JP2025509651A - 並行サンプル及びインデックス配列決定 - Google Patents

Abstract

テンプレートポリヌクレオチド中の核酸塩基を同定するシステム及び方法が開示される。一実施形態では、そのような方法は、クラスター中に複数のテンプレートポリヌクレオチドを含む基材を提供することを含み得る。本方法は、クラスターからの蛍光発光を刺激するために光を発生させることを更に含み得る。本方法は、第１の部位で複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第１の複数のヌクレオチド類似体から第１の強度で放出される第１のシグナルを受信することを更に含み得る。本方法は、第２の部位で複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第２の複数のヌクレオチド類似体から第２の強度で放出される第２のシグナルを受信することを更に含み得る。本方法は、第１及び第２のシグナルの組み合わせに基づいて、テンプレートポリヌクレオチドの第１及び第２の部位でハイブリダイズした核酸塩基を同定することを更に含み得る。

Description

本開示の技術は、核酸配列決定の分野に関する。より具体的には、本開示の技術は、次世代配列決定を使用して、同じ配列決定実行においてインデックス配列及び対応する標的核酸のヌクレオチド配列を決定することに関する。

いくつかのタイプの次世代配列決定技術では、ＤＮＡクラスターが、標的ポリヌクレオチドの増幅後にフローセル上に作製され得る。次世代配列決定サイクルは、標的ポリヌクレオチドの相補鎖が合成されているときに行われ得る。各配列決定サイクルにおいて、蛍光標識とコンジュゲートされたデオキシリボ核酸類似体は、ある特定の部位で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされ得、励起光源は、デオキシリボ核酸類似体上の蛍光標識を励起するために使用され得る。検出器は、デオキシリボ核酸類似体を同定するために、蛍光標識からの蛍光発光を捕捉し得る。結果として、標的ポリヌクレオチドの配列は、配列決定サイクルを繰り返し実施することによって決定され得る。標的ポリヌクレオチドを配列決定する速度は、配列決定サイクルを実施し、連続的な順序で標的ポリヌクレオチドの核酸塩基を同定する必要性のために制限され得る。

開示される技術は、ポリヌクレオチドの核酸塩基配列を効率的に決定するためのシステム及び方法に関する。より具体的には、開示される技術は、インデックス部分及びテンプレート部分などのポリヌクレオチドの異なる部分の核酸塩基配列を並行して決定するためのシステム及び方法に関する。

一態様では、本開示の技術は、テンプレートポリヌクレオチド中の核酸塩基を同定するシステム及び方法を提供する。一実施形態では、開示される方法は、クラスター中に複数のテンプレートポリヌクレオチドを含む基材を提供することを含み得る。本方法は、クラスターからの蛍光発光を刺激するために光を発生させることを更に含むことができる。本方法は、第１の部位で複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第１の複数のヌクレオチド類似体から第１の強度で放出される第１のシグナルを受信することを更に含むことができる。本方法は、第２の部位で複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第２の複数のヌクレオチド類似体から第２の強度で放出される第２のシグナルを受信することを更に含むことができる。本方法は、第１及び第２のシグナルの組み合わせに基づいて、テンプレートポリヌクレオチドの第１及び第２の部位でハイブリダイズした核酸塩基を同定することを更に含むことができる。

別の態様では、開示される技術は、バーコードインデックスを含むテンプレートポリヌクレオチドの配列を決定するシステム及び方法を提供する。一実施形態では、開示される方法は、インデックスプライマー及びリードプライマーをテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含み得る。本方法は、第１の標識を含む第１の標識されたヌクレオチドでインデックスプライマーを伸長することを更に含み得る。本方法は、第２の標識を含む第２の標識されたヌクレオチドでリードプライマーを伸長することを更に含み得る。本方法は、第１及び第２の標識されたヌクレオチドからの蛍光発光を刺激するために光を発生させることを更に含み得る。本方法は、蛍光発光を捕捉することによってバーコードインデックス及びテンプレートポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定することを更に含み得る。

本明細書に開示されるシステム、デバイス、キット、及び方法は各々、いくつかの態様を有し、そのうちのいずれか１つが単独でそれらの望ましい属性を担うことはない。より少ない、追加の、及び／又は異なる構成要素、ステップ、特徴、目的、利益、及び利点を有する実施形態を含む、多数の他の実施形態も企図される。構成要素、態様、及びステップは、異なって配置及び順序付けられ得る。この考察を考慮した後、特に「発明を実施するための形態」と題されたセクションの閲読後、本明細書に開示されるデバイス及び方法の特徴が、いかに他の既知のデバイス及び方法よりも利点を提供するか理解するであろう。

本明細書で開示されるシステムの任意の特徴を、任意の所望の様式及び／又は構成で組み合わせることができることを理解されたい。更に、本明細書で開示される方法の任意の特徴を、任意の所望の様式で組み合わせることができることを理解されたい。更に、方法及び／若しくはシステムの特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができ、かつ／又は本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。以下でより詳細に考察される前述の概念と追加の概念との全ての組み合わせが、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられ、本明細書に記載される便益及び利点を実現するために使用され得ることを理解されたい。

本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、同一ではないかもしれないが類似のものである構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて説明される場合も、説明されない場合もある。
開示される方法を実施するために使用され得る例示的な配列決定システムを概略的に例示するブロック図を示す。 図１の例示的な配列決定システムと併せて使用され得る例示的なイメージングシステムを概略的に例示するブロック図を示す。 図１の例示的な配列決定システムで使用され得る例示的なコンピュータシステムの機能ブロック図を示す。 開示される技術の一実施形態による、インデックス付きサンプルの核酸クラスター及びインデックス付きサンプルを配列決定するために使用されるプライマーの概略図を示す。 図４の実施形態と併せて使用され得る例示的な色素標識スキームを示す。 開示される技術の一実施形態による核酸クラスターからのシグナルの１６個の分布のグラフ表示を示すプロットである。 開示された技術の一実施形態によるポリヌクレオチドを配列決定するための方法を示す流れ図である。

全ての特許、特許出願、及び他の刊行物は、これらの文献に開示され、本明細書で言及される全ての配列を含めて、各公開物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。引用された全ての文献は、関連部分において、本明細書の引用の文脈によって示される目的のために、参照により全文が本明細書に組み込まれる。しかしながら、いずれの文献の引用も、それが本開示に対する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。

序論
いくつかの次世代配列決定技術では、ライブラリ調製中に生成されたＤＮＡ断片への一意の識別子又はインデックス配列の付加は、複数のＤＮＡライブラリをプールして一緒に配列決定することを可能にするインデックス付きテンプレート配列を形成することができる。いくつかのシステムでは、各テンプレート配列は一意のインデックス部分を有する。テンプレートは、フローセルに結合され得、同一のインデックス付きテンプレート配列のクラスターが、フローセル上の単一の位置で生成され得る。したがって、フローセル上のＤＮＡクラスターは、生物学的サンプル又は他のサンプルから採取された元のＤＮＡ断片に由来するインデックス配列部分及びインサート部分を有するテンプレートポリヌクレオチドの同一コピーを含み得る。核酸のインデックス付き配列決定に関する更なる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８２２，１５０号に見出すことができる。

一態様では、本開示の技術は、テンプレートポリヌクレオチドのインデックス配列部分及びインサート部分の同時配列決定を可能にすることによって、テンプレートポリヌクレオチドを配列決定するための時間を短縮することができる。一態様では、インデックス配列部分を配列決定するためのプライマー（すなわち、インデックスプライマー）及びインサート部分を配列決定するためのプライマー（すなわち、リードプライマー）は、合成による配列決定（sequencing-by-synthesis、ＳＢＳ）ワークフローの効率を増加させるために、同じ反応ステップにおいてテンプレートポリヌクレオチドにアニールされる。加えて、インデックスプライマー及びリードプライマーをテンプレート鎖に同時にアニーリングすることは、システム全体の流体の複雑性を低減し得る。例えば、インデックスプライマー及びリードプライマーをテンプレートポリヌクレオチドに同時にハイブリダイズさせた後、ＳＢＳケミストリーサイクルを通じてインデックス配列部分及びインサート部分を読み出すことができる。一実施形態では、インデックス配列部分及びインサート部分上の標識された核酸塩基から受け取られるシグナルを分離するために、インデックス配列部分からのシグナルは、リード部分によって生成されるシグナルと比較して、例えば、５０％減少される。例えば、インデックスプライマーは、インデックスプライマー分子の一部分（例えば、５０％）がブロックされ、伸長することができないように調製され得る。インデックスプライマー（又はリードプライマー）への標識された核酸塩基の付加をブロックすることによって、各プライマーに付加された標識された核酸塩基によって生成されるシグナルを区別することができる。例えば、インデックスプライマーの半分がブロックされた部位を有する場合、インデックスプライマーの半分のみが任意のＳＢＳ配列決定反応において標識される。標識されるインデックスプライマーの割合のこの減少は、各クラスター中のインデックスプライマーによって発せられる光の波長の強度の比例した減少を導く。光の波長だけでなく、各クラスターからのその光の強度も検討することによって、インデックスプライマーに結合した標識された核酸塩基は、リードプライマーに付加された標識された核酸塩基から区別することができる。これについては、以下のセクションでより完全に説明する。

以下の実施例は、インデックスプライマーのいくつかが、インデックスプライマーに付加された核酸塩基から受け取られる蛍光シグナルの強度を減少させるためにブロックされることを示し得るが、インデックスプライマー又はリードプライマーのいずれかに付加された蛍光標識の強度を区別するための任意の機構が、本発明の範囲内であると想定されることが理解されるべきである。例えば、一態様では、インデックスプライマーはブロックされないが、ある割合又はパーセンテージのリードプライマーは、標識された核酸塩基がリードプライマーに付加され得ないようにブロッキング基を含有する。いくつかの実施形態では、ブロックされたインデックスプライマー又はブロックされたリードプライマーは、不可逆的にブロックされた３’末端を有し得る。例えば、ブロックされたプライマーは、核酸鎖を更に成長させるために必要な３’ＯＨ基を欠く、ジデオキシヌクレオチド又はｄｄＮＴＰ（例えば、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ又はｄｄＣＴＰ）で終わる核酸であり得る。

いくつかの実施形態では、開示される技術は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの合成による配列決定及び除去可能な蛍光色素を用いる可逆的ターミネーターベースの配列決定化学（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ６：５３－５９［２００９］に記載されているもの）を使用して配列情報を得ることを含む。約数十～数百個の塩基対の短い配列リードは、参照ゲノムに対して位置合わせされ得、参照ゲノムに対する短い配列リードの一意のマッピングが同定され得る。第１のフォワード配列決定が完了した後、テンプレートをその場で再生して、断片の反対側末端から第２のリバース配列決定を可能にすることができる。したがって、ＤＮＡ断片のシングルエンド配列決定又はペアエンド配列決定のいずれかを使用することができる。ペアエンド配列決定に関する更なる情報は、米国特許第７，６０１，４９９号及び米国特許公開第２０１２／００５３０６３号に見出すことができ、これらは参照により組み込まれる。開示される技術によって使用され得る合成による配列決定及び色素標識方法に関する更なる詳細は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号、同第２００６／０１８８９０１号、同第２００６／０２４０４３９号、同第２００６／０２８１１０９号、同第２００５／０１００９００号、同第２０１３／００７９２３２号、米国特許第７，０５７，０２６号、ＰＣＴ出願公開第２００５／０６５８１４号、同第２００６／０６４１９９号、同第２００７／０１０２５１号、及び同第２０１８／１６５０９９号、並びに米国特許出願第１７／３３８５９０号に記載されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

例示的なシーケンサ
図１を参照すると、例示的な配列決定システム１０の概略図が、サンプル１４の遺伝物質の配列を決定するように設計されたシーケンサ１２を含むものとして示されている。シーケンサは、様々な様式で機能することができ、本発明で企図される実施形態におけるような、標識されたヌクレオチドを使用するプライマー伸長による配列決定、並びに他の配列決定技術（例えば、ライゲーションによる配列決定又はパイロシークエンシング）を含む、様々な技術に基づき得る。いくつかの実施形態では、シーケンサ１２は、反応サイクル及びイメージングサイクルを通してサンプルを漸進的に移動させて、サンプル上の個々の部位でヌクレオチドをテンプレートに結合させることによってオリゴヌクレオチドを漸進的に構築する。いくつかの実施形態では、サンプルは、サンプル調製システム１６によって調製され得る。このプロセスは、配列決定プロセスによって配列が決定されるＤＮＡ又はＲＮＡ断片の多数の部位を作製するための、支持体上でのＤＮＡ又はＲＮＡの断片の増幅を含み得る。配列決定に適した増幅核酸の部位を生成するための例示的な方法としては、限定されないが、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification、ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８））、ブリッジＰＣＲ（Ａｄａｍｓ ａｎｄ Ｋｒｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｎｔｅｒ Ｈｉｌｌ，Ｍａｓｓ．）；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．，（１９９７）、Ａｄｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：Ｅ８７（２０００）、Ｐｅｍｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅｌｌ（２００５）、又は米国特許第５，６４１，６５８号）、ポロニー生成（Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５９２６－５９３１（２００３）、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２０：５５－６５（２００３））、又はエマルジョンを使用したビーズ上でのクローン増幅（Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：８８１７－８８２２（２００３））又はビーズベースのアダプタライブラリへのライゲーション（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：６３０－６３４（２０００）、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１６６５－１６７０（２０００））、Ｒｅｉｎａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ １：９５－１０４（２００２））が挙げられ、前述の刊行物は、参照により組み込まれる。サンプル調製システム１６は、サンプルを処理及びイメージングのためにサンプル容器内に配置してもよく、サンプルは、部位のアレイの形態であってもよい。

いくつかの実施形態では、シーケンサ１２は、流体制御／送達システム１８及び検出システム２０を含む。流体制御／送達システム１８は、参照番号２４によって指定される、プロセス中のサンプルのサンプル容器を通した循環のために、参照番号２２によって示されるような複数のプロセス流体を受容してもよい。当業者によって理解されるように、プロセス流体は、配列決定の特定の段階に依存して変化し得る。例えば、標識されたヌクレオチドを使用する合成による配列決定（ＳＢＳ）において、サンプルに導入されるプロセス流体は、ポリメラーゼ及び４つの一般的なＤＮＡタイプのタグ付きヌクレオチドを含むことができ、各ヌクレオチドは、一意の蛍光タグ及びそれに連結されたブロッキング剤を有する。蛍光タグは、検出システム２０が、アレイ中の個々の部位でテンプレート核酸にハイブリダイズしたプライマーにどのヌクレオチドが最後に付加されたかを検出することを可能にし、ブロッキング剤は、各部位でサイクル当たり１つを超えるヌクレオチドの付加を防止する。

配列決定サイクルの他の段階において、プロセス流体２２は、他の流体及び試薬（例えば、ヌクレオチドから伸長ブロックを除去するか、又はヌクレオチドリンカーを切断して、新たに伸長可能なプライマー末端を放出するための試薬）を含み得る。例えば、反応がサンプルのアレイ中の個々の部位で起こると、タグ付けされたヌクレオチドを含有する最初のプロセス流体は、１回以上のフラッシング操作でサンプルから洗浄され得る。次いで、サンプルは、検出システム２０における光学撮像などによって検出を受けることができる。その後、流体制御／送達システム１８によって試薬を添加して、最後に添加されたヌクレオチドを脱ブロックし、それぞれから蛍光タグを除去することができる。次いで、流体制御／送達システム１８は、サンプルを再び洗浄し得、次いで、サンプルは、配列決定の後続サイクルのために調製される。本明細書に記載される方法及びデバイスにおいて使用することができる例示的な流体及び検出構成は、国際公開第０７／１２３７４４号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、そのような配列決定は、配列決定から導出されるデータの品質が、収率の累積損失に起因して低下するまで、又は所定の数のサイクルが完了するまで、継続してもよい。

