JP2024525145A

JP2024525145A - がんなどの疾患の治療のための（ｒ）－ｎ－エチル－５－フルオロ－ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩

Info

Publication number: JP2024525145A
Application number: JP2023576415A
Authority: JP
Inventors: カイ，ウェイ; ダイ，シュエドン; アレシスジョルジュケロル，オリヴィエ; ウィルヘルムスジェイ．チューリング，ヨハネス; ティーフェイエヌジー，アリシア; フレディージェイクスブルーノダーヴィレ，ニコラス; マイケルゲールトマン，ロバート; アフジャ，ディパリ; リウ，インタオ; パンデ，ヴィニート; クリエーター，エドワード; ハイム，シリルベン; ジャンシースモルダース，シモン
Original assignee: ヤンセンファーマシューティカエヌ．ベー．
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2024-07-10

Abstract

本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩及びその溶媒和物に関する。この化合物は、哺乳動物における治療及び／又は予防、そのような化合物を含む医薬組成物、並びに、疾患、例えば、限定するものではないが白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などのがん及び糖尿病を治療するのに有用なメニン／ＭＬＬタンパク質／タンパク質相互作用阻害剤としての使用に有用であり得る。

Description

本発明は、
（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩及びその溶媒和物に関する。

この化合物は、哺乳動物における治療及び／又は予防、そのような化合物を含む医薬組成物、並びに、疾患、例えば、限定するものではないが白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などのがん及び糖尿病を治療するのに有用なメニン／ＭＬＬタンパク質／タンパク質相互作用阻害剤としての使用に有用であり得る。

混合系統白血病遺伝子（ＭＬＬ、ＭＬＬ１、ＫＭＴ２Ａ）に影響を及ぼす染色体再配列は、全ての年齢群にわたって侵襲性急性白血病をもたらし、依然として大部分が不治の疾患であり、新規な治療アプローチの緊急の必要性が力説されている。ＭＬＬのこれらの染色体転座を有する急性白血病は、リンパ性、骨髄性又は二表現型疾患として表れ、成人における急性白血病の５～１０％及び乳児における約７０％を構成する（Ｍａｒｓｃｈａｌｅｋ，ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ２０１１．１５２（２），１４１－５４、Ｔｏｍｉｚａｗａｅｔａｌ．，ＰｅｄｉａｔｒＢｌｏｏｄＣａｎｃｅｒ２００７．４９（２），１２７－３２）。

ＭＬＬは、リジン４（Ｈ３Ｋ４）上のヒストンＨ３をメチル化するヒストンメチルトランスフェラーゼであり、多タンパク質複合体において機能する。Ｍｌｌ１の誘導性機能喪失型対立遺伝子の使用は、Ｍｌｌ１が造血幹細胞（ＨＳＣ）の維持及びＢ細胞の発生において必須の役割を果たすが、そのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は造血には必要ないことを実証した（Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｐ２０１４．７（４），１２３９－４７）。

ＭＬＬと６０を超える異なるパートナーとの融合が今日までに報告されており、白血病の形成／進行に関連付けられている（Ｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ２０１３．２７，２１６５－２１７６）。興味深いことに、ＭＬＬのＳＥＴ（Ｓｕ（ｖａｒ）３－９、ｚｅｓｔｅのエンハンサー、及びｔｒｉｔｈｏｒａｘ）ドメインは、キメラタンパク質中に保持されないが、融合パートナーによって置換される（Ｔｈｉｅｌｅｔａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ２０１２．３４，７７１－８０）。融合パートナーによるＤｏｔ１Ｌ及び／又はｐＴＥＦｂ複合体のようなクロマチン修飾酵素の動員は、最も顕著なものとしてＨＯＸＡ遺伝子（例えば、ＨＯＸＡ９）及びＨＯＸ補因子ＭＥＩＳ１を含むＭＬＬ標的遺伝子の転写及び転写伸長の増強をもたらす。次に、これらの遺伝子の異常な発現は、造血分化をブロックし、増殖を増進する。

多発性内分泌腺腫症１型（ＭＥＮ１）遺伝子によってコードされるメニンは、遍在的に発現され、主に核に局在する。これは、多数のタンパク質と相互作用することがわかっており、したがって、種々の細胞プロセスに関与する。メニンの最もよく理解されている機能は、ＭＬＬ融合タンパク質の発がん性補因子としてのその役割である。メニンは、全ての融合タンパク質に保持されるＭＬＬのＮ末端断片内の２つのモチーフ、ＭＢＭ１（メニン結合モチーフ１）及びＭＢＭ２と相互作用する（Ｔｈｉｅｌｅｔａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ２０１２．３４，７７１－８０）。メニン／ＭＬＬ相互作用によって、水晶体上皮由来増殖因子（ＬＥＤＧＦ）について新しい相互作用表面が形成される。ＭＬＬはＬＥＤＧＦに直接結合するが、メニンは、ＭＬＬとＬＥＤＧＦとの間の安定な相互作用、及びＬＥＤＧＦのＰＷＷＰドメインを介したＭＬＬ複合体の遺伝子特異的クロマチン動員に必須である（Ｃｅｒｍａｋｏｖａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１４．１５，５１３９－５１、Ｙｏｋｏｙａｍａ＆Ｃｌｅａｒｙ，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２００８．８，３６－４６）。更に、多くの遺伝学的研究は、メニンがＭＬＬ融合タンパク質による発がん性形質転換に厳密に必要とされることを示しており、メニン／ＭＬＬ相互作用を魅力的な治療標的として示唆している。例えば、Ｍｅｎ１の条件付き欠失は、ＭＬＬ融合を異所的に発現する骨髄前駆細胞における白血球形成を防止する（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ２００６．１０３，１０１８－２３）。同様に、機能喪失型突然変異によるメニン／ＭＬＬ融合相互作用の遺伝子破壊は、ＭＬＬ融合タンパク質の発がん特性を無効にし、白血病の発生をインビボでブロックし、ＭＬＬ形質転換白血病芽球の分化ブロックを解除する。これらの研究はまた、メニンが、ＭＬＬ融合タンパク質によるＨＯＸ遺伝子発現の維持に必要であることを示した（Ｙｏｋｏｙａｍａｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ２００５．１２３，２０７－１８）。更に、メニン／ＭＬＬ相互作用の小分子阻害剤が開発されており、このタンパク質／タンパク質相互作用のドラッガビリティを示唆しており、ＡＭＬの前臨床モデルにおける有効性も実証されている（Ｂｏｒｋｉｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２０１５．２７，５８９－６０２、ＣｉｅｒｐｉｃｋｉａｎｄＧｒｅｍｂｅｃｋａ，ＦｕｔｕｒｅＭｅｄＣｈｅｍ２０１４．６，４４７－４６２）。メニンが正常な造血中のＭＬＬ１の必須補因子ではないという観察結果（Ｌｉｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ２０１３．１２２，２０３９－２０４６）と共に、これらのデータは、ＭＬＬ再構成白血病及び活性ＨＯＸ／ＭＥＩＳ１遺伝子シグネチャを有する他のがんの処置のための有望な新しい治療アプローチとして、メニン／ＭＬＬ相互作用を妨げることの正当性を立証する。例えば、ＭＬＬ遺伝子の５’領域内の内部タンデム重複（ＰＴＤ）は、デノボ及び二次性ＡＭＬ並びに骨髄異形成症候群において主に見出される別の主要な異常を表す。ＭＬＬ－ＰＴＤの分子機構及び生物学的機能は十分に理解されていないが、メニン／ＭＬＬ相互作用に影響を及ぼす新しい治療標的化戦略もまた、ＭＬＬ－ＰＴＤ関連白血病の治療において有効であることが証明され得る。更に、去勢抵抗性前立腺がんは、メニン／ＭＬＬ相互作用に依存することがわかっている（Ｍａｌｉｋｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｄ２０１５．２１，３４４－５２）。

ＭＬＬタンパク質は、科学分野においてヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＭＴ２Ａ）タンパク質としても知られている（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０３１６４）。

いくつかの参考文献には、メニン－ＭＬＬ相互作用を標的とする阻害剤が記載されている。国際公開第２０１１０２９０５４号、ＪＭｅｄＣｈｅｍ２０１６，５９，８９２－９１３には、チエノピリミジン及びベンゾジアゼピン誘導体の調製が記載されており、国際公開第２０１４１６４５４３号には、チエノピリミジン及びチエノピリジン誘導体が記載されており、ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙＭａｒｃｈ２０１２，８，２７７－２８４及びＲｅｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍＬｅｔｔ（２０１６），２６（１８），４４７２－４４７６には、チエノピリミジン誘導体が記載されており、ＪＭｅｄＣｈｅｍ２０１４，５７，１５４３－１５５６には、ヒドロキシ及びアミノメチルピペリジン誘導体が記載されており、ＦｕｔｕｒｅＭｅｄＣｈｅｍ２０１４，６，４４７－４６２には、小分子及びペプチド模倣化合物が概説されており、国際公開第２０１６１９５７７６号には、フロ［２，３－ｄ］ピリミジン、９Ｈ－プリン、［１，３］オキサゾロ［５，４－ｄ］ピリミジン、［１，３］オキサゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン、［１，３］チアゾロ［５，４－ｄ］ピリミジン、チエノ［２，３－ｂ］ピリジン及びチエノ［２，３－ｄ］ピリミジン誘導体が記載されおり、国際公開第２０１６１９７０２７号には、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［３，４－ｄ］ピリミジン、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［４，３－ｄ］ピリミジン、ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン及びキノリン誘導体が記載されており、国際公開第２０１６０４０３３０号には、チエノピリミジン及びチエノピリジン化合物が記載されている。国際公開第２０１７１９２５４３号には、メニン阻害剤としてピペリジンが記載されている。国際公開第２０１７１１２７６８号、国際公開第２０１７２０７３８７号、国際公開第２０１７２１４３６７号、国際公開第２０１８０５３２６７号及び国際公開第２０１８０２４６０２号には、メニン－ＭＬＬ相互作用の阻害剤が記載されている。国際公開第２０１７１６１００２号及び国際公開第２０１７１６１０２８号には、メニン－ＭＬＬの阻害剤が記載されている。国際公開第２０１８０５０６８６号、国際公開第２０１８０５０６８４号及び国際公開第２０１８１０９０８８号には、メニン－ＭＬＬ相互作用の阻害剤が記載されている。国際公開第２０１８２２６９７６号には、メニンとＭＬＬタンパク質との相互作用を阻害するための方法及び組成物が記載されている。国際公開第２０１８１７５７４６号は、血液悪性腫瘍及びユーイング肉腫の治療方法を提供する。国際公開第２０１８１０６８１８号及び国際公開第２０１８１０６８２０号は、膵臓細胞の増殖を促進する方法を提供する。国際公開第２０１８１５３３１２号は、医薬品化学の分野に関するアザスピロ化合物を開示する。国際公開第２０１７１３２３９８号は、ＮＰＭ１変異を示す白血病細胞を、ＭＬＬとメニンとの間の相互作用の薬理学的阻害剤と接触させることを含む方法を開示する。国際公開第２０１９０６０３６５号には、メニン－ＭＬＬの置換阻害剤が記載されている。国際公開第２０２００６９０２７号には、メニンの阻害剤による血液学的悪性腫瘍の治療が記載されている。Ｋｒｉｖｔｓｏｖｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２０１９．Ｎｏ．６Ｖｏｌ．３６，６６０－６７３には、メニン－ＭＬＬ阻害剤が記載されている。

本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩（ベンゼンスルホネート塩）：

及びその溶媒和物である。
当業者は、「及びその溶媒和物」が、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドのベシル酸塩を指すことを理解するであろう。したがって、本発明は、（Ｒ－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドのベシル酸塩、及び（Ｒ－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドのベシル酸塩の溶媒和物も包含する。

特に、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩又はその水和物に関する。

特に、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩又はその溶媒和物に関する。

特に、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩又はその水和物に関する。

特に、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩０．５～２．０当量水和物に関する。

特に、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩２．０当量水和物に関する。

より詳細には、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａに関する。

より詳細には、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩０．５～２．０当量水和物の結晶形態Ａに関する。

より詳細には、本発明は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩２．０当量水和物の結晶形態Ａに関する。

（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドのベシル酸塩又はその溶媒和物は、その化学的／物理的安定性、その物理的特性、及び安定な結晶性固体として単離できるという事実に関して優れている。

本発明の一実施形態は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩又はその溶媒和物を含む医薬組成物に関する。

本発明はまた、医薬的に許容される担体、医薬的に許容される賦形剤、及び／又は医薬的に許容される希釈剤並びに（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩又はその溶媒和物を含む医薬組成物、それらからなる医薬組成物、及び／又はそれらから本質的になる医薬組成物を提供する。

また、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩又はその溶媒和物と、医薬的に許容される担体、医薬的に許容される賦形剤、及び／又は医薬的に許容される希釈剤を含む医薬組成物、それらからなる医薬組成物、及び／又はそれらから本質的になる医薬組成物の製造プロセスも提供される。

本発明は更に、疾患、例えば、限定するものではないが、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などのがん及び糖尿病を、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩及びその溶媒和物を使用して治療又は改善するための方法に関する。

本発明はまた、医薬品の調製における、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩又はその溶媒和物の使用であって、医薬品が、疾患、例えば、限定するものではないが、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などのがん及び糖尿病を治療するために調製される、使用に関する。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、白血病、特にヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）変異型白血病、例えば、ＮＰＭ１ｃの治療又は予防に有用であり得る。

一実施形態では、本発明による化合物は、改善された代謝安定性特性を有し得る。

一実施形態では、本発明による化合物は、延長されたインビボ半減期（Ｔ１／２）を有し得る。

一実施形態では、本発明による化合物は、改善された経口バイオアベイラビリティを有し得る。

一実施形態では、本発明による化合物は、腫瘍成長、例えば、ＭＬＬ（ＫＭＴ２Ａ）遺伝子の再構成／変化及び／又はＮＰＭ１変異を有する腫瘍を減少させ得る。

一実施形態では、本発明による化合物は長期間にわたってインビボで改善されたＰＤ特性、例えば、ＭＥＩＳ１などの標的遺伝子発現の阻害及び少なくとも１６時間の期間にわたる分化マーカーの上方制御を有し得る。

一実施形態では、本発明による化合物は、改善された安全性プロファイル（例えば、低減されたｈＥＲＧ阻害、改善された心血管安全性）を有し得る。

一実施形態では、本発明による化合物は、Ｑ．Ｄ．投薬（１日１回）に適切であり得る。

本発明はまた、限定するものではないが、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などのがん及び糖尿病の治療又は予防において使用するための、追加の医薬品と組み合わせた本発明による化合物の使用に関する。

更に、本発明は、本発明による医薬組成物を調製するためのプロセスに関し、プロセスは、医薬的に許容される担体が、治療有効量の本発明による化合物と均質に混合されることを特徴とする。

本発明はまた、限定するものではないが、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などのがん及び糖尿病の治療又は予防において同時に、又は別々に、又は逐次的に使用するための組み合わせ製剤として、本発明による化合物とび追加の医薬品を含む製品に関する。

更に、本発明は、温血動物における細胞増殖性疾患を治療又は予防する方法であって、有効量の本明細書に定義される本発明による化合物、又は本明細書に定義される医薬組成物も若しくは組み合わせを上記動物に投与することを含む、方法に関する。

他の実施形態では、本発明は、医薬品として使用するための、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩及びその溶媒和物に関する。

他の実施形態では、本発明は、医薬品として使用するための、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩及びその溶媒和物に関する。

他の実施形態では、本発明は、医薬品として使用するための、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩水和物の結晶形態Ａに関する。

他の実施形態では、本発明は、医薬品として使用するための、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａに関する。

本発明はまた、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩及びその溶媒和物の調整に関する。

本発明はまた、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａの調整に関する。

発明の概要、並びに以下の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて読むことで、更に理解される。本発明を説明する目的で、図面には、本発明の例示的実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面の特定の開示に限定されない。図面のうち：
（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態ＡのＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンである。Ｍｏｌｍ－１４皮下（ｓｃ）モデルにおける有効性実験。播種性ＯＣＩ－ＡＭＬ３モデルにおける有効性実験。中間体２３４ｂの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）パターンである。

本開示は、以下の用語集及び結論付ける実施例を含む、以下の説明を参照することによって、より完全に理解され得る。また、明確さのために本明細書では別々の態様の文脈で説明される、本開示の化合物、結晶形態Ａ、組成物及び方法の特定の特徴は、単一の態様において組み合わせて提供され得ることも理解される。逆に、簡潔さのために単一の態様の文脈で説明される、本開示の化合物、結晶形態Ａ、組成物及び方法の種々の特徴が、別々に又は任意の部分的組み合わせで提供される場合もある。

本明細書で示されている量的表現の一部は、「約」という用語により修飾されていない。「約」という用語が明示的に使用されているか否かに関わらず、本明細書において示されている量は全て、その実際に示されている値を指すことを意味し、そのような示された値の実験及び／又は測定条件による近似値を含む、当該技術分野における通常の技量に基づいて合理的に推測されると思われる、そのような示された値の近似値を指すことも意味することが理解される。

本明細書の説明及び特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」及び「含む（contain）」という用語並びにその変形、例えば「含む（comprising）」及び「含む（comprises）」は、「含むがこれに限定されない（including but not limited to）」を意味し、他の構成要素を排除することを意図しない（及び排除しない）。

