JP2024521876A

JP2024521876A - 変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ

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Publication number: JP2024521876A
Application number: JP2023573663A
Authority: JP
Inventors: モントヤ，ギレルモ; デルレイ，アートゥロカラビアス; フルサン，アンダース; ステラ，ステファノ
Original assignee: ユニバーシティオブコペンハーゲン
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本発明は、対応する野生型Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼと比較して変化した活性または改善された特性を有する変異体Ｃａｓ１２ｊ（ＣａｓΦとしても知られる）エンドヌクレアーゼ、及び変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを使用する方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、対応する野生型Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼと比較して変化した活性または改善された特性を有する変異体Ｃａｓ１２ｊ（ＣａｓΦとしても知られる）エンドヌクレアーゼに関する。核酸配列を検出及び定量化するための方法、ならびに疾患を診断するための方法も開示される。

微生物とその侵入物との間の競争は、可動遺伝因子（ＭＧＥ）の攻撃を防ぐために広範囲にわたる防御システムの進化を押し進めている。それらの中でも、ＣＲＩＳＰＲは、エフェクターリボヌクレオタンパク質複合体を組み立てるＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）及びＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）によって達成される一種の適応免疫を構成し、それらの複合体は、干渉のために相補的ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を認識して切断するためにｃｒＲＮＡによってガイドされる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼは、ゲノム編集のためのツールとして広く使用されている。特定のＤＮＡ部位を標的とするためのガイドＲＮＡの再設計、ならびにタンパク質スキャフォールドの操作によって、生物医学及び生物工学用途におけるゲノム改変のための強力な方法が提供された。

原核生物の中では普遍的に多様化されているが、ＣＲＩＳＰＲ系はバクテリオファージのゲノム内でも同定された。近年、Ｃａｓ１２ｊとしても知られている、ＣａｓΦタンパク質と呼ばれるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの新しいクラス２ファミリーが、「巨大」ファージのｂｉｇｇｉｅｐｈａｇｅクレードで見つかった。ＣａｓΦタンパク質は、他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと７％未満の配列同一性を共有し、クラス２Ｖ型メンバーとＲｕｖＣドメインでのみ配列及び構造相同性を示す。ＣａｓΦＲＮＰは、クラス２Ｖ型ヌクレアーゼの他のメンバーと同様に、ｃｒＲＮＡに相補的なｓｓＤＮＡ分子での活性化後に、突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、非特異的ｓｓＤＮＡ切断を解く。さらに、ＣａｓΦ１及びＣａｓΦ２のＲｕｖＣ触媒部位はまた、前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）を処理する。ＣａｓΦエンドヌクレアーゼは、最小のＴリッチＰＡＭでプロトスペーサーを認識し、それらの小さいサイズ（７００～８００残基）と、機能的なＲＮＰを構築するためのトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の欠如とにより、ＣａｓΦは小型化されたＲＮＡガイドヌクレアーゼの独自のファミリーとされる。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター複合体は、ゲノム編集アプローチのためにインビトロ及びインビボで強化されるが、特に、後者は、本分野において満たされていない主要なニーズの１つである送達の問題によって制限されている。アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、遺伝子送達に一般に用いられる。それにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター複合体をコードする遺伝子をＡＡＶベクターにパッケージングすることは、その能力が限られているため困難であり、したがって、追加の調節因子の挿入のためのスペースがほとんどない。近年、ＣａｓΦ酵素が、哺乳動物及び植物細胞２においてゲノム編集を媒介し、ゲノム操作ツールの本発明者らのレパートリーを拡大することが示されている。小さいサイズのＣａｓΦＲＮＰは、送達に使用されるＡＡＶベクターにおけるパッキング問題を軽減することによってゲノム編集アプローチを改善することができる。

しかしながら、ＣａｓΦヌクレアーゼによる標的ＤＮＡの認識、開裂、及びその後の切断の詳細な分子機構に関する疑問には、構造情報が得られないため、答えは得られていない。これらのＣａｓΦヌクレアーゼエンドヌクレアーゼは、自然界で作用するのと同様に、すなわち、特定の標的配列に対して同じ要件、同じパターン及び切断の特異性などに対して同じ要件で使用されることに限られている。したがって、これらの酵素の完全な潜在能力を見いだし、公知の用途ならびに新規の用途での使用に向けてそれらを最適化する必要がある。

本開示は、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸標的配列において一本鎖切断または二本鎖切断を導入することができる変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ、例えば、変異体ＣａｓΦ－３ヌクレアーゼに関する。さらに、本開示の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸標的に、前記核酸を切断することなく、結合することができる。

本明細書に開示される新規変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼに対していくつかの利点、例えば、より高いレベルの小型化、変更されたＰＡＭ配列要件、または改善された特異性及び／もしくは酵素活性などを示し、標的核酸配列の検出及び定量化に有利に使用することができる。

最後に、本明細書に開示される新規変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、疾患の診断にも使用することができ、これは、例えば、疾患の原因となる感染因子に由来する遺伝物質を検出することによるものである。

したがって、いくつかの態様では、本開示は、ポリペプチド配列を含む変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記ポリペプチド配列は、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を以下に対して有する：
ｉ）配列番号３の残基１～２０、３６～９７、１０４～１１９、１５１～１７９、２０４～３７９、３９６～６１９、６５１～６７９及び７０１～７２６に対応する配列であって、前記ポリペプチド配列はさらに、
ａ．配列番号３の残基２１～３５に対応するＮＰＩＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｂ．配列番号３の残基９８～１０３に対応するＴＰＩＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｃ．配列番号３の残基１２０～１５０に対応するＴＰＩＤドメインの第２の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｄ．配列番号３の残基１８０～２０３に対応するＴＰＩＤドメインの第３の領域、またはＲＢＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｅ．配列番号３の残基３８０～３９５に対応するＲＢＤドメインの第２の領域、またはＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｆ．配列番号３の残基６２０～６５０に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｇ．配列番号３の残基６８０～７００に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｈ．配列番号３の残基７２６～７６６に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第３の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異
を含む、前記配列、
及び／または、
ｉｉ）配列番号３であって、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基２６、３０、５４、５５、１２３、１９７、３５５、３６０、４１３、６１８、６２５、６２６、６３０、６４３、６７３、６７５、６７６、６８０、６８３、６９１、６９８、７０１及び７０８に対応する位置から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記配列番号３。

いくつかの態様において、本明細書に記載される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログをコードするポリヌクレオチドが提供される。

いくつかの態様では、本開示は、上記で定義される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼもしくはそのオルソログをコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列を含む組換えベクターを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、プロモーターに作動可能に結合している。

したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、または本明細書に開示される組換えベクターを発現することができる細胞を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の発現のための系を提供し、前記系は、
ａ．本明細書に開示されるポリヌクレオチド、または変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼもしくはそのオルソログをコードするポリヌクレオチドを含む本明細書に開示される組換えベクター、及び
ｂ．任意にプロモーターに作動可能に連結される、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組換えベクター
を含む。

いくつかの態様において、本開示は、第１の標的核酸に核酸切断を導入する方法を提供し、この方法は、
ａ．プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第２の標的核酸を認識することができるガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計するステップ、
ｂ．ステップａ．のｃｒＲＮＡを、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログと接触させるステップであって、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、本明細書に開示されているものか、または本明細書に開示されるポリヌクレオチドもしくはベクターによってコードされ、それによって前記第２の標的核酸に結合することができるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を得るステップ、及び
ｃ．ｃｒＲＮＡ及び変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを前記第１の標的核酸と接触させるステップ
を含み、それによって、１つ以上の核酸切断を前記第１の標的核酸に導入する。

いくつかの態様では、本開示は、第１の標的核酸に核酸切断を導入するための方法におけるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の使用を提供し、
ａ．変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログを、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と接触させ、それにより第２の標的核酸を認識することができるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を取得し、ここで、第２の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、請求項１～５４のいずれか１項に記載され、
ｂ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を、第１の標的核酸と接触させ、
それにより、第１の標的核酸配列において核酸切断が生成される。

いくつかの態様では、哺乳動物細胞内で第２の標的核酸に部位特異的な二本鎖切断を導入するインビトロ方法が提供され、方法は、哺乳動物細胞内に、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を導入することを含み、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である。

いくつかの態様では、サンプル中の第２の標的核酸を検出する方法が提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、提供すること、
ｃ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体及びｓｓＤＮＡを、少なくとも１つの第２の標的核酸を含むサンプルと接触させること、及び
ｄ．蛍光体からの蛍光シグナルを検出することによりｓｓＤＮＡの切断を検出すること
を含み、それによりサンプル中の第２の標的核酸の存在を検出し、ステップｃ．は、任意にｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の活性化を含む。

いくつかの態様では、サンプル中の第２の標的核酸を検出して、任意に定量化する方法も提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、
ｉ．変異体Ｃａｓ１２ｊは、抑制されたエンドヌクレアーゼ活性を有し、
ｉｉ．変異体Ｃａｓ１２ｊは、検出可能なタンパク質標識を含み、かつ
ｉｉｉ．ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供することと、
ｂ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を、少なくとも１つの第２の標的核酸を含むサンプルと接触させることと、
ｃ．タンパク質標識、例えば蛍光シグナルを検出することにより、第２の標的核酸の存在を検出して、任意に定量化することと、を含む。

いくつかの態様では、対象における疾患を診断するためのインビトロ方法が提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、提供すること、
ｃ．対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、第２の標的核酸を含むか、または前記第２の標的核酸を含むことが疑われる、提供すること、及び
ｄ．先行請求項のいずれか１項で定義された第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、
を含み、第２の標的核酸は、疾患と相関する核酸断片であり、例えば、第２の標的核酸は、疾患のバイオマーカーであり、
それによって対象における疾患を診断する。

したがって、いくつかの態様では、対象における感染性疾患を診断するためのインビトロ方法が提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、提供すること、
ｃ．対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、第２の標的核酸を含むか、または前記第２の標的核酸を含むことが疑われる、提供すること、及び
ｄ．先行請求項のいずれか１項で定義された第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、を含み、
第２の標的核酸は、疾患を引き起こす感染病原体のゲノムの核酸またはその断片であり、
それによって対象における感染性疾患を診断する。

標的ＤＮＡ切断後のＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼＲループ複合体のＣｒｙｏ－ＥＭ構造を示す。Ｔ鎖及びＮＴ鎖のＰＡＭ相互作用ドメイン（ＴＰＩＤ、ＮＰＩＤ）、ＲＮＡハンドル結合ドメイン（ＲＢＤ）、ブリッジヘリックス（ＢＨ－Ｉ及びＢＨ－ＩＩ）、挿入（アミノ酸６２１～６４７）を含むＲｕｖＣドメイン及び停止（ＳＴＰ）ドメインを含むＣａｓΦ３のドメインアーキテクチャ。標的ＤＮＡ切断後のＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼＲループ複合体のＣｒｙｏ－ＥＭ構造を示す。ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡにより形成されるＲループの概略図。三角形は、Ｔ鎖及びＮＴ鎖におけるホスホジエステル切断位置を表し、明るいフォントのヌクレオチドは、構造中に視覚化されていないものを表す。標的ＤＮＡ切断後のＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼＲループ複合体のＣｒｙｏ－ＥＭ構造を示す。２．７Åの分解能でのＣａｓΦ３／Ｒループ複合体のｃｒｙｏ－ＥＭマップ。標的ＤＮＡ切断後のＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼＲループ複合体のＣｒｙｏ－ＥＭ構造を示す。触媒部位におけるＲループ構造、２つのヌクレオチド及び２価の金属イオンの図（明確にするためにポリペプチドは省略されている）。標的ＤＮＡ切断後のＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼＲループ複合体のＣｒｙｏ－ＥＭ構造を示す。ＣａｓΦ３－ＲＮＡ－標的ＤＮＡ三元複合体の概要。ＣａｓΦ３のＰＡＭ認識、ワトソンクリックｄＡ－１：ｄＴ＋１対のアンカップリング、及び開裂を示す。ＣａｓΦ３－Ｒループ複合体の表面図。白い破線の矢印は、ｄＧ－２後のＤＮＡヌクレアーゼ部位へのＮＴ鎖の予測経路を示している。ＣａｓΦ３のＰＡＭ認識、ワトソンクリックｄＡ－１：ｄＴ＋１対のアンカップリング、及び開裂を示す。保存されたＫ２６、Ｋ３０、Ｑ１２３及びＱ１９７残基の相互作用を示す、ＰＡＭヌクレオチド認識及びｄｓＤＮＡ巻き戻しの詳細図。ＣａｓΦ３のＰＡＭ認識、ワトソンクリックｄＡ－１：ｄＴ＋１対のアンカップリング、及び開裂を示す。ｄＴ＋１／ｄＡ－１対のアンカップリング、リン酸塩反転及び解凍のズーム。ｂ）及びｅ）における黒色の破線は、２．２Å～３．２Åの極性相互作用を表す。ＣａｓΦ３のＰＡＭ認識、ワトソンクリックｄＡ－１：ｄＴ＋１対のアンカップリング、及び開裂を示す。ＣａｓΦ３野生型（ＷＴ）及び変異体を使用する、代表的なｄｓＤＮＡ切断アッセイ。オリゴヌクレオチド３Ｆ－Ｔ－ＡＡＧ－３０及び５Ｆ－ＮＴ－ＴＴＣ－３０を基質として使用した。Ｔ鎖（ＴＳ）及びＮＴ鎖（ＮＴＳ）産生物をマークする。各実験を３～６回繰り返した。ＣａｓΦ３のＰＡＭ認識、ワトソンクリックｄＡ－１：ｄＴ＋１対のアンカップリング、及び開裂を示す。ｄ）に示される切断実験に基づく活性の定量化。バーは、平均±ｓ．ｄ．を表す。ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの集合がＲｕｖＣポケット内で触媒作用を活性化することを示す。ｃｒＲＮＡとＲｕｖＣ挿入における残基との相互作用を示すハイブリッドの図。ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの集合がＲｕｖＣポケット内で触媒作用を活性化することを示す。ＲｕｖＣ挿入の「プラグ」とＳＴＰドメインの空洞との間の疎水性相互作用を示す挿入図である。ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの集合がＲｕｖＣポケット内で触媒作用を活性化することを示す。ＣａｓΦ３野生型（ＷＴ）及び変異体を使用した代表的なｄｓＤＮＡ切断アッセイ。オリゴヌクレオチド３Ｆ－Ｔ－ＡＡＧ－３０及び５Ｆ－ＮＴ－ＴＴＣ－３０を基質として使用した。Ｔ鎖（ＴＳ）及びＮＴ鎖（ＮＴＳ）産生物が示される。各実験を３回繰り返した。ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの集合がＲｕｖＣポケット内で触媒作用を活性化することを示す。ｃ）に示される切断実験に基づく活性の定量化。バーは、平均±ｓ．ｄ．を表す。ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの集合がＲｕｖＣポケット内で触媒作用を活性化することを示す。ジヌクレオチド及び２価金属を含有するＲｕｖＣ触媒部位の詳細図を表す。Ｄ７０８の側鎖及び関連する距離は、視覚化の目的で示されている。ａ）及びｅ）中の黒色の破線は、２．０～３．５Åの間の極性相互作用を表す。ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの集合がＲｕｖＣポケット内で触媒作用を活性化することを示す。標的ｓｓＤＮＡオリゴによって引き起こされるトランスｓｓＤＮＡ非特異的活性。破線の四角形で示すように、変異体Ｒ６４３Ａ及びＲ６４３Ｅは特異的ｄｓＤＮＡ切断活性（Ｃ－Ｄ）を損なわない。しかしながら、それらは、非特異的ｔｒａｎｓｓｓＤＮＡ活性（Ｆ－Ｇ）を消失させる。ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの集合がＲｕｖＣポケット内で触媒作用を活性化することを示す。ｄｓＤＮＡオリゴ（Ｇ）によって引き起こされるトランスｓｓＤＮＡ非特異的活性。破線の四角形で示すように、変異体Ｒ６４３Ａ及びＲ６４３Ｅは特異的ｄｓＤＮＡ切断活性（Ｃ－Ｄ）を損なわない。しかしながら、それらは、非特異的ｔｒａｎｓｓｓＤＮＡ活性（Ｆ－Ｇ）を消失させる。ＣａｓΦ３ＰＡＭ依存ＤＮＡ認識、巻き戻し及び切断のモデルを示す。これは、ＣａｓΦ３ヌクレアーゼの突出標的ＤＮＡ切断を絵で描写したモデルである。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。ＣａｓΦ３野生型（ＷＴ）によって生成された代表的なｄｓＤＮＡ切断パターン。Ｔ鎖（ＴＳ）及びＮＴ鎖（ＮＴＳ）産生物を記しており、ＮＴ鎖の－１３、－１４及び－１５の位置で切断を示し、Ｔ鎖は＋２３の位置で切断される。二重標識された二重鎖の配列が下に示され、切断の位置（三角形）及び標識された産生物のサイズが記されている。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。異なる長さの特定の標的ｓｓＤＮＡによる活性化後の非特異的ｓｓＤＮＡ分解。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。異なる長さの特定のｄｓＤＮＡ活性剤で活性化した後の非特異的ｓｓＤＮＡ分解。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。ｂ）及びｃ）に示された結果の概略図の絵。非特異的ｓｓＤＮＡ切断の活性化が、１２～３０ｎｔで観察された。（ｉ）ＣａｓΦ３ＲＮＰのＲｕｖＣドメインが阻害される。非特異的な切断の完全な活性化が、１２～１８ｎｔのｃｒＲＮＡと対を成すｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性剤を使用する場合に観察された（ｉｉ及びｉｖ）。ｓｓＤＮＡ（ｉｉｉ）またはｄｓＤＮＡ（ｖ）としてより長いオリゴマーを使用すると、おそらくＴ鎖及びＮＴ鎖による触媒部位の立体的閉塞のために、切断効率が低下した。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。二価金属イオンに対するＤＮＡ切断依存性。Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｃｏ^２＋、及びＮｉ^２＋金属イオンは、ＣａｓΦ３活性をサポートするが、Ｃａ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋はしない。ＥＤＴＡによるカチオンの枯渇は、ホスホジエステルの加水分解を抑制する。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。標的ｄｓＤＮＡを用いた切断アッセイは、異なる酵素と基質の比率での異なる鎖の切断産生物を示す。切断及び非切断ｄｓＤＮＡ基質の定量化を平均±ｓ．ｄ．としてグラフに示す。曲線は、１：１の比に達した場合の非切断基質の増加を示している。漸近の挙動がＮＴ鎖産生物について観察される。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。ＣａｓΦ３による切断反応の時間経過を示す図である。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼは、Ｔ鎖については約１２０分で反応が完了し、ＮＴ鎖の切断は２０分で完了する。ＣａｓΦ３エンドヌクレアーゼの生化学的特性を示す。Ｃ末端の３９残基を欠くＣａｓΦ３－ΔＣＴ変異体による切断反応の時間経過。示される実験は、少なくとも３回の反復の代表的なものである。ＰＡＭ特異性及びｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドアセンブリを示す。異なるＰＡＭ配列を含むまたはＰＡＭ配列を含まない基質として標的ｄｓＤＮＡを使用する、ＣａｓΦ３のＷＴ及びＰＡＭ相互作用変異体を用いた切断アッセイ。ＰＡＭ特異性及びｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドアセンブリを示す。活性剤として異なるＰＡＭ配列を含むかまたはＰＡＭ配列を含まない１８－ｎｔｄｓＤＮＡを使用する非特異的ｓｓＤＮＡ分解アッセイのＣａｓΦ３活性化。ＰＡＭ特異性及びｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドアセンブリを示す。ＰＡＭなしの１８－ｎｔｓｓＤＮＡまたはＰＡＭありの１８－ｎｔｄｓＤＮＡでの活性化後の、ＣａｓΦ３ＷＴ、及びＰＡＭ認識（Ｋ３０Ａ／Ｑ１２３Ａ／Ｑ１９７Ａ）、巻き戻し（Ｋ５５Ａ）、及びＲｕｖＣ挿入（Ｒ６４３Ｅ）に関与する代表的な変異体による非特異的ｓｓＤＮＡ分解。ＰＡＭ特異性及びｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドアセンブリを示す。ｃ）に示された実験の結果を説明する概略図。示されるゲルは３回の独立した実験の代表的なものである。