いくつかの実施形態では、プロセス中のサンプル２４の品質、並びにシステムによって導出されるデータの品質、及びサンプルを処理するために使用される様々なパラメータは、品質／プロセス制御システム２６によって制御される。品質／プロセス制御システム２６は、１つ以上のプログラムされたプロセッサ、又は流体制御／送達システム１８及び検出システム２０内のセンサ及び他の処理システムと通信する汎用若しくは特定用途向けコンピュータを含んでもよい。いくつかのプロセスパラメータは、高度な品質及びプロセス制御のために、例えば、配列決定実行の過程中に機器動作パラメータを変更することができるフィードバックループの一部として使用されてもよい。

いくつかの実施形態では、シーケンサ１２はまた、システム制御／オペレータインターフェース２８と通信し、最終的に後処理システム３０と通信する。システム制御／オペレータインターフェース２８は、プロセスパラメータ、取得したデータ、システム設定などを監視するように設計された汎用又は特定用途向けコンピュータを含むことができる。オペレータインターフェースは、ローカルに実行されるプログラムによって、又はシーケンサ１２内で実行されるプログラムによって生成することができる。いくつかの実施形態では、これらは、シーケンサのシステム又はサブシステムの健全性、取得されたデータの品質などの視覚的表示を提供することができる。システム制御／オペレータインターフェース２８はまた、人間のオペレータがシステムとインターフェースして、動作を調整し、配列決定を開始及び中断し、システムハードウェア又はソフトウェアと所望され得る任意の他の相互作用を行うことを可能にし得る。例えば、システム制御／オペレータインターフェース２８は、人間のオペレータからの入力なしに、配列決定手順において実行されるステップを自動的に実行及び／又は修正することができる。代替的又は追加的に、システム制御／オペレータインターフェース２８は、配列決定手順において実行されるステップに関する推奨を生成し、これらの推奨を人間のオペレータに表示することができる。このモードは、配列決定手順におけるステップを実行及び／又は修正する前に、人間のオペレータからの入力を可能にし得る。加えて、システム制御／オペレータインターフェース２８は、他のステップを実行及び／又は修正する前に人間のオペレータからの入力を要求しながら、シーケンサ１２によって自動的に実行される配列決定手順におけるある特定のステップを人間のオペレータが選択することを可能にするオプションを人間のオペレータに提供することができる。いずれにしても、自動化モード及びオペレータ対話モードの両方を可能にすることは、配列決定手順を実行する際の柔軟性の増加を提供し得る。加えて、自動化と人間制御相互作用との組み合わせは、人間オペレータから収集された入力に基づく適応機械学習を通して新しい配列決定手順及びアルゴリズムを作成及び修正することが可能なシステムを更に可能にし得る。

後処理システム３０は、ピクセル化された画像データの形態であり得る検出された情報を受信し、画像データから配列データを導出する、１つ以上のプログラムされたコンピュータを更に含み得る。後処理システム３０は、配列決定が進行するにつれて（例えば、特定の色及び／又は強度をコードする画像データの分析によって）個々の部位で結合するヌクレオチドに付着した色素の色（例えば、色素の蛍光発光スペクトル）を区別し、個々の部位の位置でヌクレオチドの配列を記録する画像認識アルゴリズムを含み得る。次いで、漸進的に、後処理システム３０は、サンプルアレイの個々の部位についての配列リストを構築することができ、これは、様々なバイオインフォマティクスアルゴリズムによって伸長された長さの材料についての遺伝情報を確立するために更に処理され得る。

配列決定システム１０は、個々のサンプルを取り扱うように構成され得るか、又は試薬及び他の流体の送達のため、及びヌクレオチドの配列を漸進的に構築する検出のために複数のステーションが提供される様式で、より高いスループットのために設計され得る。更なる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９７９７０１２号に見出すことができる。

特に、流体制御システム１８又は品質／プロセス制御システム２６が、１つ以上の動作が最適又は所望の様式で行われなかったことを検出する場合、サンプルは、処理から除去され、再処理されてもよく、そのような処理のスケジューリングは、リアルタイムで変更されてもよい。サンプルがプロセスから除去されるか、又は実質的な持続時間である処理中の休止を経験する実施形態では、サンプルを保管状態に置くことができる。サンプルを保管状態に置くことは、生体分子試薬、バイオポリマー又はサンプルの他の成分を安定化するために、サンプルの環境又はサンプルの組成を変化させることを含むことができる。サンプル環境を変化させるための例示的な方法としては、サンプル成分を安定化させるために温度を低下させること、サンプル成分の酸化を低減するために不活性ガスを添加すること、及びサンプル成分の光退色又は光分解を低減するために光源から除去することが挙げられるが、これらに限定されない。サンプル組成を変化させる例示的な方法としては、抗酸化剤、グリセロールなどの安定化溶媒を添加すること、酵素を安定化するレベルにｐＨを変化させること、又は他の成分を分解若しくは変化させる成分を除去することが挙げられるが、これらに限定されない。更に、配列決定手順におけるある特定のステップは、処理からサンプルを除去する前に行われ得る。例えば、サンプルが処理から除去されるべきであると決定される場合、サンプルは、流体制御／送達システム１８に向けられてもよく、その結果、サンプルは、保管前に洗浄され得る。これらのステップは、サンプルからの情報が失われないことを確実にするために行われ得る。

更に、配列決定操作は、ある特定の所定の事象が発生するといつでもシーケンサ１２によって中断され得る。これらの事象には、限定されないが、望ましくない温度、湿度、振動、迷光などの許容できない環境要因、不十分な試薬送達又はハイブリダイゼーション、サンプル温度の許容できない変化、許容できないサンプル部位数／品質／分布、減衰したシグナル対ノイズ比、不十分な画像データなどが挙げられる。このような事象の発生は、配列決定操作の中断を必要としないことに留意すべきである。むしろ、そのような事象は、シーケンス動作が継続すべきかどうかを決定する際に品質／プロセス制御システム２６によって重み付けされる要因であり得る。例えば、特定のサイクルの画像がリアルタイムで分析され、その光チャネルについて低シグナルを示す場合、画像は、より長い露光時間を使用して再露光され得るか、又は特定の化学処理が繰り返され得る。画像がフローセル内の気泡を示す場合、機器は、より多くの試薬を自動的に洗い流して気泡を除去し、次いで画像を再記録することができる。画像が、流体工学の問題に起因して、１つのサイクルにおける特定の光学チャネルに対して低シグナルを示す場合、機器は、その特定の光学チャネルに対する走査及び試薬送達を自動的に停止することができ、したがって、分析時間及び試薬消費を節約する。

本システムは、サンプルの物理的移動によってサンプルが異なるステーションと相互作用するシステムに関して上記で例示されているが、本明細書に記載される原理は、各ステーションで生じるステップがサンプルの移動を必要としない他の手段によって達成されるシステムにも適用可能であることが理解されるであろう。例えば、ステーションに存在する試薬は、様々な試薬を含むリザーバに接続された流体システムによってサンプルに送達することができる。同様に、光学システムは、１つ以上の試薬ステーションと流体連通しているサンプルを検出するように構成され得る。したがって、検出ステップは、本明細書に記載される任意の特定の試薬の送達前、送達中、又は送達後に行うことができる。したがって、サンプルは、必ずしもサンプルをデバイス内のその位置から物理的に除去することなく、流体送達又は光学的検出である１つ以上の処理ステップを中止することによって、処理から効果的に除去することができる。

開示されるシステムは、複数の異なるサンプル中の核酸を連続的に配列決定するために使用することができる。開示されるシステムは、配列決定ステップを実行するためのサンプルの配置及びステーションの配置を含むように構成され得る。サンプルの配列におけるサンプルは、互いに対して固定された順序及び固定された間隔で配置することができる。例えば、核酸アレイの配置を円形テーブルの外縁に沿って配置することができる。同様に、ステーションは、互いに対して固定された順序及び固定された間隔で配置され得る。例えば、ステーションは、サンプルアレイの配置のためのレイアウトに対応する外周を有する円形配置で配置され得る。ステーションの各々は、配列決定プロトコルにおいて異なる操作を実行するように構成され得る。サンプルアレイ及びステーションの配置は、ステーションが各反応部位で反応スキームの所望のステップを実行するように、互いに対して移動させることができる。ステーションの相対位置及び相対移動のスケジュールは、配列決定反応スキームにおける反応ステップの順序及び持続時間と相関させることができ、その結果、サンプルアレイがステーションのフルセットと相互作用するサイクルを完了すると、単一の配列決定反応サイクルが完了する。例えば、アレイ上の核酸標的にハイブリダイズされるプライマーは、ステーションの順序、ステーション間の間隔、及びアレイの通過速度が、試薬送達の順序及び完全な配列決定反応サイクルの反応時間に対応する場合、単一ヌクレオチドの付加によってそれぞれ伸長され、検出され、脱ブロックされ得る。

上記の構成に従って、個々のサンプルアレイによって完了される各ラップ（又は円形テーブルが使用される実施形態における完全な回転）は、アレイ上の標的核酸の各々についての単一ヌクレオチドの決定に対応し得る（例えば、配列決定実行の各サイクルにおいて実施される取り込み、画像化、切断及び脱ブロッキングの工程を含む）。更に、システム内（例えば、円形テーブル上）に存在するいくつかのサンプルアレイは、システムを通して同様の反復ラップに沿って同時に移動し、それによって、システムによる連続配列決定をもたらす。開示されるシステム又は方法を使用して、試薬は、配列決定サイクルの第１の反応ステップに従って、第１のサンプルアレイから能動的に送達又は除去されることができ、一方、インキュベーション、又はサイクル内のいくつかの他の反応ステップが、第２のサンプルアレイについて起こる。したがって、ステーションのセットは、サンプルアレイが任意の所定の時間において配列決定サイクルの異なるステップに供される場合でさえ、反応が複数のサンプルアレイにおいて同時に起こり、それによって連続的かつ同時の配列決定が行われることを可能にするように、サンプルアレイの配置との空間的関係及び時間的関係において構成され得る。そのような循環システムは、化学及びイメージング時間が不均衡であるときに使用されてもよい。走査に短い時間しかかからない小さなフローセルの場合、システムは、機器がデータを取得するのに費やす時間を最適化するために、並行して実行するいくつかのフローセルを有することができる。イメージング時間と化学時間が等しい場合、単一のフローセル上でサンプルを配列決定しているシステムは、イメージングサイクルではなく化学サイクルを実行する時間の半分を費やし、したがって、２つのフローセルを処理することができるシステムは、１つを化学サイクル上に、１つをイメージングサイクル上に有することができる。イメージング時間が化学処理時間の１０分の１である場合、システムは、データを連続的に取得しながら、化学処理の様々な段階で１０個のフローセルを有することができる。

いくつかの実施形態では、開示されたシステムは、システムが第３のサンプルアレイの核酸を連続的に配列決定する間に、第１のサンプルアレイを第２のサンプルアレイで置き換えることを可能にするように構成される。したがって、第１のサンプルアレイは、別のサンプルアレイで生じる配列決定反応を中断することなく、システムに個々に添加され得るか又はシステムから除去され得、それによって、サンプルアレイのセットについての連続的な配列決定を可能にする。更に、異なる長さの配列決定実行は、個々のサンプルアレイがシステムを通して異なる数のラップを完了することができ、サンプルアレイは、他の部位で生じる反応が乱されないように独立した様式でシステムから除去又はシステムに追加することができるので、システムにおいて連続的かつ同時に行うことができる。

図２は、アレイの部位に付加されたヌクレオチドを検出することができ、図１の例示的な配列決定システムと併せて使用することができる例示的な検出ステーション３８を示す。上述したように、サンプルは、物理的に異なる場所に配置された装置の２つ以上のステーションに移動させることができるか、あるいは、必ずしも異なる場所に移動させることなく、１つ以上のステーションと連通しているサンプルに対して１つ以上のステップを実行することができる。したがって、特定のステーションに関する本明細書の説明は、サンプルがステーション間を移動するか否か、ステーションがサンプルに移動するか否か、又はステーション及びサンプルが互いに対して静止しているか否かにかかわらず、様々な構成のステーションに関するものと理解される。図２に示される実施形態では、１つ以上の光源４６が、調整光学系４８に向けられる光ビームを提供する。光源４６は、１つ以上のレーザを含んでもよく、複数のレーザが、異なる対応する波長で蛍光を発する色素を検出するために使用される。光源は、調整光学系におけるビームのフィルタリング及び整形のために、ビームを調整光学系４８に向けることができる。例えば、本発明で企図される実施形態では、調整光学系４８は、複数のレーザからのビームを組み合わせて、集束光学系５０に伝達される実質的に線形の放射ビームを生成する。レーザモジュールは、各レーザの出力を記録する測定構成要素を更に含むことができる。出力の測定は、各画像について均一な露光エネルギー、したがってシグナルを得るために、画像が記録される時間の長さを制御するためのフィードバック機構として使用することができる。測定構成要素がレーザモジュールの故障を検出した場合、機器は、サンプルを「保持バッファ」で洗い流して、レーザ内の誤差が補正され得るまでサンプルを保存することができる。

サンプル２４は、サンプル位置決めシステム５２上に位置決めされ、サンプル位置決めシステム５２は、サンプルを３次元で適切に位置決めすることができ、サンプルアレイ上の部位の漸進的なイメージングのためにサンプルを移動させることができる。本発明で企図される実施形態では、集束光学系５０は、配列決定される個々の部位が位置するアレイの１つ以上の表面に放射線を共焦点的に向ける。集束ビーム中の光の波長に依存して、放射線の逆ビームが、各部位でヌクレオチドに結合した色素の蛍光に起因してサンプルから戻される。

次に、レトロビームは、ビーム内の異なる波長を分離し、これらの分離されたビームを１つ以上のカメラ５６に向けるなど、ビームをフィルタリングすることができるレトロビーム光学系５４を通して戻される。カメラ５６は、デバイス内の位置に衝突する光子に基づいてピクセル化された画像データを生成する電荷結合素子を含むなど、任意の適切な技術に基づくことができる。いくつかの実施形態では、カメラ５６はＣＭＯＳセンサを含んでもよい。いくつかの実施形態では、カメラ５６は、１つ以上のオートフォーカスカメラを含んでもよい。いくつかの実施形態では、カメラ５６は、１つ以上の時間遅延積分（time delay and integration、ＴＤＩ）カメラを含んでもよい。カメラは画像データを生成し、画像データは次いで画像処理回路５８に転送される。いくつかの実施形態では、処理回路５８は、アナログ－デジタル変換、スケーリング、フィルタリング、及び複数のフレーム内のデータの関連付けなどの様々な動作を実行して、サンプル上の特定の位置にある複数の部位を適切かつ正確に撮像することができる。画像処理回路５８は、画像データを記憶することができ、最終的に画像データを後処理システム３０に転送することができ、後処理システム３０では、画像データから配列データを導出することができる。検出ステーションで使用することができる例示的な検出デバイスとしては、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１４３６２号（米国特許出願第１１／２８６，３０９号）及び国際公開第０７／１２３７４４号に記載されているものが挙げられ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

図３に示されるようなコンピュータシステム１０６は、図１の例示的配列決定システム１０のシステム制御／オペレータインターフェース２８及び後処理システム３０を実装するために使用され得る。図３に示すように、コンピュータシステム１０６は、光学／流体工学システムを制御し、ポリヌクレオチドの核酸塩基配列を決定するための機能を含むことができる。

