JP2025510239A - 植物細胞小器官ｄｎａのアデニンをグアニンに塩基校正する方法 - Google Patents

植物細胞小器官ｄｎａのアデニンをグアニンに塩基校正する方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2025510239000001
本発明は、植物細胞小器官ＤＮＡの塩基校正用組成物、特に、植物細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニンに校正するための組成物及び校正方法に関する。

Description

本発明は、植物細胞小器官ＤＮＡの塩基校正用組成物、特に、植物細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニンに校正するための組成物及び校正方法に関する。
ＤＮＡ結合タンパク質と脱アミノ酵素とが連結された融合タンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成することなく、ゲノムで標的化されたヌクレオチド置換又は塩基校正（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）を行うか、遺伝的障害を誘発する点突然変異を校正するか、原核細胞、ヒト及び他の真核細胞に目的とする単一ヌクレオチド変異を導入するように標的化された方式（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｎｎｅｒ）で単一ヌクレオチド転換を可能にする。
ＺＦＮ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）システム、及び核酸分解効率がないクリスパー関連タンパク質９（Ｃａｓ９）変異体及び塩基脱アミノ酵素タンパク質の塩基校正技術などのプログラム（設定）ゲノム校正道具は、塩基配列の変化を通じて植物の遺伝的研究及び作物形質の改善のために発展してきた。しかし、これらの道具は、ミトコンドリア及び葉緑体を含む植物器官のＤＮＡ配列を校正するのに適していないが、その主な理由は、ガイドＲＮＡを小器官に伝達するか、二つの化合物を小器官で同時に発現することが難しいためである。植物細胞小器官は、光合成及び呼吸に必要な多くの必須な遺伝子を暗号化している。このような小器官の遺伝子を校正する方法や道具は、このような遺伝子の機能研究や作物生産性及び形質改善において非常に必要である。例えば、ミトコンドリアａｔｐ６遺伝子の標的突然変異が繁殖に有用な特性である雄性不妊を誘発し得ると共に、葉緑体ゲノムの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定の点突然変異が抗生剤耐性を誘発し得る。
バクテリア毒素ＤｄｄＡｔｏｘは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａから由来したバクテリア毒素の酵素機能を担当する部分であって、二重らせんＤＮＡのシトシンを脱アミノ化することができる。脱アミノ酵素の例示として、ＤｄｄＡｔｏｘが細胞に対して毒性を有するので、宿主細胞での毒性を避けるために、ＤｄｄＡｔｏｘは、二つの非活性化された分割体（ｓｐｌｉｔ）に分けて使用するが、それぞれの半体は、ＤＮＡに結合できるように考案されたＤＮＡ結合タンパク質に連結し、機能を備えたＤｄＣＢＥペアとして使用することができる。
このような技術的な背景の下で、植物細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニンに校正できることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ＤＮＡ結合タンパク質、分離された形態のシトシン脱アミノ酵素及びアデニン脱アミノ酵素又はこれをコードする核酸を含む植物細胞小器官ＤＮＡのアデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）塩基校正用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、植物細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）に校正する方法を提供すことにある。
本発明の目的は、前記方法によって葉緑体ｐｓｂＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、除草剤抵抗性植物を提供することにある。
本発明の目的は、前記方法によって１６ｓ ｒＲＮＡのアデニン塩基がグアニンに校正された、スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｅ）抵抗性植物を提供することにある。
本発明の目的は、前記方法によってｐｓａＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、アルビノ表現型を有する植物を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質又はこれをコードする核酸；シトシン脱アミノ酵素（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）から由来した第１分割体及び第２分割体又はこれをコードする核酸；及びアデニン脱アミノ酵素又はこれをコードする核酸；を含み、前記第１分割体及び第２分割体は、それぞれ前記ＤＮＡ結合タンパク質に結合される形態である、植物細胞小器官ＤＮＡのアデニン塩基校正用組成物を提供する。
また、本発明は、前記組成物を植物細胞に処理する段階を含む植物細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニンに校正する方法を提供する。
また、本発明は、前記方法によってＧＴＴＧＡＡＡＧＣ配列を含む葉緑体ｐｓｂＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、アトラジン（Ａｔｒａｚｉｎｅ）除草剤抵抗性植物に関する。
本発明は、前記方法によってＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡ配列を含む１６ｓ ｒＲＮＡのアデニン塩基がグアニンに校正された、スペクチノマイシン抵抗性植物に関する。
本発明は、前記方法によってＡＴＧを含むｐｓａＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、アルビノ表現型を有する植物に関する。
ＤｄｄＡｔｏｘとアデニン脱アミノ酵素（Ａｄｅｎｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）をＴＡＬＥに結合した校正器に対する模式図である。
塩基校正しようとするレタス（Ｌｅｔｔｕｃｅ）のｐｓｂＡ位置を示した図である。
ｍＲＮＡを伝達し、培養を通じてカルス（Ｃａｌｌｕｓ）を確保した後、アデニン塩基校正効率を確認した結果を示した図である。
レタスプロトプラスト（Ｌｅｔｔｕｃｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）に試験管合成したｍＲＮＡを伝達し、７日後にアデニン塩基校正効率を確認した結果を示した図である。
ｍＲＮＡを伝達し、培養を通じてカルスを確保した後、アデニン塩基校正効率を確認した結果を示した図である。
多くの植物のｐｓｂＡ ＤＮＡシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）アライン結果を示した図である。
別の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
植物細胞の小器官ＤＮＡの塩基校正としては、ＤｄｄＡｔｏｘをＴＡＬＥと結合し、シトシンをチミンに校正する方法のみが存在していた。本発明に係る技術的課題は、ＤｄｄＡｔｏｘとアデニン脱アミノ酵素をＴＡＬＥに結合し、細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニンに塩基校正しようとする。既存には不可能であった細胞小器官ＤＮＡのアデニンの塩基校正により、除草剤抵抗性を有する植物などの機能性植物を開発することができる。
本出願の発明者等は、ＤＮＡに結合できるＴＡＬＥ又はＺＦＰタンパク質にＤｄｄＡｔｏｘシトシン脱アミノ酵素とＡ－ｔｏ－Ｇ転換（Ａ ｔｏ Ｇ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を起こし得るアデニン脱アミノ酵素を連結し、Ａ塩基を校正可能な塩基校正器（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ）を製作した。
既存のＤｄｄＡｔｏｘを活用した脱アミノ酵素（ＤｄＣＢＥ）の場合、ＤＮＡ結合モジュール（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ）としてＴＡＬＥリピート（ｒｅｐｅａｔ）を使用するシトシン脱アミノ酵素である。Ｃ－ｔｏ－Ｔ転換のみを起こすＤｄＣＢＥとは異なり、ＤｄＡＢＥはＡ－ｔｏ－Ｇ転換を起こし得るので、他の変異パターンを作り出すことができる。
ＤｄＡＢＥは、それ自体で二本鎖ＤＮＡを認識し、脱アミノ化を起こすので、ＲＮＡなどの付加的なコンポーネントがない。ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）や葉緑体（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）などの場合、ＲＮＡを伝達するメカニズムが知られていないので、クリスパーシステム（Ｃｒｉｓｐｒ ｓｙｓｔｅｍ）を適用することができなかった。しかし、このようなコンポーネントがないＤｄＡＢＥは、細胞内のゲノムＤＮＡを標的化できるだけでなく、ミトコンドリアや葉緑体などの小器官のＤＮＡを標的化し、特定のＤＮＡのＡ－ｔｏ－Ｇ転換を起こし得る。
ＤｄＡＢＥは、必要に応じて、分割体となったＤｄｄＡｔｏｘを使用することもでき、全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）のＤｄｄＡｔｏｘ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を使用することもできるので互換性が高い。
本明細書における「校正」は、「編集」と相互互換的に使用可能であり、特異的ゲノム標的の選択的欠失によって核酸配列を変更させる方法を意味する。このような特異的ゲノム標的は、染色体領域、遺伝子、プロモーター、オープンリーディングフレーム又は任意の核酸配列を含むが、これに制限されない。