本開示において、「結晶形態」及び「多形」という用語は同義である。結晶形態の特徴情報が本明細書に提供される。特定の形態の決定は、当業者が特定の形態の存在を確立するのに十分であると認識する特徴情報の任意の部分を使用して達成することができることを理解されたい。例えば、たった１つの特徴的なピークであっても、特定の形態が存在することを当業者が認識するのに十分であり得る。

「単離された形態」という用語は、別の化合物との任意の固体混合物、溶媒系又は生物学的環境から分離された形態で存在する化合物を指す。本発明の一実施形態では、結晶形態は単離形態で存在する。

「室温」（ＲＴ）という用語は、約１５℃～約３０℃、特に約２０℃～約３０℃の温度を指す。好ましくは、室温は約２５℃の温度である。

結晶形態が、角度２θ（２シータ）として与えられる１つ以上のＸＲＰＤピークを使用して同定される場合、２θ値のそれぞれは、別段の記載がない限り、所与の値±０．２度２シータを意味すると理解される。

「播種」という用語は、結晶化又は再結晶化を開始するための溶液又は混合物への結晶性材料の添加を指す。

本明細書で使用される場合、「（本）発明の化合物」又は「（本）発明による化合物」という用語は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩及びその溶媒和物、又はその任意のサブグループを含むことを意味する。

（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩は溶媒和物として存在し得る。「溶媒和物」は、水（すなわち、水和物）又は一般的な有機溶媒との溶媒和物であり得る。

（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩又はその溶媒和物は、実質的に純粋な形態で得ることができ、単離された化合物中の不純物のモルパーセントは、約５モルパーセント未満、好ましくは約２モルパーセント未満、より好ましくは約０．５モルパーセント未満、最も好ましくは約０．１モルパーセント未満である。本発明の一実施形態では、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩又はその溶媒和物が実質的に純粋な形態で存在する。

（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａは、実質的に純粋な形態で得ることができ、単離された結晶形態中の不純物のモルパーセントは、約５モルパーセント未満、好ましくは約２モルパーセント未満、より好ましくは約０．５モルパーセント未満、最も好ましくは約０．１モルパーセント未満である。本発明の一実施形態では、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物は、実質的に純粋な形態で存在する。

本明細書では、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドの１つ以上の追加の形態（他の結晶形態、他の塩形態、又はそれらの溶媒和物など）との混合物としての（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａも提供される。少なくとも特定の重量パーセントは、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａであり得る。特定の重量パーセントとしては、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％及び９９．９％が挙げられる。

本明細書では、本明細書に記載の結晶形態を調製するプロセスであって、化合物Ａを再結晶する工程を含み、再結晶が、
ａ）化合物Ａ又はその水和物若しくは溶媒和物を、ベンゼンスルホン酸の存在下で、適切な溶媒の混合物に添加し、約２０℃から溶媒還流温度の範囲の温度に調整する工程と、
ｂ）結晶形態Ａを播種する工程と、
ｃ）本明細書に記載の結晶形態の沈殿物を得る工程とを含む、方法が提供される。

特に、前段落に記載したプロセスにおける適切な溶媒の混合物は、アセトン、水及びＩＰＡｃの混合物である。

特に、前段落に記載したプロセスにおける適切な溶媒の混合物は、イソプロパノール、水及びＩＰＡｃの混合物である。特に、本プロセスで使用される温度は約２５℃である。

また

クエン酸塩の結晶形態も提供され、
ここで、結晶形態は、５．８２、１０．０９及び１８．４２度の２シータ±０．２度の２シータにピークを含むＸ線粉末回折パターンを生成し、具体的には、Ｘ線粉末回折パターンは、５．８２、８．５２、９．２０、１０．０９、１１．４３、１３．６１、１４．９４、１５．８９、１７．０３及び１８．４２度の２シータ±０．２度の２シータにピークを含む。

また、以下の中間体：

がその医薬的に許容される塩又は溶媒和物として提供される。

当業者は、「又はその溶媒和物」が、中間体の医薬的に許容される塩を指し、したがって医薬的に許容される塩の溶媒和物を包含することを理解するであろう。

また、以下の中間体：

が溶媒和物として提供される。

医薬的に許容される塩としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。そのような塩は、従来の手段によって、例えば、遊離酸形態又は遊離塩基形態を、適切な塩基又は酸の１つ以上の等価物と、任意選択的に溶媒中で、又は塩が不溶性である媒体中で反応させ、続いて標準的な技術を使用して（例えば、真空で、凍結乾燥法によって、又は濾過によって）、当該溶媒又は当該媒体を除去することによって形成され得る。塩はまた、例えば、好適なイオン交換樹脂を使用して、塩の形態の本開示の化合物の対イオンを別の対イオンと交換することによって調製されてもよい。

適切な酸は、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば、塩酸若しくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの酸などの無機酸、又は例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわち、エタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクラム酸、サリチル酸、ｐ－アミノサリチル酸、パモン酸などの酸などの有機酸を含む。逆に、上記塩形態は、適切な塩基で処理することによって、遊離塩形態に変換されることができる。

適切な塩基塩形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム、マグネシウム、カルシウム塩など、有機塩基、例えば、一級、二級及び三級脂肪族アミン及び芳香族アミン、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、４つのブチルアミン異性体、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジ－ｎ－ブチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、キヌクリジン、ピリジン、キノリン、及びイソキノリンを有する塩、ベンズアチン、Ｎ－メチル－グルカミン、ヒドラバミン塩、及びアミノ酸、例えばアルギニン、リジンなどを有する塩を含む。逆に、塩基形態は、酸で処理することによって、遊離塩基形態に変換されることができる。

溶媒和物という用語は、溶媒付加形態を含む。そのような溶媒付加形態の例は、例えば、水和物、アルコラートなどである。

５－フルオロ－２－ヒドロキシ－安息香酸からＮ－エチル－５－フルオロ－２－ヒドロキシ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（中間体２８）への一段階変換も提供される。

この反応は、ＴＨＦ、トルエン、アセトニトリル又は２－メチルテトラヒドロフランなどの適切な溶媒中、カップリング剤ＣＤＩの存在下で行われる。特に、溶媒はＴＨＦである。反応は、典型的には、０℃～還流温度、好ましくは０℃～５０℃、より好ましくは１０℃～３０℃、更により好ましくは１５℃～２５℃の温度範囲で行われる。

「医薬的に許容される」は、連邦政府若しくは州政府の規制当局又は米国以外の国の該当する当局により承認された、又は承認可能であること、あるいは動物における、より具体的にはヒトにおける使用について、米国薬局方又は他の一般的に認知されている薬局方に列挙されていることを意味する。

「対象」という用語は、治療、観察、又は試験の対象となっている動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。

用語「治療有効量」は、本明細書で使用するとき、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医により求められている、治療されている疾患又は障害の症状の緩和若しくは逆転を含む、組織系、動物、又はヒト内で生体学的反応又は医薬反応を引き出す活性化合物又は医薬的薬剤の量を意味する。

「組成物」という用語は、特定の成分を特定の量で含む製品、及び特定の量の特定の成分の組み合わせから直接的又は間接的に得られる任意の製品を包含することを意図する。

本明細書で使用される場合、特に注記しない限り、「影響」又は「影響を受ける」という用語は（メニン／ＭＬＬタンパク質／タンパク質相互作用阻害剤の阻害によって影響を受ける疾患、症候群、状態、又は障害を指す場合）、上記疾患、症候群、状態、若しくは障害のうちの１つ以上の症状若しくは症状発現の頻度及び／若しくは重症度を減少させることを含み、並びに／又は上記疾患、症候群、状態、若しくは障害の１つ以上の症状若しくは症状発現の発症を予防することを含む。

本明細書で使用される「治療」及び「治療すること」という用語は、障害の進行の減速、中断、停止若しくは停止、又はその１つ以上の症状の改善があり得る全てのプロセスを指すことを意図しているが、必ずしも全ての症状の完全な排除を示すものではない。

実験パート
（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａの合成

当業者は、以下の実験プロトコルに明示的に言及されていない場合であっても、典型的にはカラムクロマトグラフィ精製後に、所望の画分を収集し、溶媒を蒸発させたことを理解するであろう。

立体化学が示されていない場合、これは、特に示されていないか、又は文脈から明らかでない限り、立体異性体の混合物であることを意味する。

立体中心が「ＲＳ」で示される場合、これは、別途記載のない限り、示された中心でラセミ混合物が得られたことを意味する。

当業者によって理解されるように、示されるプロトコルを使用して合成された化合物及び中間体は、溶媒和物、例えば、水和物として存在し得、かつ／又は残留溶媒若しくは微量不純物を含有し得る。塩の形態又は溶媒和物（例えば、水和物）で単離された化合物又は中間体は、整数化学量論、すなわち、単塩若しくは二塩、又は中間化学量論のものであり得る。中間体又は化合物が、ＨＣｌの当量数を示さずに「ＨＣｌ塩」として示される場合、これは、ＨＣｌの当量数を確認しなかったことを意味する。中間体又は化合物が、Ｈ_２Ｏの当量数を示さずに「水和物」として示される場合、これは、Ｈ_２Ｏの当量数を確認しなかったことを意味する。

便宜上、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（遊離塩基）は、以下の実験パートにおいて「化合物Ａ」として示される。

実施例１－（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（化合物Ａ）の合成－調製方法Ａ
中間体１の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（５－メチル－４－オキソヘキシル）カルバメート

－７０℃に冷却したＴＨＦ（６０ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル２－オキソピロリジン－１－カルボキシラート（５．０ｇ、２７ｍｍｏｌ）及びＴＭＥＤＡ（５．０ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、イソプロピルマグネシウムブロミド溶液（１９ｍＬ、５５ｍｍｏｌ、２－メチルテトラヒドロフラン中２．９Ｍ）をゆっくり添加し、得られた混合物をゆっくりと室温に加温し、１２時間撹拌した。混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（５０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをＦＣＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１：０～１００：１）によって更に精製して、標題中間体（３．７ｇ、収率６０％）を黄色油として得た。

中間体１３の調製
ｔｅｒｔ－ブチル６－（３，６－ジクロロ－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート

０℃に冷却したＤＣＭ（１００ｍＬ）に、３，５，６－トリクロロ－１，２，４－トリアジン（１０．０ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１５．２ｍＬ、１０９ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ｔｅｒｔ－ブチル２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート（９．２１ｇ、４３．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温に加温し、１時間撹拌した。混合物を水（２０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲルＦＣＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１：０～３：１）により精製して、標題中間体（１２．０ｇ、収率５８％）を黄色固体として得た。

中間体２７の調製
Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－メトキシベンズアミド

０℃に冷却した乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に、５－フルオロ－２－メトキシ安息香酸（８．００ｇ、４７．０ｍｍｏｌ）及びＮ－エチルプロパン－２－アミン（８．１９ｇ、９４．０ｍｍｏｌ）を混合した混合物に、ＨＡＴＵ（２１．５ｇ、５６．５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．１０ｇ、７０．４ｍｍｏｌ）を小分けにしてゆっくり添加した。得られた混合物をゆっくりと室温に温め、８時間撹拌した。有機層を水（２０ｍＬ×３）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。濾過後、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をＦＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ＝０％～２０％）により精製して、標題中間体（１２．０ｇ、収率９６％）を白色固体として得た。

中間体２８の調製
Ｎ－エチル－５－フルオロ－２－ヒドロキシ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド

－７８℃に冷却した乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）に、Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－メトキシベンズアミド（中間体２７）（１２．０ｇ、５０．１ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ＢＢｒ_３（１４．４ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、得られた混合物を室温にゆっくり加温し、８時間撹拌した。混合物を再び－７８℃に冷却し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）を滴加して反応をクエンチした。得られた混合物をゆっくり室温に加温し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加することによってｐＨ値を約８に調整した。水層をＤＣＭ（５０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得て、これをＦＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ＝０％～２０％）により精製して、標題中間体（９．０ｇ、収率７８％）を白色固体として得た。

中間体２８の代替調製

ＴＨＦ（１６８Ｌ、１２体積）に５－フルオロ－２－ヒドロキシ－安息香酸（１４．０ｋｇ、８９．６８ｍｏｌ、１．０当量）を混合した混合物を１５～２５℃に調整し、１，１－カルボニルジイミダゾール（１７．４５ｋｇ、１０７．６２ｍｏｌ、１．２当量）を１時間かけて添加した。添加後、混合物を１５～２５℃で１８時間撹拌した。この時間を経た後、Ｎ－エチルプロパン－２－アミン（１４．８５ｋｇ、１７０．３９ｍｏｌ、１．９当量）を混合物に１５～２５℃で２時間かけて添加した。得られた混合物を１５～２５℃で１８～２４時間にわたって更にエージングした。１０％Ｈ_２ＳＯ_４水溶液（１４０ｋｇ、１０体積）を用いてｐＨをｐＨ４～５に調整し、層を分離した。温度を４０℃未満に維持しながら有機相を４２～５６Ｌに濃縮し、次いで、ｎ－ヘプタン（４３ｋｇ、４．５体積）を混合物に１５～２５℃で３時間にわたって添加した。次いで、混合物を０～１０℃に冷却し、更に６時間撹拌した。得られたスラリーを濾過し、ケーキをｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）：ｎ－ヘプタン混合物（２５ｋｇのＭＴＢＥ：ｎ－ヘプタンの２：３体積／体積混合物、２．５体積）で洗浄した。ケーキ洗浄を更に２回繰り返し、得られた固体を真空中５０℃で乾燥させて、中間体２８（１６．５ｋｇ、純度：９９．１％、収率：８０．４％）を得た。

中間体１４の調製
ｔｅｒｔ－ブチル６－（３－クロロ－６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート

ＴＨＦ（１２０ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル６－（３，６－ジクロロ－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート（中間体１３）（１２．０ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチル－５－フルオロ－２－ヒドロキシ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（中間体２８）（７．５ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（６．１ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を混合した混合物を２５℃で８時間撹拌した。混合物を水（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをＦＣＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１：０～３：１）により精製して、標題中間体（１４．０ｇ、収率７３％）を緑色固体として得た。

中間体２の調製
ｔｅｒｔ－ブチル６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート
中間体２の合成方法Ａ

ＴＨＦ（５００ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル６－（３－クロロ－６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２、６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート（中間体１４）（２０ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）、ＮａＢＨ_４（２．４８ｇ、６５．７ｍｍｏｌ）及びＴＭＥＤＡ（８．５４ｇ、７３．５ｍｍｏｌ）を混合した混合物に、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２×ＤＣＭ（１．７０ｇ、２．０８ｍｍｏｌ）をＮ_２雰囲気下で添加した。添加後、反応混合物を２５℃で１４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、残留物をシリカゲルＦＣＣ（ＥｔＯＡｃ）により精製して、標題中間体（１５ｇ、純度９３％、収率７４％）を褐色固体として得た。

中間体２の合成方法Ｂ

ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル６－（３－クロロ－６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート（中間体１４）（２２．０ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１５ｍＬ）を溶解した溶液に、Ｐｄ／Ｃ（湿潤、５．０ｇ、１０％）を添加した。得られた混合物をＨ_２雰囲気下（３０ｐｓｉ）、２５℃で８時間撹拌した。反応混合物をｃｅｌｉｔｅパッドを通して濾過し、濾液を真空中で濃縮して、標題中間体（２５．０ｇ、粗製）を得、これを更に精製することなく次工程で直接使用した。

中間体３の調製
２－（（５－（２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド

ＤＣＭ（５ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－カルボキシレート（中間体２）（３００ｍｇ、０．５８３ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ、６．４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で３時間撹拌した。次いで、１０％ＮａＯＨ（５ｍＬ）溶液を混合物にゆっくり添加してｐＨ値を約１２に調整し、得られた混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、標題中間体（２２０ｍｇ、収率９０％）を白色固体として得た。

化合物６１の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（４－（６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－５－メチルヘキシル）カルバメート

ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に、２－（（５－（２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（中間体３）（１．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（５－メチル－４－オキソヘキシル）カルバメート（中間体１）（８３０ｍｇ、３．６２ｍｍｏｌ）及びＺｎＣｌ_２（６６０ｍｇ、４．８４ｍｍｏｌ）を混合した混合物を８０℃で０．５時間撹拌した。次いで、ＮａＢＨ_３ＣＮ（３１０ｍｇ、４．９３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を８０℃で６時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物を減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをＷａｔｅｒｓＸｂｒｉｄｇｅＰｒｅｐＯＢＤを用いた分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８１５０×４０ｍｍ１０ｕｍ、溶離液：ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．０５％アンモニア）４５％～７５％ｖ／ｖ）により更に精製して、標題化合物（７００ｍｇ、収率４６％）を無色油状物として得た。

化合物６２及び６３の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（４－（６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－５－メチルヘキシル）カルバメート
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－（４－（６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－５－メチルヘキシル）カルバメート

ｔｅｒｔ－ブチル（４－（６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４－トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－５－メチルヘキシル）カルバマート（化合物６１）（２００ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ）を、ＤＡＩＣＥＬＣＨＩＲＡＬＰＡＫＩＧ（カラム：２５０×３０ｍｍ１０ｕｍ、定組成溶離：ＥｔＯＨ（０．１％の２５％アンモニアを含有する）：超臨界ＣＯ_２、４０％：６０％（ｖ／ｖ））を用いたＳＦＣにより精製して、標題化合物（化合物６２）（８５ｍｇ、収率４２％）及び（化合物６３）（８０ｍｇ、収率４０％）をいずれも淡黄色油状物として得た。