一実施形態では、コンピュータシステム１０６は、メモリ２０４、記憶装置２０６、及び通信インターフェース２０８と電気通信するプロセッサ２０２を含む。プロセッサ２０２は、流体システム１０４に、配列決定反応中にフローセル１１４に試薬を供給させる命令を実行するように構成することができる。プロセッサ２０２は、光学システム１０２の光源１２０を制御して所定の波長付近の光を生成する命令を実行することができる。プロセッサ２０２は、光学システム１０２の検出器１２６を制御し、検出器１２６からデータを受信する命令を実行することができる。プロセッサ２０２は、命令を実行して、検出器１２６から受け取ったデータ、例えば蛍光画像を処理し、検出器１２６から受け取ったデータに基づいてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。メモリ２０４は、配列決定システム１００が電源投入されたときにコンピュータシステム１０６の機能を実行するようにプロセッサ２０２を構成するための命令を記憶するように構成することができる。配列決定システム１００の電源が切られているとき、記憶装置２０６は、コンピュータシステム１０６の機能を実行するようにプロセッサ２０２を構成するための命令を記憶することができる。通信インターフェース２０８は、コンピュータシステム１０６、光学システム１０２、及び流体システム１０４の間の通信を促進するように構成することができる。

コンピュータシステム１０６は、配列決定システム１００の配列決定結果を表示するための表示装置（図示せず）と通信するように構成されたユーザインターフェース２１０を含むことができる。ユーザインターフェース２１０は、配列決定システム１００のユーザから入力を受信するように構成することができる。コンピュータシステム１０６の光学システムインターフェース２１２及び流体システムインターフェース２１４は、図１Ａに図示される通信リンク１０８ａ及び１０８ｂを通して、光学システム１０２及び流体システム１０４を制御するように構成することができる。例えば、光学システムインターフェース２１２は、通信リンク１０８ａを介して光学システム１０２のコンピュータインターフェース１１０と通信することができる。

コンピュータシステム１０６は、検出器１２６から受け取ったデータを使用してポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するように構成された核酸塩基決定器２１６を含むことができる。核酸塩基決定器２１６は、テンプレート生成器２１８、位置登録器２２０、強度抽出器２２２、強度補正器２２４、塩基コーラ２２６、及び品質スコア決定器２２８のうちの１つ以上を含むことができる。テンプレート生成器２１８は、検出器１２６によって取り込まれた蛍光画像を使用して、フローセル１１４内のポリヌクレオチドクラスターの位置のテンプレートを生成するように構成することができる。位置登録器２２０は、テンプレート生成器２１８によって生成された位置テンプレートに基づいて、検出器１２６によって取り込まれた蛍光画像内のフローセル１１４内のポリヌクレオチドクラスターの位置を登録するように構成することができる。強度抽出器２２２は、蛍光画像から蛍光発光の強度を抽出して、抽出強度を生成するように構成することができる。例えば、ＤＮＡクラスターの回折限界スポットにおいて見出されるピーク強度値は、画像から抽出され、ＤＮＡクラスターのシグナルを表すために使用され得る。別の例では、ＤＮＡクラスターの回折限界スポット内に含まれる総強度は、画像から抽出され、ＤＮＡクラスターのシグナルを表すために使用され得る。あるいは、強度推定は、等化及びチャネル推定の使用を通して行われることができる。

強度補正器２２４は、配列決定反応又は光学システムに固有のノイズ又は収差を低減又は排除するように構成され得る。例えば、強度は、レーザ強度変動、ＤＮＡクラスター形状／サイズ変動、不均一な照明、光学的歪み若しくは収差、及び／又はＤＮＡクラスター内で発生する位相調整／事前位相調整によって影響され得る。いくつかの実施形態では、強度補正器２２４は、抽出された強度を位相補正又はプリ位相補正することができる。塩基コーラ２２６は、補正された強度からポリヌクレオチドの核酸塩基を決定するように構成することができる。塩基コーラ２２６によって決定されたポリヌクレオチドの塩基は、品質スコア決定器２２８によって決定された品質スコアに関連付けることができる。品質スコアリングは、品質スコアを各塩基コールに割り当てるプロセスを指す。配列決定リードから塩基コールの品質を評価するために、例示的なプロセスは、塩基コールについての予測子値のセットを計算することと、予測子値を使用して品質表において品質スコアをルックアップすることとを含み得る。品質スコアは、ユーザが任意の所与の塩基コールのエラーの確率を決定することを可能にする任意の適切なフォーマットで提示され得る。いくつかの実施形態では、品質スコアは数値として提示される。例えば、品質スコアはＱＸＸとして引用することができ、ここで、ＸＸはスコアであり、それは、その特定のコールが１０^{－ＸＸ／１０}の誤り確率を有することを意味する。したがって、一例として、Ｑ３０は１０００分の１、すなわち０．１％の誤り率に等しく、Ｑ４０は１０，０００分の１、すなわち０．０１％の誤り率に等しい。誤り率は、対照核酸を用いて計算することができる。更に、いくつかのメトリック表示は、サイクルごとの誤り率を含むことができる。いくつかの実施形態では、品質表は、較正データセットを使用して生成され、較正セットは、実行及び配列変動性を表す。核酸塩基決定器によって実行され得る計算の更なる詳細、誤り率の算出及び品質スコアは、米国特許第８３９２１２６号、米国特許出願公開第２０２０／００８０１４２号及び同第２０１２／００２０５３７号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

並行インサート及びインデックス配列決定
図４は、開示される技術の一実施形態による、インデックス付けされたサンプルの配列決定の概略図を示す。クローン核酸クラスター４０２は、固体支持体４０１（例えば、フローセルの一部）の表面に付着している多くのクローン核酸クラスターのうちの１つであってもよい。クローン核酸クラスター４０２は、テンプレートポリヌクレオチド４０３のクローンコピーを含んでもよい。例えば、クローン核酸クラスター４０２は、テンプレートポリヌクレオチドのブリッジＰＣＲ増幅によって生成することができる。いくつかの実施形態では、テンプレートポリヌクレオチドは、インデックス付けされた核酸サンプルであり得る。例えば、テンプレートポリヌクレオチド鎖４０３は、核酸サンプルに由来するインサート部分４０９と、ライブラリ調製プロセス中に付加されるインデックス部分４０４とを含み得る。追加されたインデックス部分は、サンプルを一意に同定する（例えば、サンプルの供給源及び／又はバッチ番号を一意に示す）バーコードを含んでもよい。付加されたインデックス部分は、約６、１０、１５、２０、２５、又はそれらの間の任意の値のヌクレオチド長の核酸であり得る。

ライブラリ調製プロセスはまた、リードプライマー４２９がインサート部分４０９の隣に特異的にハイブリダイズして、重合／プライマー伸長反応を開始し、蛍光標識されたヌクレオチドが伸長されたリードプライマーに付加される際にインサート部分４０９の配列決定を可能にすることができるように、プライマー結合部位をインサート部分４０９の隣に付加してもよい。同様に、ライブラリ調製プロセスは、インデックスプライマー４１４がインデックス部分４０４の隣に特異的にハイブリダイズして、重合／プライマー伸長反応を開始し、蛍光標識されたヌクレオチドが伸長されたインデックスプライマーに付加される際にインデックス部分４０４の配列決定を可能にすることができるように、別のプライマー結合部位をインデックス部分４０４の隣に付加してもよい。しかしながら、伸長されたリードプライマーによって放出される蛍光シグナル及び伸長されたインデックスプライマーによって放出される蛍光シグナルは同じ場所に位置し、光学的に分解され得ないので、インサート部分４０９及びインデックス部分４０４の核酸配列を正確に決定するために、少なくとも伸長されたリードプライマーにおける標識されたヌクレオチドが伸長されたインデックスプライマーにおける標識されたヌクレオチドと同じでない場合（例えば、「Ａ」がリードプライマーに付加され、「Ｃ」がインデックスプライマーに付加される場合）、蛍光シグナルが伸長されたリードプライマー又は伸長されたインデックスプライマーに関連するかどうかを決定するための方法が必要である。蛍光シグナルが伸長されたリードプライマー又は伸長されたインデックスプライマーに関連するかどうかを決定する１つの方法は、識別可能なレベルのシグナル強度を使用することである。いくつかの実施形態では、インデックスプライマーの一部（例えば、４分の１、３分の１、半分、３分の２など、又はそれらの間の任意の値）は、化学的にブロックされており、ポリメラーゼによって伸長され得ない。ブロックされたインデックスプライマーは、図４において参照番号４１５として標識される。例えば、インデックスプライマーの一部は、化学的にブロックされた３’末端を有し得る一方で、全てのリードプライマー４２９は、ブロックされていない３’末端を有し得る。結果として、クラスター内で伸長されるインデックスプライマーの数は、リードプライマーの数と比較して少なくてもよい。クラスター中の伸長されたインデックスプライマーに関連する標識されたヌクレオチドの数は、リードプライマーの数と比較して少なくてもよい。蛍光励起を受けた後、インデックスプライマーに付加された標識されたヌクレオチドから放出されるシグナルは、リードプライマーのシグナルと比較して弱い場合がある。したがって、より弱いシグナル及びそれが表すヌクレオチド同一性は、伸長されたインデックスプライマーに関連するものとして決定することができる。

使用において、リードプライマー、ブロックされたインデックスプライマー及びブロックされていないインデックスプライマーは、一緒に混合され、混合物としてフローセルに提供され、テンプレートポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズされ得る（例えば、同時に／同じ反応工程においてハイブリダイズされる）。次いで、例えば、蛍光標識されたヌクレオチド類似体を用いて、合成による配列決定反応サイクルが実施され得る。したがって、クラスター４０２から放出される蛍光シグナルは、伸長されたリードプライマー４２９及び伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４の両方に由来し得る。更に、クラスター内の伸長されたリードプライマー４２９のコレクション及び伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４のコレクションから放出される蛍光シグナルの強度は、クラスター内の２種類のプライマー分子の量、又は２種類の伸長されたプライマー分子上の標識されたヌクレオチド類似体の量に比例し得る。したがって、シグナルが伸長されたリードプライマー４２９に由来するか、又は伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４に由来するかの決定は、受信シグナルの強度（又は輝度）に基づいて行うことができる。例えば、インデックスプライマーの半分がブロックされる場合、インデックス部分４０４に付加された標識されたヌクレオチドからのシグナルの強度は、インサート部分４０９に付加された標識されたヌクレオチドからのシグナルの強度と比較して半分の強度である。したがって、配列決定システムにおけるシグナル対ノイズ比（signal-to-noise ratio、ＳＮＲ）が、半強度シグナルを全強度シグナルから区別するのに十分に高い（例えば、約８ｄＢ、１０ｄＢ、又は１２ｄＢの閾値を上回る）ままであるという条件で、インデックス部分４０４における核酸塩基及びインサート部分４０９における核酸塩基の両方を並行して（又は実質的に同時に）同定することができる。（すなわち、図６に示されるビンは十分に分離されており、例えば分解することができる。）核酸クラスター中の２つの核酸塩基の同時同定のこの段階において、ＳＮＲは、平均塩基コール強度を非塩基コール強度の標準偏差で割ったものとして計算することができ、ここで、強度は、各クラスターに由来する２つのシグナルに関連する。一態様では、例えば、図６の１６個のビンを考慮すると、ＳＮＲは、２つのビン間の平均強度の差をそれらのビン内の強度の標準偏差で除算したものとして計算することができ、１６個のビンは、各クラスターから来る２つのシグナルに関連付けられた強度の分布を表す。ＳＢＳ反応サイクルの過程にわたって、配列決定システムにおけるＳＮＲは、鎖終結、ポリメラーゼ損傷などの問題に起因して減衰し得る。したがって、必要とされる塩基コールエラー率（例えば、０．０１％）を達成するために十分であるものよりもはるかに高いＳＮＲが、ＳＢＳ反応サイクルの過程の開始時に使用され得る。例えば、２０ｄＢを上回るＳＮＲは、配列決定実行の開始時に使用され得、ＳＮＲは、ＳＢＳサイクルにわたって徐々に減衰し得、約１０又は２０ ＳＢＳサイクル後に閾値（例えば、８ｄＢ、１０ｄＢ、又は１２ｄＢ）に達する。したがって、配列決定実行の開始時におけるＳＮＲの余剰は、約１０又は２０ＳＢＳサイクルまでのインデックス部分４０４における核酸塩基及びインサート部分４０９における核酸塩基の同時同定を可能にし得る。

インデックス部分のためのブロックされたプライマー及びインサート部分のためのブロックされていないプライマーの一部を使用する実施形態は、インデックスシグナル（インデックス部分４０４からのシグナル）及びインサートシグナル（インサート部分４０９からのシグナル）が同じクラスター位置に物理的に配置されることを確実にするのに役立ち得る。更に、インデックス対インサートシグナル（すなわち、インデックス部分４０４からのシグナル対インサート部分４０９からのシグナル）の比がクラスターごとに維持されることを確実にすることができ、したがって、クラスターのサイズからシグナルの比への予想される影響はない。すなわち、クラスターがより大きいかより小さいか（例えば、テンプレート鎖のより多くのコピー又はより少ないコピーを含むか）にかかわらず、そのインサートシグナル及びインデックスシグナルは両方とも、クラスターサイズに従って同じ量だけスケーリングされる。

いくつかの実施形態では、ある特定の数のプライマー伸長工程／配列決定サイクル（例えば、約１０又は２０サイクル）の後、又は配列決定システムにおけるシグナル対ノイズ比が所望の閾値（例えば、８ｄＢ、１０ｄＢ、又は１２ｄＢ）未満に低下した場合、インデックスプライマーは、配列決定がリードプライマー４２９からのみ生じるように、クラスター４０２から除去され得る。例えば、インデックスプライマーは、熱的に脱ハイブリダイズされ得る。別の例として、インデックスプライマーは、ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）をテンプレートポリヌクレオチド鎖と接触させてインデックスプライマーを置換することによって除去されてもよく、ＬＮＡは化学的にブロックされてもよく、重合しなくてもよい。いくつかの実施形態では、伸長されたインデックスプライマーは、最終的にリードプライマー４２９に移動してもよく、インデックスプライマー４１４からの重合が停止してもよい。一例では、伸長部分がハイブリダイズしたリードプライマーと接触したときにインデックスプライマーの伸長が停止するように、非鎖置換ポリメラーゼが使用され得る。いくつかの実施形態では、伸長されたインデックスプライマーは、最終的に固体支持体４０１に移動して、インデックスプライマー４１４からの重合は停止し得る（例えば、重合が固体支持体４０１に向かって移動するが、インデックス部分４０４がインサート部分４０９と比較して固体支持体により近いシナリオにおいて）。インデックスプライマーの除去後、又はインデックスプライマーからの重合が停止した後、リードプライマー４２９からの反応が継続してもよく、インサート部分４０９が配列決定され続けてもよい。核酸クラスター中の１つのみの核酸塩基を同定する段階（例えば、約１０又は２０サイクル後に、インサート部分４０９のみを配列決定する）において、配列決定システムにおけるシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）は、例えば、平均塩基コール強度を非塩基コール強度の標準偏差で割ったものとして、異なって計算され得、ここで、強度は、各クラスターからの１つのみのシグナルに関連する。一態様では、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１３／００７９２３２号に記載されているように、核酸クラスターからのシグナルの分布の散布図において４つのビンのみを考慮する。このシナリオでは、ＳＮＲは、２つのビン間の平均強度の差をそれらのビンにおける強度の標準偏差で除算したものとして計算することができ、４つのビンは、各クラスターからの１つのシグナルのみに関連付けられた強度の分布を表す。クラスター中の１つの核酸塩基のみを同定する段階の間のＳＮＲは、上記と同様の問題に起因して、配列決定サイクルにわたって徐々に減衰し得、約５００ＳＢＳサイクル後に閾値（例えば、最小限必要とされる塩基コールエラー率に対応する８ｄＢ、１０ｄＢ、又は１２ｄＢ）に達する。