本明細書で使用される「単一塩基」は、核酸配列内の一つ、及びただ一つのヌクレオチドを意味する。単一塩基校正の脈絡で使用されるとき、これは、核酸配列内の特異的位置の塩基が相違する塩基に置換されることを意味する。このような置換は、制限なしに置換又は変形を含む、多くのメカニズムによって起こり得る。
本明細書で使用される「標的」又は「標的部位」は、任意の組成及び／又は長さの事前に確認された核酸配列を意味する。このような標的部位は、染色体領域、遺伝子、プロモーター、オープンリーディングフレーム又は任意の核酸配列を含むが、これに制限されない。
本明細書で使用される「オン－ターゲット」は、プログラム可能なＤＮＡ結合領域及び／又は単一ガイドＲＮＡ配列と完全に相補的であり得る特異的ゲノム標的の下位配列を意味する。
本明細書で使用される「オフ－ターゲット」は、プログラム可能なＤＮＡ結合領域及び／又は単一ガイドＲＮＡ配列と部分的に相補的であり得る特異的ゲノム標的の下位配列を意味する。
本発明は、シトシン脱アミノ酵素又はその変異体から由来する第１分割体及び第２分割体を含み、前記第１分割体及び第２分割体は、それぞれ前記ＤＮＡ結合タンパク質に結合される形態を有する。
前記シトシン脱アミノ酵素は、アミノ基離脱酵素であって、シトシン（Ｃ）をウリジン（Ｕ）に転換させることができる。
前記シトシン脱アミノ酵素が使用され得る。前記シトシン脱アミノ酵素として、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ １）及びＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）の形態が存在するが、ほとんどのＤＮＡ脱アミノ酵素は、一本鎖ＤＮＡにのみ作動し、ＤＮＡ結合タンパク質に連結して塩基校正するのに適していない場合がある。具体的には、前記シトシン脱アミノ酵素は、二本鎖ＤＮＡに作用する脱アミノ酵素（ＤｄｄＡ）又はそのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）から由来したものであり得る。さらに具体的には、前記シトシン脱アミノ酵素は、二本鎖ＤＮＡ特異的バクテリアシトシン脱アミノ酵素であり得る。
前記シトシン脱アミノ酵素は、分割された形態であって、前記シトシン脱アミノ酵素は、分離された第１分割体及び第２分割体を含み、前記第１分割体と第２分割体のそれぞれは脱アミノ酵素活性を有さない。
全長シトシン脱アミノ酵素は、ｔｏｘ分割体に該当する配列番号１の配列を含むことができる。前記シトシン脱アミノ酵素は、第１分割体及び第２分割体を含み、前記第１分割体と第２分割体のそれぞれは脱アミノ酵素活性を有さない。
［配列番号１］
ＧＳＹＡＬＧＰＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＤＡＧＧＬＥＳＫＶＦＳＳＧＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＥＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＡＫＭＴＶＶＰＰＥＧＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＫＶＦＴＧＮＳＮＳＰＫＳＰＴＫＧＧＣ
一つの実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体又は第２分割体は、配列番号１の配列のうち、Ｎ－末端からＧ３３、Ｇ４４、Ａ５４、Ｎ６８、Ｇ８２、Ｎ９８、及びＧ１０８からなる群から選ばれる一つ以上までの配列を含むことができる。前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体又は第２分割体は、配列番号１の配列のうち、Ｇ３４、Ｐ４５、Ｇ５５、Ｎ６９、Ｔ８３、Ａ９９、及びＡ１０９からなる群から選ばれる一つ以上からＣ－末端までの配列を含むことができる。
具体的には、前記シトシン脱アミノ酵素は、配列番号２の第１分割体（Ｇ１３３３－Ｎ）及び配列番号３の第２分割体（Ｇ１３３３－Ｃ）を含むか、配列番号４の第１分割体（Ｇ１３９７－Ｎ）及び配列番号５の第２分割体（Ｇ１３９７－Ｃ）を含むか、配列番号２の第１分割体（Ｇ１３３３－Ｎ）及び配列番号５の第２分割体（Ｇ１３９７－Ｃ）を含むか、配列番号４の第１分割体（Ｇ１３９７－Ｎ）及び配列番号２の第２分割体（Ｇ１３３３－Ｃ）を含むことができる。
（配列番号２）Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＤｄｄＡｔｏｘ Ｇ１３３３－Ｎ
ＧＳＹＡＬＧＰＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＤＡＧＧＬＥＳＫＶＦＳＳＧＧ
ＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＡＧＴＧＣＴＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＣＣＡＡＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＧ
（配列番号３）Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ Ｇ１３３３－Ｃ
ＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＥＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＡＫＭＴＶＶＰＰＥＧＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＫＶＦＴＧＮＳＮＳＰＫＳＰＴＫＧＧＣ
ＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＣＴＡＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＧＣＡＴＴＡＧＣＧＡＡＧＧＧＣＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＧＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＣＧＴＡＣＣＡＣＣＣＧＡＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＣＧＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＴＴＧＣ
（配列番号４）Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＤｄｄＡｔｏｘ Ｇ１３９７－Ｎ
ＧＳＹＡＬＧＰＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＤＡＧＧＬＥＳＫＶＦＳＳＧＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＥＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＡＫＭＴＶＶＰＰＥＧ
ＧＧＴＡＧＣＴＡＣＧＣＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＧＣＡＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＡＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＴＣＧＧＧＡＣＣＴＴＴＴＡＣＴＡＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＧＴＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＧＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＧＣＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧＴＣＴＴＣＣＡＴＡＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＡＣＴＴＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＴＧＴＣＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣ
（配列番号５）Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＤｄｄＡｔｏｘ Ｇ１３９７－Ｃ
ＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＫＶＦＴＧＮＳＮＳＰＫＳＰＴＫＧＧＣ
ＧＣＣＡＴＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＣＴＣＴＡＡＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＧＧＴＧＴ
組み合わされたＧ１３３３Ｎ、Ｇ１３３３Ｃ、Ｇ１３９７Ｎ及びＧ１３９７Ｃは、分割形態の脱アミノ酵素として使用可能であり、具体的には、Ｌｅｆｔ－Ｇ１３３３－Ｎ＋Ｒｉｇｈｔ－Ｇ１３３３ －Ｃ、Ｌｅｆｔ－Ｇ１３９７－Ｎ＋Ｒｉｇｈｔ－Ｇ１３９７－Ｃ、Ｌｅｆｔ－Ｇ１３９７－Ｎ＋Ｒｉｇｈｔ－Ｇ１３３３－Ｃ、又はＬｅｆｔ－Ｇ１３３３－Ｎ＋Ｒｉｇｈｔ－Ｇ１３９７－Ｃの形態で使用され得る。
前記ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）アレイ又はこれらの組み合わせであり得る。
前記ジンクフィンガータンパク質のジンクフィンガーモチーフは、ＤＮＡ結合ドメインを有し、フィンガーのｃ－末端部分は、ＤＮＡ配列を特異的に認識する。３個～６個のジンクフィンガーモチーフを含むＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ配列を認識する。
一つの実施例において、前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体及びシトシン脱アミノ酵素の第２分割体のそれぞれは、ジンクフィンガータンパク質のＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。
シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体Ｎ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＣ－末端が結合（ＣＣ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）するか；
シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＮ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＣ－末端が結合（ＮＣ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）するか；
シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端が結合（ＣＮ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）するか；又は
シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＮ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端が結合（ＮＮ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）することができる。
前記ＺＦ－Ｌｅｆｔは、次の配列を含むことができる：
ＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＮＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＩＳＳＮＬＮＳＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲ。
前記ＺＦ－Ｒｉｇｈｔは、次の配列を含むことができる：
ＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＳＶＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＫＩＮＬＱＶＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＶＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＲＮＨＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲ。
ＺＦは、ＤＮＡターゲットによって配列が変わり得る。ＺＦは、ＤＮＡターゲット配列によってカスタマイズ製作され得る。ＺＦは、ＤＮＡ ３ｂｐを認識するので、普通、３個～６個のＺＦをつなぎ合わせ、９～１８ｂｐのＤＮＡを認識するＺＦ組み合わせを製作することができ、例えば、ＧＮＮ、ＴＮＮ、ＣＮＮ又はＡＮＮなどのモジュールが含まれたライブラリを用いて製作することができる。
場合に応じて、前記ジンクフィンガータンパク質は、リンカーを介して脱アミノ酵素と連結され得る。前記リンカーは、２個～４０個のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーであり得る。前記リンカーは、例えば、２ａａ、５ａａ、１０ａａ、１６ａａ、２４ａａ又は３２ａａの長さのリンカーなどであり得るが、これに制限されるものではない。
一つの実施例において、前記リンカーは、次を含むことができる：
２ａ．ａリンカー：ＧＳ
５ａ．ａリンカー：ＴＧＥＫＱ
１０ａ．ａリンカー：ＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦ
１６ａ．ａリンカー：ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ
２４ａ．ａリンカー：ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ、又は
３２ａ．ａリンカー：ＧＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ。
本発明に係る具体的な実施例において、分割脱アミノ酵素とジンクフィンガータンパク質とがリンカーを介して連結され得る。また、第１分割体を含む半分の脱アミノ酵素のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質が結合し、第２分割体を含む半分の脱アミノ酵素のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質が結合する。このとき、左側と右側のＺＦＰが付く部分の間であるスペーサーでＣからＴへの塩基転換が起こり得る。左側と右側のＺＦＰが、いずれも２４ａ．ａリンカーを介して第１分割体を含む半分の脱アミノ酵素及び第２分割体を含む半分の脱アミノ酵素のそれぞれと連結される場合、高い校正効率を示すことを確認した。
前記ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）は、３３個から３４個のアミノ酸配列が繰り返された形態からなっており、約９個のドメイン（ＲＶＤ、Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｄｏｍａｉｎ）が繰り返される。前記ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）は、一つのドメイン当たりに一つのヌクレオチドを認知することができ、１２番目～１３番目のアミノ酸配列によって特異的なＤＮＡ配列と結合することができる（ＨＤ－＞Ｃｙｔｏｓｉｎｅ、ＮＩ－＞Ａｄｅｎｉｎｅ、ＮＧ－＞Ｔｈｙｍｉｎｅ、ＮＮ－＞Ｇｕａｎｉｎｅ）。ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）は、標的部位内の一本鎖ＤＮＡを認識する。標的部位の間の距離は、１２－１４ヌクレオチドであり得る。
前記ＴＡＬＥドメインは、一つ以上のＴＡＬＥ－リピートの組み合わせによって配列特異的方式でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを意味する。少なくとも一つ以上のＴＡＬＥ－リピート、具体的には１個～３０個のＴＡＬＥ－リピートを含むが、これに限定されない。ＴＡＬＥ－リピートは、ＴＡＬＥドメイン内の特定のヌクレオチド配列を認識する部位である。
前記ＴＡＬＥドメインには、バックボーン構造としてＴＡＬＥのＮ－末端包含領域及びＴＡＬＥのＣ－末端包含領域が含まれる。
切断部位を基準にして前記ＴＡＬＥドメインが結合する位置によって、単一ＴＡＬＥアレイ又は第１ＴＡＬＥアレイ及び第２ＴＡＬＥアレイがそれぞれ結合することができる。
前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体に第１ＴＡＬＥが結合（ｌｅｆｔ ＴＡＬＥ）し、前記シトシン脱アミノ酵素の第２分割体に第２ＴＡＬＥ（ｒｉｇｈｔ ＴＡＬＥ）が結合することができ、それぞれＮ’－ＴＡＬＥ－第１分割体－Ｃ’及びＮ’－ＴＡＬＥ－第２分割体－Ｃ’構造を有する。
ＴＡＬＥアレイは、ターゲットＤＮＡ配列によってカスタマイズ製作することができる。ＴＡＬＥアレイは、３３個～３５個のアミノ酸残基で構成されたモジュールが繰り返し配列されて構成されるが、これらは、植物病源菌キサントモナス（Ｘａｎｔｈｍｏｎａｓ）から由来したものであって、一つのモジュールは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ塩基をそれぞれ一つずつ認識してからＤＮＡに結合する。それぞれのモジュールの塩基特異性は、１２番目及び１３番目のアミノ酸残基によって決定されるが、これらをＲＶＤ（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ）という。例えば、ＲＶＤがＮＮであるモジュールはＧを認識し、ＮＩはＡを認識し、ＨＤはＣを認識し、ＮＧはＴを認識する。ＴＡＬＥアレイは、最小１４個から最大１８個以上のモジュールで構成され、ターゲットＤＮＡ配列１５ｂｐ～２０ｂｐを認識できるように設計することができる。
Ｃａｓタンパク質は、変異された形態で含むことができ、ＤＮＡ二本鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失するように変異されたものを意味することができ、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を喪失し、ニッカーゼ活性を有するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て喪失するように変異された形態のうち１種以上であり得る。
ニッカーゼ活性を有する場合、前記シトシン脱アミノ酵素による塩基変換（例えば、シトシンがウラジンに変換）と同時に又は順序に関係なく順次的に、前記塩基変換が起こった鎖又はその逆鎖（例えば、塩基変換が起こった鎖の逆鎖）でｎｉｃｋが導入され得る（例えば、ＰＡＭが位置する鎖の逆鎖で、ＰＡＭ配列の５’末端方向に３番目のヌクレオチドと４番目のヌクレオチドとの間に該当する位置にｎｉｃｋが導入される）。このような変異（例えば、アミノ酸置換など）は、触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ触媒ドメイン）で起こるものであり得る。ストレプトコッカス・ピオゲネスから由来したＣａｓ９の場合、変異は、触媒活性を有するアスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ；１０番目の位置のアスパラギン酸（Ｄ１０）など）、７６２番目の位置のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０番目の位置のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４番目の位置のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３番目の位置のアスパラギン（Ｎ８６３）、９８６番目の位置のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群から選ばれた一つ以上の任意の他のアミノ酸に置換された突然変異を含むことができる。このとき、置換される任意の他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であり得るが、これに制限されない。
場合に応じて、ストレプトコッカス・ピオゲネスから由来したＣａｓ９タンパク質の１１３５番目の位置のアスパラギン酸（Ｄ１１３５）、１３３５番目の位置のアルギニン（Ｒ１３３５）、及び１３３７番目の位置のトレオニン（Ｔ１３３７）のうち一つ以上、例えば、３個がいずれも他のアミノ酸に置換され、野生型Ｃａｓ９のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）と相違するＮＧＡ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選ばれた任意の塩基である。）を認識するように変異されたものであり得る。