本発明は特許請求の範囲において定義される。

本開示は、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ及びそれらの使用に関する。本開示全体を通して、「変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ」は、自然に発生する変異体、例えば、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を保有するＣａｓ１２ｊ遺伝子によってコードされる変異体、または自然に発生しない変異体、例えば、Ｃａｓ１２ｊ遺伝子の直接変異誘発またはランダム変異誘発によって得られる変異体であり得る。

定義
本明細書で使用される「コドン」という用語は、特定のアミノ酸をコードする隣接するヌクレオチドのトリプレットを指す。

本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリーのメンバーを指す。原核生物適応免疫系ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ及びＣＲＩＳＰＲ－関連タンパク質）は、ＲＮＡガイド認識により標的ＤＮＡ配列を結合及び切断することができる。それらの分子アーキテクチャによれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の様々なメンバーは、２つのクラスに分類されている：クラス１は、いくつかのエフェクタータンパク質を包含し、クラス２系は、単一の要素を使用する（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，２０１５）。Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、いくつかのファージゲノムに存在するクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼの新しいメンバーとして記載されている（Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．，２０２０）。

本明細書で使用される「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指す。いくつかのエンドヌクレアーゼは特異的であり、すなわち、それらは切断部位を指示する所与のヌクレオチド配列を認識する。エンドヌクレアーゼの一例は、ニッキングエンドヌクレアーゼである。本明細書で使用されるニッキングエンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの１本を切断して「ニッキングされた」ＤＮＡ分子を生成する（「ニッカーゼ」活性）酵素を指す。本明細書で使用されるニッキングエンドヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡの一本鎖を切断するエンドヌクレアーゼも指す。

本明細書で使用される「断片」という用語は、核酸またはポリペプチドの非全長の部分を示す。したがって、断片は、それ自体がそれぞれ核酸またはポリペプチドでもある。ＤＮＡ断片は、本開示を通じて５’末端から開始して指定される。

本明細書で使用される「遺伝子編集」という用語は、ヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを挿入、削除または置換するための遺伝子工学手法の使用を指す。

「ガイドＲＮＡ」という用語は、本明細書では「ｃｒＲＮＡ」と互換的に使用され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、特にＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼによる標的核酸配列の認識に必要とされるＲＮＡ分子を指す。

相同体または機能的相同体は、参照ポリペプチドと少なくとも一部の配列同一性を示し、元の機能の少なくとも１つの態様を保持した任意のポリペプチドであり得る。本明細書において、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの機能的相同体とは、前記Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはその断片と少なくとも一部の配列同一性を共有するポリペプチドであって、前記Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼと同様にエンドヌクレアーゼとして機能する能力を有する、すなわち、ｃｒＲＮＡに特異的に結合し、標的核酸を特異的に認識し、結合して切断することができるポリペプチドである。

本明細書で使用される「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」という用語は、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ系などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によって標的にされるＤＮＡ配列のすぐ下流にあるＤＮＡ配列を指す。ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体のｃｒＲＮＡは、ＰＡＭを含む標的ＤＮＡ配列のみを認識してハイブリダイズすることができる。

本明細書で使用される「認識」という用語は、ヌクレオチド配列を同定するための分子の能力を指す。例えば、酵素またはＤＮＡ結合ドメインは、核酸配列を潜在的な基質として認識し、それに結合し得る。好ましくは、認識は特異的である。

本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、比較ウィンドウにわたって同一である２つのポリヌクレオチド配列（すなわち、ヌクレオチド毎に基づいて）を指す。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較し、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、もしくはＩ）が生じる位置の数を決定して、整合された位置の数を得、整合された位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質に適用されるように、アミノ酸配列の同一性の程度は、これらのアミノ酸配列によって共有される位置における同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、これらのアミノ酸配列によって共有されている位置におけるアミノ酸の数、すなわち構造的に関連したアミノ酸の数の関数である。

配列同一性の全体的なパーセンテージは、デフォルトギャップ重みを使用して、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅＲｅｌｅａｓｅ７．０のアルゴリズムＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、またはＦＡＳＴＡで決定される。

「対応する配列」、「対応する領域」または「対応する残基」という用語は、当該技術分野で一般的に理解されているように、第１及び第２の配列が比較のために最適に位置合わせされる場合、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列上の領域または残基と同じ（すなわち、同等の）位置を占める第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列上の領域または残基を指す。したがって、第１のペプチド配列中の第１の位置の残基は、必ずしも第２のペプチド配列中の同じ第１の位置の残基に対応する必要はないが、その代わりに、第１及び第２のペプチド配列が最適に位置合わせされる場合、前記第１のペプチド配列の前記第１の位置の残基と最適に位置合わせされる第２のペプチド配列中の第２の位置の残基に対応し得る。前記位置合わせは、当該技術分野において公知の任意の方法により、例えば、ＮｅｅｄｌｅｐｒｏｇｒａｍｏｆｔｈｅＥＭＢＯＳＳｐａｃｋａｇｅ（ＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）で実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して、好ましくはバージョン５．０．０以降（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）により実施され得る。使用されるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ拡張ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスであり得る。

本明細書で使用される「相互作用標識」または「相互作用標識のセット」という用語は、隣接して配置される場合、相互作用することができる少なくとも１つの蛍光体及び少なくとも１つのクエンチャーを指す。相互作用標識がクエンチャーに隣接して配置される場合、クエンチャーは蛍光体シグナルをクエンチすることができる。相互作用は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって媒介され得る。

本明細書で使用される「隣接して配置される」という用語は、互いに近接した２つの物体の間の物理的距離を指す。蛍光体とクエンチャーとが隣接して配置されると、クエンチャーは、蛍光体シグナルを部分的または完全にクエンチすることができる。ＦＲＥＴクエンチは、典型的には最大約１００Åの距離にわたって生じ得る。本明細書で使用される隣接して配置されるとは、１００Å以下及び／または約１００Åの距離を指す。

本明細書で使用される「蛍光標識」または「蛍光体」という用語は、光励起によって光を再放出することができる蛍光化合物を指す。蛍光体は、特定の波長の光エネルギーを吸収し、より長い波長の光を再放出する。吸収された波長、エネルギー移動効率、及び放出前の時間は、励起状態にある分子が周囲の分子と相互作用するため、蛍光体構造及びその化学環境の両方に依存する。最大吸収（≒励起）及び発光（例えば、吸収／発光＝４８５ｎｍ／５１７ｎｍ）の波長は、所定の蛍光体を指すために使用される典型的な用語であるが、スペクトル全体を考慮することが重要であり得る。

本明細書で使用される「クエンチ」または「クエンチング」という用語は、蛍光体などの所定の物質の蛍光強度を低減する任意のプロセスを指す。クエンチングは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって媒介され得る。ＦＲＥＴは、供与体（例えば、蛍光体）と受容体（例えば、クエンチャー）の遷移ダイポールの間の古典的なダイポール－ダイポール相互作用に基づいており、供与体－受容体距離に依存する。ＦＲＥＴは、典型的には最大１００Åまでの距離にわたって発生することができる。ＦＲＥＴはまた、供与体－受容体のスペクトルの重なり、及び供与体及び受容体の遷移双極子モーメントの相対的な配向に依存する。蛍光体のクエンチングも、蛍光体と他の蛍光体または非蛍光分子との間に非蛍光性複合体が形成された結果として生じうる。この機構は、「接触クエンチング」、「静的クエンチング」、または「基底状態の複合形成」として知られている

本明細書で使用される「クエンチャー」という用語は、蛍光体などの、所定の物質をクエンチすることができる化合物を指す。

本明細書で使用する場合、「標的鎖」は、ｃｒＲＮＡと相互作用してｃｒＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを形成する核酸鎖を指す。「非標的鎖」は、標的鎖に対して相補的である。

本明細書で使用される「オルソログ」という用語は、特定の事象によって分離された同じ祖先の配列に由来すると推測される遺伝子（及び前記遺伝子によってコードされるタンパク質）を指し、ある種が２つの別個の種に分岐する場合、得られた２つの種における単一の遺伝子のコピーはオルソログであると言われる。オルソログ、またはオルソログ遺伝子は、最後の共通祖先の単一の遺伝子からの垂直系統によって発生した異なる種の遺伝子である。Ｃａｓ１２ｊのオルソログは、本系との配列類似性に基づいて識別及び特徴付けることができる。

変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ
発明者らは、異なる酵素活性に関与するＣａｓａ１２ｊファミリーメンバーＣａｓΦ－３（配列番号３）のいくつかのドメインを同定し、特徴付けた。図１Ａに、ＣａｓΦ－３（配列番号３）のドメイン構成の概要を示す。

この情報を使用して、本発明者らは、変異した場合にＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼファミリーメンバーの酵素活性を改善または改変するいくつかの重要な領域及び重要な残基を同定した。

特に、ＣａｓΦ－３（配列番号３）の場合、以下の領域の改変によってタンパク質の酵素活性が改善または改変される：
・ＮＰＩＤドメインの第１の領域、前記ＮＰＩＤドメインの第１の領域は、配列番号３の残基２１～３５を定義する、
・ＴＰＩＤドメインの第１の領域、前記ＴＰＩＤドメインの第１の領域は、配列番号３の残基９８～１０３として定義される、
・ＴＰＩＤドメインの第２の領域、前記ＴＰＩＤドメインの第２の領域は、配列番号３の残基１２０～１５０として定義される、
・ＴＰＩＤドメインの第３の領域またはＲＢＤドメインの第１の領域、前記ＴＰＩＤドメインの第３の領域及び前記ＲＢＤドメインの第１の領域は、配列番号３の残基１８０～２０３として定義される、
・ＲＢＤドメインの第２の領域またはＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域、前記ＲＢＤドメインの第２の領域及び前記ＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域は、配列番号３の残基３８０～３９５として定義される、
・ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域、前記ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域は、配列番号３の残基６２０～６５０として定義される、
・ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域、前記ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域は、配列番号３の残基６８０～７００として定義される、
・ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第３の領域、前記ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第３の領域は、配列番号３の残基７２６～７６６として定義される。

これらの領域のいずれかにおけるアミノ酸の置換、挿入または欠失は、本明細書で以下に詳述するように、改変された酵素活性を生じさせ得る。ＣａｓΦ－３以外の他のＣａｓ１２ｊファミリーメンバーにおける対応する領域の改変によって、同様の改善または改変された酵素活性を提供することができる。

さらに、酵素活性にとって重要であると思われる重要な残基が同定され、すなわち、これらの残基のいずれかの変異または欠失も、酵素活性を改変する。これらの残基は、ＣａｓΦ－３について、配列番号２６、３０、５４、５５、１２３、１９７、３５５、３６０、４１３、６１８、６２５、６２６、６３０、６４３、６７３、６７５、６７６、６８０、６８３、６９１、６９８、７０１及び７０８の位置にある。他のＣａｓ１２ｊファミリーメンバーにおけるこれらの位置に対応する残基は、酵素活性について同様に重要であり得、すなわちこれらの残基のいずれかの変異または欠失も、酵素活性を改変する。