したがって、開示される技術は、インデックスプライマー及びリードプライマーを同じ操作で（又は実質的に同時に）ハイブリダイズ及び／又は脱ハイブリダイズすることができ（テンプレート鎖の配列決定の完了時に）、したがって、別々の操作を使用することと比較して時間を節約するという点で、より効率的な配列決定ワークフローを提供する。更に、開示される技術は、インデックス部分がインサート部分と並行して（又は同時に）配列決定され得、したがって、インデックス部分及びインサート部分を別々に（又は連続して）配列決定することと比較して、ＳＢＳの読み取りサイクルを節約するという点で、より効率的な配列決定ワークフローを提供する。読み取りサイクルを節約することは、配列決定ワークフローがより短い実行時間で実装されることを可能にし得、例えば、実行時間の節約は、いくつかの例では、約半時間であり得る。

開示される技術の更なる実施形態では、クラスターに結合したインデックスプライマー及びリードプライマーの比は、配列決定の前に調整及び決定されてもよく、この情報は、配列決定中に得られた蛍光イメージングデータを較正するために使用されてもよい。例えば、クラスターにハイブリダイズしたインデックスプライマー及びリードプライマーの比は、異なるフルオロフォアがインデックスプライマー及びリードプライマーに結合している場合、蛍光イメージングによってモニターすることができる。インデックスプライマー及びリードプライマーは、所望の比が達成されるまで、調節された熱脱ハイブリダイゼーションによって異なる速度で除去され得る。あるいは、蛍光団は、配列決定の前にインデックスプライマー及びリードプライマーから化学的に除去され得る。

図５は、図４に例示した開示された技術の実施形態と併せて使用され得る例示的な色素標識スキームを示す。図５に示されるように、異なるタイプのヌクレオチド類似体は、異なる吸収及び／又は発光スペクトルを有する異なる蛍光標識／色素によって標識され得る。例えば、ｄＧＴＰは標識されておらず、ｄＡＴＰは第１の標識／色素で標識されており、ｄＣＴＰは第２の標識／色素で標識されており、ｄＴＴＰは第３の標識／色素で標識されており、したがって、異なるタイプのヌクレオチド類似体は、光源によって励起された後に蛍光発光の異なる特性を生成することができる。代替の色素標識スキームが企図され得る。例えば、ｄＴＴＰは、２つの異なる色素で標識され得る。いくつかの実施形態では、色素の吸収スペクトルは、約４５０ｎｍの「青色」レーザなどの所定の波長の単一光源によって色素を励起することを可能にする。しかしながら、実施形態は、この特定の波長の光を発生させる光源に限定されず、赤色、緑色、紫色、又は他の利用可能な波長の光に対応する他の波長が企図される。他の実施形態では、色素の吸収スペクトルが十分に異なる場合、２つ以上の光源を使用して染料を励起してもよい。

第１の蛍光標識／色素は、第１の光チャネル（例えば、図５の「ＩＭＡＧＥ１」）で撮影された第１の画像に取り込むことができる発光スペクトルを有し得る。第２の蛍光標識／色素は、第１の光チャネルとは異なる第２の光チャネル（例えば、図５の「ＩＭＡＧＥ２」）で撮影された第２の画像に取り込むことができる発光スペクトルを有し得る。第３の蛍光色素は、第１及び第２の光チャネルの両方（例えば、図５の「ＩＭＡＧＥ１」及び「ＩＭＡＧＥ２」の両方）に取り込むことができる発光スペクトルを有し得る。その結果、図５に示す例では、ｄＴＴＰは、十分に高い強度で第１及び第２の画像の両方に示されるものとして同定することができる。ｄＧＴＰは、いずれの画像においても非常に低い強度（例えば、カットオフ値よりも低い）を有するものとして示され得る。ｄＡＴＰは、第１の画像では十分に高い強度を示すが、第２の画像では非常に低い強度（例えば、カットオフ値より低い）を示すものとして同定することができる。ｄＣＴＰは、十分に高い強度を有するが、第１の画像では非常に低い強度（例えば、カットオフ値より低い）を有する第２の画像を示すものとして同定され得る。４つのタイプのヌクレオチド類似体にコンジュゲートされた蛍光色素は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図しない。他の実施形態では、いずれの蛍光色素ともコンジュゲートされないヌクレオチド類似体は、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、又はｄＡＴＰであり得る。他の実施形態では、第１の蛍光色素とコンジュゲートされたヌクレオチド類似体は、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、又はｄＴＴＰであり得る。他の実施形態では、第２の蛍光色素とコンジュゲートされたヌクレオチド類似体は、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はｄＡＴＰであり得る。他の実施形態では、第３の蛍光色素とコンジュゲートされたヌクレオチド類似体は、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、又はｄＣＴＰであり得る。

いくつかの実施形態では、開示される配列決定システムにおいて使用されるヌクレオチド類似体は、完全に官能化されたヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド塩基と蛍光分子との間に位置するリンカーは、１つ以上の切断基を含み得る。その後の配列決定サイクルの前に、蛍光標識は、リンカーの切断によってヌクレオチド類似体から除去され得る。例えば、蛍光標識をヌクレオチド類似体に付着させるリンカーは、リンカーがホスフィン試薬による各組み込みサイクル後に切断され、それによって蛍光標識を放出することができるように、アジド及び／又はアルコキシ基を例えば同じ炭素上に含むことができる。ヌクレオチド三リン酸は、配列決定が制御されるように３’位で可逆的にブロックされ得、単一のヌクレオチド類似体のみが、各サイクルにおいて各伸長性プライマー－ポリヌクレオチドに付加され得る。例えば、ヌクレオチド類似体の３’リボース位置は、ホスフィン試薬による切断によって除去することができるアルコキシ及びアジド官能基の両方を含むことができ、それによって、更に伸長することができるヌクレオチドを生成する。その後の配列決定サイクルの前に、可逆的３’ブロックを除去して、別のヌクレオチド類似体を各伸長性プライマー－ポリヌクレオチドに付加することができる。

いくつかの実施形態では、蛍光標識は、ポリメチン誘導体、クマリン誘導体、ベンゾピラン誘導体、クロメノキノリン誘導体、ビス－ホウ素複素環を含有する化合物、例えば、ＢＯＰＰＹ及びＢＯＰＹＰＹからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、切断可能なリンカーを介してヌクレオチドに取り付けられている。いくつかの更なる実施形態では、標識されたヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に結合された蛍光標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置に、任意選択的にリンカー部分を通して結合された蛍光標識を有し得る。例えば、核酸塩基は、７－デアザアデニンであり得、色素は、Ｃ７位置で、任意選択的に切断可能なリンカーを介して７－デアザアデニンに結合している。核酸塩基は、７－デアザグアニンであり得、色素は、Ｃ７位置で、任意選択的に切断可能なリンカーを介して７－デアザグアニンに結合している。核酸塩基は、シトシンであり得、色素は、任意選択的に切断可能なリンカーを通して、Ｃ５位置でシトシンに結合されている。別の例として、核酸塩基は、チミン又はウラシルであり得、色素は、任意選択的に切断可能なリンカーを通して、Ｃ５位置でチミン又はウラシルに結合されている。いくつかの更なる実施形態では、切断可能なリンカーは、３’ヒドロキシブロッキング基及び切断可能なリンカーが同じ反応条件下又は単一の化学反応において除去され得るように、可逆的ターミネーター３’ヒドロキシブロッキング基と類似又は同じ化学的部分を含み得る。切断可能なリンカーの非限定的な例としては、ＬＮ３リンカー、ｓＰＡリンカー、及びＡＯＬリンカーが挙げられ、これらの各々は以下に例示される。

いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ｄＧＴＰの類似体、ｄＴＴＰの類似体、ｄＵＴＰの類似体、ｄＣＴＰの類似体、及びｄＡＴＰの類似体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチドは第１の可逆的にブロックされたヌクレオチド三リン酸（reversibly blocked nucleotide triphosphate、ｒｂＮＴＰ）であり、第２のヌクレオチドは第２のｒｂＮＴＰであり、第３のヌクレオチドは第３のｒｂＮＴＰであり、第４のヌクレオチドは第４のｒｂＮＴＰであり、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド及び第４のヌクレオチドのそれぞれは、互いに異なる種類のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、４つのｒｂＮＴＰは、ｒｂＡＴＰ、ｒｂＴＴＰ、ｒｂＵＴＰ、ｒｂＣＴＰ、及びｒｂＧＴＰからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、４つのｒｂＮＴＰの各々は、修飾塩基及び可逆的ターミネーター３’ブロッキング基を含む。３’ブロッキング基の非限定的な例としては、アジドメチル（^＊－ＣＨ_２Ｎ_３）、置換アジドメチル（例えば、^＊－ＣＨ（ＣＨＦ_２）Ｎ_３又は^＊－ＣＨ（ＣＨ_２Ｆ）Ｎ_３）及び^＊－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ＝ＣＨ_２が挙げられ、式中、アスタリスク^＊は、ヌクレオチドのリボース環又はデオキシリボース環の３’酸素への点結合を示す。

色素及び完全に官能化されたヌクレオチドについての更なる詳細は、米国特許出願公開第２０１８／００９４１４０号及び同第２０２０／０２７７６７０号、国際特許出願公開第２０１７／０５１２０１号、並びに米国仮特許出願第６３／０５７７５８号及び同第６３／１２７０６１号に見出すことができ、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

図６は、一例において図５に示される色素標識スキームを用いて実施され得る、図４に示される開示される技術の実施形態による核酸クラスターからのシグナルの１６個の分布の例を示す散布図である。図４に関連して説明したように、一実施形態では、伸長されたリードプライマー４２９のコレクションに由来する蛍光シグナルは、同じクラスター内の伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４のコレクションに由来する蛍光シグナルよりも明るい。図６の散布図は、クラスターのより明るいシグナルとより暗いシグナルとの組み合わせからの強度値の１６個の分布（又はビン）を示す。２つのシグナルは共局在化されてもよく、光学的に分解されなくてもよい。図６に示す強度値は、スケールファクタまでであってもよく、強度値の単位は任意であり得る。伸長されたリードプライマー４２９からのより明るいシグナルと、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４からのより暗いシグナルとの合計は、組み合わされたシグナルをもたらす。組み合わされたシグナルは、第１の光チャネル及び第２の光チャネル（例えば、図５の「ＩＭＡＧＥ１」チャネル及び「ＩＭＡＧＥ２」チャネル）によって捕捉されてもよい。より明るいシグナルはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧであり得、より暗いシグナルはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧであり得るので、図５に関連して説明した実施形態に従って光学的に捕捉されたときの１６個の区別可能なパターンに対応して、組み合わせシグナルについて１６個の可能性がある。すなわち、１６個の可能性の各々は、図６に示されるビンに対応する。コンピュータシステムは、クラスターからの合成シグナルを１６個のビンのうちの１つにマッピングすることができ、したがって、伸長されたリードプライマー４２９における付加核酸塩基及び伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加核酸塩基をそれぞれ決定することができる。

例えば、合成シグナルが塩基コールサイクルのためにビン６１２にマッピングされる場合、コンピュータプロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基及び伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基の両方をＣと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６１４にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＣと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＴと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６１６にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＣと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＧと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６１８にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＣと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＡと塩基コールする。

組み合わされたシグナルが、塩基コールサイクルのためにビン６２２にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＴと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＣと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６２４にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基及び伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基の両方をＴと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６２６にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＴと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＧと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６２８にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＴと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＡと塩基コールする。

組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６３２にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＧと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＣと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６３４にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＧと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＴと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６３６にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基及び伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基の両方をＧと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６３８にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＧと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＡと塩基コールする。

組み合わされたシグナルが、塩基コールサイクルのためにビン６４２にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＡと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＣと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６４４にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＡと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＴと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６４６にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基をＡと塩基コールし、伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基をＧと塩基コールする。組み合わされたシグナルが塩基コールサイクルのためにビン６４８にマッピングされる場合、プロセッサは、伸長されたリードプライマー４２９における付加された核酸塩基及び伸長されたブロックされていないインデックスプライマー４１４における付加された核酸塩基の両方をＡと塩基コールする。

単純化された配列決定ワークフロー
図７は、図４による開示された技術の実施形態を利用し得る、ポリヌクレオチドを配列決定するための簡略化された方法を示す流れ図である。簡略化された方法は、フォワード及びリバーステンプレート配列決定の両方について、インデックス配列決定調製及びインサート配列決定調製（例えば、ハイブリダイズするプライマー）が単一の反応ステップに組み合わされるので、より短い配列決定時間を必要とし得る。更に、インデックス及びインサートは、最初の数回の配列決定サイクル（例えば、最初の１０サイクル）において同時に配列決定され得、したがって、フォワードテンプレート配列決定及びリバーステンプレート配列決定の両方について、数回の配列決定サイクルについての時間を節約する。

図７に示されるように、開示される方法は、ブロック７０１、シーケンサ及び試薬条件の実行前チェックから開始し得る。次いで、この方法は、ブロック７０２（播種及びクラスター生成）に移動することができ、これは、オリゴヌクレオチドアンカーが結合される平面状の光学的に透明な表面へのフォワードテンプレートポリヌクレオチド鎖の付着を含み得る。フォワードテンプレートポリヌクレオチドは、図４で説明したように、インデックス部分及びインサート部分を含む。例えば、フォワードテンプレートポリヌクレオチドを末端修復して、５’リン酸化されたブラント末端を生成し、クレノウ断片のポリメラーゼ活性を使用して、単一のＡ塩基を、ブラントリン酸化核酸断片の３’末端に付加することができる。この付加は、オリゴヌクレオチドアダプタにライゲーションするための核酸断片を調製し、これは、ライゲーション効率を高めるために、それらの３’末端に単一のＴ塩基のオーバーハングを有する。アダプタオリゴヌクレオチドは、フローセルアンカーオリゴに相補的である。制限希釈条件下で、アダプタ修飾一単鎖フォワードテンプレートポリヌクレオチドがフローセルに添加されて、アンカーオリゴへのハイブリダイゼーションによって固定される。付着した核酸断片を伸長させ、ブリッジを増幅して、数億個のクラスターを有する超高密度配列決定フローセルを作製し、それぞれが同じテンプレートの約１，０００個のコピーを含有する。クラスター増幅を用いた核酸の濃縮に関する詳細は、Ｋｏｚａｒｅｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：２９１－２９５（２００９）に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。

クラスター生成後、方法はブロック７０３に移動してもよく、フォワードテンプレート鎖のインデックス部分及びインサート部分の両方のための配列決定調製であり、これは、プライマーの混合物をフローセルに提供することと、インデックスプライマー及びリードプライマーの両方をＤＮＡクラスターにハイブリダイズ／アニーリングすることとを含む。次に、方法はブロック７０４に移動して、フォワードテンプレート鎖のインデックス部分及びインサート部分の両方を配列決定することができる。配列決定は、プライマーを伸長して核酸塩基リードを生成することによって進行する。各サイクルでは、蛍光標識されたヌクレオチドは、伸長されたプライマーの成長している鎖に添加するために競合する。フォワードテンプレートの配列に基づいてプライマー位置で１つのみが組み込まれる。ヌクレオチドの添加後、クラスターは光源によって励起され、特徴的な蛍光シグナルが放出される。発光スペクトル及びシグナル強度が、塩基コールを決定する。数億の核酸クラスター、又は数千から数万のクラスターが、大規模並行方式で配列決定されてもよい。インデックスプライマーのプライマー伸長が停止すると、方法はブロック７０５に移動してもよく、ここでフォワードテンプレートのインサート部分のみの配列決定が継続される。