化合物６４
（Ｒ）－２－（（５－（２－（６－アミノ－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド

ＤＣＭ（４ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（４－（６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－５－メチルヘキシル）カルバメート（化合物６２）（５５０ｍｇ、０．８７６ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ＴＦＡ（４ｍＬ）をゆっくり添加し、得られた混合物を２５℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、ｐＨ値をＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１６ｍＬ）を用いて約１２に調整した。水層をＤＣＭで抽出した（１００ｍＬ×２）。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、標題化合物（４６０ｍｇ、粗製）を黄色固体として得、これを更に精製することなく次工程で直接使用した。

化合物１１
（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド

ＤＭＦ（１ｍＬ）に、（Ｒ）－２－（（５－（２－（６－アミノ－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（化合物６４）（１２０ｍｇ、粗製）、１－ブロモ－２－メトキシエタン（３２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（２２２ｍｇ、０．６８１ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（１０２ｍｇ、０．６８０ｍｍｏｌ）を混合した混合物を、マイクロ波照射によって８０℃で１時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物をＨ_２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＨ_２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、減圧下に濃縮して粗生成物を得、それを更に、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＧｅｍｉｎｉ－ＮＸ（カラム：１５０×３０ｍｍ５μｍ、溶離液：ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（１０ｍＭＮＨ_４ＨＣＯ_３）５１％～７１％（ｖ／ｖ））を用いたＨＰＬＣにより精製し、更に、ＤＡＩＣＥＬＣＨＩＲＡＬＣＥＬＯＤ－Ｈ（カラム：２５０×３０ｍｍ５ｕｍ、溶出液：ＥｔＯＨ中の超臨界ＣＯ_２（０．１％ｖ／ｖアンモニア）２５／２５、ｖ／ｖ）を用いたＳＦＣにより精製して、標題化合物（５．１３ｍｇ、純度９６％）を黄色固体として得た。

ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）（方法１）：Ｒ_ｔ＝２．９９７分、ｍ／ｚ実測値５８６．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

化合物Ａ
（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド

無水ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に、（Ｒ－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（化合物１１）（４０．０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）、ホルムアルデヒド（５５．４ｍｇ、０．６８３ｍｏｌ、水中３７％）及びＡｃＯＨ（８．２ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を混合した混合物を、４５℃で１時間撹拌した。次いで、ＮａＢＨ_３ＣＮ（８．６ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、得られた混合物を４５℃で更に１時間撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（４０ｍＬ）で希釈して、ｐＨ値を約８に調整し、更にＤＣＭ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをＢｏｓｔｏｎＰｒｉｍｅ（カラム：Ｃ１８１５０×３０ｍｍ５ｕｍ、移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．０４％アンモニア＋１０ｍＭＮＨ_４ＨＣＯ_３）、移動相Ｂ：ＡＣＮ、流速：２５ｍＬ／分、５０％～８０％（５０％Ｂ～８０％Ｂ）の勾配条件Ｂ／Ａ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製して、標題化合物（９．６２ｍｇ、純度９９．１０％、収率２３．３％）を黄色油状物として得た。

実施例２－（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（化合物Ａ）の合成－調製方法Ｂ
中間体７の調製
４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）ブタン酸

ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）に、４－（メチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（３．０ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（７．７８ｍＬ、５８．６ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、Ｂｏｃ_２Ｏ（４．６９ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、冷却した０．１ＮＨＣｌ（７０ｍＬ×２）、Ｈ_２Ｏ（５０ｍＬ×２）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、標題中間体（１．８０ｇ、粗製）を無色油状物として得た。

中間体８の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（４－（メトキシ（メチル）アミノ）－４－オキソブチル）（メチル）カルバメート

ＣＨＣｌ_３（３０ｍＬ）に、４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）ブタン酸（中間体７）（１．８０ｇ、粗製）を溶解した溶液に、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（９６０ｍｇ、９．８４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．２４ｇ、９．１８ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（２．８０ｍＬ、２５．１ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＥＤＣＩ（２．２３ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、１ＮＨＣｌ（３０ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３０ｍＬ×３）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、標題中間体（１．７０ｇ、粗製）を無色油状物として得た。

中間体９の調製
ｔｅｒｔ－ブチルメチル（５－メチル－４－オキソヘキシル）カルバメート

Ｎ_２雰囲気下、－７０℃に冷却したＴＨＦ（５ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル（４－（メトキシ（メチル）アミノ）－４－オキソブチル）（メチル）カルバメート（中間体８）（２００ｍｇ、粗製）を溶解した溶液に、イソプロピルリチウム（ペンタン中３．２ｍＬ、２．２４ｍｍｏｌ、０．７Ｍ）を滴下した。得られた混合物を－７０℃で２時間撹拌した。混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１５ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をＦＣＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１０：１）により更に精製して、標題中間体（６０ｍｇ）を無色油状物として得た。

化合物６０の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（４－（６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－５－メチルヘキシル）（メチル）カルバメート

ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に、２－（（５－（２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（中間体３）（６００ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ－ブチルメチル（５－メチル－４－オキソヘキシル）カルバメート（中間体９）（３３０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を溶解した溶液にＺｎＣｌ_２（７８９ｍｇ、５．７９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を８０℃で２時間撹拌した。次いで、ＮａＢＨ_３ＣＮ（７２９ｍｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、混合物を減圧下で濃縮して粗残渣を得、これをＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（５０ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをＦＣＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１）により更に精製して、標題化合物（４００ｍｇ、収率４２％）が白色固体として得た。

化合物６７
Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（２－メチル－６－（メチルアミノ）ヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドヒドロクロリド

ＤＣＭ（１０ｍＬ）に、ｔｅｒｔ－ブチル（４－（６－（６－（２－（エチル（イソプロピル）カルバモイル）－４－フルオロフェノキシ）－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－５－メチルヘキシル）（メチル）カルバメート（化合物６０）（１ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ジオキサン中の４ＭＨＣｌ（５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮して、標題化合物（９６０ｍｇ、粗製、ＨＣｌ塩）を得、これを更に精製することなく次工程で直接使用した。

ＤＭＦ（５ｍＬ）に、Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（２－メチル－６－（メチルアミノ）ヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドヒドロクロリド（化合物６７）（４８０ｍｇ、粗製）、Ｋ_２ＣＯ_３（７００ｍｇ、５．０７ｍｍｏｌ）及びＮａＩ（４００ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）を混合した混合物に、１－ブロモ－２－メトキシエタン（２３０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を５０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物をＨ_２Ｏ（３０ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３０ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して粗残渣を得た。残渣をＦＣＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１）によって精製し、Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（化合物６８）（２５０ｍｇ、収率４８％）を黄色油状物として得た。

Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（化合物６８）（方法Ｂによって得られたいくつかのバッチから合わせて９６０ｍｇ）を、最初に、ＤＡＩＣＥＬＣＨＩＲＡＬＰＡＫＩＧ（カラム：２５０×３０ｍｍ１０ｕｍ、移動相：Ａ：超臨界ＣＯ_２、Ｂ：ＥｔＯＨ（０．１％アンモニア）、Ａ：Ｂ＝４０：６０、６０ｍＬ／分）を用いるＳＦＣにより精製し、更に、ＢｏｓｔｏｎＰｒｉｍｅ（カラム：１５０×３０ｍｍ５ｕｍ、移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ（１０ｍＭＮＨ_４ＨＣＯ_３）、移動相Ｂ：ＡＣＮ、流量：２５ｍＬ／分、勾配条件Ｂ／Ａ５５％～８５％）を用いる分取ＨＰＬＣにより精製して、標題化合物（２７０ｍｇ）を無色油状物として得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ_４）：δ＝８．４０（ｓ，１Ｈ），７．４７－７．３２（ｍ，１Ｈ），７．３０－７．１０（ｍ，２Ｈ），４．２４－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８９－３．６０（ｍ，３Ｈ），３．４８（ｂｒｓ，３Ｈ），２．６３－２．５１（ｍ，２Ｈ），２．４３－２．３２（ｍ，２Ｈ），２．２９－２．０７（ｍ，６Ｈ），１．８６－１．７２（ｍ，１Ｈ），１．６２－１．４４（ｍ，２Ｈ），１．３９－１．０２（ｍ，１０Ｈ），０．９９－０．６６（ｍ，９Ｈ）．いくつかのプロトンは溶媒ピークによって隠れており、記録されていない。

ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）（方法２）：Ｒ_ｔ＝１．９６５分、ｍ／ｚ実測値６００．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

ＳＦＣ（方法１１）：Ｒ_ｔ＝４．９０４分。

実施例３－（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（化合物Ａ）の合成－調製方法Ｃ
中間体２２７の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（１－（２，２－ジメチル－４，６－ジオキソ－１，３－ジオキサン－５－イル）－３－メチルブタン－２－イル）カルバメート

－１０～０℃で予備冷却したＤＣＭ（６０７ｋｇ）中のＢｏｃ－Ｌ－バリン（４４．９ｋｇ）、２，２－ジメチル－１，３－ジオキサン－４，６－ジオン（３２．９ｋｇ）及びＤＭＡＰ（３５．５ｋｇ）を、ＤＣＭ（６１３ｋｇ）にＤＣＣ（５５．５ｋｇ）を溶解した溶液に３時間にわたって添加し、－１０～０℃で１６時間エージンした。温度を１０℃未満に維持しながら、１０％クエン酸水溶液（４４９ｋｇ）を添加した。得られたスラリーを０から１０℃で２時間エージングし、次いで濾過した。濾過ケーキをＤＣＭ（９１ｋｇ）で洗浄した。濾液を分離し、有機層を１０％クエン酸水溶液（４５０ｋｇで２回）及び１０％ＮａＣｌ水溶液（４４９ｋｇ）で洗浄した。有機相（１２００ｋｇ）に、温度を－１０～０℃に維持しながら酢酸（７５．０ｋｇ）を添加した。水素化ホウ素ナトリウム（１８．０ｋｇ）を、温度を－１０℃～０℃の範囲に維持しながら５時間にわたって小分けにして添加し、次いで、得られた混合物を－１０℃～０℃で更に１６時間エージングした。混合物を１５～２５℃に加温し、２時間エージングした。次いで、混合物を１４％ＮａＣｌ水溶液（４５０ｋｇ）で洗浄し、続いて１４％ＮａＣｌ水溶液（４３２ｋｇ）で２回目の洗浄を行い、最後に水で洗浄した（４４４ｋｇ）。有機相を減圧下で２～４体積まで濃縮した。イソ－プロパノール（１４３ｋｇ）を残渣に添加し、減圧下で４～５体積まで濃縮した。－１０～０℃に冷却し、８時間エージングした後、得られたスラリーを濾過し、ＩＰＡ（３８ｋｇ）で洗浄し、乾燥させて、標題中間体（４６．７ｋｇ、収率６９％）を白色固体として得た。

中間体２２８の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－２－イソプロピル－５－オキソピロリジン－１－カルボキシレート

トルエン（３３３ｋｇ）中のｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（１－（２，２－ジメチル－４，６－ジオキソ－１，３－ジオキサン－５－イル）－３－メチルブタン－２－イル）カルバメート（中間体２２７）（４６．７ｋｇ）を加熱還流し、４時間エージングした。混合物を周囲温度に冷却し、濾過し、トルエン（２０ｋｇ）で洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮乾固して、所望の化合物（３１．０５ｋｇ、収率９６％）を油状物として得、これを更に精製することなく直接使用した。

中間体２２９の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（５Ｒ）－２－ヒドロキシ－５－イソプロピルピロリジン－１－カルボキシレート

２－ＭｅＴＨＦ（２６．７ｋｇ）中のｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－２－イソプロピル－５－オキソピロリジン－１－カルボキシレート（中間体２２８）（３０．９ｋｇ）を－５～５℃に冷却した。ＬｉＢＨ_４の２－ＭｅＴＨＦ溶液（１Ｍ，４５．２ｋｇ，５４．４ｍｏｌ）を３時間にわたって添加し、混合物を４時間エージングした。５％ＮａＨＣＯ_３の冷水溶液（１６３ｋｇ）を－５～５℃で３時間にわたって添加し、更に２時間エージングした。混合物を周囲温度に加温し、更に２時間エージングした。水層を分離し、有機層を１０％ＮａＣｌ水溶液（１７０ｋｇ）及び水（１５５ｋｇ）で洗浄した。水洗浄中に、エマルジョンが形成され、分離させるために固体ＮａＣｌ（３．１ｋｇ）を添加した。水層を除去した後、有機層を減圧下で濃縮乾固して、所望の化合物（２８．５ｋｇ、収率９１％）を油状物として得、これを更に精製することなく直接使用した。

中間体２３０の調製
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）カルバメート

ＤＣＭ（３４４ｋｇ）中のｔｅｒｔ－ブチル（５Ｒ）－２－ヒドロキシ－５－イソプロピルピロリジン－１－カルボキシレート（中間体２２９）（２８．５５ｋｇ）を１５～２５℃で２－メトキシ－Ｎ－メチルエタン－１－アミン（１２．３ｋｇ、１３８．０ｍｏｌ）で処理し、得られた混合物を１時間エージングした。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（４０．１２ｋｇ）を、温度を１５～２５℃の間に維持しながら５時間にわたって小分けにして添加し、得られた混合物を４８時間エージングした。温度を１５～２５℃の間に維持しながら、８％ＮａＯＨ水溶液（１８４ｋｇ）を２時間にわたって添加することによって反応混合物をクエンチし、混合物を更に２時間エージングした。水層を分離し、有機層を水（１６９ｋｇ）で洗浄した。次いで、有機層を減圧下で濃縮乾固して、標題中間体（３３．２６ｋｇ、収率８８％）を油状物として得、これを更に精製することなく直接使用した。

中間体２３１の調製
（Ｒ）－Ｎ^１－（２－メトキシエチル）－Ｎ^１，５－ジメチルヘキサン－１，４－ジアミン、二塩酸塩

イソプロパノール（８４．８０ｋｇ）にＨＣｌを溶解した４モル溶液に、イソプロパノール（２５．６ｋｇ）にｔｅｒｔ－ブチル（Ｒ）－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）カルバメート（中間体２３０）（３２．３８ｋｇ）を溶解した溶液を周囲温度で３時間にわたって添加し、混合物を周囲温度で更に１９時間エージングした。次いで、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（９５．２５ｋｇ）を１時間にわたって添加し、混合物を２．５時間エージングした。得られたスラリーを濾過し、ＭＴＢＥ（５３ｋｇ）で洗浄した。濾過ケーキを乾燥させて、標題化合物（２３．９２ｋｇ、収率８１％）を白色固体として得た。

中間体２３２の調製
エチル１－ベンジル－３－（クロロメチル）ピロリジン－３－カルボキシレート

－３５～－２５℃に冷却したＴＨＦ（６Ｌ）にＤＩＰＥＡ（９５２ｇ、１．１当量）を溶解した溶液に、－２５℃未満に温度を維持しながらｎ－ＢｕＬｉ（２．３３ｋｇ、ヘキサン中２．５Ｍ、１．０当量）を添加した。得られた混合物を－３５～－２５℃で更に３０分間エージングし、次いで－７８～－６０℃に冷却した。ＴＨＦ（２Ｌ）にエチル１－ベンジルピロリジン－３－カルボキシレート（２ｋｇ、１．０当量）を溶解した溶液を－７８～－６０℃で添加し、更に３０分間撹拌した。次いで、クロロヨードメタン（１．８１ｋｇ、１．２当量）を－７８～－６０℃で投入した。反応混合物を－６０～－４０℃で２時間エージングした。反応混合物を０～１０℃の温度でクエン酸水溶液（６ＬＨ_２Ｏ中６６０ｇ）に添加し、得られた混合物を２０～３０℃で更に２０分間エージングした。層を分離した後、水層をＥｔＯＡｃ（６Ｌ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（６Ｌ）で洗浄し、次いで５０～６０℃に加温した。シュウ酸（２．２２ｋｇ）を５０～６０℃で投入した。得られた混合物を５０～６０℃で３時間撹拌し、次いで、２０～３０℃に冷却し、一晩エージングした。得られた固体を濾過し、ケーキを酢酸エチル（２Ｌ）で洗浄した。ウェットケーキをトルエン（４Ｌ）、Ｈ_２Ｏ（８Ｌ）及びＫ_３ＰＯ_４（１．５当量）に添加し、得られた混合物を２０～３０℃で２０分間エージングした。層を分離した後、水層をトルエン（２Ｌ）で抽出した。有機層を合わせ、水（２Ｌ）で２回洗浄した。有機相を減圧下で濃縮して、４．２ｋｇの所望の化合物をトルエン溶液として得た（アッセイにより４６重量％、アッセイ収率８０％）。

中間体２３３の調製
１－ベンジル－３－（クロロメチル）ピロリジン－３－カルバルデヒド

流動化学システムで反応を行った。すなわち、トルエン（２６Ｌ）にエチル１－ベンジル－３－（クロロメチル）ピロリジン－３－カルボキシレート（中間体２３２）（４．４ｋｇ）を溶解した溶液を２６．７ｍＬ／分で圧送し、－６０℃に冷却した。冷却後、次いで、これをトルエンにＤＩＢＡＬ－Ｈ（２８．１ｍｏｌ）を溶解した冷却溶液と－６０℃（２８Ｌ）で３２．１ｍＬ／分のポンプ流量で混合した。混合物を－６０℃でパーフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）コイル管反応器に通した（合計流量５８．８ｍＬ／分、滞留時間５秒）。得られた混合物を冷却したＭｅＯＨ（－６０℃）と混合し、これを１５．２ｍＬ／分の速度で圧送した。この混合溶液を別のＰＦＡコイルチューブリアクタに－６０℃で圧送した（合計流速７４ｍＬ／分、滞留時間５秒）。得られた混合物を、２０重量％のロッシェル塩水溶液（２０Ｖ）が入ったレシーバーに回収した。層を分離し、有機相を水で２回洗浄した（２×４４Ｌ）。有機相を、同様の方法で調製した別の３．０ｋｇのバッチと合わせ、減圧下で濃縮して、２０．８ｋｇの所望の化合物のトルエン溶液を得（ＨＰＬＣによるアッセイで２５．５重量％、アッセイ収率８５％が得られた）、これを更に精製することなく直接使用した。