したがって、本開示は、変更された活性を有する改変されたＣａｓ１２ｊタンパク質に関する。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－１（配列番号１）、ＣａｓΦ－２（配列番号２）、ＣａｓΦ－３（配列番号３）、ＣａｓΦ－４（配列番号４）、ＣａｓΦ－５（配列番号５）、ＣａｓΦ－６（配列番号６）、ＣａｓΦ－７（配列番号７）、ＣａｓΦ－８（配列番号８）、ＣａｓΦ－９（配列番号９）、及びＣａｓΦ－１０（配列番号１０）からなる群から選択されるＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－１（配列番号１）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－２（配列番号２）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－３（配列番号３）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－４（配列番号４）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－５（配列番号５）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－６（配列番号６）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－７（配列番号７）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－８（配列番号８）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－９（配列番号９）の変異体である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＣａｓΦ－１０（配列番号１０）の変異体である。好ましい実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、変異体ＣａｓΦ－１、例えば変異体ＣａｓΦ－２、または例えば変異体ＣａｓΦ－３である。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、Ｂｉｇｇｉｅｐｈａｇｅに由来する。例えば、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ＮＣＢＩゲノム／サンプルアクセッション識別子ＥＲＳ４０２６３７０、ＥＲＳ４０２５７２８、ＥＲＳ４０２６３８５、またはＥＲＳ４０２５７３０を有するファージに由来する。

本発明者らは、驚くべきことに、タンパク質の特定のＣ末端切断によって、酵素の触媒活性が維持され、タンパク質のさらなる小型化を可能にすることを見出した。

したがって、いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基７２７～７６６に対応する配列のＣ末端欠失をさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３１と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～２０及び、３６～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基２１～３５に対応するＮＰＩＤドメインの第１の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である。少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失は、前記ＮＰＩＤドメインの第１の領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の隣接するもしくは非隣接のアミノ酸の置換、挿入または欠失であり得る。

いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～９７及び、１０４～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基９８～１０３に対応するＴＰＩＤドメインの第１の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である。少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失は、前記ＴＰＩＤドメインの第１の領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の隣接するもしくは非隣接のアミノ酸の置換、挿入または欠失であり得る。

いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～１１９及び、１５１～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基１２０～１５０に対応するＴＰＩＤドメインの第２の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である。少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失は、前記ＴＰＩＤドメインの第２の領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の隣接するもしくは非隣接のアミノ酸の置換、挿入または欠失であり得る。

いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～１７９及び、２０４～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基１８０～２０３に対応するＴＰＩＤドメインの第３の領域またはＲＢＤドメインの第１の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である。少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失は、前記ＴＰＩＤドメインの第３の領域または前記ＲＢＤドメインの第１の領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の隣接するもしくは非隣接のアミノ酸の置換、挿入または欠失であり得る。

いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～３７９及び、３９６～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基３８０～３９５に対応するＲＢＤドメインの第２の領域またはＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である。少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失は、前記ＲＢＤドメインの第２の領域または前記ＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の隣接するもしくは非隣接のアミノ酸の置換、挿入または欠失であり得る。

いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～６１９及び、６５１～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基６２０～６５０に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である。少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失は、前記ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の隣接するもしくは非隣接のアミノ酸の置換、挿入または欠失であり得る。

いくつかの実施形態では、変異体ＣａｓΦ－３またはそのオルソログなどの、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを提供し、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号３の残基１～６７９及び、７０１～７２６に対応する配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性、例えば１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基６８０～７００に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域に少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含み、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である。少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失は、前記ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の隣接するもしくは非隣接のアミノ酸の置換、挿入または欠失であり得る。

いくつかの実施形態では、前記領域は、異なるタンパク質の別の領域、例えば対応する領域で置換されている。前記ドメイン置換は、酵素に付加的な機能を提供することができ、例えば、ＣａｓΦ－３ＲｕｖＣドメインを対応するＣａｓΦ－１またはＣａｓΦ－２ＲｕｖＣドメインで置換し、ＣａｓΦ－３に前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）を処理する能力を与えるなどの機能を提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に上述されるＣａｓΦ－３の前記ＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域、前記ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域、及び／または前記ＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域は、ＣａｓΦ－１またはＣａｓΦ－２の対応する領域で置換される。対応するＲｕｖＣ－Ｉドメイン及びＲｕｖＣ－ＩＩドメインの例を、本明細書における以下の表１に提供する。

少なくとも１つの置換は、少なくとも１０個のアミノ酸残基、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２５個、例えばなくとも５０個、例えば少なくとも７５個、例えば少なくとも１００個、例えば少なくとも１５０個、例えば少なくとも２００個、例えば少なくとも２５０個、例えば少なくとも３００個、例えば少なくとも３５０個、例えば少なくとも４００個、例えば少なくとも４５０個、例えば少なくとも５００個のアミノ酸残基の置換であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換は、１０～５００個のアミノ酸残基の範囲、例えば２５～４５０個のアミノ酸残基の範囲、例えば５０～４００個のアミノ酸残基の範囲、例えば５０～３５０個のアミノ酸残基の範囲、例えば５０～３００個のアミノ酸残基の範囲、例えば５０～３００個のアミノ酸残基の範囲、例えば５０～２５０個のアミノ酸残基の範囲、例えば５０～２００個のアミノ酸残基の範囲、例えば５０～１５０個のアミノ酸残基の範囲、または例えば７５～１５０個のアミノ酸残基の範囲にある。

上記で定義された少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失は、ドメイン中のいくつかのアミノ酸は欠失し、その他のアミノ酸は置換され得ることが理解されるであろう。

上記変異体はいずれも、配列番号３の２６、３０、５４、５５、１２３、１９７、３５５、３６０、４１３、６１８、６２５、６２６、６３０、６４３、６７３、６７５、６７６、６８０、６８３、６９１、６９８、７０１及び７０８の位置に対応する１つ以上の残基に少なくとも１つのアミノ酸置換及び／または欠失を含み得る、またはさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、荷電側鎖を有するアミノ酸の非荷電側鎖を有するアミノ酸への置換である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、荷電側鎖を有するアミノ酸の非極性側鎖を有するアミノ酸残基への置換である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、荷電側鎖を有するアミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、荷電側鎖を有するアミノ酸のグリシンへの置換である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、アミノ酸のアラニンへの置換である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸の置換または欠失は、少なくとも２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失、たとえば少なくとも１４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも２０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも２５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３５個の残基の置換または欠失、または例えば少なくとも４０個の残基の置換または欠失である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＮＰＩＤドメインにある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＴＰＩＤドメインにある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＲＢＤドメインにある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＲｕｖＣ－Ｉドメインにある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＲｕｖＣ－ＩＩドメインにある。

Ｃａｓ１２ｊヌクレアーゼのドメイン位置の例を、以下の表１に提示する。

いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣ－Ｉ及び／またはＲｕｖＣ－ＩＩドメインにおけるアミノ酸置換は、グルタミン酸またはアスパラギン酸ではないアミノ酸の置換である。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＫ２６に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＫ３０に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＦ５４に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＫ５５に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＱ１２３に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＱ１９７に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＬ３５５に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＴ３６０に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＤ４１３に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＥ６１８に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＫ６２５に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＦ６２６に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＧ６３０に対応する位置に置換を含む。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＲ６４３に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３（ＣａｓΦ－３）または配列番号３１のＲ６４３に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、前記置換はＲ６４３Ｅ置換である。前記Ｒ６４３Ｅ置換は、酵素の非特異的エンドヌクレアーゼ活性を抑制し得る。したがって、いくつかの実施形態では、特異的な二本鎖ＤＮＡ切断活性は変化しないのに対して、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの任意の非特異的な一本鎖ＤＮＡ切断活性は抑制される。いくつかの実施形態では、前記置換はＲ６４３Ａ置換である。前記Ｒ６４３Ａ置換は、酵素の非特異的エンドヌクレアーゼ活性を抑制し得る。したがって、いくつかの実施形態では、特異的な二本鎖ＤＮＡ切断活性は変化しないのに対して、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの任意の非特異的な一本鎖ＤＮＡ切断活性は抑制される。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＰ６７３に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＷ６７５に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＴ６７６に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＣ６８０に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＣ６８３に対応する位置に置換を含む。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３（ＣａｓΦ－３）または配列番号３１のＲ６９１に対応する位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、前記置換はＲ６９１Ａ置換である。前記Ｒ６９１Ａ置換は、酵素のエンドヌクレアーゼ活性を抑制し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの特異的な二本鎖ＤＮＡ切断活性、及び／または、任意の非特異的な一本鎖ＤＮＡ切断活性は抑制される。したがって、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの特異的な二本鎖ＤＮＡ切断活性、及び／または、任意の非特異的な一本鎖ＤＮＡ切断活性が完全に失われる。いくつかの実施形態では、前記Ｒ６９１Ａ置換は、ＣａｓΦ－１（配列番号１）におけるＲ６５１Ａ置換に対応する。いくつかの実施形態では、前記Ｒ６９１Ａ置換は、ＣａｓΦ－２（配列番号２）におけるＲ６７８Ａ置換に対応する。

いくつかの実施形態では、変異体Φ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＣ６９８に対応する位置に置換を含む。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＣ７０１に対応する位置に置換を含む。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、配列番号３または配列番号３１のＤ７０８に対応する位置に置換を含む。

いくつかの実施形態では、変異体エンドヌクレアーゼはタンパク質タグにコンジュゲートしている。

いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、ＦＬＡＧタグである。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、ＨＡタグである。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、ビオチンである。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、ストレプタグである。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、ポリ（Ｈｉｓ）タグである。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、酵素、例えばペルオキシダーゼ、ビオチンリガーゼ、または塩基編集酵素、例えばシチジンまたはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、転写因子などの転写調節因子である。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、ＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓまたはフルオレセインのような蛍光タグである。

コンジュゲートされたタンパク質タグを含む本明細書に開示される変異体は、塩基編集、エピジェネティックリモデリング、転写調節、クロマチン構造の調査、及び標的核酸配列の検出及び定量化などの様々な用途において有用である。

本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、野生型エンドヌクレアーゼと比較して１つ以上の改善及び／または変更された活性を有し得る。

いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、標的核酸配列の二本鎖切断に関連する酵素活性における改善及び／または変更である。いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、標的核酸配列の一本鎖切断に関連する酵素活性における改善及び／または変更である。いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、標的核酸認識に関連する酵素活性の改善及び／または変更である。

いくつかの実施形態では、変更された活性は、二本鎖核酸切断を誘導することから一本鎖核酸切断（ニッカーゼ活性）を誘導することへの切断活性の変更である。したがって、いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ニッキングエンドヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、速度を高めた触媒作用である。

いくつかの実施形態では、前記変更された活性は、変更されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列認識である。変更されたＰＡＭ配列認識は、未改変酵素では標的化できない核配列の標的化を可能にする。

いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、突出核酸二本鎖切断の結果として生じるオーバーハングの長さを変更する。いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、したがって、変更された切断パターンである。

いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、オフターゲット切断の頻度の減少である。

いくつかの実施形態では、前記変更された活性は、ヌクレアーゼ活性の阻害である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ｊ変異体は、ヌクレアーゼ死Ｃａｓ１２ｊタンパク質である。前記変異体は、例えば、本明細書でさらに詳述される特定の核酸配列を検出するのに有用であり得る。

いくつかの実施形態では、前記変更及び／または改善された活性は、標的核酸配列に対する特異性の増加である。

Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの最適化された活性のための緩衝液
本発明者らは、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼが特定の金属イオンを含む媒体に含まれている場合、１つ以上の変更及び／または改善された活性、例えば、触媒作用の改善された速度または変更された核酸切断パターンを有することを見出した。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、２価のニッケル（Ｎｉ^２＋）、２価のマンガン（Ｍｎ^２＋）及び／または２価の銅（Ｃｏ^２＋）を含む媒体に含まれる。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、２価のニッケル（Ｎｉ^２＋）を含む媒体に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｎｉ^２＋の濃度は、少なくとも０．２ｍＭ、例えば少なくとも０．５ｍＭ、例えば少なくとも１ｍＭ、例えば少なくとも２ｍＭ、例えば少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭ、例えば０．２ｍＭ～５ｍＭである。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、２価のマンガン（Ｍｎ^２＋）を含む媒体に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｍｎ^２＋の濃度は、少なくとも０．２ｍＭ、例えば少なくとも０．５ｍＭ、例えば少なくとも１ｍＭ、例えば少なくとも２ｍＭ、例えば少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭ、例えば０．２ｍＭ～５ｍＭである。

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、２価の銅（Ｃｏ^２＋）を含む媒体に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃｏ^２＋の濃度は、少なくとも０．２ｍＭ、例えば少なくとも０．５ｍＭ、例えば少なくとも１ｍＭ、例えば少なくとも２ｍＭ、例えば少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭ、例えば０．２ｍＭ～５ｍＭである。

変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド及び組換えベクター
本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、核酸配列、及びベクターもまた提供される。当業者は、このような所望のＣａｓ１２ｊ変異体をコードする核酸配列及び／またはベクターを設計する方法を知っている。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、変異体ＣａｓΦ－１、例えば変異体ＣａｓΦ－２、例えば変異体ＣａｓΦ－３、例えば変異体ＣａｓΦ－４、例えば変異体ＣａｓΦ－５、例えば変異体ＣａｓΦ－６、例えば変異体ＣａｓΦ－７、例えば変異体ＣａｓΦ－８、例えば変異体ＣａｓΦ－９、または例えば変異体ＣａｓΦ－１０である。好ましい実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、変異体ＣａｓΦ－１、例えば変異体ＣａｓΦ－２、または例えば変異体ＣａｓΦ－３である。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、配列番号１１、配列番号１２（ＣａｓΦ－２）、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３３からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチドにコードされる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞内の発現のためにコドン最適化される。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－１エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１１と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－２エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１２と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－３エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１３と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化されたＣ末端切断ＣａｓΦ－３エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３２と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－４エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１４と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－５エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１５と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－６エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１６と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－７エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１７と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－８エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１８と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－９エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１９と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－１０エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２０と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－１エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２１と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－２エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２２と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－３エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２３と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化されたＣ末端切断ＣａｓΦ－３エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３３と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－４エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－５エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２５と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－６エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２６と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－７エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２７と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－８エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２８と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－９エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２９と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現に最適化された変異体ＣａｓΦ－１０エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３０と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、組換えベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列をさらに含み、ｃｒＲＮＡは、コードされたＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼと、標的核酸にハイブリダイズするのに十分な塩基対を有する核酸の断片を結合する。ｃｒＲＮＡは、本明細書の以下の「ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）」の節にさらに記載される。

変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの発現のための細胞及び系
本明細書ではさらに、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの発現のための細胞及び系を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の発現のための系を提供し、前記系は、
ａ．変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼもしくはそのオルソログをコードする本明細書に開示されるポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む本明細書に開示される組換えベクター、及び
ｂ．任意にプロモーターに作動可能に連結される、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組換えベクター
を含む。