フォワードテンプレート鎖配列決定（すなわち、ブロック７０３～７０５）の完了後、本方法は、ブロック７０６、ペアエンドターンに移動し得る。ペアエンドターンプロセスにおいて、フォワードテンプレート鎖配列決定の間に合成されたプライマー伸長産物は、脱ハイブリダイズされ、洗い流され得る。伸長されたリードプライマー及び伸長されたインデックスプライマーの両方を同じステップで脱ハイブリダイズして洗い流すことができるので、開示される方法は、配列決定時間を更に節約することができる。次に、フォワードテンプレート鎖の３’末端を脱保護することができる。次に、フォワードテンプレート鎖は、フローセル上の第２のオリゴの上に折り重なり、第２のオリゴに結合する。次に、ポリメラーゼを使用して第２のフローセルオリゴを伸長し、二本鎖架橋を形成することができる。次いで、この二本鎖核酸架橋は変性され得、３’末端はブロックされ得る。元のフォワードテンプレート鎖を切断し、洗い流して、フォワードテンプレート鎖に相補的な逆方向テンプレート鎖を残すことができる。

ペアエンドターンの後、本方法は、リバーステンプレート配列決定に進んでもよい。本方法は、ブロック７０７に移動し得、リバーステンプレート鎖のインデックス部分及びインサート部分の両方のための配列決定調製を行い、これは、（リバース）プライマーの混合物をフローセルに提供することと、（リバース）インデックスプライマー及び（リバース）リードプライマーの両方を核酸クラスターにハイブリダイズ／アニーリングすることとを含む。次に、方法はブロック７０８に移動して、リバーステンプレート鎖のインデックス部分及びインサート部分の両方を配列決定してもよい。配列決定は、プライマーを伸長して核酸塩基リードを生成することによって進行する。（リバース）インデックスプライマーのプライマー伸長が停止すると、方法はブロック７０９に移動してもよく、ここでリバース鎖のインサート部分のみの配列決定が継続される。

サンプル
したがって、いくつかの実施形態では、サンプルは、組織サンプル、生体液サンプル、細胞サンプルなどに由来する精製又は単離されたポリヌクレオチドを含むか又はそれからなる。好適な生体液サンプルとしては、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、痰、耳液、リンパ液、唾液、脳脊髄液、洗浄液（ravage）、骨髄懸濁液、膣流、子宮頸部洗浄液、脳液、腹水、乳、気道、腸道及び泌尿生殖器道の分泌物、羊水、乳、及び白血球瀉血サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、痰、耳液、唾液、又は糞便などの、非侵襲的処置によって容易に得ることができるサンプルである。ある特定の実施形態では、サンプルは、末梢血サンプル、又は末梢血サンプルの血漿及び／若しくは血清画分である。他の実施形態では、生体サンプルは、スワブ若しくはスミア、生検標本、又は細胞培養物である。別の実施形態では、サンプルは、２つ以上の生体サンプルの混合物であり、例えば、生体サンプルは、生体液サンプル、組織サンプル、及び細胞培養サンプルのうちの２つ以上を含むことができる。本発明で使用する場合、「血液」、「血漿」、及び「血清」という用語は、その画分又はその処理された部分を明示的に包含する。同様に、サンプルが生検、綿棒、スミアなどから採取される場合、「サンプル」は、生検、綿棒、スミアなどから得られる処理された画分又は部分を明示的に包含する。

ある特定の実施形態では、サンプルは、異なる個体からのサンプル、同じ個体又は異なる個体の異なる発育段階からのサンプル、異なる罹患した個体からのサンプル（例えば、がんを有するか、又は遺伝病を有する疑いのある個体）、正常な個体、個体における疾患の異なる段階で得られたサンプル、疾患に関して異なる治療を受けた個体から得られたサンプル、異なる環境因子を受けた個体からのサンプル、病状に素因を有する個体からのサンプル、感染症剤に曝露された個体からのサンプルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、サンプルは、妊娠した女性、例えば、妊婦から得られる、母体サンプルである。母体サンプルは、組織サンプル、生体液サンプル、又は細胞サンプルであり得る。別の例示的であるが非限定的な実施形態では、母体サンプルは、２つ以上の生体サンプルの混合物であり、例えば、生体サンプルは、生体液サンプル、組織サンプル、及び細胞培養サンプルのうちの２つ以上を含むことができる。

ある特定の実施形態では、サンプルはまた、インビトロ培養された組織、細胞、又はその他のポリヌクレオチド含有供給源から得ることもできる。培養されたサンプルは、異なる培地及び条件（例えば、ｐＨ、圧力、又は温度）で維持した培養物（例えば、組織又は細胞）、異なる期間で維持した培養物（例えば、組織又は細胞）、異なる要素若しくは試薬（例えば、薬物候補、又は修飾物質）で処理した培養物（例えば、組織又は細胞）、又は異なる種類の組織及び／若しくは細胞の培養物を含むがこれらに限定されない供給源から、採取することができる。

いくつかの実施形態では、開示される配列決定技術の使用は、配列決定ライブラリの調製を伴わない。他の実施形態では、本明細書で企図される配列技術は、配列決定ライブラリの調製を含む。１つの例示的なアプローチでは、配列決定ライブラリの調製は、配列決定される準備が整ったアダプタ修飾ＤＮＡ断片（例えば、ポリヌクレオチド）のランダムなコレクションの産生を含む。

ポリヌクレオチドの配列決定ライブラリは、例えば、逆転写酵素の作用によって、ＲＮＡテンプレートから産生された相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡであるＤＮＡ又はｃＤＮＡなどの、ＤＮＡ又はｃＤＮＡのいずれかの等価物、類似物を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡから調製することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖形態（例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ増幅生成物などのｄｓＤＮＡなど）において発生し得る、又はある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖形態（例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡなど）で発生し得て、ｄｓＤＮＡ形態に変換されている。例示として、ある特定の実施形態では、配列決定ライブラリの調製に使用するのに好適な二本鎖ｃＤＮＡに、一本鎖ｍＲＮＡ分子をコピーすることができる。一次ポリヌクレオチド分子の正確な配列は、一般に、ライブラリ調製の方法に対して重要ではなく、既知であっても未知であってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ分子である。より具体的には、ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、生物の遺伝子相補体全体又は実質的に生物の遺伝子相補体全体を表し、ゲノムＤＮＡ分子である（例えば、細胞ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）など）が、典型的にはイントロン配列及びエクソン配列（コード配列）、並びにプロモータ及びエンハンサ配列などの非コード調節配列を含む。ある特定の実施形態では、一次ポリヌクレオチド分子は、ヒトゲノムＤＮＡ分子、例えば、妊娠被験者の末梢血中に存在するｃｆＤＮＡ分子を含む。

生物学的供給源から核酸を分離する方法は、供給源の性質に応じて異なり得る。当業者は、本明細書に記載された方法に必要とされるように、核酸を供給源から容易に分離することができる。場合によっては、核酸サンプル中の大きな核酸分子（例えば、細胞ゲノムＤＮＡ）を断片化して、所望のサイズ範囲のポリヌクレオチドを得ることが有利であり得る。断片化はランダムであってもよい、又は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化を使用して達成されるように、特異的であり得る。ランダムな断片化のための方法は、例えば、限定されたＤＮａｓｅ消化、アルカリ処理、及び物理的剪断が挙げられ得る。断片化はまた、当業者に公知のいくつかの方法のうちのいずれかによって達成され得る。例えば、断片化は、噴霧化、超音波処理、及び水剪断が挙げられるが、これらに限定されない機械的手段によって達成され得る。

いくつかの実施形態では、サンプル核酸は、断片化されていないｃｆＤＮＡから取得される。例えば、ｃｆＤＮＡは、典型的には、約３００個の塩基対未満の断片として存在し、その結果、断片化は、ｃｆＤＮＡサンプルを使用して配列決定ライブラリを生成するために、典型的には必要ではない。

典型的には、ポリヌクレオチドが強制的に断片化される（例えば、インビトロで断片化される）か、又は自然に断片として存在するかどうかは、５’－リン酸及び３’－ヒドロキシルを有するブラント末端ＤＮＡに変換される。標準的なプロトコル、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定するためのプロトコルは、末端修復されたサンプルＤＮＡに対して、ｄＡ－テーリングの前に、末端修復された産物を精製して、ライブラリ調製のアダプタ－ライゲーティング工程の前に、ｄＡ－テーリング産物を精製するようにユーザに指示する。

様々な実施形態では、サンプルの完全性の検証及びサンプル追跡は、サンプルゲノム核酸、例えば、ｃｆＤＮＡと、例えば処理前にサンプルに導入されている付随のマーカー核酸との混合物を配列決定することによって達成することができる。

コンピュータシステム
いくつかの実施形態では、開示されるシステム及び方法は、ある特定の配列データ分析機能及び配列データ記憶装置をクラウドコンピューティング環境又はクラウドベースのネットワークにシフト又は分配するためのアプローチを伴い得る。配列決定データ、ゲノムデータ、又は他のタイプの生物学的データとのユーザ相互作用は、データを記憶し、データとの様々な相互作用へのアクセスを制御する中央ハブを介して媒介され得る。いくつかの実施形態では、クラウドコンピューティング環境はまた、プロトコル、分析方法、ライブラリ、配列データ、並びに配列決定、分析、及びレポートのための分散処理の共有を提供し得る。いくつかの実施形態では、クラウドコンピューティング環境は、ユーザによる配列データの修正又は注釈を容易にする。いくつかの実施形態では、システム及び方法は、コンピュータブラウザ、オンデマンド、又はオンラインに実装され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を実行するように書かれたソフトウェアは、メモリ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、メモリスティック、フラッシュドライブ、ハードドライブ、ＳＳＤハードドライブ、サーバ、メインフレームストレージシステムなどのいくつかの形態のコンピュータ可読媒体に記憶される。

いくつかの実施形態では、方法は、様々な好適なプログラミング言語、例えば、Ｃ、Ｃ＃、Ｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、及びＪａｖａなどのコンパイルされた言語のいずれかで書かれ得る。他のプログラミング言語としては、Ｐｅｒｌ、ＭａｔＬａｂ、ＳＡＳ、ＳＰＳＳ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｒｕｂｙ、Ｐａｓｃａｌ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｒ、及びＰＨＰなどのスクリプト言語があり得る。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃ、Ｃ＃、Ｃ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｊａｖａ、Ｐｅｒｌ、Ｒ、Ｊａｖａ、又はＰｙｔｈｏｎで書かれている。いくつかの実施形態では、方法は、データ入力及びデータ表示モジュールを有する独立したアプリケーションであり得る。あるいは、方法は、コンピュータソフトウェア製品であり得、分散オブジェクトが、本明細書に記載の計算方法を含むアプリケーションを含むクラスを含み得る。

いくつかの実施形態では、方法は、配列決定機器に見られるような既存のデータ分析ソフトウェアに組み込まれ得る。本明細書において説明されるコンピュータ実施方法を含むソフトウェアは、コンピュータシステム上に直接インストールされるか、又はコンピュータ可読媒体上に間接的に保持され、必要に応じてコンピュータシステム上にロードされる。更に、この方法は、サードパーティサービスプロバイダによって提供されるものなど、データが生成されている場所に対して別の場所に維持されているサーバなどで見出されるソフトウェアのような、データが生成されている場所に対してリモートであるコンピュータ上に配置され得る。

アッセイ機器、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、又はサーバは、システム及び方法の実装のための命令を含む、アクセス可能なメモリと動作上の通信を行うプロセッサを含み得る。いくつかの実施形態では、デスクトップコンピュータ又はラップトップコンピュータは、１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体又はデバイス及び／又は出力デバイスと動作可能に通信する。アッセイ機器、デスクトップコンピュータ、及びラップトップコンピュータは、Ａｐｐｌｅベースのコンピュータシステム又はＰＣベースのコンピュータシステムによって利用されるものなどの、多くの異なるコンピュータベースの動作言語の下で動作し得る。アッセイ機器、デスクトップ、及び／又はラップトップコンピュータ及び／又はサーバシステムは、実験的定義及び／又は条件を作成又は修正し、データ結果を閲覧し、実験進捗を監視するためのコンピュータインターフェースを更に提供し得る。いくつかの実施形態では、出力デバイスは、コンピュータモニタ又はコンピュータ画面、プリンタ、携帯デジタルアシスタントなどの携帯デバイス（すなわち、ＰＤＡ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ、ｉＰｈｏｎｅ）、タブレットコンピュータ（例えば、ｉＰＡＤ）、ハードドライブ、サーバ、メモリスティック、フラッシュドライブなどのグラフィックユーザインターフェースであり得る。

コンピュータ可読記憶デバイス又は媒体は、サーバ、メインフレーム、スーパーコンピュータ、磁気テープシステムなどの任意のデバイスであり得る。いくつかの実施形態では、記憶デバイスは、アッセイ機器に近接する場所、例えば、アッセイ機器に隣接するか、又は近接した位置に位置し得る。例えば、記憶デバイスは、同じ部屋内、同じ建物内、隣接する建物内、建物内の同じフロア上、建物内の異なるフロア上などに、アッセイ機器に関連して位置し得る。いくつかの実施形態では、記憶デバイスは、アッセイ機器の外側又は遠位に位置し得る。例えば、記憶デバイスは、アッセイ機器に対して、都市の異なる場所に、異なる都市に、異なる州に、異なる国に位置し得る。記憶デバイスがアッセイ機器の遠位に位置する実施形態では、アッセイ機器と、デスクトップ、ラップトップ、又はサーバのうちの１つ以上との間の通信は、典型的には、アクセスポイントを介した無線又はネットワークケーブルのいずれかによるインターネット接続を介する。いくつかの実施形態では、記憶デバイスは、アッセイ機器と直接関連付けられた個人又はエンティティによって維持及び管理され得るが、他の実施形態では、記憶デバイスは、典型的には、アッセイ機器と関連付けられた個人又はエンティティに対する遠位位置に、サードパーティによって維持及び管理され得る。本明細書において説明される実施形態では、出力デバイスは、データを視覚化するための任意のデバイスであり得る。

アッセイ機器、デスクトップ、ラップトップ、及び／又はサーバシステムは、本明細書において説明される計算方法を実行及び実施するためのコンピュータコードを組み込んだコンピュータ実施ソフトウェアプログラム、計算方法の実施で使用するためのデータなどを記憶及び／又は検索するために使用され得る。アッセイ機器、デスクトップ、ラップトップ、及び／又はサーバのうちの１つ以上は、本明細書において説明される計算方法を実行及び実施するためのコンピュータコードを組み込んだソフトウェアプログラム、計算方法の実施で使用するためのデータなどを記憶及び／又は検索するための１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体を含み得る。コンピュータ可読記憶媒体には、ハードドライブ、ＳＳＤハードドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ－ＲＯＭドライブ、フロッピーディスク、テープ、フラッシュメモリスティック又はカードのうちの１つ以上が含まれ得るが、これらに限定されない。更に、インターネットを含むネットワークは、コンピュータ可読記憶媒体であり得る。いくつかの実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、例えば、ローカルデスクトップ又はラップトップコンピュータからアッセイ機器へのローカルデスクトップ又はラップトップコンピュータではなく、インターネットを介したコンピュータネットワーク又はサービスプロバイダによって提供される会社ネットワークによってアクセス可能な計算リソースストレージを指す。

