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号６で示されるアミノ酸配列と比べて１～５個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ３、および／または
４）配列番号７で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号７で示されるアミノ酸配列と比べて１個のアミノ酸変異を有するフレームワーク領域ドメインＦＲ４をさらに含み、
好ましくは、ＦＲ１ドメインにおける前記１個または２個のアミノ酸変異は、１位および／または５位にあり、さらに好ましくはＱ１Ｅおよび／またはＱ５Ｌ変異であり、
好ましくは、ＦＲ２ドメインにおける前記１個のアミノ酸変異は、４９位にあり、さらに好ましくはＡ４９Ｓ変異であり、
好ましくは、ＦＲ３ドメインにおける前記１～５個のアミノ酸変異は、７４位、８２Ｂ位、８３位、８４位及び８９位から選ばれる１または２または３または４または５個であり、さらに好ましくはＤ７４Ｓ、Ｖ（８２Ｂ）Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｐ８４Ａ及びＭ８９Ｖから選ばれる１位または２位または３位または４位または５位にあり、
好ましくは、ＦＲ４ドメインにおける前記１個のアミノ酸変異は、１０８位にあり、さらに好ましくはＱ１０８Ｌであり、
好ましくは、前記ＶＨＨドメインが、
１）配列番号４または配列番号９で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワーク領域ドメインＦＲ１、および／または
２）配列番号５または配列番号１０で示されるアミノ酸配列と一致しているフレームワーク領域ドメインＦＲ２、および／または
３）配列番号６または配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域ドメインＦＲ３、および／または
４）配列番号７または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域ドメインＦＲ４
をさらに含み、
好ましくは、前記ＶＨＨドメインが、以下のアミノ酸で特定されるフレームワーク領域の組み合わせ：
１）配列番号４で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ２、配列番号６で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ３、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ４；
２）配列番号９で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ２、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ３、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ４；
３）配列番号９で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ２、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ３、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列と一致しているＦＲ４
を含む、
ことを特徴とするＶＨＨドメイン。
前記ＶＨＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号８で示されるアミノ酸配列と一致しているか、あるいは配列番号８で示されるアミノ酸配列と比べて１～１１個のアミノ酸変異を有し、
好ましくは、前記アミノ酸変異の部位が１位、５位、４９位、５８位、６５位、７４位、８２Ｂ位、８３位、８４位、８９位及び１０８位から選ばれ、
好ましくは、前記アミノ酸変異がＱ１Ｅ、Ｑ５Ｌ、Ａ４９Ｓ、Ｎ５８Ｙ、Ｄ６５Ｇ、Ｄ７４Ｓ、Ｖ（８２Ｂ）Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｐ８４Ａ、Ｍ８９Ｖ、Ｑ１０８Ｌから選ばれる１～１１個であり、
好ましくは、前記変異が以下の変異の組み合わせ：
１）Ｑ１Ｅ＋Ｑ５Ｌ＋Ａ４９Ｓ＋Ｎ５８Ｙ＋Ｄ６５Ｇ＋Ｄ７４Ｓ＋Ｖ（８２Ｂ）Ｓ＋Ｋ８３Ｒ＋Ｐ８４Ａ＋Ｍ８９Ｖ＋Ｑ１０８Ｌ
２）Ｑ１Ｅ＋Ｑ５Ｌ＋Ｎ５８Ｙ＋Ｄ６５Ｇ＋Ｄ７４Ｓ＋Ｖ（８２Ｂ）Ｓ＋Ｋ８３Ｒ＋Ｐ８４Ａ＋Ｍ８９Ｖ＋Ｑ１０８Ｌ
であり、
好ましくは、前記ＶＨＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１３または配列番号１４で示されるアミノ酸配列と一致している、ことを特徴とする請求項１に記載のＶＨＨドメイン。
組換えタンパク質の構築に用いられる請求項１又は２に記載のＶＨＨドメイン。
請求項１又は２に記載のＶＨＨドメインを含み、
好ましくは、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又は抗体薬物コンジュゲートである、ことを特徴とする組換えタンパク質。
請求項１又は２に記載のＶＨＨドメイン、または請求項４に記載の組換えタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
請求項６に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノム上に請求項５に記載のポリヌクレオチドが統合された、宿主細胞。
請求項１または２に記載のＶＨＨドメイン、または請求項４に記載の組換えタンパク質、及びその薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
請求項１または２に記載のＶＨＨドメイン、または請求項４に記載の組換えタンパク質を含む癌治療用薬であって、
好ましくは前記癌が結腸・直腸癌である癌治療用薬。