いくつかの実施形態では、系は、上記ａ．及びｂ．のポリヌクレオチドまたは組換えベクターの発現のための細胞をさらに含む。

本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドまたは組換えベクターの発現に適した宿主細胞は、当業者に知られている。いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞から発現される。これは、当該技術分野で周知のように、例えば、本明細書で上記の所望の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはオルソログをコードする核酸配列を含むベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に、例えば電気穿孔または化学形質転換によって導入することによって行うことができる。タンパク質は、当該技術分野で周知のように単離及び／または精製され得る。

ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）
エンドヌクレアーゼとして機能するために、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体は、Ｃａｓ１２ｊエフェクタータンパク質だけではなく、切断される標的核酸の認識を担うガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）も必要とする。

ｃｒＲＮＡは、定常領域及び可変領域を含むかまたはこれらからなる。定常領域は、２３～２５ヌクレオチドからなり、所与の生物由来のすべての複合体について一定である。ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の最適な活性のためには、使用されるＣａｓ１２ｊヌクレアーゼまたはそのオルソログに特異的な定常領域に基づいてｃｒＲＮＡを設計することが重要であり得る。

いくつかの実施形態では、定常領域はＣａｓΦ－１に特異的であり、配列番号３４に定義される配列を有する。いくつかの実施形態では、定常領域はＣａｓΦ－２に特異的であり、配列番号３５に定義される配列を有する。いくつかの実施形態では、定常領域はＣａｓΦ－３に特異的であり、配列番号３６に定義される配列を有する。

可変領域は、９～２０ヌクレオチド、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドからなる。可変領域は、標的認識を担うと考えられるｃｒＲＮＡの領域である。したがって、可変領域の配列を改変することは、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体が異なる標的核酸を特異的に切断できるようにするために利用することができる。定常領域とは対照的に、可変領域は特定のＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼに特異的ではない。

したがって、いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と９個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３２ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１０個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３３ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１１個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３４ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１２個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３５ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１３個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３６ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１４個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３７ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１５個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３８ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１６個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３９ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１７個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４０ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１８個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４１ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と１９個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４２ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２３個のヌクレオチドの定常領域と２０個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４３ヌクレオチドの全長を有する。

いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と９個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３３ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１０個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３４ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１１個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３５ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１２個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３６ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１３個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３７ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１４個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３８ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１５個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３９ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１６個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４０ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１７個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４１ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１８個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４２ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と１９個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４３ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２４個のヌクレオチドの定常領域と２０個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４４ヌクレオチドの全長を有する。

いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と９個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３４ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１０個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３５ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１１個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３６ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１２個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３７ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１３個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３８ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１４個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、３９ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１５個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４０ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１６個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４１ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１７個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４２ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１８個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４３ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と１９個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４４ヌクレオチドの全長を有する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２５個のヌクレオチドの定常領域と２０個のヌクレオチドの可変領域からなり、ｃｒＲＮＡは、４５ヌクレオチドの全長を有する。

当業者は、所望の標的核酸に結合することができる可変領域を設計することに困難はないであろう。可変領域は、標的核酸の逆相補体となる配列を有する。

したがって、ｃｒＲＮＡは、２３、２４または２５ヌクレオチドの定常領域、及び９～２０ヌクレオチドで構成される可変領域からなり、例えば前記ｃｒＲＮＡは、少なくとも３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、または４５ヌクレオチド長である。

ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の標的核酸への認識及び結合は、ｃｒＲＮＡの標的核酸への結合に依存する。これは、標的核酸中のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の存在に依存する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’末端にＰＡＭ配列を含む標的核酸配列に結合するように設計されている。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＴＴＮ－３’を含むか、または配列５’－ＴＴＮ－３’からなる。ｃｒＲＮＡは、好ましくは、ＰＡＭ自体にハイブリダイズしない。

ガイドＲＮＡ配列が設計されると、ガイドＲＮＡは既知の方法によって合成することができる。例えば、標的部位の逆相補配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを販売する会社から注文してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、２４塩基長のＴ７プライミング配列を含み得る。これらのＤＮＡ二重鎖は、次いで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる転写反応における鋳型として使用することができる。例えば、反応は、３７℃で少なくとも１時間のインキュベーションで構成され得る。反応は、２倍停止溶液、例えば、５０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０及び８Ｍ尿素を使用して停止させてもよい。ＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿などの当該技術分野で周知の方法で精製され得る。

ゲノム編集のためのｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ゲノム編集に有利に使用され得る。

いくつかの態様において、本開示は、第１の標的核酸に核酸切断を導入する方法を提供し、この方法は、
ａ．プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第２の標的核酸を認識することができるガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計するステップ、
ｂ．ステップａ．のｃｒＲＮＡを、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログと接触させ、ここで、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、本明細書に開示されているものか、または本明細書に開示されるポリヌクレオチドもしくはベクターによってコードされ、それによって前記第２の標的核酸に結合することができるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を得るステップ、及び
ｃ．ｃｒＲＮＡ及び変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを前記第１の標的核酸と接触させるステップ、
を含み、それによって、１つ以上の核酸切断を前記第１の標的核酸に導入する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される上記の方法のステップｂ．及びｃ．が同時に行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される上記の方法のステップｂ．及びｃ．が順次に行われる。

いくつかの実施形態では、第１の標的核酸及び第２の標的核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸及び第２の標的核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸はＤＮＡであり、第２の標的核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸はＲＮＡであり、第２の標的核酸はＤＮＡである。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の標的核酸は二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、互いの相補体である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、二本鎖核酸の同じストレッチである。

いくつかの実施形態では、核酸切断は、一本鎖切断である。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸切断は、第１の標的配列中にある。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸切断は、第２の標的配列中にある。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸切断は、第１の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列において生成される。

いくつかの実施形態では、核酸切断は、ニ本鎖切断である。この場合、第１及び第２の標的配列の双方で核酸切断が生成される。いくつかの実施形態では、二本鎖切断は、突出二本鎖切断である。いくつかの実施形態では、二本鎖切断は、平滑ニ本鎖切断である。

いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、本明細書に開示されるものである。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、本明細書に開示されるものであり、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。

いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、少なくとも１５連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１６連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１７連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１８連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１９連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２０連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２１連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２２連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２３連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２４連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２５連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２６連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２７連続ヌクレオチドの配列を含む認識配列を含むか、またはそれからなるが、但し、５’末端にある３個の核酸は、ＰＡＭ配列からなることを条件とする。

いくつかの実施形態では、第１の標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸は、クロマチンである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸は、ヌクレオソームである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸は、プラスミドＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸は、メチル化ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸は、合成ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸は、ＤＮＡ断片である。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、クロマチンである。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、ヌクレオソームである。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、プラスミドＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、メチル化ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、合成ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、ＤＮＡ断片である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、エクスビボで実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、インビトロで細胞において実施される。

本明細書で上述されるように、第１及び第２の標的核酸は、二本鎖核酸の同じストレッチであり得る。この場合、二本鎖切断を、第１及び第２の標的核酸の両方に導入することができる。

したがって、いくつかの態様では、哺乳動物細胞内で第２の標的核酸に部位特異的な二本鎖切断を導入するインビトロ方法が提供され、方法は、哺乳動物細胞内に、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を導入することを含み、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である。

標的ＤＮＡ配列を検出及び／または定量化するためのｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼのいくつかは、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体のｃｒＲＮＡによってハイブリダイズされない第１の標的配列にのみ一本鎖切断を導入することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体のｃｒＲＮＡが第２の標的配列を認識してハイブリダイズすると、前記複合体の変異体Ｃａｓ１２ｊのニッカーゼ活性が活性化され、これが第１の標的配列の部位に１つ以上の一本鎖切断を導入する。さらに、第２の標的核酸は、Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼによって切断されることはなく、したがってより長期にわたって活性状態を維持し、場合により１つより多くの第１の標的配列を切断することになる。第１の標的配列が、前記第１の標的配列の切断時にシグナルが放出されるように標識されている場合には、本記載の方法は第２の標的配列の検出を可能にする。

したがって、これらの変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体中にある場合、提供された標識された第１の標的配列を用いて、第２の標的配列を検出及び定量化するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、目的の標的核酸である。

したがって、いくつかの態様では、サンプル中の第２の標的核酸を検出する方法が提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、提供すること、
ｃ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体及びｓｓＤＮＡを、少なくとも１つの第２の標的核酸を含むサンプルと接触させること、及び
ｄ．蛍光体からの蛍光シグナルを検出することによりｓｓＤＮＡの切断を検出すること
を含み、それによりサンプル中の第２の標的核酸の存在を検出し、ステップｃ．は、任意にｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の活性化を含む。

ステップｃ．において、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体及びｓｓＤＮＡを少なくとも１つの第２の標的核酸と接触させ、ｃｒＲＮＡと第２の標的核酸、例えば一本鎖または二本鎖の標的ＤＮＡとの認識及び結合により、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を活性化させ、次いで、ｓｓＤＮＡの一本鎖切断、例えば切断を導入することができる。

したがって、工程ｃ．は、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の活性化を含み得る。

方法はさらに、第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定するステップを含み得、第２の標的核酸のレベル及び／または濃度は、切断されたｓｓＤＮＡと相関している。

上記で説明したように、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、第２の標的核酸を切断せず、したがって、本明細書に記載された方法では標識ｓｓＤＮＡまたはその断片であり得る、第１の標的核酸配列において複数回の切断に十分であり得る期間、活性を維持することになる。ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の第２の標的核酸へのハイブリダイゼーション後に、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体によって切断される第１の標的核酸分子が多いほど、シグナルが高くなり、したがって方法の感度が高くなる。これは、開示された変異体Ｃａｓ１２ｊが他のＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼよりも有利な点である。

したがって、本明細書に開示される方法は高い感度を有し、ナノモル範囲以下の濃度で、例えばピコモル範囲以下の濃度で、例えばフェムトモル範囲以下の濃度で、第２の標的核酸の検出を可能にし得る。例えば、本明細書に開示される方法は、アトモル範囲以下の濃度で、第２の標的核酸の検出を可能にする。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、第２の標的核酸を切断し、したがって、切断された第２の標的核酸が放出されるまで活性なままであるであろう。

ｓｓＤＮＡは、鎖に沿った任意の位置の少なくとも１つの塩基で標識され得る。例えば、ｓｓＤＮＡは、鎖に沿った任意の位置の１つの塩基で、例えば鎖に沿った任意の位置の少なくとも２つの塩基で、例えば鎖に沿った任意の位置の少なくとも３つの塩基で、例えば鎖に沿った任意の位置の少なくとも４つの塩基で標識されている。

ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む、少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識され得る。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの色素は、蛍光体である。

したがって、本方法のステップｄ．におけるｓｓＤＮＡの切断は、ｓｓＤＮＡの切断から生じる蛍光シグナルを検出することを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの蛍光体は、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）１、ＢＨＱ２及びＢＨＱ３、ＣｏｓｍｉｃＱｕｅｎｃｈｅｒ（例えば、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＵＳＡ）、ＥｘｃｅｌｌｅｎｔＢｉｏｎｅｅｒＱｕｅｎｃｈｅｒ（ＥＢＱ）（例えば、Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）またはこれらの組み合わせを含む群から選択される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）１、ＢＨＱ２及びＢＨＱ３（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＵＳＡ）からなる群から選択される。

本発明において有用であり得る蛍光体には、当該技術分野で既知の蛍光分子を含み得る。蛍光体の例：Ｃｙ２（商標）Ｃｆｆｌｆｉ）、ＹＯ－ＰＲｎ（商標）－１（５０９）、ＹＤＹＯ（商標）－１（５０９）、Ｃａｌｒｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ（商標）（５１９）、Ａｌｅｘａ（商標）（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０（５２０）、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（商標）５００（５２２）、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（商標）４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（５２５）、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ（商標）（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（５２９）、ＭａｇｎｅｓｉｕｍＧｒｅｅｎ（商標）（５３１）、ＣａｌｃｉｕｍＧｒｅｅｎ（商標）（５３３）、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－Ｉ（５３３）、ＴＯＴＯＩ（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、３０ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３（商標）（５７０）、Ａｌｅｘａ（商標）５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、ＭａｇｎｅｓｉｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）（５７５）、フィコエリトリンＲ＆Ｂ（５７５）、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、ＣａｌｃｉｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）（５７６）、ＰｙｒｏｎｉｎＹ（５８０）、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＲｅｄ（商標）（５９０）、Ｃｙ３．５（商標）（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、ＣａｌｃｉｕｍＣｒｉｍｓｏｎ（商標）（６１５）、Ａｌｅｘａ（商標）５９４３５（６１５）、ＴｅｘａｓＲｅｄ（６１５）、ＮｉｌｅＲｅｄ（６２８）、ＹＯ－ＰＲＯ（商標）－３（６３１）、ＹＯＹＯ（商標）－３（６３１）、ＲＰ３６４９ＰＣ００ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ－Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－３（６６０）、ＴＯＴ０３（６６０）、ＤｉＤＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５（商標）（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＢｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬＦｌｕｏｒＧｏｌｄ５４０（５４４）、ＣＡＬＦｌｕｏｒＯｒａｎｇｅ５６０（５５９）、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ５９０（５９１）、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０（６１０）、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、６－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６－ＦＡＭ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ６７０（７０５）及びＱｕａｓａｒ７０５（６１０）。括弧内の数字は、ナノメートル単位の最大発光波長である。

広い波長範囲または特定の波長の蛍光をクエンチングすることができる非蛍光性の黒色クエンチャー分子が本発明において使用され得る。

蛍光体／クエンチャーの適切な対は当該技術分野で知られている。

本明細書で開示されるように、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、蛍光タンパク質またはアフィニティタグなどのタンパク質タグをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓ１２ｊのエンドヌクレアーゼ活性は抑制されており、したがって、第１または第２の標的核酸配列のいずれにも核酸切断は導入されない。これらの変異体は、標的核酸配列の検出及び／または定量化に特に有用である。

したがって、いくつかの態様では、サンプル中の第２の標的核酸を検出して、任意に定量化する方法が提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、
ｉ．変異体Ｃａｓ１２ｊは、抑制されたエンドヌクレアーゼ活性を有し、
ｉｉ．変異体Ｃａｓ１２ｊは、検出可能なタンパク質標識を含み、かつ
ｉｉｉ．ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供することと、
ｂ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を、少なくとも１つの第２の標的核酸を含むサンプルと接触させることと、
ｃ．タンパク質標識、例えば蛍光シグナルを検出することにより、第２の標的核酸の存在を検出して、任意に定量化することと、を含む。

本明細書に開示される方法は、任意の核酸の存在及びレベルを検出するために使用することができ、したがって、サンプルは、核酸を含み、かつ適切に処理された（例えばプロテアーゼを排除するため）、任意のサンプルであり得る。サンプルは、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含み得る。サンプルは、第２の標的核酸を含むと疑われるサンプルであり得る。サンプルは、原核細胞培養物または真核細胞培養物の培養抽出物、ヒトなどの哺乳動物の体液であり得る。

第２の標的核酸は、ウイルスゲノム、微生物ゲノム、がん遺伝子などの遺伝子、または病原体のゲノムの核酸断片であり得る。

いくつかの実施形態では、第２の標的核酸は、ヒト疾患に関連する核酸配列である。これは、ヒト疾患のバイオマーカーであってよく、例えば、特定の疾患と関連することが多い特定の変異または一塩基多型などである。

第２の標的核酸は、変異核酸配列、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）であってもよい。

サンプル中の第２の標的核酸を検出するための方法に使用される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される変異体のいずれかであり得る。

疾患の診断のためのｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ複合体の使用
本開示はまた、増加／減少した遺伝子発現及び／または外因性遺伝物質の存在に関連するいずれかの疾患の診断方法に関する。