いくつかの実施形態では、本明細書において説明される計算方法を実行及び実施するためのコンピュータコードを組み込んだコンピュータ実施ソフトウェアプログラム、計算方法の実施に使用されるデータなどを記憶及び／又は検索するためのコンピュータ可読記憶媒体は、インターネット接続又はネットワーク接続を介してアッセイ機器、デスクトップ、ラップトップ、及び／又はサーバシステムと動作可能に通信するサービスプロバイダによって動作及び維持される。

いくつかの実施形態では、計算環境を提供するためのハードウェアプラットフォームは、プロセッサ時間及びランダムアクセスメモリ（すなわち、ＲＡＭ）などのメモリレイアウトがシステムの考慮事項であるプロセッサ（すなわち、ＣＰＵ）を含む。例えば、より小さいコンピュータシステムは、安価で高速プロセッサ及び大きなメモリ及び記憶能力を提供する。いくつかの実施形態では、グラフィックス処理ユニット（graphics processing unit、ＧＰＵ）を使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において説明される計算方法を実行するためのハードウェアプラットフォームは、１つ以上のプロセッサを有する１つ以上のコンピュータシステムを含む。いくつかの実施形態では、より小さいコンピュータが一緒にクラスター化されて、スーパーコンピュータネットワークをもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書において説明される計算方法は、協調的に様々なオペレーティングシステムを実行し得る接続間又は接続内コンピュータシステム（すなわち、グリッドテクノロジ）の集合体で実行される。例えば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓから入手可能なＣＯＮＤＯＲフレームワーク（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ－Ｍａｄｉｓｏｎ）及びシステムは、多量のデータを扱う目的のための複数の独立型コンピュータシステムの協調の例示である。これらのシステムは、連続又は並行構成のクラスター上の大きな配列分析ジョブを提出、監視、及び管理するためのＰｅｒｌインターフェースを提供し得る。

定義
別途定義されない限り、本開示書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照されたい。本開示の目的のために、次の用語を以下に定義する。

本明細書で使用される場合、「クラスター」又は「クランプ」という用語は、分子の群（例えば、ＤＮＡの群、又はシグナルの群）をいう。いくつかの実施形態では、クラスターのシグナルは、異なる特徴から導出される。いくつかの実施形態では、シグナルクランプは、１つの増幅オリゴヌクレオチドによって覆われた物理的領域を表す。各シグナルクランプは、理想的にはいくつかのシグナルとして観察することができる。したがって、同じシグナルのクランプから重複シグナルを検出することができる。いくつかの実施形態では、シグナルのクラスター又はクランプは、特定の特徴に対応する１つ以上のシグナル又はスポットを含み得る。マイクロアレイデバイス又は他の分子分析デバイスと関連して使用される場合、クラスターは、増幅されたオリゴヌクレオチド（又は同一若しくは類似の配列を有する他のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド）によって占有される物理的領域を一緒に占有する１つ以上のシグナルを含み得る。例えば、特徴が増幅されたオリゴヌクレオチドである場合、クラスターは、１つの増幅されたオリゴヌクレオチドによってカバーされる物理的領域であり得る。他の実施形態では、シグナルのクラスター又はクランプは、特徴に厳密に対応する必要はない。例えば、スプリアスノイズシグナルは、シグナルクラスターに含まれてもよいが、必ずしも特徴領域内に含まれなくてもよい。例えば、配列決定反応の４つのサイクルからのシグナルのクラスターは、少なくとも４つのシグナルを含み得る。

本明細書で使用される場合、「スポット半径」又は「クラスター半径」という用語は、回折限界スポット又はシグナルのクラスターを包含する定義された半径を指す。したがって、クラスター半径をより大きく又はより小さく定義することによって、後続の順序付け及び選択のために、より多数のシグナルが半径内に入ることができる。クラスター半径は、ピクセル、メートル、ミリメートル、又は距離の任意の他の有用な尺度など、任意の距離尺度によって定義することができる。

本明細書で使用される場合、「シグナル」は、例えば画像内の発光、発光などの検出可能なイベントを指す。したがって、いくつかの実施態様では、シグナルは、画像内に捕捉された任意の検出可能な発光（すなわち、「スポット」）を表すことができる。したがって、本明細書で使用される場合、「シグナル」は、検体の特徴からの実際の放出を指すことができ、実際の特徴と相関しない擬似発光を指すことができる。したがって、シグナルはノイズから生じ得、試験片の実際の検体の特徴を代表しないように後に廃棄することができる。

本明細書で使用される場合、放出される光の「強度」は、単位面積当たりに伝達される光の強度を指し、面積は、光線の伝搬方向に垂直な平面上で測定され、強度は、単位時間当たりに伝達されるエネルギーの量である。いくつかの実施形態では、シグナル「強度」、「振幅」、「大きさ」、又は「レベル」は、シグナル強度と同義的に使用され得る。いくつかの実施形態では、検出器によって撮影された画像は、ある時間量にわたって積分された強度マップに近似又は比例する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡクラスターの回折限界スポットのシグナルは、積分時間の因子まで、スポットに含まれる総強度として画像から抽出される。例えば、ＤＮＡクラスターのシグナルは、積分時間の因子まで、ＤＮＡクラスターのスポット半径内に含まれる強度として定義され得る。他の実施形態では、スポット半径内で見出されるピーク強度値は、積分時間の因子まで、ＤＮＡクラスターのシグナルを表すために使用され得る。

本明細書で使用される場合、シグナル位置のテンプレートを所与の画像上に位置合わせするプロセスは、「レジストレーション」と呼ばれ、所与の画像のテンプレート内の各シグナルの強度値又は振幅値を決定するプロセスは、「強度抽出」と呼ばれる。位置合わせのために、本明細書で提供される方法及びシステムは、画像相関を使用してテンプレートを画像に位置合わせすることによって、シグナルクランプ位置のランダムな性質を利用することができる。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である。ヌクレオチドの例としては、例えば、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。リボヌクレオチド（ribonucleotide、ＲＮＡ）において、糖はリボースであり、デオキシリボヌクレオチド（deoxyribonucleotide、ＤＮＡ）において、糖は、デオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在するヒドロキシル基が欠如している糖である。窒素含有複素環式塩基は、プリン塩基又はピリミジン塩基であり得る。プリン塩基としては、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。ピリミジン塩基としては、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１又はプリンのＮ－９に結合される。リン酸基は、一、二、又は三リン酸型であり得る。これらのヌクレオチドは天然ヌクレオチドであってもよいが、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は前述のヌクレオチドの類似体も使用できることが更に理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「核酸塩基」は、複素環式塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、又はその複素環式誘導体、類似体、若しくは互変異性体である。核酸塩基は、天然に存在するか又は合成であり得る。核酸塩基の非限定的な例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、８－アザプリン、８位でメチル又は臭素で置換されたプリン、９－オキソ－Ｎ６－メチルアデニン、２－アミノアデニン、７－デアザキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－アデニン、Ｎ４－エタノシトシン、２，６－ジアミノプリン、Ｎ６－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ３～Ｃ６）－アルキニルシトシン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、チオウラシル、シュードイソシトシン、２－ヒドロキシ－５－メチル－４－トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、７，８－ジメチルアロキサジン、６－ジヒドロチミン、５，６－ジヒドロウラシル、４－メチル－インドール、エテノアデニン、並びに米国特許第５，４３２，２７２号及び同第６，１５０，５１０号、及びＰＣＴ出願第９２／００２２５８号、同第９３／１０８２０号、同第９４／２２８９２号、及び同第 ９４／２４１４４号、並びにＦａｓｍａｎ（「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，ｐｐ．３８５－３９４，１９８９，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＬＯ）（これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている天然に存在しない核酸塩基である。

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、ペプチド核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）及びホスホロチオエートＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。別途記載のない限り、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。ヌクレオチドにとしては、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰ、ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ＵＴＰ、ＴＴＰ、ｄＵＴＰ、５－メチル－ＣＴＰ、５－メチル－ｄＣＴＰ、ＩＴＰ、ｄＩＴＰ、２－アミノ－アデノシン－ＴＰ、２－アミノ－デオキシアデノシン－ＴＰ、２－チオチミジン三リン酸、ピロロ－ピリミジン三リン酸、及び２－チオシチジン、並びに上記の全てに対するアルファチオ三リン酸、及び上記の全ての塩基に対する２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。修飾塩基としては、５－Ｂｒ－ＵＴＰ、５－Ｂｒ－ｄＵＴＰ、５－Ｆ－ＵＴＰ、５－Ｆ－ｄＵＴＰ、５－プロピニルｄＣＴＰ、及び５－プロピニル－ｄＵＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。

使用されるポリメラーゼは、一般に、３’－ＯＨ ５’－三リン酸ヌクレオチド、オリゴマー、及びそれらの類似体を結合するための酵素である。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ，Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ（Klenow）断片、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９０Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、９０Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ，ＴｆＩ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＴＩｉ ＤＮＡポリメラーゼ、真核ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＫＯＤ ＨｉＦｉ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＫＯＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータレプリカーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、バイオプロスペクティングによって発見された新規ポリメラーゼ、並びに米国特許出願公開第２００７／００４８７４８号、米国特許第６，３２９，１７８号、同第６，６０２，６９５号、及び同第６，３９５，５２４号（参照により組み込まれる）に引用されているポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリメラーゼは、野生型、変異体アイソフォーム、及び遺伝子操作されたバリアントを含む。「コードする」又は「パースする（parse）」とは、１つの形式から別の形式に移すことを指す動詞であり、標的鋳型塩基配列の遺伝情報をレポーターの配置に移すことを指す。

ヌクレオシド及びヌクレオチドは、糖又は核酸塩基上の部位で標識されてもよい。色素は、例えばリンカーを介してヌクレオチド塩基上の任意の位置に取り付けられてもよい。特定の実施形態では、ワトソン・クリック塩基対合が、得られた類似体に対して依然として実行され得る。特定の核酸塩基標識部位としては、ピリミジン塩基のＣ５位置、又は７－デアザプリン塩基のＣ７位置が挙げられる。リンカー基を使用して、ヌクレオシド又はヌクレオチドに色素を共有付着させてもよい。本明細書で使用される場合、「共有結合した（「ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ」又は「ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ」）」という用語は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる化学結合の形成を指す。例えば、共有結合したポリマーコーティングとは、他の手段、例えば、接着又は静電相互作用による表面への付着と比較して、基材の官能化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合したポリマーは、共有結合に加えて、手段によって結合され得ることが理解されるであろう。

異なる長さ及び化学的特性を有する様々な異なるタイプのリンカーを使用することができる。「リンカー」という用語は、１つ以上の分子又は化合物を互いに、反応混合物の他の成分に、及び／又は反応部位に接続するのに有用な任意の部分を包含する。例えば、リンカーは、レポーター分子又は「標識」（例えば、蛍光色素）を反応成分に付着させることができる。ある特定の実施形態では、リンカーは、置換又は非置換アルキル（例えば、２～５個の炭素鎖）、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換シクロアルキル、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキルから選択されるメンバーである。一例では、リンカー部分は、任意選択で少なくとも１つのへテロ原子（例えば、エーテル、チオエーテル、アミド、スルホンアミド、カーボネート、カルバメート、尿素及びチオ尿素などの少なくとも１つの官能基）を含み、任意選択で少なくとも１つの芳香族、ヘテロ芳香族又は非芳香族環構造（例えば、シクロアルキル、フェニル）を含む、直鎖及び分岐鎖の炭素鎖から選択される。ある特定の実施形態では、三官能性連結能力を有する分子が使用され、これには、塩化シヌール（cynuric chloride）、メアラミン（mealamine）、ジアミノプロパン酸、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ピログルタミン酸、Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物、カルボベンゾキシリジン、ヒスチジン、リジン、セリン、ホモセリン、チロシン、ピペリジニル１，１－アミノカルボン酸、ジアミノ安息香酸などが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の具体的な実施形態では、親水性ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカーが使用される。

ある特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも２つの反応性官能基（例えば、各末端に１つ）を含む分子に由来し、これらの反応性官能基は、様々な反応成分上の相補的な反応性官能基と反応し得るか、又は反応部位で１つ以上の反応成分を固定化するために使用され得る。「反応性官能基」は、本明細書で使用される場合、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハライド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、スルフェート、スルフェン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸塩、エナミン、イナミン（ynamines）、尿素、イソ尿素（pseudoureas）、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、及びニトロソ化合物が挙げられるが、これらに限定されない基を指す。反応性官能基には、バイオコンジュゲートを調製するために使用されるもの、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなども含まれる。

開裂可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に開裂可能なリンカー、求核的に開裂可能なリンカー、光開裂可能リンカー、還元条件下で開裂可能なリンカー（例えば、ジスルフィド又はアジド含有リンカー）、酸化的条件で開裂可能なリンカー、安全装置リンカーの使用によって開裂可能なリンカー、除去機構によって開裂可能であるリンカーであり得る。色素化合物を基材部分に付着させるために開裂可能なリンカーを使用することにより、必要に応じて、検出後に標識を除去することができ、下流の工程においていかなる干渉シグナルも回避することができる。

いくつかの実施形態では、１つ以上の色素分子又は標識分子は、非共有結合相互作用によって、又は複数の介在分子を介した共有結合相互作用と非共有結合相互作用との組み合わせによって、ヌクレオチド塩基に付着し得る。一例では、標的ポリヌクレオチドから合成するポリメラーゼによって新たに組み込まれるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、最初は標識されていない。１つ以上の蛍光色素を含有する標識された親和性試薬に結合させることによって、１つ以上の蛍光標識をヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に導入することができる。合成による配列決定における標識されていないヌクレオチド及び親和性試薬の使用は、米国公開第２０１３／００７９２３２号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、反応混合物中の４つの異なるタイプのヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ）のうちの１つ、２つ、３つ、又は各々は、最初は標識されていない場合がある。４つのタイプのヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の各々は、単一塩基のみが標的ポリヌクレオチドから合成されているコピーポリヌクレオチドの３’末端にポリメラーゼによって添加され得ることを確実にするために、３’ヒドロキシブロッキング基を有する。標識されていないヌクレオチドの組み込み後、次いで、組み込まれたｄＮＴＰに特異的に結合する親和性試薬を導入して、組み込まれたｄＮＴＰを含む標識された伸長産物を提供し得る。親和性試薬は、例えば、抗体－抗原相互作用又はリガンド－受容体相互作用を介して組み込まれたｄＮＴＰに特異的に結合するように設計することができる。ｄＮＴＰは、対応する親和性試薬に含まれる特異的抗体と対になる特異的抗原を含むように修飾され得る。したがって、４つの異なるタイプのヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、又は各々は、それらの対応する親和性試薬を介して特異的に標識され得る。いくつかの実施形態では、親和性試薬は、ヌクレオチドのハプテン部分（例えば、ストレプトアビジン－ビオチン、抗ＤＩＧ及びＤＩＧ、抗ＤＮＰ及びＤＮＰ）、抗体（限定されないが、抗体の結合断片、一本鎖抗体、二重特異性抗体等を含む）、アプタマー、ノッチン、アフィマー、又は組み込まれたヌクレオチドに適切な特異性及び親和性で結合する任意の他の公知の因子に結合し得る小分子又はタンパク質タグを含み得る。いくつかの実施形態では、標識されていないヌクレオチドのハプテン部分は、切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合されてもよく、これは、３’ブロッキング基を除去するためのものと同じ反応条件下で切断されてもよい。いくつかの実施形態では、１つの親和性試薬は、同じ蛍光色素の複数のコピー、例えば、同じ色素の１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５コピーで標識され得る。更なる実施形態では、各親和性試薬を同じ蛍光色素の異なる数のコピーで標識することができる。いくつかの実施形態では、第１の親和性試薬は第１の数の第１の蛍光色素で標識されてもよく、第２の親和性試薬は第２の数の第２の蛍光色素で標識されてもよく、第３の親和性試薬は第３の数の第３の蛍光色素で標識されてもよく、第４の親和性試薬は第４の数の第４の蛍光色素で標識されてもよい。いくつかの実施形態では、各親和性試薬は、１つ以上のタイプの色素の異なる組み合わせで標識されてもよく、ここで、各タイプの色素は、ある特定のコピー数を有する。いくつかの実施形態では、異なる親和性試薬は、同じ光源によって励起され得る異なる色素で標識され得るが、各色素は、識別可能な蛍光強度又は識別可能な発光スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、異なる親和性試薬を異なるモル比で同じ色素で標識して、それらの蛍光強度に測定可能な差を生じさせてもよい。