例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスから由来したＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列のうち、
（１）Ｄ１０、Ｈ８４０、又はＤ１０＋Ｈ８４０；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７、又はＤ１１３５＋Ｒ１３３５＋Ｔ１３３７；又は
（３）（１）と（２）の残基の全てにおいてアミノ酸置換が起こったものであり得る。
前記「他のアミノ酸」は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リシン、及び前記各アミノ酸の公知となった全ての変形体のうち、野生型タンパク質が元の変異位置で有するアミノ酸を除いた各アミノ酸から選ばれたアミノ酸を意味する。一例において、前記「他のアミノ酸」は、アラニン、バリン、グルタミン、又はアルギニンであり得る。
場合に応じて、ガイドＲＮＡをさらに含むことができる。前記ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）、及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）からなる群から選ばれた１種以上であり得、具体的には、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに結合した二本鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、又はｃｒＲＮＡ又はその一部とｔｒａｃｒＲＮＡ又はその一部とがオリゴヌクレオチドリンカーで連結された一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。
本発明は、アデニン脱アミノ酵素を含む。前記アデニン脱アミノ酵素は、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ １）、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）及びｔａｄＡ（ｔＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）からなる群から選択可能であり、具体的には、ｔａｄＡ（ｔＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。前記アデニン脱アミノ酵素は、例えば、大腸菌ＴａｄＡの変異体としてデオキシアデニン脱アミノ酵素（ｄｅｏｘｙ－ａｄｅｎｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。
前記シトシン脱アミノ酵素が分割形態で含まれ、前記ＤＮＡ結合タンパク質がジンクフィンガータンパク質で、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＮ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＣ－末端が結合（ＮＣ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）した構造において、アデニン脱アミノ酵素は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端又はＣ－末端、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。
アデニン脱アミノ酵素は、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＣ－末端が結合（ＣＣ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）するか；シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端が結合（ＣＮ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）するか；又は、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＮ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端が結合（ＮＮ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）した構造においても、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端又はＣ－末端、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。
前記シトシン脱アミノ酵素が分割形態で含まれ、前記ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥである場合、前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体に第１ＴＡＬＥが結合し、前記シトシン脱アミノ酵素の第２分割体に第２ＴＡＬＥが結合することができ、それぞれＮ’－ＴＡＬＥ－第１分割体ＤＤＤＡ－Ｃ’及びＮ’－ＴＡＬＥ－第２分割体ＤＤＤＡ－Ｃ’構造を有する。アデニン脱アミノ酵素は、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端又はＣ－末端、又はシトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。
本発明は、１）ＤＮＡ結合タンパク質、２）分割された二本鎖ＤＮＡ特異的バクテリアシトシン脱アミノ酵素、及び３）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴａｄＡから由来したデオキシアデニン脱アミノ酵素を含む植物細胞小器官ＤＮＡのＡ－ｔｏ－Ｇ塩基校正用組成物（ＵＧＩなし）であって、前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）アレイで；分割された二本鎖ＤＮＡ特異的バクテリアシトシン脱アミノ酵素であるバークホルデリア・セノセパシア （Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）から由来したＤｄｄＡｔｏｘである組成物である。
前記シトシン脱アミノ酵素が分割形態で含まれ、前記ＤＮＡ結合タンパク質がジンクフィンガータンパク質で、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＮ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＣ－末端が結合（ＮＣ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）した構造において、アデニン脱アミノ酵素は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端又はＣ－末端、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。
アデニン脱アミノ酵素は、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＣ－末端が結合（ＣＣ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）するか；シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端が結合（ＣＮ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）するか；又は、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＮ－末端が結合し、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＣ－末端にジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端が結合（ＮＮ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）した構造においても、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｌｅｆｔ）のＣ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端又はＣ－末端、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ－Ｒｉｇｈｔ）のＮ－末端、シトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。
前記シトシン脱アミノ酵素が分割形態で含まれ、前記ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥである場合、前記シトシン脱アミノ酵素の第１分割体に第１ＴＡＬＥが結合し、前記シトシン脱アミノ酵素の第２分割体に第２ＴＡＬＥが結合することができ、それぞれＮ’－ＴＡＬＥ－第１分割体ＤＤＤＡ－Ｃ’及びＮ’－ＴＡＬＥ－第２分割体ＤＤＤＡ－Ｃ’構造を有する。アデニン脱アミノ酵素は、シトシン脱アミノ酵素の第１分割体のＮ－末端又はＣ－末端、又はシトシン脱アミノ酵素の第２分割体のＮ－末端又はＣ－末端に結合することができる。
本発明は、植物細胞小器官Ａ－ｔｏ－Ｇ塩基校正用組成物であって、前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥアレイで、前記シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体は、バクテリアから由来し、二本鎖ＤＮＡ特異的であることを特徴とする組成物に関する。
本発明は、植物細胞小器官Ａ－ｔｏ－Ｇ塩基校正用組成物であって、前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥアレイで、前記シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体は、バクテリアから由来し、二本鎖ＤＮＡ特異的であり、前記第１分割体のＮ－末端にＤＮＡ結合タンパク質が結合しており、アデニン脱アミノ酵素のＣ－末端にＤＮＡ結合タンパク質が結合している、組成物に関する。