いくつかの態様では、対象における疾患を診断するためのインビトロ方法が提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、提供すること、
ｃ．対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、第２の標的核酸を含むか、または第２の標的核酸を含むことが疑われる、提供すること、及び
ｄ．先行請求項のいずれか１項で定義された第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、
を含み、第２の標的核酸は、疾患と相関する核酸断片であり、例えば、第２の標的核酸は、疾患のバイオマーカーであり、
それによって対象における疾患を診断する。

対象における疾患の診断方法は、前記疾患を治療するステップを更に含み得る。例えば、本方法は、治療的に有効な薬剤を投与することにより前記疾患を治療することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、疾患は、感染性疾患である。

したがって、いくつかの態様では、対象における感染性疾患を診断するためのインビトロ方法が提供され、方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、Ｃａｓ１２ｊは、本明細書に開示される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、提供すること、
ｃ．対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、第２の標的核酸を含むか、または第２の標的核酸を含むことが疑われる、提供すること、及び
ｄ．先行請求項のいずれか１項で定義された第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、
を含み、第２の標的核酸は、疾患を引き起こす感染病原体のゲノムの核酸またはその断片であり、それによって対象における感染性疾患を診断する。

相互作用標識は、例えば発光標識を含み得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、前記感染性疾患を治療するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、前記感染性疾患を、治療的に有効な化合物の投与により治療することをさらに含む。

対象における感染性疾患の診断方法は、前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度をカットオフ値と比較するステップをさらに含み得、前記カットオフ値は、前記感染性疾患を呈していない対象などの健常対象における前記第２の標的核酸の濃度範囲から決定され、
前記カットオフ値よりも大きいレベル及び／または濃度が、前記感染性疾患の存在を示す。

感染性疾患は、感染病原体、例えばウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫、寄生性回虫、ぎょう虫、節足動物、真菌、白癬及び大寄生虫によって引き起こされるいずれかの疾患である。

したがって、第２の標的核酸は、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫、寄生性回虫、ぎょう虫、節足動物、真菌、白癬及び大寄生虫からなる群から選択される感染病原体のゲノムまたはその断片であり得る。

本明細書に開示される方法は、ヒトにおける感染性疾患を診断するために使用され得る。

したがって、第２の標的核酸を含むサンプルは、人体から採取したサンプルによるものであり得る。例えば、サンプルは、血液、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、及び精液からなる群から選択される人体液であり得る。

疾患の診断方法に使用される変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼは、本明細書に記載される変異体のいずれかであり得る。

実施例１－ミニＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦ３の構造
材料及び方法
プラスミド調製、タンパク質の発現及び精製
ＣａｓΦ３のｃＤＮＡを合成し、Ｃ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを用いてｐＥＴ－２１ベクター（Ｇｅｎｅｗｉｚ）にクローニングした。ＣａｓΦ３変異体をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を用いて生成した。ＣａｓΦ３－ΔＣＴを生成するために、残基Ｍ７２６の後にＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）を生成した。Ｈｉｓタグ付きＣａｓΦ３を、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｐＲＡＲＥ細胞内のｐＥＴ－２１から発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む液体Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）培地中で３７℃で、６００ｎｍでの光学濃度が約０．８となるまで増殖させた。タンパク質の過剰発現は、１６℃で１６時間にわたり１５０ｎＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。細胞を遠心分離により回収し、溶解バッファー（５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２ＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、５０ｍｌあたり１錠のＥＤＴＡフリーＣｏｍｐｌｅｔｅ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム）に再懸濁させた。溶解は、１回の凍結－解凍サイクル及び超音波処理によって完了した。細胞抽出物を希釈して最終塩濃度を５００ｍＭとし、高速遠心分離（１０，０００×ｇ、４５分）して、可溶性画分を不溶性画分及び細胞破片から分離した。可溶性画分を、緩衝液ＩＭＡＣ－Ａ（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で平衡化した５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＦＦ粗製カラム（Ｃｙｔｉｖａ）に充填し、結合タンパク質を、緩衝液ＩＭＡＣ－Ｂ（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２００ｍＭＫＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）でイミダゾール濃度を段階的に上昇することにより溶出した。ＣａｓΦ３タンパク質は、約１５０ｍＭのイミダゾールで溶出した。ＣａｓΦ３－ΔＣＴの場合、タンパク質をＴＥＶ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中の０．３ｍｇのＴＥＶプロテアーゼで４℃で１６時間インキュベートすることによってＣ末端セグメント（残基７２７～７６６）を切断した。ＣａｓΦ３を含む画分をプールし、濃縮し、さらにＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、５００ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。純粋なタンパク質を含む画分をプールし、５～１０ｇ／Ｌに濃縮し、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保管した。

切断アッセイ
フルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＤＮＡオリゴヌクレオチド５’末端または３’末端、未標識ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。ｄｓＤＮＡ基質は、ｓｓＤＮＡオリゴをアニーリング緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２００ｍＭのＫＣｌ）中で８０μＭの最終濃度に混合し、９５℃で１０分間変性し、サーマルサイクラー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で２０分間かけて徐々に温度を４℃に下げることによって調製した。５０μΜのＣａｓΦ３と５０μΜのＣａｓΦ３成熟ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）とを等体積で混合し、ＣａｓΦ３のリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成した。

特異的ｄｓＤＮＡ切断アッセイの場合、ＦＡＭ標識ｄｓＤＮＡ基質を、４００ｎＭで、切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１６０ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ_２）中の２μＭのＣａｓΦ３ＲＮＰとともに３７℃で２時間インキュベートするか、または図面の説明で別様に述べるようにインキュベートした。イオン依存性アッセイの場合、５ｍＭのＭｇＣｌ_２を、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＣａＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＦｅＳＯ_４、ＣｏＣｌ_２、ＮｉＳＯ_４、ＣｕＣｌ_２、ＺｎＳＯ_４により置換した。ＤＮＡ飽和実験の場合、１ｕΜのＣａｓΦ３ＲＮＰを、０．５～８ｕΜの標識ｄｓＤＮＡとともに３７°Ｃで２時間インキュベートした。非特異的トランスｓｓＤＮＡ切断アッセイ（図５ｂ～ｃ、図６ｂ～ｃ）の場合、０．４μΜのＦＡＭ標識非特異的ｓｓＤＮＡ基質（すなわち、ｃｒＲＮＡに対して相補的ではない）を、上記２μＭのＣａｓΦ３ＲＮＰとともに、０．１μＭの非標識活性剤ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ（ｃｒＲＮＡに対して相補的）と一緒に、切断緩衝液中、３７℃で１時間インキュベートした。等体積の停止緩衝液（８Ｍの尿素、ｐＨ８で１００ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、続いて９５℃で５分間インキュベートすることにより、反応を停止させた。切断産生物を、製造業者の指示に従って実行される１５％のＮｏｖｅｘＴＢＥ－尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分解した。ＯｄｙｓｓｅｙＦＣＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を使用して、ゲルをイメージングした。ゲル中のバンドの密度測定分析を、ＩｍａｇｅＪを使用して実施した。切断効率は、産物に対応するバンドの強度を特異的ｄｓＤＮＡ切断アッセイの合計強度で除したものとして、または非特異的ｓｓＤＮＡ分解アッセイの非切断産生物のシグナルの喪失として計算した。

Ｃｒｙｏ－ＥＭについてのサンプル調製
Ｃｒｙｏ－ＥＭ試料の調製には、Ｍｇ^２＋の代わりに、より高い収率が得られるＮｉ^２＋を触媒イオンとして使用した。ＣａｓΦ３ＲＮＰを、前述のように調製した。２５ｎｍｏｌのＲＮＰ及び３７ｎｍｏｌの非標識ｄｓＤＮＡ基質を、ＤＮＡ切断を可能にするために、２５ｍｌのＭｏｎｏＱＡ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＮｉＳＯ_４、０．５ｍＭＴＣＥＰ）中で、２０℃で２時間インキュベートした。この反応産生物を、ＭｏｎｏＱＡ緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱカラムに入れ、ＣａｓΦ３Ｒループ複合体を、ＭｏｎｏＱＢ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２ＭＫＣｌ、１ｍＭＮｉＳＯ_４、０．５ｍＭＴＣＥＰ）を用いた塩勾配溶出によってＲＮＰ及び非結合ＤＮＡ基質から分離した。ＣａｓΦ３Ｒループを、１６～２０％のＭｏｎｏＱ緩衝液Ｂ（約５００ｍＭのＫＣｌ）で溶出させた。Ｒループ複合体を、ＭｏｎｏＱＡ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、ＳＥＣにより非結合ＤＮＡから更に精製した。複合体の分子量及びサンプルの均一性は、ＭｏｎｏＱＡ緩衝液中で希釈した１０～２０ｎＭのタンパク質を用いて、ＲｅｆｅｙｎＯｎｅ質量光度計（Ｒｅｆｅｙｎ）を使用して推定した。新たに精製したＣａｓΦ３Ｒループ複合体２．５μＬ（吸光度_{２６０ｎｍ}、約１．６）をＵｌｔｒＡｕＦｏｉｌ３００メッシュＲ０．６／１．０ホリーグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）に適用し、１０ｍＡで６０秒間グロー放電し（ＬｅｉｃａＥＭＡＣＥ２００）、ＶｉｔｒｏｂｏｔＭａｒｋＩＶ（ＦＥＩ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して以下の条件で液体エタンでプランジ凍結した（液体窒素液で予備冷却）：ブロット時間３秒、湿度１００％及び４℃。

ＣｒｙｏＥＭデータの収集及び処理
動画は、ＴＦＳＦａｌｃｏｎＩＩＩカメラを備えたＴｉｔａｎＫｒｉｏｓＧ３Ｃｒｙｏ－ＴＥＭで、計数モードで３００ｋｅＶで作動させて収集した。露出１．０５ｅ／Å^２／フレーム、４０フレーム、したがって最終線量４２ｅ／Å^２。キャリブレーションしたピクセルサイズは０．８３２Å／ｐｘであった。すべての動画は、ＷＡＲＰ１．０．９を使用して前処理した（Ｔｅｇｕｎｏｖｅｔａｌ．，２０１９）。グローバルモーションについては２０の時間分解能で、ローカルモーションについては５×５の空間分解能で動き補正を行った。－５００Å^２のＢ係数で重み付けされた４５～３Åの範囲の動きを考察した。５Å未満のフレーム内モーションを示す顕微鏡写真のみを使用した。ＣＴＦ推定を、３５～４Åの範囲内の５×５パッチを用いて実施した。０．０～５．０μｍの間に適切なデフォーカス量を有し、５Åより良好な分解能を有する顕微鏡写真を選択した。粒子ピッキングについては、顕微鏡写真をマスクし、再訓練されたＢｏｘＮｅｔ深層畳み込みニューラルネットワークを使用して粒子をピッキングした。これにより、４，３９３顕微鏡写真から３，５０４，１０２個の粒子が得られた。粒子を、２５６×２５６のボックスサイズ及び０．８３２のピクセルサイズで抽出し、反転させ、正規化し、その後、２Ｄ分類のためにＲＥＬＩＯＮ３．１（Ｚｉｖａｎｏｖｅｔａｌ．，２０１８）にインポートした。選択された２Ｄクラスを、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ３．１．０（Ｐｕｎｊａｎｉｅｔａｌ．，２０１７）にインポートし、４つの初期クラスに３Ｄ分類した。最大個数の粒子を有する体積を、初期２．６１Åの分解能マップまで３Ｄオートリファインした。この体積内で使用した粒子の立体構造の不均一性を、３Ｄ変動解析ジョブにより調査し、不均質リファインメントのための入力として、２つのさらに広い体積を使用した。最良の体積における粒子の３Ｄ変動性をさらに分析し、続いて、４つのクラスによる不均質リファインメントを行った。得られた４つのボリュームを不均一にリファインして、２．７～３．３Åの分解能でマップを得た。２つの最良のマップ（２．７Å及び２．９Åの分解能）は、本文で考察されている複合体の異なる立体構造状態を表している。鮮明化及び局所的分解マップを、ＰＨＥＮＩＸで計算し（Ｌｉｅｂｓｃｈｎｅｒｅｔａｌ．，２０１９）、３Ｄ－ＦＳＣサーバで方位分解能異方性解析を実行した（Ｔａｎｅｔａｌ．，２０１７）。

原子モデルの構築及び改良
完全なＤＮＡ及びＲＮＡ配列ならびにタンパク質配列の約５０％を含む初期モデルを、ＰＨＥＮＩＸに実装されたｍａｐ－ｔｏ－ｍｏｄｅｌを使用して非経験的に構築した（Ｌｉｅｂｓｃｈｎｅｒｅｔａｌ．，２０１９）。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ＆Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を使用して、タンパク質断片を接続、伸長及び補正し、タンパク質配列の約７０％をカバーするモデルを生成した。モデルの残りは、ＣＣＰ－ＥＭで実装されたＢｕｃｃａｎｅｅｒを使用して自動構築し（Ｂｕｒｎｌｅｙｅｔａｌ．，２０１７）、その後、ＣＯＯＴで補正した。最終的なモデルは、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅ及びＣＯＯＴにおける手動の検査及び補正を用いて、数回微調整を行った後に得られた。最終的なモデルは、タンパク質配列の９２％をカバーし、主に、構造化されていないと予測されるＣ末端セグメントを欠いている。マップ及び分子モデルイメージは、ＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｇｏｄｄａｒｄｅｔａｌ．，２０１８）を使用して作成した。

結果
ＣａｓΦ３／Ｒループ構造の決定
本発明者らは、機能性ＣａｓΦ３－ｃｒＲＮＡ複合体を再構成して特徴付け（図５）、ｃｒｙｏ－ＥＭにより標的ｄｓＤＮＡを切断した後に酵素の構造を決定した（図１）。不均質リファインメントにより、複合体のいくつかの立体構造を得た。主要なクラスは、２．７Åの分解能でマップを得て、これを使用してＣａｓΦ３／Ｒ－ループ構造のモデルを構築した。第二の主要なクラスで観察された高い柔軟性は、完全なモデルを構築することを妨げたが、柔軟性領域及び複合体の立体構造の不均一性を明らかにした。ＣａｓΦ３／Ｒループ構造は、基質切断後のエンドヌクレアーゼ産生物複合体のスナップショット（図１ｃ～ｅ）を表し、ＰＡＭ認識、標的ＤＮＡの巻き戻し及び切断のための重要な残基を明らかにし、それによって、この新規なファミリーのゲノム編集ツールを再設計するための詳細な原子情報を提供する。

ＣａｓΦ３生化学的特性評価
ＣａｓΦ３は、異なるホスホジエステル結合で特定の標的ＤＮＡを切断することにより、９～１１ヌクレオチドのオーバーハングを生成する（図１ｂ、図５ａ）。その特異的切断の副次的な効果は、標的ｄｓＤＮＡとして、またはｃｒＲＮＡに相補的なｓｓＤＮＡ活性剤として提供されるＴ鎖によって引き起こされる、無差別なｓｓＤＮＡ分解の解放である（Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．，２０２０）（図５ｂ～ｃ）。いずれの場合も、１２－ｎｔ～１３－ｎｔの最小ｃｒＲＮＡ－ＤＮＡ二本鎖が構築される際に、ＣａｓΦ３の無差別な切断が引き起こされる。この構造は、１８－ｎｔより長い活性剤で観察される違いは、触媒部位における非特異的ｓｓＤＮＡ基質の侵入を阻害するＲループの存在に起因し得ることを示唆している（図１ｄ～ｅ、図５ｄ）。エンドヌクレアーゼの活性を、Ｍｇ^２＋及び他の二価金属イオンの存在下で試験した（図５ｅ）。このアッセイにより、ＣａｓΦ３がＭｎ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｃｏ^２＋及びＮｉ^２＋の存在下で触媒作用をサポートし、異なる切断パターンをもたらすことが明らかになった。ＣａｓΦ３の切断活性は、エンドヌクレアーゼ／標的ＤＮＡの比がほぼ等モルであったときに飽和しており、他のＲＮＡガイドヌクレアーゼにおいて観察されるように（Ｓｔｅｌｌａｅｔａｌ．，２０１７ａ及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１４）、ＰＡＭ近位切断産物から酵素の解離が遅いことを示唆している（図５ｆ）。さらに、構造中に可視化されていないＣ末端の最後の３９残基を除去することで、ＣａｓΦ３活性が低下した。しかしながら、酵素は十分な触媒活性を保持しており、ＣａｓΦファミリーメンバーをさらに小型化できることを示唆していた（図５ｇ～ｈ）。