^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）：δ ９．６２（ｓ，１Ｈ），７．３９－７．２０（ｍ，５Ｈ），３．８３－３．５７（ｍ，４Ｈ），２．９６（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），２．８０－２．５５（ｍ，３Ｈ），２．１７（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．９，７．９，６．１Ｈｚ，１Ｈ），１．８３（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．４，７．８，５．５Ｈｚ，１Ｈ）。

中間体２３４の調製
（Ｒ）－４－（６－ベンジル－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－Ｎ－（２－メトキシエチル）－Ｎ，５－ジメチルヘキサン－１－アミン

トルエン（３０Ｌ）及び（Ｒ）－Ｎ^１－（２－メトキシエチル）－Ｎ^１，５－ジメチルヘキサン－１，４－ジアミン、二塩酸塩（中間体２３１）（３．４７ｋｇ）で希釈した、トルエン（３．０ｋｇ、１０重量％）に１－ベンジル－３－（クロロメチル）ピロリジン－３－カルバルデヒド（中間体２３３）を溶解した溶液に、トリエチルアミン（２．５５ｋｇ、２５．２ｍｏｌ）を２０～３０℃で添加した。得られた混合物を２０～３０℃で２時間エージングした。次いで、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（９．０ｋｇ）を２０～３０℃で投入し、混合物を１２時間エージングした。反応混合物を５～１５℃に冷却し、温度を３５℃未満に維持しながら２５重量％ＮａＯＨ水溶液（２５Ｌ、約１６．７５当量）を添加した。得られた混合物を２０～３０℃で２５分間エージングし、層を分離した。有機層を１５重量％のＮａＣｌ水溶液（１０Ｌ）で洗浄し、層を再度分離し、水（１８Ｌ）を有機相に投入した。水相のｐＨを、４ＭＨＣｌ水溶液を用いて、内部温度を３５℃未満に維持しながら、６～７に調整した。次いで、有機相を廃棄し、水相を分離し、Ｋ_２ＨＰＯ_４でｐＨ８～９に塩基性化した。

得られた混合物を５０～５５℃に加温し、３時間エージングした。次いで、反応混合物を周囲温度に冷却し、他の２つのバッチ（２．４ｋｇ＋３．０ｋｇ）と合わせた。合わせた流れをメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで３回洗浄した（３×４０Ｌ）。得られた水層に更なるメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（８３Ｌ）を添加し、水相を８重量％のＮａＯＨ水溶液を用いて、１５～３５℃の温度を維持しながら、ｐＨ９～１０に塩基性化した。水層を分離し、有機層を水で３回洗浄した（３×３０Ｌ）。次いで、有機層を減圧下で約３体積まで濃縮し、次いで、メタノールで３回フラッシングし（３×３０Ｌ）、濃縮乾固して、所望の中間体（１２．４ｋｇ、単離収率９０％）を淡黄色油状物として得、これを更に精製することなく直接使用した。

中間体２３４ａ（中間体２３４のクエン酸塩）の調製

ＥｔＯＨ（８０ｍＬ）及び中間体２３４（２０ｇ）を丸底フラスコに添加した。次に、ＥｔＯＨにクエン酸を溶解した０．５Ｍ溶液（１００ｍＬ、１当量）を丸底フラスコ中の混合物に室温で添加した。その後、混合物を乾燥するまで蒸発させた（ロータリーエバポレーター、４０℃）。アセトニトリル（２００ｍＬ）を残渣に添加し、混合物を乾燥するまで蒸発させた（ロータリーエバポレーター、４０℃）。アセトニトリル（１００ｍＬ）を残渣に添加し、室温で磁気加熱プレートを用いて一晩撹拌した。最後に、中間体２３４ａを濾別し、室温で乾燥させた。

中間体２３４（中間体２３４ｂ）のクエン酸塩の結晶形態の調製

中間体２３４ａ（３．７２ｇ）を室温でアセトニトリル（２０ｍＬ）に添加し、混合物を撹拌した。反応混合物が均一になるまで、混合物を６０℃に加熱した（約１０分）。次に、混合物を０．５℃／分の速度で５０℃まで冷却した。次に、シードを添加し（１９ｍｇの中間体２３４ａ、０．５ｗ／ｗ％）、混合物を撹拌しながら３時間３０分間エージングした。次に、混合物を８時間かけて２０℃まで指数２、３で非線形に冷却した。得られた混合物を一晩撹拌し、生成物を濾別し、乾燥させた（フード内で室温で一晩）。

単離後、中間体２３４ｂ（２．７５ｇ；収率７３．９％）を中間体２３４のクエン酸塩の結晶形態として得た。得られた中間体／クエン酸の比は３／２（ＮＭＲ）である。

上記の非線形冷却は、以下の式に従って行われた。

規定の冷却期間中、３０秒毎に新しい線形ランプが開始される。ランプは、以下の式に従って計算される。

Ｔ_ｓｅｔ：各新規ランプの設定値
Ｔ_{ｓｔａｒｔｖａｌｕｅ}：冷却軌跡開始時の混合物温度の測定値
Ｔ_{ｅｎｄｖａｌｕｅ}：冷却軌跡の終了規定値
ｔ_{ａｃｔｉｏｎ}：冷却開始からの実時間
Ｄｕｒａｔｉｏｎ：定義された冷却持続時間
ｎ：指数

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ－ｄ_４）δ ｐｐｍ０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ）０．９８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ）１．４６－１．５７（２Ｈ，ｍ）１．６７－１．８７（２Ｈ，ｍ）１．９４－２．０３（１Ｈ，ｍ）２．２０－２．２９（２Ｈ，ｍ）２．６２－２．６９（２Ｈ，ｍ）２．７２－２．７７（４Ｈ，ｍ）２．７７－２．８２（２Ｈ，ｍ）２．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ）２．９５－３．０２（２Ｈ，ｍ）３．０７－３．１６（２Ｈ，ｍ）３．１６－３．２２（２Ｈ，ｍ）３．３７（３Ｈ，ｓ）３．６８－３．７２（２Ｈ，ｍ）３．８３－３．８９（２Ｈ，ｍ）３．９０－３．９２（２Ｈ，ｍ）３．９４－４．０６（２Ｈ，ｍ）７．３２－７．４３（５Ｈ，ｍ）。

中間体２２４の調製
（Ｒ）－Ｎ－（２－メトキシエチル）－Ｎ，５－ジメチル－４－（２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）ヘキサン－１－アミン

－５～５℃に冷却したＥｔＯＨ（１．４７ｋｇ）中の水酸化パラジウム炭素（１．２ｋｇ）に、メタンスルホン酸（ＭＳＡ）（１１ｋｇ）、（Ｒ）－４－（６－ベンジル－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル－Ｎ－（２－メトキシエチル）－Ｎ，５－ジメチルヘキサン－１－アミン（中間体２３４）（１０ｋｇ）及びＥｔＯＨ（２５０Ｌ）を添加した。混合物を３５～４５℃に加温し、水素雰囲気（０．２７～０．４０ＭＰａ）下で１６～２０時間撹拌した。混合物を珪藻土（２０ｋｇ）で濾過し、パッドをＥｔＯＨ（２４Ｌ）で洗浄した。濾液を減圧下（４０℃未満）で２～３体積まで濃縮し、次いで、２－ＭｅＴＨＦ（７３ｋｇ及び４７ｋｇ）で２回フラッシングして、２～３体積の溶液を得た。２－ＭｅＴＨＦ（６５ｋｇ）で希釈した後、１０％硫酸ナトリウム水溶液（３０ｋｇ）を添加し、混合物を０～１０℃に冷却し、続いて１６％ＮａＯＨ水溶液（５０ｋｇ）を添加してｐＨを１３～１４に調整した。温度を１５～２５℃に調整し、３０～６０分間撹拌した。水層を分離し、２－ＭｅＴＨＦ（４７ｋｇ×２）で２回抽出した。合わせた有機層を減圧下（４０℃未満）で３～４体積に濃縮し、２－ＭｅＴＨＦ（９５０ｇ）を添加した。減圧下（４０℃未満）で３～４体積に濃縮した後、得られた溶液を２－ＭｅＴＨＦ（３０ｋｇ）で希釈し、４Ａモレキュラーシーブ（２５ｋｇ）に通して乾燥させ、２－ＭｅＴＨＦ（３０ｋｇ）で洗浄した。最終溶液を濃縮して、７９％補正収率で９０．１％のアッセイ純度を有する油状体として所望の化合物（６．７ｋｇ）が得られた。

中間体２２５の調製
（Ｒ）－４－（６－（３，６－ジクロロ－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－Ｎ－（２－メトキシエチル）－Ｎ，５－ジメチルヘキサン－１－アミン

（Ｒ）－Ｎ－（２－メトキシエチル）－Ｎ，５－ジメチル－４－（２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）ヘキサン－１－アミン（中間体２２４）（１００ｇ）に、２－ＭｅＴＨＦ（４３０ｇ）及びＴＥＡ（６８ｇ）を添加し、混合物を－５０～－４０℃に冷却した。２－ＭｅＴＨＦ（１７２ｇ）中の３，５，６－トリクロロ－１，２，４－トリアジン（６２ｇ）を添加し、混合物を１～３時間撹拌した。得られた混合物を－２０～－１０℃に加温し、７％ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加し、混合物を２０～３０℃に加温し、３０～６０分間撹拌した。水層を除去し、有機層を１０％Ｎａ_２ＳＯ_４（５００ｇ）で洗浄した。有機層を４Åモレキュラーシーブ（２２０ｇ）に通して乾燥させ、２－ＭｅＴＨＦ（１８０ｇ）で洗浄した。標題中間体を、アッセイ収率９０％で、２－１４．８重量％のＭｅＴＨＦの溶液として得た。

化合物３９３
（Ｒ）－２－（（３－クロロ－５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－ベンズアミド
化合物３９３の合成方法Ａ

無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）に、Ｎ－エチル－５－フルオロ－２－ヒドロキシ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（中間体２８）（１．１０ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）、（Ｒ）－４－（６－（３，６－ジクロロ－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－Ｎ－（２－メトキシエチル）－Ｎ，５－ジメチルヘキサン－１－アミン（中間体２２５）（１．７０ｇ、３．８２ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（７５０ｍｇ、４．９３ｍｍｏｌ）を混合した混合物を４０℃で８時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をＤＣＭ（６０ｍＬ）で希釈し、Ｈ_２Ｏ（２０ｍＬ×３）で洗浄した。×有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これを精製ＦＣＣ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝０％～１０％）により精製して黄色油状物（１．４０ｇ）を得、これを更に、ＤＡＩＣＥＬＣＨＩＲＡＬＰＡＫＡＤ（カラム：２５０×５０ｍｍ、１０μｍ×移動相：Ａ：超臨界ＣＯ_２、Ｂ：ＥｔＯＨ（０．１％アンモニア）、７０ｍＬ／分でＡ：Ｂ＝５０：５０；カラム温度：３８℃；ノズル圧力：１００バール；ノズル温度：６０℃；蒸発器温度：２０℃；トリマー温度：２５℃；波長：２２０ｎｍ）を用いるＳＦＣにより分離して、標題化合物（１．０ｇ）を得た。

化合物３９３の合成方法Ａ

２０～３０℃の２－ＭｅＴＨＦ（４０ｇ）に、（Ｒ）－４－（６－（３，６－ジクロロ－１，２，４トリアジン－５－イル）－２，６－ジアゾスピロ［３．４］オクタン－２－イル）－Ｎ－（２－メトキシエチル）－Ｎ，５－ジメチルヘキサン－１－アミン（中間体２２５）（２－１４．８重量％のＭｅＴＨＦ溶液６７６ｇ、中間体２２５について補正すると１００ｇ）及びＮ－エチル－５－フルオロ－２－ヒドロキシ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（中間体２８）（５０．６ｇ）を溶解した２－ＭｅＴＨＦ溶液に、テトラメチルグアニジン（３１ｇ）を添加し、混合物を４０～４８時間撹拌した。７％ＮａＨＣＯ_３水溶液（５００ｇ）を添加し、混合物を３０～６０分間撹拌した。水層を除去し、有機層を４％ＮａＯＨ水溶液（２×５００ｇ）で２回洗浄し、１０％Ｎａ_２ＳＯ_４水溶液（５００ｇ）で１回洗浄した。有機層を減圧下（４０℃未満）で２．２～３．０体積まで濃縮し、２－ＭｅＴＨＦ及び含水量の両方が１．０％未満になるまでＭｅＯＨ（１×７９０ｇ及び２×３９５ｇ）で３回フラッシングして、６０．１重量％のメタノール溶液として８６％のアッセイ収率で所望の化合物を得た。

（Ｒ）－２－（（３－クロロ－５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピルベンズアミド（化合物３９３）（６０．１重量％のＭｅＯＨ溶液１６３．９３ｇ、化合物３９３について補正すると１００ｇ）、パラジウム炭素（１０ｇ）及びＭｅＯＨ（３１６ｇ）のメタノール溶液を、水素雰囲気（０．２０から０．３０ＭＰａ）下、２０～３０℃で１８時間撹拌した。混合物を珪藻土（７５ｇ）で濾過し、ケーキをＭｅＯＨ（１５８ｇ）で洗浄した。濾液を減圧下（４０℃未満）で約３体積に濃縮し、次いで、酢酸イソプロピル（ＩＰＡｃ、８７０ｇ）でフラッシュして約３体積に濃縮した。次いで、混合物をＩＰＡｃ（６９６ｇ）で希釈し、２０％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液を添加した（５００ｇ）。混合物を３０～６０分間撹拌した。水層を除去した。有機層を水（５００ｇ）で洗浄し、次いで、４５℃未満の減圧下で約３体積に濃縮した。４８．１重量％のＩＰＡｃ溶液として、約９０％のアッセイ収率で標題中間体を得た。

実施例４－（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドオキサレート（化合物Ａ３）の合成

化合物Ａ３
２０ｍＬのＡＣＮ（２０ｍＬ）に（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミド（化合物Ａ）（２７０ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、シュウ酸（８１．０ｍｇ、０．９００ｍｍｏｌ）を添加した。添加後、反応混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を濃縮し、残渣をＡＣＮ及び脱イオン水に再溶解し、凍結乾燥させて、標題化合物（３５０ｍｇ）を白色固体として得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ_４）：δ＝８．４８（ｓ，１Ｈ），７．５２－７．１１（ｍ，３Ｈ），４．５４－３．６４（ｍ，１２Ｈ），３．４０－３．３４（ｍ，５Ｈ），３．２３－３．１３（ｍ，２Ｈ），２．９０（ｓ，３Ｈ），２．５４－２．２７（ｍ，２Ｈ），２．１９－２．０３（ｍ，１Ｈ），１．９７－１．７７（ｍ，２Ｈ），１．７５－１．５０（ｍ，２Ｈ），１．３５－０．６５（ｍ，１７Ｈ）。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝８．５１（ｓ，１Ｈ），７．５１－７．２９（ｍ，３Ｈ），４．２９－３．３４（ｍ，１２Ｈ），３．２３－２．８４（ｍ，７Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），２．３５－２．０９（ｍ，２Ｈ），２．０５－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．８１－１．５８（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．３３（ｍ，２Ｈ），１．１８－０．６０（ｍ，１７Ｈ）。

ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）（方法２）：Ｒ_ｔ＝１．９６９分、ｍ／ｚ実測値６００．４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

実施例５－化合物Ａ１の合成

ＩＰＡｃ（３６０ｇ）に化合物Ａ（ＩＰＡｃ中４８重量％溶液２０７．９０ｇ、活性化合物Ａ１００ｇ）を溶解した溶液に、ＥｔＯＨ（６３ｇ）を２０℃～２５℃で添加した。次いで、溶液をＥｔＯＨ（４９．５ｇ）中の濃ＨＣｌ（３２．９ｇ）で約１５分間にわたって処理した。混合物に結晶性化合物Ａ１のシード（２ｇ、２％シード負荷）を播種し、次いで、１８時間エージングした。ＩＰＡｃ（８７０ｇ）を２０～２５℃で４時間にわたってゆっくり添加し、スラリーを更に１８時間撹拌した。約５℃に冷却した後、生成物を濾過し、ＩＰＡｃ（５２２ｇ）で洗浄し、２０～３０℃で真空下で乾燥させて、弱結晶性化合物Ａ１を白色固体として得た（収率９１．０％、１１５．４ｇ）。（注：反応に使用した少量のシード材料は、小規模の類似の反応プロトコルを介して得た）