本発明は、１）ＤＮＡ結合タンパク質、２）分割された二本鎖ＤＮＡ特異的バクテリアシトシン脱アミノ酵素、及び３）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴａｄＡから由来したデオキシアデニン脱アミノ酵素を含む植物細胞小器官Ａ－ｔｏ－Ｇ塩基校正用組成物であって、ＵＧＩを含まなく、前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）アレイで；分割された二本鎖ＤＮＡ特異的バクテリアシトシン脱アミノ酵素であるバークホルデリア・セノセパシア （Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）から由来したＤｄｄＡｔｏｘである組成物である。
本発明は、植物細胞小器官Ａ－ｔｏ－Ｇ塩基校正方法であって、ＤＮＡ結合タンパク質又はこれをコードする核酸；シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体又はこれをコードする核酸；及びアデニン脱アミノ酵素又はこれをコードする核酸を植物細胞に処理する段階を含み、前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥアレイで、前記シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体は、バクテリアから由来し、二本鎖ＤＮＡ特異的であることを特徴とする方法に関する。
本発明は、植物細胞小器官Ａ－ｔｏ－Ｇ塩基校正方法であって、ＤＮＡ結合タンパク質又はこれをコードする核酸；シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体又はこれをコードする核酸；及びアデニン脱アミノ酵素又はこれをコードする核酸を植物細胞に処理する段階を含み、前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質又はＴＡＬＥアレイで、前記シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体は、バクテリアから由来し、二本鎖ＤＮＡ特異的であり、前記第１分割体のＮ－末端にＤＮＡ結合タンパク質が結合しており、アデニン脱アミノ酵素のＣ－末端にＤＮＡ結合タンパク質が結合している、方法に関する。
本発明は、植物細胞小器官Ａ－ｔｏ－Ｇ塩基校正方法であって、ＤＮＡ結合タンパク質又はこれをコードする核酸；シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体又はこれをコードする核酸；及びアデニン脱アミノ酵素又はこれをコードする核酸を植物細胞に処理する段階を含み、１）ＤＮＡ結合タンパク質、２）分割された二本鎖ＤＮＡ特異的バクテリアシトシン脱アミノ酵素、及び３）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴａｄＡから由来したデオキシアデニン脱アミノ酵素を含む植物細胞小器官Ａ－ｔｏ－Ｇ塩基校正用組成物であって、ＵＧＩを含まなく、前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）アレイで；分割された二本鎖ＤＮＡ特異的バクテリアシトシン脱アミノ酵素であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａから由来したＤｄｄＡｔｏｘである方法である。
本発明は、葉緑体伝達ペプチド（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）又はミトコンドリア伝達タンパク質（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ、ＭＴＳ）をさらに含むことができる。
例えば、葉緑体伝達タンパク質（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｔｒａｎｓｉｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＴＰ）又はミトコンドリア伝達信号タンパク質（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ、ＭＴＳ）は、結合によって植物細胞内葉緑体とミトコンドリアに伝達される。葉緑体とミトコンドリアに伝達されるとき、Ｎ－末端のＣＴＰ又はＭＴＳタンパク質を除いた残りの部分は、前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）形態で葉緑体とミトコンドリアの内部に伝達される。葉緑体とミトコンドリアの内部への進入過程で伝達タンパク質部分が分離され、葉緑体とミトコンドリアのターゲッティングによって特定の部分を塩基校正することができる。
前記核酸と関連して、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、及び「オリゴヌクレオチド」は、相互交換的に使用される。任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はこれらの類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知又は非公知の任意の機能を行うことができる。ポリヌクレオチドは、一つ以上の変形したヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド構造に対する変形は、ポリマーのアセンブリ前後に行うことができる。
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はその組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。
前記融合タンパク質を発現させるための手段として、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクターなどの公知の発現ベクターを使用することができ、ベクターは、ＤＮＡ組換え技術を用いた任意の公知の方法によって当業者が容易に製造することができる。
前記ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得、前記ウイルスベクターは、具体的には、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、及びレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクターであり得るが、これに限定されたものではない。
組換え発現ベクターは、宿主細胞で核酸の発現に適した形態で核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが発現のために使用されるように、すなわち、発現される核酸配列に作動可能に連結されるように宿主細胞をベースにして選ばれ得る一つ以上の調節要素を含むことを意味する。
組換え発現ベクター内で「作動可能に連結された」とは、関心ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を許容する方式で（例えば、試験管内転写／翻訳システムで、又はベクターが宿主細胞内に導入される場合は宿主細胞で）調節要素に連結されることを意味する。
組換え発現ベクターは、Ｔ７プロモーターを含み、メッセンジャーＲＮＡ合成に適した形態を含むことができ、これは、機内でｍＲＮＡ合成を行えるように、すなわち、Ｔ７ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によってメッセンジャーＲＮＡが合成され得る一つ以上の調節要素を含むことを意味する。
「調節要素」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びその他の発現調整要素（例えば、転写終決信号、例えば、ポリアデニル化信号及びポリ－Ｕ配列）を含むことができる。調節要素は、多くの類型の宿主細胞でヌクレオチド配列を誘導するか、又は常に発現を指示する要素及び特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示する要素（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、所望の関心組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞類型（例えば、リンパ球）で主に発現を指示することができる。また、調節要素は、組織又は細胞類型特異的であるか、又は組織又は細胞類型特異的でない細胞周期依存性又は発達段階依存的方式などの一時的－依存的方式で発現を指示することができる。
場合に応じて、ベクターは、一つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、一つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター、一つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例は、非制限的にＵ６及びＨ１プロモーターを含む。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例は、非制限的に、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（選択的にＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーターを含む。
「調節要素」には、エンハンサー、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲでのＲ－Ｕ５’セグメント；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列などが含まれ得る。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に左右され得ることが当業者によって認識され得る。ベクターは、宿主細胞内に導入され、本願に記載された核酸によってエンコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む転写物、タンパク質又はペプチドを生成することができる（例えば、クラスタリングされた規則的間隔の短い回文反復部（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、その突然変異体、その融合タンパク質など）。有益なベクターは、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含み、また、このようなベクターの類型は、特定の類型の細胞を標的化するために選択され得る。