ＣａｓΦ３／Ｒループ複合体の全体構造
ＣａｓΦ３／Ｒループ複合体は、他のＶ型エフェクター複合体で観察される古典的な２ローブ構造を提示しない。Ｒループは、ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドによるＴ字形を示し、ｃｒＲＮＡハンドルが水平及び垂直のバーを形成し、タンパク質ドメインがこれらの核酸に巻き付いている（図１ｄ～ｅ）。ｃｒＲＮＡのハンドルは、Ｃ－１及びＵ－１８と相互作用する厳密に保存されたＲ３３８、ならびにＧ－１７とＡ－２の間の隣接する非ワトソン－クリック型塩基対相互作用によって安定化される。ヘテロ二本鎖のＰＡＭ遠位領域及びＰＡＭ近位領域は、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端領域（図１ｄ～ｅ）によって認識され、これらは、１５残基ループによって接続されている（３８０～３９５）。各領域は、タンパク質のサイズの約半分を含み、それらはＴ字型集合体上のｃｒＲＮＡの長いハンドルによって分離されている。Ｎ末端領域は、Ｔ鎖及びＮＴ鎖のＰＡＭ相互作用ドメイン（ＴＰＩＤ、ＮＰＩＤ）及びＲＮＡハンドル結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、Ｃ末端は、触媒ＲｕｖＣ及び停止（ＳＴＰ）ドメインからなる（図１ａ）。ＲｕｖＣドメインは、ＳＴＰドメインの挿入によりＲｕｖＣ－Ｉ及びＲｕｖＣ－ＩＩに分割され、これは、２つの長いブリッジヘリックスであるＢＨ－Ｉ及びＢＨ－ＩＩにより触媒ドメインに接続されている。さらに、ＲｕｖＣ－ＩＩサブドメインは、ＣａｓΦ７を除くＣａｓΦファミリーの全ての既知のメンバーに保存されている特徴的な挿入を提示する（図１）。このＮ末端及びＣ末端の物理的分離もまた機能的であり、ＲＮＰアセンブリ、ＰＡＭ認識及び巻き戻しは、Ｎ末端領域に存在し、ｃｒＲＮＡ／Ｔ鎖ハイブリッドアセンブリ、及び標的ＤＮＡの触媒作用は、ポリペプチドのＣ末端部によって行われる。したがって、ＰＡＭ結合部位は、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性部位から約５５Å離れている。

標的ＤＮＡ切断により、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたＴ鎖との三本鎖Ｒループが得られ（図１ｂ、ｄ）、解離されたＰＡＭＮＴ鎖は、ＲｕｖＣ触媒ポケットに向けられる（図２ａ）。ＰＡＭの－１～－２上流のＮＴ鎖ヌクレオチドは密集状態で構築されたが、ＮＴ鎖の遠位端での高い柔軟性により、Ｃａｓ９（Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，２０１６）及びＣａｓ１２ａ（Ｓｔｅｌｌａｅｔａｌ．，２０１７）について示すようにヌクレオチドの残りの可視化が妨げられた。しかしながら、ＮＴ鎖の骨格は、ｃｒｙｏＥＭマップ中で低輪郭レベルで観察され、ＲｕｖＣ触媒ポケットへのＤＮＡがたどる経路を示唆している（図２ａ）。興味深いことに、プリンとしてモデル化された２つのヌクレオチドが、ホスホジエステル加水分解の副生成物として、Ｎｉ^２＋と複合したＲｕｖＣポケット内で観察された（図１ｃ～ｅ、２ａ）。これらのヌクレオチドがどの鎖に属するかを決定するために、種々の標識標的ＤＮＡの切断後に結合アッセイを行い、これらのヌクレオチドがＮＴ鎖に由来することを明らかにした。

ＰＡＭ認識
ＰＡＭ認識は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓヌクレアーゼによるＤＮＡ標的化の重要な特徴であり、これは切断前の標的ＤＮＡの識別、鎖分離、及びｃｒＲＮＡ標的ＤＮＡヘテロ二本鎖形成のための前提条件であるからである（Ａｎｄｅｒｓｅｔａｌ．，２０１４）。ＣａｓΦ３は、ＮＴ鎖における５’－ＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列を認識することが報告されている（Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．，２０２０）。本発明者らの構造は、ＣａｓΦ３におけるＰＡＭ認識が、ＴＰＩＤドメイン及びＮＰＩＤドメインによる両方の鎖における相互作用の組み合わせによって達成されることを示している（図２ｂ）。ＮＰＩＤのヘリックスａ１（Ｓ２１～Ａ３４）の正に帯電した側をｄｓＤＮＡ長手軸に対して４５°の角度で副溝に挿入することで、ｄｓＤＮＡの巻き戻しを容易にする。２つの保存されたリジン、Ｋ２６及びＫ３０は、ＮＴ鎖と相互作用する。Ｋ３０は、ｄＴ＋２と特異的に接触するが、Ｋ２６はｄｓＤＮＡ内に配置してワトソン－クリック塩基カップリングを分裂し、ＮＴ鎖を変位させ、分離を促進させる（図２ｂ～ｃ）。ＰＡＭ認識切断の反対側で、ＴＰＩＤ中のＱ１２３は、Ｔ鎖中のｄＡ－３、ｄＡ－２及びＮＴ鎖中のｄＴ＋３との極性相互作用の入り組んだネットワークを構築する（図２ｂ）。隣接するＧ１９８アミドは、Ｑ１２３のカルボニルに接触し、これらの塩基との接触に有利な立体構造で側鎖を固定する。さらに、Ｑ１９７の側鎖は、Ｑ１２３と相互作用し、ｄＡ－３と水素結合する。

Ｑ１２３Ａ及びＱ１９７Ａの変異は約９０％の活性低下を示す一方、Ｋ３０Ａ変異は切断を約５５％低減する。この３つの変異の活性はＱ１２３Ａ／Ｑ１９７Ａ変異と類似しており、Ｋ３０Ａ変異の追加は更なる減少を示さないことから、ＰＡＭ認識におけるグルタミンの非常に重要な役割を示している（図２ｄ～ｅ）。Ｋ２６Ａ変異活性は影響を受けないことから、ａ１ヘリックスの挿入はｄｓＤＮＡの開裂に十分であることを示唆している。ＰＡＭ認識に関与するすべての変異体は、ｄｓＤＮＡ標的の切断パターンを変化させない（図２ｄ～ｅ）。野生型及び変異体の双方とも、異なるＰＡＭ配列を有する標的ｄｓＤＮＡ、またはＰＡＭの不存在において標的ｄｓＤＮＡを切断せず、Ｑ１２３Ａ、Ｑ１９７Ａ及びＫ３０Ａによって形成されるＰＡＭ相互作用ネットワークの選択性を明確にした（図６ａ）。さらに、非特異的ｓｓＤＮＡ触媒作用も、ＰＡＭを含むｄｓＤＮＡの存在下で完全に活性化されることが観察され、したがって、ＰＡＭ認識の後にｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドアセンブリが触媒作用を活性化することを示唆している（図６ｂ）。最後に、Ｔ鎖中のＰＡＭ相補性塩基の役割を評価するために、種々のＰＡＭ配列を有するＴ鎖を模倣するｓｓＤＮＡ活性剤を使用してＣａｓΦ３の非特異的活性を誘発した。アッセイは、ＰＡＭ相補性３’－ＡＡＧ－５’配列及びＰＡＭなしの活性剤が、ホスホジエステル加水分解を完全に放出し、一方、他のＰＡＭは、異なるレベルに活性化を促進したことを示した。この実験は、適切なハイブリッドの集成体により触媒活性が発揮される一方で、ｃｒＲＮＡと部分的にハイブリダイズする領域を含む活性剤ではより低い切断が示されることを示唆する（図６ｂ）。

まとめると、本発明者らの分析により、標的ＤＮＡの主溝のＰＡＭと相互作用する、十分に保存されたＱ１２３残基及びＱ１９７残基が、認識において不可欠な役割を果たすことが示唆される。ＣａｓΦヌクレアーゼのＰＡＭ領域における直接的な塩基の読み出しは、ＴＰＩＤ及びＮＰＩＤと標的ＤＮＡの両鎖との相互作用を組み合わせる。しかしながら、ＴＰＩＤとＴ鎖との相互作用は、ＰＡＭ識別に重要な役割を果たしていると考えられる。他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼは、ＮＴ鎖と優先的に相互作用することによりＰＡＭスキャニングを実行することから、これは、ＣａｓΦファミリーの特異な特性である（Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，２０１７及びＳｔｅｌｌａｅｔａｌ．，２０１７ｂ）^{１７，１８}。

標的ＤＮＡ巻き戻し
ＰＡＭ、ＴＰＩＤ、ＮＰＩＤ及びＲＢＤドメインのｂ１、ｂ６、及びｂ７鎖からなる逆平行ｂシートの上流に第１の非結合塩基対が重なることで空洞が形成され、そこで巻き戻し及び最初のｃｒＲＮＡ／Ｔ鎖ハイブリダイゼーションが起こる（図２ｃ）。この空洞は、Ｃ末端領域上でＢＨ－ＩヘリックスとＲｕｖＣドメインによって挟まれている。十分に保存されたＦ５４、Ｋ５５、Ｐ５６、Ｐ５７、Ｐ３６３、Ｔ３６０、Ｇ３６１、Ｄ３６２及びＶ３６４は、酸性残基と疎水性残基とを組み合わせて空洞を構築し、Ｔ鎖及びｃｒＲＮＡのシードにおいてｄＴ＋１及びＡ＋１のワトソン－クリック塩基対形成を促進する（図２ｃ）。さらに、ｄＧ－１の骨格リン酸基は、Ｔ３６０、Ｋ５５の側鎖、及びＹ３７６の主鎖によって認識される。この相互作用により、リン酸基の回転（図２ｃ）が生じ、Ｃａｓ９複合体（Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，２０１５）及びＣａｓ１２ａ複合体（Ｓｔｅｌｌａｅｔａｌ．，２０１７ａ，Ｓｔｅｌｌａｅｔａｌ．，２０１８，ＳｗａｒｔｓａｎｄＪｉｎｅｋ，２０１９，Ｓｗａｒｔｓｅｔａｌ．，２０１７及びＹａｍａｎｏｅｔａｌ．，２０１６）において観察されるようにｃｒＲＮＡにおけるｄＴ＋１とＡ＋１との間の塩基対形成が促進される。隣接するＫ３７７Ａ変異は、約２０％の活性の低下をもたらしたが、Ｔ３６０Ａ及びＫ５５Ａの変異は、５０％及び６０％の減少を示し、リン酸反転及びハイブリッド形成のためのこれらの残基の重要性を強調した（図２ｄ～ｅ）。ＴＰＩＤ中の長ヘリックスａ７はｃｒＲＮＡ／Ｔ鎖ハイブリッドをＢＨ－Ｉヘリックス及びＩＩヘリックスならびにＲｕｖＣ挿入によって形成される「ネスト」へと導き、このハイブリッドをＮＴ鎖から切り離し、標的ＤＮＡが再アニーリングすることを防ぐ。ハイブリッドが置かれている領域は、ＲｕｖＣ触媒ドメイン及びＳＴＰドメインに隣接しており、これは球状船首（ｖｅｓｓｅｌｂｕｌｂｂｏｗ）としてｃｒＲＮＡ／Ｔ鎖ハイブリッドを分裂させる（図３ａ）。ｂ１１及びｂ１２によって形成される逆平行ｂシートは、ワトソン－クリック塩基カップリングをｄＧ－１７：Ｃ＋１７対以降で分裂させ、その結果、スペーサー長の効率を試験する切断実験と一致するように、ハイブリッドの長さを１７ヌクレオチドに制限する（Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．，２０２０）。ｂ１１中のＦ５３８の芳香環はハイブリッド開裂を開始させる（図３ａ）。ｃｒＲＮＡの３’－リン酸はドメインの裏側にガイドされ、そこでＣ＋１７及びＵ＋１８は、塩基性（Ｒ５３５、Ｒ５４７）と疎水性残基（Ｍ５００、Ｌ５５５）との組み合わせによって収容され、Ｔ鎖の５’－リン酸は、ＲｕｖＣ触媒ポケットが位置するタンパク質の反対側に誘導される。

触媒活性化
ＲｕｖＣ挿入は、ハイブリッドのｃｒＲＮＡ鎖に沿って走り、Ｕ＋９からＧ＋１３までのそのリン酸骨格と複数の接触を作り、挿入の先端の折り返しを疎水性相互作用によりＳＴＰドメインの裏側に固定する（図３ｂ）。この配置及び活性アッセイ（図５ｂ～ｃ、図６ｃ～ｄ）は、ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのアセンブリは、活性ポケットをｓｓＤＮＡ基質に利用可能にすることで触媒作用を活性化するＲｕｖＣ挿入の立体構造変化を引き起こすことができることを示唆する。異なる長さの活性剤を使用するｓｓＤＮＡ基質の非特異的切断のモニタリング（図５ｂ～ｃ）からは、活性剤の長さが１２－ｎｔ以上のｃｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの形成を可能にする場合にＣａｓΦ３の非特異的活性が完全に放出されることが示されており、触媒作用を活性化するために一定のハイブリッドの長さが必要であるという考えを支持している。保存されたＧ６３０及びＲ６４３は、Ｇ＋１２のリン酸と極性の相互作用のネットワークを配置するため、重要な残基であり、これにより、挿入先端の保存されたＷ６３６、Ｆ６３９及びＦ６４０残基によって構成される疎水性「プラグ」を結合する接続の特別な配置が生じる（図３ａ～ｂ）。本発明者らは、ハイブリッドの集成体は、Ａ４９０、Ｗ５１０、Ｍ５１３で構成されるＳＴＰドメインの裂け目においてプラグによって固定されたＲｕｖＣ挿入の観察された立体構造を促進すると仮定している（図３ｂ）。ハイブリッドによるこの立体構造の安定化は、ＳＴＰドメインを触媒部位に引き寄せ、適切な５’～３’極性を有する活性部位にＴ鎖を配置するであろう。疎水性プラグ及びＳＴＰの裂け目の残基における変異によりＣａｓΦ３が不溶化し、当該ＣａｓΦファミリーにおけるこの保存された相互作用の重要性が強調された。