ヌクレオチド類似体は、１つ以上の光検出可能な標識に結合又は会合され、検出可能なシグナルを提供し得る。いくつかの実施形態では、光検出可能な標識は、小分子蛍光標識などの蛍光化合物であり得る。蛍光標識として好適な蛍光分子（フルオロフォア）としては、１，５ ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８－ＡＮＳ；４－メチルウンベリフェロン；５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン；５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）；フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）；５－カルボキシフルオレセイン；テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）；ヘキサクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）；２，７－ジメトキシ－４，５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；ＶＩＣ（登録商標）；ＮＥＤ（商標）；テトラメチルローダミン（tetramethylrhodamine、ＴＭＲ）；５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）；５－ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）；５－ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）；６－カルボキシローダミン６Ｇ；６－ＪＯＥ；Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド６１０；Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド６４０；Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド６７０；Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）レッド７０５；７－アミノ－４－メチルクマリン；７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）；７－ヒドロキシ－４－メチルクマリン；９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン；６－メトキシ－Ｎ－（４－アミノアルキル）キノリニウムブロミド塩酸塩（ＡＢＱ）；酸性フクシン；ＡＣＭＡ（９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン）；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ；ＡＦＰ－自己蛍光タンパク質－（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；テキサスレッド；テキサスレッド－Ｘコンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＣＮ；チオライト；チオゾールオレンジ；Ｔｉｎｏｐｏｌ ＣＢＳ（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ）；ＴＭＲ；ＴＯ－ＰＲＯ－１；ＴＯ－ＰＲＯ－３；ＴＯ－ＰＲＯ－５；ＴＯＴＯ－１；ＴＯＴＯ－３；ＴｒｉＣｏｌｏｒ（ＰＥ－Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン－イソチオシアン酸）；トゥルーブルー；ＴｒｕＲｅｄ；ウルトラライト；ウラニンＢ；Ｕｖｉｔｅｘ ＳＦＣ；ＷＷ ７８１；Ｘ－ローダミン；Ｘ－ローダミン－５－（及び－６）－イソチオシアネート（５（６）－ＸＲＩＴＣ）；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；ＹＯ－ＰＲＯ－１；ＹＯ－ＰＲＯ－３；ＹＯＹＯ－１；ＹＯＹＯ－３、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ、チアゾールオレンジなどのインターキレート色素；広いスペクトルをカバーし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、及び７５０などの一般的な励起源の主出力波長に一致するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のメンバー；Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などの広いスペクトルもカバーするＣｙ Ｄｙｅフルオロフォアシリーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のメンバー；Ｏｙｓｔｅｒ－５００、－５５０、－５５６、６４５、６５０、６５６などのＯｙｓｔｅｒ（登録商標）色素フルオロフォア（Ｄｅｎｏｖｏ Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ）のメンバー；例えば、４１８ｎｍ（ＤＹ－４１５）～８４４ｎｍ（ＤＹ－８３１）の範囲の吸収の最大値を有するＤＹ－Ｌａｂｅｌｓシリーズ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）のメンバー、例えば、ＤＹ－４１５、－４９５、－５０５、－５４７、－５４８、－５４９、－５５０、－５５４、－５５５、－５５６、－５６０、－５９０、－６１０、－６１５、－６３０、－６３１、－６３２、－６３３、－６３４、－６３５、－６３６、－６４７、－６４８、－６４９、－６５０、－６５１、－６５２、－６７５、－６７６、－６７７、－６８０、－６８１、－６８２、－７００、－７０１、－７３０、－７３１、－７３２、－７３４、－７５０、－７５１、－７５２、－７７６、－７８０、－７８１、－７８２、－８３１、－４８０ＸＬ、－４８１ＸＬ、－４８５ＸＬ、－５１０ＸＬ、－５２０ＸＬ、－５２１ＸＬ；蛍光標識のＡＴＴＯシリーズ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）のメンバー、例えばＡＴＴＯ ３９０、４２５、４６５、４８８、４９５、５２０、５３２、５５０、５６５、５９０、５９４、６１０、６１１Ｘ、６２０、６３３、６３５、６３７、６４７、６４７Ｎ、６５５、６８０、７００、７２５、７４０；ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ又はＱｕａｓａｒ（登録商標）シリーズの色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、例えば、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５６０、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５７０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６３５、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５７０、及びＱｕａｓａｒ（登録商標）６７０が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第１の光検出可能な標識は、第２の光検出可能な部分と相互作用して、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、「ＦＲＥＴ」；また、フェルスター共鳴エネルギー移動としても知られている）を介して検出可能なシグナルを変更する。

本明細書に開示されるシステム及び方法によって利用される蛍光標識は、例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲の異なるピーク吸収波長を有することができる。いくつかの実施形態では、蛍光標識のピーク吸収波長は、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００ｎｍ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得るか、又はおよそこれらであり得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識のピーク吸収波長は、少なくとも、又は最大で４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、又は８００ｎｍであり得る。

蛍光標識は、例えば４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲の異なるピーク発光波長を有することができる。いくつかの実施形態では、蛍光標識のピーク発光波長は、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００ｎｍ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得るか、又はおよそこれらであり得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識のピーク発光波長は、少なくとも、又は最大で４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、又は８００ｎｍであり得る。

蛍光標識は、例えば１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲の異なるストークスシフトを有することができる。いくつかの実施形態では、ストークシフトは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｎｍ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得るか、又はおよそこれらであり得る。いくつかの実施形態では、ストークシフトは、少なくとも、又は最大で、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｎｍであり得る。

いくつかの実施形態では、任意の２つの蛍光標識のピーク発光波長間の距離は、例えば、１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲で変動し得る。いくつかの実施形態では、任意の２つの蛍光標識のピーク発光波長間の距離は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｎｍ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得るか、又はおよそこれらであり得る。いくつかの実施形態では、任意の２つの蛍光標識のピーク発光波長間の距離は、少なくとも、又は最大で、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｎｍであり得る。

「光源」は、電磁スペクトルに沿ってエネルギーを放射することができる任意のデバイスであってもよい。光源は、可視光（ＶＩＳ）、紫外光（ＵＶ）及び／又は赤外光（ＩＲ）の光源であってもよい。「可視光」（ＶＩＳ）は、一般に、約４００ｎｍ～約７５０ｎｍの波長を有する電磁放射の帯域を指す。「紫外（ＵＶ）光」は、一般に、可視光の波長より短い波長、又は約１０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の波長を有する電磁放射線を指す。「赤外光」又は赤外放射（ＩＲ）は、一般に、ＶＩＳ範囲よりも大きい波長、又は約７５０ｎｍ～約５０，０００ｎｍの波長を有する電磁放射を指す。光源はまた、全スペクトル光を提供してもよい。光源は、選択された波長又は波長の範囲から光を出力することができる。本発明のいくつかの実施形態では、光源は、所定の波長より上又は下の光を提供するように構成されてもよく、又は所定の範囲内の光を提供してもよい。光源は、光源からの選択された波長の光を選択的に透過又は遮断するために、フィルタと組み合わせて使用されてもよい。光源は、１つ以上の電気コネクタによって電源に接続することができる。光源のアレイは、電源に直列又は並列に接続され得る。電源は、バッテリ、又は車両電気システム若しくは建物電気システムであってもよい。光源は、制御電子機器（制御回路）を介して電源に接続されてもよい。制御電子機器は、１つ以上のスイッチを備えてもよい。１つ以上のスイッチは、自動化されてもよく、センサ、タイマ、若しくは他の入力によって制御されてもよく、又はユーザによって制御されてもよく、又はそれらの組み合わせであってもよい。例えば、ユーザはスイッチを操作してＵＶ光源をオンにすることができる。光源は、それがオフにされるまで一定ベースで適用されてもよく、又はそれがオフにされるまでパルス化されてもよい（オン／オフサイクルを繰り返す）。いくつかの実施形態では、光源は、連続オン状態からパルス状態に、又はその逆に切り替えられてもよい。いくつかの実施形態では、光源は、経時的に明るくなるか又は暗くなるように構成されてもよい。

動作のために、光源は、サンプルを照明するのに十分な強度を提供することができる電源に接続されてもよい。制御電子機器は、ユーザからの入力又は何らかの他の入力に基づいて強度をオン又はオフに切り替えるために使用されてもよく、強度を好適なレベルに変調するために（例えば、出力光の輝度を制御するために）使用することもできる。制御電子機器は、必要に応じて光源をオンオフするように構成されてもよい。制御電子機器は、光源の手動、自動、又は半自動動作のためのスイッチを含んでもよい。１つ以上のスイッチは、例えば、トランジスタ、リレー又は電気機械スイッチであってもよい。いくつかの実施形態では、制御回路は、電圧源からの電圧を光源のための適切な電圧に変換するためのＡＣ－ＤＣ及び／又はＤＣ－ＤＣコンバータを更に備えてもよい。制御回路は、電圧を調整するためのＤＣ－ＤＣレギュレータを備えてもよい。制御回路は、入力の受信に続く固定された期間の間、光学フィルタに電圧を印加するためのタイマ及び／又は他の回路要素を更に備えてもよい。スイッチは、手動で、又は所定の条件に応答して自動的に、又はタイマを用いて起動されてもよい。例えば、制御電子機器は、ユーザ入力、記憶された命令などの情報を処理することができる。

複数の光源のうちの１つ以上が設けられてもよい。いくつかの実施形態では、複数の光源の各々は同じであってもよい。代替的に、光源のうちの１つ以上が変化してもよい。光源によって放出される光の光特性は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。複数の光源は、独立して制御可能であってもなくてもよい。光源がオンであるかオフであるか、光源の明るさ、光の波長、光の強度、照明の角度、光源の位置、又はそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、光源の１つ以上の特性は、制御されてもされなくてもよい。

いくつかの実施形態では、光源からの光出力は、約３５０～約７５０ｎｍ、又はそれらの間の任意の量若しくは範囲、例えば、約３５０ｎｍ～約３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０若しくは約４５０ｎｍ、又はそれらの間の任意の量若しくは範囲であってもよい。他の実施形態では、光源からの光は、約５５０～約７００ｎｍ、又はそれらの間の任意の量若しくは範囲、例えば、約５５０～約５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０若しくは約７００ｎｍ、又はそれらの間の任意の量若しくは範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、光源によって生成される光の波長は、例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲で変動し得る。いくつかの実施形態では、光源によって生成される光の波長は、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００ｎｍ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であり得るか、又はおよそこれらであり得る。いくつかの実施形態では、光源によって生成される光の波長は、少なくとも、又は最大で４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、又は８００ｎｍであり得る。光源は、任意のスペクトルの電磁波を放射することができてもよい。いくつかの実施形態では、光源は、１０ｎｍ～１００μｍの波長を有してもよい。いくつかの実施形態では、光の波長は、１００ｎｍ～５０００ｎｍ、３００ｎｍ～１０００ｎｍ、又は４００ｎｍ～８００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、光の波長は、１０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、１１００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１５００ｎｍ、１７５０ｎｍ、２０００ｎｍ、２５００ｎｍ、３０００ｎｍ、４０００ｎｍ、又は５０００ｎｍ未満、及び／又はそれに等しくてもよい。

一例では、光源は、発光ダイオード（light-emitting diode、ＬＥＤ）（例えば、ガリウムヒ素（ＧａＡｓ）ＬＥＤ、アルミニウムガリウムヒ素（ＡｌＧａＡｓ）ＬＥＤ、ガリウムヒ素リン（ＧａＡｓＰ）ＬＥＤ、アルミニウムガリウムインジウムリン（ＡｌＧａＩｎＰ）ＬＥＤ、ガリウム（ＩＩＩ）リン（ＧａＰ）ＬＥＤ、インジウムガリウム窒化物（ＩｎＧａＮ）／ガリウム（ＩＩＩ）窒化物（ＧａＮ）ＬＥＤ、又はアルミニウムガリウムリン（ＡｌＧａＰ）ＬＥＤ）であってもよい。別の例では、光源は、レーザ、例えば、垂直共振器面発光レーザ（vertical cavity surface emitting laser、ＶＣＳＥＬ）、又はインジウム－ガリウム－アルミニウム－リン化物（ＩｎＧａＡＩＰ）レーザ、ガリウム－ヒ素リン化物／ガリウムリン化物（ＧａＡｓＰ／ＧａＰ）レーザ、若しくはガリウム－アルミニウム－ヒ素化物／ガリウム－アルミニウム－ヒ素化物（ＧａＡｌＡｓ／ＧａＡｓ）レーザなどの他の適切な発光体とすることができる。光源の他の例としては、電子励起光源（例えば、カソードルミネセンス、電子励起ルミネセンス（ＥＳＬ電球）、陰極線管（ＣＲＴモニタ）、ニキシー管）、白熱光源（例えば、カーボンボタンランプ、従来の白熱電球、ハロゲンランプ、グローバー、ネルンストランプ）、エレクトロルミネセント（electroluminescent、ＥＬ）光源（例えば、発光ダイオード、有機発光ダイオード、ポリマー発光ダイオード、固体照明、ＬＥＤランプ、エレクトロルミネセントシート、エレクトロルミネセントワイヤ）、ガス放電光源（例えば、蛍光ランプ、誘導照明、ホローカソードランプ、ネオン及びアルゴンランプ、プラズマランプ、キセノンフラッシュランプ）、又は高輝度放電光源（例えば、カーボンアークランプ、セラミック放電メタルハライドランプ、ヨウ化水素中アークランプ、水銀蒸気ランプ、メタルハライドランプ、ナトリウム蒸気ランプ、キセノンアークランプ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。あるいは、光源は、生物発光、化学発光、リン光、又は蛍光光源であってもよい。

本明細書で使用される場合、「光チャネル」は、光周波数（又は同等に波長）の所定のプロファイルである。例えば、第１の光チャネルは、５００ｎｍ～６００ｎｍの波長を有し得る。第１の光チャネルにおいて画像を撮影するために、５００ｎｍ～６００ｎｍの光のみに応答する検出器を使用するか、又は５００ｎｍ～６００ｎｍの透過窓を有するバンドパスフィルタを使用して、３００ｎｍ～８００ｎｍの光に応答する検出器への入射光をフィルタ処理することができる。第２の光チャネルは、３００ｎｍ～４５０ｎｍ及び８５０ｎｍ～９００ｎｍの波長を有してもよい。第２の光チャネルにおいて画像を撮影するために、３００ｎｍ～４５０ｎｍの光に応答する検出器と、８５０ｎｍ～９００ｎｍの光に応答する別の検出器とを使用し、次いで、２つの検出器の検出シグナルを組み合わせてもよい。別の方法としては、第２の光チャネルにおいて画像を撮影するために、４５１ｎｍ～８４９ｎｍの光に応答する検出器の前で３００ｎｍ～９００ｎｍの光を拒絶するバンドストップフィルタを使用してもよい。