前記ベクターは、それぞれ局所注入法（例えば、病変又は標的部位直接注入）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション、ウイルスベクター、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）のみならず、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法などを通じて生体内又は細胞内に伝達され得る。
前記核酸は、リボ核酸、例えば、メッセンジャーリボ核酸ｍＲＮＡ形態で注入し、細胞の遺伝子塩基校正、例えば、動物細胞又は植物細胞に制限なく遺伝子塩基校正を行うことができる。
本発明に係る核酸は、ｍＲＮＡ形態であり得、ｍＲＮＡ形態で伝達する場合、ＤＮＡを用いたベクター形態で伝達する場合に比べて、ｍＲＮＡへの転写過程が不必要であり、遺伝子校正の開始が速くなり得る。一時的タンパク質発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の可能性が高い。
本出願の発明者等は、植物細胞小器官遺伝子校正のために、シトシン塩基校正器（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ）をリボ核酸、例えば、メッセンジャーリボ核酸形態で植物細胞に注入したとき、プラスミドに伝達する場合に比べて非標的効果が減少することを確認した。植物細胞小器官遺伝子校正において、シトシン塩基校正器をｍＲＮＡ形態で植物細胞に形質転換したとき、プラスミドに比べて非標的効果の面で長所を有することを最初に立証した。
前記ｍＲＮＡは、直接伝達されるか、キャリアを介して伝達され得る。場合に応じて、核酸切断酵素及び／又は切断因子のｍＲＮＡは、化学変形（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するか、合成自己複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）形態で直接伝達することができる。
細胞にｍＲＮＡを伝達する方法、又は生体内でｍＲＮＡをヒト、動物などの有機体の細胞に伝達する方法を含み、試験管内又は生体内でｍＲＮＡ分子を細胞に伝達できる方法を考慮することができる。例えば、脂質（例えば、リポソーム、マイセルなど）を含むか、ナノ粒子又はナノチューブを含むか、陽イオン性化合物（例えば、ポリエチレンイミン又はＰＥＩ）を含むか、陽イオン性化合物（例えば、ポリエチレンイミン又はＰＥＩ）を含み、ｍＲＮＡ分子を細胞に伝達することができる。場合に応じて、ｍＲＮＡを細胞に伝達するために、遺伝子銃又はバイオリステック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）粒子伝達システムなどのバイオリステック方法（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ）を使用することができる。
前記キャリアは、例えば、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ナノ粒子、又は重合体を含み得るが、これに制限されるものではない。
前記ＣＰＰは、多様な分子カーゴ（ナノサイズの粒子から小さい化学分子及びＤＮＡの大きい断片まで）の細胞吸収を容易にする短いペプチドである。
前記ナノ粒子と関連して、本発明に係る組成物は、高分子ナノ粒子、金属ナノ粒子、金属／無機ナノ粒子又は脂質ナノ粒子を介して伝達され得る。前記高分子ナノ粒子は、例えば、ローリングサークル増幅によって合成されたＤＮＡナノクリュー（ｎａｎｏｃｌｅｗ）、糸状ＤＮＡナノ粒子であり得る。ＤＮＡナノクリュー及び糸状ＤＮＡナノ粒子にｍＲＮＡをローディングし、エンドソーム脱出能を向上させるためにＰＥＩをコーティングすることができる。このような複合体は、細胞膜に結合して内在化された後、エンドソーム脱出を通じて核に移動しながら伝達され得る。
前記金属ナノ粒子と関連して、金粒子を連結させ、陽イオン性エンドソーム脱出ポリマー（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）と複合体を形成しながら細胞に伝達することができる。前記陽イオン性エンドソーム脱出ポリマーは、例えば、ポリエチレンイミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ－［２－｛（２－アミノエチル）アミノ｝－エチル－アスパルトアミド］（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とポリ（アルギニン）のブロックコポリマー、ＰＥＧとポリ（リシン）のブロックコポリマー、又はＰＥＧとポリ｛Ｎ－［Ｎ－（２－アミノエチル）－２－アミノエチル］アスパルトアミド｝（ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））のブロックコポリマーであり得る。
前記金属／無機ナノ粒子と関連して、例えば、ＺＩＦ－８（ｚｅｏｌｉｔｉｃ ｉｍｉｄａｚｏｌａｔｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ－８）を通じてｍＲＮＡをカプセル化することができる。
場合に応じて、前記ｍＲＮＡは、陰イオンを帯び（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）、陽イオンを帯びる（ｃａｔｉｏｎｉｃ）各物質と結合しながらナノ粒子を形成することができ、これは、細胞に受容体媒介エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）或いはファゴサイトーシス（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）などを介して浸透し得る。
陽イオン性重合体として、ポリアリルアミン（ＰＡＨ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）；ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＬＡ）；ポリビニルアミン単一又は共重合体；ポリ（ビニルベンジル－トリ－Ｃ１－Ｃ４－アルキルアンモニウム塩）；脂肪族又は芳香脂肪族ジハロゲン化物及び脂肪族Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アルキレンジアミンの重合体；ポリ（ビニルピリジン）又はポリ（ビニルピリジニウム塩）；ポリ（Ｎ，Ｎ－ジアリル－Ｎ，Ｎ－ジ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アンモニウムハロゲン化物）；四級化ジ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アミノエチルアクリレート又はメタクリレートの単一又は共重合体；ＰＯＬＹＱＵＡＤＴＭ；ポリアミノアミドなどが含まれ得る。
陽イオン性脂質として、陽イオン性リポソーム製剤を含むことができる。リポソームの脂質二重層は、カプセル化された核酸を分解から保護し、核酸に結合できる抗体による特異的中和を防止することができる。エンドソームの成熟の間にエンドソームメンブレンとリポソームとが融合され、陽イオン性脂質－核酸切断酵素の効率的なエンドソーム脱出が可能である。陽イオン性脂質として、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとの組み合わせ）、リポフェクターゼ、リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（登録商標）（例えば、リポフェクタミン（登録商標）２０００、リポフェクタミン（登録商標）３０００、リポフェクタミン（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、リポフェクタミン（登録商標）ＬＴＸ）、ＳＡＩＮＴ－ＲＥＤ（Ｓｙｎｖｏｌｕｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、オランダのグローニンゲン所在）、ＤＯＰＥ、シトペクチン（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニアのフォスターシティ所在）、及びユペクチン（ＪＢＬ社、カリフォルニアのサンルイスオビスポ所在）が含まれ得る。代表的な陽イオン性リポソームは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；又はジメチルジオキタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から製造され得る。
脂質ナノ粒子と関連して、キャリアとしてリポソームを用いて伝達することができる。リポソームは、内部水性区画を取り囲む単一又は多重ラメラ脂質二重層、及び相対的に不透過性である外側親脂性リン脂質二重層で構成された球体小嚢構造である。リポソーム剤形は、主に、天然リン脂質及び脂質、例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン又はモノシアロガングリオシドなどを含むことができる。場合に応じて、血漿内の不安定性を解消するために、脂質膜にコレステロール又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を追加することができる。コレステロールの添加は、カプセル化された生活性化合物の血漿内への迅速な放出を減少させるか、又は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は安定性を増加させる。
前記組成物は、次を通じて植物細胞に伝達され得る：
遺伝子銃（Ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いた注入（Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；
ＰＥＧ－媒介原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）；
電気穿孔による原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）；又は
微細注射による原形質体注射（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はその組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。
前記核酸は、次を通じて植物細胞に伝達され得る：
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅなどを用いた形質転換
－バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）、
－ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）：ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ＴＲＶ（ｔｏｂａｃｃｏ ｒａｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）、ＴｏＭＶ（ｔｏｍａｔｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＦｏＭＶ（ｆｏｘｔａｉｌ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、 ＢＹＳＭＶ（ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉａｔｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、 ＳＹＮＶ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）など；
ウイルスを用いたトランスフェクション；
注入（Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ、Ｇｅｎｅ ｇｕｎ）；
ＰＥＧ－媒介原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）；
電気穿孔による原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）；又は
微細注射による原形質体注射（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
前記ウイルスとしては、例えば、ウイルスベクター：ジェミニウイルス、ＴＲＶ（ｔｏｂａｃｃｏ ｒａｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）、 ＴｏＭＶ（ｔｏｍａｔｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＦｏＭＶ（ｆｏｘｔａｉｌ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＢＹＳＭＶ（ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉａｔｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＳＹＮＶ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）などを挙げることができる。
前記ベクターは、それぞれ局所注入法（例えば、病変又は標的部位直接注入）、電気穿孔法、リポフェクション、ウイルスベクター、ナノ粒子のみならず、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法などを通じて細胞内に伝達され得る。
本発明は、前記組成物を植物細胞に処理する段階を含む植物細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニンに校正する方法に関する。
本発明は、前記方法によってＧＴＴＧＡＡＡＧＣ配列を含む葉緑体ｐｓｂＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、アトラジン除草剤抵抗性植物に関する。
本発明は、前記方法によってＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡ配列を含む１６ｓ ｒＲＮＡのアデニン塩基がグアニンに校正された、スペクチノマイシン抵抗性植物に関する。
本発明は、前記方法によってＡＴＧを含むｐｓａＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、アルビノ表現型を有する植物に関する。
葉緑体ＤＮＡのうちｐｓｂＡの２９５番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）をセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）に塩基校正することによって、除草剤のうち一つであるアトラジンに抵抗性を有する植物を開発することができる。葉緑体のｐｓｂＡのみならず、１６ｓ ｒＲＮＡ、ｐｓａＡのアデニン塩基校正を通じてスペクチノマイシン抵抗性植物及びアルビノ形態の植物を開発することができる。
本発明は、前記方法によって葉緑体ルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ：ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）コーディング遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された植物に関する。光合成に関与するルビスコのラージユニット（ｒｕｂｉｓｃｏ Ｌａｒｇｅ ｕｎｉｔ）の塩基校正が可能になり、光合成効率を調節し、植物の生産量増大を期待することができる。
葉緑体の塩基配列は、植物間の相同関係（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）が高いので、本発明に使用したレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｃｈｅｏｎｇｃｈｉｍａ）のみならず、イネ、コムギ、ジャガイモ、トマトなどの植物も、アトラジンに抵抗性を有する植物を開発することができる。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１．
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：５１７９（２０１８）に発表された論文によると、Ｅ．ｃｏｌｉの１６ｓ ｒＲＮＡの１１８３番目及び１１８９番目のウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）をそれぞれ又は同時にシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）に置換することによって、Ｅ．ｃｏｌｉがスペクチノマイシンに抵抗性を有することを報告した。植物の葉緑体に存在する１６ｓ ｒＲＮＡの１１８３、１１８９のアデニンをグアニンに置換すると、スペクチノマイシンに抵抗性を有する植物の開発が可能である。
実施例で使用されたアデニン塩基校正器の各構成に対する配列は、次の通りである。図１は、ＤｄｄＡｔｏｘとアデニン脱アミノ酵素をＴＡＬＥに結合した模式図である。
ＣＴＳ
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ＣＴＤ
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡＬＡＡＬＴＮＤＨＬＶＡＬＡＣＬＧＧＲＰＡＬＤＡＶＫＫＧＬＧ
ＡＤ
ＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＳＫＲＧＡＡＧＳＬＭＮＶＬＮＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＤＦＹＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＩＮ
Ｌｉｎｋｅｒ １（ＴＡＬＥ ａｒｒａｙ－Ｌｉｎｋｅｒ １－ＤｄｄＡｔｏｘ）
ＧＳ
Ｌｉｎｋｅｒ ２（ＤｄｄＡｔｏｘ－Ｌｉｎｋｅｒ ２－ＡＤ）
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ
ＤｄｄＡｔｏｘ Ｇ１３４７Ｎ
ＧＳＧＳＹＡＬＧＰＹＱＩＳＡＰＱＬＰＡＹＮＧＱＴＶＧＴＦＹＹＶＮＤＡＧＧＬＥＳＫＶＦＳＳＧＧＰＴＰＹＰＮＹＡＮＡＧＨＶＥＧＱＳＡＬＦＭＲＤＮＧＩＳＥＧＬＶＦＨＮＮＰＥＧＴＣＧＦＣＶＮＭＴＥＴＬＬＰＥＮＡＫＭＴＶＶＰＰＥＧ
ＤｄｄＡｔｏｘ Ｇ１３９７Ｃ
ＧＳＡＩＰＶＫＲＧＡＴＧＥＴＫＶＦＴＧＮＳＮＳＰＫＳＰＴＫＧＧＣ
ｐｓｂＡ Ｌｅｆｔ ＴＡＬＥ ｒｅｐｅａｔ
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ｐｓｂＡ Ｒｉｇｈｔ ＴＡＬＥ ｒｅｐｅａｔ
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１６ｓ ｒＲＮＡ Ｌｅｆｔ ＴＡＬＥ ｒｅｐｅａｔ
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１６ｓ ｒＲＮＡ Ｒｉｇｈｔ ＴＡＬＥ ｒｅｐｅａｔ
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レタスプロトプラストに試験管合成したｍＲＮＡをそれぞれ３０μｇ伝達し、７日後にアデニン塩基校正効率を確認した結果を図２ａ～図２ｃに示した。図２ａは、青色となっているＤＮＡシーケンスに左側及び右側のＴＡＬＥアレイが結合することを示す。赤色で表示されたＡ５及びＡ１１は、１６ｓＲＮＡの標的アデニン（Ｔａｒｇｅｔ Ａｄｅｎｉｎｅ）である。図２ｂによると、Ａ５の塩基校正比率は１７．２７％及び６．９１％で、Ａ１１の塩基校正比率は１８．１７％及び７．７％である。図２ｃにおいて、ＷＴに標的化するアデニンが青色で表示されており、標的が変わるＡｌｌｅｌｅとしては、Ａｌｌｅｌｅ－３、Ａｌｌｅｌｅ－４、Ａｌｌｅｌｅ－９がある。
ｍＲＮＡを伝達し、培養を通じてカルスを確保した後、アデニン塩基校正効率を確認した。図３ａによると、Ａ５の塩基校正比率は９．７％及び２．９％で、Ａ１１の塩基校正比率は９．１５％及び３．０６％である。図３ｂによると、ＷＴに標的化するアデニンが青色で表示されており、標的が変わるＡｌｌｅｌｅとしては、Ａｌｌｅｌｅ－１、Ａｌｌｅｌｅ－４、Ａｌｌｅｌｅ－６がある。
実施例２．
葉緑体にあるｐｓａＡの突然変異は、アルビノ表現型を有する植物になる。本発明では、ｐｓａＡの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）がＡＴＧを破壊することによって、アルビノ表現型を有する植物の開発が可能である。
レタスプロトプラストに試験管合成したｍＲＮＡをそれぞれ３０μｇ伝達し、７日後にアデニン塩基校正効率を確認した結果を図４に示した。図４ａによると、青色となっているＤＮＡシーケンスに左側及び右側のＴＡＬＥアレイが結合することを示す。Ａ５及びＡ６が開始コドンの標的アデニンである。図４ｂによると、Ａ５の塩基校正比率は１０．６７％及び７．６８％で、Ａ６の塩基校正比率は１４．６６％及び１２．２７％である。図４ｃによると、ＷＴに標的化するアデニンが青色で表示されており、標的が変わるＡｌｌｅｌｅとしては、Ａｌｌｅｌｅ－３、Ａｌｌｅｌｅ－５、Ａｌｌｅｌｅ－６、Ａｌｌｅｌｅ－９がある。