活性化仮説を試験するために、Ｇ６３０及びＲ６４３における置換を分析した。Ｇ６３０Ａ変異は、その主鎖を介した極性ネットワークに対するＧ６３０の寄与と一致して、約１０％のわずかな活性の減少を示した（図３ｃ～ｄ）。しかしながら、Ｇ６３０Ｖは大幅な減少を示し、嵩高な側鎖がリン酸との相互作用に影響を与えていることを示唆し、ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡアセンブリのモニタリングにおける保存されたＧ６３０の重要な役割を支持している。興味深いことに、逆極性変異体Ｒ６４３Ｅは、標的ＤＮＡの最小の切断減少を示したが（図３ｃ～ｄ）、その無差別なｓｓＤＮＡ分解活性は、Ｇ６３０Ｖと同様に、約１００％の減少を示し（図６ｃ～ｄ）、それにより、ＲｕｖＣ挿入における置換がＣａｓ１２ｊファミリーの切断を改変できることが示された。

さらに、すべてのＰＡＭ及び巻き戻し変異体は、ＰＡＭを欠くｓｓＤＮＡ活性剤を使用して同じアッセイを実施した場合に完全に無差別なｓｓＤＮＡ活性を示す。この活性剤は、認識及び巻き戻しをスキップし、したがってｃｒＲＮＡとハイブリダイズして活性を惹起する。しかしながら、ＰＡＭが標的ｄｓＤＮＡ中に存在する場合、変異体のＰＡＭ認識及び巻き戻しがそれらの特異的ｄｓＤＮＡ切断活性と一致して損なわれているため、変異体は最小の活性を示した（図２ｄ～ｅ）。ＰＡＭ及び巻き戻し変異体は、ｓｓＤＮＡで活性化されると認識及び巻き戻しをスキップし、したがってｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、ヌクレアーゼ活性を惹起することから、これらの結果は、提案されたモデルを支持している。

したがって、標的ｄｓＤＮＡの存在下では、ＰＡＭ認識、ＤＮＡ巻き戻し、及び活性化はリンクしているが、適切なｓｓＤＮＡが提供されれば、触媒活性化からＰＡＭ認識を省略することができる。さらに、ＲｕｖＣ挿入における変異は、酵素活性に影響を与えるだけでなく、Ｇ６３０Ｖ変異体及びＲ６４３Ｅ変異体の場合に観察されるように、それらの変異は、特異的な標的ｄｓＤＮＡ切断から無差別ｓｓＤＮＡ活性を解離させ、そのパターンを変化させることができる。

ＤＮＡ切断
ＣａｓΦヌクレアーゼのＲｕｖＣドメインは、特徴的なＲＮａｓｅＨ折り畳みを呈するレトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーに属する。ＣａｓΦ３触媒ポケット内のＮＴ鎖からの２つのヌクレオチドは、保存されたＥ６１８及びＤ４１３に関連している（図３ｅ）。密集状態のため塩基が識別できず、ｄＡまたはｄＧのいずれかがモデル化された。本発明者らは、切断産生物中のヌクレオチド数及びその位置のプリンリッチ配列に応じて、５’～３’極性及びＮｉ^２＋イオン（方法）を有する２つのグアニンを構築した（図１ｂ、３ｅ）。したがって、ＤＳＢ生成後のＤＮＡの長さによって、切断したＮＴ鎖が触媒中心に会合したままであることが可能となり、先に観察したようにＴ鎖の侵入を妨げて、その触媒作用を遅延させることができる（Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．，２０２０）（図５ｇ）。Ｚｎとしてモデル化された第二の金属原子は、Ｃａｓ１２ｆ（Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．，２０２１）及びＣａｓ１２ｇ（Ｌｉｅｔａｌ．，２０２１）と同様に、４つの保存されたシステインによって配位している。ＲｕｖＣのこの部分には、ジヌクレオチドから３．７Å離れた保存されたＲ６９１が含まれる。この残基により、触媒ポケット内でのホスホジエステル骨格の配置を容易にすることができる（図３ｅ）。しかしながら、この領域の残りの部分は、らせん状の調節蓋モチーフを含まない異なる構造を示すため、Ｃａｓ１２ｆ及びＣａｓ１２ｇの標的核酸結合（ＴＮＢ）ドメイン（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂのＮｕｃドメインならびにＣａｓ１２ｅの標的鎖ローディングドメインとしても知られる）とは異なる。

ＲｕｖＣドメインは、５’－リン酸化切断を導入し、３つの酸性アミノ酸（Ｎｏｗｏｔｎｙ，２００９）及び２つの二価金属イオン（Ｓｔｅｉｔｚ＆Ｓｔｅｉｔｚ，１９９３）を含む。Ｅ６１８及びＤ４１３カルボキシレートアミノ酸は重要な触媒残基であり、Ｅ６１８Ａ及びＤ４１３Ａ変異はＣａｓΦ３活性を消失させる（図３ｃ～ｅ）。両残基は、求核試薬を活性化し、遷移状態及び脱離基を安定化する金属イオンを配位させることが予測される。本発明者らの構造では、Ｅ６１８及びＤ４１３は、金属及びジヌクレオチドの骨格を配位する（図３ｅ）。第３の触媒残基として作用すると予測されるＤ７０８の側鎖は、電子照射により観察されない（Ｂａｒｔｅｓａｇｈｉｅｔａｌ．，２０１４）。この活性部位残基は、他のＲｕｖＣドメインの他のカルボキシレートよりも重大ではないことが示されており、このアミノ酸のＡｓｎまたはＨｉｓへの置換は、切断の部分的な損失のみを引き起こす（Ｃｈａｐａｄｏｓｅｔａｌ．，２００１及びＫａｎａｙａ，１９９８）。しかしながら、Ｄ７０８Ａ変異は活性を抑制する（図３ｃ～ｅ）。ＤＡＬＩを使用した、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む他のＲｕｖＣドメインとの構造比較は、２つの金属イオン機構を支持する。興味深いことに、ＣａｓΦファミリー内でこのドメインにおける配列相同性が高いことから、ＣａｓΦ３がそれ自体のｃｒＲＮＡを切断できず、それによってプロセシングできない理由を説明することができるＣａｓΦ１及びＣａｓΦ２のＲｕｖＣとの違いは、観察することができない。

参考文献
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Ｓｗａｒｔｓ，Ｄ．Ｃ．，ｖａｎｄｅｒＯｏｓｔ，Ｊ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢａｓｉｓｆｏｒＧｕｉｄｅＲＮＡＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇａｎｄＳｅｅｄ－ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＤＮＡＴａｒｇｅｔｉｎｇｂｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ．ＭｏｌＣｅｌｌ６６，２２１－２３３ｅ２２４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１７．０３．０１６（２０１７）．

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項目
１．ポリペプチド配列を含む、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ、例えば変異体ＣａｓΦ－３、またはそのオルソログであって、前記ポリペプチド配列は、
ｉ）配列番号３の残基１～２０、３６～９７、１０４～１１９、１５１～１７９、２０４～３７９、３９６～６１９、６５１～６７９及び７０１～７２６に対応する配列であって、前記ポリペプチド配列はさらに、
ａ．配列番号３の残基２１～３５に対応するＮＰＩＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｂ．配列番号３の残基９８～１０３に対応するＴＰＩＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｃ．配列番号３の残基１２０～１５０に対応するＴＰＩＤドメインの第２の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｄ．配列番号３の残基１８０～２０３に対応するＴＰＩＤドメインの第３の領域、またはＲＢＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｅ．配列番号３の残基３８０～３９５に対応するＲＢＤドメインの第２の領域、またはＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｆ．配列番号３の残基６２０～６５０に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｇ．配列番号３の残基６８０～７００に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｈ．配列番号３の残基７２６～７６６に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第３の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異
を含む、前記配列、及び／または、
ｉｉ）配列番号３であって、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基２６、３０、５４、５５、１２３、１９７、３５５、３６０、４１３、６１８、６２５、６２６、６３０、６４３、６７３、６７５、６７６、６８０、６８３、６９１、６９８、７０１及び７０８に対応する位置から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記配列番号３
に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。

２．前記変異体エンドヌクレアーゼが、配列番号３の残基１～７２６に対応する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基７２７～７６６に対応する配列のＣ末端の欠失をさらに含み、例えば、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、またはそれからなる、項目１に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。

３．前記変異体エンドヌクレアーゼが、野生型エンドヌクレアーゼと比較して、１つ以上の変更された活性を有し、前記活性は、標的核酸配列の二本鎖切断、標的核酸配列の一本鎖切断及び標的核酸認識からなる群から選択される、先行項目のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。

４．前記エンドヌクレアーゼが、２価のニッケル（Ｎｉ^２＋）、２価のマンガン（Ｍｎ^２＋）及び／または２価の銅（Ｃｏ^２＋）を含む媒体に含まれる、先行項目のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。

５．先行項目のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログをコードするポリヌクレオチド。

６．項目５に記載のポリヌクレオチド、または項目１～４のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼもしくはそのオルソログをコードする核酸配列を含む、組換えベクター。

７．項目１～４のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ、項目５に記載のポリヌクレオチド、または項目６に記載の組換えベクターを発現することができる細胞。

８．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の発現のための系であって、
ａ．項目５に記載のポリヌクレオチド、または、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼもしくはそのオルソログをコードするポリヌクレオチドを含む項目６に記載の組換えベクター、及び
ｂ．任意にプロモーターに作動可能に連結される、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び
ｃ．任意に、ａ．及びｂ．の前記ポリヌクレオチドまたは前記組換えベクターを発現するための細胞、
を含む、前記系。

９．第１の標的核酸に核酸切断を導入する方法におけるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の使用であって、
ａ．変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログを、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と接触させ、それにより第２の標的核酸を認識することができるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を取得し、ここで、前記第２の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、前記Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは項目１～４のいずれか１つに記載され、
ｂ．前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を、前記第１の標的核酸と接触させ、
それによって、前記第１の標的核酸配列において核酸切断が生成される、前記使用。

１０．第１の標的核酸に核酸切断を導入する方法であって、前記方法は、
ａ．プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第２の標的核酸を認識することができるガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計するステップ、
ｂ．ステップａ．の前記ｃｒＲＮＡを、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログと接触させるステップであって、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、項目１～４のいずれか１つに記載のものか、または項目５または６に記載のポリヌクレオチドもしくはベクターによってコードされ、それによって前記第２の標的核酸に結合することができるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を得る、前記ステップ、及び
ｃ．前記ｃｒＲＮＡ及び前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを前記第１の標的核酸と接触させるステップを含み、
それによって、１つ以上の核酸切断を前記第１の標的核酸に導入する、前記方法。

１１．哺乳動物細胞内で第２の標的核酸に部位特異的な二本鎖切断を導入するインビトロ方法であって、前記方法は、前記哺乳動物細胞内に、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を導入することを含み、前記Ｃａｓ１２ｊは、項目１～４のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、前記第２の標的核酸に特異的である、前記方法。

１２．サンプル中の第２の標的核酸を検出するための方法であって、前記方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、項目１～４のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、前記第２の標的核酸に特異的である、前記提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、前記ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、前記提供すること、
ｃ．前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体及び前記ｓｓＤＮＡを、少なくとも１つの第２の標的核酸を含む前記サンプルと接触させること、
ｄ．蛍光体からの蛍光シグナルを検出することによりｓｓＤＮＡの切断を検出すること、及び
ｅ．任意に、前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定することであって、前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度は、前記切断されたｓｓＤＮＡと相関する、前記決定すること
を含み、それによって、前記サンプル中の前記第２の標的核酸の存在を検出し、ステップｃ．は、任意に前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の活性化を含む、前記方法。

１３．第２の標的核酸、例えばウイルスゲノム、微生物ゲノム、病原体の遺伝子、またはヒト疾患に関連する核酸配列の核酸断片を、サンプル中で検出して、任意に定量化する方法であって、前記方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、項目１～４のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、
ｉ．前記変異体Ｃａｓ１２ｊは、抑制されたエンドヌクレアーゼ活性を有し、
ｉｉ．前記変異体Ｃａｓ１２ｊは、検出可能なタンパク質標識を含み、かつ
ｉｉｉ．前記ｃｒＲＮＡは、前記第２の標的核酸に特異的である、提供することと、
ｂ．前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を、少なくとも１つの第２の標的核酸を含む前記サンプルと接触させることと、
ｃ．前記タンパク質標識、例えば蛍光シグナルを検出することにより、前記第２の標的核酸の存在を検出して、任意に定量化することと、
を含む、前記方法。

１４．対象における疾患を診断するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、項目１～４のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、前記提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、前記ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、前記提供すること、
ｃ．前記対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、前記第２の標的核酸を含むか、または前記第２の標的核酸を含むことが疑われる、提供すること、及び
ｄ．先行項目のいずれか１つで定義された前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、
を含み、前記第２の標的核酸は、前記疾患と相関する核酸断片であり、例えば、前記第２の標的核酸は、前記疾患のバイオマーカーであり、
それによって対象における疾患を診断する、前記方法。

１５．対象における感染性疾患を診断するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、項目１～４のいずれか１つに記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、前記提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、前記ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、前記提供すること、
ｃ．前記対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、前記第２の標的核酸を含むか、または前記第２の標的核酸を含むことが疑われる、提供すること、及び
ｄ．先行項目のいずれか１つで定義された前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、
を含み、前記第２の標的核酸は、前記疾患を引き起こす感染病原体のゲノムの核酸またはその断片であり、
それによって対象における感染性疾患を診断する、前記方法。