再結晶：弱結晶性化合物Ａ１（１００ｇ）、ＥｔＯＨ（１６６ｇ）、精製水（２１．５ｇ）及びＩＰＡｃ（１７８ｇ）の溶液を２０～３０℃で０．５から２時間撹拌して、透明な溶液を得た。追加のＩＰＡｃ（５２２ｇ）を１～２時間にわたって滴下し、次いで、混合物に結晶性化合物Ａ１のシード（２ｇ、２％シード負荷）を播種した。次いで、混合物を１８～２０時間エージングし、ＩＰＡｃ（３４８ｇ）を２０～３０℃で１２時間にわたってゆっくり添加し、スラリーを更に５５～６０時間撹拌した。生成物を濾過し、ＩＰＡｃ（１５８ｇ）で洗浄し、２０～３０℃で真空中で乾燥させて、化合物Ａ１を白色固体（収率８５％、正味８５．０ｇ）として得た。

^１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６，４００ＭＨｚ）：δ＝１１．６０（１Ｈ，ｂｒｓ），１０．８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．５２（１Ｈ，ｓ），７．３６（３Ｈ，ｍ），３．９７－４．２０（７Ｈ，ｍ），３．６４－３．７１（４Ｈ，ｍ），３．４７（７Ｈ，ｍ），３．２５（２Ｈ，ｍ），３．０５（３Ｈ，ｍ），２．７３（３Ｈ，ｓ），２．１０－２．４５（１Ｈ，ｍ），１．９９（１Ｈ，ｍ），１．７８（２Ｈ，ｍ），１．５５（２Ｈ，ｍ），０．８３－１．１２（１２Ｈ，ｍ），０．７０（２Ｈ，ｍ）。

ＬＣＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝０．６６９分、ｍ／ｚ実測値６００．５［Ｍ＋Ｈ］^＋。

実施例６－（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物（化合物Ａ４）の結晶形態Ａの合成（水当量は求めず）

４３．０６ｇのベンゼンスルホン酸（遊離塩基化合物Ａに対して２当量）をアセトン／水９５／５ｖ／ｖ混合物８４０ｍＬに添加し、溶解した。ＩＰＡｃに化合物Ａ（８０ｇのＡＰＩを含有する）を溶解した溶液１９２．８ｇを添加した。材料が溶解し、透明な溶液が得られた。更にＩＰＡｃ８０ｍＬを添加し、温度を２５℃に調整した。２％のシードを添加し、混合物を２５℃で１時間撹拌した。次いで、２８．８Ｖ（２３１２ｍＬ）のＩＰＡｃを８時間かけて添加した。その後、懸濁液を２５℃で１８時間撹拌した。懸濁液を濾過し、アセトン／水／ＩＰＡｃ２３．７５／１．７５／７５ｖ／ｖ／ｖの混合物３２０ｍＬで洗浄した。１２２．９１ｇの結晶形態Ａビスーベシラート水和物（水当量は求めず）を得た。

当業者は、上記の反応で使用される少量の初期シード材料が、小規模の同様の反応プロトコルを介して、シードを添加することなく、自発的な核形成を待つことによって得られることを理解するであろう。

塩スクリーニング実験中に、ベシル酸塩の最初のシードも得た。これらの実験では、１００ｍｇの遊離塩基を２ｍＬバイアルに量り入れ、次いで２００μＬの酢酸エチル又はアセトンを添加して遊離塩基を溶解した。１当量の対イオン（ベンゼンスルホン酸）を試料に添加し、試料を２５℃で３日間撹拌した。得られた懸濁液を遠心分離し、初期シードを得た。

適切な量の結晶形態Ａの（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物を重水素化ＤＭＳＯに溶解し、１Ｄ ^１ＨＮＭＲスペクトルを記録した。

Ｂｒｕｋｅｒ５ｍｍＰＡＢＢＯ６００Ｓ３ＢＢ－Ｈ－Ｄ－０５Ｚ－ＧＲＤ高分解能プローブを備え、ＴＯＰＳＰＩＮ４．０ソフトウェアを実行するＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥＮＥＯ－６００ＭＨｚＮＭＲ分光計を使用して、重水素化ＤＭＳＯ中の試料上の３００Ｋでの一次元プロトン実験を収集した。

^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ ｐｐｍ０．６９（ｂｒｓ，２Ｈ）０．８２－０．９８（ｍ，９Ｈ）１．０７（ｂｒｓ，４Ｈ）１．３１－１．４６（ｍ，１Ｈ）１．５１（ｂｒｄ，Ｊ＝２．９１Ｈｚ，１Ｈ）１．６９（ｂｒｄ，Ｊ＝３．４５Ｈｚ，２Ｈ）１．９８（ｂｒｓ，１Ｈ）２．０６－２．４５（ｍ，２Ｈ）２．７７（ｂｒｓ，３Ｈ）２．８７－３．１９（ｍ，３Ｈ）３．２４（ｂｒｓ，１Ｈ）３．３１（ｓ，６Ｈ）３．６４（ｂｒｓ，４Ｈ）３．７１－４．５９（ｍ，７Ｈ）７．２４－７．５４（ｍ，９Ｈ）７．６１（ｂｒｄ，Ｊ＝７．２７Ｈｚ，４Ｈ）８．４５－８．６０（ｍ，１Ｈ）９．２４（ｂｒｓ，１Ｈ）９．４４－９．８２（ｍ，１Ｈ）。

実施例７－（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物（化合物Ａ４）の結晶形態Ａの代替合成（水当量は求めず）
９５／５のイソプロパノール／水の混合物（２４ｍＬ）をフラスコに投入し、４０℃に加熱した。ベンゼンスルホン酸（４．３１ｇ、９８％）を添加した。続いて、ＩＰＡｃ中の１９．３ｇの化合物Ａの溶液（８ｇの化合物Ａを含有する）を添加した。更に、ＩＰＡｃを１６ｍＬを添加した。２％のシードを添加し、混合物を４０℃で１時間撹拌した。次いで、ＩＰＡｃ（１１５．２ｍＬ）を８時間かけて滴下した。次に、混合物を０℃に１５時間にわたって冷却した。懸濁液を濾過し、ウェットケーキを（ＩＰＡ／Ｈ_２Ｏ９５／５）／ＩＰＡｃ１／６（３２ｍＬ）で洗浄した。ウェットケーキを２５℃で１６時間乾燥させ、結晶形態Ａビスーベシラート水和物１１．４４ｇを得た（水当量は求めず）。

実施例において、化合物Ａ４は請求項１に包含される化合物である。実施例における他の化合物は例示目的のためのものである。いくつかの中間体（例えば、中間体２３４ｂ）は、特許請求されている中間体である。

上記の実験パートで使用した分析方法
上記の化合物の分析情報は、以下に記載する分析方法を使用することによって生成された。

ＮＭＲ法
いくつかのＮＭＲ実験は、ＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅＩＩＩ４００分光計を使用して周囲温度（２９８．６Ｋ）で、内部重水素ロックを使用し、ｚ勾配を有するＢＢＯ４００ＭＨｚＳ１５ｍｍプローブヘッドを装備し、プロトンについては４００ＭＨｚ、炭素については１００ＭＨｚで動作して実施した。化学シフト（δ）は、パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告される。Ｊ値は、Ｈｚで表される。

いくつかのＮＭＲ実験は、周囲温度（２９８．６Ｋ）でＶａｒｉａｎ４００－ＭＲ分光計を使用し、内部重水素ロックを使用し、ｚ勾配を有するＶａｒｉａｎ４００４ＮＵＣＰＦＧプローブヘッドを装備し、プロトンについては４００ＭＨｚ、炭素については１００ＭＨｚで動作して実施した。化学シフト（δ）は、パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告される。Ｊ値は、Ｈｚで表される。

いくつかのＮＭＲ実験は、Ｖａｒｉａｎ４００－ＶＮＭＲＳ分光計を使用して周囲温度（２９８．６Ｋ）で、内部重水素ロックを使用し、ｚ勾配を有するＶａｒｉａｎ４００ＡＳＷＰＦＧプローブヘッドを装備し、プロトンについては４００ＭＨｚ、炭素については１００ＭＨｚで動作して実施した。化学シフト（δ）は、パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告される。Ｊ値は、Ｈｚで表される。

いくつかのＮＭＲ実験は、ＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ３００分光計を周囲温度（２９８．６Ｋ）で使用し、内部重水素ロックを使用し、ｚ勾配を有するＰＡＢＢＯ３００Ｓ１ＢＢＦ－Ｈ－Ｄ－０５Ｚ５ｍｍプローブヘッドを装備し、プロトンについては３００ＭＨｚ、炭素については７５ＭＨｚで動作して実施した。化学シフト（ｄ）は百万分率（ｐｐｍ）で報告されている。Ｊ値は、Ｈｚで表される。

ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィ／質量分析）
一般的な手順
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）測定は、それぞれの方法で指定されたＬＣポンプ、ダイオードアレイ（diode-array、ＤＡＤ）又はＵＶ検出器及びカラムを使用して実行した。必要に応じて、追加の検出器を含めた（以下の表２を参照されたい）。

カラムからの流れは、大気圧イオン源で構成された質量分析計（Mass Spectrometer、ＭＳ）にもたらされた。化合物の公称モノアイソトピック分子量（ＭＷ）の同定を可能にするイオンを得るために、調整パラメータ（例えば、走査範囲、滞留時間など）を設定することは、当業者の知識の範囲内である。適切なソフトウェアでデータ収集を実行した。

化合物は、それらの実験的保持時間（Ｒ_ｔ）及びイオンによって記載される。データの表において別様に指定されない場合、報告された分子イオンは、［Ｍ＋Ｈ］^＋（プロトン化分子）及び／又は［Ｍ－Ｈ］^－（脱プロトン化分子）に相当する。化合物が直接イオン化不可能であった場合、付加物の種類は、特定される（すなわち、［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋、［Ｍ＋ＨＣＯＯ］^－、など）。複数の同位体パターン（Ｂｒ、Ｃｌ）を有する分子については、報告された値は、最も低い同位体質量に関して得られたものである。全ての結果は、使用される方法と一般的に関連する実験的不確定性を伴って得られた。

以下、「ＳＱＤ」はシングル四重極検出器を、「ＲＴ」は室温を、「ＢＥＨ」は架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッドを、「ＨＳＳ」は高強度シリカを、「ＤＡＤ」はダイオードアレイ検出器を意味する。

分析ＳＦＣ
ＳＦＣ法の一般的手順
二酸化炭素（ＣＯ_２）を送達するためのバイナリポンプ及び改質剤によって構成される分析超臨界流体クロマトグラフィ（ＳＦＣ）システム、オートサンプラー、カラムオーブン、最大４００バールに耐える高圧フローセルを備えたダイオードアレイ検出器を使用してＳＦＣ測定を実行した。分析ＳＦＣの詳細を以下の表３に示す。質量分析計（ＭＳ）と構成された場合、カラムからの流れは（ＭＳ）にもたらされた。化合物の公称モノアイソトピック分子量（ＭＷ）の同定を可能にするイオンを得るために、調整パラメータ（例えば、走査範囲、滞留時間など）を設定することは、当業者の知識の範囲内である。適切なソフトウェアでデータ収集を実行した。

結晶形態中間体２３４ｂ
結晶形態の中間体２３４ｂは、Ｘ線粉末回折パターンによって特徴付けることができる。

ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌＡｅｒｉｓ回折計でＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析を行った。この装置は、入射ビーム及び回折ビームにそれぞれｉＣｏｒｅ及びｄＣｏｒｅ可変光学系を使用するＣｕ－ＫαＸ線管を備えている。化合物を、バックローディング技術を使用して１６ｍｍのサンプルホルダーの空洞にロードした。

以下の方法を用いて、試料をＸＲＰＤに供した：
管：Ｃｕ：Ｋ－α（λ＝１．５４１８７４Å）
発生器：電圧：４５ｋＶ電流：１５ｍＡ
ジオメトリ：Ｂｒａｇｇ－Ｂｒｅｎｔａｎｏ
走査様式：連続走査
走査範囲：４～５０度
ステップサイズ：０．０２１７度
カウント時間：５８ｓ
スピナー回転時間：１秒
入射ビーム経路（ｉＣｏｒｅ）
発散スリット：１／４°
ソーラスリット：０．０４ｒａｄ
マスク１：９ｍｍ
回折ビーム経路（ｄＣｏｒｅ）
散乱防止スリット：９ｍｍ
照射長：１０ｍｍ
ソーラスリット：０．０４ｒａｄ
検出器：ＰＩＸｃｅｌ３Ｄ－Ｍｅｄｉｐｉｘ３１ｘ１

当業者は、回折パターン及びピーク位置が、典型的には、使用される回折計とは実質的に無関係であり、特定の較正方法を利用するかどうかを認識するであろう。典型的には、ピーク位置は、約±０．２°２シータ以下だけ異なり得る。特定の回折ピークのそれぞれの強度（及び相対強度）はまた、以下に限定されないが、粒子サイズ、配向、試料純度などを含めた様々な要因の関数に応じて、変動することがある。

Ｘ線粉末回折パターンは、５．８２、１０．０９及び１８．４２度の２シータ±０．２度の２シータにピークを含む。

Ｘ線粉末回折パターンは、５．８２、８．５２、９．２０、１０．０９、１１．４３、１３．６１、１４．９４、１５．８９、１７．０３及び１８．４２度の２シータ±０．２度の２シータにピークを含む。

中間体２３４ｂは、それらのピークから選択される４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はそれ以上のピークを有するＸ線粉末回折パターンによって更に特徴付けられ得る。

中間体２３４ｂは、実質的に図４に示すＸ線粉末回折パターンよって更に特徴付けられ得る。

結晶形態Ａ
（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａは、Ｘ線粉末回折パターンによってキャラクタライズすることができる。

ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌＥｍｐｙｒｅａｎ回折計でＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析を行った。この装置は、入射ビーム及び回折ビームにそれぞれｉＣｏｒｅ及びｄＣｏｒｅ可変光学系を使用するＣｕ－ＫαＸ線管を備えている。化合物を、バックローディング技術を使用して１６ｍｍのサンプルホルダーの空洞にロードした。

以下の方法を用いて、試料をＸＲＰＤに供した：
管：Ｃｕ：Ｋ－α（λ＝１．５４１８７４Å）
発生器：電圧：４５ｋＶ電流：４０ｍＡ
ジオメトリ：Ｂｒａｇｇ－Ｂｒｅｎｔａｎｏ
走査様式：連続走査
走査範囲：３～３５度
工程サイズ：０．０１３１度
カウント時間：３０ｓ
スピナー回転時間：１秒
入射ビーム経路（ｉＣｏｒｅ）
プログラム発散スリット：自動
照射長：１０ｍｍ
ソーラスリット：０．０３ｒａｄ
マスク１：１４ｍｍ
マスク２：６ｍｍ
幅：７．７ｍｍ
回折ビーム経路（ｄＣｏｒｅ）
散乱防止スリット：自動
照射長：１０ｍｍ
ソーラスリット：０．０４ｒａｄ
検出器：ＰＩＸｃｅｌ３Ｄ－Ｍｅｄｉｐｉｘ３１ｘ１

Ｘ線粉末回折パターンは、５．４、７．２、１１．１、１１．９及び２１．７度の２シータ±０．２度の２シータにピークを含む。Ｘ線粉末回折パターンは、１３．７、１４．５、１４．７、１５．０、１６．５、１７．８、１９．０、１９．４、２０．１度２シータ±０．２度２シータから選択される少なくとも１つのピークを更に含み得る。

形態Ａは、更に、表４で特定されるピークから選択される４、５、６、７、８、９個又はそれ以上のピークを有するＸ線粉末回折パターンによってキャラクタライズし得る。

形態Ａは、更に表４で特定されるピークを含むＸ線粉末回折パターンによってキャラクタライズし得、ピークの相対強度は、約２％超、好ましくは約５％超、より好ましくは約１０％超、より好ましくは約１５％超である。しかしながら、当業者は、ピークの相対強度が、異なる試料相互間で、また同じ試料の異なる測定値相互間で異なり得ることを理解するであろう。

形態Ａは、更に、実質的に図１に示すＸ線粉末回折パターンによってキャラクタライズし得る。

表４は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物（図１）の結晶形態ＡのＸＲＰＤについてのピークリスト及び相対強度を示す。

薬理学
本発明の化合物は、メニンとＭＬＬタンパク質及び発がん性ＭＬＬ融合タンパク質との相互作用を遮断することが見出された。したがって、本発明による化合物及びかかる化合物を含む医薬組成物は、疾患、例えば、限定するものではないが、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）などのがん及び糖尿病の治療又は予防、特に治療に有用であり得る。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、がんの治療又は予防に有用であり得る。一実施形態によれば、本発明のメニン／ＭＬＬ阻害剤による治療から恩恵を受け得るがんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫又は固形腫瘍がん（例えば、前立腺がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、肝臓がん、黒色腫及び神経膠芽腫など）を含む。いくつかの実施形態では、白血病には、急性白血病、慢性白血病、骨髄球性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ＭＬＬ再構成白血病、ＭＬＬ－ＰＴＤ白血病、ＭＬＬ増幅白血病、ＭＬＬ陽性白血病、ＨＯＸ／ＭＥＩＳ１遺伝子発現シグネチャを示す白血病などが含まれる。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）の治療又は予防に有用であり得る。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、ＡＭＬ、特にヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）変異ＡＭＬ（すなわち、ＮＰＭ１^ｍｕｔＡＭＬ）、より詳細には、抽象ＮＰＭ１変異ＡＭＬの治療又は予防に有用であり得る。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、ＭＬＬ再構成白血病、特にＭＬＬ再構成ＡＭＬ又はＡＬＬの治療又は予防に有用であり得る。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、ＭＬＬ遺伝子変化を伴う白血病、特にＭＬＬ遺伝子変化を伴うＡＭＬ又はＡＬＬの治療又は予防に有用であり得る。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、Ｑ．Ｄ．投薬（１日１回）に適切であり得る。