追記事項
本明細書に記載される実施形態は例示的なものである。これらの実施形態に対して、修正、再配置、代替プロセス等が行われてもよく、依然として、本明細書に記載される教示内に包含される。本明細書で説明されるステップ、プロセス、又は方法のうちの１つ以上は、好適にプログラムされる、１つ以上の処理及び／又はデジタルデバイスによって行われてもよい。

本明細書に開示される実施形態に関連して説明される様々な例証的イメージング又はデータ処理技法は、電子ハードウェア、コンピュータソフトウェア、又は両方の組み合わせとして実装されることができる。ハードウェア及びソフトウェアのこの互換性を例示するために、様々な例示的な構成要素、ブロック、モジュール、及びステップが、概してそれらの機能に関して上記で説明されている。そのような機能がハードウェア又はソフトウェアとして実装されるかどうかは、特定のアプリケーション及びシステム全体に課される設計制約に依存する。説明した機能は、特定の適用例ごとに様々な方法で実装され得るが、そのような実装の決定は、本開示の範囲からの逸脱を引き起こすものとして解釈されるべきではない。

本明細書に開示される実施形態に関連して説明される様々な例示的な検出システムは、特定の命令で構成されたプロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ（digital signal processor、ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（application specific integrated circuit、ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（field programmable gate array、ＦＰＧＡ）、又はその他のプログラム可能な論理デバイス、別個のゲート若しくはトランジスタ論理、別個のハードウェア構成要素、又は本明細書に記載される機能を実行するように設計されたそれらの任意の組み合わせなどの機械装置によって、実装又は実行され得る。プロセッサはマイクロプロセッサであってもよいが、代替的に、プロセッサは、コントローラ、マイクロコントローラ、又はステートマシン、それらの組み合わせなどであってもよい。プロセッサはまた、コンピューティングデバイスの組み合わせ、例えば、ＤＳＰとマイクロプロセッサ、複数のマイクロプロセッサ、ＤＳＰコアに関連した１つ以上のマイクロプロセッサ、又は任意のその他のこのような構成の組み合わせとして実装することもできる。例えば、本明細書で説明されるシステムは、ディスクリートメモリチップ、マイクロプロセッサ内のメモリの一部、フラッシュ、ＥＰＲＯＭ、又は他のタイプのメモリを使用して実装され得る。

本明細書で開示される実施形態に関連して説明される方法、プロセス、又はアルゴリズムの要素は、直接ハードウェアで、プロセッサによって実行されるソフトウェアモジュールで、又はその２つの組み合わせで具現化され得る。ソフトウェアモジュールは、ＲＡＭメモリ、フラッシュメモリ、ＲＯＭメモリ、ＥＰＲＯＭメモリ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、レジスタ、ハードディスク、リムーバブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、又は当技術分野で知られている任意の他の形態のコンピュータ可読記憶媒体中に常駐することができる。例示的な記憶媒体は、プロセッサが記憶媒体から情報を読み取り、記憶媒体に情報を書き込むことができるように、プロセッサに結合され得る。代替として、記憶媒体は、プロセッサと一体化され得る。プロセッサ及び記憶媒体は、ＡＳＩＣ内に常駐し得る。ソフトウェアモジュールは、ハードウェアプロセッサにコンピュータ実行可能命令を実行させるコンピュータ実行可能命令を含み得る。

特に明記しない限り、「できる（can）」、「し得る（might）」、「し得る（may）」、「例えば（ｅ．ｇ．）」などの本明細で使用される条件的文言は、特に明記しない限り、そうでない場合には使用される文脈内で理解される限り、一般に、ある特定の実施形態が含まれることを伝えることを意図しており、他の実施形態は、ある特定の特徴、要素、及び／又はステップを含まない。したがって、そのような条件的文言は、一般に、特徴、要素、及び／又は状態が、１つ以上の実施形態に必要な任意の方法であること、又は１つ以上の実施形態は、これらの特徴、要素、及び／若しくは状態が含まれるか、又は任意の特定の実施形態で実行されるかどうかを、著者入力を用いて若しくは用いずに判定するか又は促すためのロジックを必然的に含むこと、を意味するものではない。「備える（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」、「伴う（involving）」などの用語は、同義であり、包括的にオープンエンド方式で使用され、追加の要素、特徴、行為、動作などを除外しない。また、「又は」という用語は、例えば、要素のリストを接続するために使用されるとき、用語「又は」が、リスト内の要素のうちの１つ、いくつか、又は全てを意味するように、その包括的な意味で（その排他的な意味ではなく）使用される。

「Ｘ、Ｙ、又はＺのうちの少なくとも１つ」という語句などの選言的言語は、別段に具体的に述べられていない限り、項目、用語などがＸ、Ｙ、若しくはＺのいずれか、又はそれらの任意の組み合わせ（例えば、Ｘ、Ｙ、及び／又はＺ）であり得ることを提示するために一般に使用されるような文脈で別様に理解される。したがって、このような選言的な言葉は、一般に、ある特定の実施形態が、Ｘのうちの少なくとも１つ、Ｙのうちの少なくとも１つ、又はＺのうちの少なくとも１つがそれぞれ存在することを必要とすることを暗示することを意図せず、暗示すべきではない。

「約」又は「およそ」などの用語は同義であり、その用語によって修飾される値がそれに関連する理解された範囲を有することを示すために使用され、その範囲は±２０％、±１５％、±１０％、±５％、又は±１％であり得る。「実質的に」という用語は、結果（例えば、測定値）が目標値に近いことを示すために使用され、近いとは、例えば、結果が値の８０％以内、値の９０％以内、値の９５％以内、又は値の９９％以内であることを意味し得る。

特に明記しない限り、「ａ」又は「ａｎ」などの冠詞は、一般に、１つ以上の記載された項目を含むと解釈すべきである。したがって、「～するように構成されたデバイス」又は「～するためのデバイス」などの語句は、１つ以上の列挙されたデバイスを含むことが意図されている。このような１つ以上の列挙されたデバイスはまた、記載された詳細説明を実行するように集合的に構成され得る。例えば、「詳細説明Ａ、Ｂ、及びＣを実行するように構成されたプロセッサ」は、詳細説明Ａを実行し、かつ詳細説明Ｂ及びＣを実行するように構成された第２のプロセッサと関連して動作を行うために、第１のプロセッサを含むことができる。

上記の詳細な説明は、例示的な実施形態に適用される新規の特徴を示し、説明し、指摘してきたが、本開示の趣旨から逸脱することなく、示されたデバイス又はアルゴリズムの形態及び詳細における様々な省略、置換、及び変更を行うことができることが理解されよう。認識されるように、本明細書に記載されるある特定の実施形態は、いくつかの特徴が他とは別個に使用又は実施され得るので、本明細書に記載される特徴及び利点の全てを提供しない形態内で具現化され得る。特許請求の範囲の意味及び均等範囲内に含まれる全ての変更は、それらの範囲内に包含されるものである。

前述の概念の全ての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しないという条件で）は、本明細書に開示される本発明の主題の一部であると意図されていることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。

Claims (31)

1. バーコードインデックスを含むテンプレートポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
   インデックスプライマー及びリードプライマーを前記テンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることと、
   第１の標識を含む第１の標識されたヌクレオチドで前記インデックスプライマーを伸長することと、
   第２の標識を含む第２の標識されたヌクレオチドでリードプライマーを伸長することと、
   前記第１及び第２の標識されたヌクレオチドからの蛍光発光を刺激するために光を発生させることと、
   前記蛍光発光を捕捉することによって、前記バーコードインデックス及び前記テンプレートポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定することと、を含む、方法。
2. 前記テンプレートポリヌクレオチドが、前記テンプレートポリヌクレオチドの同一コピーのクラスターの一部であり、前記インデックスプライマーが、インデックスプライマーの第１の集団の一部であり、前記リードプライマーが、リードプライマーの第２の集団の一部である、請求項１に記載の方法。
3. 前記バーコードインデックス及び前記テンプレートポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定することが、
   前記インデックスプライマーの第１の集団から第１の強度で放出される第１のシグナルを受信することと、
   前記リードプライマーの第２の集団から第２の強度で放出される第２のシグナルを受信することと、
   前記第１のシグナル及び前記第２のシグナルの組み合わせに基づいて、前記バーコードインデックスにハイブリダイズした核酸塩基及び前記テンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした核酸塩基を同定することと、を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記インデックスプライマーの第１の集団の一部が、ブロックされた３’末端を有する、請求項２に記載の方法。
5. 前記リードプライマーの第２の集団が、ブロックされていない３’末端を有する、請求項２に記載の方法。
6. 前記第１の標識されたヌクレオチド及び前記第２の標識されたヌクレオチドが、同じ反応工程において前記テンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項１に記載の方法。
7. 前記インデックスプライマーを伸長することが、非鎖置換ポリメラーゼによって触媒される、請求項１に記載の方法。
8. 前記インデックスプライマーが、所定の数の核酸重合サイクル後に熱的に脱ハイブリダイズされる、請求項１に記載の方法。
9. 前記インデックスプライマーが、ロックド核酸を前記テンプレートポリヌクレオチドと接触させることによって、所定の数の核酸重合サイクル後に除去される、請求項１に記載の方法。
10. 前記リードプライマーを更に伸長することと、前記インデックスプライマーの伸長が捕捉された後に前記テンプレートポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定することと、を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記インデックスプライマー及び前記リードプライマーを伸長する前に、前記インデックスプライマーの第１の集団及び前記リードプライマーの第２の集団の比を調整することを含む、請求項２に記載の方法。
12. 前記インデックスプライマーの第１の集団及び前記リードプライマーの第２の集団に付着したフルオロフォアからの蛍光発光を刺激及び検出することによって、前記テンプレートポリヌクレオチドの同一コピーのクラスターにハイブリダイズした前記インデックスプライマーの第１の集団及び前記リードプライマーの第２の集団の比をモニタリングすることと、
    所定の比が達成されるまで、調節された熱脱ハイブリダイゼーションによって異なる速度で前記インデックスプライマーの第１の集団及び前記リードプライマーの第２の集団を除去することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記クラスターにハイブリダイズしたままの前記インデックスプライマーの第１の集団及び前記リードプライマーの第２の集団に付着した前記フルオロフォアを除去することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
14. テンプレートポリヌクレオチド中の核塩基を同定するシステムであって、
    クラスター中に複数の前記テンプレートポリヌクレオチドを含む基材と、
    方法を実行するように構成されたプロセッサであって、前記方法が、
    前記クラスターからの蛍光発光を刺激するために光を発生させることと、
    第１の部位で前記複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第１の複数のヌクレオチド類似体から第１の強度で放出される第１のシグナルを受信することと、
    第２の部位で前記複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第２の複数のヌクレオチド類似体から第２の強度で放出される第２のシグナルを受信することと、
    前記第１及び第２のシグナルの組み合わせに基づいて、前記テンプレートポリヌクレオチドの前記第１及び第２の部位でハイブリダイズした前記核酸塩基を同定することと、を含む、プロセッサと、を備える、システム。
15. 前記プロセッサが、前記第１のシグナルの前記第１の強度と前記第２のシグナルの前記第２の強度との間の差異に基づいて、前記テンプレートポリヌクレオチド中の前記核酸塩基を同定するように構成されている、請求項３０に記載のシステム。
16. テンプレートポリヌクレオチド中の核塩基を同定する方法であって、
    クラスター中に複数の前記テンプレートポリヌクレオチドを含む基材を提供することと、
    前記クラスターからの蛍光発光を刺激するために光を発生させることと、
    第１の部位で前記複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第１の複数のヌクレオチド類似体から第１の強度で放出される第１のシグナルを受信することと、
    第２の部位で前記複数のテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズした第２の複数のヌクレオチド類似体から第２の強度で放出される第２のシグナルを受信することと、
    前記第１及び第２のシグナルの組み合わせに基づいて、前記テンプレートポリヌクレオチドの前記第１及び第２の部位でハイブリダイズした前記核酸塩基を同定することと、を含む、方法。
17. 前記第１の部位が、前記テンプレートポリヌクレオチドのバーコードインデックスセグメント内にあり、前記第２の部位が、前記テンプレートポリヌクレオチドの非バーコードインデックスセグメント内にある、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１のシグナルの前記第１の強度と前記第２のシグナルの前記第２の強度との間の差異に基づいて、前記テンプレートポリヌクレオチド中の前記核酸塩基を同定することを含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記第１の複数のヌクレオチド類似体中の前記ヌクレオチド類似体が、前記クラスター中の前記テンプレートポリヌクレオチドのバーコードインデックス部分に隣接する部位にハイブリダイズしたインデックスプライマーの一部である、請求項１６に記載の方法。
20. 前記第２の複数のヌクレオチド類似体中の前記ヌクレオチド類似体が、前記クラスター中の前記テンプレートポリヌクレオチドの非バーコードインデックス部分に隣接する部位にハイブリダイズしたリードプライマーの一部である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記核酸塩基を同定することが、前記インデックスプライマー上の前記ヌクレオチド類似体からの前記第１の強度における前記第１のシグナルを、前記リードプライマー上のヌクレオチド類似体からの前記第２の強度における前記第２のシグナルと比較することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第１のシグナルが、前記第２のシグナルの強度よりも低い強度を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第１及び第２のシグナルの前記強度が、前記インデックスプライマー中の前記第１の複数のヌクレオチド類似体及び前記リードプライマー中の前記第２の複数のヌクレオチド類似体の濃度と対応する、請求項２０に記載の方法。
24. 前記インデックスプライマーの一部が、ブロックされた３’末端を有し、前記リードプライマーが、ブロックされていない３’末端を有する、請求項２０に記載の方法。
25. 光周波数の第１の範囲及び光周波数の第２の範囲において前記第１のシグナルを検出することと、
    前記光周波数の第１の範囲及び前記光周波数の第２の範囲において前記第２のシグナルを検出することと、を含み、
    前記光周波数の第１の範囲と前記光周波数の第２の範囲とが同一ではない、請求項１６に記載の方法。
26. 光周波数の第１の範囲において前記クラスターの第１の蛍光画像を取得することと、
    光周波数の第２の範囲において前記クラスターの第２の蛍光画像を取得することであって、前記光周波数の第１の範囲と前記光周波数の第２の範囲とが同一ではない、取得することと、
    前記クラスターの前記第１及び第２の蛍光画像から蛍光強度を抽出することと、
    前記抽出された蛍光強度に基づいて、前記第１及び第２の部位における前記核酸塩基を同定することと、を含む、請求項１６に記載の方法。
27. 前記第１及び第２の部位における前記核酸塩基の組み合わせが、前記第１及び第２の蛍光画像からの前記抽出された蛍光強度の組み合わせと、核酸塩基の種類の１６の組み合わせについての所定の蛍光強度分布とに基づいて、核酸塩基の種類の１６の組み合わせのうちの１つとして分類される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記抽出された蛍光強度を正規化することと、
    前記正規化された抽出された蛍光強度の組み合わせと、核酸塩基の種類の１６の組み合わせについての所定の正規化された蛍光強度分布とに基づいて、前記第１及び第２の部位における前記核酸塩基の組み合わせを、核酸塩基の種類の１６の組み合わせのうちの１つとして分類することと、を含む、請求項２６に記載の方法。
29. 前記クラスターからの発光を所定の光周波数の光で刺激することを含む、請求項２６に記載の方法。
30. 前記クラスターからの発光を２つの所定の光周波数の光で刺激することを含む、請求項２６に記載の方法。
31. 前記テンプレートポリヌクレオチドに相補的な追加のポリヌクレオチド中の核酸塩基を実質的に同時に同定することを更に含む、請求項１６に記載の方法。