Claims

ポリペプチド配列を含む、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼ、例えば変異体ＣａｓΦ－３、またはそのオルソログであって、前記ポリペプチド配列は、
ｉ）配列番号３の残基１～２０、３６～９７、１０４～１１９、１５１～１７９、２０４～３７９、３９６～６１９、６５１～６７９及び７０１～７２６に対応する配列であって、前記ポリペプチド配列はさらに、
ａ．配列番号３の残基２１～３５に対応するＮＰＩＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｂ．配列番号３の残基９８～１０３に対応するＴＰＩＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｃ．配列番号３の残基１２０～１５０に対応するＴＰＩＤドメインの第２の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｄ．配列番号３の残基１８０～２０３に対応するＴＰＩＤドメインの第３の領域、またはＲＢＤドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｅ．配列番号３の残基３８０～３９５に対応するＲＢＤドメインの第２の領域、またはＲｕｖＣ－Ｉドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｆ．配列番号３の残基６２０～６５０に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第１の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｇ．配列番号３の残基６８０～７００に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第２の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異、及び／または
ｈ．配列番号３の残基７２６～７６６に対応するＲｕｖＣ－ＩＩドメインの第３の領域における少なくとも１つのアミノ酸変異であって、各変異は、独立して、アミノ酸置換、挿入または欠失である、前記アミノ酸変異
を含む、前記配列、及び／または、
ｉｉ）配列番号３であって、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基２６、３０、５４、５５、１２３、１９７、３５５、３６０、４１３、６１８、６２５、６２６、６３０、６４３、６７３、６７５、６７６、６８０、６８３、６９１、６９８、７０１及び７０８に対応する位置から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記配列番号３
に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼがＢｉｇｇｉｅｐｈａｇｅ由来である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記変異体エンドヌクレアーゼが、配列番号３の残基１～７２６に対応する前記配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３の残基７２７～７６６に対応する前記配列のＣ末端の欠失をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記エンドヌクレアーゼが、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、またはそれからなる、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、荷電側鎖を有するアミノ酸から非荷電側鎖を有するアミノ酸への置換である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、荷電側鎖を有するアミノ酸から非極性側鎖を有するアミノ酸残基への置換である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、荷電側鎖を有するアミノ酸からグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンへの置換である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、荷電側鎖を有するアミノ酸からグリシンへの置換である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アミノ酸のアラニンへの置換である、請求項１～７のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸の置換または欠失が、少なくとも２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも６個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも７個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも８個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも９個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１１個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１２個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１３個の残基の置換または欠失、たとえば少なくとも１４個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも１５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも２０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも２５個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３０個の残基の置換または欠失、例えば少なくとも３５個の残基の置換または欠失、または例えば少なくとも４０個の残基の置換または欠失である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＮＰＩＤドメインにある、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＴＰＩＤドメインにある、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＲＢＤドメインにある、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＲｕｖＣ－Ｉドメインにある、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＲｕｖＣ－ＩＩドメインにある、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記ＲｕｖＣ－Ｉ及び／またはＲｕｖＣ－ＩＩドメイン中の前記アミノ酸置換が、グルタミン酸またはアスパラギン酸ではないアミノ酸の前記置換である、請求項１４～１５のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼである、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＫ２６に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＫ３０に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＦ５４に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＫ５５に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＱ１２３に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＱ１９７に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＬ３５５に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＴ３６０に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＤ４１３に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＥ６１８に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＫ６２５に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＦ６２６に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＧ６３０に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＲ６４３に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＰ６７３に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＷ６７５に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＴ６７６に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＣ６８０に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＣ６８３に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＲ６９１に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前配列番号３または配列番号３１のＲ６９１に対応する位置での前記置換がＲ６９１Ａ置換である、請求項３７に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＣ６９８に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＣ７０１に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
配列番号３または配列番号３１のＤ７０８に対応する位置で置換を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼが、ＣａｓΦ－１（配列番号１）、ＣａｓΦ－２（配列番号２）、ＣａｓΦ－３（配列番号３）、ＣａｓΦ－４（配列番号４）、ＣａｓΦ－５（配列番号５）、ＣａｓΦ－６（配列番号６）、ＣａｓΦ－７（配列番号７）、ＣａｓΦ－８（配列番号８）、ＣａｓΦ－９（配列番号９）、及びＣａｓΦ－１０（配列番号１０）からなる群から選択されるＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼの変異体である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼが、ＣａｓΦ－３（配列番号３）の変異体である、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記変異体エンドヌクレアーゼが、野生型エンドヌクレアーゼと比較して、１つ以上の変更された活性を有し、前記活性は、標的核酸配列の二本鎖切断、標的核酸配列の一本鎖切断及び標的核酸認識からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記変更された活性が、触媒速度の増加、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列認識の変更、突出核酸二本鎖切断によって生じるオーバーハングの長さの変更、オフターゲット切断頻度の減少、ヌクレアーゼ活性の抑制、標的核酸配列に対する特異性の増加、及び二本鎖核酸切断の誘発から一本鎖核酸切断の誘発（ニッカーゼ活性）への切断活性の変更からなる群から選択される、請求項４４に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記エンドヌクレアーゼがタンパク質タグにコンジュゲートしている、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記タンパク質タグが、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ビオチン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ストレプタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはポリ（Ｈｉｓ）タグである、請求項４６に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記タンパク質タグが、酵素、例えばペルオキシダーゼ、ビオチンリガーゼ、または塩基編集酵素、例えばシチジンまたはアデニンデアミナーゼである、請求項４６に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記タンパク質タグが、転写因子などの転写調節因子である、請求項４６に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記タンパク質タグが、ＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓまたはフルオレセインなどの蛍光タグである、請求項４６に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
前記エンドヌクレアーゼが、２価のニッケル（Ｎｉ^２＋）、２価のマンガン（Ｍｎ^２＋）及び／または２価の銅（Ｃｏ^２＋）を含む媒体に含まれる、先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
Ｎｉ^２＋の濃度が、少なくとも０．２ｍＭ、例えば少なくとも０．５ｍＭ、例えば少なくとも１ｍＭ、例えば少なくとも２ｍＭ、例えば少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭ、例えば０．２ｍＭ～５ｍＭである、請求項５１に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
Ｍｎ^２＋の濃度が、少なくとも０．２ｍＭ、例えば少なくとも０．５ｍＭ、例えば少なくとも１ｍＭ、例えば少なくとも２ｍＭ、例えば少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭ、例えば０．２ｍＭ～５ｍＭである、請求項５１に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
Ｃｏ^２＋の濃度が、少なくとも０．２ｍＭ、例えば少なくとも０．５ｍＭ、例えば少なくとも１ｍＭ、例えば少なくとも２ｍＭ、例えば少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭ、例えば０．２ｍＭ～５ｍＭである、請求項５１に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ。
先行請求項のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログをコードするポリヌクレオチド。
前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３３からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼが、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３２または配列番号３３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項５５または５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞での発現のためにコドン最適化されている、請求項５５～５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
請求項５５～５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１～５４のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼもしくはそのオルソログをコードする核酸配列を含む、組換えベクター。
前記ポリヌクレオチドまたは核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項５９に記載の組換えベクター。
プロモーターに作動可能に連結されたガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列をさらに含み、前記ｃｒＲＮＡは、コードされたＣａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼと、標的核酸にハイブリダイズするのに十分な塩基対を有する核酸の断片を結合する、請求項５９～６０のいずれか１項に記載の組換えベクター。
前記ｃｒＲＮＡが、２３～２５ヌクレオチドの定常領域、及び９～２０ヌクレオチドで構成される可変領域からなり、前記ｃｒＲＮＡは、少なくとも３２ヌクレオチド長、例えば３３ヌクレオチド長、例えば３４ヌクレオチド長、例えば３５ヌクレオチド長、例えば３６ヌクレオチド長、例えば３７ヌクレオチド長、例えば３８ヌクレオチド長、例えば３９ヌクレオチド長、例えば４０ヌクレオチド長、例えば４１ヌクレオチド長、例えば４２ヌクレオチド長、例えば４３ヌクレオチド長、例えば４４ヌクレオチド長、例えば４５ヌクレオチド長である、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の組換えベクター。
前記ｃｒＲＮＡの前記定常領域が、配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６に記載されているものである、請求項５９～６２のいずれか１項に記載の組換えベクター。
前記ｃｒＲＮＡの前記定常領域が、配列番号３６に記載されているものである、請求項５９～６３のいずれか１項に記載の組換えベクター。
請求項１～５４のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログ、請求項５５～５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項５９～６４のいずれか１項に記載の組換えベクターを発現することができる細胞。
ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の発現のための系であって、
ａ．請求項５５～５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼもしくはそのオルソログをコードするポリヌクレオチドを含む請求項５９～６４のいずれか１項に記載の組換えベクター、
ｂ．任意にプロモーターに作動可能に連結される、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組換えベクター、
を含む、前記系。
ｃ．上記のａ．及びｂ．の前記ポリヌクレオチドまたは前記組換えベクターを発現するための細胞
をさらに含む、請求項６６に記載の系。
前記細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項６５に記載の細胞、または請求項６６～６７のいずれか１項に記載の系。
第１の標的核酸に核酸切断を導入する方法におけるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の使用であって、
ａ．変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログを、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と接触させ、それにより第２の標的核酸を認識することができるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を取得し、ここで、前記第２の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、前記Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは請求項１～５４のいずれか１項に記載され、
ｂ．前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を、前記第１の標的核酸と接触させ、
それによって、前記第１の標的核酸配列において核酸切断が生成される、前記使用。
前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログが、請求項５５～６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされ、及び／または前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、請求項１～５４のいずれか１項に記載される、請求項６９に記載の使用。
前記核酸切断が、一本鎖切断である、請求項６９～７０のいずれか１項に記載の使用。
前記核酸切断が、二本鎖切断である、請求項６９～７０のいずれか１項に記載の使用。
前記二本鎖切断が、突出二本鎖切断である、請求項７２に記載の使用。
前記第２の標的核酸が、少なくとも１５連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１６連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１７連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１８連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１９連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２０連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２１連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２２連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２３連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２４連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２５連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２６連続ヌクレオチド、例えば少なくとも２７連続ヌクレオチドの配列を含む認識配列を含むかまたはそれからなり、但し、５’末端にある３個の核酸は、ＰＡＭ配列からなる、請求項６９～７３のいずれか１項に記載の使用。
前記ＰＡＭが、配列５’－ＴＴＮ－３’を含むかまたはそれからなる、請求項６９～７４のいずれか１項に記載の使用。
前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項６９～７５のいずれか１項に記載の使用。
前記第１及び／または第２の標的核酸が二本鎖ＤＮＡである、請求項６９～７６のいずれか１項に記載の使用。
前記第１及び／または第２の標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、クロマチン、ヌクレオソーム、プラスミドＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＤＮＡ断片からなる群から選択されるＤＮＡである、請求項６９～７７のいずれか１項に記載の使用。
前記方法をエクスビボで実施する、請求項６９～７８のいずれか１項に記載の使用。
第１の標的核酸に核酸切断を導入する方法であって、前記方法は、
ａ．プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む第２の標的核酸を認識することができるガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計するステップ、
ｂ．ステップａ．の前記ｃｒＲＮＡを、変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログと接触させるステップであって、前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログは、請求項１～５４のいずれか１項に記載のものか、または請求項５５～６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドもしくはベクターによってコードされ、それによって前記第２の標的核酸に結合することができるｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を得る、前記ステップ、及び
ｃ．前記ｃｒＲＮＡ及び前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼを前記第１の標的核酸と接触させるステップ、
を含み、それによって、１つ以上の核酸切断を前記第１の標的核酸に導入する、前記方法。
前記核酸切断が、一本鎖切断または突出二本鎖切断などの二本鎖切断である、請求項８０に記載の方法。
ステップｂ．及びｃ．が、同時にまたは順次に行われる、請求項８０～８１のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、インビトロで細胞において実施される、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の方法。
前記一本鎖切断が、前記第１の標的核酸の特異的認識ヌクレオチド配列に生成される、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が、先行請求項のいずれか１項に定義されるものである、請求項８０～８４のいずれか１項に記載の方法。
哺乳動物細胞内で第２の標的核酸に部位特異的な二本鎖切断を導入するインビトロ方法であって、前記方法は、前記哺乳動物細胞内に、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を導入することを含み、前記Ｃａｓ１２ｊは、請求項１～５４のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、前記第２の標的核酸に特異的である、前記方法。
サンプル中の第２の標的核酸を検出するための方法であって、前記方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、請求項１～５４のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、前記第２の標的核酸に特異的である、前記提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、前記ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、前記提供すること、
ｃ．前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体及び前記ｓｓＤＮＡを、少なくとも１つの第２の標的核酸を含む前記サンプルと接触させること、及び
ｄ．蛍光体からの蛍光シグナルを検出することにより前記ｓｓＤＮＡの切断を検出すること、
を含み、それによって、前記サンプル中の前記第２の標的核酸の存在を検出し、ステップｃ．は、任意に前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の活性化を含む、前記方法。
ステップｃ．が、前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体の活性化、例えば一本鎖または二本鎖の標的ＤＮＡによる活性化を含む、請求項８７に記載の方法。
ｅ．前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定することをさらに含み、
前記第２の標的核酸の前記レベル及び／または濃度は、前記切断されたｓｓＤＮＡと相関している、請求項８７～８８のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、第２の標的核酸をナノモル以下の範囲の濃度で、例えばピコモル以下の範囲の濃度で、例えばフェムトモル以下の範囲の濃度で、例えばアトモル以下の範囲の濃度で検出することができる、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の方法。
前記ｓｓＤＮＡが、前記鎖に沿った任意の位置の少なくとも１つの塩基で標識されている、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つの色素が、蛍光体である、請求項８７～９１のいずれか１項に記載の方法。
ステップｄ．が、前記ｓｓＤＮＡの切断から生じる蛍光シグナルを検出することを含む、請求項８７～９２のいずれか１項に記載の方法。
サンプル中の第２の標的核酸を検出及び任意に定量化する方法であって、前記方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、請求項１～５４のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、
ｉ．前記変異体Ｃａｓ１２ｊは、抑制されたエンドヌクレアーゼ活性を有し、
ｉｉ．前記変異体Ｃａｓ１２ｊは、検出可能なタンパク質標識を含み、かつ
ｉｉｉ．前記ｃｒＲＮＡは、前記第２の標的核酸に特異的である、提供することと、
ｂ．前記ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を、少なくとも１つの第２の標的核酸を含む前記サンプルと接触させることと、
ｃ．前記タンパク質標識、例えば蛍光シグナルを検出することにより、前記第２の標的核酸の存在を検出及び任意に定量化することと、
を含む、前記方法。
前記サンプルが、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む、請求項８７～９４のいずれか１項に記載の方法。
前記サンプルが、前記第２の標的核酸を含むことが疑われる、請求項８７～９５のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の標的核酸が、ウイルスゲノム、微生物ゲノム、病原体の遺伝子、またはヒト疾患に関連する核酸配列の核酸断片である、請求項８７～９６のいずれか１項に記載の方法。
対象における疾患を診断するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、請求項１～５４のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、前記提供すること、
ｂ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、前記ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、前記提供すること、
ｃ．前記対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、前記第２の標的核酸を含むか、または前記第２の標的核酸を含むことが疑われる、前記提供すること、及び
ｄ．先行請求項のいずれか１項で定義された第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、
を含み、前記第２の標的核酸は、前記疾患と相関する核酸断片であり、例えば、前記第２の標的核酸は、前記疾患のバイオマーカーであり、
それによって対象における疾患を診断する、前記方法。
前記第２の標的核酸が、前記疾患と相関する核酸断片であり、例えば、前記第２の標的核酸が、前記疾患のバイオマーカーである、請求項９８に記載の方法。
対象における感染性疾患を診断するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ｅ．ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１２ｊ複合体を提供することであって、前記Ｃａｓ１２ｊは、請求項１～５４のいずれか１項に記載の変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログであり、前記ｃｒＲＮＡは、第２の標的核酸に特異的である、前記提供すること、
ｆ．標識ｓｓＤＮＡを提供することであって、前記ｓｓＤＮＡは、少なくとも１つの色素及び少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの相互作用標識のセットで標識される、前記提供すること、
ｇ．前記対象由来のサンプルを提供することであって、前記サンプルは、前記第２の標的核酸を含むか、または前記第２の標的核酸を含むことが疑われる、前記提供すること、及び
ｈ．先行請求項のいずれか１項で定義された前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度を決定すること、
を含み、前記第２の標的核酸は、前記疾患を引き起こす感染病原体のゲノムの核酸またはその断片であり、
それによって対象における感染性疾患を診断する、前記方法。
前記感染性疾患を治療するステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
前記感染性疾患を、治療的に有効な化合物の投与により治療することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
前記第２の標的核酸のレベル及び／または濃度をカットオフ値と比較するステップをさらに含み、
前記カットオフ値は、前記感染性疾患を呈していない対象などの健常対象における前記第２の標的核酸の濃度範囲から決定され、
前記カットオフ値よりも大きいレベル及び／または濃度が、前記感染性疾患の存在を示す、請求項９８～１０２のいずれか１項に記載の方法。
前記感染性疾患が感染病原体によって引き起こされ、前記感染病原体は、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫、寄生性回虫、ぎょう虫、節足動物、真菌、白癬及び大寄生虫を含む、請求項９８～１０３のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、ヒトである、請求項９８～１０４のいずれか１項に記載の方法。
前記サンプル体液が、血液、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙液、脳脊髄液及び精液からなる群から選択される、請求項９８～１０５のいずれか１項に記載の方法。
前記変異体Ｃａｓ１２ｊエンドヌクレアーゼまたはそのオルソログが、配列番号３または配列番号３１を含むかまたはそれからなる、請求項９８～１０６のいずれか１項に記載の方法。