特に、本発明による化合物及びその医薬組成物は、ＮＰＭ１遺伝子変異及び／又は混合系統白血病遺伝子（ＭＬＬ、ＭＬＬ１、ＫＭＴ２Ａ）変化、混合型白血病（ＭＬＬ）、ＭＬＬ関連白血病、ＭＬＬ関連白血病、ＭＬＬ陽性白血病、ＭＬＬ誘発性白血病、再構成された混合型白血病、ＭＬＬに関連する白血病、ＭＬＬ遺伝子の再構成／変化又は再構成／変化、急性白血病、慢性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、インスリン抵抗性、糖尿病前症、糖尿病、又は糖尿病のリスク、高血糖、染色体１１ｑ２３上の染色体再構成、１型糖尿病、２型糖尿病、を示す対象における血液がんの治療又は予防に有用であり得、それは膵臓細胞の増殖を促進し、ここで、膵臓細胞は、膵島細胞であるベータ細胞であり、ベータ細胞増殖は、ベータ細胞産生又はインスリン産生の増加によって証明され、それはメニン－ＭＬＬ相互作用を阻害するためのものであって、ＭＬＬ融合タンパク質標的遺伝子はヒトにおいてはＨＯＸ又はＭＥＩＳ１である。

したがって、本発明は、医薬品として使用するための本発明の化合物に関する。

本発明はまた、医薬品の製造のための、本発明の化合物の使用に関する。

本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物におけるメニンとＭＬＬタンパク質及び発がん性ＭＬＬ融合タンパク質との相互作用に関連する障害の治療、予防、改善、制御又はリスクの低減に使用するための、本発明による化合物又は本発明による医薬組成物に関し、その治療又は予防は、メニンとＭＬＬタンパク質及び発がん性ＭＬＬ融合タンパク質との相互作用をブロックすることによって影響を受けるか又は促進される。

また、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるメニンとＭＬＬタンパク質及び発がん性ＭＬＬ融合タンパク質との相互作用に関連する障害の治療、予防、改善、制御又はリスク低減のための医薬品の製造のための、本発明による化合物の使用に関し、その治療又は予防は、メニンとＭＬＬタンパク質及び発がん性ＭＬＬ融合タンパク質との相互作用をブロックすることによって影響を受けるか又は促進される。

本発明はまた、前述の疾患のいずれか１つの治療又は予防に使用するための、本発明による化合物に関する。

本発明はまた、前述の疾患のいずれか１つを治療又は予防する際に使用するための、本発明による化合物に関する。

本発明はまた、前述の疾患状態のいずれか１つを治療又は予防するための医薬品の製造のための、本発明による化合物の使用に関する。

本発明の化合物は、前述の疾患のいずれか１つの治療又は予防のために、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。

本発明による化合物の有用性を考慮して、前述の疾患のいずれか１つに罹患しているヒトを含む温血動物を治療する方法が提供される。

上記方法は、治療有効量の本発明による化合物の、ヒトを含む温血動物への投与、すなわち全身投与又は局所投与を含む。

したがって、本発明はまた、治療有効量の本発明による化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、前述の疾患のいずれか１つを治療又は予防する方法に関する。

当業者は、治療有効量の本発明の化合物が治療活性を有するのに十分な量であり、この量がとりわけ、疾患の種類、治療製剤中の化合物の濃度、及び患者の状態によって変化することを理解するであろう。有効な治療１日量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。治療効果を達成するために必要とされる、本明細書において有効成分とも呼ばれる本発明による化合物の量は、例えば、特定の化合物、投与経路、レシピエントの年齢及び状態、並びに治療される特定の障害又は疾患により、個々の場合に応じて異なり得る。治療方法はまた、１日当たり１～４回の摂取量のレジメンで有効成分を投与することを含み得る。これらの治療方法では、本発明による化合物は、好ましくは投与前に製剤化される。

本発明はまた、本明細書で言及される障害を予防又は治療するための組成物を提供する。上記組成物は、治療有効量の本発明による化合物、及び医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む。

有効成分は単独で投与することも可能であるが、医薬組成物として与えることが好ましい。したがって、本発明は更に、医薬的に許容される担体又は希釈剤と共に、本発明による化合物を含む医薬組成物を提供する。担体又は希釈剤は、組成物の他の成分と適合性があり、かつそのレシピエントに有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。

医薬組成物は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏｅｔａｌ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１８^ｔｈｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０、特に、Ｐａｒｔ８：ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｉｒＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照されたい）に記載されているものなどの方法を使用して、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。

本発明の化合物は、単独で、又は１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用することができる。併用療法には、本発明による化合物及び１つ以上の追加の治療剤を含有する単一の薬剤投与製剤を投与すること、並びに本発明による化合物及び各追加の治療剤をそれ自身の別個の薬剤投与製剤で投与することを含む。

したがって、本発明の一実施形態は、第１の有効成分としての本発明による化合物と、更なる有効成分としての１つ以上の抗がん剤とを、がんに罹患している患者の治療において同時に、又は別々に、又は逐次的に使用するための組み合わせ調製物として含む製品に関する。

１つ以上の他の薬剤及び本発明による化合物は、同時に（例えば、別個に、又は単一の組成物で）、又はいずれかの順序で逐次的に投与することができる。後者の場合、２つ以上の化合物は、有利な又は相乗的な効果が達成されることを確実にするのに十分な期間内及び量及び方法で投与される。組み合わせの各成分のための、好ましい投与の方法及び順序並びにそれぞれの投与量及びレジームは、投与される特定の他の医薬品及び本発明の化合物、それらの投与経路、治療される特定の状態、特に腫瘍、並びに処置される特定の宿主に依存することが理解されるであろう。

薬理試験
以下に記載される薬理試験では、以下の化合物について説明する。化合物Ａ：（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）－アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－ベンズアミド、
化合物Ａ１：（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）－アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－ベンズアミド．２ＨＣｌ．ｘＨ_２Ｏ（ｘ＝２～３）、
化合物Ａ３：（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）－アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－ベンズアミドオキサレート塩。
化合物Ａ４：（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａ
これらの薬理試験からの結果は、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）－アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）－ベンズアミドの生物学的活性を明確に示している。

１）メニン／ＭＬＬ均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ
未処理の白色３８４ウェルマイクロタイタープレートに、ＤＭＳＯ中４０ｎＬの２００Ｘ試験化合物及びアッセイ緩衝液（４０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）及び０．０５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７）中４μＬの２Ｘテルビウムキレート標識メニン（調製については以下参照）を添加した。試験化合物及びテルビウムキレート標識メニンを周囲温度で３０分間インキュベートした後、アッセイ緩衝液中の４μＬの２ＸＦＩＴＣ－ＭＢＭ１ペプチド（ＦＩＴＣ－β－アラニン－ＳＡＲＷＲＦＰＡＲＰＧＴ－ＮＨ_２）（「ＦＩＴＣ」はフルオレセインイソチオシアネートを意味する）を添加し、マイクロタイタープレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、アッセイ混合物を周囲温度で１５分間インキュベートした。アッセイ混合物中に存在するメニンＦＩＴＣ－ＭＢＭ１複合体の相対量は、テルビウム／ＦＩＴＣドナー／アクセプター蛍光団ペアの均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（励起３３７ｎｍ／テルビウム蛍光４９０ｎｍ／ＦＩＴＣ蛍光５２０ｎｍ）を周囲温度で使用して測定することにより求められる。蛍光共鳴エネルギー移動の程度（ＨＴＲＦ値）は、ＦＩＴＣとテルビウムフルオロフォアの蛍光発光強度の比（Ｆ^ｅｍ５２０ｎｍ／Ｆ^ｅｍ４９０ｎｍ）として表される。結合アッセイにおける試薬の最終濃度は、アッセイ緩衝液中２００ｐＭテルビウムキレート標識メニン、７５ｎＭＦＩＴＣ－ＭＢＭ１ペプチド及び０．５％ＤＭＳＯである。試験化合物の用量応答滴定は、１１点、四倍段階希釈スキームを用いて行い、典型的には１０μＭから開始する。

化合物の有効性を、まず、式１に従って各化合物濃度における阻害％を計算することによって調べた。
阻害％＝（（ＨＣ－ＬＣ）－（ＨＴＲＦ^化合物－ＬＣ））／（ＨＣ－ＬＣ））^＊１００（式１）
式中、ＬＣ及びＨＣは、メニンへの結合についてＦＩＴＣ－ＭＢＭ１と競合する化合物の飽和濃度の存在下又は非存在下におけるアッセイのＨＴＲＦ値であり、ＨＴＲＦ^化合物は、試験化合物の存在下における測定されたＨＴＲＦ値である。ＨＣ及びＬＣＨＴＲＦ値は、１プレート当たり少なくとも１０回の反復の平均を表す。各試験化合物について、阻害％値を試験化合物濃度の対数に対してプロットし、これらのデータを式２に当てはめることから得られたＩＣ_５０値をプロットした。
阻害％＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ｌｏｇＩＣ_５０－ｌｏｇ［ｃｍｐｄ］）^＊ｈ））（式２）
式中、Ｂｏｔｔｏｍ及びＴｏｐはそれぞれ用量反応曲線の下側及び上側の漸近線であり、ＩＣ_５０はシグナルの５０％阻害をもたらす化合物の濃度であり、ｈはヒル係数である。

メニンのテルビウムクリプテート標識の調製：メニン（ａ．ａ１－６１０－６ｘｈｉｓタグ、２０ｍＭＨｅｐｅｓ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸）中２．３ｍｇ／ｍＬ、８０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ｐＨ７．５）をテルビウムクリプテートで以下のように標識した。２００μｇのメニンを１×Ｈｅｐｅｓ緩衝液に緩衝液交換した。６．６７μＭのメニンを、８倍モル過剰のＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）－テルビウムクリプテートと室温で４０分間インキュベートした。溶出緩衝液（０．１ＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７＋０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））を用いてＮＡＰ５カラムで反応を実行することによって、標識タンパク質の半分を遊離標識から精製した。残りの半分を０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７で溶出した。４００μｌの溶離液をそれぞれ回収し、等分し、－８０℃で凍結した。テルビウム標識メニンタンパク質の最終濃度は、それぞれＨｅｐｅｓ緩衝液中で１１５μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ緩衝液中で８５μｇ／ｍＬであった。

メニンタンパク質配列（配列番号１）：
ＭＧＬＫＡＡＱＫＴＬＦＰＬＲＳＩＤＤＶＶＲＬＦＡＡＥＬＧＲＥＥＰＤＬＶＬＬＳＬＶＬＧＦＶＥＨＦＬＡＶＮＲＶＩＰＴＮＶＰＥＬＴＦＱＰＳＰＡＰＤＰＰＧＧＬＴＹＦＰＶＡＤＬＳＩＩＡＡＬＹＡＲＦＴＡＱＩＲＧＡＶＤＬＳＬＹＰＲＥＧＧＶＳＳＲＥＬＶＫＫＶＳＤＶＩＷＮＳＬＳＲＳＹＦＫＤＲＡＨＩＱＳＬＦＳＦＩＴＧＴＫＬＤＳＳＧＶＡＦＡＶＶＧＡＣＱＡＬＧＬＲＤＶＨＬＡＬＳＥＤＨＡＷＶＶＦＧＰＮＧＥＱＴＡＥＶＴＷＨＧＫＧＮＥＤＲＲＧＱＴＶＮＡＧＶＡＥＲＳＷＬＹＬＫＧＳＹＭＲＣＤＲＫＭＥＶＡＦＭＶＣＡＩＮＰＳＩＤＬＨＴＤＳＬＥＬＬＱＬＱＱＫＬＬＷＬＬＹＤＬＧＨＬＥＲＹＰＭＡＬＧＮＬＡＤＬＥＥＬＥＰＴＰＧＲＰＤＰＬＴＬＹＨＫＧＩＡＳＡＫＴＹＹＲＤＥＨＩＹＰＹＭＹＬＡＧＹＨＣＲＮＲＮＶＲＥＡＬＱＡＷＡＤＴＡＴＶＩＱＤＹＮＹＣＲＥＤＥＥＩＹＫＥＦＦＥＶＡＮＤＶＩＰＮＬＬＫＥＡＡＳＬＬＥＡＧＥＥＲＰＧＥＱＳＱＧＴＱＳＱＧＳＡＬＱＤＰＥＣＦＡＨＬＬＲＦＹＤＧＩＣＫＷＥＥＧＳＰＴＰＶＬＨＶＧＷＡＴＦＬＶＱＳＬＧＲＦＥＧＱＶＲＱＫＶＲＩＶＳＲＥＡＥＡＡＥＡＥＥＰＷＧＥＥＡＲＥＧＲＲＲＧＰＲＲＥＳＫＰＥＥＰＰＰＰＫＫＰＡＬＤＫＧＬＧＴＧＱＧＡＶＳＧＰＰＲＫＰＰＧＴＶＡＧＴＡＲＧＰＥＧＧＳＴＡＱＶＰＡＰＡＡＳＰＰＰＥＧＰＶＬＴＦＱＳＥＫＭＫＧＭＫＥＬＬＶＡＴＫＩＮＳＳＡＩＫＬＱＬＴＡＱＳＱＶＱＭＫＫＱＫＶＳＴＰＳＤＹＴＬＳＦＬＫＲＱＲＫＧＬＨＨＨＨＨＨ

２ａ）増殖アッセイ
メニン／ＭＬＬタンパク質／タンパク質相互作用阻害剤試験化合物の抗増殖効果を、ヒト白血病細胞株において評価した。細胞株ＭＯＬＭ－１４は、ＭＬＬ転座を有し、それぞれＭＬＬ融合タンパク質ＭＬＬ－ＡＦ９及び第２の対立遺伝子由来の野生型タンパク質を発現する。ＮＰＭ１ｃ遺伝子変異を有するＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞についても試験した。ＭＬＬ再構成細胞株（例えば、ＭＯＬＭ－１４）及びＮＰＭ１ｃ変異細胞株は、幹細胞様のＨＯＸＡ／ＭＥＩＳ１遺伝子発現シグネチャを示す。一般的な細胞毒性効果を示す化合物を排除するために、ＫＯ－５２を２つのＭＬＬ（ＫＭＴ２Ａ）野生型対立遺伝子を含む対照細胞株として使用した。

ＭＯＬＭ－１４細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭＬ－グルタミン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で培養した。ＫＯ－５２及びＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞株を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭＬ－グルタミン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したアルファ－ＭＥＭ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で増殖させた。細胞を培養中に０．３～２５０万細胞／ｍＬに維持し、継代数は２０を超えなかった。

抗増殖効果を評価するために、２００個のＭＯＬＭ－１４細胞、２００個のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞又は３００個のＫＯ－５２細胞を、９６ウェル丸底超低接着プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号７００７）中の２００μｌ培地／ウェルに播種した。細胞播種数は、実験全体を通して線形増殖を確実にするために増殖曲線に基づいて選択した。試験化合物を異なる濃度で添加し、ＤＭＳＯ含有量を０．３％に正規化した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２で８日間インキュベートした。スフェロイド様増殖を、８日目に画像を取得する生細胞イメージング（ＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭ、Ｅｓｓｅｎｂｉｏ、４倍の対物レンズ）によってリアルタイムで測定した。スフェロイドサイズの尺度としてのコンフルエンス（％）を、統合解析ツールを使用して決定した。

試験化合物の効果を経時的に求めるために、各ウェルにおけるスフェロイドサイズの尺度としてのコンフルエンスを計算した。参照化合物の最高用量のコンフルエンスをＬＣのベースライン（低対照）として使用し、ＤＭＳＯ処理細胞のコンフルエンスを０％細胞傷害性（高対照、ＨＣ）として使用した。

絶対ＩＣ_５０値を、コンフルエンスのパーセント変化として以下のように計算した。
ＬＣ＝低対照：例えば、１μＭの細胞傷害剤スタウロスポリンで処理した細胞、又は、例えば、高濃度の代替基準化合物で処理した細胞；
ＨＣ＝高対照：平均コンフルエンス（％）（ＤＭＳＯ処理細胞）；
効果％＝１００－（１００^＊（試料－ＬＣ）／（ＨＣ－ＬＣ））；及び
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（バージョン７．００）を使用してＩＣ_５０を計算した。用量応答方程式を、可変勾配を用い、最大値を１００％に固定し、最小値を０％に固定して、効果％対Ｌｏｇ１０化合物濃度のプロットに使用した。