ｍＲＮＡを伝達し、培養を通じてカルスを確保した後、アデニン塩基校正効率を確認した。図５ａによると、Ａ５の塩基校正比率は８．４％及び７．５％で、Ａ６の塩基校正比率は１２．２％及び１０．０％である。図５ｂによると、ＷＴに標的化するアデニンが青色で表示されており、標的が変わるＡｌｌｅｌｅとしては、Ａｌｌｅｌｅ－４、Ａｌｌｅｌｅ－８がある。
実施例３．
植物の葉緑体ＤＮＡは、高い相同性を有している。図６に示したものは、多くの植物のｐｓｂＡ ＤＮＡシーケンスであって、赤色ａが標的位置である。ｍＲＮＡ伝達、ＲＮＰ、アグロバクテリウムを用いた方法により、商業的に高い価値を有しているトウモロコシ（Ｍａｉｚｅ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、コメ（ｒｉｃｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）などの葉緑体ＤＮＡ塩基校正を通じて除草剤抵抗性植物を開発することができる。Ｚｅａ ｍａｙｓ－ＮＣ＿００１６６．２、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ－ＮＣ＿００１３２０．１、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ－ＮＣ＿００７１４４、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ－ＮＣ＿００２７６２．１、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ－ＮＣ＿００８０９６、Ｓｏｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ－ＮＣ＿００７８９８、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔｈａｌｉａｎａ－ＡＰ０００４２３、Ｌｅｔｔｕｃｅ ｓａｔｉｖａ－ＡＰ００７２３２．１のシーケンスを用いた。
植物細胞小器官ＤＮＡの塩基校正としては、ＤｄｄＡｔｏｘを用いたシトシンをチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）する塩基校正のみが存在していたが、本発明でアデニンをグアニンに塩基校正することによって、小器官ＤＮＡ塩基校正の範囲が広くなった。
現在まで、除草剤抵抗性植物の開発は、核にあるＤＮＡの塩基校正を通じて開発されたが、葉緑体のｐｓｂＡの塩基校正で新しい除草剤抵抗性植物の開発が可能になった。
葉緑体のｐｓｂＡのみならず、他の葉緑体遺伝子の校正を通じて新しい形質の植物開発が可能である。
光合成に関与するルビスコのラージユニットの塩基校正が可能になり、光合成効率を調節し、植物の生産量増大を期待することができる。
ＣＴＳの代わりにＭＴＳ（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ）を使用すると、植物ミトコンドリアＤＮＡのアデニンが校正可能である。
以上では、本発明の内容における特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好適な実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
電子ファイルを添付した。

Claims (20)

  1. ＤＮＡ結合タンパク質又はこれをコードする核酸；
    シトシン脱アミノ酵素から由来した第１分割体及び第２分割体又はこれをコードする核酸；及び
    アデニン脱アミノ酵素又はこれをコードする核酸；を含み、
    前記第１分割体及び第２分割体は、それぞれ前記ＤＮＡ結合タンパク質に結合される形態である、植物細胞小器官ＤＮＡのアデニン塩基校正用組成物。
  2. 前記第１分割体と第２分割体のそれぞれは、シトシン脱アミノ酵素活性を有さないことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記シトシン脱アミノ酵素は、二本鎖ＤＮＡに作用する脱アミノ酵素（ＤｄｄＡ）又はそのオルソログから由来したことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記第１分割体は、配列番号１の配列のうち、Ｎ－末端からＧ３３、Ｇ４４、Ａ５４、Ｎ６８、Ｇ８２、Ｎ９８、及びＧ１０８からなる群から選ばれる一つ以上までの配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記第２分割体は、配列番号１の配列のうち、Ｇ３４、Ｐ４５、Ｇ５５、Ｎ６９、Ｔ８３、Ａ９９、及びＡ１０９からなる群から選ばれる一つ以上からＣ－末端までの配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ＺＦタンパク質（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、又はＴＡＬＥアレイ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｒｒａｙ）である、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ＤＮＡ結合タンパク質は、２個～４０個のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記リンカーは、次を含む、請求項７に記載の組成物：
    ２ａ．ａリンカー：ＧＳ；
    ５ａ．ａリンカー：ＴＧＥＫＱ；
    １０ａ．ａリンカー：ＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦ；
    １６ａ．ａリンカー：ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ；
    ２４ａ．ａリンカー：ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ；又は
    ３２ａ．ａリンカー：ＧＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ。
  9. 前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質であって、前記第１分割体及び第２分割体のそれぞれは、前記ジンクフィンガータンパク質のＮ－末端又はＣ－末端に結合されている形態である、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＡＬＥアレイであって、単一ＴＡＬＥアレイが分割体の一末端に結合された形態であるか、又は、第１ＴＡＬＥアレイ及び第２ＴＡＬＥアレイが第１分割体及び第２分割体に結合された形態である、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記アデニン脱アミノ酵素は、ＤＮＡ結合タンパク質又はシトシン脱アミノ酵素のＮ又はＣ－末端に結合された、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記アデニン脱アミノ酵素は、ＴａｄＡから由来したデオキシアデニン脱アミノ酵素である、請求項１に記載の組成物。
  13. 葉緑体伝達ペプチド又はこれをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
  14. ミトコンドリア伝達タンパク質（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ、ＭＴＳ）又はこれをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
  15. 次を通じて植物細胞に伝達されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
    遺伝子銃を用いた注入（Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；
    ＰＥＧ－媒介原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）；
    電気穿孔による原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）；又は
    微細注射による原形質体注射（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
  16. 前記核酸は、次を通じて植物細胞に伝達されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物：
    アグロバクテリウム、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ）などを用いた形質転換；
    ウイルストランスフェクション；
    遺伝子銃を用いた注入（Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；
    ＰＥＧ－媒介原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）；
    電気穿孔による原形質体トランスフェクション（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）；又は
    微細注射による原形質体注射（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物を植物細胞に処理する段階を含む植物細胞小器官ＤＮＡのアデニンをグアニンに校正する方法。
  18. 請求項１７に記載の方法によってＧＴＴＧＡＡＡＧＣ配列を含む葉緑体ｐｓｂＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、アトラジン除草剤抵抗性植物。
  19. 請求項１７に記載の方法によってＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡ配列を含む１６ｓ ｒＲＮＡのアデニン塩基がグアニンに校正された、スペクチノマイシン抵抗性植物。
  20. 請求項１７に記載の方法によってＡＴＧを含むｐｓａＡ遺伝子のアデニン塩基がグアニンに校正された、アルビノ表現型を有する植物。
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