２ｂ）ＭＥＩＳ１ｍＲＮＡ発現アッセイ
化合物処理時のＭＥＩＳ１ｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉｇｅｎｅＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって調べた。この技術は、目的の定義された標的配列にハイブリダイズするプローブを使用してｍＲＮＡ標的の直接定量を可能にし、マルチモードプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してシグナルを検出する。ＭＯＬＭ－１４細胞株をこの実験に使用した。細胞を、増加する濃度の化合物の存在下、９６ウェルプレートに３，７５０細胞／ウェルで播種した。化合物と４８時間インキュベートした後、細胞を溶解緩衝液中で溶解し、５５℃で４５分間インキュベートした。細胞溶解物を、正常化対照としてのヒトＭＥＩＳ１特異的捕捉プローブ又はヒトＲＰＬ２８（リボソームタンパク質Ｌ２８）特異的プローブ、並びにブロッキングプローブと混合した。次いで、細胞溶解物をカスタムアッセイハイブリダイゼーションプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、５５℃で１８～２２時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄して未結合物質を除去した後、前置増幅剤、増幅剤及び標識プローブを順次加えた。シグナル（＝遺伝子カウント）をマルチモードプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎで測定した。ＩＣ_５０を、適切なソフトウェアを使用した用量応答モデリングによって計算した。全ての非ハウスキーパ遺伝子について、応答は、バックグラウンド及び相対発現について補正されたカウントに等しい。各試料について、各試験遺伝子シグナル（バックグラウンドを差し引いたもの）を正規化遺伝子シグナル（ＲＰＬ２８：バックグラウンドを差し引いたもの）で割った。処理された試料の正規化された値をＤＭＳＯ処理された試料の正規化された値で割ることによって、倍率変化を計算した。各標的遺伝子の倍率変化をＩＣ_５０の計算に使用した。

結果を以下の表５にまとめる。

３）マウスＰＫ（インビボＴ_１／２及び経口バイオアベイラビリティ）
絶食させた雄性ＣＤ－１マウス（６～８週齢）にＨＰ－β－ＣＤ２０％（ｗ：ｖｏｌ）溶液又はパイロジェンフリー水に製剤化された試験物質を、静脈内投与（０．５又は１．０ｍｇ／ｋｇを２．５ｍＬ／ｋｇで静脈内投与）又は経口投与（５ｍｇ／ｋｇを１０ｍＬ溶液／ｋｇで経口投与）した後のインビボ薬物動態（ＰＫ）を評価した。

抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用して、連続キャピラリーマイクロサンプリング（約０．０３ｍＬ）によって所望の時点で背側中足静脈から血漿及び／又は全血試料を採取した。血漿及び血液試料中の化合物の濃度を、適格なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を用いて分析した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）、バージョン６．１）又は同様のソフトウェアを使用して、主な薬物動態パラメータのインシリコ分析を行った。

４）ヒト／マウス肝臓ミクロソームにおける代謝安定性
実験手順
この実験の目的は、ヒト及びマウスの肝臓ミクロソームにおける試験化合物のインビトロ代謝安定性を測定し、代謝回転速度に関する定量的情報を提供すること（すなわち、試験の見かけの固有クリアランスを決定すること）である。

ＤＭＳＯ中１０ｍＭのストック濃度で試験項目を調製した。代謝ターンオーバーを調べるために、試験化合物又は陽性対照化合物用の２μＬの１０ｍＭＤＭＳＯ原液を１９８μＬのアセトニトリルに添加することによって最終作業溶液を調製した（最終濃度１００μＭ）。

インキュベーションを以下のように行った。最初に、肝臓ミクロソームを氷上で解凍し、１００ｍＭＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に肝臓ミクロソームを含有するｐＨ７．４のマスター溶液を調製する。次に、肝臓ミクロソーム溶液をインキュベーションプレートに加え、１０ｍＭＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を加えた（ＭＷ：８３３．４ｇ／ｍｏｌ、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ、ドイツ。リン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解）。混合物を１０秒間混合し、インキュベーションプレートにおいて３７℃で１０分間予熱した。°試験化合物又は陽性対照化合物の１００μＭ作業溶液５μＬをインキュベーションプレートに添加して代謝反応を開始した（最終試験項目の濃度＝１μＭ）。反応最終混合物には、ｐＨ７．４の１００ｍＭＰＢＳ中に１ｍＭＮＡＤＰＨ、０．５ｍｇ／ｍＬミクロソームタンパク質及び１μＭ試験化合物又は陽性対照化合物を含有させる必要がある。インキュベーション混合物中の有機溶媒のパーセンテージは１％であり、ＤＭＳＯ≦０．０２％である。

選択した時点でインキュベートした混合物５０μＬを、冷メタノール２００μＬを含有するクエンチプレートに移すことによって、反応をクエンチした。全ての時点のサンプリングを終えた後、クエンチプレートを４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離してタンパク質を沈殿させた。合計９０μＬの上清を分析プレートに移し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために超純Ｈ_２Ｏ水を各ウェルに添加した。全てのインキュベーション及び分析を２連で行った。

データ分析
全ての計算は、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを使用して行った。勾配値ｋは、親薬物の残存パーセンテージ対インキュベーション時間曲線の自然対数の線形回帰によって求めた。結果を以下の表６にまとめる。

インビトロ半減期（インビトロｔ_１／２）を勾配値から求めた。
インビトロｔ_１／２＝－（０．６９３／ｋ）
インビトロｔ_１／２（分）のインビトロ固有クリアランス（ｉｎｖｉｔｒｏＣＬ_ｉｎｔ、μＬ／分／ｍｇタンパク質単位）への変換は、以下の式を使用して行った。

「ＮＡ」は分析しなかったことを意味する

５）ＭＯＬＭ－１４又はＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の皮下（ｓｃ又はＳＣ）異種移植片における薬力学（ＰＤ）活性のためのプロトコル
試験薬剤及び対照
化合物Ａ３を２０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）に製剤化し、動物２０ｇについて１用量当たり０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）の総体積に達するように調製した。用量は、毎日個々の体重によって調整した。化合物Ａ３の作業用ストックを各実験用に週に１回調製し、室温で保存した。化合物Ａ３を経口（ＰＯ）で毎日投与した。

アッセイ
化合物のインビボ薬力学（ＰＤ）活性を、ＭＯＬＭ－１４細胞又はＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞の皮下（ＳＣ）異種移植片において評価した。ＭＯＬＭ－１４又はＯＣＩ－ＡＭＬ３腫瘍を有するヌードＮＭＲＩマウス（Ｃｒｌ：ＮＭＲＩ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／－）を１日３回のビヒクル又は化合物で処置した。血漿試料を、２日目投与の２３時間後、最終投与の０．５時間後及び最終投与の１６時間後に採取し、腫瘍試料を最終投与の１６時間後に採取した。複数のメニン－ＭＬＬ標的遺伝子（例えば、ＭＥＩＳ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＦＬＴ３）の発現に対する化合物の効果を調べるために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＰｌｅｘ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。凍結腫瘍をホモジナイズし、溶解緩衝液中の個々の溶解マトリックスチューブに移し、５５℃で３０分間インキュベートした。細胞溶解物を標的特異的捕捉プローブ、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ及びブロッキングプローブと混合し、カスタムアッセイハイブリダイゼーションプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、５４℃で１８～２２時間インキュベートした。その後、プレートを磁気分離プレートに移し、洗浄してビーズから未結合物質を除去し、引き続いて前置増幅剤、増幅剤及び標識プローブからなる連続ハイブリダイゼーション及びその後のストレプトアビジンフィコエリトリン結合を行った。ビーズからのシグナルをＬｕｍｉｎｅｘＦｌｅｘＭａｐ三次元機器で測定した。全ての非ハウスキーパ遺伝子について、応答は、バックグラウンド及び相対発現について補正されたカウントに等しい。各試料について、各試験遺伝子シグナル（バックグラウンドを差し引いたもの）を正規化遺伝子シグナル（ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２８、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、バックグラウンドを差し引いたもの）で割った。処理された試料の正規化された値をＤＭＳＯ処理された試料の正規化された値で割ることによって、倍率変化を計算した。結果を以下の表７及び表８にまとめる。

表７ａ及び表８ａは、新鮮な腫瘍試料を用いた最適化された条件での反復実験に基づく中央値を示す。

６）ＭＯＬＭ－１４皮下モデルにおける有効性実験
試験薬剤及び対照
化合物Ａ３を２０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）に製剤化し、動物２０ｇについて１用量当たり０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）の総体積に達するように調製した。用量は、毎日個々の体重によって調整した。化合物Ａ３の作業用ストックを各実験用に週に１回調製し、２５℃で保存した。

動物
雌ＮＭＲＩヌードマウス（ＭＯＬＭ－１４ＳＣ）を、およそ６週齢～８週齢であり、およそ２５ｇの体重であるときに使用した。全ての動物は、実験的使用の前に最低７日間、あらゆる出荷関連ストレスに順応し、それから回復することができた。オートクレーブ処理した水及び照射食物を自由に与え、動物を１２時間の明暗サイクルで維持した。ケージ、寝床、及び水筒を使用前にオートクレーブ処理し、毎週交換した。更なる詳細を以下の表９に示す。

腫瘍モデル及び細胞培養方法
ヒトＡＭＬ細胞ＭＯＬＭ－１４を、示された完全培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＨＩ－ＦＢＳ＋２ｍＭＬ－グルタミン＋５０ｕｇ／ｍＬゲンタマイシン）中、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。対数増殖の間に細胞を回収し、無血清培地中の冷（４℃）ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０に再懸濁した。

各マウスの右脇腹に、１ｃｃシリンジ及び２７ゲージ針を使用して０．２ｍＬの総体積で、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中５×１０^６個のＭＯＬＭ－１４細胞を投与した。

実験計画
化合物Ａ３を経口（ＰＯ）で毎日投与した。

０日目は、腫瘍細胞移植及び実験開始の日である。

ＳＣＭＯＬＭ－１４腫瘍を有するマウスを腫瘍移植後１６日目に無作為化し、腫瘍体積（平均約１３０ｍｍ^３、ｎ＝１０／群）に従って治療群に割り当てた。ビヒクル又は化合物Ａ３（３０及び１００ｍｇ／ｋｇ）による治療を同日に開始し、２１日間毎日経口投与した。ＰＫ（薬物動態）分析のために、最後の投与（ｎ＝４～５／群／時点）の１、２、４、８、及び２３時間後に血漿を採取した。

動物のモニタリング
ＳＣ腫瘍体積を、実験全体を通して週に２～３回又はそれ以上の回数、各動物について測定した。

計算
腫瘍体積は、以下の式を使用して計算し、
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（Ｄ×ｄ^２／２）；式中、「Ｄ」はノギス測定によって測定される腫瘍の大きい方の直径を表し、「ｄ」は小さい方の直径を表す。腫瘍体積データを平均腫瘍体積±ＳＥＭとしてグラフ化した。

ΔＴＧＩ％を治療群と対照群の平均腫瘍負荷の差として定義し、ΔＴＧＩ％＝（［（ＴＶ_ｃＴＶｃ_０）（ＴＶ_ｔＴＶ_ｔ０）］／（ＴＶ_ｃＴＶｃ_０））×１００（式中、「ＴＶ_ｃ」は所与の対照群の平均腫瘍負荷であり、「ＴＶｃ_０」は所与の対照群の平均初期腫瘍負荷であり、「ＴＶ_ｔ」は治療群の平均腫瘍負荷であり、「ＴＶ_ｔ０」は治療群の平均初期腫瘍負荷である）として計算した。ＴＧＩ％を間の差として定義した。

治療群及び対照群の平均腫瘍体積を以下のように計算した。

ＴＧＩ％＝（（ＴＶ_ｃＴＶ_ｔ）／ＴＶ_ｃ）×１００（式中、「ＴＶ_ｃ」は対照群の平均腫瘍体積であり、「ＴＶ_ｔ」は治療群の平均腫瘍体積である）。国立がん研究所の基準によって定義されるように、６０％以上のＴＧＩは生物学的に有意であるとみなされる。

対照群とは無関係のベースラインと比較して処置に関連した腫瘍体積の減少を反映するように定量化された腫瘍退縮（ＴＲ）％は、ＴＲ％＝（１平均（ＴＶ_ｔｉ／ＴＶ_ｔ０ｉ））×１００として計算され、式中、「ＴＶ_ｔｉ」は治療群の個々の動物の腫瘍負荷であり、「ＴＶ_ｔ０ｉ」は動物の初期腫瘍負荷である。

データ解析
腫瘍体積を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄバージョン７又は８）を使用してグラフ化した。ほとんどの実験の統計的有意性を、２／３以上のマウスが各群に残っていた実験最終日に、ＨＰβＣＤビヒクル処置対照と比較して、化合物Ａ３治療群について評価した。ｐ≦０．０５のとき、群間の差異は有意であるとみなした。

動物腫瘍体積の統計的有意性は、Ｒソフトウェアバージョン３．４．２（Ｊａｎｓｓｅｎの内部開発Ｓｈｉｎｙアプリケーションバージョン４．０を使用）の線形混合効果（ＬＭＥ）分析を使用して計算し、処置及び時間を固定効果、動物をランダム効果とした。個々の縦方向応答軌跡が線形でない場合、対数変換を行った。

このモデルから得られた情報を使用して、対照群の腫瘍体積又は全ての治療群間の腫瘍体積の対治療比較を行った。結果を図２に示す。

７）Ｃａ^２＋蛍光アッセイ（ＣＴＣＭヒト）を使用したヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（ｈＳＣ－ＣＭ）の同期した拍動における試験化合物の心電生理学的効果
プロトコル
化合物を９６ウェルプレートで試験した。

Ｃｏｒ．４Ｕ（登録商標）－心筋細胞又はｉＣｅｌｌ（登録商標）心筋細胞２につき、化合物を、０．１μＭ、０．２μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭ及び５μＭ（ｎ＝４／用量）で試験した。

あるいは、主にｉＣｅｌｌ（登録商標）心筋細胞２について、化合物を、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ及び３０μＭ（ｎ＝４／用量）で試験した。

陽性対照及び陰性対照
３ｎＭのドフェチリド
１００ｎＭのイソプロテレノール
１００～３００ｎＭのニモジピン
３μＭのセチリジン。

ビヒクル対照：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。ＤＭＳＯ又はその溶媒中の化合物の溶液（０．１％ＤＭＳＯの最終濃度、ｎ＝８）。

試験物質及び対照の調製
試験した化合物を、意図する濃度の１０００倍でＤＭＳＯに溶解した。試験化合物並びに陽性対照及び陰性対照を最終濃度の１０００倍で含有する化合物「マザープレート」を作製した。実験日に、これらのストック溶液を、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＴｙｒｏｄｅ（Ｓｉｇｍａ）で、意図する濃度の２倍に（丸底化合物プレート中で）希釈した。試験溶液及びビヒクル対照中の最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。

細胞
ｈＳＣ－ＣＭ（Ｃｏｒ．４Ｕ（登録商標）心筋細胞）は、ＣＤＩ（Ｎｃａｒｄｉａ、ドイツ）から入手した。細胞を予めプレーティングし、単層を形成するのに適した密度でフィブロネクチン被覆９６ウェルプレートに播種し、細胞供給元の説明書に従って、ステージインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内の培養物内に維持する。

ｉＣｅｌｌ（登録商標）心筋細胞２と呼ばれる第二系統のｈＳＣ由来心筋細胞をＦＵＪＩＦＩＬＭＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ（米国）から購入した。試験薬物を用いた実験は、ｈｉＰＳＣ由来心筋細胞の生きた拍動する単層を有するように細胞をプレート上にプレーティングした５～７日後に行われる。９６ウェルプレート中の拍動している単層を、通常、凍結したｉＣｅｌｌ（登録商標）心筋細胞２（≒５００万細胞／バイアル）の２バイアルから採取し、これを３つの９６ウェルプレート（おおよそ５０Ｋ／ウェル）にプレーティングする。

実験開始前
実験開始の少なくとも１時間前に、正常細胞培地をカルシウム色素を含むＴｙｒｏｄｅ溶液で置き換えた（下記参照）。

Ｃａｌ５２０色素（ＡＡＴＢｉｏｑｕｅｓｔ）を、１０ｍＭＨＥＰＥＳを補充した１１ｍＬのＴｙｒｏｄｅに溶解し、３７℃まで加温した後、細胞に添加した。

３５μｌの細胞培養培地を各ウェルから取り出し、３５μｌの予熱したＣａｌ５２０色素溶液と交換し、細胞プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で４５分間インキュベートした。細胞を３７℃で５分間インキュベートした。

実験
自発電気的活動を、Ｃａｌ５２０（商標）（ＡＡＴＢｉｏｑｕｅｓｔ）カルシウム蛍光色素シグナル伝達を使用して記録する。この色素は、ウェル全体にわたる総細胞内カルシウム活性を統合する。Ｃａｌ５２０色素のボトル（５０μｇ、ＭＷ：１１０３／ｍｏｌ）を、０．９ｍＭのストック溶液として５０μｌのＤＭＳＯで溶解する。色素のストック溶液５０μＬを１０ｍＬのＴｒｙｏｄｅｓ溶液に添加して、色素濃度を４．５μＭにした。続いて、この色素溶液３５μｌを各ウェルに添加して、最終色素濃度を１．５８μＭにした。このＣＴＣＭヒトアッセイに関する現在の色素プロトコルが最近確立された（ＩｖａｎＫｏｐｌｊａｒｅｔａｌ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ２０１８．９１：８０－８６；Ｌｕｅｔａｌ．，ＴｏｘＳｃｉ２０１９．１７０（２）：３４５－３５６）。

蛍光シグナル（Ｃａ^２＋過渡現象の形態）を、機能的薬物スクリーニングシステム（ＦＤＳＳ／μＣｅｌｌ、浜松、日本）を使用して測定し、その後、その記録を適切なソフトウェア、例えば、Ｎｏｔｏｃｏｒｄを使用してオフラインで分析した。

試験運転のために細胞プレートをＦＤＳＳ／μＣｅｌｌにロードし、Ｃａ^２＋過渡現象を４分間測定して、各ウェルの心筋細胞の同期拍動を確認した。９６個全てのウェルを同時に測定した（サンプリング間隔：０．０６秒、短い曝露時間：１０ｍｓ、励起波長４８０ｎｍ、発光波長５４０ｎｍ、ＦＤＳＳ／μＣｅｌｌを３７℃に加温）。全てが同期拍動を示した場合、９６ウェルプレートを３回繰り返し測定した（ベースラインでの９６ウェル全ての同期拍動を検証するために、予め設定された基準を満たさなかったウェルを実験から除外し、化合物で処置しなかった）。
Ｔ＝０：対照期間（－５～－１分）＋化合物添加、引き続いて３分間。
Ｔ＝３０：化合物添加後２９～３４分で測定

化合物添加工程中、各二重濃縮試験溶液１００μｌを各ウェルに同時にピペットで注入した。

データを、適切なソフトウェア、例えばＮｏｔｏｃｏｒｄ－Ｈｅｍ（バージョン４．３）を使用してオフラインで分析した。

Ｃａ^２＋過渡現象の形態の以下のパラメータを測定した。

拍動数（ＢＲ）
Ｃａ^２＋過渡現象の振幅（Ａｍｐ）、
－ＣＴＤ_９０：９０％でのＣａ^２＋過渡現象の持続時間（初期ベース値の９０％に至るまでの時間）。

様々な「不整脈様」活動の存在も実験期間中に認められた。これらには以下が含まれる。

「早期後脱分極様」（ＥＡＤ様）事象（「過渡現象の初期ピークに続く過渡現象波形の非常に小さいピーク」として定義される）、
「心室頻拍様」（ＶＴ様）事象（非常に速い拍動数として定義される）、又は
「心室細動様」（ＶＦ様）事象（「不規則性及び測定不能な過渡電位を有する小振幅高速レートＣａ^２＋波形」と定義される）
細胞の「拍動停止」（Ｃａ^２＋過渡現象は観察されない）。

カルシウム過渡現象シグナルの化合物誘導変化をソフトウェアによって分析できなかった場合、これらのシグナルをＢＱＬ（品質分析レベル未満）として同定した。

データ解析
ＦＤＳＳ－μＣｅｌｌから測定されたデータをオフライン分析のためにコピーし、分析し、更なる分析のためにＳＰＥＣ－ＩＩ（本発明者らの運用管理システム）にアップロードした。化合物の投与前後の変数の値を収集し、エクセルブックに移した。

全ての値（実際の単位及びベースライン値からの変化率）を中央値（最小値及び最大値）として表す。化合物群で観察された（実際の単位での）対応するベースライン値に対する変化を、ウィルコクソン－マン－ホイットニー検定を用いて溶媒対照群の変化と比較した。多重度調整のためのボンフェローニ補正を用いた両側検定を行った。溶媒群と比較してそれぞれ１０の治療群が存在するので、０．０５／１０（０．００５）のアルファレベルは、溶媒群との統計学的に有意な差を反映すると考えられた。全ての統計分析は、適切なソフトウェア、例えば、Ｒソフトウェアバージョン３．５．２を使用して行った。

プレート中のｈｉＰＳＣ－ＣＭの品質管理：
以下の基準を満たさない場合、プレートを不合格とした。
安定した規則的な拍動
５００超の相対単位の振幅
２５～８０拍／分の間の拍動数
３００～８００ｍｓのＣＴＤ_９０。

本実験では、プレート中のｈｉＰＳＣ－ＣＭが上記基準を満たした。

不整脈の発生率又は拍動停止と組み合わせたこれらのパラメータを使用して、重み付けスコアリング法（Ｋｏｐｌｊａｒｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ２０１８．１１，１３６５－１３７７に基づく）を使用して潜在的危険レベルを計算した。このハザードスコアは、ＣＴＤ_９０、拍動数及び振幅（ΔΔ％）並びに拍動停止及び早期後脱分極（ＥＡＤ）の発生の変化に対する許容差間隔（ＴＩ）に基づいて重み付きポイントを加算することによって濃度毎に計算される。その結果、各濃度について、４つの異なる危険レベルのうちの１つが生成される。これは、化合物と３０分間インキュベートした後に行う。危険レベルは以下のとおりである。

危険なし：ビヒクル内の影響レベル又は小さな意味のない変化。

低い危険性：意味のある影響であるが、心臓の負債のリスクはおそらく低い。

高い危険性：心臓の負担に対する比較的高いリスク。

非常に高い危険性：不整脈様事象（ＥＡＤ）による非常に高いリスク。

「ハザードスコア」の結果は、（血漿タンパク質がウェルに添加されていないので）遊離薬物当量での潜在的な急性心臓薬物誘発効果を同定するものである。ハザード同定の評価は、ＣＴＣＭ＿Ｓｃｏｒｉｎｇ＿ｖｅｒｓｉｏｎ１と呼ばれるスコアリング参照ブック（Ｋｏｐｌｊａｒｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ２０１８．１１：１３６５－１３７７）を用いて実施し、表１０の以下の表色系に従ってレベルを示す。

関連する表で異なる色で上に列挙したＨｉＰＳｃ－ＣＭで測定したＣａ^２＋過渡現象アッセイに対するハザードスコア重症度による試験化合物のランク付け。

結果
ｉＣｅｌｌ（登録商標）心筋細胞２を細胞株として使用
陽性対照及び陰性対照：陽性対照及び陰性対照は全て
このアッセイにおいて予想された薬理学的効果を有していた。結果を以下の表１１及び表１２にまとめる。

化合物Ａ１の場合：３０ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）のマウス異種移植モデルにおける有効用量で、ＣＴＣＭヒト濃度対遊離Ｃ_ｍａｘは以下のように推定されるであろう。
マージンＣＴＣＭヒト１０μＭ対遊離Ｃｍａｘ＞１６（マウス、ヒト）
マージンＣＴＣＭヒト３０μＭ対遊離Ｃｍａｘ＞４５（マウス、ヒト）。

８）ｈＥＲＧトランスフェクト細胞株における膜カリウム電流Ｉ_Ｋｒに対する効果

方法
ｈＥＲＧカリウムチャネルを安定に発現するＣＨＯ細胞を用いて実験を行った。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、ハイグロマイシンＢ（１００μｇ／ｍＬ）及びジェネティシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したハムＦ１２培地中、培養フラスコ中で３７℃及び５％ＣＯ_２で増殖させた。自動パッチクランプシステムで使用するために、ＱＰａｔｃｈ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）細胞を回収して、単一細胞の細胞懸濁液を得た。

溶液：浴溶液は、１４５ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、２ｍＭＣａＣｌ_２及び１ｍＭＭｇＣｌ_２（ＮａＯＨでｐＨ７．４）を含有した。ピペット溶液は、１２０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＥＧＴＡ（エチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５．３７４ｍＭＣａＣｌ_２及び１．７５ｍＭＭｇＣｌ_２（ＫＯＨでｐＨ７．２）を含有した。

パッチクランプ実験を電位固定モードで行い、全細胞電流を、ＱＰａｔｃｈシステム（Ｓｏｐｈｉｏｎ）を利用する自動パッチクランプアッセイで記録した。現在のシグナルを増幅し、デジタル化し、保存し、ＱＰａｔｃｈアッセイソフトウェアを用いて分析した。

保持電位は－８０ｍＶであった。ｈＥＲＧ電流（Ｋ^＋選択的外向き電流）を、＋６０ｍＶへの２秒間の脱分極後の－４０ｍＶでの最大テール電流として測定した。パルスサイクリング速度は１５秒であった。短いパルス（９０ｍｓ）～－４０ｍＶが、テール電流振幅を計算するためのベースライン工程として機能した。ホールセル構成及び安定期間を確立した後、溶媒対照（０．３％ＤＭＳＯ）を５分間適用し、引き続いて試験物質を３×１０^－７Ｍ、３×１０^－６Ｍ、１０^－５Ｍ及び３×１０^－５Ｍの４つの漸増濃度で適用した。試験物質の各濃度を２回適用した。各濃度の結果は、５分後に３つの連続電圧パルスの平均電流として測定された。閉塞の程度を調べるために、残留電流をビヒクル前処理と比較した。

個々のデータ点に対する非線形最小二乗フィッティングによって、濃度／応答関係を計算した。最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）をフィッティングルーチンによって計算した。

各化合物を少なくとも５ウェルで同じプレート上で複製した。阻害率の結果を以下の表１３にまとめる。

９）播種性ＯＣＩ－ＡＭＬ３モデルにおける有効性実験
試験薬剤及び対照
化合物Ａ３を２０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）に製剤化し、動物２０ｇについて１用量当たり０．２ｍＬ（１０ｍＬ／ｋｇ）の総体積に達するように調製した。用量は、毎日個々の体重によって調整した。化合物Ａ３の作業用ストックを各実験用に週に１回調製し、２５℃で保存した。

動物
雌のＳＣＩＤベージュマウス（ＣＢ１７．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ－Ｊ／Ｃｒｌ／－）は、およそ６～８週齢で、体重がおよそ２５ｇのときに使用した。全ての動物は、実験的使用の前に最低７日間、任意の出荷関連ストレスに順応し、それから回復することができた。オートクレーブ処理した水及び照射食物を自由に与え、動物を１２時間の明暗サイクルで維持した。ケージ、寝床、及び水筒を使用前にオートクレーブ処理し、毎週交換した。組織培養及び細胞注入試薬を以下の表１４にまとめる。

腫瘍モデル及び細胞培養方法
ヒトＡＭＬ細胞株ＯＣＩ－ＡＭＬ３を、示されている完全培養培地（ＭＥＭアルファ＋２０％ＨＩ－ＦＢＳ（熱不活性化ウシ胎児血清）＋２ｍＭＬ－グルタミン＋５０ｕｇ／ｍＬゲンタマイシン）中、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。対数増殖中に細胞を回収し、血清非含有培地中の冷（４℃）ＭＥＭ（（最小必須培地）アルファに再懸濁した。

播種性ＯＣＩ－ＡＭＬ３モデルについては、各マウスに２６ゲージ針を使用して０．２ｍＬの総体積でＩＶ注射によって５×１０^５細胞を投与した。

実験計画
化合物Ａ３を経口（ＰＯ）で毎日投与した。

０日目は、腫瘍細胞移植及び実験開始の日である。

有効性試験では、ＩＶＯＣＩ－ＡＭＬ３異種移植片腫瘍を有するマウスを、腫瘍細胞の生着の３日後に治療群に無作為に割り当てた。ビヒクル又は化合物Ａ３による（３０、５０，１００ｍｇ／ｋｇでの）による治療を同じ日に開始し、２８日間毎日投与した。

動物のモニタリング
化合物毒性又は腫瘍負荷（すなわち、後肢麻痺、嗜眠など）のいずれかに関連する臨床徴候について動物を毎日モニタリングした。

計算
生存評価のために、結果を腫瘍移植後の日数に対する生存率としてプロットした。陰性の臨床徴候及び／又は２０％以上の体重減少を、死亡の代用エンドポイントとして使用した。カプラン・マイヤー生存分析を利用して生存期間中央値を求めた。生存期間の増加パーセント（ＩＬＳ）を、（（治療群の生存期間中央値－対照群の生存期間中央値）／対照群の生存期間中央値）×１００として計算した。有害な臨床徴候（例えば、潰瘍化した腫瘍、体重減少など）のために代用エンドポイントに到達できなかった動物、又は治療とは無関係の死亡を、生存評価に関しては除外した。ＮＣＩ基準によって定義されるように、２５％以上のＩＬＳは生物学的に有意であるとみなされる。（ＪｏｈｎｓｏｎＪＩｅｔａｌ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ。２００１．８４（１０），１４２４－１４３１）。

データ解析
生存及び体重データを、Ｐｒｉｓｍ（バージョン７）を利用してグラフで表した。体重についての統計学的有意性を上記のように評価した。統計的有意性は、Ｒソフトウェアバージョン３．４．２のログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して、治療治療群対適切なビヒクル処置対照を比較するカプラン・マイヤー生存プロットについて評価した。ｐ値が≦０．０５である場合、群間の差を有意とみなした。

生存
カプラン・マイヤー生存曲線を図３に示す。確立されたＯＣＩ－ＡＭＬ３腫瘍を有するマウスに、２０％ＨＰ－β－ＣＤ製剤中３０、５０，１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ３を毎日合計２８日間経口投与した（ｎ＝９～１０／群）。ビヒクル処置対照群の生存期間中央値３８．５日に対して、化合物Ａ３治療群では、３０ｍｇ／ｋｇで７５．５日、５０ｍｇ／ｋｇで５８．５日、及び１００ｍｇ／ｋｇで７５日の生存期間中央値に達した。化合物Ａ３の治療は、対照マウスの寿命と比較して、ＯＣＩ－ＡＭＬ３腫瘍担持マウスの寿命を（３０、５０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量レベルで）９６．１％、５１．９％及び９４．８％だけ統計学的に有意に増加させた（ｐ≦０．００１）。これは、２５％以上のＩＬＳのＮＣＩ基準閾値による生物学的に有意なＩＬＳであった（ＪｏｈｎｓｏｎＪＩｅｔａｌ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ。２００１．８４（１０），１４２４－１４３１）。

安定性データ
（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａについて安定性実験を行った。ビスベシル酸塩水和物は、化学的及び物理的に安定であり、評価されたストレス条件下では、ＵＨＰＬＣによって分解が観察されず、ＸＲＤによって固体状態の変化が観察されないことが見出される。

Claims

（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドベシル酸塩
又はその溶媒和物。
前記溶媒和物が水和物である、請求項１に記載の化合物。
前記化合物が、（Ｒ）－Ｎ－エチル－５－フルオロ－Ｎ－イソプロピル－２－（（５－（２－（６－（（２－メトキシエチル）（メチル）アミノ）－２－メチルヘキサン－３－イル）－２，６－ジアザスピロ［３．４］オクタン－６－イル）－１，２，４－トリアジン－６－イル）オキシ）ベンズアミドビスベシル酸塩水和物の結晶形態Ａであり、
前記結晶形態が、５．４、７．２、１１．１、１１．９、及び２１．７度の２シータ±０．２度の２シータにピークを含むＸ線粉末回折パターンを生成する、請求項１に記載の化合物。
前記Ｘ線粉末回折パターンが、１３．７、１４．５、１４．７、１５．０、１６．５、１７．８、１９．０、１９．４、及び２０．１度の２シータ±０．２度の２シータから選択される少なくとも１つのピークを更に含み得る、請求項３に記載の結晶形態。
実質的に図１に示されるＸ線粉末回折パターンを更に特徴とする、請求項３又は請求項４に記載の結晶形態。
請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物と、医薬的に許容される担体、医薬的に許容される賦形剤、及び医薬的に許容される希釈剤のうちの少なくとも１つと、を含む、医薬組成物。
医薬的に許容される担体を、治療有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物と混合することを含む、請求項６に記載の医薬組成物を調製するプロセス。
医薬品として使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項６に記載の医薬組成物。
がんの予防又は治療に使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項６に記載の医薬組成物。
白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及び骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）の予防又は治療に使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項６に記載の医薬組成物。
前記白血病が（ＮＰＭ１）変異型白血病である、白血病の予防又は治療に使用するための請求項１０に記載の化合物又は医薬組成物。
がんが、白血病、リンパ腫、骨髄腫又は固形腫瘍がん、例えば、前立腺がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、肝臓がん、黒色腫及び神経膠芽腫から選択される、請求項９に記載の使用のための化合物又は医薬組成物。
白血病の予防又は治療に使用するための請求項１０に記載の化合物又は医薬組成物であって、前記白血病が、急性白血病、慢性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ＭＬＬ再構成白血病、ＭＬＬ－ＰＴＤ白血病、ＭＬＬ増幅白血病、ＭＬＬ陽性白血病、及びＨＯＸ／ＭＥＩＳ１遺伝子発現シグネチャを示す白血病から選択される、化合物又は医薬組成物。
がんから選択される障害を治療又は予防する方法であって、治療有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物又は請求項６に記載の医薬組成物を、治療又は予防を必要とする対象に投与することを含む、方法。
請求項３～５のいずれか一項に記載の結晶形態を調製するプロセスであって、化合物Ａを再結晶する工程を含み、前記再結晶が、
ａ）化合物Ａ又はその水和物若しくは溶媒和物を、ベンゼンスルホン酸の存在下で、適切な溶媒の混合物に添加し、約２０℃から溶媒還流温度の範囲の温度に調整する工程と、
ｂ）結晶形態Ａを播種する工程と、
ｃ）請求項３～５のいずれか一項に記載の結晶形態の沈殿物を得る工程とを含む、プロセス。
前記適切な溶媒の混合物が、アセトン、水及びＩＰＡｃの混合物である、請求項１５に記載のプロセス。
前記適切な溶媒の混合物が、イソプロパノール、水及びＩＰＡｃの混合物である、請求項１５に記載のプロセス。
前記温度が約２５℃である、請求項１５、請求項１６又は請求項１７に記載のプロセス。
クエン酸塩の結晶形態であって、
５．８２、１０．０９、及び１８．４２度の２シータ±０．２度の２シータにピークを含むＸ線粉末回折パターンを生成する、結晶形態。
適切な溶媒中、カップリング剤ＣＤＩの存在下で５－フルオロ－２－ヒドロキシ－安息香酸を反応させることによる一段階反応によってＮ－エチル－５－フルオロ－２－ヒドロキシ－Ｎ－イソプロピルベンズアミドを提供する方法